CN116400074A - 一种crp检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种CRP检测试剂盒及其应用。该CRP检测试剂盒包括：偶联CRP受体颗粒的受体试剂和含有供体颗粒的供体试剂，所述供体试剂包含缓冲溶液以及悬浮于其中的供体颗粒，所述供体颗粒在液相中被激发后能够产生活性氧；所述供体颗粒在所述供体试剂中的粒径分布变异系数C.V值不低于5％，且每克质量的所述供体颗粒中的糖含量不高于25mg。

Description

一种CRP检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及化学发光检测领域，更具体地，本技术方案涉及一种CRP检测试剂盒及其应用。
背景技术
体外诊断(In Vitro diagnosis，IVD)技术，通常是指在人体之外，通过对机体包括血液、体液及组织等样本进行检测而获取相关的临床诊断信息，从而帮助判断疾病或机体功能的产品和服务。纳米材料具有独特的尺寸依赖物理或化学性质，在纳米尺度内，可以通过改变它们的尺寸、形状、化学组成及表面官能团等来调节其光、磁、电、热及生物学性能，特别是纳米材料由于具有远高于宏观材料的比表面积，可提供大量的空间在其表面修饰不同的分子，使得它们在生物分析和生物传感器等应用方面具有重要作用。利用这些表面修饰了不同分子的纳米材料可以有选择性地检测小分子、核酸、蛋白质和微生物等。显然，纳米材料与体外诊断技术融合后有望具有检测限更低、灵敏度更高、选择性更强等特性，而纳米材料与临床诊断分析技术相结合也将把临床体外诊断学科推向新的发展生长点。
免疫分析经过半个多世纪的发展，先后出现了很多检测种类。根据测定过程中是否要将待测物质与反应体系分离可以分为非均相免疫分析和均相免疫分析。非均相免疫分析，是指引入探针进行标记的操作过程中，各种相关试剂混合反应后需要进行分离，将待测物与反应体系分离后再进行检测，是现在免疫分析中的主流方法。如广为人们熟知的酶联免疫吸附法(ELISA法)和磁微粒化学发光法等。均相免疫分析则是指在测定过程中将待测物与反应体系中的相关试剂混合反应后直接测定，而没有多余的分离或清洗的步骤。截止目前，多种灵敏的检测方法被应用于均相免疫分析，比如化学发光检测方法、电化学检测方法等。
在光激化学发光技术(Light Initiated Chemiluminescent Assay，LiCA)就是一种典型的均相免疫分析方法。它是基于被包被在一种纳米微球表面的抗原与被包被在另一纳米微球表面的抗体在液相中反应将两种纳米微球拉近，从而形成“双球”免疫复合物。即供体颗粒和受体颗粒借助抗原-抗体间结合共同组成一对“双球”体系。“双球”均是纳米微球，它们在光激化学发光系统中相辅相成，相互作用，相互配合，相互影响，二者缺一不可。两种纳米微球在液相中有很好悬浮特性，微球在液相中和抗原或抗体相遇完全符合液态动力学特征。在680nm的激光照射下，供体颗粒的光敏剂负责将周围环境中的氧气激发为单线态氧分子。当单线态氧分子扩散到“双球”体系中的受体颗粒时，与受体颗粒中的化学发光剂产生一系列化学发光反应，从而产生610nm至620nm的发射波长光信号，通过光子计数器和数学拟合将光子数换算为靶分子浓度，从而实现“免分离”的均相免疫分析。当待测样本中不含靶分子时，两种纳米微球间就无法形成免疫复合物，此时两种纳米微球的间距超出单线态氧200nm内的传播范围，因而单线态氧在液相中迅速淬灭，检测时则没有高能级红光信号产生。该方法具有快速、均相(免冲洗)、高灵敏和操作简单的特点。
然而，现有技术中的“双球”存在在液相中均质性差，在用于免疫分析时重复性差、发光效果不稳定，难以兼顾高灵敏度和宽检测量程等缺陷。
发明内容
基于现有技术中的缺陷，本发明之一提供了一种供体试剂，其包含缓冲溶液以及悬浮于其中的供体颗粒，所述供体颗粒在液相中被激发后能够产生活性氧，所述供体颗粒在供体试剂中的粒径分布变异系数C.V值不低于5％，且每克质量的所述供体颗粒中的糖含量不高于25mg。
在一个具体实施方式中，所述供体颗粒包括载体，所述载体的内部填充有敏化剂，所述载体的表面连接有特异性配对结合成员中的一员。
在一个具体实施方式中，所述供体颗粒在供体试剂中的粒径分布变异系数C.V值不高于20％。
在一个具体实施方式中，所述供体颗粒在供体试剂中的粒径分布变异系数C.V值不高15％。
在一个具体实施方式中，所述供体颗粒在供体试剂中的粒径分布变异系数C.V值不低于8％。
在一个具体实施方式中，在一个具体实施方式中，每克质量的所述供体颗粒中的糖含量不高于15mg。
在一个具体实施方式中，每升体积的所述缓冲溶液中的糖含量不低于0.2g且不高于2g。
在一个具体实施方式中，每升体积的所述缓冲溶液中的糖含量不低于0.5g且不高于1.5g。
在一个具体实施方式中，通过蒽酮法检测所述糖含量。
