CN104991076B - 一种侧向层析系统及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种侧向层析系统。本发明所提供的侧向层析系统，包括样本垫、结合垫、反应膜、吸水垫和PVC衬板，还包括含有亲和素活化的光敏微球和检测蛋白活化的荧光微球的样本稀释液；所述结合垫涂布有生物素标记抗待测物抗体或生物素与待测物双标记载体蛋白；所述反应膜上包被有检测线和质控线；所述检测线上包被抗待测物抗体或抗载体蛋白抗体；所述质控线上包被生物素标记抗原或生物素标记抗检测蛋白抗体。本文所提供的侧向层析系统，通过独特的复合物捕获(T线)设计，成功利用光激化学发光技术，可有效降低侧向层析系统中非特异性结合对检测结果的影响，从而有效提高了检测灵敏度和特异性。

Description

一种侧向层析系统及其应用
技术领域
本发明涉及医药制剂领域，特别涉及一种侧向层析系统及其应用。
背景技术
免疫胶体金技术是继三大标记技术(荧光素、放射性同位素和酶)后发展起来的固相标记免疫测定技术。80年代出现在临床诊断领域的胶体金免疫层析(colloidal goldimmunochromatography assay，GICA)快速诊断试纸条是建立在金标免疫渗滤基础上的一种免疫检测技术。它具有简单快速、结果明确、无需复杂操作技巧和特殊设备、敏感度高、携带方便等优点，己成为临床实验诊断领域发展的一个新方向。但是，在传统侧向层析测试过程中，由于缺乏洗涤过程，非特异性结合的信号物质(如胶体金、荧光染料等)会残留在检测线区域(T线)，影响结果的判定。
光激发化学发光免疫分析技术是以纳米级高分子微粒为基础的新一代化学发光免疫技术，又称为AlphaLISA分析法，被誉为免洗的ELISA。该技术的核心原理是单线态氧的产生和传递。在受到红色激光(680nm)照射后，感光微粒能使周围环境中的氧转化为单线态氧，单线态氧的生存时间仅为4微秒。短暂的生存时间决定了单线态氧的传播直径很小(约为200nm)。如果发光微粒在200nm范围之内就能接受单线态氧，并发出高能级的光(520nm-620nm)。反之，单线态氧就会回落到基态氧而没有信号产生。通常在反应体系中，微粒的浓度是很低的。两种微粒相互随机碰撞的几率很低，因此，反应体系的本底非常微弱。如果包被在微粒表面的生物分子相互作用，拉近了两个微粒的距离，例如形成免疫夹心或受体-配体复合物，这样就能产生能量的有效传递并发出光信号。由于AlphaLISA技术中微珠均为纳米微粒，增加了反应表面积，极大地提高了检测灵敏度；恰当的荧光波长及时间分辨计数模式，增加了其特异性；检测过程不易受到样本常见干扰物质、pH值、温度等因素的影响，保证了检测稳定性；该技术独特的发光方式，有效的降低了非特异信号的干扰，提高了检测的准确性。但是由于该技术为均相反应，而T线包被物(捕获抗体或抗原)为固相，非均相反应使空间位阻效应明显，影响检测的灵敏度，因此限制了其在侧向层析系统中的应用。
发明内容
在侧向层析系统中，由于缺乏洗涤过程，检测线区域非特异性结合的信号物质(如胶体金、荧光染料等)会干扰检测结果。因此，为了降低非特异性结合对检测结果的干扰，提高检测结果的特异性，本发明提供一种光激化学发光侧向层析系统。该侧向层析系统，采用光激化学发光技术，即只有由特异性反应而发生桥连的光敏微球和荧光微球，才能在680nm的光照射下光敏微球释放单线态氧而激发荧光微球发光(图1)，而非特异性结合未能使光敏微球和荧光微球发生桥连，因此不发光，进而有效提高检测的特异性。
