JP2002369699A - 選択可能な開裂部位を用いるポリヌクレオチド確認法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 目的のオリゴヌクレオチド配列を検出する、
単純、正確かつ効果的な技術を提供する。 【解決手段】 核酸試料中に存在する核酸被分析物中の
対象オリゴヌクレオチド配列の存在を検出する方法。ハ
イブリダイズ条件下で、該核酸試料をポリヌクレオチド
試薬と結合する工程であって、該試料または該試薬の成
分の何れか一つが支持体と結合し、該被分析物と該ポリ
ヌクレオチド試薬とのハイブリダイゼーションが、Ｘが
過ヨウ素酸開裂し得る結合である選択可能な開裂部位−
Ｒ₁−Ｏ−Ｘ−Ｏ−Ｒ₂−を介して、該支持体と結合した
標識を生じさせる工程を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、オリゴヌクレオチ
ド鎖内への選択可能開裂部位の組み込み一般に関し、そ
してより詳細には、オリゴヌクレオチド鎖内への過ヨウ
素酸で開裂し得る結合の導入に有用な、新規な試薬類に
関する。本発明はまた、この新規な試薬類を生化学的ア
ッセイに使用する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】オリゴヌクレオチド配列を自由に合成
し、そして、合成的方法で調製された、または、天然の
ソースから得られたポリヌクレオチド配列をクローニン
グし得ることで、染色体（単数あるいは複数）、配列の
混合物、ｍＲＮＡ等の伸張したオリゴヌクレオチド配列
中の特定の配列の存在を検出する機会が著しく拡大しつ
つある。以下は僅か数例の代表例に過ぎないが、興味深
い特定の配列には、病原体の存在の診断、対立遺伝子の
存在の確認、宿主ゲノム中の損傷の存在、特定のｍＲＮ
Ａの検出または細胞宿主の修飾のモニタリング、が含ま
れ得る。試料中の種々の抗原の存在を診断するアッセイ
を行なうための抗体の使用は、ラジオイムノアッセイの
出現以降、技法およびプロトコールの面で爆発的拡大が
見られるが、つい最近まで、ＤＮＡプローブの領域では
同様の拡大はなかった。従って、配列の検出法の殆ど
は、ポリヌクレオチド配列を支持体に結合する必要があ
り、そして放射標識したプローブを使用する種々のハイ
ブリダイゼーション技術を含んでいる。

【０００３】経済的方法で大量のオリゴヌクレオチド配
列を製造する能力の向上を背景に、研究者らの関心は、
特定のオリゴヌクレオチド配列の検出のための、単純、
正確かつ効果的な技術の提供に向けられている。これら
技術は、迅速で、技術者がエラーを犯す機会を最小に
し、自動化が可能で、そして、単純かつ正確な検出方法
を考慮していることが望ましい。この目的のために、ラ
ジオアイソトープ以外の標識でオリゴヌクレオチドプロ
ーブを標識する手段の提供、および、ゲルから支持体へ
のＤＮＡ配列の転写の正確さの向上、および、標識の結
合を考慮した誘導体化オリゴヌクレオチドのための改善
された方法を提供するために、すでに努力がなされてい
る。多様なソースに由来し得るＤＮＡを用いる種々の状
況でも、対象のＤＮＡ配列をフレキシブルに検出し得る
新しいプロトコールの提供に対する必要性は存続してい
る。

【０００４】ＭｅｉｎｋｏｔｈとＷａｈｌ、Ａｎａｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８４） １３８：２
６７−２８４は、ハイブリダイゼーション技術の優れた
総説である。Ｌｅａｒｙら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９８３） ８０：４
０４５−４０４９は、特定のオリゴヌクレオチド配列の
検出のための、アビジン−酵素複合体と組み合わせたビ
オチン化ＤＮＡの使用を記載している。Ｒａｎｋｉら、
Ｇｅｎｅ（１９８３）２１：７７−８５は、オリゴヌク
レオチド配列の検出のための、彼等が「サンドイッチ」
ハイブリダイゼーションと呼ぶ技術を記載している。Ｐ
ｆｅｕｆｆｅｒとＨｅｌｍｒｉｃｈ、Ｊ． ｏｆ Ｂｉ
ｏｌ． Ｃｈｅｍ．（１９７５）２５０：８６７−８７
６は、セファロース４Ｂへのグアノシン−５’−Ｏ−
（３−チオトリホスフェート）のカップリングを記載し
ている。Ｂａｕｍａｎら、Ｊ． ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈ
ｅｍ． ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．（１９８１） ２
９：２２７−２３７は、蛍光を用いるＲＮＡの３’末端
の標識化を記載している。ＰＣＴ出願ＷＯ／８３０２２
７７号は、標識用の改変リボヌクレオチドのＤＮＡフラ
グメントへの付加および、このようなＤＮＡフラグメン
トを分析する方法を記載している。ＲｅｎｚとＫｕｒ
ｚ、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （１９８４）
１２：３４３５−３４４４は、オリゴヌクレオチドに酵
素を共有結合させる方法を記載している。Ｗａｌｌａｃ
ｅ、ＤＮＡ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ（Ｗｏｏ，Ｓ．編集）ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、 Ｂ
ｏｃａ Ｒａｔｏｎ、 Ｆｌｏｒｉｄａは、診断のため
のプローブの使用に関する一般的背景を提供している。
ＣｈｏｕとＭｅｒｉｇａｎ、Ｎ． Ｅｎｇ． Ｊ． ｏ
ｆ Ｍｅｄ． （１９８３）３０８：９２１−９２５
は、ＣＭＶの検出用の、ラジオアイソトープ標識化プロ
ーブの使用を記載している。Ｉｎｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ３４Ｂ， ２４ （１９
７４） ３０−５９は、ポリアクリルアミドへの結合の
ための手順を記載し、一方、Ｐａｒｉｋｈら、Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ． ３４Ｂ， ２４ （１
９７４） ７７−１０２は、アガロースとのカップリン
グ反応を記載している。Ａｌｗｉｎｅら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９７
７） ７４：５３５０−５３５４は、ハイブリダイゼー
ションのための、ゲルから固相支持体へのオリゴヌクレ
オチドの転写方法を記載している。Ｃｈｕら、Ｎｕｃ
ｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （１９８３）１１：６５
１３−６５２９は、末端のヌクレオチドの誘導体化技術
を記載している。Ｈｏら、Ｂｉｏｃｈｍｉｓｔｒｙ
（１９８１）２０：６４−６７は、リン酸を付してエス
テルを形成する末端のヌクレオチドの誘導体化を記載し
ている。ＡｓｈｌｅｙとＭａｃＤｏｎａｌｄ、 Ａｎａ
ｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． （１９８４）１４０：９５−
１０３は、表面に結合したテンプレートからプローブを
調製する方法を報告している。これらの技術を記載した
これら参考文献を、標識化オリゴヌクレオチドの調製方
法を支持する記載として、本明細書に援用する。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】目的のオリゴヌクレオ
チド配列を検出する、単純、正確かつ効果的な技術を提
供する。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、核酸試料中に
存在する核酸被分析物中の対象オリゴヌクレオチド配列
の存在を検出する方法に関し、この方法は、ハイブリダ
イズ条件下で、該核酸試料とポリヌクレオチド試薬とを
結合する工程であって、該ハイブリダイズ条件では、該
試料または該試薬の成分の何れか一つが支持体と結合さ
れ、そして該被分析物と該ポリヌクレオチド試薬とのハ
イブリダイゼーションは、Ｒ₁およびＲ₂が独立して、ア
ルキレン、アルケニレン、シクロアルキレン、シクロア
ルケニレン、シクロオキシアルキレン、アリール、アリ
ールアルキレン（ａｒａｌｋｙｌｅｎｅ）、およびこれ
らの組合せからなる群から選択され、そしてＸは過ヨウ
素酸で開裂し得る結合である選択可能な開裂部位−Ｒ₁
−Ｏ−Ｘ−Ｏ−Ｒ₂−を介して、該支持体と結合した標
識を生じさせる工程；該選択可能な開裂部位を介さずに
該支持体に結合した標識を該支持体から実質的に除去す
る工程；過ヨウ素酸試薬で該開裂部位を切断する工程；
および該支持体から遊離した標識を検出する工程；を包
含する。

【０００７】前記ポリヌクレオチド試薬は、支持体と結
合した第一ポリヌクレオチド捕捉プローブおよび第二ポ
リヌクレオチド標識プローブを含有し得、該第一および
第二プローブは、前記ハイブリダイズ条件下で前記被分
析物中に存在する配列と二本鎖を形成する様に、該配列
に相補的なオリゴヌクレオチド配列を有し得、該第一お
よび第二オリゴヌクレオチド配列の内の少なくとも一つ
は対象配列であり得、前記捕捉プローブは前記選択可能
な開裂部位を含み得る。

