JP5844643B2 - 液相ホモジニアスアッセイ - Google Patents

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Description

特異的結合アッセイは、物質の量の存在を検出するための試験方法であり、特異的結合パートナーの特異的な認識およびこれとの結合に基づく。イムノアッセイは、特異的結合アッセイの例であり、抗体が特定のタンパク質または化合物に結合する。この例では、抗体は、特異的結合対メンバーの一メンバーである。核酸結合アッセイは、別の型であり、相補的核酸鎖が特異的結合対である。特異的結合アッセイは、技術の広く、成長しつつある分野を占め、これは、疾患状態、感染性の生物、および乱用薬物の正確な検出を可能にする。要求される感度、ダイナミックレンジ、ロバスト性、自動化のための広い適用性および適正を有するアッセイおよびアッセイ法を考案するために、多くの研究が過去数十年にわたって捧げられている。これらの方法は、２つのカテゴリーに広く分類することができる。
ホモジニアス法は、被検体特異的結合反応を利用することによって、被検体特異的反応物と被検体非特異的反応物の間の分離ステップを必要とすることなく、検出可能なシグナルを調節し、または作り出す。ヘテロジニアス形式は、被検体が結合した、および遊離した（被検体に結合していない）検出可能な程度に標識された特異的結合パートナーの物理的な分離に依拠する。分離は一般に、極めて重要な反応物が、いくつかの型の物理的プロセス、例えば、濾過、沈殿、凝集、または磁気分離を使用することができるように、いくつかの型の固体基材上に固定されることを必要とし、一般に、遊離した検出可能な程度に標識された特定の結合パートナーを除去するために、洗浄ステップも必要とする。
化学発光シグナルの生成に依拠し、これを被検体の量に関連づけるアッセイ法は、ますます使用されてきている。そのような方法は、相対的に単純な機器を用いて実施され、それでも良好な分析特性を示すことができる。特に、被検体のために酵素標識特異的結合パートナー（ｅｎｚｙｍｅ−ｌａｂｅｌｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐａｒｔｎｅｒ）、および検出のために化学発光酵素基質を使用する方法は、広範な用途がある。一般的な標識酵素には、アルカリホスファターゼ、および西洋わさびペルオキシダーゼが含まれる。
特許文献１は、第１の膜上の増感剤または増感剤標識プローブに結合したポリヌクレオチド被検体を検出する方法を開示している。この膜は、固定化された化学発光前駆体を有する第２の膜と接触している。サンドイッチ状になった膜中の増感剤が励起されると一重項酸素が生成し、これは、化学発光前駆体と反応することによって、第２の膜上に作動可能な（ｔｒｉｇｇｅｒａｂｌｅ）化学発光化合物を生成する。作動可能な化学発光化合物は、試薬と反応することによって、第２の膜上で、被検体を検出するための化学発光を生じさせる。これらの方法は、反応物を接触させるための特異的結合反応に依拠せず、むしろ第２の膜は、試薬送達デバイスとして機能を果たす。
特許文献２は、被検体が、光感受性物質および化学発光化合物をごく接近させるような条件下で、被検体を含有する疑いのある媒質を処理するステップを含むアッセイ法を開示している。光増感剤は、光源で照射されると一重項酸素を生成し、一重項酸素は、溶液を通じて拡散し、化学発光化合物がごく近くにあるとき、化学発光化合物を活性化する。活性化された化学発光化合物は、引き続いて光を生成する。生成される光の量は、媒質中の被検体の量に関係する。一実施形態では、光増感剤または化学発光化合物の少なくとも１つは、懸濁可能な（ｓｕｓｐｅｎｄｉｂｌｅ）粒子と結合し、特異的な結合対メンバーがそれに結合する。
米国特許第６，９１１，３０５号明細書 米国特許第６，４０６，９１３号明細書
米国特許出願公開第ＵＳ２００７０２６４６６４号、および同第ＵＳ２００７０２６４６６５号は、固定化された化学発光化合物と、特異的な結合反応によって反応性の配置にされたアクチベーター化合物との反応を伴う、特異的結合対アッセイを実施するためのアッセイ法を開示している。過剰の非結合の化学発光化合物またはアクチベーターの分離または除去をまったく必要としない。これらのアッセイ形式は、従来技術のアッセイ技法と比較して、自動化における優れた操作の利便性および柔軟性をもたらす。これらの利点にもかかわらず、アッセイ設計および性能の追加の改善は、依然としてアッセイ開発者の目標となっている。本開示のアッセイ法は、改善された感度の単純なアッセイ法を提供することによって、これらの必要性に対処する。
すべての試薬が水溶液に可溶性である、被検体を含有している疑いのある試料中で、被検体を測定するための方法、試薬、キット、およびシステムが開示されている。１つのアッセイ法は、被検体を含有している疑いのある試料を、被検体が存在する場合、アクチベーターが、化学発光化合物と反応性の配置にされることによって、化学発光化合物を活性化する条件下で処理するステップを含む。試料はまた、被検体に関係しないシグナルを低減するための作用剤を用いて処理される。最後に、試料はトリガー溶液で処理され、それによって、活性化された化学発光化合物から光を生じさせる。試薬は、表面または他の固相にまったく結合していない。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
試料中の被検体についてのアッセイ法であって、
試料、
化学発光標識特異的結合パートナー、
アクチベーター標識特異的結合パートナー、および
選択的シグナル阻害剤
を任意の順序で、または同時に添加することによって、水溶液中で反応混合物を形成するステップであって、
すべての成分は、水溶液に可溶性であり、
上記化学発光標識特異的結合パートナー、および上記アクチベーター標識特異的結合パートナーは、上記試料中に存在する被検体に結合することによって、結合複合体を形成するステップと、
上記反応混合物にトリガー溶液を添加するステップであって、上記トリガー溶液は、上記反応混合物中の、上記被検体が結合した化学発光標識特異的結合パートナー、および上記被検体が結合したアクチベーター標識特異的結合パートナーの量に相関した、検出可能な化学発光シグナルを放出するステップと
を含むアッセイ法。
（項目２）
任意の順序で、または同時に反応混合物を形成するステップが、エンハンサーをさらに含む、試料中の被検体についての、項目１に記載のアッセイ法。
（項目３）
上記選択的シグナル阻害剤が、上記複合体においてではない場合の化学発光標識とアクチベーター標識との反応からのシグナルを超える、上記被検体との上記複合体における、化学発光標識とアクチベーター標識との反応によって生じるシグナルの割合を引き起こす、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
上記選択的シグナル阻害剤が、オルトまたはパラ関係に配向した少なくとも２つのヒドロキシル基を有する芳香族化合物、オルトまたはパラ関係に配向した、少なくとも１つのヒドロキシル基および１つのアミノ基を有する芳香族化合物、Ｃ−Ｃ二重結合上で置換された少なくとも２つのヒドロキシル基を有する化合物、ならびに窒素複素環式化合物からなる群から選択される、項目１から３のいずれかに記載の方法。
（項目５）
選択的シグナル阻害剤が、アスコルビン酸、イソアスコルビン酸、Ｔｒｏｌｏｘ、Ｌ−アスコルビン酸６−パルミテート、５，６−イソプロピリデン−Ｌ−アスコルビン酸、ＢＨＴ、グルタチオン、尿酸、トコフェロール、およびカテキンからなる群から選択される、項目１から４のいずれかに記載の方法。
（項目６）
上記化学発光標識特異的結合パートナーが、特異的結合対メンバーに直接または間接的に連結している化学発光標識化合物を含み、上記化学発光標識が、芳香族環状ジアシルヒドラジド、トリヒドロキシ芳香族化合物、アクリダンケテンジチオアセタール化合物、アクリダンエステル、アクリダンチオエステル、アクリダンスルホンアミド、アクリダンエノール誘導体、および式ＶＩの化合物

［式中、Ｒ１は、炭素原子１〜２０個のアルキル、炭素原子１〜２０個のアルケニル、炭素原子１〜２０個のアルキニル、炭素原子１〜２０個のアリール、および炭素原子１〜２０個のアラルキル基から選択され、そのいずれもカルボニル基、カルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ ３ − 基、ＯＳＯ ３ −２ 基、グリコシル基、ＰＯ ３ − 基、ＯＰＯ ３ −２ 基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、４級アンモニウム基、または４級ホスホニウム基から選択される１〜３個の基で置換されていてもよく、Ｘは、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、アリール、アラルキル基、１〜２０個の炭素原子を有するアルキルカルボキシル基またはアリールカルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ ３ − 基、グリコシル基、および式ＰＯ（ＯＲ’）（ＯＲ’’）のホスホリル基（式中、Ｒ’およびＲ’’は独立してＣ１〜Ｃ８アルキル、シアノアルキル、アリールおよびアラルキル基、トリアルキルシリル基、アルカリ金属陽イオン、アルカリ土類陽イオン、アンモニウムおよびトリアルキルホスホニウム陽イオンから選択される）から選択され、Ｚ１およびＺ２はそれぞれ、ＯおよびＳ原子から選択され、Ｒ２およびＲ３は独立して、水素およびＣ１〜Ｃ８アルキルから選択される］から選択される、項目１から５のいずれかに記載の方法。
（項目７）
上記化学発光標識された、固定化された特異的結合メンバーが、特異的結合メンバーに直接または間接的に連結している化学発光標識化合物を含み、上記化学発光標識が、式

［式中、

は、上記化学発光標識の上記特異的結合メンバーへの結合箇所を指定し、Ｒ １ およびＲ ２ は独立して、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアルキル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアルケニル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアルキニル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアリール、および炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアラルキル基から選択され、Ｒ １ またはＲ ２ が置換された基である場合、これは、カルボニル基、カルボキシル基、トリ（Ｃ １ 〜Ｃ ８ アルキル）シリル基、ＳＯ ３ − 基、ＯＳＯ ３ −２ 基、グリコシル基、ＰＯ ３ − 基、ＯＰＯ ３ −２ 基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＮＨ ２ 基、四級アンモニウム基、および４級ホスホニウム基から選択される１〜３個の基で置換されていてもよく、Ｒ ３ は、炭素原子１〜２０個のアルキル、炭素原子１〜２０個の置換アルキル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアルケニル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアルキニル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアリール、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアラルキル基や、フェニル、置換または非置換のベンジル基、アルコキシアルキル、カルボキシアルキルおよびアルキルスルホン酸基からなる群から選択され、Ｒ ３ が置換された基である場合、これは、カルボニル基、カルボキシル基、トリ（Ｃ １ 〜Ｃ ８ アルキル）シリル基、ＳＯ ３ − 基、ＯＳＯ ３ −２ 基、グリコシル基、ＰＯ ３ − 基、ＯＰＯ ３ −２ 基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、４級アンモニウム基、および４級ホスホニウム基から選択される１〜３個の基で置換されていてもよい］
の化合物である、項目１から６のいずれかに記載の方法。
（項目８）
上記アクチベーター標識特異的結合パートナーが、特異的結合対メンバーに直接または間接的に連結しているアクチベーター標識化合物を含み、上記アクチベーター標識が、遷移金属塩、遷移金属錯体、および酵素から選択され、上記アクチベーター標識がペルオキシダーゼ活性を有する、項目１から７のいずれかに記載の方法。
（項目９）
上記アクチベーター標識化合物がペルオキシダーゼ酵素である、項目１から８のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
上記化学発光標識特異的結合パートナーおよび上記アクチベーター標識特異的結合パートナーの少なくとも１つが、可溶性タンパク質、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラビジン、ビオチン、陽イオン化されたＢＳＡ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、可溶性合成デンドリマー、可溶性合成ポリマー、可溶性天然ポリマー、多糖、デキストラン、オリゴヌクレオチド、リポソーム、ミセル、およびベシクルから選択される補助物質を含む、項目１から９のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
上記エンハンサーが、ペルオキシダーゼ活性を有するアクチベーターの触媒ターンオーバーを促進する化合物または化合物の混合物である、項目１から１０のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
上記エンハンサーが、フェノール化合物、芳香族アミン、ベンゾオキサゾール、ヒドロキシベンゾチアゾール、アリールボロン酸、およびこれらの混合物から選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
上記トリガー溶液が過酸化物化合物を含む、項目１から１２のいずれかに記載の方法。
（項目１４）
上記トリガー溶液が、フェノール化合物、芳香族アミン、ベンゾオキサゾール、ヒドロキシベンゾチアゾール、アリールボロン酸、およびこれらの混合物から選択されるエンハンサーを含む、項目１から１３のいずれかに記載の方法。
（項目１５）
上記化学発光標識特異的結合パートナーおよび上記アクチベーター標識特異的結合パートナーがそれぞれ、上記試料中の上記被検体に結合する、項目１から１４のいずれかに記載の方法。
（項目１６）
化学発光標識特異的結合パートナーが、上記被検体の類似体に連結している化学発光標識を含み、上記被検体および上記化学発光標識類似体が、上記アクチベーター標識特異的結合パートナーとの結合を競合する、項目１から１５のいずれかに記載の方法。
（項目１７）
すべての成分が水溶液に可溶性である、項目１から１６のいずれかに記載の方法。
（項目１８）
上記成分のいずれも、粒子または他の固相に、直接または間接的にコンジュゲートされない、項目１から１７のいずれかに記載の方法。
（項目１９）
試料中の被検体を検出するためのキットであって、
上記被検体のための第１の特異的結合パートナーと；
上記第１の特異的結合パートナーにコンジュゲートされる化学発光化合物と；
上記被検体のための第２の特異的結合パートナーと；
上記第２の特異的結合パートナーにコンジュゲートされるアクチベーター化合物と；
選択的シグナル阻害剤と；
トリガー溶液と
を含むキット。
（項目２０）
すべての成分が水溶液に可溶性である、項目１９に記載のキット。
（項目２１）
上記成分のいずれも、粒子または他の固相に、直接または間接的にコンジュゲートされない、項目１９または２０に記載のキット。
（項目２２）
上記選択的シグナル阻害剤が、オルトまたはパラ関係に配向した少なくとも２つのヒドロキシル基を有する芳香族化合物、オルトまたはパラ関係に配向した、少なくとも１つのヒドロキシル基および１つのアミノ基を有する芳香族化合物、Ｃ−Ｃ二重結合上で置換された少なくとも２つのヒドロキシル基を有する化合物、ならびに窒素複素環式化合物からなる群から選択される、項目１９から２１のいずれかに記載のキット。
（項目２３）
上記化学発光化合物が、芳香族環状ジアシルヒドラジド、トリヒドロキシ芳香族化合物、アクリダンケテンジチオアセタール化合物、アクリダンエステル、アクリダンチオエステル、アクリダンスルホンアミド、アクリダンエノール誘導体、および式ＶＩの化合物

［式中、Ｒ １ は、炭素原子１〜２０個のアルキル、炭素原子１〜２０個のアルケニル、炭素原子１〜２０個のアルキニル、炭素原子１〜２０個のアリール、および炭素原子１〜２０個のアラルキル基から選択され、そのいずれもカルボニル基、カルボキシル基、トリ（Ｃ １ 〜Ｃ ８ アルキル）シリル基、ＳＯ ３ − 基、ＯＳＯ ３ −２ 基、グリコシル基、ＰＯ ３ − 基、ＯＰＯ ３ −２ 基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、４級アンモニウム基、または４級ホスホニウム基から選択される１〜３個の基で置換されていてもよく、Ｘは、Ｃ １ 〜Ｃ ８ アルキル、アリール、アラルキル基、炭素原子１〜２０個を有するアルキルカルボキシル基または炭素原子１〜２０個を有するアリールカルボキシル基、トリ（Ｃ １ 〜Ｃ ８ アルキル）シリル基、ＳＯ ３ − 基、グリコシル基、および式ＰＯ（ＯＲ’）（ＯＲ’’）のホスホリル基（式中、Ｒ’およびＲ’’は独立して、Ｃ １ 〜Ｃ ８ アルキル、シアノアルキル、アリールおよびアラルキル基、トリアルキルシリル基、アルカリ金属陽イオン、アルカリ土類陽イオン、アンモニウム陽イオンおよびトリアルキルホスホニウム陽イオンから選択される）から選択され、Ｚ １ およびＺ ２ はそれぞれ、ＯおよびＳ原子から選択され、Ｒ ２ およびＲ ３ は独立して、水素およびＣ １ 〜Ｃ ８ アルキルから選択される］
から選択される、項目１９から２２のいずれかに記載のキット。
（項目２４）
上記アクチベーター化合物が、遷移金属塩、遷移金属錯体、および酵素から選択され、上記アクチベーター標識がペルオキシダーゼ活性を有する、項目１９から２３のいずれかに記載のキット。
（項目２５）
上記トリガー溶液が、過酸化水素、尿素過酸化物、および過ホウ酸塩から選択される過酸化物を含む、項目１９から２４のいずれかに記載のキット。
（項目２６）
上記トリガー溶液が、フェノール化合物、芳香族アミン、ベンゾオキサゾール、ヒドロキシベンゾチアゾール、アリールボロン酸、およびこれらの混合物から選択されるエンハンサーを含む、項目１９から２５のいずれかに記載のキット。
（項目２７）
項目１に記載のアッセイ法を実施するためのシステムであって、
上記反応混合物中に試料を送達するための流体取り扱いシステムと、
上記反応混合物中に化学発光標識特異的結合パートナー、アクチベーター標識特異的結合パートナー、選択的シグナル阻害剤を送達するための流体取り扱いシステムと、
化学発光シグナルを放出するために、上記反応混合物中にトリガー溶液を送達するための流体取り扱いシステムと、
上記化学発光シグナルを検出するための検出システムであって、上記トリガー溶液を送達するための流体取り扱いシステムが、トリガー流体注入のときおよびトリガー流体注入後に上記化学発光シグナル放出を測定するために、上記検出システムと協調して作用する、検出システムと
を含むシステム。
定義
アルキル −− １〜２０個の炭素を含有する分枝、直鎖、または環状の炭化水素基であり、これは、Ｈ以外の１つ以上の置換基と置換されていてもよい。低級アルキルは、本明細書で使用する場合、最大８個の炭素を含有するアルキル基を指す。
被検体 −− アッセイにおいて検出されるべき試料中の物質。被検体への特異的な結合親和性を有する１つ以上の物質が、被検体を検出するのに使用される。被検体は、タンパク質、ペプチド、抗体またはハプテン（それに結合する抗体が作られ得る）とすることができる。被検体は、相補的な核酸またはオリゴヌクレオチドによって結合される核酸またはオリゴヌクレオチドであってもよい。被検体は、特異的結合対のメンバーを形成する任意の他の物質とすることができる。他の例示的な型の被検体として、ステロイドなどの薬物、ホルモン、タンパク質、糖タンパク質、ムコタンパク質、核タンパク質、リンタンパク質、乱用薬物、ビタミン、抗菌薬、抗真菌薬、抗ウイルス剤、プリン、抗腫瘍薬、アンフェタミン、アゼピン化合物、ヌクレオチド、およびプロスタグランジン、ならびにこれらの薬物のいずれかの代謝産物、農薬および農薬の代謝産物、ならびに受容体が挙げられる。被検体には、細胞、ウイルス、細菌、および真菌も含まれる。
アクチベーター：トリガーの存在下で、化学発光が生じるような化学発光化合物の活性化をもたらす、標識と呼ばれる場合もある化合物。
アクチベーター標識ｓｂｍ、またはアクチベーター特異的結合メンバーコンジュゲート − 連結している配置で少なくとも以下のものを含むアッセイミックス中の反応物：ａ）被検体のための特異的結合メンバー、およびｂ）化学発光化合物の活性化をもたらすアクチベーター化合物または標識。
抗体 −− 完全免疫グロブリン、ならびに天然断片および操作された断片を含む。
アラルキル −− アリール基で置換されたアルキル基。例には、ベンジル、ベンズヒドリル（ｂｅｎｚｙｈｙｄｒｙｌ）、トリチル、およびフェニルエチルが含まれる。
アリール −− Ｈ以外の１つ以上の置換基で置換されている場合がある、１〜５個の炭素環式芳香環を含有する芳香環含有基。
生体物質 −− 例えば、全血、抗凝固処理全血（ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｅｄ ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ）、血漿、血清、組織、動物細胞および植物細胞、細胞の内容物、ウイルス、ならびに真菌を含む。
化学発光化合物 −− 例えば、電子励起状態において形成される別の化合物に変換されることによって、光の放出を引き起こすように反応を起こす、標識と呼ばれる場合もある化合物。励起状態は、一重項励起状態であっても、三重項励起状態であってもよい。励起状態は、基底状態に緩和すると光を直接放出することができ、または放出性エネルギーアクセプター（ｅｍｉｓｓｉｖｅ ｅｎｅｒｇｙ ａｃｃｅｐｔｏｒ）に励起エネルギーを移し、それによって基底状態に戻ることができる。エネルギーアクセプターは、このプロセスにおいて励起状態に上げられ、光を放出する。
化学発光標識固定ｓｂｍ：連結している配置で少なくとも以下のものを含むアッセイミックス中の反応物：ａ）被検体のための特異的結合メンバー、ｂ）化学発光化合物または標識、およびｃ）固相。
連結している −− 本明細書で使用する場合、２つ以上の化学種または支持体材料（ｓｕｐｐｏｒｔ ｍａｔｅｒｉａｌ）が、例えば、１つ以上の共有結合によって化学的に連結され、または例えば、吸着、イオン引力、もしくは親和結合などの特異的結合プロセスによって受動的に結合されていることを示す。そのような種または物質が互いに連結されているとき、１つを超える型の連結を伴っていてもよい。
用量反応 − 試料中で測定されている被検体の量に関係する、アッセイ反応からの化学発光出力などのシグナル。
ヘテロアルキル −− 環または非末端鎖炭素原子の少なくとも１つが、Ｎ、Ｏ、またはＳから選択されるヘテロ原子で置換されているアルキル基。
ヘテロアリール −− 環炭素原子の１〜３個が、Ｎ、Ｏ、またはＳから選択されるヘテロ原子で置換されているアリール基。例示的な基には、ピリジル、ピロリル、チエニル、フリル、キノリル、およびアクリジニル（ａｃｒｉｄｎｙｌ）基が含まれる。
試料 −− アッセイにおいて測定される被検体を含有するか、または含有する疑いのある混合物。被検体として、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、ホルモン、抗体、薬物、およびステロイドが挙げられる。本開示の方法において使用することができる典型的な試料として、体液、例えば、収集された血液試料中に一般に見出されるような抗凝固処理血液であってもよい血液、血漿、血清、尿、精液、唾液、細胞培養物、組織抽出物などが挙げられる。他の型の試料として、溶媒、海水、工業用水試料、食物試料、および土壌または水などの環境試料、植物材料、真核生物、細菌、プラスミド、ウイルス、真菌、および原核生物に由来する細胞が挙げられる。
ｓｂｐ −− 特異的結合対メンバーまたは特異的結合パートナーは、別の物質（例えば、被検体）に対して特異的な結合親和性を有する、生体分子を含めた分子である。好ましくは被検体上の異なる結合部位を伴う、被検体についての２つの特異的結合パートナーは、特異的結合対と呼ばれる。
ＳＳＩＡ、（選択的シグナル阻害剤（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｓｉｇｎａｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ Ａｇｅｎｔ）） − 非特異的なシグナルまたはバックグラウンドシグナルが、アッセイ反応混合物の化学発光生成反応から生じる被検体特異的シグナルより大きい量で低減されるように、本開示のアッセイ反応混合物で提供される化合物。
固体支持体 −− アッセイ成分が固定化される表面を有する、サイズが少なくとも１ミクロンの物質。物質は、粒子、微粒子、ナノ粒子、金属コロイド、繊維、シート、ビーズ、膜、フィルター、ならびに他の支持体、例えば、試験管、マイクロウェル、チップ、ガラススライド、およびマイクロアレイなどの形態とすることができる。
可溶性の、溶解度、可溶化する − １つの物質が、別の物質と均一にブレンドする能力または傾向。本開示では、溶解度および関連用語は一般に、液体中の固体、例えば、水性緩衝液中のＳＳＩＡの特性を指す。固体は、これらがその結晶形態を失い、溶媒（例えば、液体）中に、分子的またはイオン的に溶解または分散した状態になることによって真の溶液を形成する程度に可溶性である。対照的に：１つの相が、沈殿を阻止するように安定化されていても、安定化されていなくても、バルク物質全体にわたって分布した小さい粒子（微粒子またはコロイドサイズの粒子を含む）からなる２相系。
