CN111562383A - 标记物引导通用探针检测三种真菌毒素的侧向抗体芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种标记物引导通用探针检测三种真菌毒素的侧向抗体芯片，包括包括衬板、以及依次粘附于衬板上且相邻之间部分叠置的双功能抗原释放垫、通用荧光探针释放垫、层析膜和吸水垫；所述双功能抗原释放垫包含由卵清白蛋白和AFB1、OTA、ZEN分别偶联而成的检测抗原的基础上偶联特定标记物；所述通用荧光探针释放垫包含标记有抗特定标记物抗体的通用荧光探针；所述层析膜设有检测线A、B、C和质控线，所述检测线A、B、C分别固定抗AFB1、抗OTA和抗ZEN抗体，所述质控线固定抗特定标记物抗体。本发明可以用一种通用荧光探针解决所有检测试剂的生产，降低了成本和提高质量控制可靠性；又增加了检测的信号强度和稳定性，提高了检测灵敏度和定量精密度。
Description
技术领域
本发明涉及食品药品安全检测领域，尤其涉及标记物引导通用探针检测三种真菌毒素的侧向抗体芯片。
背景技术
真菌毒素是真菌产生的次级代谢产物，目前已知超过300种化学结构不同的真菌毒素，其中有30多种真菌菌株产生的真菌毒素，对人畜具有致癌性、遗传毒性、致畸性，还会引起肝中毒、肾中毒、生殖异常以及抑制免疫反应，毒性和危害性巨大。
农产品可能受多种真菌污染，从而代谢产生多种真菌毒素混合污染的情况，正在全球范围内受到关注。国内外权威研究表明，花生、玉米、大豆等粮油作物可能同时受黄曲霉毒素B1(AFB1)、赭曲霉毒素(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)的污染。
目前，检测违法添加AFB1、OTA和ZEN的确证方法是高效液相色谱、液-质联用检测。但是这些方法设备投入大、运行费用高，样品预处理复杂，不能够现场进行检测，难以大规模对基层样品展开大规模筛查。基于纳米材料的免疫荧光检测方法灵敏、特异、快速和价廉，在环境监测和食品安全领域已广泛应用，在食品药品安全快速检测中也越来越被给予厚望。现有AFB1、OTA和ZEN的快速检测方法免疫荧光检测方法发展迅速，但是每种免疫试剂只能检测1-2种真菌毒素。
高通量检测是同时提供多种信息的检测，提高免疫学检测技术的信息通量，是确保食品安全保障水平的热门课题。针对真菌毒素来源普遍性、类型多样性、残留痕量性的特点，相应的免疫分析检测技术正朝着高通量高、灵敏度、高特异性、高效费比、高可靠性的方向发展。免疫阵列也称为免疫芯片，是通过特定技术形式将多种免疫检测元件整合，形成系列免疫检测技术的叠加，是一种很有希望的高通量生物检测技术。
免疫阵列包含多个免疫检测单元，每个检测单元必须有检测抗原、检测抗体和信号探针。信号探针是影响检测性能的重要因素，通常按各单元要求针对性制备。在免疫芯片信号探针的有序释放、特异识别和背景控制是比较复杂的问题，探针之间容易出现相互干扰导致结果的误判。如果创新工作机制，能够用通用探针确保所有免疫检测单元的信号，对降低阵列的生产成本、提高芯片的性能和质量稳定性，将会有积极的意义。
发明内容
基于上述检测方法的缺点，本发明的目的是提供一种标记物引导通用探针检测三种真菌毒素的侧向抗体芯片。
本发明采用的技术方案如下：
一种标记物引导通用探针检测三种真菌毒素的侧向抗体芯片，包括衬板、以及依次粘附于衬板上且相邻之间部分叠置的双功能抗原释放垫、通用荧光探针释放垫、层析膜和吸水垫；所述双功能抗原释放垫包含由卵清白蛋白和AFB1、OTA、ZEN分别偶联而成的检测抗原的基础上偶联特定标记物；所述通用荧光探针释放垫包含标记有抗特定标记物抗体的通用荧光探针；所述层析膜设有检测线A、检测线B、检测线C和质控线，所述检测线A、检测线B、检测线C分别固定抗AFB1、抗OTA和抗ZEN抗体，所述质控线固定抗特定标记物抗体。
优选地，所述特定标记物为7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸。
