CN111562384A - 双功能抗原引导的西地那非和他达拉非的抗体阵列检测卡 - Google Patents
双功能抗原引导的西地那非和他达拉非的抗体阵列检测卡 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种双功能抗原引导的西地那非和他达拉非的抗体阵列检测卡，包括衬板、以及依次粘附于衬板上且相邻之间部分叠置的双功能抗原释放垫、通用荧光探针释放垫、层析膜和吸水垫；所述双功能抗原释放垫包含由卵清白蛋白分别和西地那非、他达拉非偶联而成的检测抗原的基础上偶联特定标记物；所述通用荧光探针释放垫包含标记有抗特定标记物抗体的通用荧光探针；所述层析膜设有检测线A、检测线B和质控线，分别固定抗西地那非、抗他达拉非抗体和抗特定标记物抗体。本发明可以用一种通用荧光探针解决所有检测试剂的生产，降低了成本和提高质量控制可靠性；又增加了检测的信号强度和稳定性，提高了检测灵敏度和定量精密度。
Description
技术领域
本发明涉及食品药品安全检测领域，尤其涉及双功能抗原引导的西地那非和他达拉非的抗体阵列检测卡。
背景技术
西地那非和他达拉非的俗名分别为“伟哥”和“超级伟哥”，都属于磷酸二酯酶-5(PDE-5)抑制剂药物，是风行全球的治疗阳痿和壮阳药物。由于这两种效果明显且仿制价格低廉，不法厂家在壮阳保健食品(以保健酒为主)中违法添加西地那非和他达拉非，以增强疗效牟取不正当利益。这两种PDE-5抑制剂药物属于处方药，会引起一系列副作用，如头痛、面部潮红、消化不良、视力模糊和肌肉酸痛。美国FDA官方网页发布的药物不良反应信息显示，服用PDE-5抑制剂药物可能导致失明，还会导致听力突然下降甚至失聪。因此，世界各国对PDE-5抑制剂药物都严格按照处方药管理，在没有医生指导下服用违法添加的该类药品是危险的。其次，PDE-5抑制剂药物与硝酸酯药物的相互作用会导致严重的低血压。硝酸酯药物广泛应用于糖尿病、高血压,高血脂和冠心病的治疗，患有这些疾病而又伴随阳痿症状的病人，往往求助于天然壮阳药品。如果这些病人服用了硝酸酯药物的同时，在不知情的情况下，有服用了含违法的PDE-5抑制剂药物的中成药(保健品)，将会导致可怕的后果。患者不知情而长期服用含西地那非和他达拉非的保健食品，其危害性是非常严重的，必须加强对违法添加西地那非和他达拉非产品的监督检查。
目前，检测违法添加西地那非和他达拉非的确证方法是高效液相色谱、液-质联用检测。但是这些方法设备投入大、运行费用高，样品预处理复杂，不能够现场进行检测，难以大规模对违法添加现象展开筛查。现有西地那非和他达拉非的快速检测方法主要是化学检测方法和薄层色谱检测方法，检测的灵敏度和抗干扰能力有提高的需要。
另外，由于免疫学检测方法灵敏、特异、快速和廉价，在食品安全检测领域也被广泛应用。目前报道的针对小分子化合物的荧光免疫检测方法，都是将量子点微球标记于检测抗体上制备荧光探针，与检测线上固定的检测抗原形成免疫复合物，产生检测信号。但该方法存在以下缺点：1、检测不同的目标物质，需分别采用相应的检测抗体连接量子点微球制备荧光探针，工作量大、良品率低、质量不稳定；2、检测抗体通过化学反应制备荧光探针，可能影响抗体的结构和免疫亲和力；3、缺乏信号放大机制，检测信号强度偏弱、灵敏度较低。
已有的专利技术利用“三文治免疫复合物”原理进行检测食品添加物，即利用针对“检测抗原载体蛋白”的抗体，作为“通用抗体”的结合位点介导“通用探针”识别“检测抗原”，形成三文治免疫复合物产生检测信号，从而实现检测目的。但是“检测抗原载体蛋白”的免疫原性不稳定，蛋白质构象发生轻微的变化，都会导致“通用抗体”与“检测抗原”亲和力的下降，弱化“三文治免疫复合物”的形成，影响检测信号的产生。
发明内容
基于上述检测方法的缺点，本发明的目的是提供一种双功能抗原引导的西地那非和他达拉非的抗体阵列检测卡。
本发明采用的技术方案如下：
一种双功能抗原引导的西地那非和他达拉非的抗体阵列检测卡，包括衬板、以及依次粘附于衬板上且相邻之间部分叠置的双功能抗原释放垫、通用荧光探针释放垫、层析膜和吸水垫；所述双功能抗原释放垫包含由卵清白蛋白和西地那非、他达拉非偶联而成的检测抗原的基础上偶联特定标记物；所述通用荧光探针释放垫包含标记有抗特定标记物抗体的通用荧光探针；所述层析膜设有检测线A、检测线B和质控线，所述检测线A、检测线B分别固定抗西地那非和抗他达拉非抗体，所述质控线固定抗特定标记物抗体。
优选地，所述特定标记物为7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸。