置換された −− １つの基上の少なくとも１つの水素原子の、非水素基による置換を指す。置換される基に関して、別段の明らかな指示のない限り、複数の置換箇所が存在し得ることが意図されていることに留意すべきである。
反応容器 −− 本発明によるアッセイの試料および他の成分を入れるための容器または装置。例えば、様々なサイズおよび形状の試験管、ならびにマイクロウェルプレートが含まれる。
開示
本開示は、ホモジニアスアッセイ法、特に、化学発光標識特異的結合パートナー、およびアクチベーター標識特異的結合パートナーコンジュゲート、および被検体が結合した後の、被検体の化学発光検出を使用するホモジニアスアッセイ法を提供する。ホモジニアスアッセイおよび方法は、複合体中で結合した特異的結合パートナーから遊離の特異的結合パートナーを分離することなく実施される。
本開示は、特異的な結合対反応によって物質の存在、位置、または量を検出するための迅速で単純なホモジニアスアッセイを提供する。このアッセイは、溶液相およびトリガー溶液中で、第１の特異的結合パートナーに連結している化学発光化合物（「化学発光標識ｓｂｐ」）、第２の特異的結合パートナーにコンジュゲートされたアクチベーター化合物（「アクチベーター標識ｓｂｐ」）、選択的シグナル阻害剤（「ＳＳＩＡ」）、エンハンサーを使用することが必要である。
他のホモジニアスアッセイと対照的に、本開示の基本の実施形態では、アクチベーター標識ｓｂｐ、および化学発光標識ｓｂｐを含めたすべての反応物は、水溶液に可溶性である。実際に、本開示のアッセイは、固相を必要とせず、または利用しない。本アッセイ法はまた、特殊化されたコンストラクト、すなわち、不活化されているか、または複合体中で別の成分と結合された後に特定の検出可能なシグナルを生成することができるだけである検出可能な成分と共に設計される標識された特異的結合対メンバーを必要としないことによって、他のホモジニアスアッセイ法と異なる。本開示のアッセイシステムと対照的に、他のホモジニアスアッセイシステムは、これらがそのような特殊化された成分を必要とすることから、準備するのに複雑、困難、または高価である。本アッセイは、アッセイの設計および開発に対してより単純で、より柔軟な手法を提供し、多種多様な被検体へのより素早い適用を可能にする。本アッセイ法は、複合体中で結合した特異的結合パートナーから遊離の特異的結合パートナーを区別するために分離ステップまたはプロセスを利用しないことによって、従来のヘテロジニアスアッセイ法または分離に基づくアッセイ法と異なる。分離を回避する本アッセイ法を使用することによって、アッセイの実施が単純化され、アッセイ時間を低減することができ、自動化が促進される。
本開示のアッセイ法では、化学発光標識ｓｂｐ、アクチベーター標識ｓｂｐ、および選択的シグナル阻害剤（「ＳＳＩＡ」）が、水溶液中で試料と共に一緒にされる。一実施形態では、ｓｂｐメンバーによって認識される被検体が試料中に存在する場合、化学発光標識ｓｂｐ、およびアクチベーター標識ｓｂｐはそれぞれ、被検体の異なる範囲に結合する。被検体に関係する特定のシグナルが生成され、トリガー溶液を添加すると検出が始まる。別の実施形態では、被検体の化学発光標識類似体が、競合アッセイ形式で使用するために提供される。被検体および化学発光標識類似体が、アクチベーター標識ｓｂｐに競合的に結合する。競合的結合アッセイの一実施形態では、化学発光標識類似体とアクチベーター標識ｓｂｐの複合体を予め形成し、被検体を添加することによって標識類似体を置換することができる。別の実施形態では、化学発光標識類似体、被検体、およびアクチベーター標識ｓｂｐは、結合複合体を予め形成することなく、一緒に混合することができる。被検体に関係する特異的なシグナルが生成され、トリガー溶液を添加すると検出が始まる。このアッセイ形式において、シグナルは、被検体濃度と逆に関係する。
特異的結合パートナーが被検体に結合する結果として、アクチベーターが、トリガー溶液を添加すると化学発光を生じさせる反応を活性化するのに有効であるように、化学発光化合物に作動可能に近接した状態にされる。アクチベーターと化学発光化合物の反応は、化学発光化合物を活性化し、または変化させ、その結果、トリガー溶液を用いた処理により、さらなる反応が生じ、光の生成がもたらされる。作動可能に近接とは、化学発光化合物およびアクチベーターが、最大で物理的接触を含めて、これらが反応することができるほど十分に近いことを意味する。過剰量のアクチベーター標識特異的結合パートナーおよび／または化学発光標識特異的結合パートナーを、被検体の濃度を判定するのに必要な量に関連させてシステムに供給することができる。過剰の非結合のアクチベーター標識ｓｂｐおよび／または非結合の化学発光コンジュゲートは、トリガー溶液の添加、および検出の前に除去されず、その理由は、アッセイシステムにおけるこれらの存在および固相の欠如が、化学発光検出シグナルが被検体の量に正確に相関することを妨げないためである。非結合の標識された特異的結合パートナーは、同じ化学発光検出反応を起こすことができ、反応物は固相に連結されていないので、シグナルの被検体との有用な相関のまったくないこと、またはせいぜい、非常に限定された相関が予期される。この特徴は、従来の知識によれば、通常アッセイを失敗させる。
目ざましいことに、この問題は、本方法において選択的シグナル阻害剤を使用することによって克服された。本方法では、溶解していて固相にまったく連結しない反応物、ならびに除去されない過剰のアクチベーターおよび／または過剰の化学発光化合物の存在は、感度のよい、特異的な、被検体濃度依存性結合アッセイを実施する能力を無効にしない。この知見は、予期されておらず、または予測可能でなかった。特に、アクチベーターが酵素（これが反応する分子が溶けていて遊離しているときに、通常毎秒数百から数千の反応性変換を生じる）などの触媒である場合、広範囲の被検体濃度にわたって用慮反応性のシグナルを生成するために、結合したアクチベーターを、遊離アクチベーター反応物から有用に識別し得るとは予期されていなかった。それにもかかわらず、本発明者らは、優れた識別は、ある特定のＳＳＩＡ化合物の添加からおこることを発見した。ＳＳＩＡを使用することにより、標識された特異的結合対メンバーと被検体との複合体により共に反応性の配置にある、化学発光標識とアクチベーター標識の間の反応によって生じるシグナルと、存在するが、そのような複合体中ではない標識からのシグナルとの比は、劇的に改善される。
アッセイ感度の改善におけるＳＳＩＡの機能は、スキーム１を参照して理解される。遊離した（例えば、被検体に結合されていない）、および複合体形成した（例えば、被検体が結合した）、化学発光標識ｓｂｐ（「ＣＬＳＢＰ」）、およびアクチベーター標識特異的結合対（「ＡＬＳＢＰ」）の複数の異なる組合せが、トリガー溶液が添加されるとき、観察される化学発光シグナルにおそらく寄与することができる。４つの提案される反応スキームを以下に列挙する。
１ 結合−ＡＬＳＢＰ＋結合−ＣＬＳＢＰ→特異的シグナル
２ 結合−ＡＬＳＢＰ＋遊離−ＣＬＳＢＰ→非特異的シグナル
３ 遊離−ＡＬＳＢＰ＋結合−ＣＬＳＢＰ→非特異的シグナル
４ 遊離−ＡＬＳＢＰ＋遊離−ＣＬＳＢＰ→非特異的シグナル
上記リストに示したように、４つの異なる型の化学発光物質（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）−アクチベーター対が、反応ミックス中で反応することができる；それにもかかわらず、第１の型のみが、アッセイにおいて被検体の量に関係づけられるシグナルを生成する。ＳＳＩＡは、反応１からのシグナルの量と関連して、反応２〜４からのシグナルの量を選択的に阻害または抑制することによって、その目ざましい機能を実現する。いくつかの実施形態では、これは、４つすべての反応を低減するが、２〜４からのシグナルをはるかに多く比例して低減することによって起こり得る。
本発明の実施形態では、被検体および被検体についての特異的結合パートナー（ｓｂｐ）を伴う特異的結合反応によって、試料中の対象とする被検体をアッセイする方法であって、一方の特異的結合パートナーが、酵素、特にペルオキシダーゼ酵素などの触媒とすることができるアクチベーター化合物で標識される方法が提供される。被検体についての別の特異的結合パートナーは、化学発光化合物で標識される。標識されたｓｂｐと被検体の結合は、標識された複合体を形成する。化学発光化合物は、トリガー溶液が添加されると、アクチベーターによって誘発される化学発光反応を起こす。生じる化学発光は、試料中の被検体の量に関係する。特異的結合対反応および化学発光反応は、溶液、一般に水溶液中に溶解したすべての成分と共に実施される。重要なことには、標識された特異的結合パートナーは、標識されたｓｂｐのすべてが被検体と複合体を形成しないように、試料中の被検体の量に関して過剰量で提供される。過剰の標識されたｓｂｐは、化学発光反応に関与することができるが、反応溶液から除去されない。複合体中でなく、除去されない標識されたｓｂｐの反応性は、通常、そのようなホモジニアスアッセイが実施されることを妨げ、その理由は、被検体によって媒介される複合体形成の存在によるものではない、容認しがたく高いシグナルが生成されるためである。多くの場合では、非常に多くの「バックグラウンド」シグナルが生成され、有用な用量−反応関係をまったく引き出すことができない。化学発光シグナル生成に必要な反応成分のすべてが、結合複合体、および遊離または非結合形態の両方に存在する場合に、ホモジニアス非分離アッセイを実施することができるために、物理的な分離以外のいくつかの手段が、結合した標識されたｓｂｐと非結合の標識されたｓｂｐを識別するために提供されなければならない。本発明は、この問題に対する、長く求められていた解決策を提供し、すべての成分が溶けて存在しており、分離が実施されないアッセイ法を提供する。公知のホモジニアスアッセイ法と異なり、本方法は、特別に設計された、標識された結合パートナーであって、これらが結合複合体にされない限りシグナル生成反応を起こすことができないパートナーを必要とせず、または使用しない。
本発明によって具現されるアッセイ法において、被検体との複合体中で結合した標識されたｓｂｐメンバーの、遊離した非結合の標識されたｓｂｐメンバーからの必要な識別は、反応溶液に選択的シグナル阻害剤（ＳＳＩＡ）を供給することによって実現される。反応溶液に有効量のＳＳＩＡを添加することにより、結合した標識されたｓｂｐメンバーからのシグナル（シグナル）が、非結合の標識されたｓｂｐメンバーからの任意のシグナル寄与を含むバックグラウンドシグナルを、ＳＳＩＡの非存在下で起こるより有意に大きい程度に上回る。シグナルとバックグラウンドの関係のこの改善が実現されるとき、より高いレベルの検出感度を含めたアッセイの有用性が増大する。
一実施形態では、アッセイ法、特に、結合アッセイ法であって、化学発光標識ｓｂｐおよびアクチベーター標識ｓｂｐが、被検体の存在による少なくとも１つの特異的結合反応を介して、作動可能に近接され、結合したアクチベーター標識ｓｂｐが反応を活性化し、トリガー溶液を添加すると化学発光を生成して、被検体の存在、位置、または量を検出するアッセイ法が提供される。
一実施形態では、本方法はまた、被検体と特異的に連結している量に対して大過剰で存在する非結合のアクチベーター標識ｓｂｐを除去しないことにおいて、従来の試験方法と異なる。過剰の非結合のアクチベーターアクチベーター標識ｓｂｐの洗浄および分離をまったく必要としない。別の実施形態では、本方法は、被検体と特異的に連結している量に対して過剰に存在する非結合の化学発光コンジュゲートも除去しない。過剰の非結合の化学発光コンジュゲートの洗浄および分離をまったく必要としない。
アッセイ成分、すなわち、被検体を含有する試料、アクチベーター標識ｓｂｐ、化学発光標識ｓｂｐ、選択的シグナル阻害剤、およびトリガー溶液は、洗浄および分離をすることなく、試験容器に順次添加することができ、発光を読むことができる。最後に添加されるトリガー溶液以外のアッセイ成分は、試験容器に任意の順序または組合せで添加することができる。一実施形態では、試料およびアクチベーター標識ｓｂｐを、予め混合し、化学発光標識ｓｂｐの入った試験容器に添加した後、トリガー溶液を導入することができる。
化学発光基質、および酵素標識コンジュゲートを使用する従来のアッセイは、標識酵素の量に対して大過剰で化学発光基質を供給する。しばしば、基質／酵素のモル比は、１０の９乗、すなわち、１０億倍過剰を超える場合がある。連続的な酵素ターンオーバーのために基質の適切な供給を確実にし、このプロセスがアッセイ法において適切な検出感度を保証するために、そのような非常に大過剰の化学発光化合物を供給することが、従来のアッセイにおいて必要であると考えられている。出願人らは、化学発光化合物とアクチベーターの比を数桁低減する高感度のアッセイ法を考案することが可能であることを見出した。この点において、本明細書に記載されるこれらの方法は、公知の酵素連結アッセイ法と基本的に異なる。
上記したように、かつ以下に記載される例示的なアッセイにおいて実証されるように、洗浄ステップおよび分離ステップの排除は、アッセイプロトコールの設計を単純化する機会をもたらす。操作ステップの数の低減は、アッセイ時間、不完全な洗浄に由来するアッセイ間ばらつき、および費用を減少させる。同時に、これは、自動化および小型化に付帯的な固有の利点のすべてを伴って、アッセイの実行を自動化および小型化する能力を増強する。
本方法によって実施されるアッセイは、対象とする被検体を特異的に結合または捕捉するための特異的結合パートナー（「ｓｂｐ」）を提供するステップを含む。特異的結合パートナーは、検出される被検体に直接または間接的に結合することができる。特異的結合パートナーは、直接または間接的にそれに結合した化学発光標識化化合物（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）と共にさらに提供される。化学発光標識は、以下により詳細に記載されるように、いくつかの異なる方法で提供することもできる。各変形において、化学発光標識は、「化学発光標識ｓｂｐ」の水溶解度を維持する様式で、特異的結合パートナーと直接または間接的に、安定に、または不可逆的に連結される。「不可逆的に」とは、化学発光標識が、意図されたアッセイにおける使用条件下で、化学発光標識ｓｂｐから実質的に除去されないことを意図する。受動的な、または非共有結合性の結合も企図されており、ただし、標識は、使用条件下で化学発光標識ｓｂｐ上に安定に結合および保持される。
このアッセイは、被検体を有するアクチベーター標識ｓｂｐ、および被検体のための化学発光標識ｓｂｐが連結している特異的結合パートナーを提供するステップ、ならびにこれらの成分に特異的な結合複合体を形成させるステップをさらに含む。試料、化学発光標識ｓｂｐ、およびアクチベーターアクチベーター標識ｓｂｐは、任意の順序もしくは任意の組合せで順次もしくは同時に別個に添加することができ、または予め混合し、組合せとして添加することができる。一般に、被検体を標識されたｓｂｐメンバーに結合させるのにある時間の期間が必要となる。これは、結合反応を起こさせるのに任意選択の遅延時間によって結合成分が順次添加される、いくつかの実施形態において実現することができる。
結合複合体が形成された後、トリガー溶液が添加されることによって、被検体を検出するための化学発光が生じ、化学発光が検出される。一般に、ピーク光強度レベル、または光強度が固定時間間隔について積分され、または全積分光強度が測定される。生成される光の量は、反応容器内に含まれる試料中に存在する被検体の量に関係する。光の量は、一般に公知の方法に従って較正曲線を構築することによって、被検体の数値的量を決定するのに使用することができる。発光が、トリガー溶液を添加すると急速に引き続いて起こる場合、測定の開始を、適当な注射器による添加に対して機械的に調節し、または検出器にすでに曝された反応容器を用いて添加を実施することが望ましい。反応物の最適量、体積、希釈度、特異的結合対反応のためのインキュベーション時間、反応物の濃度などは、日常の実験によって、特異的結合アッセイを実施する方法に対する標準的な論文を参照することによって、および以下に詳細に記載される具体例を指針として使用して容易に決定することができる。
本方法およびアッセイにおいて使用されるｓｂｐメンバーの濃度または量は、被検体濃度、所望の結合の速度／アッセイ時間、費用、およびコンジュゲートの利用可能性、ｓｂｐメンバーの非特異的結合の程度などの要因に依存する。通常、ｓｂｐメンバーは、最小の予測される被検体濃度に少なくとも等しく、より通常には、少なくとも予期される最高の被検体濃度またはそれより高い濃度で存在することになり、非競合的アッセイについては、濃度は、最高被検体濃度の１０倍〜１０６倍である場合がある。通常、ｓｂｐメンバーの濃度は、１０−４Ｍ未満、好ましくは１０−６Ｍ未満、しばしば１０−１１〜１０−７Ｍの間である。ｓｂｐメンバーと連結されるアクチベーターまたは化学発光化合物の量は、通常、ｓｂｐメンバー当たり少なくとも１つの分子となり、１０２以上もの多さとなり得る。多くの実施形態では、ｓｂｐメンバーと連結されるアクチベーターまたは化学発光化合物の量は、１〜２０分子である。アクチベーターと化学発光化合物との比の例および他の比は、実施例に示されている。
化学発光標識ｓｂｐ
この方法は、第１の特異的結合パートナーと連結される化学発光化合物（「化学発光標識ｓｂｐ」）の使用を必要とする。
本開示のアッセイおよび方法では、化学発光標識ｓｂｐは、水溶液に可溶性である。本開示のアッセイおよび方法では、化学発光標識化化合物は、他の親和性アッセイおよび方法において見出されるように、固体表面、例えば、粒子、マルチウェルプレート、または膜、フィルター、試験管、ディップスティック、またはピペットチップなどに固定化されない。
化学発光標識ｓｂｐは、化学発光標識化合物、および特異的結合対のメンバーを含む。
いくつかの実施形態では、化学発光標識ｓｂｐは、１つ以上の化学発光標識化合物を含む。
いくつかの実施形態では、化学発光標識ｓｂｐは、特異的結合対のメンバーの１つ以上のコピーを含む。
いくつかの実施形態では、化学発光標識化合物は、特異的結合対のメンバーの１つ以上のコピーに直接連結される。いくつかの他の実施形態では、１つ以上の化学発光標識化合物が、特異的結合対のメンバーの１つのコピーに直接連結される。直接標識された、とも呼ばれる直接連結には、共有結合相互作用、イオン結合相互作用、および疎水性相互作用が含まれる。一実施形態では、化学発光標識は、被検体のための特異的結合パートナーに共有結合でつながれる。
いくつかの実施形態では、化学発光標識化合物は、特異的結合対のメンバーの１つ以上のコピーに間接的に連結される。いくつかの他の実施形態では、１つ以上の化学発光標識化合物が、特異的結合対のメンバーの１つのコピーに間接的に連結される。間接的な連結は、化学発光標識化合物および特異的結合対のメンバーに加えて、１つ以上の補助物質（ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）を含む。
補助物質は、水溶液に可溶性である。１つ以上の補助物質を含む化学発光標識ｓｂｐは、水溶液に可溶性である。
様々な実施形態では、補助物質として、可溶性タンパク質（例えば、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラビジン、ビオチン、陽イオン化されたＢＳＡ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、キーホールリンペットヘモシニアン「ＫＬＨ」、天然であるかまたは操作された免疫グロブリンおよびその断片または部分、可溶性合成デンドリマー（例えば、ＰＡＭＡＭ）、可溶性合成ポリマー（例えば、ポリアクリル酸「ＰＡＡ」）、可溶性天然ポリマー（例えば、官能性デキストラン、アミノ−デキストランなどの多糖、オリゴヌクレオチド、タンパク質、およびこれらの任意の組合せ）、リポソーム、ミセル、およびベシクル、ならびに可溶性合成ポリマー、可溶性天然ポリマー、および可溶性タンパク質の１つ以上の組合せ（例えば、ＩｇＧ／ビオチン／ストレプトアビジン／ＰＡＡ）が挙げられる。水溶液に可溶性であり、１つ以上の化学発光標識化合物および／またはｓｂｐへの結合のために機能化可能である他の補助物質も、開示される方法およびアッセイにおける使用が想定されている。
いくつかの実施形態では、化学発光標識が共有結合でつながれる補助物質は、タンパク質またはペプチドである。例示的な可溶性タンパク質として、アルブミン、アビジン類、ストレプトアビジン、アビジン、α−ヘリックスタンパク質、ｆｏｓ、ｊｕｎ、キーホールリンペットヘモシニアン「ＫＬＨ」、天然であるかまたは操作された免疫グロブリンおよびその断片または部分、ならびにこれらの任意の組合せが挙げられる。一実施形態では、補助物質は、ＩｇＧなどのユニバーサル抗体であり、化学発光標識は、被検体特異的な捕捉抗体に対してその結合親和性を維持する様式でユニバーサル抗体に共有結合でつながれる。別の化学発光標識ｓｂｐの実施形態では、化学発光化合物は、ビオチン−ストレプトアビジンまたはビオチン−ニュートラビジン結合を介して１つ以上のｓｂｐに連結される。ストレプトアビジン−ビオチン、または等価な結合を組み込んでいる化学発光標識ｓｂｐは、例えば、ビオチンコンジュゲートとして特異的結合パートナーを提供することができ、この場合、化学発光化合物は、ストレプトアビジンコンジュゲートである。ビオチン−ストレプトアビジンおよび同様の結合の代替の配置は、一般に公知である。あるいは、ストレプトアビジン−ビオチン、または等価な結合を組み込んでいる化学発光標識ｓｂｐは、ｓｂｐまたは化学発光化合物の、１つ以上の追加の補助物質への結合（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）のための結合（ｌｉｎｋａｇｅ）を利用することができる。
別の実施形態では、化学発光標識が共有結合でつながれる補助物質は、合成ポリマーである。化学発光化合物を連結するのにポリマー助剤を使用するアッセイ形式は、ビオチン−アビジンコンジュゲートとして、共有結合によって、または種特異的な免疫グロブリンなどのユニバーサル捕捉成分を通じた間接的な結合によって、被検体についての特異的結合パートナーに連結することができる。
選ばれた実施形態では、化学発光標識ｓｂｐは、多糖または可溶性自己集合タンパク質から選択される補助物質を含む。いくつかの実施形態では、化学発光標識ｓｂｐは、アミノ−デキストランまたはカルボキシル−デキストランなどの多糖を含む。いくつかのそのような実施形態では、アミノ−デキストランまたはカルボキシル−デキストランなどの多糖は、１０ｋＤａ〜５００ｋＤａの範囲内の平均分子量を有し、他の実施形態では、２５〜１５０ｋＤａの範囲内の平均分子量を有する。さらなる実施形態では、化学発光標識ｓｂｐは、５０〜１００ｋＤａの範囲内の平均分子量を有する、アミノ−デキストランまたはカルボキシル−デキストランなどの多糖を含む。なおさらなる実施形態では、化学発光標識ｓｂｐは、７０ｋＤａの平均分子量を有する、アミノ−デキストランまたはカルボキシル−デキストランなどの多糖を含む。
多くの実施形態では、化学発光標識ｓｂｐの平均直径は、５ｎＭ〜８００ｎＭの包含範囲内である。可溶性タンパク質、または他の可溶性天然ポリマー（ｐｌｙｍｅｒ）もしくは可溶性合成ポリマー、あるいはこれらの組合せを組み込む、選ばれた実施形態では、化学発光標識ｓｂｐの平均直径は、２００ｎＭ〜６００ｎＭの包含範囲内であり、いくつかのさらなる実施形態では、３００ｎＭ〜５００ｎＭの包含範囲内である。
アクチベーター標識ｓｂｐ
この方法は、第１の特異的結合パートナーに連結しているアクチベーター化合物（「アクチベーター標識ｓｂｐ」）の使用を必要とする。
本開示のアッセイおよび方法では、アクチベーター標識ｓｂｐは、水溶液に可溶性である。本開示のアッセイおよび方法では、アクチベーター化合物は、他の親和性アッセイおよび方法において見出されるような、固体表面、例えば、粒子、マルチウェルプレート、または膜、フィルター、試験管、ディップスティック、またはピペットチップなどに固定化されない。
アクチベーター標識ｓｂｐは、アクチベーター標識化合物、および特異的結合対のメンバーを含む。
いくつかの実施形態では、アクチベーター標識ｓｂｐは、１つ以上のアクチベーター化合物を含む。
いくつかの実施形態では、アクチベーター標識ｓｂｐは、特異的結合対のメンバーの１つ以上のコピーを含む。
いくつかの実施形態では、アクチベーター化合物は、特異的結合対のメンバーの１つ以上のコピーに直接連結される。いくつかの他の実施形態では、１つ以上のアクチベーター標識化合物が、特異的結合対のメンバーの１つのコピーに直接連結される。直接標識された、とも呼ばれる直接連結には、共有結合相互作用、イオン結合相互作用、および疎水性相互作用が含まれる。一実施形態では、アクチベーター標識は、被検体のための特異的結合パートナーに共有結合でつながれる。
いくつかの実施形態では、アクチベーター化合物は、特異的結合対のメンバーの１つ以上のコピーに間接的に連結される。いくつかの他の実施形態では、１つ以上のアクチベーター化合物が、特異的結合対のメンバーの１つのコピーに間接的に連結される。間接的な連結は、化学発光標識化合物および特異的結合対のメンバーに加えて、補助物質を含む。
補助物質は一般に、水溶液に可溶性である。１つ以上の補助物質を含むアクチベーター標識ｓｂｐは、水溶液に可溶性である。様々な実施形態では、補助物質として、可溶性タンパク質（例えば、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラビジン、ビオチン、陽イオン化されたＢＳＡ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、キーホールリンペットヘモシニアン「ＫＬＨ」、天然であるかまたは操作された免疫グロブリンおよびその断片または部分、ならびにこれらの任意の組合せ）、可溶性合成デンドリマー（例えば、ＰＡＭＡＭ）、可溶性合成ポリマー（例えば、ポリアクリル酸「ＰＡＡ」）、可溶性天然ポリマー（例えば、デキストランなどの多糖、オリゴヌクレオチド、タンパク質、およびこれらの任意の組合せ）、リポソーム、ミセル、およびベシクル、ならびに可溶性合成ポリマー、可溶性天然ポリマー、および可溶性タンパク質の１つ以上の組合せ（例えば、ＩｇＧ／ビオチン／ストレプトアビジン／ＰＡＡ）が挙げられる。水溶液に可溶性であり、１つ以上のアクチベーター標識化合物および／またはｓｂｐへの結合のために機能化可能である他の補助物質も、開示される方法およびアッセイにおける使用が想定されている。