本发明所述的双功能抗原分别在载体蛋白(OVA)上同时连接半抗原(AFB1、OTA或ZEN)和多个标记物(7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸)。其双功能特征在于：所含半抗原结合检测抗体，所含标记能够结合“双功能抗原引导通用探针”，在所述的检测线A、检测线B和检测线C分别形成“三文治免疫复合物”介导通用探针堆积形成检测信号；双功能抗原上的多个标记物，分别结合质控线上和通用探针上的双功能抗原引导，在质控线形成另一种“三文治免疫复合物”介导通用探针堆积形成检测信号。
相比于传统的“二元体系免疫竞争法”，本发明的检测卡利用了“三文治免疫竞争法”原理，在“双功能抗原”和“检测抗体”这两个免疫检测要素之外，增加了针对双功能抗原标记物“7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸”的“通用抗体”。本发明在载体蛋白(卵清白蛋白)上分别共价连接检测物质AFB1、OTA和ZEN合成双功能抗原，将通用抗体(抗“7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸”抗体)标记于量子点上，将检测抗体1(抗AFB1抗体)固定于层析膜的检测线A上，将检测抗体2(抗OTA抗体)固定于层析膜的检测线B上，将检测抗体3(抗ZEN抗体)固定于层析膜的检测线C上，从而检测抗体捕获双功能抗原上偶联的检测物质，通用抗体结合双功能抗原上偶联的“7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸”，形成三文治免疫复合物，在相应的检测线产生荧光检测信号。当检测抗体被游离的检测物质结合，相应的检测线上的荧光强度将被抑制，从而产生抑制检测信号。
具体的，检测时将样品溶液滴到双功能抗原释放垫上，样品溶液运动的过程中将双功能抗原和通用荧光探针溶解，并携带到检测线A、检测线B、检测线C和质控线，被携带的通用荧光探针标记的抗“7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸”抗体、双功能抗原分别与检测线A上的抗AFB1抗体、检测线B上的抗OTA、检测线C上的抗ZEN抗体形成三文治免疫结合物，使检测线产生荧光信号；被携带的通用荧光探针标记的抗“7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸”抗体与质控线上固定的“7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸”抗体结合，在质控线上堆积形成荧光信号。当样品中存在游离的AFB1、OTA和ZEN达到一定浓度，检测线A、检测线B和检测线C上免疫反应就会被相应的检品竞争阻断，荧光信号被抑制；而质控线上的荧光信号基于“7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸”产生，不受三种真菌毒素浓度的影响。
由于在双功能抗原中引入标记分子，并且用抗标记分子的抗体构建通用荧光探针，既可以用一种通用荧光探针解决所有检测试剂的生产，从而降低成本和提高质量控制可靠性；又能够增加了检测的信号强度和稳定性，提高了检测灵敏度和定量精密度。
进一步地，所述双功能抗原释放垫采用玻璃纤维素膜吸收含有三种双功能抗原、表面活性剂、甘露醇、蔗糖的PBS溶液制得。优选的，采用厚度为0.85mm的玻璃纤维素膜充分吸收含有两种浓度分别为20μg/mL带标记的双氯芬酸检测抗原、25μg/mL带标记的吲哚美辛检测抗原、50μg/mL表面活性剂、30mg/mL甘露醇、50mg/mL蔗糖的PBS溶液。其中，甘露醇作为冻干支架用于确保检测过程中双功能抗原迅速溶解；蔗糖用于调节检测溶液黏度控制层析展开速度；表面活性剂用于消除检测过程的非特异性吸附，优选聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)；三种双功能抗原分别由OVA/AFB1、OVA/OTA、OVA/ZEN共价偶联合成，然后标记上7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸成为双功能抗原。既能被膜上检测抗体结合，又能被量子点上的通用抗体结合。
