CN103376319A - 光子晶体微球液相芯片化学发光法高灵敏度多重检测真菌毒素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用光子晶体微球液相芯片化学发光法检测真菌毒素的方法，该方法利用光子晶体微球为多种真菌毒素探针载体，在微球表面进行竞争免疫检测真菌毒素，通过多种真菌毒素与微球表面固定的抗原竞争结合各自毒素的抗体，利用辣根过氧化物酶标记的二抗与各真菌毒素抗体特异性结合，利用光纤光谱仪测量光子晶体微球反射峰对微球进行解码，利用多功能酶标仪对化学发光信号进行同时高通量检测。该方法对黄曲霉毒素、伏马毒素和赭曲霉毒素的线性检测范围分别为0.0001～1ng/mL，0.0001～1ng/mL，0.001～1ng/mL之间，仅仅需要2μL/样品。

Description

光子晶体微球液相芯片化学发光法高灵敏度多重检测真菌毒素的方法

技术领域

本发明设计农产品、饲料和食品中的真菌毒素快速、高通量、低成本检测技术方法。具体通过谷物中典型的黄曲霉毒素（AFB1）、伏马毒素（FB1）和赭曲霉毒素（OTA）为检测对象，利用三维光子晶体微球液相芯片为载体，通过竞争免疫方法在光子晶体微球表面构建液相芯片化学发光高灵敏度，高通量检测新技术。 

背景技术

真菌毒素是由污染农产品的某些真菌在一定的外部环境下所产生的次级代谢产物，真菌毒素往往会通过食物链进入人体，对人体造成不同程度的影响。在已知的真菌毒素中，黄曲霉毒素、伏马毒素和赭曲霉毒素等对人体危害较为严重。基于此，世界各国和地区都制定了严格的标准，以保护本国的农产品、食品和饲料等的安全。人们长期以来努力采取各种措施，研发新的检测方法来防止真菌毒素进入人类食物链中。目前常用的检测方法有色谱法、免疫分析法等。色谱法主要包括薄层色谱法、气相色谱法及液相色谱法。免疫分析法包括免疫亲和柱层析法、酶联免疫吸附法等。这些常用的检测方法长期以来对真菌毒素的检测起着非常重要的作用。但是随着经济的发展，人们生活水平的提高，食品安全意识的不断增强以及新型的有害物质的发现；同时许多国家为了保护本国国民健康或者制造技术性贸易壁垒，都规定了农产品、食品和饲料中真菌毒素的含量标准。这些都要求检测方法能够快速有效的同时检测多种真菌毒素。并且随着各国经济交流的日益增强，传统的检测方法已经逐渐显现出不足，如检测成本高，试剂用量大，检测仪器昂贵，检测时间长等缺点。基于此，研究和开发一种新型的检测成本低，检测时间短，试剂用量少，灵敏度高，能够同时检测多种真菌毒素的检测技术和方法具有重要的现实意义。 

发明内容

本发明目的在于开发一种高灵敏度、高通量、低成本、检测时间快、特异性好的检测食品中真菌毒素新技术，以替代传统色谱技术或酶联免疫法（ELISA）真菌毒素检测的方法。 

本发明的原理如图1所示，在同一体系中，分别在粒径大小相同，反射峰位置不同的光子晶体微球表面用双氧水：浓硫酸（3：7）溶液进行羟基化修饰，用γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）环氧基修饰，固定真菌毒素包被抗原，牛血清蛋白（BSA）封闭。包被的抗原与真菌毒素标准品或试样中真菌毒素竞争结合真菌毒素抗体，用标记有辣根过氧化物酶的二抗与真菌毒素抗体特异性结合，用微球的反射光谱或其结构色识别不同的真菌毒素探针。添加化学发光底物后，用多功能酶标仪检测化学发光信号值强弱。建立标准曲线和同时检测 食品中的多种真菌毒素。 

本发明所属用光子晶体微球流式芯片检测真菌毒素的方法，是采用光子晶体微球为真菌毒素探针载体，在微球表面进行竞争免疫检测真菌毒素，以黄曲霉毒素（AFB1）、伏马毒素（FB1）和赭曲霉毒素（OTA）为检测对象，通过真菌毒素与微球表面固定抗原竞争各自的抗体，利用标记有辣根过氧化物酶的二抗与抗体特异性结合，利用各光子晶体的反射光谱进行解码，加入化学发光底物，利用多功能酶标仪检测化学发光信号强度。 

