CN103575903B - 一种人乳铁蛋白夹心elisa检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种人乳铁蛋白的夹心ELISA检测试剂盒，包括包被抗体和酶标抗体，其中所述包被抗体为人乳铁蛋白多克隆抗体，所述酶标抗体为人乳铁蛋白单克隆抗体。本发明可用于转基因成分定量检测，根据标准曲线在25～200ng/mL范围内线性良好，可实现对样品的高特异性和高灵敏度检测。该方法采用夹心ELISA法，敏感、特异、操作方便。

Description

一种人乳铁蛋白夹心ELISA检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体来说涉及人乳铁蛋白夹心ELISA检测试剂盒及其应用。
背景技术
在转基因生物新品种培育重大专项和国家其他经费的资助下，我国转基因猪、牛和羊新品种研发获得了蓬勃发展，多个转基因动物品种展示了良好的产业化前景，其中发展最为迅速的是乳腺生物反应器的利用，目前转人乳铁蛋白基因奶牛已经通过了农业部规定的中间试验、环境释放、生产性试验，距离获颁最终的农业转基因生物安全证书仅有一步之遥。
由于转基因生物及其产品存在风险，转基因生物及产品的管理一直受到各国政府的高度重视。牛奶和奶制品是人们餐桌上最常见的一类食物，食品安全直接关系民生，在没有足够的数据证明其安全之前，质检机构均有责任和义务去检测和监测这些已上市或即将上市的转基因产品。开发一种实用、灵敏、特异的人乳铁蛋白成分检测试剂十分必要。
目前用于检测乳铁蛋白的方法主要有高效液相色谱法、毛细管电泳法、放射性免疫法和酶联免疫吸附法等，但是检测人乳铁蛋白的报道却并不多。王燕平等建立了一种人乳中乳铁蛋白ELISA检测方法，为间接ELISA法，摸索了ELISA操作的工作条件，检测人乳铁蛋白的限度为1.56~100ng/mL。该方法针对标准品检测灵敏度高，但针对样品的检测灵敏度低。双抗体夹心ELISA又称抗原捕捉ELISA，该方法已被大量用于动物疫病的临床诊断，该方法最关键的条件是制备高纯度的包被抗体，纯度越高，则特异性越好，但尚无人乳铁蛋白转基因成分双抗体夹心ELISA检测方法的报道。
发明内容
本发明目的是提供一种人乳铁蛋白夹心ELISA检测试剂盒用于定量检测转基因成分。
本发明另一目的是提供人乳铁蛋白夹心ELISA检测试剂盒检测人乳铁蛋白的方法。
本发明再一目的是提供人乳铁蛋白夹心ELISA检测试剂盒在检测转基因牛奶及奶制品中人乳铁蛋白含量中的应用。
本发明提供的人乳铁蛋白的夹心ELISA检测试剂盒，包括包被抗体和酶标抗体，其中所述包被抗体为人乳铁蛋白多克隆抗体，所述酶标抗体为人乳铁蛋白单克隆抗体。
其中，所述人乳铁蛋白单克隆抗体由保藏号为CGMCCNO.6394的杂交瘤细胞株分泌获得。
用重组蛋白hLF免疫雌性BALB/c小鼠，取脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合，经ELISA法进行阳性克隆筛选、通过有限稀释法进行亚克隆，获得稳定分泌抗hLF的4株细胞1C2、2G11、3A6、3D12。取杂交瘤细胞（效价较高同时细胞状态好）注射至小鼠腹腔，收集腹水，亲和柱纯化得单克隆抗体。
经鉴定腹水制备前细胞上清效价检测显示细胞3D12效价最高。3D12细胞亚型为IgG1+kappa。3D12细胞能与免疫原hLF反应，不与筛选原牛乳铁蛋白（bLF）反应。用细胞3D12制备腹水，检测腹水效价为1:81000，腹水纯化检测单克隆抗体效价为1:81000，抗体纯度高于95%。
杂交瘤细胞ZZYhLF3D12的保藏号为：CGMCCNo.6394；保藏时间：2012年7月20日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
所述人乳铁蛋白单克隆抗体可用于检测转基因牛奶中表达量数量级为g/L的人乳铁蛋白。WesternBlot检测显示抗体3D12只与转基因牛奶及奶粉反应，不与非转基因牛奶及奶粉反应。
其中，所述酶标抗体的标记酶为辣根过氧化物酶。
其中，所述人乳铁蛋白多克隆抗体是以人乳铁蛋白作为免疫抗原，分批次免疫正常家兔，加强免疫后7天收集血清，分离纯化得到。
纯化抗体通过考马斯亮蓝验证，多克隆抗体能满足要求，浓度约为2mg/mL。采用间接ELISA法对抗体IgG进行鉴定，抗体效价达到1∶200,000。