进一步地，所述通用荧光探针释放垫采用人造纤维素膜吸收含有量子点荧光探针、聚乙二醇、甘露醇、蔗糖、甘氨酸的PBS溶液制得。优选的，采用厚度为0.34mm的人造纤维素膜吸收含有30μg/mL通用量子点荧光探针、60μg/mL聚乙二醇(PEG-500)、10mg/mL甘露醇、60mg/mL蔗糖、10mg/mL甘氨酸的PBS溶液。其中，甘露醇作为冻干支架用于确保检测过程中通用荧光探针迅速溶解；聚乙二醇、蔗糖用于调节检测溶液黏度控制层析展开速度；甘氨酸用于消除检测过程的非特异性吸附；量子点荧光探针由量子点表面标记抗7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体构成，能够结合被捕获在三条检测线上的双功能抗原和固定在质控线上的抗7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体，分别产生荧光检测信号。
进一步地，所述层析膜采用硝酸纤维素膜，所述检测线A由含有抗AFB1抗体和蔗糖的PBS溶液喷涂在硝酸纤维素膜上制得；所述检测线B由含有抗OTA抗体和蔗糖的PBS溶液喷涂在硝酸纤维素膜上制得；所述检测线C由含有抗ZEN抗体和蔗糖的PBS溶液喷涂在硝酸纤维素膜上制得。优选的，将含有0.3mg/mL抗AFB1、抗OTA、抗ZEN抗体和10mg/mL蔗糖的0.05MPBS溶液(pH 7.4)，以3.0μg/cm的量喷涂在硝酸纤维素膜上。检测线荧光信号形成的基础是抗体与双功能抗原所偶联三种真菌毒素的免疫反应，会被检品中游离的相应的真菌毒素竞争抑制。
进一步地，所述质控线由含有抗7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体和蔗糖的PBS溶液喷涂在硝酸纤维素膜上制得。优选的，将含有0.3mg/mL7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体和10mg/mL蔗糖的0.05M PBS溶液(pH 7.4)，以1.0～3.0μg/cm的量喷涂在硝酸纤维素膜上。质控线荧光信号形成的基础是量子点和质控线都含有抗7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体，与检测抗原上的7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体分别产生免疫反应，形成“三文治免疫复合物”，由此在质控线上所产生的检测信号与目标检品无关，不会被检品中游离的三种真菌毒素竞争抑制。
本发明还包括同时检测油料作物三种真菌毒素的检测方法，包括以下步骤：
S1:制备双功能抗原、通用荧光探针、检测线和质控线；所述三种双功能抗原由卵清白蛋白分别与AFB1、OTA、ZEN偶联之后标记7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸，所述通用荧光探针标记有抗7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体，所述检测线A固定抗AFB1抗体，检测线B固定抗OTA抗体，检测线C固定抗ZEN抗体；所述质控线固定抗7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体；
S2：将样品溶液、三种双功能抗原和通用荧光探针混合，一起输送至检测线A、检测线B、检测线C和质控线，根据三条检测线和质控线的荧光信号判断样品中是否含有AFB1、OTA和ZEN，以及测定三种真菌毒素的浓度。
AFB1、OTA和ZEN真菌毒素是小分子化合物，常规检测小分子化合物的免疫检测原理是“双功能抗原”与“检测抗体”形成的“二元体系免疫竞争法”，针对该方法在量子点侧向免疫层析中的不足，本发明在“双功能抗原”的基础上加入“通用抗体”，与“检测抗体”形成“双抗体免疫竞争法”，并对各免疫反应要素在层析系统中的组合也进行了调整。
以检测线A的信号形成举例：将AFB1抗体固定在检测线A，在量子点上连接标记物构成通用探针。AFB1双功能抗原分别于两种抗体结合“桥连”，形成[AFB1抗体-(AFB1半抗原-OVA-标记物)-标记物抗体]“双抗体”免疫复合物，标记物抗体介导通用探针积累形成荧光信号。当AFB1抗体被游离的AFB1毒素结合，荧光强度将被抑制，从而产生抑制检测信号。