いくつかの実施形態では、アクチベーター標識が共有結合でつながれる補助物質は、タンパク質またはペプチドである。例示的な可溶性タンパク質として、アルブミン、アビジン類、ストレプトアビジン、アビジン、α−ヘリックスタンパク質、ｆｏｓ、ｊｕｎ、キーホールリンペットヘモシニアン「ＫＬＨ」、天然であるかまたは操作された免疫グロブリンおよびその断片または部分、ならびにこれらの任意の組合せが挙げられる。一実施形態では、補助物質は、ＩｇＧなどのユニバーサル抗体であり、アクチベーター標識は、被検体特異的な捕捉抗体に対してその結合親和性を維持する様式でユニバーサル抗体に共有結合でつながれる。別のアクチベーター標識ｓｂｐの実施形態では、アクチベーター化合物は、ビオチン−ストレプトアビジン結合を介して１つ以上のｓｂｐに連結される。ストレプトアビジン−ビオチン、または等価な結合を組み込んでいるアクチベーター標識ｓｂｐは、例えば、ビオチンコンジュゲートとして特異的結合パートナーを提供することができ、この場合、アクチベーター化合物は、ストレプトアビジンコンジュゲートである。ビオチン−ストレプトアビジンおよび同様の結合の代替の配置は、一般に公知である。あるいは、ストレプトアビジン−ビオチン、または等価な結合を組み込んでいるアクチベーター標識ｓｂｐは、ｓｂｐまたはアクチベーター化合物の、１つ以上の追加の補助物質への結合のための結合を利用することができる。
別の実施形態では、アクチベーター標識が共有結合でつながれる補助物質は、合成ポリマーである。アクチベーター化合物を連結するのにポリマー助剤を使用するアッセイ形式は、共有結合、非共有結合によって、または種特異的な免疫グロブリン、またはビオチン−アビジンコンジュゲーションなどのユニバーサル捕捉成分を通じた間接的な結合によって、被検体についての特異的結合パートナーに連結することができる。
選ばれた実施形態では、アクチベーター標識ｓｂｐは、多糖または可溶性自己集合タンパク質から選択される補助物質を含む。いくつかの実施形態では、アクチベーター標識ｓｂｐは、アミノ−デキストランまたはカルボキシル−デキストランなどの多糖を含む。いくつかのそのような実施形態では、アミノ−デキストランまたはカルボキシル−デキストランなどの多糖は、１０ｋＤａ〜５００ｋＤａの範囲内の平均分子量を有し、または他の実施形態では、２５ｋＤａ〜１５０ｋＤａの範囲内の平均分子量を有する。さらなる実施形態では、化学発光標識ｓｂｐは、５０〜１００ｋＤａの範囲内の平均分子量を有する、アミノ−デキストランまたはカルボキシル−デキストランなどの多糖を含む。なおさらなる実施形態では、化学発光標識ｓｂｐは、７０ｋＤａの平均分子量を有する、アミノ−デキストランまたはカルボキシル−デキストランなどの多糖を含む。
ほとんどの実施形態では、アクチベーター標識ｓｂｐの平均分子量は、２００ｋＤａ〜３０００ｋＤａの包含範囲内である。いくつかの実施形態では、アクチベーター標識特異的結合対の平均分子量は一般に、３５０ｋＤａ〜１５００ｋＤａである。
アクチベーター標識
アクチベーター化合物は、アクチベーター標識ｓｂｐの一部を形成し、これは、アクチベーター−特異的結合パートナーコンジュゲートと呼ばれる場合もある。アクチベーター標識ｓｂｐは、二重の機能を果たす：１）直接に、または中間の特異的結合パートナーを通じて、特異的結合パートナー部分を通じて、アッセイにおける被検体の量に比例した特異的結合反応を起こし、かつ２）アクチベーター部分を通じて化学発光化合物を活性化する。アクチベーター標識ｓｂｐのアクチベーター部分は、トリガー溶液の存在下で化学発光が生じるように、化学発光化合物の活性化を起こす化合物である。アクチベーター標識として機能を果たすことができる化合物には、遷移金属の塩および錯体ならびに酵素を含めたペルオキシダーゼ様活性を有する化合物、特に遷移金属含有酵素、最も特に、ペルオキシダーゼ酵素が含まれる。アクチベーター化合物において有用な遷移金属として、周期表の３〜１２族のもの、特に、鉄、銅、コバルト、亜鉛、マンガン、クロム、およびバナジウムが挙げられる。
化学発光反応を起こすことができるペルオキシダーゼ酵素として、例えば、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、バナジウムブロモペルオキシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、真菌ペルオキシダーゼ類、リグニンペルオキシダーゼ、Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ ｒａｍｏｓｕｓに由来するペルオキシダーゼ、白色腐朽菌（ｗｈｉｔｅ ｒｏｔ ｆｕｎｇｉ）で産生されるＭｎ依存性ペルオキシダーゼ、およびダイズペルオキシダーゼが挙げられる。ｈｅｍｅなどの鉄錯体、およびＭｎ−ＴＰＰＳ４を含めた、酵素でないが、ペルオキシダーゼ様活性を有する他のペルオキシダーゼ模倣化合物も公知である（Ｙ．−Ｘ． Ｃｉら、Ｍｉｋｒｏｃｈｅｍ． Ｊ．、５２巻、２５７〜６２頁（１９９５年））。これらは、基質の化学発光酸化を触媒し、本明細書で使用する場合、ペルオキシダーゼの意味の範囲内であると明確に見なされる。
いくつかの実施形態では、アクチベーター標識ｓｂｐは、化学発光を生じさせるための方法において、ペルオキシダーゼおよび生体分子のコンジュゲートまたは複合体を含むことができ、唯一の条件は、コンジュゲートがペルオキシダーゼ活性またはペルオキシダーゼ様活性を示すことである。ペルオキシダーゼの１つ以上の分子にコンジュゲートすることができる生体分子として、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体断片、抗体−ＤＮＡキメラ、抗原、ハプテン、タンパク質、ペプチド、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、およびビオチンが挙げられる。ペルオキシダーゼを含む、または組み込んでいる複合体、例えば、生体分子への結合に関して機能化されているリポソーム、ミセル、ベシクル、およびポリマーなども、本開示の方法において使用することができる。
選択的シグナル阻害剤（ＳＳＩＡ）
本発明の選択的シグナル阻害剤は、遊離した、および／または被検体が結合した化学発光標識ｓｂｐ、遊離した、および／または被検体が結合したアクチベーター標識ｓｂｐ、エンハンサー、ならびにトリガー溶液を含むアッセイ反応混合物中に含められる場合、被検体が結合した標識ｓｂｐメンバーから得られるシグナルが、ＳＳＩＡの非存在下で起こるより、有意に大きい程度でバックグラウンドシグナルを超えるような化合物である。
１つ以上の選択的シグナル阻害剤が、１０−６Ｍ〜１０−１Ｍの間、しばしば１０−６Ｍ〜１０−２Ｍの間、多くの場合１０−５Ｍ〜１０−３Ｍの間、時折１０−５Ｍ〜１０−４Ｍの間の濃度で、反応方法において存在する。いくつかの実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、５×１０−６Ｍ〜５×１０−４Ｍの間で、本方法による反応において存在する。なおさらなる実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、５×１０−５Ｍ〜５×１０−４Ｍの間で、本方法による反応において存在する。
選択的シグナル阻害剤は、反応溶液中で意図されるより高い濃度で、別個の試薬または溶液として供給することができる。この実施形態では、測定された量の作業溶液（ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）が反応溶液中に投与されることによって、所望の反応濃度が実現される。別の実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、標識ｓｂｐメンバーの１つ以上を含有する溶液中に合わされる。別の実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、トリガー溶液の成分として提供される。
選択的シグナル阻害剤が、シグナル：バックグラウンド比を改善する程度は、他の要因の中でも、化合物の素性、およびこれが使用される濃度に応じて変化する。この程度は、改善係数の観点からその枠を決めることができ、この観点では、アッセイが選択的シグナル阻害剤を用いて実施される、特定の被検体濃度でのアッセイのシグナル：バックグラウンド比が、選択的シグナル阻害剤を用いない、同じ被検体濃度でのアッセイのシグナル：バックグラウンド比と比較される。改善係数＞１は、改善されたアッセイの尺度、および選択的シグナル阻害剤の有益な効果の証拠である。本発明の実施形態では、少なくとも５など、および少なくとも１０、または少なくとも５０を含めた少なくとも２の改善係数が実現される。以下の実施例を参照すると、改善係数は、被検体濃度の関数としてアッセイ内で変化し得ることが分かる。例えば、改善係数は、被検体濃度が増大するにつれて増大する場合がある。別の実施形態では、濃度間の改善係数の変動は、より直線的な較正曲線、すなわち、化学発光強度対被検体濃度のプロットをもたらす場合がある。
以下の表は、選択的シグナル阻害剤として有効に機能することができる化合物を、限定することなく列挙する。明確に列挙されていない追加の化合物は、実施例に記載されるアッセイおよびスクリーニング検査方法の通常の適用によるものを含めて、本開示の技法を使用して見出すことができる。
いくつかの他の実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、ジアルキルヒドロキシアミンから選択される。
いくつかの実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、オルトまたはパラ関係に配向した少なくとも２つのヒドロキシル基を有する芳香族化合物から選択される。例示的な化合物を表２に示す。
いくつかの他の実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、オルトまたはパラ関係に配向した、少なくとも１つのヒドロキシル基および１つのアミノ基を有する芳香族化合物から選択される。例示的な化合物を表３に示す。
さらに他の実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、エンジオールとしても公知である、Ｃ−Ｃ二重結合上で置換された少なくとも２つのヒドロキシル基を有する化合物から選択される。例示的な化合物を表４に示す。
一実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、窒素複素環式化合物から選択される。例示的な化合物を表５に示す。
一実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、過酸化物と接触すると活性ＳＳＩＡに変換可能な化合物として、マスクされた形態で供給される。適当なマスクされたＳＳＩＡ化合物は、例えば、ヒドロキシル置換またはアミノ置換アリールボロン酸化合物から選択される。例示的な化合物を表６に示す。
一実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、表７に示される化合物から選択される。
様々な実施形態では、上記選択的シグナル阻害剤の１つ以上が、本開示のアッセイ法、アッセイ、またはキットにおいて組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、１０倍の作業溶液濃度の水溶液中で溶解性を有する。作業溶液は、濃縮水溶液の一部が反応混合物に添加されることによって、トリガー溶液を添加した後に必要とされる最終濃度を与えるような濃縮水溶液として定義される。
選択的シグナル阻害剤の作業溶液のための適当な水溶液は、以下の追加の成分のうちの１つ以上を含む：塩、生物学的緩衝液、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、エタノール、メタノール、グリコールを含めたアルコール、および界面活性剤。いくつかの実施形態では、水溶液には、Ｔｒｉｓ緩衝水溶液、２５％のエタノール／７５％のＴｒｉｓ緩衝水溶液、２５％のエタノール／７５％の水性Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（１％）、１０％の０．１ＮのＮａＯＨ／９０％のＴｒｉｓ緩衝水溶液が含まれる。１つの例のＴｒｉｓ緩衝水溶液は、ＴＲＩＳ緩衝食塩水、界面活性剤、＜０．１％のアジ化ナトリウム、および０．１％のＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ）からなり、緩衝液ＩＩと本明細書で呼ばれ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｂｒｅａ ＣＡから市販されている。
トリガー溶液＆エンハンサー
トリガー溶液は、化学発光に必要な励起状態の化合物を生成するのに必要な反応物を提供する。反応物は、化学発光標識と直接反応することによって化学発光反応を実施するのに必要なものとすることができる。これは、この機能の代わりに、またはこの機能に加えて、アクチベーター化合物の作用を促進する機能を果たすことができる。これは、例えば、アクチベーターがペルオキシダーゼ酵素である場合、そのようになる。一実施形態では、トリガー溶液は、過酸化物化合物を含む。過酸化物成分は、ペルオキシダーゼと反応することができる、任意の過酸化物またはアルキルヒドロペルオキシドである。例示的な過酸化物には、過酸化水素、尿素過酸化物、および過ホウ酸塩が含まれる。トリガー溶液中に使用される過酸化物の濃度は、一般に約１０−８Ｍ〜約３Ｍ、より一般に約１０−３Ｍ〜約１０−１Ｍという値の範囲内で変更することができる。別の実施形態では、トリガー溶液は、過酸化物、およびペルオキシダーゼ活性を有するアクチベーターの触媒ターンオーバーを促進するエンハンサー化合物を含む。
代表的な実施形態では、アクチベーターとしてのペルオキシダーゼコンジュゲート、被検体のアクリダン標識特異的結合パートナー（ここで、アクリダン標識は、以下に記載されるように、特異的結合パートナーをアクリダン標識化化合物と反応させることによって提供される）、および過酸化水素を含むトリガー溶液が使用される。過酸化物は、ペルオキシダーゼと反応することによって、おそらく、酵素の活性部位における鉄の酸化状態を、異なる酸化状態に変化させる。この変化した状態の酵素は、エンハンサー分子と反応することによって、酵素の触媒ターンオーバーを促進する。エンハンサーまたは酵素から形成される反応性種は、酵素に近接して維持されたアクリダン標識と反応する。化学発光反応は、化学発光化合物から形成される中間体と過酸化物とのさらなる反応を含み、最終反応生成物および光を生成する。
ある特定のエンハンサー化合物をトリガー溶液中に取り込むことにより、酵素の反応性が促進され、もしくはバックグラウンドシグナルが低減され、または両方の機能が実施される。これらのエンハンサーの中に含まれるのは、ペルオキシダーゼ反応を増強することが公知であるフェノール化合物および芳香族アミンである。米国特許第５，１７１，６６８号に開示されているような、フェノキサジン化合物またはフェノチアジン化合物の、インドフェノール化合物またはインドアニリン化合物との混合物を、本発明においてエンハンサーとして使用することができる。置換ヒドロキシベンゾオキサゾール、２−ヒドロキシ−９−フルオレノン、および米国特許第５，２０６，１４９号に開示されているような化合物Ｉ、
も、本発明においてエンハンサーとして使用することができる。米国特許第５，５１２，４５１号に開示されているような置換および非置換のアリールボロン酸化合物、ならびにこれらのエステルおよびアンヒドリド誘導体も、本開示において有用なエンハンサーの範囲内であると見なされる。例示的なフェノールエンハンサーとして、それだけに限らないが、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸、ｐ−イミダゾリルフェノール、アセトアミノフェン、２，４−ジクロロフェノール、２−ナフトール、および６−ブロモ−２−ナフトールが挙げられる。
上記したクラスからの１つを超えるエンハンサーの混合物も使用することができる。
本発明を実施するのに有用な追加のエンハンサー、および誘導体には、ヒドロキシベンゾチアゾール化合物、ならびに以下の式ＩＩおよびＩＩＩのフェノキサジン化合物およびフェノチアジン化合物が含まれる。
フェノキサジンエンハンサーおよびフェノチアジンエンハンサーの窒素原子上で置換されたＲ基には、１〜８炭素原子のアルキル、およびスルホン酸塩またはカルボン酸塩の基で置換された１〜８炭素原子のアルキルが含まれる。例示的なエンハンサーとして、３−（Ｎ−フェノチアジニル）−プロパンスルホン酸塩、３−（Ｎ−フェノキサジニル）プロパンスルホン酸塩、４−（Ｎ−フェノキサジニル）ブタンスルホン酸塩、５−（Ｎ−フェノキサジニル）−ペンタン酸塩、およびＮ−メチルフェノキサジン、ならびに関連同族体が挙げられる。トリガー溶液中で使用されるエンハンサーの濃度は、一般に約１０−５Ｍ〜約１０−１Ｍ、より一般に約１０−４Ｍ〜約１０−２Ｍという値の範囲内で変更することができる。
本開示の検出反応は、一般に水性緩衝液であるトリガー溶液を用いて実施される。適当な緩衝液には、化学発光反応の進行を可能にする環境を維持することができる、任意の一般に使用される緩衝液が含まれる。一般に、トリガー溶液は、約５〜約１０．５の範囲内のｐＨを有する。例示的な緩衝液として、ホスフェート、ボレート、アセテート、カーボネート、ｔｒｉｓ（ヒドロキシ−メチルアミノ）メタン［ｔｒｉｓ］、グリシン、トリシン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、ジエタノールアミン、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳなどが挙げられる。
トリガー溶液は、光生成反応の発光効率を増強し、またはアッセイのシグナル／ノイズ比を改善するために、１つ以上の界面活性剤またはポリマー界面活性剤も含有することができる。本開示を実施するのに有用な非イオン性界面活性剤には、例として、ポリオキシエチレン化（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎａｔｅｄ）アルキルフェノール、ポリオキシエチレン化アルコール、ポリオキシエチレン化エーテル、およびポリオキシエチレン化ソルビトールエステルが含まれる。ＣＴＡＢなどの４級アンモニウム塩化合物、および４級ホスホニウム塩化合物を含めた、モノマーの陽イオン性界面活性剤を使用することができる。４級アンモニウム塩およびホスホニウム塩の基を含むものを含めた、ポリマーの陽イオン性界面活性剤も、この目的のために使用することができる。
一実施形態では、トリガー溶液は、水性緩衝液、約１０−５Ｍ〜約１Ｍの濃度の過酸化物、および約１０−５Ｍ〜約１０−１Ｍの濃度のエンハンサーを含む組成物である。この組成物は、界面活性剤、金属キレート化剤、および微生物混入を予防し、または最小限にするための保存剤を含めた添加剤を必要に応じて含有することができる。トリガー溶液のｐＨは一般に、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０の間である。いくつかの実施形態では、ｐＨは、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．５であり、さらなる実施形態では、ｐＨは、ｐＨ７．０〜８．０の範囲内である。
特異的結合対
特異的結合対メンバーまたは特異的結合パートナー（ｓｂｐ）は、別の物質に対して特異的な結合親和性を有する、生体分子を含めた分子として本明細書で定義される。特異的結合対メンバーとして、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体断片、抗体−ＤＮＡキメラ、抗原、ハプテン、タンパク質、ペプチド、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、およびビオチンが挙げられる。特異的結合対の各特異的結合対メンバーは、同じ物質（例えば、被検体）に対して特異的な結合親和性を有する。各特異的結合対メンバーは、少なくとも、被検体上の同じまたは重複結合部位を競合するべきでないという点で、特異的結合対中の他の特異的結合対メンバーと非同一である。例えば、特異的結合対が２つの抗体からなる場合、各ｓｂｐ抗体は、被検体上に、異なる、非競合エピトープを有する。
特異的な結合物質として、限定することなく、抗体および抗体断片、抗原、ハプテンおよびその同族抗体、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、プロテインＡおよびＩｇＧ、相補的核酸またはオリゴヌクレオチド、レクチンおよび炭水化物が挙げられる。
上記の抗原−抗体、ハプテン−抗体、または抗体−抗体対に加えて、特異的結合対として、相補性のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチン、ホルモン−受容体、レクチン−炭水化物、ＩｇＧプロテインＡ、結合タンパク質−受容体、核酸−核酸結合タンパク質、および核酸−抗核酸抗体も挙げることができる。薬物候補のスクリーニングにおいて使用される受容体アッセイは、本方法についての使用の別の範囲である。これらの結合対のいずれも、上記した３成分サンドイッチ技法または２成分競合技法によって、本方法において使用するのに適応することができる。
化学発光化合物
本開示の実施において化学発光標識として使用される化合物は、一般式ＣＬ−Ｌ−ＲＧを有し、式中、ＣＬは、化学発光部分を表し、Ｌは、化学発光部分と反応基を連結するための連結部分（ｌｉｎｋｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）を表し、ＲＧは、別の物質にカップリングするための反応基部分を表す。用語「化学発光基」および「化学発光部分」は、用語「連結部分」および「連結基（ｌｉｎｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）」と同様に互換的に使用される。化学発光部分ＣＬは、アクチベーターと反応を起こし、活性化された化合物に変換される化合物を含む。活性化された化合物とトリガー溶液の反応により、電子励起状態化合物が形成される。励起状態は、一重項励起状態であっても、三重項励起状態であってもよい。励起状態は、基底状態に緩和すると光を直接放出することができ、または放出性エネルギーアクセプターに励起エネルギーを移し、それによって基底状態に戻ることができる。エネルギーアクセプターは、このプロセスにおいて励起状態に上げられ、光を放出する。ＣＬ基、アクチベーター、およびトリガー溶液の化学発光反応は急速であり、非常に短期間で起こることが望ましいが、必須ではなく、一実施形態では、数秒以内にピーク強度に到達する。
本開示の一実施形態では、化学発光化合物は、アクチベーターおよびトリガー溶液の存在下で、酸化されることによって化学発光を生じることができる。リンカーおよび反応基を取り込むことによって、化学発光標識として機能することができる化合物の例示的なクラスとして、イソルミノール、アミノブチルエチルイソルミノール（ＡＢＥＩ）、アミノヘキシルエチルイソルミノール（ＡＨＥＩ）、７−ジメチルアミノナフタレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、環置換アミノフタルヒドラジド、アントラセン−２，３−ジカルボン酸ヒドラジド、フェナントレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、ピレンジカルボン酸ヒドラジド、５−ヒドロキシフタルヒドラジド、６−ヒドロキシフタルヒドラジド、ならびにＭａｓｕｙａらへの米国特許第５，４２０，２７５号およびＹａｍａｇｕｃｈｉへの米国特許第５，３２４，８３５号において開示された他のフタラジンジオン類似体を含めた、ルミノールならびに構造的に関連した環状ヒドラジドなどの芳香族環状ジアシルヒドラジドが挙げられる。
過酸化水素およびペルオキシダーゼの作用によって化学発光を生じることが公知である任意の化合物が、本開示において使用される化学発光標識化合物の化学発光部分として機能すると考えられる。キサンテン色素（例えば、フルオレセイン色素、エオシン色素、ローダミン色素、またはロドール色素など）、芳香族アミン、および複素環式アミンを含めた、様々な構造上のクラスの多数のそのような化合物が、これらの条件下で化学発光を生じることが当技術分野で公知である。別の例は、化合物ＭＣＬＡ、２−メチル−６−（ｐ−メトキシフェニル）−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オンである。別の例はインドール酢酸であり、別の例はイソブチルアルデヒドであり、後者は一般に、可視光の出力を増大させるための蛍光エネルギーアクセプターを伴っている。トリヒドロキシ芳香族化合物のピロガロール、フロログルシノール、およびプルプロガリンは、個々に、または組合せて、本開示の化学発光標識化化合物中の化学発光部分として機能を果たすことができる化合物の他の例である。
一実施形態では、本開示の方法において有用なアクリダンケテンジチオアセタール（ＡＫ）を含む一群の化学発光標識化合物は、式ＩＶを有するアクリダン化合物
を含み、式中、基Ｒ１〜Ｒ１１の少なくとも１つは、式−Ｌ−ＲＧの標識化置換基であり、Ｌは、結合、または別の二価もしくは多価の基となり得る連結基であり、ＲＧは、化学発光標識化化合物が別の化合物に結合することを可能にする反応基であり、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、１〜５０の非水素原子を含有する有機基であり、Ｒ４〜Ｒ１１のそれぞれは、水素、または干渉しない置換基である。標識化置換基−Ｌ−ＲＧは、Ｒ１またはＲ２の１つに存在することができるが、これは、Ｒ３またはＲ４〜Ｒ１１の１つに置換基として存在することもできる。