本发明所述的双功能抗原分别在载体蛋白(OVA)上同时连接半抗原(西地那非或他达拉非)和多个标记物(7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸)。其双功能特征在于：所含半抗原结合检测抗体，所含标记能够结合“双功能抗原引导通用探针”，在所述的检测线A、检测线B分别形成“三文治免疫复合物”介导通用探针堆积形成检测信号；双功能抗原上的多个标记物，分别结合质控线上和通用探针上的双功能抗原引导，在质控线形成另一种“三文治免疫复合物”介导通用探针堆积形成检测信号。
相比于传统的“二元体系免疫竞争法”，本发明的检测卡利用了“三文治免疫竞争法”原理，在“双功能抗原”和“检测抗体”这两个免疫检测要素之外，增加了针对双功能抗原标记物“7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸”的“通用抗体”。本发明在载体蛋白(卵清白蛋白)上分别共价连接检测物质西地那非和他达拉非合成双功能抗原，将通用抗体(抗“7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸”抗体)标记于量子点上，将检测抗体1(抗西地那非抗体)固定于层析膜的检测线A上，将检测抗体2(抗他达拉非抗体)固定于层析膜的检测线B上，从而检测抗体捕获双功能抗原上偶联的检测物质，通用抗体结合双功能抗原上偶联的“7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸”，形成三文治免疫复合物，在相应的检测线产生荧光检测信号。当检测抗体被游离的检测物质结合，相应的检测线上的荧光强度将被抑制，从而产生抑制检测信号。
具体的，检测时将样品溶液滴到双功能抗原释放垫上，样品溶液运动的过程中将双功能抗原和通用荧光探针溶解，并携带到检测线A、检测线B和质控线，被携带的通用荧光探针标记的抗“7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸”抗体、双功能抗原分别与检测线A上的抗西地那非抗体、检测线B上的抗他达拉非抗体形成三文治免疫结合物，使检测线产生荧光信号；被携带的通用荧光探针标记的抗“7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸”抗体与质控线上固定的“7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸”抗体结合，在质控线上堆积形成荧光信号。当样品中存在游离的西地那非和他达拉非达到一定浓度，检测线A、检测线B上免疫反应就会被相应的检品竞争阻断，荧光信号被抑制；而质控线上的荧光信号基于“7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸”产生，不受西地那非和他达拉非浓度的影响。
由于在双功能抗原中引入标记分子，并且用抗标记分子的抗体构建通用荧光探针，既可以用一种通用荧光探针解决所有检测试剂的生产，从而降低成本和提高质量控制可靠性；又能够增加了检测的信号强度和稳定性，提高了检测灵敏度和定量精密度。
进一步地，所述双功能抗原释放垫采用玻璃纤维素膜吸收含有两种双功能抗原、表面活性剂、甘露醇、蔗糖的PBS溶液制得。优选的，采用厚度为0.85mm的玻璃纤维素膜充分吸收含有两种浓度分别为20μg/mL带标记的西地那非检测抗原、25μg/mL带标记的他达拉非检测抗原、50μg/mL表面活性剂、30mg/mL甘露醇、50mg/mL蔗糖的PBS溶液。其中，甘露醇作为冻干支架用于确保检测过程中双功能抗原迅速溶解；蔗糖用于调节检测溶液黏度控制层析展开速度；表面活性剂用于消除检测过程的非特异性吸附，优选聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)；两种双功能抗原分别由OVA/西地那非、OVA/他达拉非共价偶联合成，然后标记上7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸成为双功能抗原。既能被膜上检测抗体结合，又能被量子点上的通用抗体结合。
进一步地，所述通用荧光探针释放垫采用人造纤维素膜吸收含有量子点荧光探针、聚乙二醇、甘露醇、蔗糖、甘氨酸的PBS溶液制得。优选的，采用厚度为0.34mm的人造纤维素膜吸收含有30μg/mL通用量子点荧光探针、60μg/mL聚乙二醇(PEG-500)、10mg/mL甘露醇、60mg/mL蔗糖、10mg/mL甘氨酸的PBS溶液。其中，甘露醇作为冻干支架用于确保检测过程中通用荧光探针迅速溶解；聚乙二醇、蔗糖用于调节检测溶液黏度控制层析展开速度；甘氨酸用于消除检测过程的非特异性吸附；量子点荧光探针由量子点表面标记抗7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体构成，能够结合被捕获在两条检测线上的双功能抗原和固定在质控线上的抗7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体，分别产生荧光检测信号。