【０００８】本発明は、１つの局面で、核酸試料中に存
在する核酸被分析物中の目的オリゴヌクレオチド配列の
存在を検出する方法に関し、この方法は、ハイブリダイ
ズ条件下で、該核酸試料を、少なくとも１つの標識され
たポリヌクレオチド成分を含むポリヌクレオチド試薬と
混合する工程；ここで、該ハイブリダイズ条件では、該
試料または該試薬の成分の何れか一つが支持体と結合さ
れ、そして該被分析物と該ポリヌクレオチド試薬とのハ
イブリダイゼーションによって、Ｒ₁およびＲ₂が独立し
て、アルキレン、アルケニレン、シクロアルキレン、シ
クロアルケニレン、シクロオキシアルキレン、アリー
ル、アリールアルキレン（ａｒａｌｋｙｌｅｎｅ）、お
よびこれらの組合せからなる群から選択され、そしてＸ
が過ヨウ素酸開裂し得る結合であって、Ｒが水素または
アルキルである、

【０００９】

【化２】 からなる群から選択される結合である選択可能な開裂部
位−Ｒ₁−Ｏ−Ｘ−Ｏ−Ｒ₂−を介して、標識が該支持体
と結合する；該選択可能な開裂部位を介さずに該支持体
に結合した標識を該支持体から実質的に除去する工程；
過ヨウ素酸試薬で該開裂部位を切断する工程；および該
支持体から遊離した標識を検出する工程；を包含する。

【００１０】好ましい実施態様において、上記ポリヌク
レオチド試薬が、支持体と結合した第一ポリヌクレオチ
ド捕捉プローブおよび第二ポリヌクレオチド標識プロー
ブを含有し得、ここで、該第一および第二プローブは、
前記ハイブリダイズ条件下で、前記被分析物中に存在す
る配列と二本鎖を形成する様に、該配列に相補的なオリ
ゴヌクレオチド配列を有し、該第一および第二オリゴヌ
クレオチド配列の内の少なくとも一つが目的配列であ
り、ここで、前記捕捉プローブが前記選択可能な開裂部
位を含む。

【００１１】好ましい実施態様において、上記過ヨウ素
酸開裂し得る結合Ｘは、Ｒが水素またはアルキルであ
る、

【００１２】

【化３】 からなる群から選択され得る。

【００１３】別の好ましい実施態様において、上記過ヨ
ウ素酸開裂し得る結合Ｘは、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（Ｏ
Ｈ）−であり得る。

【００１４】さらに好ましい実施態様において、上記選
択可能な開裂部位は、以下の構造：−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｐｈ
−Ｏ−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＯＨ）−Ｏ−Ｐｈ−ＣＨ₂
ＣＨ₂−を有し得、ここでＰｈはフェニレンである。

【００１５】本発明は、別の局面で、核酸試料中に存在
する核酸被分析物中の目的オリゴヌクレオチド配列の存
在を検出する方法に関し、この方法は、以下の工程：水
性溶媒中のハイブリダイズ条件下で、該核酸試料を、少
なくとも１つの標識されたポリヌクレオチド成分を含む
ポリヌクレオチド試薬と混合する工程；を包含し、ここ
で、該ハイブリダイズ条件では、該試料または該試薬の
成分の何れか一つが支持体と結合され、そして、該被分
析物と該ポリヌクレオチド試薬とのハイブリダイゼーシ
ョンによって、R₁およびR₂が独立して、アルキレン、ア
ルケニレン、シクロアルキレン、シクロアルケニレン、
シクロオキシアルキレン、アリール、アリールアルキレ
ン、およびこれらの組合せからなる群から選択され、そ
して、Xが過ヨウ素酸開裂し得る結合であって、Rが水素
またはアルキルである、

【００１６】

【化４】 からなる群から選択される結合である選択可能な開裂部
位-R₁-O-X-O-R₂-を介して、標識が該支持体と結合す
る；該水性溶媒から、ポリヌクレオチド試薬が結合した
該支持体および核酸被分析物を分離する工程；該水性溶
媒と異なるハイブリダイゼーションストリンジェンシー
の溶媒で該支持体を洗浄し、該選択可能な開裂部位を介
さずに該支持体に結合した標識を除去する工程；過ヨウ
素酸試薬で該開裂部位を切断する工程；および該支持体
から遊離した標識を検出する工程；を包含する方法に関
する。

【００１７】好ましい実施態様において、前記ポリヌク
レオチド試薬が、支持体と結合した第一ポリヌクレオチ
ド捕捉プローブおよび第二ポリヌクレオチド標識プロー
ブを含有し得、ここで、該第一および第二プローブは、
前記ハイブリダイズ条件下で前記被分析物中に存在する
配列と二本鎖を形成する様に、該配列に相補的なオリゴ
ヌクレオチド配列を有し、該第一および第二オリゴヌク
レオチド配列の内の少なくとも一つが目的配列であり、
ここで、前記捕捉プローブが前記選択可能な開裂部位を
含み得る。

【００１８】本発明は、１つの局面で、一方の末端近傍
で支持体と結合し、そして反対の末端に対象の配列に相
補的な配列を有するポリヌクレオチド配列を含む、核酸
試料中に存在する核酸被分析物中の対象オリゴヌクレオ
チド配列の存在の検出に有用なプローブに関し、このプ
ローブは、さらに、Ｒ₁およびＲ₂が独立して、アルキレ
ン、アルケニレン、シクロアルキレン、シクロアルケニ
レン、シクロオキシアルキレン、アリール、アリールア
ルキレン、およびこれらの組合せからなる群から選択さ
れ、そして、Ｘは、過ヨウ素酸開裂し得る結合である、
選択可能な開裂部位−Ｒ₁−Ｏ−Ｘ−Ｏ−Ｒ₂−を含む。

【００１９】好ましい実施態様において、上記Ｘは、Ｒ
が水素あるいはアルキルである、

【００２０】

【化５】 からなる群から選択され得る。

【００２１】本発明は、１つの局面で、次式の構造：

【００２２】

【化６】 を有するポリヌクレオチド試薬に関し、ここで、ＤＮＡ
₁はＤＮＡの第一鎖であり、ＤＮＡ₂は、ＤＮＡの第二鎖
であり、Ｒ₁およびＲ₂は独立して、アルキレン、アルケ
ニレン、シクロアルキレン、シクロアルケニレン、シク
ロオキシアルキレン、アリール、アリールアルキレン、
およびこれらの組合せからなる群から選択され、そし
て、Ｘは過ヨウ素酸開裂し得る結合である。

【００２３】前記Ｘは、Ｒが水素あるいはアルキルであ
る。

【００２４】

【化７】 からなる群から選択され得る。

【００２５】前記−Ｒ₁−Ｏ−Ｘ−Ｏ−Ｒ₂−は、

【００２６】

【化８】 であり得る。

【００２７】本発明は、１つの局面で、次式の構造：

【００２８】

【化９】 ；ここで、Ｒ₁およびＲ₂は独立して、アルキレン、アル
ケニレン、シクロアルキレン、シクロアルケニレン、シ
クロオキシアルキレン、アリール、アリールアルキレ
ン、およびこれらの組合せからなる群から選択され、Ｘ
は、過ヨウ素酸開裂し得る結合であり、Ｙ₁は、酸に感
受性で、塩基に安定な保護基であり、そしてＹ₂は、水
素、ホスホルアミダイト、ホスホトリエステル、ホスホ
ジエステル、ホスファイト、Ｈ−ホスホネートおよびホ
スホロチオエートからなる群から選択される；で表され
るポリヌクレオチド合成に有用なポリヌクレオチド試薬
に関する。

【００２９】好ましい実施態様において、上記Ｘは、Ｒ
が水素あるいはアルキルである。

【００３０】

【化１０】 からなる群から選択され得る。

【００３１】このポリヌクレオチド試薬は、構造式：

【００３２】

【化１１】 ；ここで、ＤＭＴは、ジメトキシトリチルを、そして、
ｉＰｒは、イソプロピルを表わす；であり得る。

【００３３】固相支持体、少なくとも一種類の標識、お
よび試料と標識化プローブが関与するハイブリダイゼー
ションを使用する、特定のヌクレオチド配列を検出する
ための方法が提供される。この方法では、二本鎖形成の
存在または不在は、支持体と標識（単数あるいは複数
の）との間の空間的関係を改変する能力に変換される。
この技術の例は、標識化プローブと試料ＤＮＡとの二本
鎖形成を介して、標識と支持体の間に開裂部位を提供す
ることである。この状態では、二本鎖は、支持体に結合
している。次に、この開裂部位を切断すると、支持体と
標識（単数あるいは複数の）が分離される。次いで、標
識の存在または不在の検出は、通常の技術に従って、行
ない得る。

【００３４】従来技術に対する本発明の主要な利点は、
本方法が、標識が特異的に結合しているかあるいは非特
異的に結合しているのかの区別を可能にすることであ
る。即ち、従来の技術では、標識は一般に、固相支持体
上で検出されていた。即ち、試料を支持体に付着させ、
そして、相補的な標識化プローブと接触させ；次いで、
二本鎖形成を、支持体上でアッセイしていた。この方法
の問題点は、被分析物が存在しない場合にも標識が支持
体と結合する可能性があり、実際に結合することであ
る。この標識の支持体への直接の結合を、本明細書中で
は「非特異結合」と呼ぶ。任意の有意な量の非特異結合
が生じた場合、被分析物の存在に拘らず支持体上で標識
が検出され、偽陽性の結果が出る。