其中，检测样本中免疫抗原检测限为25ng/mL。
所述人乳铁蛋白的夹心ELISA检测试剂盒还包括以下试剂中的一种或几种：
1）洗涤液；
2）底物显色液；
3）反应终止液；
4）人乳铁蛋白标准品。
所述洗涤液为PBST，所述底物显色液为TMB，所述反应终止液为2mol/LH2SO4。
所述试剂盒检测人乳铁蛋白的方法，包括如下步骤：
1）向包被人乳铁蛋白多克隆抗体的酶联板中加入人乳铁蛋白抗原标准品和待检测样品，洗涤液洗板；
2）加入酶标人乳铁蛋白单克隆抗体，洗涤液洗板；
3）加入底物显色液显色，加入反应终止液终止反应，测定OD450值；
4）以人乳铁蛋白抗原标准品的剂量-效应曲线为标准曲线，计算样品人乳铁蛋白的含量。
具体包括以下步骤：
IIgG标准曲线的建立：
将人乳铁蛋白多克隆抗体包被于酶联板上，洗板；封闭经包被的酶联板，洗板；加入不同浓度的人乳铁蛋白抗原标准品溶液，洗板；加入酶标人乳铁蛋白单克隆抗体，洗板；加底物显色；终止反应；测定OD450值，以与阴性对照孔OD值的比值大于2.1为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点，建立标准曲线；
II检测样品中人乳铁蛋白的含量：
将人乳铁蛋白多克隆抗体包被于酶联板上，洗板；封闭经包被的酶联板，洗板；加入待检测样品，洗板；加入酶标人乳铁蛋白单克隆抗体，洗板；加底物显色；终止反应；测定OD450值，通过与标准曲线比对，定量检测人乳铁蛋白。
优选地，人乳铁蛋白多克隆抗体浓度为5μg/mL，包被液为pH9.6磷酸缓冲液，酶标人乳铁蛋白单克隆抗体稀释倍数为1:500。
具体实施步骤如下：
IIgG标准曲线的建立：
（1）包被：浓度为5μg/mL兔多克隆抗体，100μL/孔，4℃过夜，洗液洗涤3次；
（2）封闭：加150μL/孔封闭液，37℃2小时后，洗涤3次，拍干，置4℃冰箱保存备用；
（3）加标准样品：
混合转基因样品和非转基因样品制备人乳铁蛋白抗原标准品，标准品原始浓度为0.2mg/mL，分别按照1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000稀释，PBS作为阴性对照；加入不同浓度的人乳铁蛋白抗原标准品溶液100μL/孔，37℃孵育30min，洗板4次，拍干；
（4）加二抗：小鼠单克隆抗体-HRP抗体，按1:500的稀释比例加入，37℃孵育20min，洗板4次，拍干；
（5）显色：TMB按100μL/孔加入，37℃显色15-30min；
（6）终止：加入终止液2MH2SO450μL/孔；
（7）读数：以450nm单波长测定各孔OD值，以与阴性对照孔OD值的比值大于2.1为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点，建立标准曲线；
II检测样品中人乳铁蛋白的含量：
（1）包被：浓度为5μg/mL兔多克隆抗体，100μL/孔，4℃过夜，洗液洗涤3次；
（2）封闭：加150μL/孔封闭液，37℃2小时后，洗涤3次，拍干，置4℃冰箱保存备用；
（3）加待测样品：
加入待测样品，100μL/孔，37℃孵育30min，洗板4次，拍干；
（4）加二抗：小鼠单克隆抗体-HRP抗体，按1:500的稀释比例加入，37℃孵育20min，洗板4次，拍干；
（5）显色：TMB按100μL/孔加入，37℃显色15-30min；
（6）终止：加入终止液2MH2SO450μL/孔；
（7）读数：以450nm单波长测定各孔OD值，通过与标准曲线比对，定量检测人乳铁蛋白。
本发明的有益效果：本发明的人乳铁蛋白单克隆抗体纯度高，效价高，灵敏度高，无交叉反应，专一性强，可特异性识别转基因样品，可直接对外源表达蛋白进行检测，同时避免了核酸检测方法中，基因提取费时费力且容易污染的问题。本发明可用于转基因牛奶及奶制品中人乳铁蛋白的定量检测，根据标准曲线在25～200ng/mL范围内线性良好，可实现对样品的高特异性和高灵敏度检测，检测成本低廉，结果迅速，灵敏可靠，而且可以稳定、方便地提供准化的试剂，便于实现工业化生产。
附图说明
图1为免疫后小鼠血清WB检测结果图；其中A1:1#1:1000；A2:1#1:3000；A3:2#1:1000；A4:2#1:3000；A5:3#1:1000；A6:3#1:3000；A7:4#1:1000；A8:4#1:3000；A9:5#1:1000；A10:5#1:3000；