进一步地，所述层析膜采用硝酸纤维素膜，所述检测线A由含有抗西地那非抗体和蔗糖的PBS溶液喷涂在硝酸纤维素膜上制得。优选的，将含有0.3mg/mL抗西地那非抗体和10mg/mL蔗糖的0.05M PBS溶液(pH 7.4)，以3.0μg/cm的量喷涂在硝酸纤维素膜上。检测线荧光信号形成的基础是抗体与双功能抗原所偶联西地那非的免疫反应，会被检品中游离的西地那非竞争抑制。同理，所述检测线B由含有抗他达拉非抗体和蔗糖的PBS溶液喷涂在硝酸纤维素膜上制得。优选的，将含有0.5mg/mL抗他达拉非抗体和10mg/mL蔗糖的0.05M PBS溶液(pH 7.4)，以2.0μg/cm的量喷涂在硝酸纤维素膜上。检测线荧光信号形成的基础是抗体与双功能抗原所偶联他达拉非的免疫反应，会被检品中游离的他达拉非竞争抑制。
进一步地，所述质控线由含有抗7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体和蔗糖的PBS溶液喷涂在硝酸纤维素膜上制得。优选的，将含有0.3mg/mL7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体和10mg/mL蔗糖的0.05M PBS溶液(pH 7.4)，以1.0～3.0μg/cm的量喷涂在硝酸纤维素膜上。质控线荧光信号形成的基础是量子点和质控线都含有抗7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体，与检测抗原上的7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体分别产生免疫反应，形成“三文治免疫复合物”，由此在质控线上所产生的检测信号与目标检品无关，不会被检品中游离的西地那非和他达拉非竞争抑制。
本发明还包括同时检测西地那非和他达拉非的检测方法，包括以下步骤：
S1：制备双功能抗原、通用荧光探针、检测线和质控线；所述两种双功能抗原由卵清白蛋白分别与西地那非、他达拉非偶联之后标记7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸，所述通用荧光探针标记有抗7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体，所述检测线A固定抗西地那非抗体，检测线B固定抗他达拉非抗体，所述质控线固定抗7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体；
S2：将样品溶液、两种双功能抗原和通用荧光探针混合，一起输送至检测线A、检测线B和质控线，根据两条检测线和质控线的荧光信号判断样品中是否含有西地那非和他达拉非。
西地那非和他达拉非药物药品是小分子化合物，常规检测小分子化合物的免疫检测原理是“双功能抗原”与“检测抗体”形成的“二元体系免疫竞争法”，针对该方法在量子点侧向免疫层析中的不足，本发明在“双功能抗原”与“检测抗体”的基础上，加入“通用抗体”形成“三元体系免疫竞争法”，并对各免疫反应要素在层析系统中的组合也进行了调整，将西地那非捕获抗体固定在检测线A，在量子点上标记抗7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体构成荧光探针，与双功能抗原1(西地那非-OVA-7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸)“桥连”形成“三文治”免疫复合物，荧光探针积累形成检测信号。当检测抗体被游离的西地那非结合，荧光强度将被抑制，从而产生抑制检测信号。
同理，他达拉非抗体/检测抗原2(他达拉非-OVA-7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸)/荧光探针形成“三元体系免疫竞争法”，在检测线B产生能够被游离他达拉非抑制的荧光信号。
利用本发明的检测方法对样品溶液中西地那非和他达拉非药物药品的最低检出限度为2.0ng/mL，对保健品、中成药中违法添加西地那非和他达拉非药物药品的最低检出限度为2.0μg/kg，且可在5分钟内完成快速检测。
进一步地，步骤S2中，通过以下方法进行判断：检测线A、检测线B和质控线都显示荧光信号，断定结果为阴性，样品中不含西地那非和他达拉非药物药品；只有检测线A不显示荧光信号，质控线显示荧光信号，断定样品中含有西地那非；只有检测线B不显示荧光信号，质控线显示荧光信号，断定样品中含有他达拉非。其中，质控线是为了检验方法有效与否而设定，质控线显示荧光信号表明方法有效，质控线不显示荧光信号表明方法本身无效。
进一步地，所述通用荧光探针在365nm光源激发下，产生630nm的发射光。