上述方法包括以下步骤： 

（1）光子晶体微球的制备 

（2）光子晶体微球表面的修饰：通过体积比3：7的双氧水与浓硫酸对步骤（1）得到的微球表面进行羟基化修饰，再用γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）对微球表面进行环氧基修饰； 

（3）抗原的固定：通过化学键合的方法将黄曲霉毒素（AFB1）、伏马毒素（FB1）和赭曲霉毒素（OTA）人工抗原AFB1-BSA,FB1-BSA,OTA-BSA固定于经步骤（2）表面修饰的微球表面。 

（4）用光子晶体微球流式芯片对待测样品进行竞争免疫检测，利用标记有辣根过氧化物酶的二抗与各自真菌毒素抗体进行特异性反应，利用光纤光谱仪对各微球进行解码，加入化学发光底物后，用多功能酶标仪对发光信号强度进行同时检测。 

光子晶体微球的制备：将装有单分散纳米二氧化硅乳液的1号注射器及装有甲基硅油的2号注射器连接到三通管上，利用微流注射泵将甲基硅油和单分散纳米二氧化硅乳液通过三通管混合包裹，并通过玻璃管流入疏水性的收集器皿中，在界面力的作用下单分散纳米二氧化硅乳液形成球状结构。 

以不同纳米二氧化硅颗粒自组装技术制备上述的粒径相同的光子晶体为球，各微球具有不同的反射光谱。 

将制备好的液态微球置于60℃烘箱内，加热9小时，使液态微球中的水分逐渐蒸发并使单分散纳米二氧化硅微球进一步自组装。微球成型后，用正己烷浸泡微球，每次10min，直至将甲基硅油洗净，后用无水乙醇清洗微球4次，将正己烷完全洗净。将清洗好的微球至于管式炉中煅烧，升温速度为2℃/min，升至700℃，保温3小时，后自然降至室温。 

光子晶体微球表面化学修饰： 

修饰羟基：将10mL食人鱼洗液（浓硫酸：双氧水=7：3）加入到光子晶体微球的烧杯中，浸泡6小时，后用双蒸水冲洗4次，用氮气流吹干。经过该食人鱼洗液处理后，清除掉微球表面的有机杂质得以清除，并且使微球表面形成更多的硅羟基（-OH）。 

修饰环氧基：将上述经食人鱼洗液处理过的微球浸泡于含1%（v/v）γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）的甲苯溶液中，浸泡6小时，待反应结束后，用甲苯和无水乙醇分别清洗微球4次，后用氮气流吹干，将微球置于110℃下加热45min。处理好后的微球用于下一步的毒素检测。 

谷物试样的处理： 

大米、玉米和小麦使用中药粉碎机粉碎，过200目筛，称取试样各5g于100mL的三角瓶中，向样品中添加不同浓度及体积的真菌毒素标准品，充分混合试样后，将其放入通风处内，直至溶剂蒸发完全。向其中加入提取剂（甲醇：水=4：6）15mL，在摇床内150r/min，提取2小时，用whatman滤纸过滤，滤液即为待测样品。 

竞争免疫检测： 

将修饰后的微球至于离心管中，每管5球，后加入10μL浓度为1200ng/mL的黄曲霉毒素-牛血清蛋白偶联物（AFB1-BSA）、1200ng/mL伏马毒素-牛血清蛋白偶联物（FB1-BSA）和400ng/mL赭曲霉毒素-牛血清蛋白偶联物（OTA-BSA），4℃下过夜。后用PBST和PBS各清洗微球3次，后向离心管中加入10μL含有1%牛血清蛋白（BSA）的pH=9.6的碳酸盐缓冲液，对微球表面上未结合抗原的活性基团进行封闭，室温下封闭1小时，后用PBST和PBS各清洗微球3次。向各离心管中依次加入10μL不同浓度梯度的各自真菌毒素标准溶液（标准曲线）或提取的谷物试样，接着再向离心管中加入10μL的相应的真菌毒素抗体，37℃下竞争结合1.5小时，用PBST和PBS各清洗微球3次后，向离心管中加入10μL的稀释比率为1：6000的辣根过氧化物酶标记的二抗（HRP-IgG），37℃下反应1小时，用PBST和PBS各清洗微球3次。将微球移入384白色微孔板中，每孔加入化学发光底物液（双氧水、鲁米诺和对碘苯酚混合物）20μL，用酶标仪检测各孔化学发光强度，积分时间1s。各真菌毒素的标准曲线见图2。 

