CN1668757A - 氟核磁共振用于高通量筛选的用途 - Google Patents

Abstract

通过使用¹⁹F检测的竞争结合试验的高通量配体NMR筛选。

Description

氟核磁共振用于高通量筛选的用途

本申请要求享有于2003年3月14日提交的美国专利临时申请No.60/454,766的优先权，该申请通过引用的方式被全文包括在本申请中。

发明背景

当前许多市场上所销售的药物都是通过高通量筛选(HTS)由先导化合物所发展而来的。在HTS中所使用的用于治疗的标靶通常是从可由不同方式表达的克隆基因所产生的重组蛋白。大的化合物集一般是对照用于识别抑制剂的蛋白质来进行筛选的。

在过去十年间，由于在各项目中有系统地应用组合化学，其结果导致专有化合物集的规模成指数级增长。现今，通过组合化学方法得到巨大的化合物库，并与从传统药物化学和天然来源的化合物库互为补充。机器人和自动控制的发展和应用使得能够在短时间内对大量的化合物进行测试。若干新的检测系统也被用于潜在先导分子的识别。

最近，核磁共振(NMR)已经成为一种用于探测与药物标靶相互作用的小分子的强有力的方法。尽管核磁共振并非一项灵敏的技术，但是它的优点在于较少受到在其他的检测系统中所观测到的人为现象的影响。最近在低温核磁共振探针技术方面的发展已经减少了筛选所需的时间和所需的蛋白质的量。

核磁共振方法已被用于对照同位素标记的蛋白质筛选大的化合物集。在化合物混合物的存在下，对¹⁵N-¹H HSQC光谱中的交叉峰的化学位移变化进行检测。对混合物进行去褶合从而能够识别与蛋白质相互影响的分子(即，产生化学位移的化合物)。当蛋白质的三维结构是已知的且已经获得了蛋白质骨架共振的具体的NMR谱带归属序列时，该方法就提供了关于配体结合位点和配体结合方式的重要的结构信息。

另一种进行NMR筛选的方法是基于配体共振的检测。在文献中已经给出了若干NMR参数以作为配体识别的工具。这些方法允许对筛选的化合物进行快速的去褶合，并且特别适合于低亲和性配体介质的识别。

然而，这些技术还存在一些缺陷。首先，不能直接获得关于结合位点的结构信息。其次，由于在这些试验中，通常使用相对于蛋白质极大过量的测试化合物，因此不能检测到高亲和性配体和能够与受体共价结合的分子。也就是说，将不能检测到与蛋白质结合更紧密的化合物或者动力学较慢的化合物，因为这些化合物在蛋白质内部的残留时间比在NMR试验中所使用的混合时间范围(例如，1至2秒)更长。第三，溶解性差的可作为潜在配体的化合物难以被检测到，因为该方法需要观测配体的信号。

因此，所需要的是另外的可用于探测靶分子例如蛋白质的配体的NMR方法，该方法不存在与常规的配体观测筛选试验有关的缺陷。

发明内容

本发明涉及合理的药物设计。具体来说，本发明提供筛选与靶分子(例如，通常为蛋白质)相互作用的化合物的核磁共振(NMR)方法。该方法包括使用¹⁹F核磁共振，特别是¹⁹F核磁共振竞争结合试验，以检测结合相互作用。

竞争结合试验包括在竞争分子的存在下置换参考化合物。优选，参考化合物结合到靶分子的结合亲和性在微摩尔范围内。尽管也可以使用本发明的方法评价比1微摩尔更弱(即，超过)的结合亲和性的分子结合，但优选与靶分子相互作用的测试化合物的结合亲和性比1微摩尔更强(例如，在纳摩尔范围内)。

本发明的方法，特别是使用竞争结合试验时，可被用于基于适当安排的竞争结合试验进行有效的高通量筛选(HTS)，且不具有与常规配体观测筛选试验相关的缺点。另外，该方法能够使用单点测量来测定识别配体的K_D值。使用该方法，可以在短时间内对例如蛋白质或DNA和RNA片段筛选数以千计的化合物。

还发现本发明可被用于化学混合物(即，两种或多种测试化合物)例如植物和真菌提取物的快速筛选。快速筛选技术一般包括提供多个测试样品，每一测试样品包含两种或多种测试化合物的混合物。