式ＩＶの化合物中の基Ｒ１およびＲ２は、光生成を可能にするＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ、およびハロゲン原子から選択される、１〜約５０の非水素原子を含有する任意の有機基とすることができる。後者とは、式Ｉの化合物が本開示の反応を起こすとき、励起状態生成物の化合物が生成され、１つ以上の化学発光中間体の生成を含むことができることを意味する。励起状態生成物は、直接光を放出することができ、またはエネルギー移動を通じて蛍光アクセプターに励起エネルギーを移し、この蛍光アクセプターから光を放出させることができる。一実施形態では、Ｒ１およびＲ２は、１〜２０炭素原子の、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアルケニル、置換または非置換のアルキニル、置換または非置換のアリール、および置換または非置換のアラルキル基から選択される。Ｒ１またはＲ２が置換された基である場合、これは、カルボニル基、カルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３ −基、ＯＳＯ３ −２基、グリコシル基、ＰＯ３ −基、ＯＰＯ３ −２基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、４級アンモニウム基、および４級ホスホニウム基から選択される１〜３個の基で置換されていてもよい。一実施形態では、Ｒ１またはＲ２は、式−Ｌ−ＲＧの標識化置換基で置換されており、式中、Ｌは連結基であり、ＲＧは反応基である。
基Ｒ３は、基内の原子の価数を満たすのに要求される必要な数のＨ原子に加えて、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ、およびハロゲンから選択される１〜５０の非水素原子を含有する有機基である。一実施形態では、Ｒ３は、１〜２０の非水素原子を含有する。別の実施形態では、有機基は、１〜２０炭素原子の、アルキル、置換アルキル、置換または非置換のアルケニル、置換または非置換のアルキニル、置換または非置換のアリール、および置換または非置換のアラルキル基からなる群から選択される。別の実施形態では、Ｒ３についての基には、置換または非置換のＣ１〜Ｃ４アルキル基、フェニル、置換または非置換のベンジル基、アルコキシアルキル、カルボキシアルキル、およびアルキルスルホン酸基が含まれる。Ｒ３が置換された基である場合、これは、カルボニル基、カルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３ −基、ＯＳＯ３ −２基、グリコシル基、ＰＯ３ −基、ＯＰＯ３ −２基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、４級アンモニウム基、および４級ホスホニウム基から選択される１〜３個の基で置換されていてもよい。基Ｒ３は、５または６員環を完成するために、Ｒ７またはＲ８に結合することができる。一実施形態では、Ｒ３は、式−Ｌ−ＲＧの標識化置換基で置換されている。
式ＩＶの化合物では、基Ｒ４〜Ｒ１１はそれぞれ、独立してＨ、または励起状態生成物が生成されるのを可能にし、一般にＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ、およびハロゲンから選択される１〜５０の原子を含有する置換基である。存在することができる代表的な置換基として、限定することなく、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリールオキシ、ハロゲン、アミノ、置換アミノ、カルボキシル、カルボアルコキシ、カルボキサミド、シアノ、およびスルホネート基が挙げられる。隣接する基の対、例えば、Ｒ４−Ｒ８またはＲ８−Ｒ６は、一緒に結合することによって、この２つの基が結合されている環に縮合した少なくとも１つの５員環または６員環を含む炭素環系または複素環系を形成することができる。そのような縮合複素環は、Ｎ、Ｏ、またはＳ原子を含有することができ、上記したものなどのＨ以外の環置換基を含有することができる。基Ｒ４〜Ｒ１１の１つ以上は、式−Ｌ−ＲＧの標識化置換基とすることができる。一実施形態では、Ｒ４〜Ｒ１１は、水素、ハロゲン、およびアルコキシ基、例えば、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシなどから選択される。別の実施形態では、一群の化合物は、ハロゲンとしてＲ８、Ｒ６、Ｒ９、またはＲ１０の１つを有し、Ｒ４〜Ｒ１１の他のものは、水素原子である。
置換基は、化合物の特性を改変し、または合成の利便性をもたらすために、様々な量で、アクリダン環内の選択された環または鎖の位置で組み込むことができる。そのような特性として、例えば、化学発光量子収率、酵素との反応速度、最大光強度、発光の継続時間、発光波長、および反応媒質中の溶解度が挙げられる。特定の置換基およびこれらの効果は、以下の具体例において例示されているが、これは、本開示の範囲を限定すると決して見なされるべきではない。合成の便宜のために、式Ｉの化合物は、水素原子としてＲ４〜Ｒ１１のそれぞれを有することが望ましい。
別の実施形態では、一群の化合物は式Ｖを有し、式中、Ｒ４〜Ｒ１１のそれぞれは水素である。基Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は上記に定義された通りである。
式ＩＶまたはＶの標識化化合物は、基Ｒ１またはＲ２上に置換基として基−Ｌ−ＲＧを有する。一実施形態では、標識化化合物は、式ＶＩを有する。
代表的な標識化化合物は、以下の構造を有する。追加の例示的な化合物、ならびに他の分子および固体表面への結合におけるこれらの使用は、以下の具体例において記載されている。以下に示された構造は、式ＣＬ−Ｌ−ＲＧの例示的な化合物を例示する。
上記の特定のＡＫ化合物、ならびに上に示された一般式ＩＶ、Ｖ、およびＶＩの化合物は、公開された出願ＵＳ２００７／０１７２８７８に開示された方法を含む、一般に公知の方法を使用して、熟練した有機化学者によって調製することができる。例示的な方法では、Ｎ−置換、かつ必要に応じて環置換アクリダン環化合物は、強塩基、その後にＣＳ２と反応されることによって、アクリダンジチオカルボキシレートを形成する。ジチオカルボキシレートは、従来法によってエステル化されることによって、Ｒ１と命名した置換基の１つが組み込まれる。得られたアクリダンジチオエステルは、非プロトン性溶媒中で、ｎ−ＢｕＬｉまたはＮａＨなどの強塩基を用いて再び脱プロトン化され、脱離基およびＲ２部分を含有する適当な試薬を用いてＳ−アルキル化される。Ｒ２部分は、適当な反応基を組み込むためにさらなる操作にかけることができることが、有機化学における当業者に容易に明らかである。
別のクラスの化学発光部分には、米国特許第５，４９１，０７２号；同第５，５２３，２１２号；同第５，５９３，８４５号；および同第６，０３０，８０３号に開示された、アクリダンエステル、チオエステル、およびスルホンアミドが含まれる。このクラスにおける化学発光標識化化合物は、以下の式ＶＩＩの化学発光部分ＣＬを有し、式中、Ｚは、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ１１ＳＯ２Ａｒであり、Ｒ１１は、アルキルまたはアリールであり、Ａｒは、アリール、またはアルキル置換アリールであり、Ｒ１は、Ｃ１〜８アルキル、ハロ置換Ｃ１〜８アルキル、アラルキル、アリール、またはアルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、アリール、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロゲン、カルボニル、カルボキシル、カルボキサミド、シアノ、トリフルオロメチル、トリアルキルアンモニウム、ニトロ、ヒドロキシ、アミノ、およびメルカプト基で置換されたアリールであり、Ｒ２は、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、およびアラルキル基から選択され、Ｒ３〜１０はそれぞれ、水素であり、または１もしくは２個の置換基が、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、およびハロゲンから選択され、Ｒ３〜１０の残りは水素である。一実施形態では、Ｒ３〜１０のそれぞれは水素であり、Ｒ１は標識化置換基である。別の実施形態では、Ｒ３〜１０の１つは標識化置換基であり、Ｒ３〜１０の他のものは水素である。
別のクラスの化学発光部分には、米国特許第５，９２２，５５８号；同第６，６９６，５６９号；、および同第６，８９１，０５７号に開示された複素環式化合物が含まれる。一実施形態では、この化合物は、窒素、酸素、または硫黄を含有する５員もしくは６員の環、または複数の環基を含む複素環式環を含み、これに環外の二重結合が結合しており、その末端炭素は、酸素および硫黄原子から選択される２つの原子で置換されている。
別の実施形態では、化学発光標識化合物は、以下の式ＶＩＩＩの化学発光アクリダンエノール誘導体を含み、式中、Ｒ１は、１〜２０炭素原子のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、およびアラルキル基から選択され、そのいずれも、カルボニル基、カルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３ −基、ＯＳＯ３ −２基、グリコシル基、ＰＯ３ −基、ＯＰＯ３ −２基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、４級アンモニウム基、または４級ホスホニウム基から選択される１〜３個の基で置換されていてもよく、Ｘは、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、アリール、アラルキル基、１〜２０炭素原子を有するアルキルカルボキシル基またはアリールカルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３ −基、グリコシル基、および式ＰＯ（ＯＲ’）（ＯＲ’’）のホスホリル基（式中、Ｒ’およびＲ’’は独立して、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、シアノアルキル、アリール、およびアラルキル基、トリアルキルシリル基、アルカリ金属陽イオン、アルカリ土類陽イオン、アンモニウム陽イオンおよびトリアルキルホスホニウム陽イオンから選択される）から選択され、Ｚは、ＯおよびＳ原子から選択され、Ｒ６は、置換または非置換のＣ１〜Ｃ４アルキル、フェニル、ベンジル、アルコキシアルキル、およびカルボキシアルキル基から選択され、Ｒ７〜１４はそれぞれ、水素であり、または１もしくは２個の置換基が、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、およびハロゲンから選択され、Ｒ７〜１４の残りは水素である。一実施形態では、Ｒ７〜１４のそれぞれは水素であり、Ｒ１は標識化置換基である。別の実施形態では、Ｒ７〜１４の１つは標識化置換基であり、Ｒ７〜１４の他のものは水素である。
別の実施形態では、化学発光標識化化合物は、以下の式ＩＸの化学発光化合物を含み、式中、Ｒ１は、１〜２０炭素原子のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、およびアラルキル基から選択され、そのいずれも、カルボニル基、カルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３ −基、ＯＳＯ３ −２基、グリコシル基、ＰＯ３ −基、ＯＰＯ３ −２基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、４級アンモニウム基、または４級ホスホニウム基から選択される１〜３個の基で置換されていてもよく、Ｘは、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、アリール、アラルキル基、１〜２０炭素原子を有するアルキルカルボキシル基またはアリールカルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３ −基、グリコシル基、および式ＰＯ（ＯＲ’）（ＯＲ’’）のホスホリル基（式中、Ｒ’およびＲ’’は独立して、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、シアノアルキル、アリール、およびアラルキル基、トリアルキルシリル基、アルカリ金属陽イオン、アルカリ土類陽イオン、アンモニウム陽イオンおよびトリアルキルホスホニウム陽イオンから選択される）から選択され、Ｚ１およびＺ２はそれぞれ、ＯおよびＳ原子から選択され、Ｒ２およびＲ３は独立して、水素およびＣ１〜Ｃ８アルキルから選択される。
連結基（Ｌ）。本開示において使用される任意の化学発光化合物における連結基は、結合、原子、二価の基、および多価の基、またはいくつかは環状構造の一部となり得る、直鎖もしくは分枝鎖の原子とすることができる。置換基は通常、１〜約５０の非水素原子、より通常には１〜約３０の非水素原子を含有する。別の実施形態では、鎖を構成する原子は、Ｃ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ、Ｂ、およびＳｅ原子から選択される。別の実施形態では、鎖を構成する原子は、Ｃ、Ｏ、Ｎ、Ｐ、およびＳ原子から選択される。鎖中の炭素以外の原子の数は、通常０〜１０である。ハロゲン原子は、鎖または環上の置換基として存在することができる。連結置換基を構成する典型的な官能基として、アルキレン、アリーレン、アルケニレン、エーテル、過酸化物、カルボニル（ケトン、エステル、炭酸エステル、チオエステル、またはアミド基としての）、アミン、アミジン、カルバメート、尿素、イミン、イミド、イミデート、カルボジイミド、ヒドラジノ、ジアゾ、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホン酸エステル、チオエーテル、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸エステル、硫酸エステル、およびチオ尿素基が挙げられる。別の実施形態では、基は、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＮＲ−、−ＳｉＯ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−、−ＮＲＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲＣ（＝Ｓ）−、または−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ−基で終止する１〜２０原子のアルキレン鎖であり、式中、ＲはＣ１〜８アルキルである。別の実施形態では、連結基は、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＮＲ−、−ＳｉＯ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−、−ＮＲＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲＣ（＝Ｓ）−、または−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ−基で終止する３〜３０原子のポリ（アルキレン−オキシ）鎖であり、式中、ＲはＣ１〜８アルキルである。
反応基。反応基ＲＧは、その存在が、共有結合または物理的な力による別の分子への結合を促進する原子または基である。いくつかの実施形態では、本開示の化学発光標識化化合物の、別の化合物または物質への結合は、例えば、反応基が、ハロゲン原子またはトシレート基などの脱離基である場合、反応基から１つ以上の原子を失うことになり、化学発光標識化化合物は、求核置換反応によって別の化合物に共有結合的に結合している。
一実施形態では、ＲＧは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基である。当業者は、ＮＨＳエステル基を含むそのような標識化化合物で標識される物質は、その物質上の部分、一般にアミン基と、エステルのＣ−Ｏ結合を分割し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを放出し、その物質の原子（アミン基の場合Ｎ）と、標識化化合物のカルボニル炭素との間に新しい結合を形成するプロセスにおいて反応することを容易に理解する。別の実施形態では、ＲＧは、ヒドラジン部分、−ＮＨＮＨ２である。当技術分野で公知であるように、この基は、標識される物質中のカルボニル基と反応することによって、ヒドラジド結合を形成する。
他の実施形態では、化学発光標識化化合物の、共有結合形成による別の化合物への結合は、マイケル付加などの付加反応において起こる場合、または反応基がイソシアネートまたはイソチオシアネート基である場合、反応基内の結合の再編成を伴う。さらに他の実施形態では、結合は、共有結合形成を伴わず、むしろ物理的な力を伴い、この場合、反応基は変化しないままである。物理的な力とは、引力、例えば、水素結合、静電気引力またはイオン引力、塩基スタッキングなどの疎水性引力など、ならびに特定の親和性相互作用、例えば、ビオチン−ストレプトアビジン、抗原−抗体、およびヌクレオチド−ヌクレオチド相互作用などを意味する。
標識が有機分子および生体分子に化学結合するための反応基として、それだけに限らないが、以下のものが挙げられる：ａ）アミン反応基：−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、−ＳＯ２Ｃｌ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、−ＳＯ２ＣＨ２ＣＦ３；ｂ）チオール反応基：−Ｓ−Ｓ−Ｒ；ｃ）カルボン酸反応基：−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨＮＨ２；ｄ）ヒドロキシル反応基：−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、−ＳＯ２Ｃｌ、−ＳＯ２ＣＨ２ＣＦ３；ｅ）アルデヒド／ケトン反応基：−ＮＨ２、−ＯＮＨ２、−ＮＨＮＨ２；およびｆ）他の反応基、例えば、Ｒ−Ｎ３、Ｒ−Ｃ≡ＣＨ。
一実施形態では、反応基として、ＯＨ、ＮＨ２、ＯＮＨ２、ＮＨＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＳＯ２ＣＨ２ＣＦ３、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエーテル、およびマレイミド基が挙げられる。
二官能性カップリング試薬も、適度に反応性の基を有する有機分子および生体分子に標識をカップリングさせるのに使用することができる（Ｌ． Ｊ． Ｋｒｉｃｋａ、Ｌｉｇａｎｄ−Ｂｉｎｄｅｒ Ａｓｓａｙｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８５年、１８〜２０頁、表２．２、およびＴ． Ｈ Ｊｉ、「Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、９１巻、５８０〜６０９頁（１９８３年）を参照）。２つの型の二官能性試薬、すなわち、最終的な構造中に組み込まれた状態になるもの、および組み込まれず、２つの反応物をカップリングするためだけに機能を果たすものが存在する。
水溶液
本開示において使用するのに適した水溶液は、一般に、５０％超の水を含有する溶液である。反応混合物、試料希釈物、キャリブレーター溶液、化学発光標識ｓｂｐ溶液、アクチベーター標識ｓｂｐ溶液、エンハンサー溶液、ならびにトリガー溶液、または化学発光標識ｓｂｐ、アクチベーター標識ｓｂｐ、エンハンサー、トリガー、試料、および／もしくは選択的シグナル阻害剤の１つもしくは複数の濃縮溶液を含めて、本明細書に記載される水溶液は、使用に適している。多くの実施形態では、水溶液は緩衝水溶液である。適当な水性緩衝液には、水溶液中の環境を維持し、被検体の溶解度を維持し、反応物の溶解度を維持し、および化学発光反応を進行させることができる、一般に使用される緩衝液のいずれも含まれる。例示的な緩衝液として、ホスフェート、ボレート、アセテート、カーボネート、ｔｒｉｓ（ヒドロキシ−メチルアミノ）メタン（ｔｒｉｓ）、グリシン、トリシン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、ジエタノールアミン、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳなどが挙げられる。一般に、本開示によって使用するための水溶液は、約５〜約１０．５の範囲内のｐＨを有する。
適当な水溶液は、以下の追加の成分の１つ以上を含むことができる：塩、生物学的緩衝液、エタノール、メタノール、グリコールを含めたアルコール、および界面活性剤。いくつかの実施形態では、水溶液には、緩衝液ＩＩ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｉｎｃ．、Ｂｒｅａ ＣＡから市販されている、ＴＲＩＳ緩衝食塩水、界面活性剤、＜０．１％のアジ化ナトリウム、および０．１％のＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ））などのＴｒｉｓ緩衝水溶液が含まれる。
いくつかの実施形態では、ヒト血清を模倣する水溶液が利用される。１つのそのような合成マトリクスは、０．１％のＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００を含む、２０ｍＭのＰＢＳ、７％のＢＳＡ、ｐＨ７．５である。合成マトリクスは、それだけに限らないが、試料希釈液、キャリブレーター溶液、化学発光標識ｓｂｐ溶液、アクチベーター標識ｓｂｐ溶液、エンハンサー溶液、およびトリガー溶液に使用することができる。用語「ＰＢＳ」は、慣例的な意味において、当技術分野で公知であるような、リン酸緩衝食塩水を指す。用語「ＢＳＡ」は、慣例的な意味において、当技術分野で公知であるような、ウシ血清アルブミンを指す。
アッセイ形式
アッセイ形式は、化学発光標識ｓｂｐの化学発光標識と、アクチベーター標識ｓｂｐのアクチベーター標識とが近接するのを媒介する特異的結合作用を必要とする。
別の実施形態では、被検体の類似体が使用され、アクチベーター−被検体類似体コンジュゲートを構成する。別の実施形態では、標識された被検体が使用され、アクチベーター−被検体コンジュゲートを構成する。アクチベーター−被検体類似体コンジュゲートまたはアクチベーター−被検体コンジュゲート、および被検体は、被検体についての特異的結合パートナーと競合的に結合する。この型のアッセイ法において、試料中の被検体の量と化学発光の強度の間に負の相関が生じることは明らかである。
抗原もしくは他のタンパク質に結合するための抗体、またはイムノアッセイを介した他の抗体を通じた化学発光標識の結合に加えて、本方法は、相補的核酸の結合を通じて核酸を検出するための化学発光標識核酸を使用することができる。この点において、使用は、核酸のサイズに関して特に限定されず、唯一の基準は、相補性パートナーが、安定なハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な長さのものであることである。核酸には、本明細書で使用する場合、遺伝子長の核酸、核酸のより短い断片、ポリヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドが含まれ、そのいずれも一本鎖であっても二本鎖であってもよい。特異的結合パートナーとして核酸を使用して本開示を実施する際、核酸は、被検体核酸を捕捉するために、固体支持体の表面上に共有結合しているか、または物理的に固定化されている。化学発光標識は、捕捉核酸に結合することができ、または標識は、上記に説明したように、やはり捕捉核酸に結合した補助物質に連結することができる。捕捉核酸は、被検体核酸の配列領域と完全、または実質的に完全な配列相補性を有する。実質的に相補性である場合、捕捉核酸は、被検体と相補性でない末端オーバーハンギング部分、末端ループ部分、または内部ループ部分を有することができ、ただし、これは、被検体とのハイブリダイゼーションを妨害または阻止しない。逆の状況も起こり得、この場合、オーバーハングまたはループは、被検体核酸内に属する。捕捉核酸、被検体核酸、アクチベーターのコンジュゲート、および第３の核酸が、ハイブリダイズさせられる。第３の核酸は、捕捉核酸と相補性の配列領域とは異なる、分析物核酸の配列領域と実質的に相補性である。捕捉核酸およびアクチベーターコンジュゲート核酸の被検体とのハイブリダイゼーションは、いずれの順序でも連続して、または同時に実施することができる。このプロセスの結果として、化学発光標識は、支持体の表面に結合した化学発光標識付近にアクチベーターを運ぶ特異的なハイブリダイゼーション反応によって、アクチベーターと反応性の配置にされる。上記したように、トリガー溶液が供給され、化学発光が検出される。
別の実施形態は、被検体のアクチベーターとのコンジュゲートが使用される変形を含む。被検体核酸−アクチベーターコンジュゲートおよび被検体核酸は、被検体核酸についての特異的結合パートナーと競合的に結合する。この型のアッセイ法において、試料中の被検体の量と化学発光の強度の間に負の相関が生じることは明らかである。
抗体に基づくシステムおよび核酸に基づくシステムに加えて、結合アッセイの当業者に一般に公知であるような他の特異的結合対も、本開示による試験方法の基礎として機能を果たすことができる。抗体−ハプテン対も使用することができる。フルオレセイン／抗フルオレセイン、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン、およびニトロフェニル／抗ニトロフェニルの対は、例示的である。