在一个具体实施方式中，所述载体的表面带有键合官能团，所述键合官能团用于将特异性结合配对成员中的一员化学键合在所述载体的表面。
在一个具体实施方式中，所述键合官能团选自胺基、酰胺基、羟基、醛基、羧基、马来酰亚胺基和巯基中的至少一种；优选地，所述键合官能团选自醛基和/或羧基。
在一个具体实施方式中，所述供体颗粒在所述供体试剂中的粒径分布呈现多分散性。
在一个具体实施方式中，所述供体试剂中包含至少两种平均粒径分布的供体颗粒。
在一个具体实施方式中，所述特异性配对结合成员为亲和素-生物素系统，所示亲和素选自卵白亲和素、卵黄亲和素、链霉亲和素、中性亲和素及类亲和素分子，优选为链霉亲和素。
在一个具体实施方式中，所示亲和素选自链霉亲和素。
本发明之二提供了一种化学发光检测试剂盒，其包括如本发明之一中任意一项所述的供体试剂。
在一个具体实施方式中，所述试剂盒中含有多个试剂条，每个试剂条上开设有若干盛装试剂的试剂孔，其中一个所述试剂孔用于盛装所述供体试剂。
本发明之三提供了发明之一中任意一项所述的供体试剂或发明之二中任意一项所述的试剂盒在使用化学发光分析仪中的应用。
本发明之四提供了发明之一中任意一项所述的供体试剂或发明之二中任意一项所述的试剂盒在使用POCT仪器中的应用。
本发明所述的供体试剂的作用在于其试剂中的供体颗粒受外在激发光的激发后能够产生单线态氧，单线态氧把能量传递至距离受体颗粒200nm范围内的供体颗粒，最终才能产生化学发光信号，从而实现对未知物的检测。
本发明所述用语“活性氧”是指机体内或者自然环境中由氧组成，含氧并且性质活泼的物质的总称，主要为一种激发态的氧分子，包括氧的一电子还原产物超氧阴离子(O2·-)、二电子还原产物过氧化氢(H2O2)、三电子还原产物羟基自由基(·OH)以及一氧化氮和单线态氧(1O2)等。
本发明中，所述“直接或间接连接”是指指定的物质能够通过化学或物理键合到另一物质上(直接连接)；或者指定的物质通过中间体物质(化合物、聚合物、多糖)再化学或物理键合到另一物质上(间接连接)。
本发明所述用语“受体颗粒”是指含有能够与活性氧反应产生可检测信号的化合物颗粒。供体颗粒被能量或活性化合物诱导激活并释放高能态的活性氧，该高能态的活性氧被近距离的受体颗粒俘获，从而传递能量以激活所述受体颗粒。
在一个具体实施方式中，所述受体颗粒包含发光剂和载体，发光剂填充于载体中和/或包被于载体表面。本发明所述“载体”选自带、片、棒、管、孔、微滴定板、珠、粒子和微球，其可以是本领域技术人员所公知的微球或微粒，其可以是任何尺寸的，其可以是有机的或是无机的，其可以是可膨胀或不可膨胀的，其可以是多孔的或非多孔的，其具有任何密度，但优选具有和水接近的密度，优选能漂浮于水中，且由透明、部分透明或不透明的材料构成。所述载体可以有或没有电荷，当带有电荷时，优选是负电荷。所述载体可以是乳胶颗粒或是含有有机或无机聚合物的其他颗粒、脂双层如脂质体、磷脂囊泡、小油滴、硅颗粒、金属溶胶、细胞和微晶染料。
本发明中，所述“发光剂”即一种被称作为标记物的化合物，可进行化学反应以便引起发光，比如通过被转化为在电子激发态下形成的另一种化合物。激发态可以是单线态或是三重激发态。激发态可弛豫到基态直接发光，或者是通过将激发能量传递到发射能量受体，从而自身恢复到基态。在此过程中，能量受体颗粒将被跃迁为激发态而发光。
本发明所述用语“供体颗粒”是指含有通过能量或者活性化合物的激活后能够产生与受体颗粒反应的诸如活性氧的活性中间体的敏化剂的颗粒。供体颗粒可以是光活化的(如染料和芳香化合物)或者化学活化的(如酶、金属盐等)。在一个具体实施方式中，所述供体颗粒为填充有光敏剂的高分子微球，所述光敏剂可以是本领域已知的光敏剂，优选相对光稳定且不与单线态氧有效反应的化合物，其非限定性的例子包括例如美国专利US5709994(该专利文献在此全文引为参考)公开的亚甲基蓝、玫瑰红、卟啉、酞菁和叶绿素等化合物，以及这些化合物的具有1-50个原子取代基的衍生物，所述取代基用于使得这些化合物更具有亲脂性或更具有亲水性、和/或作为连接至特异性结合配对成员的连接基团。本领域技术人员已知的其他光敏剂的例子也可以在本发明中使用，例如美国专利US6406913中记载的内容，该专利文献并入本文以供参考。
在一个具体实施方式中，所述载体的表面包被至少两个连续多糖层的涂层，其中多糖层与第二多糖层自发关联。
在一个具体实施方式中，所述连续多糖层中的每一层自发地与前一多糖层中的每一层相关联。
在一个具体实施方式中，所述多糖具有侧基官能团，所述连续多糖层中的所述侧基官能团与所述前一多糖层中的所述侧基官能团所带电荷相反。
在一个具体实施方式中，所述多糖具有侧基官能团，并且所述连续多糖层通过所述侧基官能团与所述前一多糖层的所述侧基官能团之间的反应与所述前一多糖层共价连接。
在一个具体实施方式中，在所述连续多糖层中，相邻的两层多糖层中的所述侧基官能团在胺官能团和胺反应性官能团之间交替。即其中一层中的所述侧基官能团为胺官能团的话，则另一层中的所述侧基官能团为胺反应性官能团。
