CN110361378B - 基于荧光素乙酯的orac抗氧化活性评价方法及荧光指示剂 - Google Patents

基于荧光素乙酯的orac抗氧化活性评价方法及荧光指示剂 Download PDF

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Abstract

基于荧光素乙酯的ORAC抗氧化活性评价方法及荧光指示剂。本发明公开了一种基于荧光素乙酯的ORAC抗氧化活性评价方法，基于荧光素乙酯的ORAC抗氧化活性评价方法无需调节pH值具有更大的适用性。适用于水溶性、脂溶性抗氧化剂，待测样品与荧光素乙酯混合均匀，以AAPH为自由基引发剂，进行抗氧化活性评价。本发明具有适用范围广、原位评价的优点。

Description

基于荧光素乙酯的ORAC抗氧化活性评价方法及荧光指示剂
技术领域
本发明属于功能食品和药品领域，具体涉及一种基于荧光素乙酯的ORAC抗氧化活性评价方法及荧光指示剂。
背景技术
随着对自由基的认识逐渐加深，人们对于抗氧化剂的需求越来越高，也越来越全面，因此许多新型抗氧化剂被开发出来，因此对抗氧化剂能力的测定的方法也是多种多样，更全面、更精确、更方便的方法也是人们研究的重点。抗氧化剂的测定方法主要有以下几个标准方法：氧自由基清除(或吸收)能力(ORAC)、亚铁还原能力测定(FRAP)、Trolox当量抗氧化能力测定(TEAC)、二苯基苦基苯肼(DPPH)法等。此外还有体内抗氧化活性的测定方法，包括DNA氧化损伤检测方法、线粒体氧化损伤检测方法、蛋白质氧化损伤检测方法等，体内检测方法可以更全面、综合地评估抗氧化剂的抗氧化能力，因为某些抗氧化剂可能需要在特定的部位中达到特定浓度才能起到抑制自由基的效果。
在体外实验中，ORAC法是一种适用最为广泛便捷的方法。在ORAC法中，以荧光素钠为荧光探针作为指示剂，使用偶氮化合物AAPH在热分解过程中产生的自由基作为自由基引发剂，以荧光探针荧光强度的消耗程度为指标来展示体系中的氧化程度。具体计算方式是以Trolox(维生素E类似物)作为标准物质，记录荧光强度曲线，以曲线积分面积量化比较，荧光积分面积的增大即视为抗氧化能力。ORAC法中的探针荧光强度的衰退不依赖于探针的浓度，而取决于自由基产生剂AAPH的浓度。多数样品不会影响AAPH的热分解效率，AAPH也不会与样品直接反应。
ORAC法的优点在于化学反应彻底，它的计算方法为将抗氧化剂存在时的荧光强度衰退面积与无抗氧化剂时的面积之差作为它的保护面积，以此代表抗氧化剂的绝对抗氧化能力，而将其与标准物质Trolox的面积比值作为ORAC值。但是ORAC法中的荧光探针荧光素钠对pH的变化十分敏感，在pH<7时荧光强度会迅速下降，因此反应需在磷酸缓冲液中进行，以保持pH的稳定。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于荧光素乙酯的ORAC抗氧化活性评价方法，实现对抗氧化剂无需调节pH值进行原位评价，具有适用范围广、原位评价的优点。
传统ORAC法采用荧光素作为指示剂受到pH干扰较大，测试抗氧化剂的抗氧化能力是需要在pH在7.4左右才能发挥比较好的荧光性能，起到指示作用，而在食品中的pH可能会有多种情况出现，最常见的就是纯水的环境中，此时荧光素的荧光性能就会降低，在偏酸性的食品中同样也有可能需要抗氧化剂，在这种环境中使用荧光素作为指示剂的ORAC法就无能为力了。
Figure BDA0002142779810000021
荧光素的荧光强度在pH值偏酸性急剧降低的主要原因是荧光素分子中的羧基环化，破坏了荧光素的共轭结构。因此本发明中采用了荧光素乙酯，将其中的羧基酯化使得在pH值偏酸性的条件下不会出现环化现象。
Figure BDA0002142779810000022
一种基于荧光素乙酯的ORAC抗氧化活性评价方法，以荧光素乙酯为荧光指示剂材料，进行ORAC抗氧化活性评价。
作为优选，检测时pH为5～8。进一步优选为6-7.4。
作为优选，检测时，不需要pH值缓冲体系。当然，根据需要，也可以在pH缓冲体系中进行检测。
作为优选，评价时，将待评价抗氧化剂与荧光素乙酯混合，以AAPH为自由基引发剂，进行抗氧化活性评价。作为进一步优选，具体步骤为：分别将待评价抗氧化剂和标准物质与荧光素乙酯进行反应，然后分别加入AAPH，在设定时间内，在各设定时间点对待评价抗氧化剂和标准物质所对应的体系进行检测，分别得到荧光曲线的积分面积，得到抗氧化保护面积或者进一步得到ORAC值。