本发明相对现有技术具有以下优点：
1、本发明引入小分子标记物“7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸”作为检测抗原的免疫识别位点，确保“通用抗体”与“检测抗原”亲和力的稳定性。该标记分子免疫原性强、偶联效率高、亲水性良好，不会在样品中出现，非常适合本发明中的检测需求。“4-羟基-2-萘磺酸”作为抗原表位，免疫原性超强而且空间位阻小，容易诱导获得高亲和力抗体，结合标记物抗体引导通用探针产生检测信号，提高了检测信号强度和灵敏度；
2、统一用抗“7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸”抗体标记的量子点产生检测信号，只需统一制备通用探针就可以满足不同品种和不同批次试剂的生产，规模效应不仅提高了生产效率，还有利于确保不同批次产品质量的均一性；
3、检测抗体固定在层析膜上，通过对膜的封闭和干燥，对抗体的活性保护作用更为有利，增加抗体稳定性；
4、特异性强，检测时间短(5-10分钟)，可现场操作，且借助便携360nm光源即可激发荧光信号，肉眼判读结果，检测成本低，操作简便，适合基层检测人员操作。
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1为所述双功能抗原引导的西地那非和他达拉非的抗体阵列检测卡的结构示意图。
图2为使用重氮法将7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸标记到检测抗原的载体蛋白OVA上。
图3为检测线A、检测线B上形成免疫复合物、产生荧光信号的示意图。
图4为检测线A、检测线B上免疫复合物被竞争阻断、荧光信号消失的示意图。
图5为质控线上发生免疫反应、产生荧光信号的示意图。
图6为荧光免疫检测结果产生的原理及检测结果的判断原则。
图注：1、双功能抗原释放垫 2、通用荧光探针释放垫 3、硝酸纤维素膜 31、检测线A 311、抗西地那非抗体 32、检测线B 321、抗他达拉非抗体 33、质控线 4、吸水垫 5、衬板6、样品溶液 61、量子点 62、“7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸”标记物 63、OVA 64、偶联西地那非641、游离西地那非 65、抗“7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸”抗体 66、偶联他达拉非 661、游离他达拉非
具体实施方式
实施例1
一种双功能抗原引导的西地那非和他达拉非的抗体阵列检测卡，包括衬板5、以及依次粘附于衬板5上且相邻之间部分叠置的双功能抗原释放垫1、通用荧光探针释放垫2、硝酸纤维素膜3(层析膜)和吸水垫4；所述双功能抗原释放垫1包含由卵清白蛋白分别和西地那非、他达拉非偶联而成的检测抗原的基础上偶联“7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸”标记物62；所述通用荧光探针释放垫2包含标记有抗“7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸”抗体65的通用荧光探针，所述通用荧光探针为量子点61；所述硝酸纤维素膜3设有检测线A、检测线B和质控线33，所述检测线A、检测线B分别固定抗西地那非抗体311和抗他达拉非抗体321，所述质控线33固定抗“7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸”抗体65。
参阅图1，本实施例在载体蛋白(卵清白蛋白)上分别共价连接检测物质西地那非和他达拉非合成双功能抗原，再将7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸标记到检测抗原上，制备成为带标记物的检测抗原。将通用抗体(抗标记物“7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸”抗体65)标记于量子点61上，将抗西地那非抗体311固定于层析膜的检测线A上，将抗他达拉非抗体312固定于层析膜的检测线B上，从而检测抗体捕获双功能抗原上偶联的目标半抗原，通用抗体结合双功能抗原上偶联的标记物，形成三文治免疫复合物，在相应的检测线产生荧光检测信号。当检测抗体被游离的检测物质结合，相应的检测线上的荧光强度将被抑制，从而产生抑制检测信号。
参阅图2，本实施例使用重氮法将7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸标记物62标记到检测抗原的载体蛋白OVA上，构建双功能抗原。