同理，在检测线B形成[OTA抗体-(OTA半抗原-OVA-标记物)-标记物抗体]的“双抗体免疫复合物”，检测线C形成[ZEN抗体(ZEN半抗原-OVA-标记物)-标记物抗体]“双抗体免疫复合物”，产生可以被游离真菌毒素抑制的荧光信号。
进一步地，步骤S2通过以下方法进行判断样品中是否含有三种真菌毒素：检测线A、检测线B、检测线C和质控线都显示荧光信号，断定结果为阴性，样品中不含AFB1、OTA和ZEN；检测线A不显示荧光信号，质控线显示荧光信号，断定样品中含有AFB1；检测线B不显示荧光信号，质控线显示荧光信号，断定样品中含有OTA；检测线C不显示荧光信号，质控线显示荧光信号，断定样品中含有ZEN。其中，质控线是为了检验方法有效与否而设定，质控线显示荧光信号表明方法有效，质控线不显示荧光信号表明方法本身无效。
进一步地，步骤S2通过以下方法进行测定三种真菌毒素的浓度：质控线的荧光信号强度检测值定义为C值，3条检测线的荧光信号强度检测值分别定义为T1值、T2值、T3值，通过各检测线的T/C比制定标准曲线从而测定具体浓度。
随着毒素浓度提高，检测线信号被抑制，T/C比趋向于0。从产生抑制到信号完全消失，所对应的毒素浓度范围定义为线性范围。AFB1的线性范围：0.01-3.0ng/mL；OTA的线性范围：0.01-3.0ng/mL；ZEN线性范围：0.01-3.0ng/mL。实际检测中，按照实际测定的的各检测线T/C比，在标准曲线中计算真菌毒素的浓度。
进一步地，所述通用荧光探针在365nm光源激发下，产生630nm的发射光。
本发明相对现有技术具有以下优点：
1、本发明引入小分子标记物“7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸”作为检测抗原的免疫识别位点，确保“通用抗体”与“检测抗原”亲和力的稳定性。该标记分子免疫原性强、偶联效率高、亲水性良好，不会在样品中出现，非常适合本发明中的检测需求。“4-羟基-2-萘磺酸”作为抗原表位，免疫原性超强而且空间位阻小，容易诱导获得高亲和力抗体，结合标记物抗体引导通用探针产生检测信号，提高了检测信号强度和灵敏度；
2、统一用抗“7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸”抗体标记的量子点产生检测信号，只需统一制备通用探针就可以满足不同品种和不同批次试剂的生产，规模效应不仅提高了生产效率，还有利于确保不同批次产品质量的均一性；
3、检测抗体固定在层析膜上，通过对膜的封闭和干燥，对抗体的活性保护作用更为有利，增加抗体稳定性；
4、特异性强，检测时间短(5-10分钟)，可现场操作，且借助便携360nm光源即可激发荧光信号，肉眼判读结果，检测成本低，操作简便，适合基层检测人员操作。
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1为所述标记物引导通用探针检测三种真菌毒素的侧向抗体芯片的结构示意图。
图2为使用重氮法将7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸标记到检测抗原的载体蛋白OVA上。
图3为检测线A、检测线B、检测线C上形成免疫复合物、产生荧光信号的示意图。
图4为检测线A、检测线B、检测线C上荧光信号被竞争阻断的原理示意图。
图5为质控线上发生免疫反应、产生荧光信号的示意图。
图6为荧光免疫检测结果产生的原理及检测结果的判断原则。
图7为实施例中AFB1在检测过程中形成的荧光信号竞争抑制曲线。
图8为实施例中OTA在检测过程中形成的荧光信号竞争抑制曲线。
图9为实施例中ZEN在检测过程中形成的荧光信号竞争抑制曲线。
图注：1、双功能抗原释放垫2、通用荧光探针释放垫3、硝酸纤维素膜31、检测线A311、抗AFB1抗体32、检测线B 321、抗OTA抗体33、检测线C 331、抗ZEN抗体34、质控线4、吸水垫5、衬板6、样品溶液61、量子点62、“7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸”标记物63、OVA 64、偶联AFB1 641、游离AFB1 65、抗“7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸”抗体66、偶联OTA 661、游离OTA 67、偶联ZEN 671、游离ZEN