【００３５】対照的に本発明では、対象被分析物が存在
する場合にのみ標識が検出される。即ち「特異的」結合
のみが検出される。好ましい実施態様では、試料と一種
またはそれ以上のプローブ間とから形成された二本鎖を
介して支持体と選択された標識との間に開裂部位を導入
することが実施される。この開裂部位は、米国特許第
４，７７５，６１９号（上記に引用し参考文献として援
用する）に記載された制限エンドヌクレアーゼ開裂部位
であり得、または、例えば、本願の親出願である米国出
願番号０７／２５１，１５２号に記載された、多くの種
類の化学的開裂部位の一つであり得る。

【００３６】本出願は、新しいクラスの化学的開裂部位
に関する。これらの開裂部位は、ハイブリダイゼーショ
ンアッセイに用いられる条件および試薬類に対しては極
めて安定であるが、開裂が要求される場合には、過ヨウ
素酸イオンにより容易に開裂できる。本発明はまた、こ
の開裂部位を含むポリヌクレオチド試薬類、および、ポ
リヌクレオチド合成に有用な試薬類、即ち、開裂部位を
含み、そして、容易にポリヌクレオチド鎖に組み込まれ
得る単量体の試薬類にも関する。これらの種々の試薬類
は、容易に高い収率で合成され、そして、開裂部位自身
と同様に種々の条件下で非常に安定である。

【００３７】

【発明の実施の形態】本発明の方法および試薬を詳細に
記載する前に、本発明が本明細書に記載の特定のプロト
コールまたは物質は当然に変化し得るので、これらに限
定されないことは、理解されるべきことである。本明細
書で使用される用語は、特定の実施態様を記述する目的
にのみ使用され、そして、限定を意図しないこともま
た、理解されるべきである。

【００３８】本明細書中および添付した請求の範囲中で
使用する限り、単数形冠詞である「ａ」、「ａｎ」およ
び「ｔｈｅ」を付けられた名詞は、その内容が明らかに
そうでないと示さない限り、複数である対象名詞をも包
むことを、特記する。従って、「ａ ｃｌｅａｖａｇｅ
ｓｉｔｅ（開裂部位）」という用語は、２つまたはそ
れ以上の開裂部位をも包含する。「ａ ｌａｂｅｌ（標
識）」という用語は、２つまたはそれ以上の標識をも包
含する、等である。

【００３９】本発明の記述および権利請求では以下に記
述した定義に従って、以下の用語が使用される。

【００４０】「アルキル」は、例えば、メチル、エチ
ル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブ
チル、ｔ−ブチル、オクチル、デシル、テトラデシル、
ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシル等の、１から
２４個の炭素原子を有する、分枝状または分枝状でない
飽和炭化水素基を指す。「低級アルキル」は、１から８
個の、より好ましくは１から６個の、炭素原子を有する
アルキル基を指し、従って例えば、メチル、エチル、プ
ロピル、などを含む。

【００４１】「アルケニル」は、例えば、エテニル、１
−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−イ
ソブテニル、オクテニル、デセニル、テトラデセニル、
Δ^{8, 11}−ヘプタデカジエニル、ヘキサデセニル、エイコ
セニル、テトラコセニル等の様な、２から２４個の炭素
原子、および、１つまたはそれ以上の不飽和の炭素−炭
素結合を有する分枝状または分枝状でない不飽和炭化水
素基を指す。「低級アルケニル」は、２から８個の、よ
り好ましくは２から６個の、炭素原子のアルケニル基を
指し、従って例えば、エテニル、１−プロペニル、２−
プロペニル、１−ブテニル、２−イソブテニルおよびオ
クテニルを含む。

【００４２】「アルキレン」は、１から６個の炭素原子
を含む二官能性の飽和した分枝状または分枝状でない炭
化水素鎖を指し、そして、例えば、メチレン（−ＣＨ₂
−）、エチレン（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−）、プロピレン（−
ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−）、２−メチルプロピレン（−
ＣＨ₂−ＣＨ（ＣＨ₃）−ＣＨ₂−）、ヘキシレン（−
（ＣＨ₂）₆−）等を含む。

【００４３】「アルケニレン」は、例えば、１、３−プ
ロピル−１−エン、１、４−ブト−２−エニレン、１、
５−ペント−２−エニレン、および１、６−ヘキサ−３
−エニレンの様な、２から２４個の炭素原子、および１
つまたはそれ以上の不飽和の炭素−炭素結合の二官能性
で、分枝状または分枝状でない不飽和炭化水素基を指
す。

【００４４】「アリール」は、フェニルまたは１−また
は２−ナフチル基を指す。これらの基は、随意に、１か
ら３個の、好ましくは１から２個の、低級アルキル、低
級アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、および／
またはメルカプト置換基で置換される。

【００４５】「アリールアルキレン」は、本明細書で定
義されたアルキレン基の一方の末端に結合された、本明
細書で定義されたアリール基を指す。

【００４６】「シクロアルキル」は、３から８個の炭素
原子を有する、飽和炭化水素環基を指し、そして例え
ば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、
シクロヘプチル、シクロヘキシル、メチルシクロヘキシ
ル、シクロオクチル、等を含む。

【００４７】「シクロアルキレン」は、本明細書で定義
されたアルキレン基の一方の末端に結合した、本明細書
で定義されたシクロアルキル基を含む飽和炭化水素を指
す。この用語は、例えば、シクロヘキシルメチレン、シ
クロプロピルメチレン、シクロブチルエチレン、６−シ
クロオクチルヘキシレン等を含む。

【００４８】「シクロオキシアルキレン」は、１つまた
はそれ以上のエーテル酸素原子を含む、本明細書で定義
されたシクロアルキレン基を指す。

【００４９】本発明は、ハイブリダイゼーションを使用
する特異的配列の検出を含み、これにより、試料ＤＮＡ
とプローブとの二本鎖形成が、標識と支持体との空間的
関係を改変する能力に影響を及ぼす。この様にして、試
料中の特定の配列の存在または不在が、媒質中に遊離し
た標識の量により、容易に測定し得る。

【００５０】本発明の方法は、核酸試料が支持体に結合
している場合、あるいは溶液中に遊離して存在している
場合も考慮して、プロトコールおよび試薬を変え得る。
好ましい実施態様では、本方法は、開裂部位により標識
が支持体から分離する様な核酸の二本鎖の形成を含み、
その結果、選択的な開裂を与える条件下で放出された標
識の量が、核酸試料中の対象の配列の存在および量の尺
度となる。選択可能な開裂部位は、ホモ二本鎖形成によ
る制限酵素認識部位の形成の結果として生じ得る、また
は、一本鎖ポリヌクレオチド鎖中のこの様な選択可能な
開裂部位の存在は、一本鎖中へこの様な部位を予め導入
した結果であり得る。

【００５１】対象のオリゴヌクレオチド配列を有し、核
酸被分析物にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含
む試薬が使用される。この試薬は、本明細書中では、場
合により、「捕捉プローブ」と呼ばれ、本方法では、選
択した固相支持体に結合されている。標識化プローブも
また使用され、これには対象の配列が含まれても含まれ
なくてもよい。

【００５２】第１の好ましい実施態様では、本発明の方
法は、ハイブリダイゼーション溶媒中でのポリヌクレオ
チド二本鎖の形成を含み、選択可能な開裂部位を介し
て、標識が支持体と結合する。試料ＤＮＡが支持体に結
合している、または溶液中に分散している状況の種々の
プロトコールが、使用され得る。

【００５３】関連する種々のヌクレオチド配列を区別す
るために、以下の用語を使用する： 核酸試料−対象のオリゴヌクレオチド配列を有する核酸
配列の含有が考えられる試料； 核酸被分析物−対象のオリゴヌクレオチド配列を有する
前記核酸前記試料中のＤＮＡまたはＲＮＡ； 対象のオリゴヌクレオチド配列−一般には、少なくとも
６塩基、より一般には少なくとも約１０塩基、好ましく
は少なくとも約１６塩基、５ ｋｂかそれ以上でもあり
得るが、通常は０．２ ｋｂ以上ではない、ヌクレオチ
ド鎖の全部または一部のＤＮＡあるいはＲＮＡ配列であ
り、遺伝上の特徴、病原体、等の診断に役立つ遺伝子ま
たは配列の特徴である、検出されるべき診断上の性質を
示す； ポリヌクレオチド配列−対象のオリゴヌクレオチド配列
の検出用の試薬として用いられるＤＮＡまたはＲＮＡ配
列であって、このポリヌクレオチド配列は、標識されて
いてもされていなくてもよく、支持体に結合していても
しなくてもよく、そして、対象のオリゴヌクレオチド配
列に相補的な配列を含んでも含まなくてもよい。単独
で、または核酸被分析物と結合させると、標識と支持体
との間の選択可能な開裂部位とを有し、標識と支持体の
間の架橋として機能する、１つまたは２つのポリヌクレ
オチドの配列も存在する；および 選択可能な開裂部位−過ヨウ素酸で、選択的に開裂し得
る単一あるいは複数の官能基。