検出
本方法によって放出される光は、任意の適当な公知の手段、例えば、ルミノメーター、Ｘ線フィルム、高速写真フィルム、ＣＣＤカメラ、シンチレーションカウンター、化学光量計、または視覚的などによって検出することができる。各検出手段は、異なるスペクトル感度を有する。ヒトの眼は、緑色光に対して最適に感度がよく、ＣＣＤカメラは、赤色光に対して最大感度を示し、ＵＶから青色光または緑色光に最大応答を有するＸ線フィルムは、利用可能である。検出デバイスの選択は、用途、および費用の考慮、利便性、および永続的な記録の作成が必要とされるかどうかによって支配される。発光の時間過程が急速である実施形態では、検出デバイスの存在下で、化学発光を生じさせるためのトリガー反応を実施することが有利である。例として、検出反応は、ルミノメーター内に収容された試験管またはマイクロウェルプレート、または試験管もしくはマイクロウェルプレートを受け入れるように適応した収納容器内のＣＣＤカメラの前に配置された試験管またはマイクロウェルプレートで実施することができる。
用途
本アッセイ法は、多くの型の特異的結合対アッセイにおいて適用性を見出す。これらの中で主要なのは、ＥＬＩＳＡなどの化学発光酵素結合イムノアッセイである。免疫化学的ステップを実施するための様々なアッセイ形式およびプロトコールは、当技術分野で周知であり、競合アッセイおよびサンドイッチアッセイの両方を含む。本開示によるイムノアッセイによってアッセイすることができる物質の型には、タンパク質、ペプチド、抗体、ハプテン、薬物、ステロイド、およびイムノアッセイの技術分野で一般に公知である他の物質が含まれる。
本開示の方法は、核酸の検出にも有用である。一実施形態では、一方法は、酵素標識核酸プローブを使用する。例示的な方法として、溶液ハイブリダイゼーションアッセイ、サザンブロット法におけるＤＮＡ検出、ノーザンブロット法によるＲＮＡ、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡフィンガープリント法、コロニーハイブリダイゼーション、およびプラークリフトが挙げられ、その実施は、当業者に周知である。
キット
本開示は、本開示の方法に従ってアッセイを実施するためのキットを提供することも企図する。
本開示の別の実施形態では、化学発光標識ｓｂｐ、アクチベーター標識ｓｂｐ、選択的シグナル阻害剤、およびトリガー溶液を含めたアッセイ材料を含有するキットが提供される。いくつかの実施形態では、これらのアッセイ材料は、水溶液で提供される。いくつかの実施形態では、アッセイ材料の１つ以上は、濃縮水溶液で提供される。アッセイ材料の濃縮水溶液は、各アッセイ材料の所望の最終濃度に到達する体積で、反応混合物に供給される。いくつかの実施形態では、追加の水溶液が、濃縮水溶液を希釈するために供給される。他の実施形態では、１つ以上のアッセイ材料は、凍結乾燥形態または固体形態で提供される。そのような実施形態では、追加の水溶液を供給することによって、凍結乾燥した、または固体のアッセイ材料を水溶液または水溶液濃縮物に変換することができる。
いくつかのキット実施形態では、各アッセイ材料は、別個の容器で提供される。他のキットの実施形態では、１つ以上のアッセイ材料が、共通の容器で提供される。さらに他のキットの実施形態では、１つ以上のアッセイ材料が、ウェルで分割された共通の容器で提供され、各ウェルは、１つのアッセイ材料を保持する。
キットは、パッケージされた組合せで、トリガー溶液および使用するための指示書と共に、化合していない標識化化合物、化学発光標識特異的結合パートナー、またはブロッキングタンパク質などの化学発光標識補助物質のいずれかとして化学発光標識を含むことができる。キットは、化学発光標識化がユーザーによって実施される場合、アクチベーターコンジュゲート、被検体キャリブレーター、および対照、希釈剤、および反応緩衝液も必要に応じて含有することができる。
システム
本開示において記載されるアッセイ法は、システムを使用することによって、迅速に実行するために自動化することができる。本開示のアッセイを実施するためのシステムは、他の反応物を含有する反応容器にトリガー溶液をアリコートおよび送達し、得られる化学発光シグナルを読むための流体取り扱い能力を必要とする。そのようなシステムの実施形態では、ルミノメーターが、トリガー溶液注入の時点および箇所で、反応容器の近位に配置される。ルミノメーターまたは他の検出デバイスを含む検出システムは、トリガー溶液を注入する流体取り扱いシステムと協調して作用することが好ましい。さらに、本開示のアッセイを実施するための自動システムは、他の反応物および試料を反応容器にアリコートおよび送達するための流体取り扱い能力を有する。一実施形態では、本発明のアッセイ法を実施するためのシステムは、反応混合物中に試料を送達するための流体取り扱いシステム、化学発光標識特異的結合パートナー、アクチベーター標識特異的結合パートナー、選択的シグナル阻害剤を、反応混合物中に送達するための流体取り扱いシステム、および化学発光シグナルを放出するために、トリガー溶液を反応混合物中に送達するための流体取り扱いシステム、ならびに化学発光シグナルを検出するための検出システムを含み、トリガー溶液を送達するための流体取り扱いシステムは、トリガー流体を注入する時、および注入した後に化学発光シグナル放出を測定するための検出システムと協調して作用する。これらの流体取り扱いシステムは、システムの配置に応じて、同じシステムであっても、異なるシステムであってもよい。
改変ＤＸＩ８００機器は、本開示のアッセイ法を実施するために改変された。改変されていないＤＸＩ８００機器のさらなる説明は、参照により本明細書に組み込まれている、ＵｎｉＣｅｌ ＤＸＩ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ、（著作権）２００７年、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒにおいて入手可能である。本明細書に記載される方法を実施するのに使用するために、ＤＸＩ（登録商標）８００イムノアッセイ機器は、トリガー溶液注入の間、および注入直後に、反応容器の位置付近（反応容器から約１９ｍｍ）で検出するために配置された光子計数ルミノメーター（市販のＤＸＩ８００機器において使用されるのと同じモデル）を組み込むことによって改変された。
ＤＸＩ（登録商標）８００イムノアッセイ内の基質送達システムが、トリガー溶液を送達するのに使用された。本明細書に記載される方法によるアッセイに必要でない、ＤＸＩ（登録商標）８００イムノアッセイ機器のいくつかの追加のコンポーネント、例えば、従来のイムノアッセイに必要であるが、本発明の方法において使用されない、分離および洗浄のために使用される磁石および吸引システムは、便宜上取り除かれた。改変ＤＸＩ（登録商標）８００イムノアッセイ機器は、反応容器の取り扱い、試薬のピペッティング、検出を自動化することにおいて便宜上利用され、温度制御を３７℃で施された。他の市販の計測装置も、機器が、トリガー溶液を反応容器中に注入し、同時またはほぼ同時の様式で化学発光シグナルの検出を開始するように改変することができ、または改変されてもよい限り、本明細書に記載されるアッセイ法を実施するために、同様に利用することができる。化学発光シグナルの検出は、非常に短い継続時間、すなわち、光電子増倍管（ＰＭＴ）の１周期などの数ミリ秒のものとすることができ、または数秒間に延長することもできる。収集されるシグナルのすべてまたは一部を、後続のデータ分析に使用することができる。
化学発光シグナルの検出は、非常に短い継続時間、すなわち、光電子増倍管（ＰＭＴ）の１周期などの数ミリ秒のものとすることができ、または数秒間に延長することもできる。収集されるシグナルのすべてまたは一部を、後続のデータ分析に使用することができる。例えば、以下に記載される一般的な手順では、光強度は、閃光に集中させて０．２５秒間合計され、他の手順では、光強度は、注入を最初の０．５秒遅らせて、５秒間合計される。
用語集：
ＡＨＴＬ：Ｎ−アセチルホモシステインラクトン
ＡＫ：アクリダン
ＣＫＭＢ：クレアチンキナーゼイソエンザイム
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＥＤＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
ＨＲＰ：西洋わさびペルオキシダーゼ
ＭＳ−ＰＥＧ：末端メチル基を有するアミン反応性直鎖状ポリエチレングリコールポリマー
Ｎａ２ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸のナトリウム塩
ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＰＥＧ：ポリエチレングリコール；特に、分子量＜２０，０００ｇ／ｍｏｌのオリゴマーまたはポリマー
ＰＥＯ：ポリエチレンオキシド；特に、分子量＞２０，０００ｇ／ｍｏｌのポリマー
ＰＭＰ：１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン
ＰＳＡ：前立腺特異的抗原
Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ：スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート
ＴＢＳ：Ｔｒｉｓ緩衝食塩水
ＴｎＩ：トロポニンＩ；ｃＴｎＩは心臓トロポニンＩである。
Ｔｒｉｓ：２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール、ｔｒｉｓ−（ヒドロキシメチル）アミノメタンとしても公知
Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０：ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（ｓｏｄｉｕｍ）モノラウレート；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ（ＭＯ）から市販されている。
材料：
既知の濃度の試料：以下に記載されるアッセイおよびアッセイ法において使用するための既知の濃度の試料は、一般に、指定された被検体の精製タンパク質を、その被検体を含まないヒト血清に添加することによって調製した。例えば、公知のＰＳＡタンパク質のＰＳＡ試料は、ヒト精液に由来するＰＳＡを、以下の実施例に示される表において提示されたＰＳＡ濃度に到達するように、ＰＳＡを含まない女性の血清中にスパイクすることによって調製した。試料は、使用する前に貯蔵される場合、４℃で貯蔵し、または凍結させ、使用前に解凍した。既知の濃度の試料は、一般に、未知の被検体濃度の試料中の被検体濃度を決定するために、アッセイ法と組み合わせて使用される検量線を作成するのに有用な較正セットについて慣例的であるように調製した。
エンハンサーを含むトリガー溶液：以下の実施例の多くにおいて使用したトリガー水溶液を、トリガー溶液Ａと呼ぶ。トリガー溶液Ａは、約３％のエタノールを含む、ｐＨ８．０の、２５ｍＭのＴｒｉｓの緩衝水溶液中に、８ｍＭのｐ−ヒドロキシケイ皮酸、１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、１０５ｍＭの尿素過酸化物、および０．２％のＴｗｅｅｎ（登録商標）−２０を含有する。すべての成分は、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯなどの様々な供給者から市販されている。
緩衝液ＩＩ：（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｂｒｅａ ＣＡから市販されている、ＴＲＩＳ緩衝食塩水、界面活性剤、＜０．１％のアジ化ナトリウム、および０．１％のＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ））。
機器：
改変ＤｘＩ（登録商標）８００イムノアッセイ機器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．Ｂｒｅａ、ＣＡ）：改変ＤＸＩ（登録商標）８００機器を、以下のいくつかの実施例において記載されるアッセイ法を実施するのに使用し、そこで注記した。本明細書に記載される方法を実施するのに使用するために、ＤＸＩ（登録商標）８００機器は、トリガー溶液注入の間、および注入直後に、反応容器の位置付近（反応容器から約１９ｍｍ）で検出するために配置された光子計数（ｐｈｏｔｏ−ｃｏｕｎｔｉｎｇ）ルミノメーター（市販のＤＸＩ（登録商標）８００機器において使用されるのと同じモデル）を組み込むことによって改変した。ＤＸＩ（登録商標）８００イムノアッセイ内の基質送達システムを、トリガー溶液を送達するのに使用した。本明細書に記載される方法によるアッセイに必要でない、ＤＸＩ（登録商標）８００イムノアッセイ機器のいくつかの追加のコンポーネント、例えば、従来のイムノアッセイに必要であるが、本発明の方法において使用されない、分離および洗浄のために使用される磁石および吸引システムは、便宜上取り除いた。改変ＤＸＩ（登録商標）８００イムノアッセイ機器は、反応容器の取り扱い、試薬のピペッティング、検出を自動化することにおいて便宜上利用され、温度制御を３７℃で施した。他の市販の計測装置も、機器が、トリガー溶液を反応容器中に注入し、同時またはほぼ同時の様式で化学発光シグナルの検出を開始するように改変することができ、または改変されてもよい限り、本明細書に記載されるアッセイ法を実施するために、同様に利用することができる。他の例の機器は、以下に列挙されている。
化学発光シグナルの検出は、非常に短い継続時間、すなわち、光電子増倍管（ＰＭＴ）の１周期などの数ミリ秒のものとすることができ、または数秒間に延長することもできる。収集されるシグナルのすべてまたは一部を、後続のデータ分析に使用することができる。
Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ（登録商標）プレートルミノメーター、（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）。改変されていない。室温で実施された方法。
ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｌマイクロプレートルミノメーター、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）。改変されていない。高速読取りキネティックモードを使用して、室温で実施された方法。
（実施例１）
ＳＳＩＡとしての有効性についての化合物のスクリーニング
Ａ．ホモジニアスＰＳＡイムノアッセイによるＳＳＩＡのスクリーニング
この実施例は、本開示のアッセイにおけるＳＳＩＡの機能性について、候補化合物を試験するのに使用した一方法を示す。試験は、タンパク質ＰＳＡのモデルスクリーニングイムノアッセイにおいて行った。試験は、９６ウェルマイクロタイタープレート形式を使用して行った。マウス抗−ＰＳＡ−ＡＫ１ ３０μＬ（６６ｎｇ）、マウス抗−ＰＳＡ−ＨＲＰコンジュゲート３０μＬ（７．８ｎｇ）、ヒト女性の血清３６μＬ、およびＰＳＡキャリブレーター２４μＬを含有する溶液を、ピペットで各ウェルに入れた。プレートを３７℃で１０分間インキュベートした。試験化合物のアリコート５μＬ（様々な濃度）を各ウェルに添加した。化学発光は、トリガー溶液の溶液１００μＬを添加することによってトリガーした。その組成を以下に列挙する。化学発光の閃光は、Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ Ａｓｅｎｔ（登録商標）プレートルミノメーター、（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、トリガー溶液を添加した後に５秒間積分した。
各候補化合物は、少なくとも２つレベルのＰＳＡ、すなわち、ゼロ、ならびに１２９ｎｇのＰＳＡ／ｍＬ（キャリブレーターＳ５）および／または２ｎｇのＰＳＡ／ｍＬ（キャリブレーターＳ２）で試験した。簡潔さのために、各候補化合物の１つの代表的な濃度の結果のみを示した。Ｓ５／Ｓ０が、対照との関連で改善されている場合、化合物は、アッセイ性能の改善に有効であると見なされる。本スクリーニングにおいて、改善係数は、少なくとも２（Ｓ５／Ｓ０≧約２０〜３０）であることが望ましく、改善係数は、少なくとも５（Ｓ５／Ｓ０≧約５０）であることがより望ましく、Ｓ５／Ｓ０は、≧１００であることがさらにより望ましい。多くの化合物は、このスクリーニング検査においてＳＳＩＡとして有効性を示すことが見出され、他の化合物は、効果的でないか、または限定された効果を有することが見出された。
Ｂ．有効な選択的シグナル阻害剤（ＳＳＩＡ）の選択のためのモデル系
モデル系も開発および使用することによって、本開示のアッセイにおいて選択的シグナル阻害剤として機能する特性を有する化合物をスクリーニングおよび選択した。このモデル系は、ストレプトアビジンおよび化学発光標識ｓｂｐとしてアクリダンケテンジチオアセタール化学発光標識（ＡＫ１）を標識されたＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）にコンジュゲートした微粒子、ならびにアクチベーター標識特異的結合対としてビオチン化ＨＲＰを使用する。このモデル系では、様々な量のＢｔｎ−ＨＲＰを、化学発光標識特異的結合対に、０、１、１０、１００、および２５０ｎｇ／ｍＬで添加する。各反応混合物中で、５００ｎｇ／ｍＬの濃度の全ＨＲＰに到達するために、追加の未標識ＨＲＰを添加する。アクチベーター標識ｓｂｐと組み合わせた未標識ＨＲＰを化学発光標識ｓｂｐ微粒子に供給することによって、試料を模倣した。ＳＳＩＡとして評価するための化合物も添加した。次いでこのモデル系のこの反応混合物を、本開示のアッセイの様式で、トリガー溶液を添加することによってトリガーした。
Ｃ．モデル系のための材料の調製：
微粒子上に化学発光標識ｓｂｐを調製するために、４倍モル過剰のビオチン−ＬＣ−ｓｕｌｆｏＮＨＳ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をビオチン化した。非結合反応物を脱塩または透析によって除去した。次いで、ビオチン−ＢＳＡを、ｐＨ７．２の２０ｍＭのリン酸ナトリウム：ＤＭＳＯ（７５：２５、ｖ／ｖ）中のアクリダンケテンジチオアセタールＡＫ１の５倍モル過剰のＮＨＳエステルと反応させ、その後、同じ緩衝液中で脱塩した。次いで二重標識（ビオチンおよびＡＫ１）ＢＳＡを、トシル活性化Ｍ２８０微粒子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、ｐＨ９．５の０．１Ｍのホウ酸塩緩衝液中で、微粒子１ｍｇ当たり標識されたＢＳＡ約２０μｇの濃度で、４０℃で１６〜２４時間カップリングさせた。カップリングした後、微粒子を、０．２ＭのＴＲＩＳ塩基、２％のＳＤＳ、ｐＨ約１１を用いて４０℃で１時間ストリップした。ストリッピングプロセスをさらに１回繰り返した。次いで微粒子を０．１％のＢＳＡ／ＴＲＩＳ緩衝食塩水（ＢＳＡ／ＴＢＳ）緩衝液中に懸濁させ、ストレプトアビジン（ＳＡ）を、微粒子１ｍｇ当たりＳＡ約１５μｇで添加した。ストレプトアビジンを、室温で４５〜５０分間微粒子と混合した。次いで微粒子を、同じＢＳＡ／ＴＢＳ中で３回洗浄し、懸濁させた。これらの微粒子の負荷は、微粒子１ｍｇ当たりビオチン化タンパク質５μｇである。
ＨＲＰ、（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）を、４倍モル過剰のビオチン−ＬＣ−ｓｕｌｆｏＮＨＳ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いてビオチン化した。あるいは、２５倍モル過剰のビオチン−ＰＥＯ４−ＮＨＳを使用することができる。非結合反応物は、脱塩または透析によって除去した。
評価するための各ＳＳＩＡ化合物を、作業強度濃度の少なくとも１０倍の濃度で緩衝液ＩＩ中に可溶化した。
Ｄ．モデル系を使用する試験手順
１ｍｇ／ｍｌの二重標識（ビオチンおよびＡＫ１）ＢＳＡ Ｍ２８０粒子２５μｌを、緩衝液ＩＩ中の作業濃度のＳＳＩＡ ４５μｌと混合した。アッセイ体積を、緩衝液ＩＩ １５μｌを添加することによって８５μｌにした。様々な比のＢｔｎ−ＨＲＰ：ＨＲＰ（ビオチン化ＨＲＰの量は、０から、１、１０、１００、および２５０ｎｇ／ｍＬで変更した）を含有する試料１５μｌを添加した。反応混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、次いでトリガー溶液１００μＬを添加し、光強度を記録した。トリガー溶液を含む反応混合物の全体積は２００μＬであり、ＳＳＩＡの最終濃度は１００μＭであった。
本開示のアッセイにおいて使用するためのＳＳＩＡとしての有用性を実証する化合物には、アスコルビン酸、アスコルビン酸の６−パルミテート誘導体および５，６−イソプロピリデン誘導体、２−アミノフェノール、４−アミノ−３−ヒドロキシ−安息香酸、４−クロロカテコール、ならびにＴＲＯＬＯＸ、トコフェロールの誘導体が含まれ、Ｓ０値を対照と比較することによって示されるバックグラウンドシグナルの低減、およびＳ１／Ｓ０値の増加によって実証されるシグナル対ノイズの改善を伴う。
モデル系においてＳＳＩＡとして不十分な有効性を示した化合物は、グルタチオン、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、リポ酸（ジスルフィド）、ペグ化トコフェロール、メラトニン（トリプタミン誘導体）、ＴＥＭＰＯＬ（安定な窒素酸化物）、ニコチン酸ヒドラジド、ニコチン酸、レスベラトロール、および２つのアクリルアミド／ビスアクリルアミド溶液である。αおよびγ−トコフェロール、尿酸、ならびにフェルラ酸を含む、第２の分類の化合物は、７５〜８８％の範囲でＳ０シグナルの低減を示すが、１０ｎｇ／ｍＬのＢｔｎ−ＨＲＰでの第３のキャリブレーション（ｃａｌ）レベルまでＳ／Ｓ０の増大を示さない。
スクリーニング検査は、上記した改変ＤｘＩ（登録商標）イムノアッセイシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｉｎｃ． Ｂｒｅａ、ＣＡ）を使用して実施した。
（実施例２）
以下の実施例では、固相の非存在下で、ＳＳＩＡの存在下および非存在下の両方で、被検体のイムノアッセイを実証した。アッセイは、２つの直接標識抗体を含んでいた。そのそれぞれは、被検体、この実施例では、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）に対して特異的な結合親和性を有する。便宜上「Ａｂ１」と指定した１つの抗体は、ＡＫ１１の１つ以上の分子、一般に２つの分子に共有結合している。「Ａｂ２」と指定した第２の抗体は、ＨＲＰに共有結合している。材料の調製、アッセイの性能、および結果は、以下に記載した通りであった。
Ａ．Ａｂ１〜ＡＫコンジュゲートの調製
以下の実施例において、ＡＫ１（上記に示した）と本明細書で呼ばれる、アクリダンケテンジチオアセタール化学発光化合物のＮＨＳエステルは、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の抗体に共有結合している。他の抗原または他のアクリダンケテンジチオアセタール化学発光化合物の化学発光標識抗体を調製するのに、以下の方法も使用することができる。
ＡＫ１、すなわち、アミン反応性アクリダンケテンジチオアセタール化学発光化合物は、１０ｍＭで、ＤＭＳＯ中で調製した。ｐＨ７．４のＰＢＳ中のモノクローナルＰＳＡ抗体３ｍｇ（６．６ｍｇ／ｍＬ）に、１０倍モル過剰のＡＫ１を添加し、暗所で、周囲温度で１時間インキュベートした。生成物を、ｐＨ７．４のＰＢＳ中で平衡化したＰＤ−１０脱塩カラムに通して精製した。生成物は、抗体上の利用可能なアミノ基において、波線によって示した抗体への結合と共に以下に示した、ＡＫ１１（ＡＫ１の反応生成物）に共有結合したモノクローナル抗ＰＳＡを含有した。２８０ｎｍおよび３８４ｎｍでの吸光度測定を使用することによって、ＩｇＧ濃度およびＡＫ１１／ＩｇＧ比（３ ＡＫ１１：１ ＩｇＧ）を決定した。
Ｂ．Ａｂ−２〜ＨＲＰコンジュゲートの調製
以下の代表的な合成手順において、酵素西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）に対する抗体に共有結合させる。本明細書に教示した方法に従って、追加の酵素−標識抗体を調製することができる。
Ｃ．ＨＲＰの活性化
ＨＲＰ（Ｒｏｃｈｅ、１０−８１４−３９３−００１）１０ｍｇを、１×ＰＢＳ（１３７ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのホスフェート、２．７ｍＭのＫＣｌ、および７．４のｐＨ）２．０ｍＬ中に溶解させた。ＤＭＳＯ中の３０倍モル過剰のｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）（２５μｇ／μＬ）を、ＨＲＰ溶液に添加し、暗所で１時間インキュベートした。マレイミド活性化ＨＲＰを、ｐＨ７．４のＰＢＳ中の、ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に通して精製した。ＨＲＰ濃度は、４０３ｎｍで２．２７５ｍＬ／ｍｇ−ｃｍの吸光係数を使用して、分光光度法で決定した。
Ｄ．抗−ＰＳＡモノクローナル抗体（Ａｂ２）の活性化
５０倍モル過剰の２−イミノチオラン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を、ｐＨ７．４のＰＢＳ中のモノクローナルＰＳＡ抗体に添加し、暗所で、周囲温度で１時間反応させた。Ａｂ２と指定したモノクローナルＰＳＡ抗体は、ＰＳＡ上の結合部位において、実施例２のＡｂ１と異なる。チオール化抗体を、ｐＨ７．４のＰＢＳ中の、ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に通して精製した。抗体濃度は、２８０ｎｍで１．４ｍＬ／ｍｇ−ｃｍの吸光係数を使用して、分光光度法で決定した。