图2为腹水制备前细胞上清WB检测结果图；其中1:1C2；2:2G11；3:3A6；4:3D12；5:1C2；6:2G11；7:3A6；8:3D12；
其中，1-4道上样hLF4μg；5-8道上样bLF4μg；
图3为SDS-PAGE检测纯化后抗体纯度检测结果图；其中1:蛋白marker；2:3D12小鼠单克隆抗体；
图4为单克隆抗体检测样品结果图；其中1:转基因牛奶；2:转基因牛奶；3:转基因牛奶；4:转基因奶粉（管壁）；5:转基因奶粉（管顶）；6:非转基因脱脂奶粉；7:非转基因脱脂奶粉；8:非转基因牛奶；9:非转基因牛奶；
图5为hLF多克隆抗体纯化考马斯亮蓝染色图；
其中，1-1：BSA2mg/mL；1-2：BSA1mg/mL；1-3：BSA0.5mg/mL；1-4：BSA0.25mg/mL；1-5：BSA0.125mg/mL；1-6：BSA0.0625mg/mL：2-1：洗脱管1；2-2：洗脱管2；2-3：洗脱管3；2-4：洗脱管4；2-5：洗脱管5；2-6：洗脱管6；
图6为hLF多克隆抗体效价图；
图7为hLF标准品检测标准曲线；
图8为模拟样品检测标准曲线。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
转人乳铁蛋白基因奶牛样品来自中国农业大学农业生物技术国家重点实验室；日本大耳白兔购自军事医学科学研究院实验动物中心；人乳铁蛋白购自Sigma公司。
人乳铁蛋白（hLF），牛乳铁蛋白（bLF）、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；96孔酶标板购自北京宏捷成生物科技有限公司；四甲基乙二胺（TEMED）购自Amresca公司；96孔培养板、25孔培养板、6孔培养板、T-25培养瓶、T-75培养瓶、250mL培养瓶、2mL冻存管购自corning公司；超滤管购自Millipore公司；HAT、100×HT、PEG4000购自Sigma公司；RPMI1640培养基购自Hyclone公司；胎牛血清购自Gibico公司；层析柱购自Phamacia公司，石蜡油购自BBI公司；HRP标记试剂盒（CatNo31488）购自Pierce公司；山羊抗小鼠IgG-HRP、山羊抗兔IgG-HRP购自中杉金桥生物公司；TMB（可溶型）购自天根生物公司；IgG纯化试剂盒购自嘉兴行建生物科技有限公司。
层析柱购自Phamacia公司；涡旋仪购自江苏海门市其林贝尔公司；高速微量离心机购自美国Sigma公司；ElixRMilliQRBiocelTM纯水系统购自美国Millipore公司；舒适性恒温仪购自eppendorf公司；台式冷冻离心机、真空浓缩仪购自eppendorf公司；电热恒温水浴锅购自PolyScience公司；NanoDrop1000紫外/可见分光光度计购自NanoDrop公司；恒温鼓风干燥箱、摇床购自中国智成公司；紫外凝胶成像系统购自UVP公司；PYY-6C型稳压稳流电泳仪、DYCP-31C微型水平电泳槽购自北京六一厂；高压灭菌锅、-80℃冰箱购自日本三洋公司；混合型球磨仪购自Retsch公司；酶标仪，BIO-RAD；二氧化碳培养箱，购自SANYO；蛋白电泳装置，购自BioRad公司；蛋白定量检测仪，购自AmershamBiosciences公司。
转基因牛奶、奶粉样品来自中国农业大学农业生物技术国家重点实验室，非转基因牛奶及脱脂奶粉购自超市。
实施例1hLF单克隆抗体的制备
1、小鼠抗体的制备
选择6周龄同一批次健康的雌性Balb/c小鼠10只作为实验动物，随机分为2组，实验组5只（1#、2#、3#、4#、5#小鼠），对照组2只。实验组用hLF进行免疫，用PBS缓冲液代替hLF进行免疫作为阴性对照。每只小鼠皮下注射总量为100μL用佐剂乳化好的抗原（250μLPBS溶解400μg抗原后与250μL弗氏不完全佐剂混合，共500μL，每只小鼠注射100μL）。第一次基础免疫剂量为每只小鼠80μg，加强免疫免疫剂量为每只小鼠40μg，基础免疫时使用弗氏完全佐剂乳化，加强免疫时用弗氏不完全佐剂乳化。基础免疫后间隔10天进行加强免疫。共免疫3次，小鼠在第3次加强免疫后7天，尾静脉采血，检测血清中抗体滴度（间接ELISA法），如滴度未达到1∶104，OD1.0以上，则再加强免疫。在抗体滴度达到1:104后的第10天眼眶采血，分离血清，-20℃保存备用。