本发明所提供的侧向层析系统，包括样本垫、结合垫、反应膜、吸水垫和PVC衬板，还包括含有亲和素活化的光敏微球(SA-LP)和检测蛋白活化的荧光微球(dPro-FP，detecting protein-FP)的样本稀释液；所述结合垫涂布有生物素标记抗待测物抗体(Biotin-Ab2)或生物素与待测物双标记载体蛋白(Biotin-cPro-T，Biotin-carrierProtein-Target)；所述反应膜上包被有检测线和质控线；所述检测线上包被抗待测物抗体(Ab3)或抗载体蛋白抗体(anti-cPro，against carrier protein antibody)；所述质控线上包被生物素标记抗原(Biotin-Ag，Biotin-antigen)或生物素标记抗检测蛋白抗体(Biotin-anti-dPro，Biotin-anti-detecting protein antibody)。
所述亲和素活化的光敏微球为亲和素与光敏微球共价偶联物。
所述检测蛋白活化的荧光微球为检测蛋白与荧光微球共价偶联物。
所述检测蛋白为能与待测物发生特异性亲和结合的蛋白。
所述抗待测物抗体为能与待测物发生特异性亲和结合的抗体。
所述生物素与待测物双标记载体蛋白为生物素和待测物与载体蛋白共价偶联物。
所述抗载体蛋白抗体为能与载体蛋白亲和结合的抗体。
所述生物素标记抗检测蛋白抗体为生物素通过共价结合的且能与检测蛋白亲和结合的抗体。
所述亲和素活化的光敏微球可以与生物素标记物质结合。
所述检测蛋白活化的荧光微球与光敏微球桥连后在680nm波长的光激发下可以发射荧光(610nm)，用于结果的判定。
所述检测蛋白活化的荧光微球可以与样本中待测物质结合。
所述结合垫涂布物为生物素标记的抗待测物抗体(Biotin-Ab2)或生物素和待测物双标记的载体蛋白(Biotin-cPro-T，Biotin-carrier Protein-Target)，其作用为可桥连光敏微球和荧光微球，使其形成光敏微球-待测物-荧光微球复合物。
所述反应膜包括：a).T线：包被抗待测物抗体(Ab3)或抗载体蛋白抗体(anti-cPro，against carrier protein antibody)，其作用可以捕获光敏微球-待测物质-荧光微球复合物，用于结果判定，据荧光强若判定结果；b).C线：包被生物素标记抗原(Biotin-Ag，Biotin-antigen)或生物素标记抗检测蛋白抗体(Biotin-anti-dPro，Biotin-detectingprotein antibody)，其作用可以桥连光敏微球和荧光微球，用于质量控制，即C线有荧光产生则代表试纸条结果有效，否则无效。
所述侧向层析系统在检测目标物中应用也属于本发明的保护范围。
本文所提供的侧向层析系统，通过独特的复合物捕获(T线)设计，成功利用光激化学发光技术，可有效降低侧向层析系统中非特异性结合对检测结果的影响，从而有效提高了检测灵敏度和特异性。具体为：
a)夹心法：
样本中待测物质与样本稀释液(含有检测蛋白活化的荧光微球和亲和素活化的光敏微球)混匀后，样本中待测物与检测蛋白活化(如抗体)的荧光微球结合而形成复合物，滴入样本垫，接着复合物和光敏微粒与结合垫涂布的生物素标记抗待测物抗体桥连，形成{光敏微球-亲和素}-{生物素-抗待测物抗体}-待测物-{检测蛋白-荧光微球}大复合物，然后大复合物被检测线(T线)包被的抗待测物质抗体捕获，而未桥连的光敏微球和荧光微球被质控线包被的生物素标记抗原进一步桥连。
b)竞争法：
样本中待测物质与样本稀释液(含有检测蛋白活化的荧光微球和亲和素活化的光敏微球)混匀后，样本中待测物与检测蛋白活化(如抗体)的荧光微球结合而形成复合物，滴入样本垫，接着未反应的荧光微球和光敏微粒，与结合垫涂布的生物素和待测物双标记载体蛋白桥连，形成{光敏微球-亲和素}-{生物素-载体蛋白-待测物}-{检测蛋白-荧光微球}大复合物，然后大复合物被检测线(T线)包被的抗载体蛋白抗体捕获，而未桥连的光敏微球和荧光微球被质控线包被的生物素标记抗检测蛋白抗体进一步桥连。