本发明的方法包括使用至少如下步骤识别靶分子的配体：提供与靶分子相互作用的¹⁹F-标记参考化合物；在靶分子的存在下采集¹⁹F-标记参考化合物的1D ¹⁹F核磁共振波谱；提供包含至少一种测试化合物的测试样品(优选多个测试样品)；在各测试样品与靶分子的存在下采集¹⁹F-标记参考化合物的1D ¹⁹F核磁共振波谱；比较在靶分子的存在下¹⁹F-标记参考化合物的波谱与在各测试样品和靶分子的存在下¹⁹F-标记参考化合物的波谱，以测定一个或多个¹⁹F-标记参考化合物的共振的变化；以及识别至少一种与靶分子相互作用的测试化合物，其中该测试化合物置换¹⁹F-标记参考化合物。如果测试化合物(即，潜在的配体)将参考化合物从靶分子上置换下来，它就是一种配体。

优选，本发明的方法包括识别参考化合物的步骤，该步骤包括：在不存在靶分子的情况下采集潜在参考化合物的WaterLOGSY核磁共振波谱；在靶分子的存在下采集潜在参考化合物的WaterLOGSY核磁共振波谱；以及比较该WaterLOGSY波谱以鉴别该潜在化合物与靶分子有无相互作用。

对于本发明方法的某些具体实施方案，该参考化合物是与具有限定的行距、振幅和频率的ERETIC信号所一起提供的。对于这些方法，在靶分子的存在下采集¹⁹F-标记参考化合物的1D ¹⁹F核磁共振波谱包括：在靶分子的存在下使用ERETIC信号采集¹⁹F-标记参考化合物的波谱；以及在各测试样品和靶分子的存在下采集¹⁹F-标记参考化合物的1D ¹⁹F核磁共振波谱包括在各测试样品和靶分子的存在下采集¹⁹F-标记参考化合物的波谱。

对于本发明的某些具体实施方案，该¹⁹F-标记参考化合物是和一种¹⁹F-标记的非相互作用的化合物一起提供的。对于这些方法，在靶分子的存在下采集¹⁹F-标记参考化合物的1D ¹⁹F核磁共振波谱包括在的靶分子存在下采集¹⁹F-标记参考化合物与¹⁹F-标记的无相互作用的化合物的波谱；以及在各测试样品与靶分子的存在下采集¹⁹F-标记参考化合物的1D ¹⁹F核磁共振波谱包括在各测试样品以及靶分子的存在下采集¹⁹F-标记参考化合物与¹⁹F-标记的无相互作用的化合物的波谱。

在另一个具体实施方案，本发明提供一种筛选化合物以识别靶分子的配体的方法。该方法包括：采集至少一种测试化合物的第一1D ¹⁹F核磁共振波谱；将该至少一种测试化合物暴露于靶分子；采集已经暴露于靶分子的至少一种测试化合物的第二1D ¹⁹F核磁共振波谱；比较第一与第二波谱以测定一个或多个共振的变化并识别至少一种与靶分子相互作用的测试化合物。

附图的简要说明

图1.由于在溶液中游离的小分子的¹⁹F信号的CSA相互作用以及当被结合到一种大高分子时随¹⁹F的拉莫尔频率变化所导致的线宽的不同。使用方程1的最后项进行模拟，其假设条件为当游离于溶液中时，对于小分子，CSA磁张量与100ppm的¹⁹F-CSA轴对称并且相关时间τ_c为200ps。高分子的不同相关时间被认为对应于不同尺寸的高分子(曲线所表示的值)。该虚垂线表示一些市售的波谱仪。与这些波谱仪的¹H拉莫尔频率对应的值如该垂直线所示。

图2.使用50μM的p21活化激酶的弱亲和配体化合物A(K_D＝10μM)进行的NMR筛选和去褶合。参考分子包含连接在六员芳环的CF₃基团。化学位移是以TFA为参照进行校正的。所记录的两个波谱中：左图是在不带有τ＝0.1s的自旋回波图的条件下记录的，右图是在带有τ＝0.1s的条件下记录的。图谱(a)是仅以1.5μM的蛋白质作为间谍分子的情形下获得的；图谱(b)是在20μM的七种化合物的混合物的条件下采集的，该混合物包含分子SPECS AB-323/25048456(荷兰，Rijswijk，SPECS公司生产)2-喹喔啉羧酸乙酯、异喹啉-3-羧酸甲酯、7-苯基-4-蝶啶醇、2-氨基-6-甲基喹喔啉-4-醇、5-甲基苯并咪唑和化合物B；图谱(c)是在不含化合物B的混合物的存在下采集的；图谱(d)是在仅有化合物B存在的情况下采集的。图谱(e)所显示的是在不含蛋白质时将参考化合物溶于PBS中所采集的。每次试验采集共计进行128次扫描并且每次扫描的重复时间为3.1s。