2、间接ELISA法检测免疫小鼠的抗体水平
以hLF作为包被抗原，包被浓度：20μg/mL，利用间接ELISA法检测血清抗体水平。实验组血清稀释倍数依次为：1:1000、1:3000、1:9000、1:27000、1:81000、1:240000、1:720000；对照组血清1:3000稀释。
hLF间接ELISA法测定的基本操作步骤如下：
（1）包被：将hLF用包被液（磷酸缓冲液pH9.6）稀释至20μg/mL，用微量加样器吸取稀释后的抗原加入96孔酶标板，100μL/孔，置4℃冰箱过夜。
（2）洗涤：取出ELISA板，弃去孔内液体，在纸巾上轻轻叩打以除去残留液体，加入PBST洗涤液，300μL/孔，静置1min，重复操作3~5次。
（3）封闭：用微量加样器按200μL/孔加1%BSA，放入37℃温箱2h。
（4）洗涤：同步骤2）。
（5）加待检样本：用PBS缓冲液将血清稀释，血清稀释倍数依次为：1:1000、1:3000、1:9000、1:27000、1:81000、1:240000、1:720000；对照组血清1:3000稀释，放入37℃温箱1h；
（6）洗涤：同步骤2）。
（7）加酶标抗体：用PBST洗涤液将HRP标记的山羊抗小鼠二抗稀释到工作浓度1:5000，每孔加100μL，37℃温箱孵育45min。
（8）洗涤：同步骤2）。
（9）加底物溶液：避光按100μL/孔加入TMB底物溶液，室温孵育15min。
（10）终止反应：室温下加终止液50μL/孔，终止反应。
（11）测OD450值：检测450nm波长下的OD值。
表1.经三次免疫后小鼠血清效价的测定结果
1:1000 1:3000 1:9000 1:27000 1:81000 1:240000 1:720000 PBS
1# 3.501 3.501 3.494 2.711 1.440 0.689 0.659 0.060
2# 3.501 3.501 3.036 1.734 0.865 0.419 0.612 0.085
3# 3.501 3.398 1.599 0.646 0.333 0.148 0.103 0.057
4# 3.501 3.501 2.811 1.302 0.528 0.286 0.243 0.057
5# 3.501 3.435 2.181 0.928 0.445 0.229 0.132 0.064
注:1#小鼠头标记，2#小鼠尾标记，3#小鼠为左前标记，4#小鼠为左后标记，5#小鼠为未标记。
结果显示，1#、2#、3#、4#、5#小鼠均已达到融合标准，其中1#小鼠效价最高。结果见表1。
3、小鼠血清WesternBlot检测
抗原hLF，上样量为4μg，WesternBlot检测的基本操作步骤如下:
（1）电泳：上样4μg，Marker4μl；先90V，后150V。
（2）转膜：0.45μm孔径的NC膜，湿转，50mA恒流转膜50分钟。
（3）封闭：用WesternBlot封闭液（1%BSA-TBST），室温封闭30min。
（4）孵育一抗：血清稀释液（1%BSA-TBST）（1:1000），室温孵育30min后，放于4℃过夜。
（5）洗膜：TBST洗膜5次，每次3min。
（6）孵育二抗：加山羊抗兔IgG，1:10000稀释，室温孵育40min。
（7）洗膜：TBST洗膜5次，每次3min。
（8）显色、曝光：ECLWesternBlotKit高灵敏度化学发光检测试剂盒。
WB检测结果显示，仅有1#小鼠呈阳性反应（见图1），选择1号小鼠进行细胞融合。
4、细胞融合
（1）饲养层细胞的制备：
1）细胞融合前1~2天进行饲养层细胞的制备，眼科剪刀、眼科镊子、200目尼龙网，平皿等试验用具用前高温干烤灭菌，HAT完全培养液做好无菌检验。
2）取2只BALB/c小鼠摘除眼球放血，按常规方法分离阴性血清。拉颈脱臼处死小鼠，将其浸泡于75%酒精中，10min后移入超静工作台。
3）将小鼠腹部向上固定在鼠架上，用镊子提起腹正中部皮肤，眼科剪刀横向剪一小口，切勿剪破腹膜，用镊子上下撕开皮肤，充分暴露腹膜。