最后当T线/C线在680nm照射下，光敏微球会产生单线态的氧而激发大复合物中荧光微球产生荧光信号，而未形成大复合物的荧光微球未被激发无荧光信号，因而可以有效的提高了检测结果的准确性和特异性。
附图说明
图1为光激化学发光原理。
图2为侧向层析系统及组成。
图3为NC膜T/C线包被。
图4为实施例2的侧向层析系统示意图。
图5为实施例3的侧向层析系统示意图。
具体实施方式
实施例1、光激化学发光侧向层析系统
所用试剂：
亲和素活化光敏微球(SA-LP)：PerkinElmer，6760002。
活性荧光微球(FP)：PerkinElmer，6772001。
pH7.510mM PBS：称取0.27g磷酸二氢钾(KH2PO4)(国药，10017608)、1.42g磷酸氢二钠(Na2HPO4)(国药，100203008)，8g氯化钠(NaCl)(国药，10019308)、0.2g氯化钾(KCl)(国药，10016308)于900mL超纯水中，完全溶解后调节pH至7.5，然后用容量瓶定容至1L。
10mM Tris-HCl：称取1.576g(国药，xw020034)于900mL超纯水中，完全溶解后调节到所需的pH值，然后定容至1L。
5％BSA：称取5g BSA(amresco，0332)于100ml PBS溶液中，至完全溶解。
术语解释：
亲和素活化的光敏微球：即SA-LP，亲和素与光敏微球共价偶联物。
检测蛋白活化的荧光微球：即dPro-FP(detecting protein-FP)，检测蛋白与荧光微球共价偶联物。
检测蛋白：即dPro(detecting protein)，可以与待测物发生特异性亲和结合的蛋白(如抗体)。
Ab2、Ab3：抗待测物抗体，可以与待测物发生特异性亲和结合的抗体。
生物素与待测物双标记载体蛋白：即Biotin-cPro-T(Biotin-carrier Protein-Target)，生物素(Biotin)和待测物(Target)与载体蛋白(carrier Protein)共价偶联物。
抗载体蛋白抗体：能与载体蛋白亲和结合的抗体。
生物素标记抗原：生物素通过共价结合的抗原。
抗检测蛋白抗体(anti-dPro)：将检测蛋白(dPro)或其片段免疫动物(如羊、鼠、兔)后，由动物体产生的可以特异性亲和结合该检测蛋白的免疫球蛋白。
生物素标记抗检测蛋白抗体(Biotin-anti-dPro)为生物素通过共价结合的且能与检测蛋白亲和结合的抗体。
一、检测蛋白活化的荧光微球(dPro-FP，detecting protein-FP)制备：
参照Perkinelmer公司偶联方法：
1)洗涤：将1mg FP溶解于50ul PBS溶液中，加入50ul PBS，16000×g离心15min，弃上清；
2)偶联：向FP溶液中加入100ul 1.0mg/ml检测蛋白，然后分别加入1.25ul 10％Tween-20(sigma，P1379)和10μL 400mM NaBH3CN(sigma，296945)溶液，混匀，37℃，18-24h。
3)封闭：加入10μL 65mg/mL CMO(carboxymethoxylamine，sigma，C13408)(溶于800mM NaOH溶液)，37℃，1h。
4)洗涤和保存：用PBS洗涤(16000×g离心15min，弃上清)后，重悬于200ul 10mMTris-HCl(pH 8.0)。
二、生物素标记蛋白方法
取1ml 2mg/ml待标记蛋白PBS溶液，加入30ul 10mM Sulfo-NHS-LC-Biotin(Thermo，21435)，室温条件反应60min，PBS透析72h。
三、样本垫、结合垫预处理
1)将样品垫(Fusion 5,GE)和结合垫(上海金标生物科技有限公司)用1％BSA浸泡30min，37℃烘干。