在一个具体实施方式中，所述胺反应性官能团是醛基或羧基。
在一个具体实施方式中，第一多糖层(即最内层)自发地与所述载体相关联。
在一个具体实施方式中，所述涂层的最外一层多糖层中的多糖具有至少一个侧基官能团。
在一个具体实施方式中，所述涂层的最外一层多糖层中的多糖的侧基官能团选自醛基、羧基、巯基、氨基、羟基和马来胺基中的至少一种；优选选自醛基和/或羧基。
在一个具体实施方式中，所述涂层的最外一层多糖层中的多糖的侧基官能团直接地或间接地化学键合特异性结合配对成员中的一员结合。
在一个具体实施方式中，所述多糖选自含有三个或更多个未修饰或修饰的单糖单元的碳水化合物；优选选自葡聚糖、淀粉、糖原、菊粉、果聚糖、甘露聚糖、琼脂糖、半乳聚糖、羧基葡聚糖和氨基葡聚糖；更优选选自葡聚糖、淀粉、糖原和聚核糖。
在一个具体实施方式中，所述载体的粒径选自100至400nm，优选为150至350nm，更优选为180至220nm。
在一个具体实施方式中，所述供体颗粒在所述供体试剂中的浓度为10μg/ml至1mg/ml，优选为20μg/ml至500μg/ml，更优选为50μg/ml至200μg/ml。
在一个具体实施方式中，所述供体试剂中还包括PH值为7.0至9.0的缓冲溶液，所述供体颗粒悬浮于所述缓冲溶液中。
在一个具体实施方式中，所述缓冲溶液中含有多糖，所述多糖选自含有三个或更多个未修饰或修饰的单糖单元的碳水化合物，优选选自葡聚糖、淀粉、糖原、菊粉、果聚糖、甘露聚糖、琼脂糖、半乳聚糖、羧基葡聚糖和氨基葡聚糖；更优选选自葡聚糖、淀粉、糖原和聚核糖。
在一个具体实施方式中，所述多糖(例如葡聚糖)的分子量分布Mw选自10000至1000000Da，优选选自100000至800000Da，更优选选自300000至700000Da。
在一个具体实施方式中，每升体积的所述缓冲溶液中的糖含量不低于0.2g且不高于2g。
在一个具体实施方式中，每升体积的所述缓冲溶液中的糖含量不低于0.5g且不高于1.5g。
在本发明中，所述“粒径分布变异系数C.V值”是指在纳米粒度仪的检测结果中，粒径在高斯分布中的变异系数。变异系数的计算公式为：变异系数C.V值＝(标准偏差SD/平均值Mean)×100％。标准偏差(Standard Deviation，SD)也被称为标准差，它描述各数据偏离平均数的距离(离均差)的平均数，它是离差平方和平均后的方根，用σ表示。标准差是方差的算术平方根。标准偏差能反映一个数据集的离散程度，标准偏差越小，这些值偏离平均值就越少，反之亦然。标准偏差σ为正态分布曲线上的拐点(0.607倍峰高处)至峰高与时间轴的垂线间的距离，即正态分布曲线上两拐点间距离的一半。半高峰宽(Wh/2)是指峰高一半处的峰宽，Wh/2＝2.355σ。通过正态分布曲线两侧的拐点作切线，在基线上的截距称为峰宽或称基线宽度，W＝4σ或W＝1.699Wh/2。
发明人经大量研究发现，颗粒在液相中的粒径分布变异系数C.V值影响光激化学发光检测信号。如果想要实现光激化学发光系统在临床免疫诊断中的商业化应用，就需要大批量的生产质量合格、性能稳定的供体颗粒，那么就必须严格控制供体试剂中的供体颗粒粒径分布的C.V值在合适的范围。值得引起注意的是，不同于传统空白聚苯乙烯微球(即本发明所述的载体，其内部既没有填充功能物质，表面也没有修饰亲和素分子或多糖)的粒径分布，本发明所述的C.V值是指供体颗粒整体在供体试剂中的粒径分布变异系数C.V值。由于从载体开始，在，供体颗粒制备工艺过程中，供体颗粒粒径分布变异系数C.V值就在持续不断的变化，尤其是包被了多糖或亲和素之后，纳米微球的粒径分布变异系数C.V值变化就更显著、更不稳定，难以满足医疗器械产品注册以及临床应用的试剂要求。因此，申请人经过大量实验研究，逐渐摸索和发现了严格控制供体颗粒在液相中的粒径分布变异系数C.V值的范围及方法，最终才实现了光激化学发光技术在临床检验上的商业应用。
本发明所述用语“待测样品”是指待测的含有或疑似含有待测目标分子的一种混合物。可以被用在本发明的待测样品包括体液，如血液(可以是在收集的血液样品中通常看到的抗凝血)、血浆、血清、尿、精液、唾液、细胞培养物、组织提取物等。其他类型的待测样品包括溶剂、海水、工业水样、食品样品、环境样本诸如土或水、植物材料、真核细胞、细菌、质粒、病毒、真菌、及来自于原核的细胞。待测样品可以在使用前根据需要利用稀释液进行稀释。例如，为了避免HOOK效应，可以在上机检测前使用稀释液对待测样品进行稀释后再在检测仪器上进行检测。
本发明所述用语“待测目标分子”是指检测时待检测样本中的物质。与待测目标分子具有特异性结合亲合力的一种或多种物质会被用于检测该目标分子。待测目标分子可以是蛋白、肽、抗体或可以使其与抗体结合的半抗原。待测目标分子可以是与互补核酸或寡聚核苷酸结合的核酸或寡聚核苷酸。待测目标分子可以是可形成特异性结合配对成员的任何其他物质。其他典型的待测目标分子的例子包括：药物，诸如类固醇、激素、蛋白、糖蛋白、粘蛋白、核蛋白、磷蛋白、滥用的药物、维生素、抗细菌药、抗真菌药、抗病毒药、嘌呤、抗肿瘤试剂、安非他命、杂氮化合物、核酸和前列腺素，以及任何这些药物的代谢物；杀虫剂及其代谢物；以及受体。分析物也包括细胞、病毒、细菌和真菌。