具体实施方式
实施例1
一种标记物引导通用探针检测三种真菌毒素的侧向抗体芯片，包括衬板5、以及依次粘附于衬板5上且相邻之间部分叠置的双功能抗原释放垫1、通用荧光探针释放垫2、醋酸纤维素膜3和吸水垫4；所述双功能抗原释放垫包含由卵清白蛋白和AFB1、OTA、ZEN分别偶联而成的检测抗原的基础上偶联“7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸”标记物62；所述通用荧光探针释1放垫包含标记有抗7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体65的通用荧光探针，所述荧光探针为量子点61；所述醋酸纤维素膜3设有检测线A、检测线B、检测线C和质控线34，所述检测线A、检测线B、检测线C分别固定抗AFB1抗体311、抗OTA抗体321和抗ZEN抗体331，所述质控线34固定抗7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体65。
参阅图1，本实施例在载体蛋白(卵清白蛋白)上分别共价连接检测物质AFB1、OTA和ZEN合成双功能抗原，再将7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸标记到检测抗原上，制备成为带标记物的检测抗原。将标记物抗体标记于量子点上，将检测抗体1(AFB1抗体)固定于层析膜的检测线A上，将检测抗体2(OTA抗体)固定于层析膜的检测线B、检测抗体3(ZEN抗体)固定于检测线C上，从而检测抗体捕获双功能抗原上偶联的目标毒素半抗原，通用抗体结合双功能抗原上偶联的标记物，形成双抗体免疫复合物，在相应的检测线产生荧光检测信号。当检测抗体被游离的检测物质结合，相应的检测线上的荧光强度将被抑制，产生抑制检测信号。
参阅图2，本实施例使用重氮法将7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸标记物62标记到检测抗原的载体蛋白OVA上，构建双功能抗原。
参阅图3，本实施例在检测时将样品溶液滴到双功能抗原释放垫1上，样品溶液运动的过程中将三种双功能抗原和通用荧光探针溶解，并携带到检测线A、检测线B、检测线C和质控线，被携带的通用荧光探针标记的抗“7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸”抗体65、双功能抗原分别与检测线A、检测线B、检测线C上的AFB1抗体、OTA抗体和ZEN抗体形成双抗体免疫结合物，使检测线产生荧光信号。
参阅图4，本实施例所述的质控线荧光信号形成的基础是量子点61和质控线34都含有抗7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体65，与检测抗原上的7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体65分别产生免疫反应，形成“双抗体免疫复合物”，由此在质控线34上所产生的检测信号与目标检品无关。当样品中存在游离的AFB1、OTA或ZEN达到一定浓度，检测线A、检测线B、检测线C上免疫反应就会被相应的检品竞争阻断，荧光信号被抑制；而质控线34上的荧光信号，不受样品中毒素的影响。
具体的，双功能抗原释放垫的制备方法如下：采用厚度为0.85mm的玻璃纤维素膜充分吸收含有30μg/mL AFB1双功能抗原、35μg/mL的OTA双功能抗原、25μg/mL的ZEN双功能抗原、50μg/mL Triton X-100、30mg/mL甘露醇、50mg/mL蔗糖的PBS溶液，冷冻干燥后备用。
具体的，通用荧光探针释放垫的制备方法如下：采用厚度为0.34mm的Whatman 85人造纤维素膜吸收含有30μg/mL通用荧光探针、60μg/mL PEG-500、10mg/mL甘露醇、60mg/mL蔗糖、10mg/mL甘氨酸的PBS溶液，冷冻干燥后备用。