4）用镊子轻轻提起腹膜，将10mL注射器内吸取的7~10mLHAT完全培养液注入腹腔，切勿刺穿脏器和肠道，注射器不要拔出，在腹腔内来回抽吸3-5次，然后用镊子按摩两侧腹部30秒左右，再进行抽吸，重复以上操作2-3次。
5）用注射器回吸腹腔内液体。注意避开肠系膜及脂肪组织，以免堵塞针头，同时可利用镊子取下针头上的脂肪组织。重复此步骤可获得更多的腹腔细胞。
6）将从2只昆明鼠中取出的腹腔细胞加入75mLHAT培养液中，吹散混匀细胞，分装于8块96孔培养板，100μl/孔。置于37℃、5%CO2培养箱中培养。
（2）骨髓瘤细胞的制备：
1）融合前36~48h，将骨髓瘤细胞扩大培养于两个250mL培养瓶中，每瓶加15mL培养液，置37℃，5%CO2培养箱中培养，使细胞处于对数生长期。
2）融合当天，用弯巴氏管吸取15mLDMEM基础培养液将细胞从瓶壁上吹下，收集于50mL离心管中。
3）将细胞沉淀重悬置20mLDMEM基础培养液中，混匀。
4）取骨髓瘤细胞悬液，计数，备用。
（3）免疫脾细胞的制备：
1）融合前摘除小鼠眼球采血，制备阳性血清。
2）将小鼠拉颈脱臼致死，浸泡于75%酒精中，10min后放于超净台。
3）无菌打开腹腔，无菌取出脾脏，将脾脏放入装有灭菌尼龙网和盛有15mLDMEM基础培养液的平皿中，用玻璃注射器内芯研磨脾脏，使脾细胞全部通过网孔进入烧杯中。
4）将脾细胞溶液转入50mL离心管中，加DMEM基础培养液定容至30mL，混匀。
5）1000rpm离心10min，弃上清。将细胞沉淀悬于10mLDMEM基础培养液中，混匀。
6）取细胞悬液，计数，备用。
（4）脾细胞与骨髓瘤细胞融合：
1)取80mLHAT培养液，15mL基础DMEM培养液和1mL50%PEG于37℃水浴中预热，另备盛有37℃水的200mL烧杯。
2）分别取1×108个脾细胞和2×107个骨髓瘤细胞的细胞悬液量，加入50mL玻璃离心管中，补加DMEM基础培养液至30mL，混匀。
3）1000rpm离心10min，弃上清，尽可能倒干。
4）用手掌轻击离心管底部，使沉淀细胞松散均匀呈糊状。
5）将离心管放入盛有37℃水的200mL烧杯中，一手均匀转动离心管，另一手用1mL巴氏吸管吸取37℃50%pH8.0的PEG溶液1mL，1min内加完，静置90s。
6）随后先慢后快地加入DMEM基础培养液终止反应，37℃水浴静置10min。
7）1000rpm离心10min，弃上清，加入80mLHAT培养基，轻轻地吹散细胞，每孔0.1mL接种于已培养有饲养细胞的8块96孔培养板，置37℃、5%的CO2培养箱中培养。
8）5d后半量换液，10d后换成HT培养基，待克隆长至孔底面积1/4-1/3时取上清进行检测。
9）采用间接ELISA方法对融合细胞上清筛选，经过两次筛选最终确认阳性细胞孔进行单克隆化，方法同hLF酶联免疫吸附法（ELISA）-间接法，待检样本为吸取的培养上清。
表2.1号板细胞上清检测结果
表3.2号板细胞上清检测结果
表4.3号板细胞上清检测结果
表5.4号板细胞上清检测结果
表6.5号板细胞上清检测结果
表7.阳性细胞孔24孔培养复筛结果
每板中H11为阴性对照，H12为阳性对照。
其中1号板细胞上清检测结果：阳性细胞孔4个，分别为C2、C9、C11、E6（见表2）；2号板细胞上清检测结果：阳性细胞孔5个，分别为A10、C1、E3、F1、G1（见表3）；3号板细胞上清检测结果：阳性细胞孔3个，分别为A6、D12、F5（见表4）；4号板细胞上清检测结果：阳性细胞孔2个，分别为B2、H9（见表5）；5号板细胞上清检测结果：阳性细胞孔1个，分别为B2（见表6）。
将所有阳性细胞孔转入24孔扩增培养进行复筛，待细胞生长至显微镜视野1/3时，进行ELISA检测，板中A11为阴性对照，A12为阳性对照。表7检测结果显示，以hLF为包被抗原，阳性细胞孔7个，分别为A1、A2、B1、B2、B7、B11、B12；以bLF为包被抗原，阳性细胞孔为0。
5、阳性杂交瘤细胞株亚克隆及建株
采用有限稀释方法对所有筛选确认的阳性细胞株进行亚克隆，待细胞集落生长至显微镜视野1/3时吸取上清进行筛选，方法同hLF酶联免疫吸附法（ELISA）-间接法，待亚克隆阳性率达到100%时，正式建株得4株细胞1C2、2G11、3A6、3D12，每株细胞冻存5支以上。
6、阳性杂交瘤细胞株腹水制备及腹水效价检测