Ｅ．Ａｂ２−ＨＲＰコンジュゲートの調製
５倍過剰の活性化されたＨＲＰを、活性化されたＡｂ２溶液に添加することによって、コンジュゲート反応混合物を作り出した。コンジュゲート反応混合物を、暗所で、室温で２時間、ローテーター上でインキュベートした。コンジュゲート反応混合物に過剰量のＬ−システインおよびヨードアセトアミドを連続添加することによって（各ステップ、１５分）、未反応のチオール基およびマレイミド基をブロックした。第１のステップにおいて、過剰（０．０２５×反応体積）の５０ｍｇ／ｍＬのＬ−システイン−ＨＣｌ（ｐＨ７．４のＰＢＳ中に溶解させた）を添加し、１５分インキュベートした。第２のステップにおいて、過剰（０．０４×反応体積）の５０ｍｇ／ｍＬのヨードアセトアミド（ｐＨ７．４のＰＢＳ中に溶解させた）を、ｐＨ８．５の５０ｍＭのボレート（０．０８×反応体積）と一緒に反応混合物に添加し、光から保護して、周囲温度でさらに１５分インキュベートした。このコンジュゲートを、ｐＨ７．４のＰＢＳ中で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、部品番号１７−５１７５−０１）に通して精製した。コンジュゲートを含有する画分をプールし、ＨＲＰ／ＩｇＧ比を、ＡおよびＢで記載したように、分光光度法で決定した。計算されたＨＲＰ／ＩｇＧ比は、１．４であった。
ＳＳＩＡを用いた、直接標識ｓｂｐを有するＰＳＡのアッセイ
Ａｂ１−ＡＫ１１コンジュゲートを、ｐＨ７．４のＰＢＳ中に、１０μｇ／ｍｌで提供した。Ａｂ２−ＨＲＰコンジュゲートを、ｐＨ７．４のＰＢＳ中に、０．２５μｇ／ｍｌで提供した。第１の反応容器内で、Ａｂ１−ＡＫ１１コンジュゲート２５μｌ、脱イオン水中の６００μＭのアスコルビン酸、およびＡｂ２−ＨＲＰコンジュゲート２５μｌを、試料２５μｌに添加し、１５分間インキュベートした。ＳＳＩＡを用いない比較のために、第２の反応容器内で、Ａｂ１−ＡＫ１１コンジュゲート２５μｌ、水２５μｌ、Ａｂ２−ＨＲＰコンジュゲート２５μｌを、試料２５μｌに添加し、１５分間インキュベートした。
インキュベートした後、トリガー溶液Ａ １００μｌを注入することによって、各反応容器内で化学発光反応を開始する。反応容器内にトリガー溶液を注入すると同時に、光子計数光電子増倍管（ＰＭＴ）を組み込んだルミノメーターによって、化学発光シグナルを検出した。シグナル収集は、３．８５秒の過程にわたって継続し、化学発光シグナルデータをコンピューターに保存した。
各試料は、三つ組で、上記アッセイ法に従って分析した。反応容器内にトリガー溶液の導入を開始して１２５ミリ秒から始めて４９５ミリ秒の時間間隔の間に、各アッセイされる試料について収集されたＲＬＵデータをそれぞれ個々の実施について合計し、各試料について三つ組に対して平均し、表１３に示した。シグナル対ノイズの比（Ｓ／Ｓ０）を各濃度値で計算した。表１３中のデータを使用することによって、未知のＰＳＡ濃度の試料を分析するための較正曲線を作成することができる。
以下の実施例では、固相の非存在下で、ＳＳＩＡの存在下および非存在下の両方で、直接標識抗体を使用する、被検体の本開示によるイムノアッセイを実証した。表１３に示した結果から、ＳＳＩＡを用いない直接標識抗体アッセイは、アッセイしたＰＳＡ濃度の全範囲にわたって（被検体）用慮反応性でない。対照的に、本開示によるＳＳＩＡを組み込んだ直接標識イムノアッセイは機能的であり、ゼロ（対照）から５つすべてのＰＳＡキャリブレーター値を通じて用慮反応をもたらした。その結果として、ＳＳＩＡを組み込んだ直接標識イムノアッセイは、他の試料中の未知の被検体濃度を決定するのに首尾よく使用することができる。また、ＳＳＩＡの添加は、較正範囲（ＰＳＡ、０〜１０１．６ｎｇ／ｍＬ）にわたってシグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｓ０）を改善する。
（実施例３）
ＰＳＡについてのＡＢ１〜ＡＫ１、ＡＢ２〜ＨＲＰコンジュゲートアッセイ
指向性標識された化学発光標識ｓｂｐおよびアクチベーター標識ｓｂｐを使用する、ＰＳＡに向けたアッセイは、以下に記載するように溶液中で行った。この実験により、様々な程度の精製を伴ったコンジュゲートされた試薬を使用することの結果をさらに探索した。
マウス抗ＰＳＡ（Ｍ×ＰＳＡ）（１１１μＬ、９ｍｇ／ｍＬ）およびＡＫ１ ＮＨＳエステル（１０６μＬ、１ｍｇ／ｍＬのＤＭＦストック）を、ｐＨ８．２５の０．１Ｍのホウ酸緩衝液（７８４μＬ）中で反応させた。この混合物を室温で９０分間混合した。反応混合物１００μＬを取り出し、リシン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）２．６μＬを添加し、３０分間混合した。この反応混合物をＰＢＳ緩衝液で希釈して、「未精製コンジュゲート」アッセイにおいて使用した。同じ様式で調製したコンジュゲートを、「精製コンジュゲート」アッセイにおいて使用するため、当技術分野で公知である脱塩カラムを用いて精製した。
ＭｘＰＳＡ−ＡＫ１コンジュゲート溶液３０μＬ（６７ｎｇ）、キャリブレーター（０〜１２９ｎｇ／ｍＬのＰＳＡ）２４μＬ、ＭｘＰＳＡ−ＨＲＰコンジュゲート３０μＬ（７．８ｎｇ）、および血清３６μＬを、白色マイクロタイタープレートのウェル中にピペットで入れた。このプレートを３７℃で１０分間インキュベートした。アスコルビン酸溶液（５．５ｍＭ）５μＬを添加した。プレートを注入プレートルミノメーター内に配置した。トリガー溶液Ａ １００μＬをルミノメーターによって添加し、化学発光シグナルを、トリガー溶液を添加してから５秒間読み取った。
反応混合物中のＰＳＡの濃度の関数としての、「未精製」および「精製」ＭｘＰＳＡ−ＡＫ１コンジュゲートの反応についての、化学発光シグナル（相対発光単位、ＲＬＵ）の強度を以下の表に提供する。
表１４に提供したデータは、対数−対数プロットに変換したとき、ＰＳＡの対数濃度に対する化学発光シグナルの対数強度は、ＭｘＰＳＡ−ＡＫ１コンジュゲート試薬の精製のレベルに関係なく、０．５ｎｇ／ｍＬ〜１２９ｎｇ／ｍＬの範囲の［ＰＳＡ］内で単調であり、近似的に直線であることを示した。
（実施例４）
競合的イムノアッセイ
競合的イムノアッセイ反応において、標識された被検体と組み合わせて、化学発光標識捕捉抗体を利用する被検体のホモジニアスイムノアッセイを提供する。本例の被検体の環状−ＡＭＰ（「ｃＡＭＰ」）は、ＨＲＰとコンジュゲートされることによって、ｃＡＭＰ−ＨＲＰ試薬をもたらし、捕捉抗体（「捕捉Ａｂ」）（ＡＫ５とコンジュゲートされることによって捕捉抗体−ＡＫ５複合体を形成する）において、被検体ｃＡＭＰで競合する。したがって、本明細書に記載されるように、捕捉抗体−ＡＫ５−ｃＡＭＰ−ＨＲＰ複合体が形成され、トリガー溶液が添加されると、化学発光（すなわち、「光」）を、捕捉抗体−ＡＫ５−ｃＡＭＰ−ＨＲＰ複合体が形成される程度に対して観察することができる。ＨＲＰとコンジュゲートされない被検体（ｃＡＭＰ）は、捕捉抗体−ＡＫ１複合体で競合し、トリガー溶液が添加されると、得られる捕捉抗体−ＡＫ５−ｃＡＭＰ複合体は、化学発光をまったくもたらさない（すなわち、「光なし」）。したがって、被検体ｃＡＭＰは、捕捉抗体−ＡＫ５複合体で競合し、それによって、捕捉抗体−ＡＫ１−ｃＡＭＰ−ＨＲＰ複合体のためにシグナルを抑制する。
ウサギ抗ｃＡＭＰ（ＩＭＭＵＮＯＴＥＣＨ、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ）０．１ｍｇ（４．９３ｍｇ／ｍＬのストックから２０．３μＬ）を、１．７ｍＬの遠心管中で、ｐＨ８．２５の、０．１Ｍのホウ酸ナトリウム緩衝液１６２μＬに添加した。ＡＫ５ １７．６μｇ（ＤＭＦの１ｍｇ／ｍＬストックから１７．６μｌ）を添加した。素早くボルテックス混合した後、管を、回転振盪機上に室温で１時間置いた。３ｍｇ／ｍＬのストックからＬ−リシン１．２μＬを添加することによって反応をクエンチした。反応混合物を、０．４％のＢＳＡ、およびＰＢＳ中で希釈し（１：１）、４℃で貯蔵した。ｃＡＭＰ−ＨＲＰは、文献に従って調製した。例えば、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９２年、１５５巻 ３１〜４０頁を参照。ｃＡＭＰは、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから購入した。ｃＡＭＰの３０ｎＭのストックは、ＰＢＳ中で調製し、ＰＢＳ中でさらに希釈することによって、アッセイのための試料キャリブレーターを作製した。表１５を参照。
競合的イムノアッセイプロトコールは以下の通りであった。ＡＫ５標識モノクローナルウサギ抗ｃＡＭＰ（０．２７５μｇ／ｍＬ）（３μＬ）、ＨＲＰ標識ｃＡＭＰ（０．０９３７５μｇ／ｍＬ）（３μｌ）、およびｃＡＭＰキャリブレーター（４μｌ）を、白色ポリスチレン３８４低体積プレート中に添加した。コンジュゲート溶液は、ＢＳＡ中０．２％であった。室温で３０分インキュベートした後、２−アミノフェノール（０．６８７５ｍＭ）１μｌを添加し、その後トリガー溶液（１０μｌ）を添加した。トリガー溶液は、ｐＨ８の２５ｍＭのＴｒｉｓ、８ｍＭのｐ−ヒドロキシケイ皮酸、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％のＴｗｅｅｎ−２０、および０．１Ｍの尿素ペルオキシドを含有していた。光強度は、トリガーを注入した直後に１秒間測定した（Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘ）。反応物は、インキュベーションの間、光に曝さず、振盪しなかった。
以下の表１５に示したように、キャリブレーターを０．１３７ｎＭ〜１００００ｎＭの範囲内で使用した。データを表１５に提供する。このデータに関して、ｃＡＭＰについてのＩＣ５０は、２．６ｎＭであると計算された。データは、化学発光シグナルの完全な抑制は、１００ｎＭ過剰の被検体ｃＡＭＰレベルで実現することができることを実証する。
（実施例５）
化学発光標識、ビオチン化ＢＳＡ、ニュートラビジン、および抗体を含む化学発光標識ＳＢＰの調製
この実施例は、ビオチンとストレプトアビジンの非共有結合性相互作用を通じた自己組織化によって形成される、「四量体」骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄ）または複合体を記載する。この実施例は、四量体骨格を使用する、被検体のためのイムノアッセイも実証する。
Ａ．化学発光化合物およびビオチンを用いたＢＳＡの標識化：
スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ）およびＡＫ１−ＮＨＳエステル（Ｌｕｍｉｇｅｎ、Ｓｏｕｔｈｆｉｅｌｄ ＭＩ）で標識されたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、ＢＳＡ １モル当たりＡＫ１ ７モル；ＢＳＡ １モル当たりビオチン３モルのモル比で混合し、この混合物を、実施例１７に記載したように、ＰＤ−１０脱塩カラムに通して精製した。
Ｂ．ニュートラビジン−ＩｇＧコンジュゲートの調製
チオール化抗ＰＳＡモノクローナル抗体を、実施例２に記載したように調製した。
３倍モル過剰のマレイミド活性化ニュートラビジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、チオール化モノクローナル抗ＰＳＡ溶液（５ｍｇ）に添加し、暗所で、室温で１時間、ローテーター上でインキュベートした。コンジュゲート反応混合物にＬ−システインおよびヨードアセトアミドを連続添加することによって（各ステップ、１５分）、未反応のチオール基およびマレイミド基をブロックした。コンジュゲートを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）を通して精製し、ｐＨ７．４のＰＢＳ中で平衡化することによって、未反応のニュートラビジンを除去した。コンジュゲートを含有するＨＰＬＣ画分をプールし、四量体骨格複合体の調製に使用した。
Ｃ．ニュートラビジンをコンジュゲートされたＩｇＧ、および標識されたＢＳＡを含有する骨格複合体の調製
上記したような、３倍モル過剰の標識されたＢＳＡを、ニュートラビジンをコンジュゲートされたＩｇＧに添加し、周囲温度で３０分間、複合体を形成させた。最終生成物を、上記したようにＨＰＬＣによって精製し、生成物を、さらに使用するまで４℃で貯蔵した。
Ｄ．四量体骨格を用いたＰＳＡのイムノアッセイ
ＰＳＡについてのイムノアッセイは、実質的に実施例２に記載したように実施した。簡単に言えば、等体積（それぞれ２５μＬ）の四量体骨格、ＨＲＰコンジュゲート、６００μＭのアスコルビン酸、およびＰＳＡ試料を反応容器内で合わせ、３７℃で１５分間インキュベートした。インキュベートした後、反応容器内にトリガー溶液Ａ １００μＬを注入することによって、化学発光反応を開始した。注入と同時に、光電子増倍管（ＰＭＴ）を組み込んだルミノメーターによって、２７５ミリ秒の過程にわたって化学発光シグナルを検出し、データをコンピューターに保存した。
既知のＰＳＡ濃度の試料は、表１６に提供したＰＳＡ濃度に到達するように、先に記載したように調製した。次いで、試料を上記したように分析し、データを、未知のＰＳＡ濃度の試料を分析するための較正曲線を作成するのに使用した。
（実施例６）
化学発光標識補助物質（ａｕｘｉｌｌａｒｙ）、ビオチン化抗体、および自己組織化ストレプトアビジン−ＩｇＧポリマーの調製
この実施例では、ＡＫ１標識ストレプトアビジンをビオチン化抗体と混合し、それによって、自己組織化によるポリマーを形成した。これらの自己組織化ストレプトアビジン／ビオチン−ＩｇＧポリマーは、被検体をイムノアッセイするための骨格として使用することができる。
Ａ．ＡＫ１標識ストレプトアビジンの調製
ＡＫ１（Ｌｕｍｉｇｅｎ、Ｓｏｕｔｈｆｉｅｌｄ、ＭＩ）を、３０ｍｇ／ｍＬの濃度で無水ＤＭＳＯ中に溶解させた。６（６）モル当量を、５０ｍＭのＮａＣｌを含有する水中で調製した、ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｐｌｕｓ（登録商標）、Ｐｒｏｚｙｍｅ、Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）の１０．１ｍｇ／ｍＬの溶液に添加した。反応を暗所で６０分間進行させ、引き続いて、ｐＨ７．２のＰＢＳで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）を使用して、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。ＡＫ１１：タンパク質のモル比を、以下の式を使用してＵＶ分光法によって決定した：
［ＡＫ１１］＝Ａ３８４／１１，３８０ｃｍ−１Ｍ−１
［ストレプトアビジン］＝（Ａ２８０−（Ａ３８４／（Ａ３８４／Ａ２８０ ＡＫ１）））／１７６，０００ｃｍ−１Ｍ−１
第２の式を使用することによって、２８０ｎｍでのＡＫ１の吸光度を補正した。これらの条件下で、ストレプトアビジン当たり４．３ＡＫ１のＡＫ１１：ストレプトアビジンのモル比を、９４％の収率で実現した。
ＡＫ１１標識抗ｃＴｎＩモノクローナル抗体の調製
ＡＫ−１標識抗体は、直接標識ＩｇＧを調製するのに、ＩｇＧに１５倍モル過剰のＡＫ−１を使用したことを除いて、実施例２に記載したように調製した。
Ｂ．ビオチン化抗ｃＴｎＩモノクローナル抗体の調製
１０倍モル過剰のＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ）を、抗ｃＴｎＩモノクローナル抗体に添加し、この混合物を室温で２時間インキュベートした。ビオチン化抗体を、ｐＨ７．２のＰＢＳ中で透析によって精製した。ビオチン：抗体のモル比は、市販のビオチン定量化キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定した場合、４．９であった。
Ｃ．自己組織化ポリマー骨格の調製
自己組織化ポリマーは、２モル当量のビオチン化ｃＴｎＩ抗体を、１モル当量のＡＫ１１標識ストレプトアビジンに添加することによって調製した。この混合物を、暗所で、周囲温度で９０分間インキュベートすることによって、複合体を形成させた。この反応混合物を、実施例３に記載したように、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００カラムを通して精製した。高分子量（８００ｋＤａ→１．５ＭＤａ）コンジュゲートに対応するＨＰＬＣ画分をプールし、使用するまで４℃で貯蔵した。
Ｄ．ｃＴｎＩについてのイムノアッセイ
ｃＴｎＩについてのイムノアッセイを、以下のように実施した。自己組織化ポリマー骨格、または対照としての直接標識抗体、ＨＲＰコンジュゲート、６００μＭのアスコルビン酸、および試料のそれぞれ２５μＬを反応容器内で混合し、１５分間インキュベートした。インキュベートした後、反応容器内にトリガー溶液Ａ １００μＬを注入することによって、化学発光反応を開始した。トリガー溶液を反応容器内に注入すると同時に、光子計数光電子増倍管（ＰＭＴ）を組み込んだルミノメーターによって、２７５ミリ秒の過程にわたって化学発光シグナルを検出し、データをコンピューターに保存した。
既知の濃度のｃＴｎＩ試料は、表１７に示したｃＴｎＩ濃度に到達するように、既知量の天然ｃＴｎＩを正常ヒト血清に添加することによって調製した。各試料は、上記した、（およびＰＳＡのイムノアッセイについての実施例４における）方法によって三つ組で分析した。所与の時間間隔にわたって、各アッセイされる試料について収集されたＲＬＵデータを、それぞれ個々の実施について合計し、各試料について三つ組に対して平均した。シグナル対ノイズの比を、各既知の濃度の試料について決定した。
表１７中のデータは、両方のアッセイ形式について、０〜１９０ｎｇ／ｍｌの被検体ＴｎＩ濃度のイムノアッセイに関して、好結果の用慮反応を例示した。実施例６の結果はまた、アクリダンを用いて直接標識された抗体と比較した場合に、自己組織化ストレプトアビジン／ビオチン−ＩｇＧ（抗体）ポリマーを利用するアッセイについて、シグナル強度（平均ＲＬＵによって示される）の増大およびシグナル対ノイズ（Ｓ／Ｓ０）の改善を示した。
（実施例７）
化学発光標識、ＫＬＨ、およびストレプトアビジン−ビオチン結合抗体を含む化学発光標識ＳＢＰの調製
この実施例は、大きいポリマー骨格の調製における、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）の使用を実証する。マレイミド活性化ＫＬＨを抗体とコンジュゲートし、ＡＫ１を用いて標識化することによって骨格を形成した。この実施例は、被検体についてのイムノアッセイにおける、そのような骨格の使用も実証する。
Ａ．ｃＴｎＩモノクローナル抗体のチオール化
５０ｍＭのＮ−アセチルホモシステインラクトン（ＡＨＴＬ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）をｐＨ９．０で抗体に添加し、この混合物を室温で１時間反応させることによって、モノクローナル抗ｃＴｎＩをチオール化した。このチオール化抗体を、実施例２に記載したように、ＰＤ−１０脱塩カラムを使用して精製した。
Ｂ．ＫＬＨ骨格の調製および標識化
チオール化抗−ｃＴｎＩ ３．４ｍｇを、マレイミド活性化ＫＬＨ（製品番号７７６０５、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）１０ｍｇに添加し、得られた溶液を室温で２時間インキュベートした。抗体−ＫＬＨコンジュゲートを標識するために、ＤＭＳＯ ０．７ｍＬ中に溶解したＡＫ１−ＮＨＳエステル０．９ｍｇを溶液に添加し、１５分間反応させた。次いで、３０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ｕｌｔｒａｃｅｌｌ遠心濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ ＭＡ）を使用して、緩衝液交換（２０ｍＭのホスフェート、１ｍＭのＥＤＴＡ）によって、このコンジュゲートを精製した。
Ｃ．大きいタンパク質ＫＬＨ骨格を用いたイムノアッセイ
大きいタンパク質ＫＬＨ骨格を使用する、ｃＴｎＩについてのイムノアッセイは、実施例６に記載したように実施した。既知のｃＴｎＩ濃度の試料は、実施例６に記載したように調製した。簡単に言えば、等体積（２５μＬ）の１０μｇ／ｍＬ（ＩｇＧ濃度に正規化された）のＫＬＨ骨格、１μｇ／ｍＬのＨＲＰコンジュゲート、水中の６００ｍＭのアスコルビン酸、および試料を、反応容器内で一緒に混合した。混合物を、トリガー溶液Ａ（すなわち、トリガー溶液）１００μＬと共にインキュベートすることによって、化学発光反応を開始した。化学発光反応を開始した後、高速読取りキネティックモードで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｌマイクロプレートルミノメーターで試料を読み取り、化学発光シグナルを、約０．１２〜０．２１秒の時間期間にわたって記録した。このイムノアッセイの結果を表１８に示す。
（実施例８）
化学発光標識、ストレプトアビジン微粒子、およびビオチン化抗体を含む化学発光標識ＳＢＰの調製
この実施例は、脱溶媒和による、ＡＫ１標識ストレプトアビジンからのタンパク質微粒子の調製を記載する。ビオチン化抗体とカップリングした後、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔｒａｖｉｄｉｎ）粒子を、イムノアッセイのための骨格として使用することができる。
Ａ．タンパク質微粒子の調製
ＡＫ１標識ストレプトアビジンを、実施例６に記載したように調製した。ＡＫ１標識ストレプトアビジン９．８ｍｇ（２ｍＬ）を、４ｍＬのガラス反応バイアルに添加し、テフロン（登録商標）撹拌子を使用して、３５０ｒｐｍの一定速度で撹拌した。次いで、無水エタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）２．８ｍＬを、溶液が濁るまで、２ｍＬ／分の速度で、液滴で添加した。次いで、５％のグルタルアルデヒド溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；蒸留水中で１：１０に希釈した）１２μＬを、反応物に添加し、さらに６０分間混合することによって、脱溶媒和によって形成された粒子のストレプトアビジンサブユニットを架橋した。グルタルアルデヒドのモル量は、ストレプトアビジン９．８ｍｇ中に存在するリシン残基の数と等しかった。次いで０．８３２Ｍのエタノールアミン水溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１２μＬを添加することによって、反応をクエンチし、その後、２０％のＴｗｅｅｎ（登録商標）−２０水溶液２．８μＬを添加することによって粒子を安定化させた。
粒子をＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）中に入れ、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する、ｐＨ７．４のＰＢＳに対して４℃で透析した。透析緩衝液（１Ｌ）を、２４時間の期間にわたって２回交換することによって、反応副生成物を除去した。次いで、粒子溶液のストレプトアビジン濃度を、市販のビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイキット（製品番号２３２２７、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。ＳＡ−２１ストレプトアビジン（Ｅ２８０＝３．２ｃｍ−１ｍｇ／ｍＬ−１）を使用することによって、既知の濃度で標準物質を調製し、粒子のタンパク質濃度を、標準物質または較正曲線から計算した。
精製した粒子を、Ｄｅｌｓａ（商標）Ｎａｎｏ Ｚｅｔａ ＰｏｔｅｎｔｉａｌおよびＳｕｂｍｉｃｒｏｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、光子相関分光法によって分析し、約４ミクロンの平均直径を有することが判明した。本明細書に記載される条件（粒子を脱溶媒和するのに使用される溶媒の体積、反応ｐＨなど）を変更することによって、所望の粒径（約２００ｎｍ〜４μｍ）を実現することができた。
Ｂ．ストレプトアビジン粒子を使用するｃＴｎＩについてのアッセイ
ＡＫ１標識ストレプトアビジン粒子に、ビオチン化抗ｃＴｎＩ抗体を、ｐＨ７．４のＰＢＳ中で、粒子１ｍｇ当たりＩｇＧ ０．２３ｍｇの比でコーティングした。この混合物を、穏やかに振盪しながら室温で３０分間インキュベートすることによって、ビオチン化ＩｇＧを、ストレプトアビジン粒子と複合体形成させた。次いで、粒子を１０，０００×ｇで５分間遠心分離し、任意の非結合ＩｇＧを含有する上澄みを除去した。粒子ペレットを、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する、ｐＨ７．４のＰＢＳ中に再懸濁し、１００μｇ／ｍＬのストレプトアビジンの最終濃度にした。
０．１５μｇ／ｍＬの濃度で抗ｃＴｎＩ抗体をコーティングされた５０μｇ／ｍＬのストレプトアビジン粒子、西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲート、３７５μＭのアスコルビン酸、および１ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ（ＢＣＩ 品目２７０９０４）を含有する混合物を、アッセイ希釈剤中で調製した。アッセイは、反応容器にＨＲＰコンジュゲート／粒子混合物７０μＬおよび各試料３０μＬを添加することによって実施した。既知のｃＴｎＩ濃度の試料は、既知量の天然ｃＴｎＩ（Ｓｃｉｐａｃ、Ｓｉｔｔｉｎｇｂｏｕｒｎｅ ＵＫ）を正常ヒト血清中にスパイクすることによって調製し、試料濃度は、ＡｃｃｕＴｎＩアッセイ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）から生じる用量値から定めた。室温で１５分インキュベートした後、高速キネティック読取りモードで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｌマイクロプレートルミノメーター（ＭＤＳ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で試料を読み取った。化学発光反応を開始するために、化学発光シグナルをモニターしながら、３５０μＬ／秒の速度で等体積のトリガー溶液Ａを注入した。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェアを利用してデータを分析した。値は、化学発光を開始して３０ｍｓ後に始めて、２０データ点（１０ｍｓの積分時間）の合計として報告し、表１９に示す。