本发明所述用语“抗体”以最广含义使用，包括任何同种型的抗体，保留对抗原的特异性结合的抗体片段，包括但不限于Fab、Fv、scFv、和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、双特异性抗体、和包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白的融合蛋白。在任何需要的情况下，抗体可以进一步与其它部分，诸如特异性结合配对成员中的一员，例如生物素或亲和素(生物素-亲和素特异性结合配对成员中的一员)等缀合。
本发明所述用语“抗原”是指能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应的物质。
本发明所述用语“结合”指由于例如共价、静电、疏水、离子和/或氢键等相互作用，包括但不限于如盐桥和水桥等相互作用引起的两个分子间的直接联合。
本发明所述用语“特异性结合”，是指两种物质之间的相互辨别和选择性结合反应，从立体结构角度上说就是相应的反应物之间构象的对应性。在本发明公开的技术思想下，特异性结合反应的检测方法包括但不限于：双抗体夹心法、竞争法、中和竞争法、间接法或捕获法。
本发明所述用语“特异性结合配对成员”是指这样一对分子，它们彼此之间能够相互特异性结合，例如，酶-底物、抗原-抗体、配基-受体。一个具体的特异性结合配对成员的例子是生物素-链霉亲和素系统，其中“生物素”广泛存在于动植物组织中，其分子上有两个环状结构，分别为咪唑酮环和噻吩环，其中咪唑酮环是与链霉亲和素结合的主要部位。活化的生物素可以在蛋白质交联剂的介导下，与已知的几乎所有生物大分子偶联，包括蛋白质、核酸、多糖和脂类等；而所述亲和素选自卵白亲和素、链霉亲和素、卵黄亲和素、中性亲和素及类亲和素，优选为中性亲和素和/或链霉亲和素。亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取，分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，因此可以和4个生物素分子亲密结合，在免疫机制有起重要作用。亲和素主要包括卵白亲和素、链霉亲和素、卵黄亲和素及中性亲和素等。链霉亲和素是由链霉菌分泌的一种蛋白质，“链霉亲和素”分子由4条相同的肽链组成，其中每条肽链都能结合一个生物素。因此每个抗原或抗体可同时偶联多个生物素分子，从而产生“触手效应”提高分析灵敏度。在任何需要的情况下，本发明中所用任何试剂，包括抗原、抗体、受体颗粒或供体颗粒，均可以根据实际需要缀合生物素-链霉亲和素特异性结合配对成员中的任一员。
在光激化学发光系统中，除了供体试剂外，根据检测对象或检测方法的需要，还包括其他试剂，例如：受体试剂、包被生物素的二抗、稀释液等。在体外诊断领域，尤其是免疫分析领域，各个厂家为了简化商品试剂盒中不同成分的命名，通常都会将试剂盒中不同瓶子的组分标记或简称为试剂1或R1、试剂2或R2、试剂3或R3，……，以此类推，这样便于客户识别、组装和使用，也出于技术保密的目的。因此，不同体外诊断厂家的试剂盒产品可能都会含有试剂1、试剂2、试剂3、……，但是不同厂家对应的各试剂组分却各不相同。
本发明的有益效果：
液态均相的模式使各测试间的一致性更好，使产品具有更好的重复性与一致性。且免冲洗，避免反应中引入不必要的干扰物及其它不确定因素，使得检测结果更为稳定。可以快速诊断领域引入独特的化学发光技术，使整体检测性能更优。
附图说明
图1显示了实施例1制备的供体颗粒a的高斯分布。
图2显示了实施例2制备的供体颗粒b的高斯分布。
图3显示了葡萄糖浓度与相应的吸光值的关系。
具体实施例
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明实施例仅为示例性的说明，该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
以下实施例中使用的试剂，如无特别说明，均可市售获得。
实施例1供体颗粒a及含有这种供体颗粒a的供体试剂A的制备
1.1载体的制备
a)准备100ml的三口烧瓶，加入40mmol苯乙烯、5mmol丙烯醛、10ml水，搅拌10min后通N2 30min。
b)称取0.11g过硫酸铵和0.2g氯化钠，溶于40ml水中配置成水溶液。将该水溶液加入到步骤a)的反应体系中，继续通N2 30min。
c)将反应体系升温至70℃，反应15小时，得到乳状液。
d)将反应完成后的乳状液冷却至室温，用合适的滤布过滤，得到的过滤乳状液用去离子水多次离心沉降清洗，直至离心后得到的上清液的电导率接近去离子水，然后用水稀释，得到最终的乳状醛基聚苯乙烯微球液。