参阅图3，本实施例在检测时将样品溶液滴到双功能抗原释放垫上，样品溶液运动的过程中将两种双功能抗原和通用荧光探针溶解，并携带到检测线A、检测线B和质控线33，被携带的通用荧光探针标记的抗“7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸”抗体65、双功能抗原分别与检测线A上的抗西地那非抗体311、检测线B上的抗他达拉非抗体321形成三文治免疫结合物，使检测线产生荧光信号。
参阅图4，本实施例所述的质控线荧光信号形成的基础是量子点61和质控线33都含有抗7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体65，与检测抗原上的7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体分别产生免疫反应，形成“三文治免疫复合物”，由此在质控线上33所产生的检测信号与目标检品无关。当样品中存在游离的西地那非641或他达拉非651达到一定浓度，检测线A、检测线B上免疫反应就会被相应的检品竞争阻断，荧光信号被抑制；而质控线33上的荧光信号，不受西地那非和他达拉非浓度影响。
具体的，双功能抗原释放垫1的制备方法如下：采用厚度为0.85mm的玻璃纤维素膜充分吸收含有20μg/mL带标记的西地那非检测抗原、25μg/mL带标记的他达拉非检测抗原、50μg/mL Triton X-100、30mg/mL甘露醇、50mg/mL蔗糖的PBS溶液，冷冻干燥后备用。
具体的，通用荧光探针释放垫2的制备方法如下：采用厚度为0.34mm的Whatman 85人造纤维素膜吸收含有30μg/mL通用荧光探针、60μg/mL PEG-500、10mg/mL甘露醇、60mg/mL蔗糖、10mg/mL甘氨酸的PBS溶液，冷冻干燥后备用。
具体的，检测线的制备方法如下：将含有0.3mg/mL抗西地那非抗体和10mg/mL蔗糖的0.05M PBS溶液(pH 7.4)，以3.0μg/cm的量喷涂在硝酸纤维素膜上形成检测线A。将含有0.5mg/mL抗他达拉非抗体和10mg/mL蔗糖的0.05M PBS溶液(pH 7.4)，以2.0μg/cm的量喷涂在硝酸纤维素膜上形成检测线B。
具体的，质控线33的制备方法如下：将含有0.3mg/mL抗7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体和10mg/mL蔗糖的0.05M PBS溶液(pH 7.4)，以1.0～3.0μg/cm的量喷涂在硝酸纤维素膜上，形成质控线。
实施例2
同时检测西地那非和他达拉非的检测方法，步骤如下：
取0.2g(或0.2mL)样品，溶解在2.0mL无水乙醇中充分抽提目标检品，抽提液静止10分钟使杂质充分沉淀，取0.2mL上清液加入到20mL样品缓冲液，充分摇匀成为样品溶液；用滴管在双功能抗原释放垫上滴加3-4滴样品溶液，样品溶液向硝酸纤维素膜运动的过程中使双功能抗原和通用荧光探针释放，并先后越过检测线和质控线，根据检测线A、检测线B和质控线上的荧光信号来判断样品中是否含有西地那非和他达拉非。
参阅图5。在硝酸纤维素膜检测线A上固定的抗西地那非抗体311，通用荧光探针上标记的抗7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体65，分别与双功能抗原结合，形成三文治免疫结合物，使检测线产生荧光检测信号。当样品中存在游离的西地那非达到一定浓度，检测线上免疫反应就会被竞争阻断，荧光信号会消失。同理，这对他达拉非类样品的检测线B，检测信号的形成与判断与检测线A相同。质控线是检验方法本身有效与否而设定，显色有效，不显色表明方法本身无效。
参阅图6，通用荧光探针在365nm光源激发下，产生630nm的发射光。
在本实施例中，检测结果的判断原则如下：
1)如图6中，检测结果示意图6-1所示：检测线A不显示荧光信号，检测线B和质控线显示荧光信号，断定结果为西地那非阳性，样品中含有西地那非。需要注意：当西地那非浓度高于2.0ng/mL，检测线A的荧光完全消失，这种情况可以判定为强阳性；当西地那非浓度在0～2.0ng/mL的范围，检测线A没有完全被阻断，但荧光强度比阴性明显减弱，这种情况可以判定为弱阳性。
2)如图6中，检测结果示意图6-2所示：检测线B不显示荧光信号，检测线A和质控线显示荧光信号，断定结果为他达拉非阳性，样品中含有他达拉非。需要注意：当他达拉非浓度高于2.0ng/mL，检测线B的荧光完全消失，这种情况可以判定为强阳性；当他达拉非浓度在0～2.0ng/mL的范围，检测线B没有完全被阻断，但荧光强度比阴性明显减弱，这种情况可以判定为他达拉非弱阳性。
3)检测结果示意图6-3与检测结果示意图6-1、图6-2同理，如果检测线A、检测线B都不显荧光，而质控线显示荧光信号，可判定西地那非和他达拉非阳性。