（1）腹水制备前细胞上清效价检测：将细胞上清分别做1:3、1:9、1:27、1:81系列稀释，以PBS作为阴性对照，检测方法同hLF酶联免疫吸附法（ELISA）-间接法，见表8。
表8腹水制备前细胞上清效价检测结果
原液 1:3 1:9 1:27 1:81 PBS
1C2 2.770 1.579 0.932 0.417 0.213 0.075
2G11 2.806 1.443 0.857 0.414 0.250 0.077
3A6 2.552 1.145 0.688 0.303 0.137 0.073
3D12 2.889 1.879 1.649 1.385 1.025 0.084
表8显示细胞3D12效价最高，将杂交瘤细胞3D12进行保藏，保藏号CGMCCNo.6394；保藏时间：2012年7月20日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
（2）腹水制备前细胞上清WB检测：方法同小鼠单克隆抗体制备中步骤3。图2显示4株细胞均能与免疫原hLF反应，均不与筛选原bLF反应。
（3）腹水制备：取2只BALB/C小鼠，每只注射0.5mL石蜡油，7天后取杂交瘤细胞（效价较高同时细胞状态好的细胞3D12细胞）重悬于无血清培养基中，按1×106个细胞/0.5mL/只量注射石蜡小鼠，注射细胞约7-14天后收集腹水。
（4）腹水效价检测：腹水效价检测方法同hLF酶联免疫吸附法（ELISA）-间接法。检测效价结果为1:81000，见表9。
表9腹水效价检测结果
7、腹水纯化及抗体效价检测
（1）腹水纯化：
1）平衡：用BindingBuffer（Phamacia）平衡proteinG亲和柱至基线平稳。
2）上样：将腹水样品上柱，收集流穿液；将流穿液再次上柱，继续平衡至基线平稳。
3）洗脱：加入ElutingBuffer（Phamacia）洗脱，收集洗脱峰，SDS-PAGE检测纯度。
4）用0.01M，pH7.2PBS透析收集的洗脱峰，使纯化后的抗体保存在0.01M，pH7.2PBS环境中。
（2）抗体浓度检测：用蛋白定量检测仪（购自AmershamBiosciences公司）测定纯化后单抗的浓度为1mg/mL。
（3）抗体纯度检测：SDS-PAGE检测纯化后抗体纯度，抗体上样量：8μg。结果显示纯化后抗体纯度高于95%，见图3。
（4）抗体效价检测：方法同hLF酶联免疫吸附法（ELISA）-间接法。结果显示纯化后抗体效价为1:81000，见表10。
表10抗体效价检测结果
8、hLF抗体亚型检测
抗体亚型的检测试剂盒由SouthernBiotech公司生产，具体实验方法参照厂家说明书。
表11阳性细胞亚型鉴定结果
IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 IgM IgA Kappa Lamda
1C2 2.097 0.047 0.047 0.043 0.045 0.054 0.047 0.354
2G11 1.727 0.060 0.058 0.056 0.057 0.060 0.063 0.399
3A6 2.129 0.046 0.042 0.045 0.050 0.054 0.055 0.396
3D12 2.252 0.051 0.048 0.058 0.055 0.056 0.065 0.461
表11显示阳性细胞亚型鉴定结果为所获得4株细胞亚型均为IgG1+kappa。
实施例2hLF单克隆抗体的应用
转基因牛奶及奶粉样品WesternBlot检测
取转基因牛奶、奶粉及非转基因牛奶及奶粉进行检测。奶粉浓度：5%（每100ml溶液中所含奶粉为5g），上样量均为20μl。步骤同hLFWesternBlot检测。
样品检测结果显示，抗体3D12只与转基因牛奶及奶粉反应，不与非转基因牛奶及奶粉反应，见图4。
实施例3多克隆抗体的制备
1、兔免疫血清的制备
选择同一批次健康的雌性日本大耳白兔4只，随机分为2组，实验组和对照组，实验组3只免疫hLF，对照组1只用PBS缓冲液代替hLF免疫，每只兔子皮下注射总量为2mL用佐剂乳化好的抗原，每只兔子5mg，在第3次加强免疫，每只兔子5mg，后7天，耳静脉采血，检测血清中抗体滴度（间接ELISA法），如滴度未达到1∶104，OD1.0以上，则再加强免疫。在抗体滴度已达到1:104后的第10天，心脏采集兔血，分离血清，-20℃保存备用。
2、多克隆抗体的提取