本发明采用改进

法合成了单分散纳米二氧化硅微球，通过二氧化硅颗粒自组装技术，组装成结构和均一的光子晶体微球。选择了三种光子晶体微球作为光编码载体。将光子晶体微球放在蒸馏水中用超声波洗净后将其浸入食人鱼洗液（浓硫酸：双氧水=7：3）进行清洗，使其表面硅羟基增多，后利用1%的γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）甲苯溶液浸泡，使其表面修饰环氧基。通过优化包被pH值及化学发光底物反应时间，黄曲霉毒素（AFB1）、伏马毒素（FB1）和赭曲霉毒素（OTA）抗原浓度，各自对应的抗体及辣根过氧化物酶标记的二抗的稀释比率，确定了最佳包被pH值为9.6，包被浓度分别为1200ng/mL，1200ng/mL，400ng/mL。抗体稀释比率为1：10000，1：10000，1：30000。二抗稀释比率为1：6000。化学发光底物反应时间为5min。包被pH值及底物反应时间对检测信号的影响见图3。 

利用三种光子晶体微球最大反射峰位置的差异对三种光子晶体微球进行物理编码，对微球表面修饰化学基团后，分别不同真菌毒素抗原包被在微球表面，加入真菌毒素标准品或谷物提取样品和对应的真菌毒素抗体后，进行竞争结合，后加入辣根过氧化物酶标记的二抗进行特异性结合，利用光子晶体微球反射峰进行解码，加入化学发光底物后，利用酶标仪对化学发光强度进行检测，构建农产品中真菌毒素的液相芯片高通量检测技术。建立真菌毒素检测范围分别在1-0.0001ng/mL，1-0.0001ng/mL，1-0.001ng/mL对三种毒素真菌毒素在大米、玉米和小麦中的回收率在63.48%～124.66%之间。各微球载体之间无干扰，具有良好的特异性。特异性见图4。 

本发明中通过对反应条件进行优化，将化学发光信号值提高，从而扩大检测线性范围。这一技术对真菌毒素的检测灵敏度达到了pg/mL，检测现行范围到3-4个数量级，各个毒素检测 分别在各自微球表面进行，不存在互相干扰问题，具有良好的检测特异性。而且，检测样品试剂仅仅需要2μL/球，节省了试剂和样品，将包被封闭好的微球直接用于检测，检测时间小于3小时。该技术可以高通量、快速、灵敏、稳定地检测样本，成本低廉。 

附图说明

图1光子晶体微球流式芯片检测真菌毒素原理图。 

图2三种真菌毒素检测标准曲线。 

图3是包被pH值及底物反应时间对检测信号。 

图4三种真菌毒素同时检测的特异性。 

具体实施方式

本发明所用黄曲霉毒素B1标准品（AFB1），黄曲霉毒素B1-牛血清蛋白偶联物（AFB1-BSA），伏马毒素B1标准品（FB1），伏马毒素B1-牛血清蛋白偶联物（FB1-BSA），赭曲霉毒素（OTA）标准品，赭曲霉毒素-牛血清蛋白偶联物（OTA-BSA），四氧乙基硅烷（TEOS）购于Sigma-Aldrich。牛血清蛋白（BSA），磷酸盐缓冲液（PBS），鲁米诺购于上海生工有限公司。辣根过氧化物酶标记的二抗（HRP-IgG），黄曲霉毒素B1抗体（AFB1-Ab），伏马毒素B1抗体（FB1-Ab），赭曲霉毒素抗体（OTA-Ab）购于Abcam。γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）购于东京化成工业株式会社。甲基硅油购于宇诺公司。氨水、无水乙醇、吐温-20购于南京化学试剂公司。谷物包括大米、玉米和小麦购于南京热河南路农贸市场。 