4)如图6中，当质控线不显示荧光信号的任何一种情况出现，即图中6-4、6-5、6-6所示，表示检测试剂已经失效。
相对于现有技术，本实施例采用的“三元体系免疫竞争法”具有以下优点：1、统一用抗标记物体标记的通用探针，只需集中制备一种作为荧光探针，有利于检测工作的规模化和标准化；2、检测抗体固定在层析膜上，通过对膜的封闭和干燥，对抗体的活性保护作用更为有利，增加抗体稳定性；3、免疫结合时空间位阻更小，提高检测信号强度和灵敏度。利用本发明的检测方法对样品溶液中对西地那非的最低检出限度为2.0ng/mL，对他达拉非的最低检出限度为2.0ng/mL，对保健品、中成药中违法添加西地那非及其类似物的最低检出限度为2.0μg/kg，他达拉非及其类似物的最低检出限度为2.0μg/kg。考虑到保健品、中成药中这两种非甾体抗炎药物的违法添加量，都在大于500μg/kg的含量水平，本实施例完全可以为两种非甾体抗炎药物的违法添加提供有效检测手段。
以上所述实施例中，西地那非和他达拉非的特异性抗体诱导产生方法、抗7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体诱导产生方法、以及在量子点上标记抗7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体、制备量子点荧光探针的方法均采用现有技术。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种双功能抗原引导的西地那非和他达拉非的抗体阵列检测卡，其特征在于，包括衬板、以及依次粘附于衬板上且相邻之间部分叠置的双功能抗原释放垫、通用荧光探针释放垫、层析膜和吸水垫；所述双功能抗原释放垫包含由卵清白蛋白分别和西地那非、他达拉非偶联而成的检测抗原的基础上偶联特定标记物；所述通用荧光探针释放垫包含标记有抗特定标记物抗体的通用荧光探针；所述层析膜设有检测线A、检测线B和质控线，所述检测线A、检测线B分别固定抗西地那非和抗他达拉非抗体，所述质控线固定抗特定标记物抗体。
2.根据权利要求1所述的阵列检测卡，其特征在于，所述特定标记物为7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸。
3.根据权利要求1所述的阵列检测卡，其特征在于，所述双功能抗原释放垫采用玻璃纤维素膜吸收含有两种双功能抗原、表面活性剂、甘露醇、蔗糖的PBS溶液制得。
4.根据权利要求1所述的阵列检测卡，其特征在于，所述通用荧光探针释放垫采用人造纤维素膜吸收含有量子点荧光探针、聚乙二醇、甘露醇、蔗糖、甘氨酸的PBS溶液制得。
5.根据权利要求1所述的阵列检测卡，其特征在于，所述层析膜采用硝酸纤维素膜；所述检测线A由含有抗西地那非抗体和蔗糖的PBS溶液喷涂在硝酸纤维素膜上制得；所述检测线B由含有抗他达拉非抗体和蔗糖的PBS溶液喷涂在硝酸纤维素膜上制得。
6.根据权利要求1所述的阵列检测卡，其特征在于，所述质控线由含有抗7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体和蔗糖的PBS溶液喷涂在硝酸纤维素膜上制得。
7.同时检测西地那非和他达拉非的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1:制备双功能抗原、通用荧光探针、检测线和质控线；所述两种双功能抗原由卵清白蛋白分别与西地那非、他达拉非偶联之后标记7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸，所述通用荧光探针标记有抗7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体，所述检测线A固定抗西地那非抗体，检测线B固定抗他达拉非抗体，所述质控线固定抗7-氨基-4-羟基-2-萘磺酸抗体；
S2：将样品溶液、两种双功能抗原和通用荧光探针混合，一起输送至检测线A、检测线B和质控线，根据两条检测线和质控线的荧光信号判断样品中是否含有西地那非和他达拉非。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤S2通过以下方法进行判断：检测线A、检测线B和质控线都显示荧光信号，断定结果为阴性，样品中不含西地那非和他达拉非；只有检测线A不显示荧光信号，质控线显示荧光信号，断定样品中只含有西地那非；只有检测线B不显示荧光信号，质控线显示荧光信号，断定样品中只含有他达拉非。
9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述通用荧光探针在365nm光源激发下，产生630nm的发射光。
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