采用IgG的纯化提取试剂盒，按说明书提取血清中的IgG，具体操作如下：
（1）10mL平衡缓冲液平衡柱子，流速为1mL/min；
（2）1mL注射器将抗体推入纯化柱中上样；
（3）10mL的结合缓冲液冲洗柱子，流出的液体收集在EP管中；
（4）4mL洗脱液进行洗脱，每mL洗脱蛋白加0.1mL中和缓冲液。
（5）收集的液体用考马斯亮蓝测定浓度，-20℃储存备用。
纯化结果通过考马斯亮蓝验证，结果见图5。洗脱管2和洗脱管3能满足要求，浓度约为2mg/mL。
3、多克隆抗体效价的鉴定
间接ELISA法检测免疫兔的抗体水平，方法同单克隆抗体制备中步骤2。以hLF作为包被抗原，包被浓度：20μg/mL，利用间接ELISA法检测血清抗体水平。实验组血清稀释倍数依次为：1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200、1:102400、1:204800；ELISA板包被人乳铁蛋白PBS作为空白对照。
如图6所示，3只兔的特异性抗体效价相近且均达到1:200,000。说明免疫效果较好，兔血清中含有较高水平的针对hLF蛋白的特异性抗体。
实施例4双抗体夹心ELISA检测
1、单克隆抗体HRP标记
严格按照产品说明书进行操作，具体参见Pierce（CatNo31488）产品说明。
2、HRP标记小鼠单克隆抗体稀释度的确定
HRP标记抗体按不同的稀释进行效价检测，选择OD值为2.0左右的点作为抗体的稀释度。单克隆抗体-HRP按照1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000稀释，PBS作为空白对照。
酶联免疫吸附法（ELISA）-间接法检测步骤：
（1）包被：hLF，20μg/mL，100μL/孔，4℃过夜，洗液洗涤3次。
（2）封闭：加150μL/孔封闭液，37℃、2小时后，洗涤3次，拍干。置4℃冰箱保存备用。
（3）加待测样品：
HRP标记抗体，第一个孔1:500稀释（1%BSA），往下以1:2的梯度倍比稀释，37℃孵育30min，洗板4次，拍干。
（4）显色：TMB按100μL/孔加入，37℃显色10min。
（5）终止：加入终止液（2MH2SO4）50μL/孔。
（6）读数：以450nm单波长测定各孔OD值，以与阴性对照孔OD值的比值（P/N）大于2.1为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点，见表12。
表12抗体-HRP效价检测结果
结果显示，单克隆抗体-HRP稀释度选择1:500作为后续实验的检测。
3、兔多抗包被条件的确定
多抗按不同浓度包被后，检测最佳包被浓度。
ELISA配对检测步骤：
（1）包被：20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312μg/mL的兔多抗，100μL/孔，4℃过夜，洗液洗涤3次。
（2）封闭：加150μL/孔封闭液，37℃2小时后，洗涤3次，拍干。置4℃冰箱保存备用。
（3）加待测样品：
非转基因牛奶、转基因奶粉和PBS加入相应孔中，100μL/孔，37℃孵育30min，洗板4次，拍干。（PBS作为空白对照，非转基因牛奶作为阴性对照）
（4）加二抗：小鼠单克隆抗体-HRP抗体，按1:500稀释，100μL/孔，37℃孵育20min，洗板4次，拍干。
（5）显色：TMB按100μL/孔加入，37℃显色15-30min。
（6）终止：加入终止液（2MH2SO4）50μL/孔。
（7）读数：以450nm单波长测定各孔OD值，以与阴性对照孔OD值的比值（P/N）大于2.1为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点，见表13。
表13多抗包被浓度检测
结果显示，阳性样品及阴性样品明显可区分，当多抗包被浓度大于5μg/mL时，OD值无明显变化，阳性样品已进入饱和状态，多抗包被浓度选择5μg/mL。
4、不同包被缓冲液检测标准品的线性反应
用不同的包被缓冲液包被多抗，两种包被缓冲液分别为：磷酸缓冲液，碳酸缓冲液。hLF标准品原始浓度0.2mg/mL，分别按照1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000稀释，PBS作为阴性对照。ELISA配对检测方法同实施例1步骤2。