【００５４】記載の便宜上、選択可能な開裂部位が創出
された本発明の好ましい実施態様は、４つの主要な副次
的実施態様に分割される。これらの第１番目（図２参
照）では、使用する試薬は、単一の構成要素で、試薬
は、一方の末端近傍で支持体と結合し、そして反対の末
端近傍で１つまたはそれ以上の検出し得る標識と結合す
るポリヌクレオチドである。このポリヌクレオチドは、
支持体と標識の中間に開裂可能な部位を含む。

【００５５】第２の場合（図３参照）では、使用する試
薬は、核酸試料が支持体に結合するか否かで、変更し得
る２つの構成要素を有する。核酸試料が支持体に結合す
る場合、２つの構成要素は、（１）架橋用ポリヌクレオ
チド配列、および（２）架橋用ポリヌクレオチド配列の
一部と相補的でハイブリダイズするポリヌクレオチド配
列である。この相補的ポリヌクレオチド配列は、標識さ
れている。この架橋用ポリヌクレオチド配列は、相補的
配列と二本鎖を形成する配列を有すると同時に、対象の
オリゴヌクレオチド配列と二本鎖を形成する領域を有す
る。

【００５６】試料核酸が溶液中に存在する場合には、こ
の２つの構成要素は、（１）対象のオリゴヌクレオチド
配列を定義し得るかどうかには関係はないが、核酸被分
析物中に存在する配列と相補的な領域を有し、支持体と
結合させた第一のポリヌクレオチド；および、（２）対
象オリゴヌクレオチド配列を定義し得るかどうかに関し
ては、第一のポリヌクレオチド配列と同じ定義を有し、
核酸被分析物中に存在する配列と相補的領域である、標
識化第二ポリヌクレオチド配列。少なくとも二本鎖化し
た領域の少なくとも一つは、対象の配列を明らかに示し
ている。第一または第二ポリヌクレオチド配列のいずれ
かは、選択可能な開裂部位を含む。

【００５７】第３の場合（図４参照）では、被分析物が
支持体に結合され、そして使用する試薬が、対象のオリ
ゴヌレオチド配列と相補的な領域を有し、選択可能な開
裂部位を含む、単独の構成要素である。

【００５８】第４の場合（図５参照）では、結合「Ｙ」
を介して支持体に結合し、そして、その反対側の末端が
核酸被分析物中に存在する第一の配列と相補的である、
ポリヌクレオチド鎖の捕捉プローブが提供される。標識
した第二ポリヌクレオチド鎖を含む標識用プローブは、
前記第一の配列と異なり、かつに重複しない被分析物中
の第二配列に相補的な領域を有する。図５で「Ｙ」と略
記した結合は、プローブを支持体に結合し得る任意の一
般的手段を表わす。結合「Ｘ」は、過ヨウ酸開裂し得る
結合を表わす。

【００５９】本発明の焦点である選択可能な開裂部位
は、構造式−Ｒ₁−Ｏ−Ｘ−Ｏ−Ｒ₂−を有する全ての過
ヨウ素酸開裂結合である。式中、Ｒ₁およびＲ₂は独立し
て、アルキレン、アルケニレン、シクロアルキレン、シ
クロアルケニレン、シクロオキシアルキレン、アリー
ル、アリールアルキレン、およびこれらの組合せからな
る群から選択され、これらの用語は上記で定義された通
りである。また、Ｘは、過ヨウ酸開裂し得る結合自身で
ある。「Ｘ」で表現し得る過ヨウ酸開裂し得る部分の例
には、「Ｒ」が水素あるいはアルキル（一般に低級アル
キル）の：

【００６０】

【化１２】 が挙げられる。

【００６１】本方法を実施するためには、相補的配列間
で二本鎖形成が起こる条件で、核酸を含有する試料と、
適切な試薬とを混合する。この混合物を、対象のオリゴ
ヌクレオチド配列上で少なくともヘテロ二本鎖形成また
はホモ二本鎖形成が起こる様に考慮された予め定めたス
トリンジェンシーの条件下で、ハイブリダイズさせる。
ハイブリダイゼーションが起こるのに充分な時間後、支
持体を上清から分離し、そして、少なくとも非特異に結
合した標識が実質的に全てなくなる様に洗浄し得る。次
に支持体に結合したオリゴヌクレオチドを、過ヨウ素酸
で処理し、その結果、少なくとも１本鎖の開裂が起こ
り、そして支持体に結合した標識の放出が起こる。

【００６２】二本鎖形成を起こす特定の配列が試量中に
存在するか否かに依存して、支持体に結合した標識（単
数あるいは複数）の放出が観察される。通常は上清の溶
媒を標識の存在に関してアッセイし得る、種々のプロト
コールが使用し得るが、場合によっては支持体を測定し
ても良い。上清からの支持体の物理的分離が必要か否か
に関わらず、種々のプロトコールおよび試薬類が、使用
され得る。

【００６３】本発明の方法は、広範な状況で、ＤＮＡま
たはＲＮＡのいずれのオリゴヌクレオチド配列の検出に
も使用し得る。重要な対象領域の一つは、特定の宿主に
感染し得る病原体、ウイルス、バクテリア、真菌類、原
生動物類等の検出である。例えば、米国特許第４，３５
８，５３５号参照。別の対象領域は、対立遺伝子の検
出、および、例えば羊水穿刺液を用いる宿主のゲノム中
に存在する変異あるいは欠失の検出；遺伝子カウンセリ
ング；宿主の過敏性または感受性試験；および細胞集団
のモニタリング；である。第３の対象領域は、転写のモ
ニタリング、ＲＮＡウイルスの検出、未発現のＲＮＡに
よる微生物の分類等の様に非常に多様な理由に基づくＲ
ＮＡの存在の確認である。例示を目的とするため包括的
ではないが、他の対象領域には、染色体外ＤＮＡまたは
組込みＤＮＡの存在；ＤＮＡ配列の増幅；このような配
列の維持；に関する改変微生物のモニタリングが含まれ
る。

【００６４】本発明の方法を使用し得る種々の目的から
明白な様に、生理学的試料は広範囲のソースから取得し
得る。ソースは、例えば便、痰、尿、唾液、その他の排
拙物；血漿、血液、血清、接眼レンズ液、脊髄液、リン
パ液、等の、種々の生理学的液体を含み得る。試料は改
変せずに使用し得る。あるいは、試料の増幅、クローニ
ング、等を行い、単離体とし、そのＤＮＡまたはＲＮＡ
を全体的に増加し、外来のＤＮＡまたはＲＮＡは全体的
に減少する様に改変し得る。ウイルスを、適合する細胞
のローン上にプレーティングし、ウイルスＤＮＡの量を
増大し得る；臨床的な単離体は、試料を栄養物を加えた
寒天培地上に試料をストリークまたはスポットし、個々
のコロニーをアッセイすることで得られ得る；あるいは
全試料を液体の培地と細胞の混合物に入れ、選択的にま
たは非選択的に増殖し得る。試料を処理する特定の方法
は、試料の性質、ＤＮＡまたはＲＮＡのソースの性質、
存在する核酸の全量に対する存在すると予想される目的
のオリゴヌクレオチド配列の量、および、採用したプロ
トコールおよびラベルの感度に依存する。

【００６５】試料の核酸または試薬のポリヌクレオチド
の一方は、共有結合または非共有結合の何れかで、拡散
しない様に、支持体に結合し得る（図５で表される実施
態様の場合には、捕捉プローブ単独が固相の支持体に結
合している）。試料の核酸を支持体に結合する場合に
は、種々の支持体が、特別の使用法を有し、その応用範
囲も知られているので、その様な支持体が好ましい。こ
れらの支持体には、非特異結合が低いかあるいは無い、
核酸試料を保持する、取り扱いが容易である、および、
増殖あるいは微生物、洗浄、加熱、転写、標識検出の様
な種々の処理が行える様な望ましい特性を与え、ニトロ
セルロースフィルター、ジアゾ化紙、エクテオラ（ｅｃ
ｔｅｏｌａ）紙、または他の支持体を含が含まれる。

【００６６】ポリヌクレオチド試薬の一成分が支持体に
結合という条件で、試料オリゴヌクレオチドと相互作用
するタイプの支持体の範囲内で、支持体のタイプは大き
く変動させ得る。支持体は、粒子、紙、プラスチックシ
ート、コンテナーホルダー壁、分割器具（ｓｅｐａｒａ
ｔｏｒ）、ミリポアフィルター等を含み得る。一方、支
持体の材料は、多糖類、ポリスチレン、ポリアクリル酸
およびその誘導体、例えばポリアクリルアミド、ガラ
ス、セラミック、金属、炭素、ポリ塩化ビニル、タンパ
ク質、等の様な、天然または合成の有機ポリマーを含み
得る。共有結合または非共有結合のどちらが望まれるか
に依存して、種々の材料を官能基化、または脱官能基化
し得る。