作为优选，评价时，待检测抗氧化剂与荧光素乙酯的摩尔比为5～500:1，进一步优选为20～300:1。荧光素乙酯与AAPH的摩尔比为1:100000～500000。待检测抗氧化剂可以以溶液的形式进行检测，浓度为1～100μmol/L，进一步优选为1～50μmol/L，溶剂可以为水或者其他可溶性有机溶剂。荧光素乙酯一般也是采用溶液的形式加入，浓度一般为0.1～1μmol/L。溶剂可以采用水或者其他可溶性有机溶剂等。AAPH(2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐)一般也是采用溶液的形式加入，溶剂一般为水或者其他可溶性有机溶剂。浓度一般为10～200mmol/L。
作为优选，反应温度或者检测温度分别独立的为25～50℃。反应时间一般控制在10～30分钟。测定时间一般持续100～150分钟，检测间隔可以为3～10分钟。
作为优选，荧光检测范围为激发波长495nm、发射波长515nm。
一种荧光指示剂，包含荧光素乙酯。
本发明的基于荧光素乙酯的ORAC抗氧化活性评价方法无需调节pH值，具有更大的适用性。荧光素乙酯比荧光素在更宽的pH值范围具有较好的荧光强度。荧光素乙酯在pH 6-7.4范围具有较好的荧光强度。荧光素乙酯在pH为6时的荧光强度高于荧光素在标准的pH＝7.4下的荧光强度。检测结果准确度更高。
本发明所述的抗氧化活性评价方法中以荧光素乙酯作为荧光指示剂。抗氧化活性评价方法中无需为了达到较好的荧光强度调节pH值到7.4。可以实现样品的原位检测，检测结果更加真实。
本发明的所述的抗氧化活性评价方法适用于水溶性抗氧化剂，待测样品与荧光素乙酯混合均匀，以AAPH为自由基引发剂，进行抗氧化活性评价。所述的水溶性抗氧化剂包括抗坏血酸、表没食子酸儿茶素没食子酸酯等各种抗氧化剂。
本发明的所述的抗氧化活性评价方法适用于脂溶性抗氧化剂，待测样品与荧光素乙酯混合均匀，加入吐温乳化剂或者其他促溶剂促进溶解，以AAPH为自由基引发剂，进行抗氧化活性评价。所述的脂溶性抗氧化剂包括丁基羟基茴香醚、特丁基对苯二酚等各种抗氧化剂。
本发明实际应用时，采用将待测样品与荧光素乙酯混合均匀，以AAPH为自由基引发剂，进行抗氧化活性评价。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明的荧光指示剂以及利用该荧光指示剂进行抗氧化性评价的方法，受pH值限制小，适用范围广，能够在大多数食品或样品原有pH值状态下进行抗氧化评价，可以实现原位评价，更接近实际使用状态，适用于水溶性、脂溶性各种类型抗氧化剂评价。
附图说明
图1为荧光素乙酯、荧光素甲酯、荧光素钠进行对比的结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
100μL抗坏血酸(5、10、20、40μmol/L水溶液)与50μL荧光素乙酯水溶液(0.4μmol/L)混合均匀，反应温度控制在37℃，反应时间控制在15分钟；加入50μL的AAPH(2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐)水溶液(100mmol/L)需快速准确，宜用八道或十二道的多孔道移液器加样，反应使用96孔板作为容器；荧光强度由多功能酶标仪读取，在加入AAPH溶液后立即测定，荧光检测范围为激发波长495nm、发射波长515nm，测定温度为37℃，测定时间持续120分钟，依次测定每个加样微孔，隔5分钟测定一次。数据由Excel处理，使用积分法计算荧光曲线下的面积，样品作用下的荧光面积与AAPH的空白组别(以Trolox(维生素E类似物)作为标准物质，其他实施例相同)的面积之差即为netAUC，即抗氧化保护面积；ORAC值由抗氧化保护面积与Trolox的抗氧化面积相比得出，以Trolox当量表达，μMTrolox/μM样品。
抗坏血酸浓度(μmol/L) ORAC值(μMTrolox/μM)
5 6.32
10 4.18
20 2.38
40 1.30