（実施例９）
デキストラン骨格およびＳＳＩＡを含む化学発光標識ＳＢＰを用いたＰＳＡのアッセイについての、アッセイ成分濃度の変化
以下の実施例は、化学発光化合物で直接標識された可溶性デキストラン骨格および抗体を含む化学発光標識ｓｂｐを利用する、被検体のイムノアッセイを実証する。
この実施例では、ＰＳＡに対するモノクローナル抗体の特異的結合対の１つのメンバーが、抗体がチオール化されており、ＡＫ１１で標識され、かつマレイミドで活性化されたデキストランに共有結合的に連結していることを除いて、以下の実施例１０に記載されているように、ＡＫ１とカップリングしたデキストラン分子にコンジュゲートされている。抗ＰＳＡ−デキストランコンジュゲートは、以下の表に示したように、１０μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、または０．５μｇ／ｍｌの水溶液で提供した。第２のモノクローナルＰＳＡ抗体は、上記したようにＨＲＰにコンジュゲートし、以下の表に示したように、０．５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、または０．０３μｇ／ｍｌの水溶液で提供した。
アッセイは、２つの各反応容器内に試料２５μｌを入れることによって実施した。第１の反応容器内の試料に、Ａｂ１溶液２５μｌ、水２５μｌ、Ａｂ２溶液２５μｌを添加し、１５分間インキュベートした。第２の反応容器内で、Ａｂ１溶液２５μｌ、２００μＭまたは５００μＭの濃度（以下の表に示したように）の脱イオン水中のアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、およびＡｂ２溶液２５μｌを、試料２５μｌに添加し、１５分間インキュベートした。インキュベートした後に、トリガー溶液Ａ １００μｌを注入することによって、各反応容器内の化学発光反応を開始した。トリガー溶液を反応容器内に注入すると同時に、光子計数光電子増倍管（ＰＭＴ）を組み込んだルミノメーターによって、３．８５秒の過程にわたって化学発光シグナルを検出し、データをコンピューターに保存した。
各試料を、上記アッセイ法に従って三つ組で分析した。反応容器内にトリガー溶液の導入を開始して８２．５ミリ秒から始めて４９５ミリ秒の時間間隔の間に、各アッセイされる試料について収集されたＲＬＵデータをそれぞれ個々の実施について合計し、各試料についての三つ組に関して平均し、表２０に示した。シグナル対ノイズの比（Ｓ／Ｓ０）を各濃度値で計算した。表２０中のデータを使用することによって、未知のＰＳＡ濃度の試料を分析するための較正曲線を作成し得る。
既知の濃度の試料は、先に記載したように調製した。各試料を、上記方法に従って三つ組で分析した。
これらの次の実証アッセイは、先の実施例と同様の反応物を利用する。ＰＳＡについての特異的結合対の１つのメンバーを、ＡＫ１とカップリングしたデキストラン分子にコンジュゲートし、以下の表に示したように、１０μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、または０．５μｇ／ｍｌの水溶液で提供する。第２のモノクローナルＰＳＡ抗体は、上記したようにＨＲＰにコンジュゲートし、以下の表に示したように、０．５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、または０．０３μｇ／ｍｌの水溶液で提供した。
各試料を、以下の方法に従って三つ組で分析した。
アッセイは、反応容器内に試料２５μｌを入れ、次いで、Ａｂ１溶液２５μｌ、以下の表に示したように、２００μＭまたは５００μＭの濃度の水中のアスコルビン酸、およびＡｂ２溶液２５μｌを添加し、それによって反応混合物を作り出すことによって実施した。混合は、各反応物の送達によってのみであり、その後１５分インキュベートした。インキュベートした後、化学発光反応を、各反応容器内にトリガー溶液Ａ １００μｌを注入することによって開始し、反応によって生じる光を、３．８５秒間、光子計数ルミノメーターによって検出し、ＲＬＵデータをコンピューターに保存した。
反応容器内にトリガー溶液の導入を開始して１２５ミリ秒から始めて４９５ミリ秒の時間間隔の間に、各アッセイされる試料について収集されたＲＬＵデータを、それぞれ個々の実施について合計し、各試料についての３回の繰り返しに関して平均し、表２１〜２３に示した。シグナル対ノイズの比（Ｓ／Ｓ０）および％ＣＶを、各濃度値で計算した。表中のデータを使用することによって、この実施例の材料およびガイダンスを利用してＰＳＡ濃度を決定するための、試料を分析するための較正曲線を作成することができる。
実施例９の結果は、イムノアッセイの成功は、化学発光標識ｓｂｐ濃度、アクチベーター標識ｓｂｐ濃度、およびＳＳＩＡ濃度、ならびにこれらの反応物の様々な比によって多様であることを実証した。実施例９の方法は、標準的な方法によってＰＳＡ濃度を決定するための較正曲線の作成を含めた、未知の試料中の被検体濃度の決定において使用するのに適している。
（実施例１０）
化学発光標識、デキストラン−ストレプトアビジン骨格、およびビオチン結合抗体を含む化学発光標識ＳＢＰの調製、ならびに様々なＳＳＩＡを用いた、ＴｎＩ、ＣＫＭＢ、またはミオグロビンについてのアッセイにおける使用
Ａ．化学発光化合物およびアミンおよびスルフヒドリル反応性ヘテロ二官能性架橋剤でのアミノ改変デキストランの標識化：
ＮＨＳ−（ＰＥＯ）８−マレイミド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）５．２ｍｇ、およびＡＫ１、アクリダンケテンジチオアセタール−ＮＨＳエステルアンモニウム塩２２．１ｍｇをＤＭＳＯ中に溶解させて３０ｍｇ／ｍＬにし、合わせ、ポリプロピレン反応容器内で、１４ｍｇ／ｍＬでｐＨ７．２のＰＢＳ中に溶解した７０ｋＤａのポリアミノデキストラン（Ｈｅｌｉｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、製品番号１２０９；デキストラン１モル当たりＮＨ２ ７０モル）３５ｍｇに添加した。反応混合物を、光から保護して、周囲温度で４５分間インキュベートした。ポリアミノデキストラン上の未反応のアミノ基は、ＭＳ（ＰＥＧ）８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）１０μＬと共にコンジュゲートを、暗所で、周囲温度でさらに１０分間インキュベートすることによってブロックした。活性化されたデキストランを、製造者の指示書に従って、マイクロ遠心分離（１４Ｋ×ｇ、１分）によって澄ませ、１ｍＭのＥＤＴＡを含有するｐＨ７．２のＰＢＳ中で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を通して精製した。
Ｂ．ストレプトアビジンのチオール化：
５０倍モル過剰（５．６３ｍｇ）の２−イミノチオラン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を、ストレプトアビジン−ｐｌｕｓ（登録商標）（Ｐｒｏｚｙｍｅ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）４５ｍｇ（１０ｍｇ／ｍＬ）に添加した。ｐＨ７．４のＰＢＳ（１ｍＬ）を混合物に添加することによって、反応物のｐＨを７．０に上昇させた。混合物を、暗所で、周囲温度で４５分間インキュベートした。チオール化ストレプトアビジンを、製造者の指示書に従って、１ｍＭのＥＤＴＡを含有するｐＨ７．２のＰＢＳ中で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を通して精製した。
Ｃ．ＡＫで誘導体化され、マレイミドで活性化されたデキストランへの、チオール化ストレプトアビジンのコンジュゲーション
次に、活性化デキストラン（Ａ）およびチオール化ストレプトアビジン（Ｂ）を組み合わせ、光から保護して、周囲温度で一晩反応させた。未反応のマレイミド基およびチオール基を、２ステッププロセスにおいて引き続いてブロックした。第１のステップにおいて、過剰（０．０２５×反応体積）の５０ｍｇ／ｍＬのＬ−システイン−ＨＣｌ（ｐＨ７．４のＰＢＳ中に溶解した）を、コンジュゲートに添加し、１５分間インキュベートした。第２のステップにおいて、過剰（０．０４×反応体積）の５０ｍｇ／ｍＬのヨードアセトアミド（ｐＨ７．４のＰＢＳ中に溶解した）を、ｐＨ８．５の５０ｍＭのボレート（０．０８×反応体積）と一緒に反応混合物に添加し、光から保護して、周囲温度でさらに１５分間インキュベートした。
Ｄ．ストレプトアビジン〜デキストラン〜ＡＫ１コンジュゲートの精製
コンジュゲートをマイクロ遠心分離（１４Ｋ×ｇ、２分）によって澄ませ、Ｇｉｌｓｏｎ ＦＣ ２０３Ｂフラクションコレクターに結合したＢｉｎａｒｙ Ｇｒａｄｉｅｎｔ １２５ポンプおよびダイオードアレイ１６８検出器を有するＳｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ（登録商標）ＨＰＬＣシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｉｎｃ．、Ｂｒｅａ、ＣＡ）において、ｐＨ７．４のＰＢＳ中で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を通して精製した。プログラムされた流速は１ｍＬ／分であり；試料注入ループ体積は１ｍＬ；分画は１ｍＬ／画分であった。コンジュゲート画分を慎重にプールすることによって、コンジュゲート後に溶出する少量の未反応のストレプトアビジンを除外した。プールされたコンジュゲート中のストレプトアビジンの濃度を、標準物質として所定の濃度のストレプトアビジンｐｌｕｓ（登録商標）を使用して、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて決定した。ＡＫ１の濃度は、分光光度法で決定した（Ｅ３８４＝１３．６ｍｇ−１ｍＬ−１）。コンジュゲートプールの計算されたストレプトアビジン濃度およびＡＫ：ストレプトアビジンのモル比は、それぞれ１．４７ｍｇ／ｍＬおよび１８：１であった。
Ｅ．ｘＰＳＡモノクローナル抗体のビオチン化
ビオチン化ＰＳＡ抗体は、ＤＭＳＯ中で２ｍｇ／ｍＬに溶解した６倍モル過剰のＮＨＳ−（ＰＥＯ）４−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を、ＭｘＰＳＡ抗体（ｐＨ７．４のＰＢＳ中７．６ｍｇ／ｍＬ）６ｍｇに添加することによって調製した。周囲温度で６０分インキュベートした後、ビオチン化抗体を、製造者の指示書に従って、ｐＨ７．４のＰＢＳ中で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を通して精製した。
Ｆ．ビオチン化抗体の、ストレプトアビジン〜デキストラン〜ＡＫコンジュゲートへのカップリング
カップリングは、ストレプトアビジン〜デキストラン〜ＡＫコンジュゲート（１．４７μｇ／ｍＬ）を、ビオチン化抗ＰＳＡモノクローナル（２μｇ／ｍＬ）と共に、希釈剤（１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．２％のＴｗｅｅｎ（登録商標）−２０、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＢＳＡ）中で、３０分間インキュベートすることによって実施した。これは、２：１のストレプトアビジン：ビオチン化抗体のモル比に対応する。
Ｇ．デキストラン骨格化学発光標識ｓｂｐおよびＳＳＩＡを用いたＴｎＩ、ＣＫＭＢ、またはミオグロビンのアッセイ
この実施例は、被検体、例えば、トロポニンＩ、ＣＫＭＢ、またはミオグロビンなどを検出するためのアッセイ法を実証する。各アッセイについて、使用した特異的結合対は、モノクローナル抗体の対であり、各抗体は、指定された被検体上の異なる抗原部位に特異的である。各アッセイについて、第１の抗体は、ビオチン化し、デキストラン−ＡＫ１−ストレプトアビジン骨格（「Ａｂ骨格」）にコンジュゲートし、実施例５で上記したものと同様の方法によって調製し、０．５μｇ／ｍｌまたは２μｇ／ｍｌの水溶液で提供した。各アッセイについての第２の抗体は、上記したようにＨＲＰとコンジュゲートし（「ＨＲＰコンジュゲート」）、水溶液（１００ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０、０．２％のＴｗｅｅｎ２０、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＢＳＡ）中、０．２５μｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌで提供した。
各アッセイは、Ａｂ骨格２５μｌ、水中の６００μＭのアスコルビン酸２５μｌ、試料２５μｌ、およびＨＲＰコンジュゲート２５μＬを、反応容器に添加することによって実施した。この反応混合物を、３７℃で１５分間インキュベートした。反応容器をルミノメーターによる検出のために配置し、次いで、トリガー溶液Ａ １００μＬを添加し、数秒の時間期間にわたって光強度を記録した。ピークシグナルにほぼ中心を合わせた３０２．５ミリ秒の経過時間に対応して、ルミノメーターによって収集したデータを合計し、１試料当たり３回の実施にわたって平均し、表２４〜２６に示した。シグナル対ノイズを各試料について計算した。
この実施例の結果は、本アッセイの、他の被検体への適用を実証する。さらに、この実施例は、化学発光標識ｓｂｐ、アクチベーター標識ｓｂｐ、およびＳＳＩＡについての、様々な濃度および比の反応物を利用するアッセイを首尾よく実証する。実施例７の方法は、標準的な方法によってＴｎＩ、ＣＫＭＢ、またはミオグロビンの濃度を決定するための較正曲線の作成を含めた、未知の試料中の被検体濃度の決定において使用するのに適している。
アッセイは、上記したような改変ＤｘＩ（登録商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）自動イムノアッセイ機器を使用して実施した。
Ｈ． ＴｎＩアッセイにおける様々なＳＳＩＡを利用するアッセイ
複数の濃度レベルの５つの異なるＳＳＩＡを、本開示によるＴｎＩアッセイシステムとの関連で実証した。すべてＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能な、アスコルビン酸、ＴＲＯＬＯＸ、フェノキサジン、３−アミノチロシン、および２−アミノフェノールの濃縮原液を、脱イオン水で１００ｍＭに調製した。
反応管内で、ｐＨ．８．０の緩衝水溶液（１００ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％のＴｗｅｅｎ−２０、および１％のＢＳＡ）中の０．５μｇ／ｍＬのＴｎＩ Ｍ６抗体ＨＲＰコンジュゲート４００μＬ、やはりｐＨ８．０の緩衝水溶液中の２μｇ／ｍＬのＡｂで２：１のＳＡ／ＡｂのＡＫ１〜Ｄｅｘ７０／３１〜ストレプトアビジン（画分１）４００μＬ、および既知の濃度のＴｎＩ被検体を含有するキャリブレーター標準溶液４００μＬ。１つの管を、各キャリブレーター濃度のために準備した。Ａｂ−ＨＲＰコンジュゲート、骨格、および標準物質のプレミックス溶液７５μＬを、Ｃｏｒｎｉｎｇ／Ｓｏｓｔａｒ９６ウェルポリプロピレンマイクロタイタープレート（白色、Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号３３５５）の各ウェル中にオクタペット（ｏｃｔａｐｅｔ）によって送達し、室温で３８〜４９分間インキュベートさせた。次に、２ｍＭ、１ｍＭ、または０．５ｍＭの濃縮溶液としての各抗酸化剤２５μＬを、リピーターピペットを使用してプレートのウェル中にピペッティングした。プレートを１０秒間回転して混合し、５〜３３分の間インキュベートした。検出は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｌ注入プレートルミノメーターを用いて実施した。ベースラインの読みを取得し、トリガー溶液Ａ １００μＬを各ウェル中に注入し、化学発光シグナルを読み取った。
結論：この代表的なＴｎＩ溶液相アッセイ形式で試験されたすべてのＳＳＩＡは、シグナル対ノイズの改善に有効に挙動した。
（実施例１１）
化学発光標識、ＰＡＡ骨格、およびストレプトアビジン−ビオチン結合抗体を含む化学発光標識ＳＢＰの調製
この実施例は、ストレプトアビジンにカップリングし、ビオチン化抗体にコンジュゲートしたポリ（アクリル酸）主鎖を有する骨格の形成を記述する。この実施例は、ＰＡＡ骨格を使用する被検体のためのイムノアッセイも記述する。
Ａ．化学発光化合物およびビオチンを用いたポリアクリル酸（ＰＡＡ）の標識化：
ポリアクリル酸（ＰＡＡ）ナトリウム塩（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ ＰＡ）２ｍｇを、ｐＨ６．０の１００ｍＭのＭＥＳ ０．４ｍＬ中に溶解させた。ＥＤＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）５０（５０）モル当量（２０ｍｇ）およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）６ｍｇを脱イオン水中に溶解させ、カルボキシレート基を活性化するために混合しながら、ＰＡＡ溶液に添加した。活性化して２０分後に、ビオチン−ＰＥＧ４−ヒドラジド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）５０モル当量（０．８４３ｍｇ）、および無水ＤＭＳＯ中で調製したＡＫ１−ヒドラジド５０モル当量（１．０１ｍｇ）を、ＰＡＡ溶液に添加し、混合しながら室温で一晩反応させた。標識されたＰＡＡを、１０ｋＤａ ＭＷＣＯ遠心濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ ＭＡ）を使用して、ｐＨ７．２のＰＢＳ中で、緩衝液交換によって精製し、５（５）回交換した後、ＰＢＳで元の体積に回復させた。ビオチンおよびＡＫ１標識ＰＡＡを、ＰＡＡ−Ｂと指定した。
Ｂ．標識されたＰＡＡのストレプトアビジンとのカップリング
ビオチンおよびＡＫ１で標識したＰＡＡ（ＰＡＡ−Ｂ）の０．７５ｍｇ／ｍＬの溶液を、ｐＨ７．４のＰＢＳ中で調製した。ＰＡＡ−Ｂ １００μＬを、ストレプトアビジンとＰＡＡの２：１のモル比に対応するストレプトアビジン（Ｐｒｏｚｙｍｅ、Ｈａｙｗａｒｄ ＣＡ）の１０ｍｇ／ｍＬの溶液１３．７５μＬと混合し、この混合物を４℃で一晩インキュベートした。
Ｃ．最終的な骨格を形成するための、ストレプトアビジン−ＰＡＡコンジュゲートへのビオチン化抗体のカップリング
先の実施例で実証したように、抗体をビオチン化した。ＰＡＡ骨格は、ストレプトアビジン−ＰＡＡ−Ｂコンジュゲートをビオチン化抗ｃＴｎＩと共に、４℃で一晩インキュベートすることにより、ストレプトアビジン−ＰＡＡ−Ｂコンジュゲートを抗体にカップリングすることによって形成した。ストレプトアビジン：抗体のモル比は、１：１から１：４まで変化した。
Ｄ．ＰＡＡ骨格を用いたＴｎＩのイムノアッセイ
ＰＡＡ骨格は、実施例６に記載したように、ｃＴｎＩなどの被検体を検出するためのアッセイ法において有用である。ＴｎＩについての第１の抗体を、上記したように調製したＰＡＡ−ＡＫ１−ストレプトアビジン骨格にコンジュゲートし、２μｇ／ｍＬの水溶液で提供した。次いで、実施例２に記載したように、第２の抗体をＨＲＰにコンジュゲートさせ、水溶液中０．５μｇ／ｍＬで提供した。
イムノアッセイは、実施例１７に記載したように実施した。簡単に言えば、等体積のＰＡＡ骨格、ＨＲＰコンジュゲート、水中６００μＭのアスコルビン酸、および被検体試料を、９６ウェルマイクロタイタープレート中で一緒に混合した。
ｃＴｎＩ試料を、実施例６に記載したように、既知量の天然の心臓トロポニンＩ（Ｓｃｉｐａｃ；Ｓｉｔｔｉｎｇｂｏｕｒｎｅ ＵＫ）を正常ヒト血清に添加することによって調製した。簡単に言えば、既知濃度のＴｎＩを正常ヒト血清中にスパイクし、上記したアッセイに従って分析した。データは、未知の濃度のＴｎＩを分析するための較正曲線を作成するのに使用することができる。
ｂ：出力（ＳＡ：ＰＡＡのモル比）は、標準物質としてストレプトアビジンを使用することによって、サイズ排除クロマトグラフィー分析から計算した。
（実施例１２）
化学発光標識ＳＢＰ、ＰＡＡ骨格、およびチオール化抗体の調製
この実施例は、ＥＤＣ化学を使用してＡＫ１およびマレイミドで標識され、チオール−マレイミド反応を介してモノクローナル抗ＴｎＩ（２８４）抗体とコンジュゲートしたＰＡＡ骨格の調製を記述する。この実施例は、ＰＡＡ骨格を使用する被検体のためのイムノアッセイも実証する。
Ａ．化学発光化合物およびヘテロ二官能性架橋剤でのＰＡＡの標識化
ＡＫ１およびマレイミドで標識したＰＡＡ（分子量約２２５，０００）を、（Ｎ−［ｋ−マレイミドウンデカン酸］ヒドラジド）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）２０モル当量、および無水ＤＭＳＯ中で調製したＡＫ２ ２０モル当量をＰＡＡ溶液に添加し、混合しながら室温で１時間反応させたことを除いて、実施例１１に記載したように調製した。標識されたＰＡＡを、１０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（登録商標）透析カセット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ｐＨ７．２のＰＢＳに対する透析によって精製した。ＰＡＡの最終濃度は、透析の間にポリマーの損失がまったくないと仮定して、１．４ｍｇ／ｍｌであった。
Ｂ．モノクローナル抗ＴｎＩ（２８４）抗体のチオール化
モノクローナル抗ＴｎＩ（２８４）抗体は、１００ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０の緩衝液に対して透析した後に使用した。トラウト試薬（２−イミノチオラン・ＨＣｌ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、２ｍｇ／ｍＬの濃度で脱イオン水中に溶解させた。３．２ｍｇ／ｍＬの濃度の抗体６．４ｍｇを、２−イミノチオラン２．３６μＬ（抗体１当量当たり１０モル当量）と、室温で１時間反応させた。チオール化抗体を、ｐＨ７．２のＰＢＳで平衡化され、１ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）を使用して精製した。
Ｃ．チオール化抗体のＡＫ１およびマレイミドで標識したＰＡＡへのカップリング
１．４ｍｇ／ｍｌの濃度の、ＡＫ１およびマレイミドで標識したＰＡＡ溶液１０５μＬを、ＰＡＡ １当量当たり抗体６当量に対応する、３．８ｍｇ／ｍＬの濃度のチオール化モノクローナル抗ＴｎＩ（２８４）抗体０．６ｍｇと直ちに混合した。反応は４℃で実施し、反応生成物をサイズ排除ＨＰＬＣによって精製した。生成物ピーク（表２９でＦｒ３、Ｆｒ４、およびＦｒ５と表した）の個々のＨＰＬＣ画分を、イムノアッセイで評価した。
Ｄ．ＰＡＡ骨格を用いたモノクローナル抗ＴｎＩ抗体についてのイムノアッセイ
ＡＫ１およびマレイミドで標識したＰＡＡ骨格を使用する、モノクローナル抗ＴｎＩについてのイムノアッセイは、実施例２０に記載したように実施した。簡単に言えば、等体積のＡＫ１およびマレイミドで標識したＰＡＡ骨格、ＨＲＰコンジュゲート、水中６００μＭのアスコルビン酸、および試料を、反応容器内で３０分間一緒に混合した。この混合物を、トリガー溶液Ａ、すなわち、トリガー溶液１００μＬと共にインキュベートすることによって、化学発光反応を開始した。開始した後、試料を、高速読取りキネティックモードで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｌマイクロプレートルミノメーターで読み取り、化学発光シグナルを、約０．１２〜０．２１秒の時間期間にわたって記録した。各試料について、５つ（５）のベースラインの読みを収集した後、トリガー溶液の添加によって開始した。表２９に報告した値は、複数のデータ点の合計である。
（実施例１３）
化学発光標識、自己組織化ポリマー、およびストレプトアビジン−ビオチン結合抗体を含む化学発光標識ｓｂｐの調製
以下の実施例において、ＡＫ１標識ストレプトアビジンをビオチン化ポリアクリル酸（ＰＡＡ）と混合し、自己組織化によってポリマー複合体が形成する。これらの自己組織化ポリマーは、被検体のイムノアッセイのための骨格材料として機能する。
Ａ．ビオチン化ＰＡＡの調製
ＡＫ１標識ストレプトアビジンおよびビオチン化モノクローナルｃＴｎＩ２８４抗体を、実施例６に記載した方法によって調製した。
２２５ｋＤａのポリ（アクリル酸）ナトリウム塩２００ｍｇを、ｐＨ６．０の１００ｍＭのＭＥＳ ７０ｍＬ中に溶解させた。カルボキシレート基を活性化するために、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド２ｇ、およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド０．９ｇを、脱イオン水１０ｍＬ中に溶解させ、混合しながらＰＡＡ溶液に添加した。２０分間活性化した後、無水ＤＭＳＯ中、２．２５ｍｇ／ｍＬの濃度で調製したビオチン−ＰＥＧ４−ヒドラジド４５ｍｇをＰＡＡ溶液に添加し、室温で一晩混合させた。次いで、ビオチン化ＰＡＡを、脱イオン水に対して広範に透析することによって反応副生成物を除去した。透析後、ビオチン化したポリマーを、真空下でＳｐｅｅｄＶａｃ（登録商標）濃縮器（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｓａｖａｎｔ）で乾燥させ、乾燥したポリマー（１１０ｍｇ）を、２ｍｇ／ｍＬの濃度で、ｐＨ７．２のＰＢＳ中に溶解させた。ビオチン：ＰＡＡのモル比（２５ビオチン：ＰＡＡ）を、市販のＨＡＢＡアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定した。