具体的，检测线的制备方法如下：用10mg/mL蔗糖的0.05M PBS溶液(pH 7.4)分别配制0.20mg/mL AFB1抗体、0.25mg/mL OTA抗体、0.15mg/mL ZEN抗体，以3.0μg/cm的量分别喷涂在硝酸纤维素膜上的设定区域，形成检测线A、检测线B、检测线C。
具体的，质控线的制备方法如下：将含有0.3mg/mL抗7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体和10mg/mL蔗糖的0.05M PBS溶液(pH 7.4)，以1.0～3.0μg/cm的量喷涂在硝酸纤维素膜上，形成质控线。
实施例2
同时检测AFB1、OTA和ZEN的检测方法，参阅图6，步骤如下：
取5g粉碎的谷类作物样品，在25mL70％甲醇-水溶液中充分抽提检品，5000rpm离心10分钟，取2.0mL上清液加入到8.0mL PBS缓冲液，充分摇匀成为样品溶液；用滴管在双功能抗原释放垫上滴加3-4滴样品溶液，样品溶液向硝酸纤维素膜运动的过程中使双功能抗原和通用荧光探针释放，并先后越过检测线和质控线，根据检测线A、检测线B、检测线C和质控线上的荧光信号来判断样品中是否含有AFB1、OTA和ZEN。
参阅图5。在硝酸纤维素膜检测线A上固定的AFB1抗体311，通用荧光探针上标记的抗7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体65，分别与双功能抗原结合，形成双抗体免疫结合物，使检测线产生荧光检测信号。当样品中存在游离的AFB1达到一定浓度，检测线上免疫反应就会被竞争阻断，荧光信号会消失。同理，对OTA、ZEN的检测线B、检测线C，检测信号的形成与判断与检测线A相同。质控线是提供荧光信号的参照而设定，显色有效，不显色表明方法本身无效。
参阅图6-9，通用荧光探针在365nm光源激发下，产生630nm的发射光。
在本实施例中，检测结果的判断原则如下：
1)如图6中，质控线的荧光信号强度检测值定义为C值，3条检测线的荧光信号强度检测值分别定义为T1值、T2值、T3值，检测线信号和质控线信号的比定义为T/C比。
根据通用探针侧向抗体芯片优化的目标，3种真菌毒素浓度都等于0的基准值，最理想的情况是：T1/C值＝T2/C值＝T3/C值＝1。由于固相载体微观偏差和空间位阻，文献报道的荧光免疫层析T/C比，存在15-20％的偏差和波动。得益于通用信号的均一、双抗体效应对位阻的克服，本发明的抗体芯片T/C比偏差控制在10-15％。
2)基于上述，检测结果示意图6中a所示：各检测线和质控线都显示充分荧光信号，T1/C值、T2/C值、T2/C值都大于85％，可以断定样品中不含AFB1、OTA和ZEN；
3)根据侧向抗体芯片的优化结果，样品溶液中AFB1浓度大于3.0ng/mL、OTA浓度大于3.0ng/mL，ZEN浓度大于3.0ng/mL，真菌毒素所对应的检测线完全消失。如图6中b-d所示，检测线A、检测线B，检测线C，其中一条检测线消失，而质控线显示荧光信号，这种情况可以判定相对应的真菌毒素含量完全阻断的标准；
4)如图6中e1-e4所示：当质控线不显示荧光信号，表示检测试剂已经失效。
5)如图7-9所示，随着毒素浓度提高，检测线信号被抑制，T/C比趋向于0。从产生抑制到信号完全消失，所对应的毒素浓度范围定义为线性范围。AFB1的线性范围：0.01-3.0ng/mL；OTA的线性范围：0.01-3.0ng/mL；ZEN线性范围：0.01-3.0ng/mL。实际检测中，按照实际测定的的各检测线T/C比，在标准曲线中计算真菌毒素的浓度。
相对于现有技术，本实施例采用的“三元体系免疫竞争法”具有以下优点：1、统一用抗标记物体标记的通用探针，只需集中制备一种作为荧光探针，有利于检测工作的规模化和标准化；2、检测抗体固定在层析膜上，通过对膜的封闭和干燥，对抗体的活性保护作用更为有利，增加抗体稳定性；3、免疫结合时空间位阻更小，提高检测信号强度和灵敏度。