【００６７】核酸試料を支持体に結合する場合、特定の
支持体によっては、核酸の満足な結合に加熱で十分であ
り得る。他の状況では、核酸に結合させるためにジアゾ
基を採用し得る。しかし、ポリヌクレオチド試薬の成分
を支持体に結合する場合、ポリヌクレオチド試薬の支持
体への結合維持を保証するために、広範な異なった技術
を使用し得る。例えば、アルキルアミン類、ヒドラジド
類、またはチオセミカルバジド類を支持体へ結合させて
得られる、結合のための活性アミノ基を持たせる様に、
支持体を官能基化し得る。その後、ターミナルトランス
フェラーゼを用いて、リボヌクレオチドをＤＮＡポリヌ
クレオチド試薬に付加し得る。例えば過ヨウ素酸塩、四
酸化オスミウム＋過酸化水素、四酢酸鉛等の適切な酸化
剤でグリコール開裂し、ジアルデヒドを形成し、次いで
これを支持体表面のアミノ基に結合し、一置換または二
置換のアミノ基を生成する。あるいは、チオ燐酸と共に
アルキルチオエステルを形成するマレイミド基も提供し
得る。前出のＰａｒｉｋｈら、および前出のＩｎｍａｎ
に記述されたアガロースおよびポリアクリルアミドにつ
いての種々の技術を採用し得、それらの技術は他の物質
に対して応用し得る。

【００６８】多くの場合、経験に基づいて決定されるた
め、アッセイ溶媒中で使用し得る支持体上のポリヌクレ
オチド試薬の成分の総数は、変化する。ポリヌクレオチ
ドがハイブリダイゼーションを妨害する密度にならない
限り、支持体上の使用し得る官能基に対して、ポリヌク
レオチドの単位表面積あたりの密度は比較的高くして使
用すべきである。

【００６９】ポリヌクレオチドのサイズは大きく変化し
得るが、通常約１５塩基以下ではなく、５０塩基または
それ以上であり得、通常は約５００塩基を越えず、より
一般には２５０塩基を越えない。ポリヌクレオチド試薬
の成分中には通常少なくとも６塩基、通常は少なくとも
１２塩基の、通常は対象配列である、核酸試料中の配列
に相同の部位を有する。ハイブリダイゼーションのため
の部位は、１６塩基またはそれ以上であり得、通常約１
ｋｂｐを越えない。完全な相同性が要求されない場
合、少なくとも約５０％、さらに好ましくは少なくとも
８０％の相同性があれば十分である（相同性百分率は、
ループアウトし得る非相補的挿入部分、５塩基長を越え
る挿入部分を無視した、相補性を意味する）。

【００７０】特に、対立遺伝子群、多数の異なる株、ま
たは、関連し合った種を対象とする場合、メッセンジャ
ーＲＮＡあるいはゲノムタンパク質は高度に保存されて
いるにもかかわらず、多型が起こっているので、任意の
特定の配列に対する、この相違を反映し、かつ全ての対
象配列への、相同性を最適化したプローブを調製するこ
とが望まれる場合がしばしばある。

【００７１】標識したポリヌクレオチド試薬の成分の標
識は、選択的開裂部位または他の結合を介して、ポリヌ
クレオチド配列に結合し得る標識はアッセイを通して保
持される。多くの種類の標識が使用可能である。標識
は、検出可能な信号または検出可能な信号を得る手段を
提供し得る。

【００７２】それゆえ標識は、直接または間接の何れか
で検出可能な信号を提供し得る、リガンド、ラジオアイ
ソトープ、酵素、蛍光物質、化学発光物質、酵素自己不
活性化抑制因子、酵素の補因子、酵素基質、またはその
他の置換基の様な多様な置換基を含んでいる。

【００７３】リガンドが関与する場合、例えば、ビオチ
ンとアビジン、２，４’−ジニトロベンゼンと抗（２，
４’−ジニトロベンゼン）ＩｇＧ等の様な、そのリガン
ドに特異的に結合するレセプターが一般に使用される。
この場合、上述の様に適切な標識で置換する。このよう
にして、検出可能な信号を与えるための、ポリヌクレオ
チド配列一個当りの標識の数を検討し得る。

【００７４】種々のイムノアッセイで使用する標識は殆
ど、本発明のアッセイでも利用し得る。これらの標識
は、米国特許第３，８５０，７５２号（酵素）；第３，
８５３，９１４号（スピンラベル）；第４，１６０，０
１６号（蛍光物質）；第４，１７４，３８４号（蛍光物
質および消光物質）；第４，１６０，６４５号（触
媒）；第４，２７７，４３７号（化学発光物質）；第
４，３１８，７０７号（消光粒子）；および第４，３１
８，８９０号（酵素基質）に説明されている。

【００７５】代表的な蛍光性および化学発光性の標識に
は、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、ウンベリ
フェロン、ビリタンパク、ルミノールその他が含まれ
る。

【００７６】代表的な対象とする酵素の例には、西洋ワ
サビペルオキシダーゼ、グルコースー６−燐酸デヒドロ
ゲナーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、β−ガラクト
シダーゼ、α−アミラーゼ、ウリカーゼ、リンゴ酸デヒ
ドロゲナーゼ、その他が含まれる。

【００７７】標識をポリヌクレオチド配列に結合する方
法は、標識の性質に依存して大きく変化する。すでに示
したように、リボヌクレオチドをオリゴヌクレオチド配
列に加え、開裂し、得られたジアルデヒドをアミノ基ま
たはヒドラジン基と結合し得る。アルキルアミンの生成
をもたらす還元条件を用いることで、結合の永続性をさ
らに高め得る。あるいは、標識とα−ブロモまたはα−
クロロアセチルの様な、活性ハロゲンで置換し得る。こ
の活性ハロゲンは、チオ燐酸基またはチオエステルと結
合させることができ、チオエステルが形成される。ある
いは、標識はマレイミド官能基を持ち得、この場合、ポ
リヌクレオチド上に存在するメルカプト基がチオエステ
ルを形成する。ポリペプチドの末端の燐酸は、カルボジ
イミドで活性化し得、得られるホスホルイミダゾリドは
アミノ基あるいはアルコールと反応し、ホスホルアミデ
ートまたは燐酸エステルを与える。アミノ修飾したプリ
ンにポリペプチドを形成し得る。従って、標識の選択、
結合の様式、および、結合基の選択には広範な自由度が
ある。

【００７８】このポリヌクレオチド試薬を試料と結合す
ることで、存在する全ての核酸被分析分が支持体に結合
する。選択可能な開裂部位の開裂で、支持体から放出さ
れる標識の量を被分析物の存在量と関連付け、被分析物
の量もまた定量的に測定し得る。

【００７９】標識と支持体の空間的関係の改変は、数多
くの方法で達成し得る。既に示したように、プローブと
同じポリヌクレオチドとには、少なくとも一つの共通の
認識部位が存在し得るので、支持体からプローブを放出
し得る。

【００８０】リガンドが検出可能な信号を直接に与えな
いが、一つ又はそれ以上の標識と結合している受容体と
結合する場合、リガンドで置換したヌクレオチドを使用
し得る。代表的な例には、アビジンと結合するビオチン
化されたヌクレオチオド、免疫グロブリンと結合するハ
プテン、および、レクチンと糖類、細胞表面膜蛋白とホ
ルモンおよび増殖因子、等の様なタンパク質様のレセプ
ターに結合する種々の天然化合物が含まれる。

【００８１】図５で表される実施態様では、選択可能な
開裂部位は、二つの方法の内一つで導入し得る。

【００８２】先ず、架橋用化合物を、捕捉プローブ１自
体に、即ち図中に示したように位置「Ｘ」で組み込み得
る。この目的には、任意の数の架橋用試薬が使用し得、
唯一の制限は、捕捉プローブに導入する開裂部位は、過
ヨウ素酸で開裂できなければならない点である。過ヨウ
素酸開裂可能な結合を導入するための適切な架橋用試薬
の例は、硫黄−硫黄架橋を有するビス（カルボン酸）
（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手可能）、
およびジスクシンイミジル酒石酸（ＤＳＴ）である。

【００８３】固相の支持体に付着させる前に、捕捉プロ
ーブを適切に改変することでも、選択可能な開裂部位を
導入し得る。この方法は、次の構造式を有するポリヌク
レオチドの調製を含む。

【００８４】

【化１３】 ただし式中の、Ｘは上述の様に過ヨウ素酸開裂可能な部
位である、あるいは含む、ＤＮＡ₁はＤＮＡの第１鎖、
ＤＮＡ₂はＤＮＡの第２鎖、そしてＲ₁およびＲ₂は以前
に定義した通りである。特に好適な実施態様では、−Ｒ
₁−Ｏ−Ｘ−Ｏ−Ｒ₂−は

【００８５】

【化１４】 である。

【００８６】次にこの化合物を、本技術分野で周知の一
般的な方法を使用して固相の支持体に付着させ、図５に
示した捕捉プローブをとし得る。この様な化合物は、上
の構造式の１，２−ジオール系がＤＮＡ合成中にジベン
ゾイル混合物として保護され、さらに次の構造式の置換
基Ｙ₁に、（ジメトキシトリチル、または「ＤＭＴ」の
様な）酸に感受性で、塩基に安定な保護基、そして置換
基Ｙ₂に、水素あるいは、ホスホルアミダイト、燐酸ト
リエステル、燐酸ジエステル、ホスファイト、Ｈ−ホス
ホネートまたはホスホチオエートの様なリンの誘導体を
含む次式の試薬：