表14不同包被浓度对标准品的线性反应检测结果
hLF浓度 1:2000 1:4000 1:8000 1:16000 1:32000 1:64000 PBS
磷酸缓冲液 0.918 0.490 0.234 0.106 0.083 0.088 0.091
碳酸缓冲液 0.983 0.889 1.073 0.783 0.834 0.879 0.487
结果显示，磷酸缓冲液（pH9.6）包被液线性反应较好，该条件下抗原的检测线为1:8000稀释度的抗原；碳酸缓冲液（pH7.2）作为包被液检测，无明显的线性反应，同时本底较高，故选磷酸缓冲液，见表14。
实施例5人乳铁蛋白夹心ELISA检测试剂盒的组建
1、本实施例提供一种用于人乳铁蛋白夹心ELISA检测的试剂盒，其组成如下：
（1）包被多克隆抗体的酶标板；
（2）辣根过氧化物酶标记抗体；
（3）洗涤液PBST；
（4）底物显色液TMB；
（5）反应终止液2MH2SO4
（6）人乳铁蛋白标准品
2、包被多克隆抗体的酶标板的制备：
（1）包被：将兔多抗用磷酸缓冲液（pH9.6）包被液稀释至5μg/mL，用微量加样器吸取稀释后的多抗加入96孔酶标板，100μL/孔，置4℃冰箱过夜；
（2）洗涤：取出ELISA板，弃去孔内液体，在纸巾上轻轻叩打以除去残留液体，加入PBST洗涤液，300μL/孔，静置1min，重复操作3~5次；
（3）封闭：用微量加样器按200μL/孔加1%BSA，放入37℃温箱2h；
（4）洗涤：同步骤2），置4℃冰箱保存备用。
实施例6人乳铁蛋白夹心ELISA检测试剂盒用于检测人乳铁蛋白
1、hLF标准品的检测灵敏度
hLF标准品原始浓度0.2mg/mL，分别按照1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000稀释，PBS作为阴性对照。ELISA配对检测方法同实施例4步骤3。（标准品稀释液是PBS缓冲液）
表15针对hLF标准品灵敏度检测结果
结果显示，免疫抗原稀释至1:8000时，P/N＞2.1，因此检测限为25ng/mL，见表15。标准曲线在25～200ng/mL范围内线性良好，标准曲线见图7。
2、模拟样品的检测灵敏度
转基因牛奶与非转基因牛奶混合，得到含转基因成分为100%、50%、20%、10%、5%、1%、0.1%、0.05%的模拟样品，非转基因牛奶作为阴性对照。ELISA配对检测方法同实施例4步骤3。（样品稀释液是非转基因牛奶）
表16针对模拟样品灵敏度检测结果
转基因成分 100% 50% 20% 10% 5% 1% 0.1% 0.05% 阴性
OD值 1.440 1.142 0.705 0.615 0.552 0.412 0.315 0.277 0.176
结果显示，模拟样品含转基因成分为0.1%时，P/N＞2.1，因此检测限为0.1%，见表16。标准曲线在1%～50%范围内线性良好，标准曲线见图8。

Claims (3)

1.一种人乳铁蛋白的夹心ELISA检测试剂盒，包括包被抗体和酶标抗体，其中，所述包被抗体为人乳铁蛋白多克隆抗体，所述酶标抗体为由保藏号为CGMCCNO.6394的杂交瘤细胞株分泌获得的人乳铁蛋白单克隆抗体；
其中，所述酶标抗体的标记酶为辣根过氧化物酶；
其中，所述试剂盒还包括以下试剂中的一种或几种：
1)洗涤液；
2)底物显色液；
3)反应终止液；
4)人乳铁蛋白标准品；
所述洗涤液为PBST，所述底物显色液为TMB，所述反应终止液为2mol/LH2SO4；
其中，所述人乳铁蛋白多克隆抗体浓度为5μg/mL。
2.利用权利要求1所述的试剂盒检测人乳铁蛋白的方法，包括如下步骤：
1)向包被人乳铁蛋白多克隆抗体的酶联板中加入人乳铁蛋白标准品和待检测样品，洗涤液洗板；
2)加入酶标人乳铁蛋白单克隆抗体，洗涤液洗板；
3)加入底物显色液显色，加入反应终止液终止反应，测定OD450值；
4)以人乳铁蛋白标准品的剂量-效应曲线为标准曲线，计算样品人乳铁蛋白的含量；
其中，包被液为pH9.6磷酸缓冲液，酶标人乳铁蛋白单克隆抗体稀释倍数为1:500。
3.权利要求1所述的试剂盒在检测转基因牛奶及奶制品中人乳铁蛋白含量中的应用。
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