e)由纳米粒度仪测得载体的大小呈高斯分布，平均粒径为201.3nm，变异系数(C.V.)＝8.0％。
1.2敏化剂填充载体
a)准备25ml的圆底烧瓶，加入0.11g酞菁铜，10ml N,N-二甲基甲酰胺，磁力搅拌，水浴升温至75℃，获得光敏剂溶液。
b)准备100ml的三口烧瓶，加入10ml 95％乙醇、10ml水，和10ml浓度为10％的步骤1.1中制备的载体，磁力搅拌，水浴升温至70℃。
c)将步骤a)中的光敏剂溶液缓慢滴加至步骤b)中的三口烧瓶中，70℃搅拌反应2小时使敏化剂填充入醛基聚苯乙烯微球中，之后停止搅拌，自然冷却，获得填充乳状液。
d)将填充乳状液30000g离心1小时，离心后弃去上清液，用50％乙醇重新悬浮。重复离心清洗三次后用pH值＝10的50mM CB缓冲液重新悬浮，使填充有敏化剂的醛基聚苯乙烯微球的终浓度为20mg/ml，得到微球混悬液。
1.3供体试剂A的制备
a)微球混悬液处理：将步骤(二)制备的微球混悬液于高速冷冻离心机中离心，弃去上清，加入MES缓冲液，超声细胞破碎仪上超声至颗粒重新悬浮，加入MES缓冲液调节微球的质量浓度至100mg/ml，得到处理后的微球混悬液。
b)亲和素溶液配制：称量一定量链霉亲和素，加MES缓冲液溶解至8mg/ml。
c)混合：将处理后的微球混悬液、8mg/ml的亲和素以及MES缓冲液，以2:5:1的体积比进行混合，迅速混匀，得到反应液。
d)反应：MES缓冲液配制25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照NaBH3CN溶液与反应液1:25的体积比加入，迅速混匀。37℃旋转反应48小时。
e)封闭：用MES缓冲液分别配制75mg/ml的甘氨酸(Gly)溶液以及25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照甘氨酸溶液、NaBH3CN溶液与反应液2:1:10的体积比加入上述步骤d)的溶液中，混匀，37℃旋转反应2小时。再加入200mg/ml的BSA溶液(用MES缓冲液配制)，BSA溶液与反应液体积比为5:8，迅速混匀，37℃旋转反应16小时。
f)清洗：向步骤e)反应后的溶液中加入MES缓冲液，用高速冷冻离心机离心，弃上清，然后重新加入新鲜MES缓冲液、超声悬浮之后，再次离心，如此清洗3次，最后用少量的缓冲液进行悬浮，测定固含量，并用缓冲液将固含量调节至150μg/ml的浓度，获得包含供体颗粒a的供体试剂A，所述缓冲液的组成如下：0.1mol Tris-HCl、0.3mol NaCl、25mmol EDTA、0.1％葡聚糖、0.01％庆大霉素和15ppm的ProClin-300，pH 8.00。
g)由纳米粒度仪测得供体试剂A中供体颗粒a的大小呈高斯分布，平均粒径为227.7nm，变异系数C.V.值为6.5％，具体如图1所示。
实施例2
供体颗粒b及含有这种供体颗粒b的供体试剂B的制备
本实施例中所用载体的制备以及敏化剂的填充过程同实施例1中步骤1.1和1.2。
2.1载体表面包被葡聚糖
a)取50mg氨基葡聚糖固体于20mL圆底烧瓶中，加入5mL 50mM/pH＝10碳酸盐缓冲液，30℃避光搅拌溶解。
b)取100mg供体颗粒a，加入到氨基葡聚糖溶液中搅拌2小时，得到反应液。
c)将10mg硼氢化钠溶于0.5mL 50mM/pH＝10碳酸盐缓冲液后滴加到上述反应液中，30℃避光反应过夜，得到包被有氨基葡聚糖的载体的混合液。
d)将步骤c)的混合液30000g离心后弃去上清液，加入50mM/pH＝10碳酸盐缓冲液超声分散。重复离心清洗三次后用50mM/pH＝10碳酸盐缓冲液定容，使包被有氨基葡聚糖的载体的终浓度为20mg/ml，得到氨基葡聚糖载体液。
e)取100mg醛基葡聚糖固体于20mL圆底烧瓶中，加入5mL 50mM/pH＝10碳酸盐缓冲液，30℃避光搅拌溶解。
f)将氨基葡聚糖载体液加入到醛基葡聚糖溶液中搅拌2小时。
g)将15mg硼氢化钠溶于0.5mL 50mM/pH＝10碳酸盐缓冲液后滴加到上述反应液中，30℃避光反应过夜，得到包被有醛基葡聚糖的载体的混合液。
h)将步骤g)的混合液30000g离心后弃去上清液，加入50mM/pH＝10碳酸盐缓冲液超声分散。重复离心清洗三次后用50mM/pH＝10碳酸盐缓冲液定容，使包被有醛基葡聚糖的载体的终浓度为20mg/ml，得到葡聚糖包覆的载体液。
i)由纳米粒度仪测得葡聚糖包覆的载体的大小呈高斯分布，平均粒径为235.6nm，变异系数(C.V.)＝8.1％。
2.2供体试剂B的制备
a)葡聚糖包覆的载体液处理：将本实施例步骤1.1中的步骤h)制得的葡聚糖包覆的载体液在高速冷冻离心机中离心，弃去上清，加入MES缓冲液，超声细胞破碎仪上超声至微球重新悬浮，再加入MES缓冲液调节载体的质量浓度至100mg/ml。