荧光素乙酯通过如下方法合成：称取荧光素(332mg，1mmol)于离心管中，加入无水乙醇8mL，加入浓硫酸(5％)，加入磁子，并置于磁力搅拌器上进行搅拌，在室温下进行反应，约18小时后反应停止。反应结束后加入饱和氯化钠溶液和乙酸乙酯萃取，将所得有机项用无水MgSO4粉末进行干燥，使用旋蒸仪蒸干溶剂得到荧光素乙酯。随后使用硅胶柱过柱分离得到纯净的荧光素乙酯粉末，洗脱剂比例为石油醚：乙酸乙酯：乙醇＝3:1:1。结构测定数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ0.86(t,J＝7.09Hz,3H)，3.96(q,J＝7.09Hz,2H)，6.56(d,J＝7.95Hz,3H)，6.79(d,J＝9.41Hz,2H)，7.46-7.51(m,1H)，7.62-7.88(m,2H)，8.17(dd,J＝7.89,1.16Hz,1H)。质谱鉴定结果可知其分子量为360.32。
实施例2
100μL表没食子酸儿茶素没食子酸酯(5、10、20、40μmol/L水溶液)与50μL荧光素乙酯水溶液(0.4μmol/L)混合均匀，反应温度控制在37℃，反应时间控制在15分钟；加入50μL的AAPH水溶液(100mmol/L)需快速准确，宜用八道或十二道的多孔道移液器加样，反应使用96孔板作为容器；荧光强度由多功能酶标仪读取，在加入AAPH溶液后立即测定，荧光检测范围为激发波长495nm、发射波长515nm，测定温度为37℃，测定时间持续120分钟，依次测定每个加样微孔，隔5分钟测定一次。数据由Excel处理，使用积分法计算荧光曲线下的面积，样品作用下的荧光面积与AAPH的空白组别的面积之差即为netAUC，即抗氧化保护面积；ORAC值由抗氧化保护面积与Trolox的抗氧化面积相比得出，以Trolox当量表达，μMTrolox/μM样品。
表没食子酸儿茶素没食子酸酯浓度(μmol/L) ORAC值(μMTrolox/μM)
5 3.92
10 3.81
20 2.32
40 1.30
实施例3
100μL丁基羟基茴香醚(5、10、20、40μmol/L含2％吐温-80的水溶液)与50μL荧光素乙酯水溶液(0.4μmol/L)混合均匀，反应温度控制在37℃，反应时间控制在15分钟；加入50μL的AAPH水溶液(100mmol/L)需快速准确，宜用八道或十二道的多孔道移液器加样，反应使用96孔板作为容器；荧光强度由多功能酶标仪读取，在加入AAPH溶液后立即测定，荧光检测范围为激发波长495nm、发射波长515nm，测定温度为37℃，测定时间持续120分钟，依次测定每个加样微孔，隔5分钟测定一次。数据由Excel处理，使用积分法计算荧光曲线下的面积，样品作用下的荧光面积与AAPH的空白组别的面积之差即为netAUC，即抗氧化保护面积；ORAC值由抗氧化保护面积与Trolox的抗氧化面积相比得出，以Trolox当量表达，μMTrolox/μM样品。
丁基羟基茴香醚(μmol/L) ORAC值(μMTrolox/μM)
5 6.12
10 2.96
20 1.96
40 1.08
实施例4
100μL特丁基对苯二酚(5、10、20、40μmol/L含2％吐温-80的水溶液)与50μL荧光素乙酯水溶液(0.4μmol/L)混合均匀，反应温度控制在37℃，反应时间控制在15分钟；加入50μL的AAPH水溶液(100mmol/L)需快速准确，宜用八道或十二道的多孔道移液器加样，反应使用96孔板作为容器；荧光强度由多功能酶标仪读取，在加入AAPH溶液后立即测定，荧光检测范围为激发波长495nm、发射波长515nm，测定温度为37℃，测定时间持续120分钟，依次测定每个加样微孔，隔5分钟测定一次。数据由Excel处理，使用积分法计算荧光曲线下的面积，样品作用下的荧光面积与AAPH的空白组别的面积之差即为netAUC，即抗氧化保护面积；ORAC值由抗氧化保护面积与Trolox的抗氧化面积相比得出，以Trolox当量表达，μMTrolox/μM样品。
特丁基对苯二酚(μmol/L) ORAC值(μMTrolox/μM)
5 7.43
10 3.70
20 1.96
40 1.00
对比例1：
不同pH条件下荧光强度的测定：荧光素乙酯、荧光素、荧光素甲酯的浓度为0.025μmol/L，使用荧光分光光度计，以400～600nm为接受波长，每隔1nm扫描一次荧光强度，得到荧光素、荧光素甲酯、荧光素乙酯的荧光激发光谱，并计算荧光积分强度，作为荧光强度指标。
检测结果如图1所示，横坐标为pH值、纵坐标为荧光积分强度。由图1可知，三种物质在面对不同pH环境时，荧光素乙酯的荧光表现最为出众，在pH为6时的荧光强度已经高于荧光素和荧光素甲酯在标准的pH＝7.4下的荧光强度，同时在pH＝5时也拥有一定的荧光强度，远超过荧光素和荧光素甲酯。