2)取Biotin-Ab2或Biotin-cPro-T涂布到结合垫上，37℃烘干。
四、T/C线(检测线/质控线)包被
C线(质控线)：将1.0mg/mL Biotin-Ag或Biotin-anti-dPro包被反应膜(180s，Millipore)C线(见图3、图4、图5)，每条1.0μL，37℃干燥。
T线(检测线)：将1.0mg/mLAb3或anti-cPro包被反应膜(180s，Millipore)(见图3、图4、图5)，每条1.0μg，37℃干燥。
五、组装
将样本垫(Fusion 5,GE)、结合垫(NJ25，上海金标生物科技有限公司)、反应膜(135s，Millipore)、吸水垫(CH37M，上海金标生物科技有限公司)、PVC衬板(上海金标生物科技有限公司)、卡盒(金灿华)，由下到上，由内到外进行组装(见图2)。
实施例2、肌钙蛋白I(cTnI)侧向层析系统
1.肌钙蛋白I(cTnI)侧向层析系统组成
样本稀释液：20ug/ml SA-LP、20ug/ml Ab1-FP(即dPro-FP)，PBS；
结合垫涂布物：Biotin-Ab2，1.0ug/cm2；
检测线(T线)包被物：Ab3，0.8ug/条；
质控线(C线)包被物：Biotin-cTnI(即Biotin-Ag)，1.0ug/条；
试纸条制备方法同实施例1，该实施例的侧向层析系统如图4所示。
注：Ab1，为抗cTnI单抗，购于Hytest公司，19C7/4T21；Ab2，为抗cTnI单抗，购于Hytest公司，3C7/4T21；Ab3，为抗cTnI单抗，购于Hytest公司，17F3/4T21。
2.cTnI侧向层析系统T线包被物选择
用不同T线包被物制备的试纸条测定血清样本(源自天津第一中心医院)(40例，采用同昕生物生产的肌钙蛋白I(cTnI)检测试剂盒(化学发光法)购自同昕生物技术(北京)有限公司，产品目录号B-1296))，计算检测系统与对照系统的相关性，结果见表1，表1的结果表明T线包被物为Ab3时与同昕试剂盒测定结果一致性较高。
筛选方法如下：
a)T线包被物分别为Biotin-Ab2或Ab3；C线包被Biotin-cTnI，0.8ug/条；
b)层析试纸条制备方法同实施例1；
c)将20μl样本加入到80μl样本稀释液中，混匀后滴入样本垫，室温反应15min；
d)据荧光强度与cTnI浓度成正比，利用仪器(滨松，C10066-50)预设的校准曲线计算cTnI浓度。
e)分别计算两种T线包被物测定结果与参比系统的相关性。
表1不同T线包被物与参比试剂的相关性
T线包被物 拟合方程及相关系数r
Ab3 y＝0.9779x+0.1377，r＝0.9831
Biotin-Ab2 y＝0.9291x+0.3393，r＝0.9646
3.cTnI检测系统性能
重复测定浓度为1.0ng/ml样本20次，系统的CV为7.9％，表明该系统具有较好的重复性。重复测定0.9％氯化钠溶液20次，计算荧光强度的均值M，标准差S，计算当荧光强度为M+2S时，对应的浓度值，即为最低检出限，最低检出限为0.3ng/ml，表明该系统有较高的灵敏度。
实施例3、25-羟基维生素D(25-OH VD)侧向层析系统
1.25-羟基维生素D(25-OH VD)侧向层析系统组成
样本稀释液：20ug/ml SA-LP、20ug/ml VDBP-FP(即dPro-FP)(VDBP购于Origene，TP308864)，PBS；
结合垫涂布物：生物素和25-OH VD双标记卵清蛋白(Biotin-OVA-25-OH VD)(即Biotin-cPro-T)(注：OVA，为卵清蛋白，购于sigma公司，A5378；含有活性基团的25-OH VD购于汉尊生物，标记方法同生物素偶联方法)，2ug/cm2；