b)亲和素溶液配制：称量一定量中性亲和素，加MES缓冲液溶解至8mg/ml。
c)混合：将处理后的微球混悬液、8mg/ml的亲和素以及MES缓冲液，以2:5:1的体积比进行混合，迅速混匀，得到反应液。
d)反应：MES缓冲液配制25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照NaBH3CN溶液与反应液1:25的体积比加入，迅速混匀。37℃旋转反应48小时。
e)封闭：用MES缓冲液分布配制75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照Gly溶液、NaBH3CN溶液与反应液2:1:10的体积比加入上述步骤d)的溶液中，混匀，37℃旋转反应2小时。再加入200mg/ml的BSA溶液(用MES缓冲液配制)，BSA溶液与反应液体积比为5:8，迅速混匀，37℃旋转反应16小时。
f)清洗：向步骤e)反应后的溶液中加入MES缓冲液，用高速冷冻离心机离心，弃上清，然后重新加入新鲜MES缓冲液、超声悬浮之后，再次离心，如此清洗3次，最后用少量的缓冲液进行悬浮，测定固含量，并用缓冲液将固含量调节至150μg/ml，获得包含供体颗粒b的供体试剂B，所述缓冲液的组成如下：0.1mol Tris-HCl、0.3mol NaCl、25mmolEDTA、0.1％葡聚糖、0.01％庆大霉素和15ppm的ProClin-300，pH 8.00。
g)由纳米粒度仪测得供体试剂B中供体颗粒b的大小呈高斯分布，平均粒径为249.9nm，变异系数C.V值为11.6％，具体如图2所示。
实施例3供体颗粒中糖含量的测定
3.1利用蒽酮法确定葡萄糖浓度与相应吸光值的关系
a)葡萄糖标准溶液的配制：用纯化水将1mg/mL葡萄糖储备液配制成0mg/mL、0.025mg/mL、0.05mg/mL、0.075mg/mL、0.10mg/mL、0.15mg/mL的标准溶液曲线。
b)蒽酮溶液的配置：用80％硫酸溶液配制成2mg/mL(此溶液室温下24h内稳定，现用现配)。
c)向各离心管分别加入0.1mL各浓度的葡萄糖标准溶液，每管各加1mL蒽酮试液。
d)85度孵育30min；然后15000g离心40min，用移液器枪头从管底吸取澄清液体，避免将上部悬浮物吸出。
e)吸出的澄清液体恢复至室温后，测量其在620nm下的吸光度(测量最好在2h内进行)，重复两次，取两次重复的平均值作为最终的吸光值，结果见表1。
f)以标准品浓度为X值，平均吸光度为Y值，进行一次直线回归，结果见图3，以此待测样品的糖浓度。
表1
序号 浓度mg/mL 吸光度A 吸光度B 吸光度均值
1 0.15 0.415 0.411 0.4130
2 0.1 0.293 0.302 0.2975
3 0.075 0.214 0.227 0.2205
4 0.05 0.146 0.153 0.1495
5 0.025 0.101 0.098 0.0995
6 0 0.032 0.031 0.0315
3.2供体颗粒中糖含量的测定
a)取含有1mg供体颗粒的供体试剂，20000g离心40min，倒去上层清液后用纯化水超声分散，重复离心分散三次后用纯化水定容至1mg/mL，制得待测样品。
b)蒽酮溶液的配置：用80％硫酸溶液配制成2mg/mL(此溶液室温下24h内稳定，现用现配)。
c)向离心管依次加入0.1mL待测样品和1mL蒽酮试液。
d)85度孵育30min；15000g离心40min，用移液器枪头从管底吸取澄清液体，避免将上部悬浮物吸出。
e)吸出的澄清液体恢复至室温后，测量其在620nm下的吸光度(测量最好在2h内进行)，重复两次，取两次重复的平均值作为最终的吸光值，然后根据图3获得的曲线方程计算得出供体颗粒中的糖含量，结果见表2。
表2
序号 吸光度A 吸光度B 吸光度均值 糖浓度mg/g
供体颗粒a 0.0572 0.0564 0.0568 11.5
供体颗粒b 0.172 0.165 0.1685 53.6
实施例5
利用上述实施例1中的供体颗粒及供体试剂的制备方法来制备包含如下一系列供体颗粒的供体试剂：
供体试剂1：高斯分布曲线中供体颗粒的平均粒径为226.5nm，粒径分布变异系数C.V值＝3.8；Nicomp分布为单峰。
供体试剂2：高斯分布曲线中供体颗粒的平均粒径为225.3nm，粒径分布变异系数C.V值＝4.6；Nicomp分布为单峰。
供体试剂3：高斯分布曲线中供体颗粒的平均粒径为225.2nm，粒径分布变异系数C.V值＝5.0；Nicomp分布为单峰。
供体试剂4：高斯分布曲线中供体颗粒的平均粒径为226.7nm，粒径分布变异系数C.V值＝8.1；Nicomp分布为单峰。
供体试剂5：高斯分布曲线中供体颗粒的平均粒径为227.8nm，粒径分布变异系数C.V值＝15.6；Nicomp分布为单峰。