Claims (7)

1.一种基于荧光素乙酯的ORAC抗氧化活性评价方法，其特征在于：以荧光素乙酯为荧光指示剂材料，进行ORAC抗氧化活性评价；荧光检测范围为激发波长 495 nm、发射波长515 nm；检测时pH为5~8。
2.根据权利要求1所述的基于荧光素乙酯的ORAC抗氧化活性评价方法，其特征在于：所述的抗氧化活性评价方法适用于水溶性抗氧化剂或脂溶性抗氧化剂。
3.根据权利要求2所述的基于荧光素乙酯的ORAC抗氧化活性评价方法，其特征在于：所述水溶性抗氧化剂包括抗坏血酸、表没食子酸儿茶素没食子酸酯；所述的脂溶性抗氧化剂包括丁基羟基茴香醚、特丁基对苯二酚。
4.根据权利要求1所述的基于荧光素乙酯的ORAC抗氧化活性评价方法，其特征在于：检测时，不需要pH值缓冲体系。
5.根据权利要求1所述的基于荧光素乙酯的ORAC抗氧化活性评价方法，其特征在于：将待评价抗氧化剂与荧光素乙酯混合，以AAPH为自由基引发剂，进行抗氧化活性评价。
6.根据权利要求5所述的基于荧光素乙酯的ORAC抗氧化活性评价方法，其特征在于：待评价抗氧化剂与荧光素乙酯反应温度或者加入AAPH后的检测温度分别独立的为25~50℃。
7.根据权利要求1所述的基于荧光素乙酯的ORAC抗氧化活性评价方法，其特征在于：检测时pH为6-7.4。
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