【００８７】

【化１５】 を使用し、標準のホスホルアミダイト反応のプロトコー
ルを用いて、ＤＮＡ断片中に組み込み、調製し得る。代
表的な化合物は、「ＤＭＴ」が、ジメトキシトリチルで
あり「ｉＰｒ」はイソプロピルである、

【００８８】

【化１６】 で表され得る。

【００８９】図２から図４に示した実施態様と同様に、
図５の実施態様は、溶液中で特異的に結合した標識の検
出を（そして、当然被分析物２の正確な測定を）を可能
にし、一方、非特異的に結合した標識６は固相の支持体
５に結合したままである。

【００９０】広範な種類の支持体、および、オリゴヌク
レオチド鎖の非拡散的結合の技術が、文献中に報告され
ている。総説は、ＭｅｉｎｋｏｔｈとＷｈａｌ、Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． （１９８４） １３８：２６７
−２８４を参照。支持体には、温度８０℃で２時間で十
分なニトロセルロースフィルター、さらなる活性化なし
に結合が起こるジアゾ化紙、エクテオラ紙、その他が含
まれる。アガロースビーズは、ＤＮＡと直接反応させる
ために、臭化シアンで活性化し得る（Ｂａｕｍａｎら、
Ｊ． Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．
（１９８１）２９： ２２７−２３７）；あるいは、臭
化シアンおよびジアミンと反応させ、次ぎに例えば、ブ
ロモアセチルの様な −ハロアセチルと反応させる、あ
るいは、例えば無水マレイン酸のカルボキシル置換活性
オレフィンと反応させ、ポリヌクレオチド鎖上に存在す
るチオール官能基と反応し得るビーズを得る。例えば、
ＤＮＡを改変してカップリング用の、 −チオ燐酸を形
成し得る。（ＰｆｅｕｆｆｅｒとＨｉｌｍｒｅｉｃｈ、
Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９７５） ２５
０：８６７−８７６）。化学的手段により、オリゴヌク
レオチドを合成しテフロン（登録商標）支持体に結合
し、そして次ぎに、オリゴヌクレオチドを取り除くこと
なくこの材料を完全に脱ブロック化することも可能であ
る。（ＬｏｈｒｍａｎｎらＤＮＡ （１９８４）３：１
２２）。

【００９１】標識と試薬が広範な多様性を有するという
観点から、本方法の全般に共通する側面を記載し、その
後いくつかの代表的プロトコルを記載する。本法全般に
共通しているのはハイブリダイゼーションである。ハイ
ブリダイゼーションは、二本鎖形成に要求される相同性
が大きいか小さいかによって、変化する度合のストリン
ジェンシーの程度で実施され得る。殆どの場合で、水性
溶媒が使用され、種々の他の成分の混合物を含み得る。
特に、有機極性溶媒は、ストリンジェンシーの増大のた
めに使用し得る。代表的な溶媒の例には、ジメチルホル
ムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシ
ドが含まれる。即ち、使用する濃度で水混和する有機溶
媒である。高いイオン強度を得るために加える塩濃度を
高めても、ストリンジェンシーを増大し得る。さらに、
温度上昇もストリンジェンシーに用い得る。各場合共
に、逆にするとストリンジェンシーは低下する。界面活
性材の様な、他の添加物もまた、ストリンジェンシーの
改変に使用し得る。

【００９２】ハイブリダイゼーションための時間の長さ
は、対象配列の濃度、ストリンジェンシー、相補的配列
の長さ、等により変化する。一般に、ハイブリダイゼー
ションは、少なくとも約１５分を要し、そして一般的に
は、約７２時間を越えず、より一般には約２４時間を越
えない。さらに、あるストリンジェンシーでハイブリダ
イゼーションを行い、そして次に、より高いストリンジ
ェンシーで洗浄し、十分な相同性を欠くヘテロ対合を除
去し得る。

【００９３】核酸試料は、種々の方法で処理し得る。例
えば、完全なゲノム、機械的に切断したまたは制限酵素
で消化した、約０．５ ｋｂから３０ ｋｂまで変化す
るゲノムの断片、あるいは、例えば電気泳動で大きさに
従って分画された断片を使用し得る。ある場合に、対象
配列は、例えば、例えばＭ１３、の様な一本鎖のＤＮＡ
またはＲＮＡウィルスである適切なベクター中でクロー
ニングされたクローン配列である。

【００９４】アッセイ溶媒中には、緩衝剤、例えばＳＤ
Ｓである界面活性剤、フィコール、ポリビニルピロリド
ン、および、非特異的結合を最小化し得る外来のＤＮ
Ａ、を含め得る。これらの添加物の全ては、参考文献中
に説明があるため、詳細な記述を要さない。

【００９５】特定のプロトコルに従い、試料核酸をポリ
ヌクレオチド試薬（単数あるいは複数）と共に、予め定
められたストリンジェンシーのハイブリダイゼーション
溶媒中に入れる。ハイブリダイゼーションに十分な時間
の経過後、支持体を、ハイブリダイゼーション溶媒より
も高いかまたは低いストリンジェンシーの溶媒で、少な
くとも一回洗浄する。次に、結合したポリヌクレオチド
と被分析物を含む支持体を、一本鎖または二本鎖開裂を
考慮した選択可能な開裂部位の開裂に必要な反応物（例
えば光の様な物理的処理を含む）と接触させる。多くの
場合、制限エンドヌクレアーゼ、ホスホジエステラー
ゼ、ピロホスファターゼ、ペプチダーゼ、エステラー
ゼ、その他の様な加水分解酵素が使用されるが、還元
剤、エルマン試薬の様な他の試薬、または光も用い得
る。開裂の後、支持体と上清とは、標識および測定の様
式、そして、支持体から放出され測定された標識の量に
依存して、分離しても分離しなくてもよい。

【００９６】本発明をさらに説明するため、幾つかの代
表的プロトコルを記載する。第１の代表的プロトコール
中では、蛍光標識されたポリヌクレオチドが各ウェルの
底に結合しているマイクロタイタープレートを使用す
る。クローン化された病原体のＤＮＡを、一つまたはそ
れ以上の制限酵素で制限酵素消化し、約０．５ ２ ｋ
ｂの断片を得る。この断片を穏和な塩基性条件下で単離
し、変性し、そしてハイブリダイゼーション溶媒中に分
散し、次に、各ウェルが特定の病原体種の異なる株の配
列に特異的に相同な異なる配列を有する複数のウェルに
順次添加する。

【００９７】ハイブリダイゼーションが起こるのに十分
な時間の間、これらのウェルを例えば６０℃の高温度に
維持し、その後に、この上清を取り除き、そして、ウェ
ルをハイブリダイゼーション溶媒より低いストリンジェ
ンシーの緩衝溶媒で繰り返し完全に洗浄する。二本鎖形
成は、全ての株に共通する制限酵素の認識部位を与え
る。次に、各ウェルに二本鎖ＤＮＡを消化するための制
限酵素溶媒を添加し、二重鎖ＤＮＡを消化し、蛍光性の
標識の上清中への放出が起こる。各ウェルからこの上清
を吸引分取し、励起光照射をする。次に対照配列の存在
の指標として蛍光の量を測定する。この様にして、液相
中の蛍光の存在を観察することで、どの株が存在するか
を迅速にスクリーニングし得る。

【００９８】第２の代表的なプロトコールでは、未標識
のポリヌクレオチドを結合したガラスビーズを含むカラ
ムを使用する。次にこのカラムに、哺乳類細胞から得た
ＤＮＡ断片を含む試料核酸を添加する。この断片は、約
０．５から１０ ｋｂの範囲である。この試料ＤＮＡ
を、適切なハイブリダイゼーション溶媒に分散し、そし
てカラムに添加し、そしてハイブリダイゼーションが起
こるのに十分な時間の間カラム中に保持する。試料のハ
イブリダイゼーションの後、ハイブリダイゼーション溶
媒をカラムから放出し、そして、第１の溶媒よりも厳密
な条件下の第２のハイブリダイゼーション溶媒中のジス
ルフィド結合を介して西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈ
ＲＰ）を標識したポリヌクレオチド試薬を加え、そし
て、第２の溶媒をハイブリダイゼーションが起こるのに
十分な時間でカラムから放出する。標識したポリヌクレ
オチドは、対象配列に相補的な配列を有する。ハイブリ
ダイゼーション溶媒を、カラムから排出する。

【００９９】次に、カラムを、より高いストリンジェン
シーを有する溶媒で１またはそれ以上の回数洗浄し、標
識したポリヌクレオチドに対して不充分な相同性を有す
る全てのポリヌクレオチド配列を除去する。次に、エル
マン試薬をカラムに加え、ジスルフィド結合の解裂を起
こし、そしてＨＲＰを放出させる。ＨＲＰを含む溶媒を
カラムから排出し、回収し、そして、引き続く、遊離し
た酵素がカラム中に残らない様保証する洗浄の洗浄液を
も、補集した。ＨＲＰ標識を含む得られた溶媒を次に、
ＨＲＰ標識に関してアッセイし得る。ＨＲＰの代わり
に、分光学的にまたは蛍光的に検出し得る生成物を生成
する多くの種類の他の酵素を、使用し得る。