供体试剂6：高斯分布曲线中供体颗粒的平均粒径为225.9nm，粒径分布变异系数C.V值＝26.1；Nicomp分布为单峰。
利用上述供体试剂1至6制备肌钙蛋白I定量测定检测试剂盒1至6。
本实施例的试剂盒均由包含第一抗cTnI抗体包被的受体颗粒的试剂1(R1’)、包含生物素标记的第二抗cTnI抗体的试剂2(R2’)所组成，另外包括供体试剂1至6中任意一种试剂(R3’)。显然，R1’是受体试剂；R3’是供体试剂。
化学发光检测过程是在博阳生物科技(上海)有限公司开发的全自动光激化学发光分析系统(LiCA HT)上完成并输出检测结果，具体实验步骤如下：
(1)将40μl含有已知浓度的cTnI标志物的待测样本、15μl R1’和15μl R2’加入到8×12的96孔板中，混匀；
(2)37℃温育8min；
(3)加入160μl通用液(R3’)；
(4)37℃温育2min；
(5)放入LiCA HT仪器中激发读数，具体检测结果如下表3所示。然后根据检测结果分析试剂盒1至6的灵敏度和检测上限。
表3
Figure BDA0004251264870000131
从表3可知，当采用供体颗粒粒径分布变异系数大于等于5％时，该方法既有较合适的灵敏度，又有相对合适的检测量程，且试剂原料及试剂盒的生产成本相对较低，能够满足临床体外诊断应用的需求。
实施例6
利用上述实施例1和2中的供体颗粒及供体试剂的制备方法来制备包含如下一系列供体颗粒的供体试剂，并利用实施例4和5中蒽酮法检测的供体颗粒中的糖含量。
参考上述实施例5中给出的方法，制备含有供体试剂A至E的肌钙蛋白I定量测定检测试剂盒A至E，化学发光检测过程是在博阳生物科技(上海)有限公司开发的全自动光激化学发光分析系统(LiCA HT)上完成并输出检测结果，具体实验步骤可参加实施例5中给出的步骤，实验结果见表4。
表4
供体试剂名称 供体颗粒的糖含量mg/g 光激化学发光检测信号
实施例1中供体试剂A 11.5 1117775
实施例2中供体试剂B 53.6 42500
供体试剂C 23.8 1079654
供体试剂D 45.3 32642
供体试剂E 60.3 25056
从表4中可以看出，当供体试剂中的供体颗粒的糖含量低于25mg/g时，光激化学发光的检测效果较好。
实施例7
本实施例利用CN208568604U中公开的均相化学发光POCT检测装置检测CRP。
本实施例所制备的试剂盒包括若干试剂杯条，试剂杯条上设有多个用于盛装试剂的孔位，孔位包括但不限于待测样本孔位、第一试剂孔位和第二试剂孔位，其中，待测样本孔位用于盛装包含待测目标分子的待测样本。第一试剂孔位用于盛装包含供体颗粒的供体试剂，所述供体颗粒能够在激发状态下产生单线态氧。第二试剂孔位用于盛装包含受体颗粒的受体试剂，受体颗粒能够与单线态氧反应产生化学发光信号，且供体颗粒的粒径大于受体颗粒的粒径。孔位可以根据实际需要进行选择及功能扩展。
本实施例的第一试剂孔位中所盛装的供体试剂是实施例1中制备的供体试剂A，其中供体颗粒的粒径分布变异系数C.V值为6.5％，糖含量为11.5mg/g。在试剂杯条的一个孔位中加入50μL CRP不同浓度临床样本(包含血清和全血)，每孔平行管取均值，50μL生物素化抗CRP抗体，50μL包含偶联CRP受体颗粒的受体试剂，37℃反应7.5min，继续加入50μL实施例1中制备得到的供体试剂A，37℃反应5min，进行光激发检测，实验结果如表5所示。表5可以看出，血清和全血之间的相关性系数达到0.9988。从该实验结果表明，本发明的供体颗粒使得样品中非特异吸附大大降低，使得针对血清和全血的测量结果之间具有非常好的相关性，该供体试剂对于临床样品的适应性大大增强，可以直接用于临床全血样品的检测。
表5
血清检测结果(单位：mg/L) 全血检测结果(单位：mg/L)
4.037 4.035
4.785 4.559
5.499 5.233
5.513 5.160
6.449 6.035
7.111 7.008
7.179 7.062
8.435 8.215
10.290 10.443
12.899 12.465
12.929 12.336
17.455 16.980
16.900 17.378
17.500 18.645
18.989 20.918
20.651 20.555
21.677 21.440
23.401 24.450
27.998 27.334
32.865 32.590
43.870 44.239
65.111 65.211
72.962 74.728
75.883 75.882
81.595 81.829
85.240 85.375
109.991 109.860
111.332 112.640
115.230 105.985
132.241 133.660
145.030 144.459
200.325 199.768
实施例8