检测线(T线)包被物：抗卵清蛋白抗体(anti-OVA，购于优宁维公司，bs-0283R)(即anti-cPro)，0.8ug/条；
质控线(C线)包被物：生物素标记抗VDBP抗体(Biotin-anti-VDBP)(即Biotin-anti-dPro)(anti-VDBP购于Origene，TA302630。)，1.0ug/条；
试纸条制备方法同实施例1，该实施例的侧向层析系统如图5所示。
2.25-OH VD侧向层析系统T线包被物选择
用不同T线包被物制备的试纸条测定40例血清样本(源自天津第一中心医院)(采用IDS生产的25-羟基维生素D检测试剂盒(酶联免疫法)(国食药监械(进)字2011第2403360号)测定)，计算检测系统与对照系统的相关性，结果见下表，结果表明T线包被物为anti-OVA时与IDS试剂盒测定结果一致性较高。
筛选方法如下：
a)T线包被物分别为anti-OVA或Biotin-OVA-25-OH VD，0.8ug/条；C线包被Biotin-anti-VDBP，1.0ug/条；
b)层析试纸条制备方法同实施例1；
c)将20μl样本加入到80μl 80％甲醇中，混匀，静置2min；
d)取10μl上述溶液，加入到90μl样本稀释液中，混匀后滴入样本垫，室温反应15min；
e)据荧光强度与25-OH VD浓度成反比，利用仪器(滨松，C10066-50)预设的校准曲线，计算25-OH VD浓度。
f)分别计算两种T线包被物测定结果与参比系统的相关性。
表2不同T线包被物与参比试剂的相关性
T线包被物 拟合方程及相关系数r
anti-OVA y＝0.9122x+4.6，r＝0.9636
Biotin-OVA-25-OH VD y＝0.816x+24.8，r＝0.8972
3.25-OH VD检测系统性能
重复测定浓度为10ng/ml样本20次，系统的CV为9.1％，表明该系统具有较好的重复性。重复测定0.9％氯化钠溶液20次，计算荧光强度的均值M，标准差S，计算当荧光强度为M-2S时，对应的浓度值，即为最低检出限，最低检出限为5ng/ml，表明该系统有较高的灵敏度。

Claims (8)

1.一种侧向层析系统，包括样本垫、结合垫、反应膜、吸水垫和PVC衬板，其特征在于：还包括含有亲和素活化的光敏微球和检测蛋白活化的荧光微球的样本稀释液；所述结合垫涂布有生物素标记抗待测物抗体或生物素与待测物双标记载体蛋白；所述反应膜上包被有检测线和质控线；所述检测线上包被抗待测物抗体或抗载体蛋白抗体；所述质控线上包被生物素标记抗原或生物素标记抗检测蛋白抗体；所述亲和素活化的光敏微球和检测蛋白活化的荧光微球桥连后在680nm波长的光激发下发射610nm的荧光，用于结果检测；所述检测蛋白为能与待测物发生特异性亲和结合的蛋白。
2.根据权利要求1所述的侧向层析系统，其特征在于：所述亲和素活化的光敏微球为亲和素与光敏微球共价偶联物。
3.根据权利要求1所述的侧向层析系统，其特征在于：所述检测蛋白活化的荧光微球为检测蛋白与荧光微球共价偶联物。
4.根据权利要求1所述的侧向层析系统，其特征在于：所述抗待测物抗体为能与待测物发生特异性亲和结合的抗体。
5.根据权利要求1所述的侧向层析系统，其特征在于：所述生物素与待测物双标记载体蛋白为生物素和待测物与载体蛋白共价偶联物。
6.根据权利要求1所述的侧向层析系统，其特征在于：所述抗载体蛋白抗体为能与载体蛋白亲和结合的抗体。
7.根据权利要求1所述的侧向层析系统，其特征在于：所述生物素标记抗检测蛋白抗体为生物素通过共价结合的且能与检测蛋白亲和结合的抗体。
8.权利要求1-7中任一所述的侧向层析系统在检测目标物中应用。
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