【０１００】第３のプロトコールでは、試料をフィルタ
ーに吸収させ、そして８０℃で２時間加熱することで、
核酸試料を、ニトロセルロースフィルターの一端に非拡
散的に結合する。このフィルターを洗浄し、そしてその
後、ハイブリダイゼーション条件下で、エステル結合を
介して、アルキルカルボキシ置換アデニンに結合させた
ウンベリフェロンで標識したポリヌクレオチドのハイブ
リダイゼーション溶液に加える。この標識したポリヌク
レオチドは、対象配列に相補的な配列を有する。ハイブ
リダイゼーションに充分な時間の後、このフィルターを
ハイブリダイゼーション溶媒から取り出し、洗浄し、非
特異的に結合たヌクレオチドを除去し、そして次に、既
知濃度のエステラーゼ溶液中に浸す。蛍光の増加の率
を、核酸試料中の被分析物の量の指標としてモニターす
る。

【０１０１】他のプロトコールでは、ポリフルオレセイ
ン化した末端を有する被分析物配列に相補的に配列され
た標識したポリヌクレオチドを有するストリップを保持
する、ホルダーを有するプラスチックの材質のディップ
スティックを使用し得る。核酸試料を適切なハイブリダ
イゼーション媒質中で調製し、そして、ディップスティ
ックを入れ、そしてハイブリダイゼーションを進行させ
る。ハイブリダイゼーションが起こるのに十分な時間の
後、このディップスティックを取り出し、そして洗浄
し、非特異的に結合した全てのポリヌクレオチドを取り
除く。対象ポリヌクレオチド配列の存在は、制限酵素認
識部位の形成をもたらし、そして次に、ディップスティ
ックを制限酵素反応混合液に入れ、そして消化を進行さ
せる。消化が進行するのに十分な時間の後、このディッ
プスティックを取り出し、徹底的に洗浄し、そして溶液
中の蛍光を読み取る。また、ベースラインの値より上の
蛍光は、被分析物の存在を示す。

【０１０２】別のプロトコールでは、ポリヌクレオチド
試薬成分は、核酸被分析物の一つの領域に対し相補的な
配列を有し、マイクロタイタープレートのウェルの壁に
結合している第一のポリヌクレオチド、および核酸被分
析物の他の領域に相補的な配列を有する標識した第２の
ポリヌクレオチドである。この標識は、Ｎ⁸−アミノヘ
キシルデオキシアデノシントリホスフェートウンベリフ
ェリルカルボキシアミドで尾部伸張ポリヌクレオチドか
ら得られる。ハイブリダイゼーション条件下で、過剰の
標識したポリヌクレオチドと共に、核酸試料をウェル中
に入れる。ハイブリダイゼーションに十分な時間の後、
ハイブリダイゼーション溶液をウェルから吸引して取り
出し、ウェルを洗浄し、そしてウェル中に残留したＤＮ
Ａを、９０％のギ酸溶液を加え、そして６０℃で１時間
加熱するか、あるいはピペリジンを加え、９０℃で３０
分加熱することで、脱プリン化する。

【０１０３】あるいは、標識されるべきポリヌクレオチ
ドと、ＳｉｌｖｅｒとＦｅｉｓｈｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ （１９８２） ２１：６０６６に従いクロロ
アセトアルデヒドで処理して、ポリ−ｄＡを処理して得
られるオリゴマーの過剰量とをライゲーションし、蛍光
性Ｎ６−エタノアデノシンを作成することで、標識が得
られる。標識の放出は、１０００ ｕｇＭの、ＣａＣｌ
２溶液中のミクロコッカスヌクレアーゼで、３７℃で１
時間処理して行われる。

【０１０４】どちらの場合も、このポリマーの蛍光は自
己消光のために顕著に減少する。溶解すると、蛍光の顕
著な増加が観察される。この様にして、脱ポリマー化に
抵抗性を有する、非特異結合した標識ポリヌクレオチド
は観察される信号に干渉されない。さらに、バックグラ
ウンドの蛍光レベルが低いので、蛍光の増加率を核酸被
分析物の定量的な指標として測定し得る。自己消光の代
わりに、蛍光物質と消光物質が入れ替わったシステム、
あるいは、２成分試薬システムで、非消光性蛍光物質が
一つの成分上に存在し、消光物質が他の成分上に存在す
るシステム、も使用し得る。

【０１０５】以下の実施例は説明を目的に提供され、限
定は意図しない。

【０１０６】

【実施例】ＰＣＬ（過ヨウ素酸開裂可能リンカー）の合
成：この実験では、略号「Ｘ」は、Ｄ，Ｌ−１，４−ビ
ス−（４−（２−ヒドロキシエチル）フェノキシ）−
２，３−ブタンジオールを、略号「Ｘ’」は２，３−イ
ソプロピリデンを、そして略号「ＤＭＴ−Ｘ（Ｂｚ₂）
−ＢＣＥ」は２−（４−［４（４−（２−ジメトキシト
リチルオキシ）エチル）フェノキシ−２，３−ジ（ベン
ゾイルオキシ）−ブタン−オキシ］フェニル）エチル−
２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホアミ
ダイトを表す。「ＤＭＴ−Ｘ（Ｂｚ₂）−ＢＣＥ２」は
次の構造式を有する。

【０１０７】

【化１７】 ４−ヒドロキシフェニルエタノール（２１．４ ｇ；１
５５ ｍｍｏｌｅ）および１，４−ジブロモ−２，３，
−ブタンジオール（１９．３ ｇ；７８ ｍｍｏｌｅ）
を４００ ｍｌの無水エタノールに溶解した混合物に、
ＮａＯＨ（２６ｍｌの６ Ｍ水溶液）を加えた。この反
応混合物を１８時間穏やかに還流した。室温に冷却した
後、溶媒の半分を減圧で除去し（−２００ ｍｌ）、そ
して、激しく撹拌しながら１０００ ｍｌの水に滴加し
た。生成した沈澱物を濾別し、そして真空デシケーター
中で、乾燥を補助する固体ＮａＯＨ（１０ ｇ）上で完
全に乾燥し、１１．９ ｇ（３３ ｍｍｏｌｅ）の
「Ｘ」（収量４２％）を得た。

【０１０８】化合物「Ｘ」（３３ ｍｍｏｌｅ）をＴＨ
Ｆに溶解し、次にこの溶液（３３０ｍｌ）を濾過し、そ
してＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（１００ ｍｇ）
とトリエチルアミン（２７ ｍｌ；２００ ｍｍｏｌ
ｅ）を加え、そして最後にｔ−ブチルジメチルシリルク
ロライド（ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ）（１９．８ ｇ；１３２
ｍｍｏｌｅ）を上記混合物に加えた。２０℃、１８時
間の後、全ての出発物質が消滅し（ｔｌｃ分析で確
認）、そして、メタノール（５０ ｍｌ）を加え過剰な
ＴＢＤＭＳ−Ｃｌを消滅した（２５分間）。この反応混
合物を少容積に濃縮し、酢酸エチル（２５０ ｍｌ）で
希釈し、そして２５０ ｍｌの５％ ＮａＨＣＯ₃で１
回、２５０ ｍｌのＮａＣｌ ８０％飽和水溶液で１回
洗浄した。有機相を固体Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥した後、溶
媒を減圧下で除去した。粗ＴＢＤＭＳ ₂−Ｘをピリジン
に溶解し、０℃に冷却し、そして１２５ ｍｌのＣＨ₂
Ｃｌ₂に溶解した塩化ベンゾイル（１３２ ｍｍｏｌ
ｅ）を滴加した。反応溶液を加熱し室温とし、そして１
８時間放置した。ピリジン溶媒を減圧下で除去し、そし
て残査を酢酸エチルに溶解した。上記と同様に水性溶媒
で処理した後、この粗ＴＢＤＭＳ₂ＸＢｚ₂（３０ ｍｍ
ｏｌｅ）を１００ ｍｌの濃酢酸を含む２００ ｍｌの
ＴＨＦに溶解し、そしてテトラブチルアンモニウムフル
オライド（１００ ｍｌの１ ＭのＴＨＦ溶液）を加
え、そして反応混合物を４℃で１８時間放置した。次に
溶媒の大部分を減圧下で除去し、そして酢酸エチル中に
入れた残査を固体ＮａＨＣＯ₃で処理し、過剰な酢酸を
中和し、上記と同様に洗浄と乾燥を行い、Ｘ（Ｂｚ₂）
（３０ ｍｍｏｌｅ；１７．０ｇ）を得た。この物質を
精製せずに使用し、そしてピリジン中で３０ ｍｍｏｌ
ｅのＤＭＴ−Ｃｌで処理した。１８時間後、溶媒を減圧
下で除去し、酢酸エチル中の残査を上記と同様に洗浄お
よび乾燥し、２７ ｇの粗ＤＭＴ−Ｘ（Ｂｚ２）を得
た。この粗生成物を、ＣＨ₂Ｃｌ₂／１％トリエチルアミ
ンを溶媒システムとして用い、シリカの大型カラムで精
製し、純粋なＤＭＴ−Ｘ（Ｂｚ₂）（１３．３ ｇ；１
５ ｍｍｏｌｅ）を得た。この精製した物質を、以下の
様して２−シアノエチルホスホルアミダイト誘導体に変
換した：ＤＭＴ−Ｘ（Ｂｚ₂）（１５ ｍｍｏｌｅ）を
Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１３．１ ｍ
ｌ；７５ ｍｍｏｌｅ）を含む５０ ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂
に溶解し、そして０℃に冷却した。この溶液に、アルゴ
ン気流下で、２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロ
ピルアミノクロロホスフィン（３．３ ｍｌ；１５ ｍ
ｍｏｌｅ）を注射器を用いて加えた。〜３０分後、反応
は完了し、そして５００ ｍｌの酢酸エチルで希釈した
後、有機相を５００ ｍｌの５％ ＮａＨＣＯ₃で２
回、そして５００ ｍｌの８０％飽和ＮａＣｌで２回洗
浄した。固体Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥した後、溶液を濾過
し、蒸発乾固し、１６ｇの白色の泡状のＤＭＴ−Ｘ（Ｂ
ｚ₂）ＢＣＥアミダイトを得た。この粗アミダイトをシ
リカゲルカラムで精製しＣＨ₂Ｃｌ₂／酢酸エチル／トリ
エチルアミン（４５：４５：１０ ｖ／ｖ）で溶出し、
白色の泡状の純粋なＤＭＴ−Ｘ（Ｂｚ₂）ＢＣＥアミダ
イト（１４．２ ｇ；１３ ｍｍｏｌｅ）を得た（ＮＭ
Ｒ³¹Ｐ δ１４４ ｐｐｍ；カップリング効率 ９７
％）。