本实施例检测40份的临床样本，其中包括13个阴性样本(编号为1至13)和27个阳性样本(编号为14至40))，所用的cTnI定量测定检测试剂盒(光激化学发光法)包括：包含第一抗cTnI单克隆抗体包被的受体颗粒的试剂1(R1)、包含生物素标记的第二抗cTnI单克隆抗体的试剂2(R2)以及含有供体颗粒的光激化学发光分析系统通用液(R3)。其中，试剂R3中供体颗粒的浓度为100μg/ml，供体颗粒在试剂R3中的粒径分布变异系数C.V值＝11％，供体颗粒的糖含量为14.5mg/g。
检测过程是在博阳生物科技(上海)有限公司开发的全自动光激化学发光分析系统(LiCA HT)上完成并输出检测结果，具体检测步骤参见实施例5。
当临床样本中存在cTnI标志物时，cTnI标志物同时与包被第一抗cTnI单克隆抗体的受体颗粒以及生物素标记的第二抗cTnI单克隆抗体特异性结合，并于受体颗粒表面形成双抗体夹心复合物；此时，如加入链霉亲和素修饰的供体颗粒，生物素与链霉亲和素结合而使得两种颗粒相互靠近，在激发光源的激发下，供体颗粒释放单线态氧，在溶液中碰到受体颗粒后产生化学发光，从而更进一步激发同一个颗粒上的荧光基团产生级联放大反应产生荧光。此时，存在的cTnI标志物含量越多，则荧光强度越强，根据发光的强弱定量检测患者血清中cTnI标志物的量，具体cTnI标志物含量检测结果见表6。
表6
Figure BDA0004251264870000161
/>
Figure BDA0004251264870000171
经数据比对，Abbott测值与博阳测值相关性为0.9973，斜率为1.0495。样本1-13号为正常体检病人，分布范围1.77pg/ml至25.3pg/ml，中值为6.77pg/ml；样本14-40号为鉴定有心肌损伤病人，分布范围30.94pg/ml至29896.88pg/ml，中值为450.54pg/ml。
心肌肌钙蛋白I(cTnI)在健康人的血清或血浆中浓度较低，患者胸痛发作后4-8小时，坏死的心肌细胞大量释放cTNI进入血液循环系统，12-48小时达峰值，严重心梗病人数天后cTnI仍然维持在较高水平，是诊断心肌损伤和心肌梗死的最优标志物。根据本发明的实施7的数据可以表明，将本发明所述的供体试剂在制备用于体外诊断主体是否患有心肌损伤的方法所使用的试剂盒中的用途具有可行性，利用发明所述的供体试剂以及相应的方法测定主体体液中cTnI标志物的定量结果可用于诊断心肌损伤和心肌梗死。

Claims (10)

1.一种CRP检测试剂盒，其包括：偶联CRP受体颗粒的受体试剂和含有供体颗粒的供体试剂，所述供体试剂包含缓冲溶液以及悬浮于其中的供体颗粒，所述供体颗粒在液相中被激发后能够产生活性氧；所述供体颗粒在所述供体试剂中的粒径分布变异系数C.V值不低于5％，且每克质量的所述供体颗粒中的糖含量不高于25mg。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括含有生物素化抗CRP抗体的试剂。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述供体颗粒在所述供体试剂中的粒径分布变异系数C.V值不高于20％。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述供体颗粒的粒径大于所述CRP受体颗粒的粒径。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述供体颗粒包括载体，所述载体的粒径选自100至400nm，优选为150至350nm。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述供体颗粒在所述供体试剂中的浓度为50μg/ml至200μg/ml。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述供体颗粒中的糖选自含有三个或更多个未修饰或修饰的单糖单元的碳水化合物；优选选自葡聚糖、淀粉、糖原、菊粉、果聚糖、甘露聚糖、琼脂糖、半乳聚糖、羧基葡聚糖和氨基葡聚糖；更优选选自葡聚糖、淀粉、糖原和聚核糖。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述供体试剂中还包括PH值为7.0至9.0的缓冲溶液，所述供体颗粒悬浮于所述缓冲溶液中。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的试剂盒，其特征在于，包括若干试剂杯条，试剂杯条上设有多个用于盛装试剂的孔位，所述孔位包括待测样本孔位、第一试剂孔位和第二试剂孔位，其中，所述待测样本孔位用于盛装包含待测目标分子的待测样本，所述第一试剂孔位用于盛装所述供体试剂；所述第二试剂孔位用于盛装所述受体试剂。
10.权利要求1至9中任意一项所述的CRP检测试剂盒在使用POCT仪器中的应用。
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