本发明所用的仪器主要有： 

AM-3250B型磁力搅拌器天津奥特赛恩斯仪器有限公司 

TDZ5-WS型台式低速自动平衡离心机长沙湘智离心机仪器有限公司 

KQ-300B型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司 

H600-II型透射电子显微镜日本日立公司 

DHG-9140型电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司 

OTL1200管式炉南京南大仪器厂 

LSP01-1A微流注射泵河北保定兰格恒流泵有限公司 

PHS-3C-01型pH计上海三信仪表厂 

Infinite200多功能酶标仪帝肯（上海）贸易有限公司 

ZQTY-70-T型震荡培养箱上海知楚仪器有限公司摇床 

中药粉碎机长沙市常宏制药机械设备厂 

SW-CJ-2净化工作台苏州净化仪器有限公司 

QL-866漩涡混合仪海门麒麟医用仪器厂 

单分散二氧化硅纳米颗粒的制备：采用改进

法合成。 

实施例1 

大米、玉米和小麦使用中药粉碎机粉碎，过200目筛，称取试样各5g于100mL的三角瓶中，向样品中添加不同浓度及体积的真菌毒素标准品，充分混合试样后，将其放入通风处内，直至溶剂蒸发完全。向其中加入提取剂（甲醇：水=4：6）15mL，在摇床内150r/min，提取2 小时，用whatman滤纸过滤，滤液即为待测样品。同时，按照上述方法提取没有加入标准品的对照试样。 

竞争免疫检测： 

将修饰后的微球至于离心管中，每管5球，然后分别加入10μL浓度为1200ng/mL的黄曲霉毒素-牛血清蛋白偶联物（AFB1-BSA）、1200ng/mL伏马毒素-牛血清蛋白偶联物（FB1-BSA）和400ng/mL赭曲霉毒素-牛血清蛋白偶联物（OTA-BSA），4℃下过夜。后用PBST和PBS各清洗微球3次，后向离心管中加入10μL含有1%牛血清蛋白（BSA）的pH=9.6的碳酸盐缓冲液，对微球表面上未结合抗原的活性基团进行封闭，室温下封闭1小时，后用PBST和PBS各清洗微球3次。向各离心管中依次加入10μL不同浓度梯度的各自真菌毒素标准溶液（标准曲线）或提取的谷物试样，接着再向离心管中加入10μL的对应真菌毒素抗体，37℃下竞争结合1.5小时，用PBST和PBS各清洗微球3次后，向离心管中加入10μL的稀释比率为1：6000的辣根过氧化物酶标记的二抗（HRP-IgG），37℃下反应1小时，用PBST和PBS各清洗微球3次。利用光纤光谱仪对微球进行光谱解码，将微球移入384白色微孔板中，每孔加入化学发光底物液（双氧水、鲁米诺和对碘苯酚混合物）20μL，用酶标仪检测各孔化学发光强度，积分时间1s。 

检测结果见表1： 

表1 

Claims (4)

1.一种用光子晶体微球液相芯片化学发光法检测真菌毒素的方法，其特征在于，利用光子晶体微球为真菌毒素探针载体，在微球表面进行竞争免疫检测多个真菌毒素，以黄曲霉毒素、伏马毒素和赭曲霉毒素为检测对象，通过真菌毒素与微球表面固定的抗原竞争结合各自毒素抗体，利用辣根过氧化物酶标记的二抗与真菌毒素抗体特异性结合，利用光纤光谱仪测量微球反射峰进行解码，利用多功能酶标仪对化学发光信号进行同时高通量检测。

2.根据权利要求1所述的方法，包括以下步骤：

（1）光子晶体微球的制备；

（2）光子晶体微球表面的修饰：通过体积比3：7的双氧水与浓硫酸对步骤（1）得到的微球表面进行羟基化修饰，再用γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷对微球表面进行环氧基修饰；

（3）抗原的固定：通过化学键合方法分别将黄曲霉毒素、伏马毒素和赭曲霉毒素人工抗原固定于经过步骤（2）表面修饰的微球表面；

（4）用光子晶体微球流式芯片对待测样品进行竞争免疫检测；利用光纤光谱仪测量微球反射峰进行解码，利用多功能酶标仪检测化学发光信号值。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤（2）中γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷微球表面进行环氧基修饰时，120℃下烘干30-60min。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述黄曲霉毒素、伏马毒素和赭曲霉毒素人工抗原包被浓度分别为1200ng/mL，1200ng/mL，400ng/mL。抗体稀释比率为1：10000，1：10000，1：30000。二抗稀释比率为1：6000。

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