以上实施例中AFB1、OTA和ZEN的特异性抗体诱导产生方法、抗7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体诱导产生方法、以及在量子点上标记抗7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体、制备量子点荧光探针的方法均采用现有技术。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种标记物引导通用探针检测三种真菌毒素的侧向抗体芯片，其特征在于，包括衬板、以及依次粘附于衬板上且相邻之间部分叠置的双功能抗原释放垫、通用荧光探针释放垫、层析膜和吸水垫；所述双功能抗原释放垫包含由卵清白蛋白和AFB1、OTA、ZEN分别偶联而成的检测抗原的基础上偶联特定标记物；所述通用荧光探针释放垫包含标记有抗特定标记物抗体的通用荧光探针；所述层析膜设有检测线A、检测线B、检测线C和质控线，所述检测线A、检测线B、检测线C分别固定抗AFB1、抗OTA和抗ZEN抗体，所述质控线固定抗特定标记物抗体。
2.根据权利要求1所述的侧向抗体芯片，其特征在于，所述特定标记物为7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸。
3.根据权利要求1所述的侧向抗体芯片，其特征在于，所述双功能抗原释放垫采用玻璃纤维素膜吸收含有三种双功能抗原、表面活性剂、甘露醇、蔗糖的PBS溶液制得。
4.根据权利要求1所述的侧向抗体芯片，其特征在于，所述通用荧光探针释放垫采用人造纤维素膜吸收含有量子点荧光探针、聚乙二醇、甘露醇、蔗糖、甘氨酸的PBS溶液制得。
5.根据权利要求1所述的侧向抗体芯片，其特征在于，所述层析膜采用硝酸纤维素膜；所述检测线A由含有抗AFB1抗体和蔗糖的PBS溶液喷涂在硝酸纤维素膜上制得；所述检测线B由含有抗OTA抗体和蔗糖的PBS溶液喷涂在硝酸纤维素膜上制得；所述检测线C由含有抗ZEN抗体和蔗糖的PBS溶液喷涂在硝酸纤维素膜上制得。
6.根据权利要求1所述的侧向抗体芯片，其特征在于，所述质控线由含有抗7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体和蔗糖的PBS溶液喷涂在硝酸纤维素膜上制得。
7.同时检测油料作物三种真菌毒素的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1:制备双功能抗原、通用荧光探针、检测线和质控线；所述三种双功能抗原由卵清白蛋白分别与AFB1、OTA、ZEN偶联之后标记7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸，所述通用荧光探针标记有抗7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体，所述检测线A固定抗AFB1抗体，检测线B固定抗OTA抗体，检测线C固定抗ZEN抗体；所述质控线固定抗7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体；
S2：将样品溶液、三种双功能抗原和通用荧光探针混合，一起输送至检测线A、检测线B、检测线C和质控线，根据三条检测线和质控线的荧光信号判断样品中是否含有AFB1、OTA和ZEN，以及测定三种真菌毒素的浓度。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤S2通过以下方法进行判断样品中是否含有三种真菌毒素：检测线A、检测线B、检测线C和质控线都显示荧光信号，断定结果为阴性，样品中不含AFB1、OTA和ZEN；检测线A不显示荧光信号，质控线显示荧光信号，断定样品中含有AFB1；检测线B不显示荧光信号，质控线显示荧光信号，断定样品中含有OTA；检测线C不显示荧光信号，质控线显示荧光信号，断定样品中含有ZEN。
9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤S2通过以下方法进行测定三种真菌毒素的浓度：质控线的荧光信号强度检测值定义为C值，3条检测线的荧光信号强度检测值分别定义为T1值、T2值、T3值，通过各检测线的T/C比制定标准曲线从而测定具体浓度。
10.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述通用荧光探针在365nm光源激发下，产生630nm的发射光。
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