【０１０９】本明細書に開示した他の過ヨウ素酸解裂種
への、１，２−ジオール結合の変換は、有機合成化学の
技術分野で周知の一般的技術を用いて容易に行い得る。

【０１１０】Ｘ’の合成：化合物Ｘ（２５ｇ， ６９
ｍｍｏｌｅ）をＣＨ₃ＣＮ（２００ ｍｌ）に懸濁さ
せ、そして５０ ｍｌの２，２−ジメトキシプロパンを
加えた。その後の数時間の間に、無水のｐ−トルエンス
ルホン酸（０．１ Ｍアセトニトリル溶液１０ ｍｌ）
を加えた。殆ど透明の溶液を得た。１８時間後、溶液を
濾過し、そして１０ ｍｌのＨ₂Ｏを加え、そして１０
分間放置し、過剰な試薬および他の副生成物を破壊し
た。ピリジン（５０ｍｌ）を加え、そして反応混合物を
減圧下で濃縮し、２５ｇのＸ’生成物を得た。精製せず
に、この物質をＤＭＴに変換し、そして以前にＸ（Ｂｚ
₂）の項で記載した様に、さらにＢＣＥホスホルアミダ
イトに変換した。

【０１１１】結果：完全に保護されたＤＭＴ−Ｘ（Ｂｚ
₂）ＢＣＥアミダイトを、固相の支持体上のオリゴマ
ー、５’−Ｔ₁₀−Ｘ−Ｔ₁₅−３’中に組み込んだ。この
断片を、ジクロロ酢酸と水酸化アンモニウムを用いた脱
保護を、先ず、２０℃で１時間、（コハク酸結合を解裂
するために）、次に６０℃でＸ部分のベンゾイル基を除
去することで行った。オリゴマーの開裂はまったく観察
されなかった。水中のテストオリゴマー試料を水中の１
００ ｍＭのＮａＩＯ₄で４℃で１時間、処理した。次
に過剰の試薬を、リボースで還元した。ポリアクリルア
ミド電気泳動（ＰＡＧＥ）で開裂が完了したことが示さ
れ、より短い２つの断片、ＸがＯ−（ＣＨ₂）₂−Ｃ₆Ｈ₄
−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨＯである、５’−Ｔ_10x−３’および
５’−Ｘ−Ｔ₁₅−３’を生じた。ＰＡＧＥの結果： レーン １： Ｔ₁₅ ２： ５’−Ｘ−Ｔ₁₅−３’ ３： ５’−Ｔ₁₀−Ｘ−Ｔ₁₅−３’，ＮＨ₄ＯＨ ２０℃／１時間 ４： レーン３と同じ、ただしＮＨ₄ＯＨ ６０℃／１８時間 ５： ＮａＩＯ₄に１時間さらした後はレーン４と同じ ６： レーン５と同じ 上記の結果から、本方法が、多様なソースに由来する特
定のポリヌクレオチド配列を検出するための、単純、迅
速かつ正確なアプローチを提供することが明かである。
本方法は、イムノアッセイで使用されてきた検出可能な
信号を含む異なるタイプの標識を考慮した、高い感度と
大きな融通性を提供する。従って、本方法は、放射活
性、分光光度計による光吸収、および、蛍光計あるいは
シンチレーションカウンターによる発光を、検出し得る
イムノアッセイ用の従来の装置中での使用に容易に適応
し得る。本方法は、任意のＤＮＡ配列に適用し得、そし
て比較的小型のプローブが使用でき偽陽性の減少、およ
び好ましくないヘテロ対合の最小化をもたらす。測定の
ために支持体から標識を解裂することで、支持体から離
れて測定し得るため、バックグラウンド値を大きく減少
し得る。さらに、ポリヌクレオチド鎖からの標識の分離
の必要に基因する、バックグラウンドさらなる変更（ｒ
ｅｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）がある。従って本方法は、病気
の診断、ハイブリッドＤＮＡの操作のモニタリング、遺
伝的特性の確認、等のため、正確で経済的なＤＮＡ配列
確認の方法を提供し得る。

【０１１２】以上の様に本発明を、明確な理解を得るた
めに、説明および実施例により、部分的に詳細に記載し
たが、何らかの変更および改変は、添付の請求項の範囲
内で実施し得ることは明かである。

【０１１３】

【発明の効果】一定のストリンジェンシーでハイブリダ
イゼーションが起こったかどうかが、支持体からの標識
の放出で判断し得る、被検物中の対象配列と実質的に相
同なオリゴヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
を使用する、核酸被検物をアッセイするための新規な方
法が提供される。より詳細には、標識を支持体に結合す
るために、種々の技法が使用され、その後、標識と支持
体間の結合を過ヨウ素酸開裂し、標識を遊離させ、標識
を試料中の特定のオリゴヌクレオチド配列の存在の指標
として検出できる。本方法は、病気の診断、遺伝子のモ
ニタリング、および核酸混合物の分析に使用できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 固相支持体に特異結合および非特異結合した
標識の相違を説明する図である。

【図２】 本発明の好ましい方法の一例を模式的に説明
する図である。選択的な開裂部位が、被分析物／プロー
ブ複合体を介して支持体と標識の間に導入される。

【図３】 本発明の好ましい方法の一例を模式的に説明
する図である。選択的な開裂部位が、被分析物／プロー
ブ複合体を介して支持体と標識の間に導入される。

【図４】 本発明の好ましい方法の一例を模式的に説明
する図である。選択的な開裂部位が、被分析物／プロー
ブ複合体を介して支持体と標識の間に導入される。

【図５】 本発明の好ましい方法の一例を模式的に説明
する図である。選択的な開裂部位が、被分析物／プロー
ブ複合体を介して支持体と標識の間に導入される。

フロントページの続き (72)発明者 トーマス ホーン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94708 バークレー，アーチ ストリート 1583 エイ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA09 CA11 HA14 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ41 QR31 QR56 QR82 QS34 QX01 QX02 QX07

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 核酸試料中に存在する核酸被分析物中の
   目的オリゴヌクレオチド配列の存在を検出する方法であ
   って：ハイブリダイズ条件下で、該核酸試料を、少なく
   とも１つの標識されたポリヌクレオチド成分を含むポリ
   ヌクレオチド試薬と混合する工程、 ここで、該ハイブリダイズ条件では、該試料または該試
   薬の成分の何れか一つが支持体と結合され、そして該被
   分析物と該ポリヌクレオチド試薬とのハイブリダイゼー
   ションによって、Ｒ₁およびＲ₂が独立して、アルキレ
   ン、アルケニレン、シクロアルキレン、シクロアルケニ
   レン、シクロオキシアルキレン、アリール、アリールア
   ルキレン（ａｒａｌｋｙｌｅｎｅ）、およびこれらの組
   合せからなる群から選択され、そしてＸが過ヨウ素酸開
   裂し得る結合であって、Ｒが水素またはアルキルであ
   る、 【化１】 からなる群から選択される結合である選択可能な開裂部
   位−Ｒ₁−Ｏ−Ｘ−Ｏ−Ｒ₂−を介して、標識が該支持体
   と結合する；該選択可能な開裂部位を介さずに該支持体
   に結合した標識を該支持体から実質的に除去する工程；
   過ヨウ素酸試薬で該開裂部位を切断する工程；および該
   支持体から遊離した標識を検出する工程；を包含する方
   法。