（実施例１４）
化学発光標識、ＰＡＡを用いる自己組織化ポリマーを含む化学発光標識ＳＢＰの調製
この実施例では、ビオチン化ポリアクリル酸（ＰＡＡ）を使用することによって、実施例６に記載したように、自己組織化によって形成されるポリマー複合体についての重合反応を停止し、形成後のポリマーを安定化させる。簡単に言えば、ビオチン化抗体を、最適化されたモル比でＡＫ１標識ストレプトアビジンとアセンブルする（先に記載したように）。次いで、ビオチン化ポリアクリル酸（ＰＡＡ）を添加することによって、自己組織化ポリマーを安定化させる。
Ａ．自己組織化ポリマーの調製
２．６６ｍｇ／ｍＬの濃度のビオチン化ＩｇＧを、０．５８４ｍｇ／ｍＬの濃度のＡＫ１標識ストレプトアビジンと混合し、実施例７に記載したように調製した。０．２５〜１．２５の様々な比のビオチン化ＩｇＧ：ＡＫ１標識ストレプトアビジン、およびその混合物を、４℃で一晩インキュベートすることによって、自己組織化させた。
Ｂ．ハイブリッドコンストラクトの調製
自己組織化コンストラクトを等体積に分割し、ビオチン化ＰＡＡを、０〜１の、ＰＡＡ：ストレプトアビジンの様々なモル比で添加した。反応は、４℃で実施し、一晩インキュベートすることによって、安定なハイブリッドＰＡＡコンストラクトを形成した。
Ｃ．ＰＡＡハイブリッド骨格を用いたイムノアッセイ
ＰＡＡハイブリッド骨格を使用する、モノクローナル抗ＴｎＩについてのイムノアッセイは、実施例１１に記載したように実施した。簡単に言えば、等体積のＰＡＡ骨格、ＨＲＰコンジュゲート、水中６００ｍＭのアスコルビン酸、および試料を、反応容器内で一緒に混合した。この混合物を、トリガー溶液Ａ、すなわち、トリガー溶液と共にインキュベートすることによって、化学発光反応を開始した。化学発光反応を開始した後、試料を、高速読取りキネティックモードで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｌマイクロプレートルミノメーターで読み取り、化学発光シグナルを、約０．１２〜０．２１秒の時間期間にわたって記録した。イムノアッセイの結果を、表３０Ａ〜３０Ｅに示す。
（実施例１５）
化学発光標識、ポリマーＨＲＰコンジュゲート、およびストレプトアビジン−ビオチン結合抗体を含む化学発光標識ＳＢＰの調製
この実施例は、ＩｇＧおよび酵素西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のポリマーコンジュゲートの調製、および溶液相イムノアッセイのための骨格材料としてのその使用を実証する。
Ａ．ＨＲＰ−ＩｇＧコンジュゲートの調製
酵素の過ヨウ素酸塩酸化のために、ＨＲＰを、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で水中に溶解させた。新たに調製した０．０８８Ｍの過ヨウ素酸ナトリウム１００μＬを、４℃で撹拌しながらＨＲＰに添加し、適切な時間（すなわち、２０〜４０分間）反応させた。エチレングリコールなどのジオールを添加することによって酸化反応をクエンチし、４℃でさらに２０分間インキュベートさせた。酸化した酵素をＰＤ１０カラムで脱塩し、ＰＢＳなどの適切な反応緩衝液中に溶出することによって、過剰の酸化反応物およびクエンチング反応物から酵素を分離した。
酸化したＨＲＰのＩｇＧとのコンジュゲートは、還元的アミノ化によって調製した。ＩｇＧを酸化したＨＲＰと、ＩｇＧとＨＲＰの１：１の体積比および１：４〜１５のＩｇＧ：ＨＲＰモル比で混合した。この混合物を室温で２時間から一晩反応させた。５Ｍの水素化ホウ素１０μＬを、室温で３０分間反応させた。反応生成物を透析し、または脱塩により分離することによって、過剰の還元試薬を除去した。次いで、コンジュゲートをＳＥ ＨＰＬＣカラムにかけ、４５０〜１５００ＫＤａの間の分子量を有するコンジュゲートを収集することによって、生成物を分離した。ＨＲＰ：ＩｇＧの比を評価し、コンジュゲートを、標準的なＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）溶液相ＳＰＡＲＣＬイムノアッセイにおいて試験した。
心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）などの特定の被検体についてのイムノアッセイは、以下に記載するコンジュゲートＡ、Ｂ、またはＣを使用して、実施例１１に記載したように実施した。簡単に言えば、等体積のＩｇＧ（３３μｇ／ｍＬ）、ＨＲＰコンジュゲートＡ、Ｂ、またはＣ（５ｍｇ／ｍＬ）、水中５００μＭのアスコルビン酸、および試料を、９６ウェルマイクロタイタープレート中で一緒に混合した。この混合物を、トリガー溶液Ａ、すなわち、トリガー溶液と共にインキュベートすることによって、化学発光反応を開始した。これらのアッセイについて、ｃＴｎＩモノクローナル抗体Ｍ０６を、１〜１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度で、ｐＨ９．６の１００ｍＭの炭酸水素塩緩衝液中に脱塩した。表３１は、ポリマーＨＲＰコンジュゲートＡ、Ｂ、またはＣを使用する、ｃＴｎＩについてのイムノアッセイ結果を示す。これらのコンジュゲートは、実質的に以下に記載するように調製した。
Ｂ．酸化したＨＲＰへのコンジュゲーションのためのモノクローナルｃＴｎＩ抗体の調製
酸化したＨＲＰとコンジュゲートする前に、ｃＴｎＩモノクローナル抗体を、ｐＨ７．２のＰＢＳ（コンジュゲートＡ＆Ｂ）、またはｐＨ９．６の炭酸ナトリウム（コンジュゲートＣ）中に緩衝液交換した。
Ｃ．コンジュゲートＡおよびＢ：ＨＲＰの酸化
ＨＲＰを５ｍｇ／ｍＬで水中に溶解させた。８．７４ｍｇ／ｍＬ（０．０８８Ｍ）の濃度の新たに調製した過ヨウ素酸ナトリウム１００μＬを、４℃で撹拌しながらＨＲＰ各１ミリリットルに添加した。この混合物を適切な時間反応させた。コンジュゲートＡについて、反応時間は約２０分であり、コンジュゲートＢについて、約４０分であった。ＨＲＰ各５ｍｇについて、エチレングリコール１７μＬを添加し、４℃でさらに２０分間インキュベートすることによって、酸化反応をクエンチした。
酸化した酵素１．０ｍＬを、ｐＨ７．２のＰＢＳ中で平衡化したＰＤ１０カラムで脱塩することによって、過剰酸化試薬およびクエンチング試薬を除去した。
Ｄ．ＩｇＧとのコンジュゲーション
コンジュゲートＡおよびＢについて、酸化したＨＲＰ ２．５ｍｇを、ＩｇＧ ０．４６９５ｍＬ（２．５ｍｇ）と反応させた。コンジュゲートを一晩反応させた。４ｍｇ／ｍＬの水素化ホウ素カリウム１０μＬを新たに調製し、この溶液１０μＬを、反応混合物各１ミリリットルに添加した。ゆっくり連続的に反転させながら、反応を室温で３０分間進行させた。次いで生成物混合物を、ＰＢＳ中への脱塩により分離することによって、過剰の還元試薬を除去した。脱塩手順後のＩｇＧの濃度は、コンジュゲートＡおよびＢについて４．２６ｍｇ／ｍＬであった。コンジュゲーションおよび還元の後、コンジュゲートをＳＥ ＨＰＬＣカラムにかけ、４５０〜１５００ＫＤａの間の分子量を有するコンジュゲートを収集することによって、生成物を分離した。ＨＲＰ：ＩｇＧの比を、先に記載したように評価した。
Ｅ．コンジュゲートＣ：ＨＲＰの酸化
ＨＲＰを５ｍｇ／ｍＬで水中に溶解させた。８．７４ｍｇ／ｍＬ（０．０８８Ｍ）の濃度の新たに調製した過ヨウ素酸ナトリウム１００μＬを、４℃で撹拌しながらＨＲＰ各１ミリリットルに添加した。この混合物を２０分間反応させた。ＨＲＰ各５ｍｇについてエチレングリコール１７μＬを添加することによって酸化反応をクエンチし、この混合物を、４℃でさらに２０分間インキュベートさせた。
酸化した酵素１．０ｍＬを、ＰＤ１０カラムで、ｐＨ４．５の１ｍＭのアセテート緩衝液などの適切な反応緩衝液中に脱塩することによって、過剰の酸化物または酸化試薬およびクエンチング反応物またはクエンチング試薬から酵素を分離した。
Ｄ．ＩｇＧとのコンジュゲーション
酸化したＨＲＰを、還元アミノ化によってＩｇＧとコンジュゲートした。ＩｇＧを酸化したＨＲＰと、１：１の体積比、１：４〜１５のＩｇＧ：ＨＲＰモル比で混合して、室温で２時間から一晩反応させた。組合せ反応の直前に、ｐＨ９．６の１００ｍＭの炭酸塩緩衝液１００μＬを、酸化したＨＲＰ １ｍＬに添加した。ＩｇＧ １ｍＬを酸化したＨＲＰと、１：１の体積比で、約１：４ＨＲＰのＩｇＧ：ＨＲＰモル比で混合し、最低２時間反応させた。形成したコンジュゲート中間体を、新たに調製した４ｍｇ／ｍＬの水素化ホウ素カリウム２０μＬを添加することによって還元した。ゆっくり連続的に反転させながら、還元を室温で３０分間進行させた。混合物をＰＢＳ中への脱塩により分離することによって、過剰の還元試薬を除去した。
コンジュゲーションおよび還元の後、コンジュゲートをＳＥ ＨＰＬＣカラムにかけ、４５０〜１５００ＫＤａの間の分子量を有するコンジュゲートを収集することによって、生成物を分離した。ＨＲＰ：ＩｇＧ比を先に記載したように評価した。
本明細書におけるすべての刊行物および特許出願は、本発明が属する技術分野における通常の技術のレベルを示し、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
上記した様々な実施形態は、例示としてのみ提供され、本発明を限定すると解釈されるべきでない。当業者は、本明細書に例示および記載された実施形態例および用途例に従うことなく、本明細書に例示および記載された実施形態例および用途例に従うことなく本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、以下の特許請求の範囲に示される本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、本発明に行うことができる様々な改変および変更を容易に認識する。

Claims (26)

  1. 試料中の被検体についてのアッセイ法であって、
    試料、
    化学発光標識特異的結合パートナー、
    アクチベーター標識特異的結合パートナー、および
    選択的シグナル阻害剤
    を任意の順序で、または同時に添加することによって、水溶液中で反応混合物を形成するステップであって、
    すべての成分は、水溶液に可溶性であり、
    前記化学発光標識特異的結合パートナー、および前記アクチベーター標識特異的結合パートナーは、前記試料中に存在する被検体に結合することによって、結合複合体を形成し、
    前記選択的シグナル阻害剤は、前記反応混合物中の非特異的シグナルを阻害し、
    ここで、前記選択的シグナル阻害剤は、以下：
    、
    アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム塩（アスコルベートアニオン）、Ｌ−アスコルビン酸６−パルミテート、５，６−イソプロピリデン−Ｌ−アスコルビン酸、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸（Ｔｒｏｌｏｘ（商標））、２−ブロモ−４−ヒドロキシフェノール、α−トコフェロール、γ−トコフェロール、および、フェルラ酸からなる群から選択される、ステップと、
    前記反応混合物にトリガー溶液を添加するステップであって、前記トリガー溶液は、前記反応混合物中の、前記被検体が結合した化学発光標識特異的結合パートナー、および前記被検体が結合したアクチベーター標識特異的結合パートナーの量に相関した、検出可能な化学発光シグナルを放出するステップと
    を含むアッセイ法。
  2. 任意の順序で、または同時に反応混合物を形成するステップが、エンハンサーをさらに含む、試料中の被検体についての、請求項１に記載のアッセイ法。
  3. 前記選択的シグナル阻害剤が、前記複合体においてではない場合の化学発光標識とアクチベーター標識との反応からのシグナルを超える、前記被検体との前記複合体における、化学発光標識とアクチベーター標識との反応によって生じるシグナルの割合を引き起こす、請求項１に記載の方法。
  4. 選択的シグナル阻害剤が、アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸（Ｔｒｏｌｏｘ（商標））、Ｌ−アスコルビン酸６−パルミテート、５，６−イソプロピリデン−Ｌ−アスコルビン酸、２−ブロモ−４−ヒドロキシフェノール、
    および、
    からなる群から選択される、請求項１および３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記化学発光標識特異的結合パートナーが、特異的結合対メンバーに直接または間接的に連結している化学発光標識化合物を含み、前記化学発光標識が、芳香族環状ジアシルヒドラジド、トリヒドロキシ芳香族化合物、アクリダンケテンジチオアセタール化合物、アクリダンエステル、アクリダンチオエステル、アクリダンスルホンアミド、アクリダンエノール誘導体、および式ＶＩの化合物
    ［式中、Ｒ１は、炭素原子１〜２０個のアルキル、炭素原子１〜２０個のアルケニル、炭素原子１〜２０個のアルキニル、炭素原子１〜２０個のアリール、および炭素原子１〜２０個のアラルキル基から選択され、そのいずれもカルボニル基、カルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３ −基、ＯＳＯ３ −２基、グリコシル基、ＰＯ３ −基、ＯＰＯ３ −２基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、４級アンモニウム基、または４級ホスホニウム基から選択される１〜３個の基で置換されていてもよく、Ｘは、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、アリール、アラルキル基、１〜２０個の炭素原子を有するアルキルカルボキシル基またはアリールカルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３ −基、グリコシル基、および式ＰＯ（ＯＲ’）（ＯＲ’’）のホスホリル基（式中、Ｒ’およびＲ’’は独立してＣ１〜Ｃ８アルキル、シアノアルキル、アリールおよびアラルキル基、トリアルキルシリル基、アルカリ金属陽イオン、アルカリ土類陽イオン、アンモニウムおよびトリアルキルホスホニウム陽イオンから選択される）から選択され、Ｚ１およびＺ２はそれぞれ、ＯおよびＳ原子から選択され、Ｒ２およびＲ３は独立して、水素およびＣ１〜Ｃ８アルキルから選択される］から選択される、請求項１および３から４のいずれかに記載の方法。
  6. 前記化学発光標識された、固定化された特異的結合メンバーが、特異的結合メンバーに直接または間接的に連結している化学発光標識化合物を含み、前記化学発光標識が、式
    ［式中、
    は、前記化学発光標識の前記特異的結合メンバーへの結合箇所を指定し、Ｒ１およびＲ２は独立して、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアルキル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアルケニル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアルキニル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアリール、および炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアラルキル基から選択され、Ｒ１またはＲ２が置換された基である場合、これは、カルボニル基、カルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３ −基、ＯＳＯ３ −２基、グリコシル基、ＰＯ３ −基、ＯＰＯ３ −２基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＮＨ２基、四級アンモニウム基、および４級ホスホニウム基から選択される１〜３個の基で置換されていてもよく、Ｒ３は、炭素原子１〜２０個のアルキル、炭素原子１〜２０個の置換アルキル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアルケニル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアルキニル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアリール、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアラルキル基、フェニル、置換または非置換のベンジル基、アルコキシアルキル、カルボキシアルキルおよびアルキルスルホン酸基からなる群から選択され、Ｒ３が置換された基である場合、これは、カルボニル基、カルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３ −基、ＯＳＯ３ −２基、グリコシル基、ＰＯ３ −基、ＯＰＯ３ −２基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、４級アンモニウム基、および４級ホスホニウム基から選択される１〜３個の基で置換されていてもよい］
    の化合物である、請求項１および３から５のいずれかに記載の方法。
  7. 前記アクチベーター標識特異的結合パートナーが、特異的結合対メンバーに直接または間接的に連結しているアクチベーター標識化合物を含み、前記アクチベーター標識が、遷移金属塩、遷移金属錯体、および酵素から選択され、前記アクチベーター標識がペルオキシダーゼ活性を有する、請求項１および３から６のいずれかに記載の方法。
  8. 前記アクチベーター標識化合物がペルオキシダーゼ酵素である、請求項１および３から７のいずれかに記載の方法。
  9. 前記化学発光標識特異的結合パートナーおよび前記アクチベーター標識特異的結合パートナーの少なくとも１つが、可溶性タンパク質、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラビジン、ビオチン、陽イオン化されたＢＳＡ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、可溶性合成デンドリマー、可溶性合成ポリマー、可溶性天然ポリマー、多糖、デキストラン、オリゴヌクレオチド、リポソーム、ミセル、およびベシクルから選択される補助物質を含む、請求項１および３から８のいずれかに記載の方法。
  10. 任意の順序で、または同時に反応混合物を形成するステップがエンハンサーをさらに含む請求項１および３から９のいずれかに記載の方法、あるいは、請求項２に記載の方法であって、前記エンハンサーが、ペルオキシダーゼ活性を有するアクチベーターの触媒ターンオーバーを促進する化合物または化合物の混合物である、方法。
  11. 前記エンハンサーが、フェノール化合物、芳香族アミン、ベンゾオキサゾール、ヒドロキシベンゾチアゾール、アリールボロン酸、およびこれらの混合物から選択される、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記トリガー溶液が過酸化物化合物を含む、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
  13. 前記トリガー溶液が、フェノール化合物、芳香族アミン、ベンゾオキサゾール、ヒドロキシベンゾチアゾール、アリールボロン酸、およびこれらの混合物から選択されるエンハンサーを含む、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
  14. 前記化学発光標識特異的結合パートナーおよび前記アクチベーター標識特異的結合パートナーがそれぞれ、前記試料中の前記被検体に結合する、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
  15. 化学発光標識特異的結合パートナーが、前記被検体の類似体に連結している化学発光標識を含み、前記被検体および前記化学発光標識類似体が、前記アクチベーター標識特異的結合パートナーとの結合を競合する、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
  16. すべての成分が水溶液に可溶性である、請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
  17. 前記成分のいずれも、粒子または他の固相に、直接または間接的にコンジュゲートされない、請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
  18. 試料中の被検体を検出するためのキットであって、
    前記被検体のための第１の特異的結合パートナーと；
    前記第１の特異的結合パートナーにコンジュゲートされる化学発光化合物と；
    前記被検体のための第２の特異的結合パートナーと；
    前記第２の特異的結合パートナーにコンジュゲートされるアクチベーター化合物と；
    選択的シグナル阻害剤であって、以下：
    、
    アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム塩（アスコルベートアニオン）、Ｌ−アスコルビン酸６−パルミテート、５，６−イソプロピリデン−Ｌ−アスコルビン酸、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸（Ｔｒｏｌｏｘ（商標））、２−ブロモ−４−ヒドロキシフェノール、α−トコフェロール、γ−トコフェロール、および、フェルラ酸からなる群から選択される選択的シグナル阻害剤と；
    トリガー溶液と
    を含むキット。
  19. すべての成分が水溶液に可溶性である、請求項１８に記載のキット。
  20. 前記成分のいずれも、粒子または他の固相に、直接または間接的にコンジュゲートされない、請求項１８または１９に記載のキット。
  21. 前記選択的シグナル阻害剤が、オルトまたはパラ関係に配向した少なくとも２つのヒドロキシル基を有する芳香族化合物、オルトまたはパラ関係に配向した、少なくとも１つのヒドロキシル基および１つのアミノ基を有する芳香族化合物、Ｃ−Ｃ二重結合上で置換された少なくとも２つのヒドロキシル基を有する化合物、ならびに窒素複素環式化合物からなる群から選択される、請求項１８から２０のいずれかに記載のキット。
  22. 前記化学発光化合物が、芳香族環状ジアシルヒドラジド、トリヒドロキシ芳香族化合物、アクリダンケテンジチオアセタール化合物、アクリダンエステル、アクリダンチオエステル、アクリダンスルホンアミド、アクリダンエノール誘導体、および式ＶＩの化合物
    ［式中、Ｒ１は、炭素原子１〜２０個のアルキル、炭素原子１〜２０個のアルケニル、炭素原子１〜２０個のアルキニル、炭素原子１〜２０個のアリール、および炭素原子１〜２０個のアラルキル基から選択され、そのいずれもカルボニル基、カルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３ −基、ＯＳＯ３ −２基、グリコシル基、ＰＯ３ −基、ＯＰＯ３ −２基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、４級アンモニウム基、または４級ホスホニウム基から選択される１〜３個の基で置換されていてもよく、Ｘは、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、アリール、アラルキル基、炭素原子１〜２０個を有するアルキルカルボキシル基または炭素原子１〜２０個を有するアリールカルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３ −基、グリコシル基、および式ＰＯ（ＯＲ’）（ＯＲ’’）のホスホリル基（式中、Ｒ’およびＲ’’は独立して、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、シアノアルキル、アリールおよびアラルキル基、トリアルキルシリル基、アルカリ金属陽イオン、アルカリ土類陽イオン、アンモニウム陽イオンおよびトリアルキルホスホニウム陽イオンから選択される）から選択され、Ｚ１およびＺ２はそれぞれ、ＯおよびＳ原子から選択され、Ｒ２およびＲ３は独立して、水素およびＣ１〜Ｃ８アルキルから選択される］
    から選択される、請求項１８から２１のいずれかに記載のキット。
  23. 前記アクチベーター化合物が、遷移金属塩、遷移金属錯体、および酵素から選択され、前記アクチベーター標識がペルオキシダーゼ活性を有する、請求項１８から２２のいずれかに記載のキット。
  24. 前記トリガー溶液が、過酸化水素、尿素過酸化物、および過ホウ酸塩から選択される過酸化物を含む、請求項１８から２３のいずれかに記載のキット。
  25. 前記トリガー溶液が、フェノール化合物、芳香族アミン、ベンゾオキサゾール、ヒドロキシベンゾチアゾール、アリールボロン酸、およびこれらの混合物から選択されるエンハンサーを含む、請求項１８から２４のいずれかに記載のキット。
  26. 請求項１に記載のアッセイ法を実施するためのシステムであって、
    反応容器中に試料を送達するための流体取り扱いシステムと、
    前記反応容器中に化学発光標識特異的結合パートナー、アクチベーター標識特異的結合パートナー、選択的シグナル阻害剤を送達するための流体取り扱いシステムと、
    前記反応容器中に化学発光シグナルを放出するために、前記反応容器中にトリガー溶液を送達するための流体取り扱いシステムと、
    前記化学発光シグナルを検出するための検出システムであって、前記トリガー溶液を送達するための流体取り扱いシステムが、トリガー流体注入のときおよびトリガー流体注入後に前記化学発光シグナル放出を測定するために、前記検出システムと協調して作用する、検出システムと
    を含むシステム。
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