图3.在用于p21活化激酶的弱亲和配体化合物A以及无相互作用的三氟乙酸(TFA)分子的存在下记录的一维¹⁹F波谱。化学位移是以TFA为参照进行校正的。每次试验采集共计进行128次扫描并且每次扫描的重复时间为3.1s。化合物A和TFA的浓度分别为50以及15μM。图谱(a)是在不存在蛋白质的条件下记录的，而图谱(b)是在1.5μM的蛋白质的存在下记录的。图谱(c)对应于图谱(a)和(b)之间的差别。示差光谱中所存在的仅有的信号是由间谍分子所产生的。

图4.通过在用于p21活化激酶的弱亲和配体化合物A以及无相互作用的三氟乙酸(TFA)分子的存在下记录的一维¹⁹F波谱进行的HTS和去褶合。化学位移是以TFA为参照进行校正的。图谱(a-d)是使用50μM化合物A和15μM的TFA进行的NMR筛选和去褶合。图谱(a)是在不存在蛋白质的情况下记录的，图谱(b-d)是在1.5μM的蛋白质的存在下记录的。图谱(b)是在不存在混合物的情况下记录的，图谱(c)是在20μM的包含六种化合物的混合物的存在下记录的，该混合物包含分子SPECS AB-323/25048456、2-喹喔啉羧酸乙酯、异喹啉-3-羧酸甲酯、7-苯基-4-蝶啶醇、2-氨基-6-甲基喹喔啉-4-醇、5-甲基苯并咪唑，图谱(d)是在加入了20μM化合物B的相同化学混合物的存在下记录的。竞争分子化合物B的存在几乎完全将参考化合物从蛋白质(d)上取代下来，并且其波谱与溶于PBS的两种分子的波谱(a)相似。

图5.MDDR库中包含一个氟原子的分子的百分比。该调查是从1981年至2000年间进行的，时间间隔为5年。各间隔的百分比标注在各条块上方。

图6.记录的是随HSA浓度变化的¹⁹F自旋回波波谱。对照分子(2)的CF₃的共振位于+15.46ppm而间谍分子(1)的CF₃共振位于+14.62ppm。该波谱是在320ms的总的自旋回波周期以及180个40ms之间的脉冲(2τ)的间隔条件下采集的。每次试验采集共计进行96次扫描并且每次扫描的重复时间为3.5秒并且谱宽为25ppm。在傅里叶变换之前该数据被乘以一个1Hz指数函数。两种分子的浓度为25μM而HSA的浓度由高到低为0、300、500、700和900nM。I(1)/I(2)的信号强度比由高到低为0.86、0.66、0.38、0.21和0.07。

图7.记录的是随HSA浓度变化的¹⁹F自旋回波波谱。对照分子(3)的CF共振位于-64.06(下面的图谱)以及对照分子(2)的CF₃共振位于+15.46ppm(上面的图谱)。该波谱是在80ms的总的自旋回波周期以及180个40ms的脉冲(2τ)之间的间隔条件下采集的。对于下面的图谱总共扫描96次，而对于上面的图谱总共扫描64次，重复时间3.5s，谱宽25ppm。在傅里叶变换之前该数据被乘以一个1Hz的指数函数。(3)和(2)的浓度分别为50和25μM，而HSA的浓度从左至右为0、150、300、450、600nM。在绘制比例强度下的I(3)/I(2)的信号强度比从左至右为0.94、0.69、0.53、0.36和0.25。

图8.随结合的对照分子([EL]/[L_ToT])(Y轴)变化的图7的两个¹⁹F信号的信号强度比(X轴)的曲线图。右面的最后一个点对应于不存在蛋白质时的值。如前所示，两个比例([EL]/[L_TOT])是使用对于(3)的41±3.3μM的ITC-派生的K_D值的约束进行计算的。圆圈所表示的值是使用44.3μM的K_D值计算的，方块所表示的值是使用37.7μM的K_D值表示的。曲线表示这些试验点的最佳拟合。

图9.使用对照分子(2)进行的¹⁹F-NMR筛选(上部)和使用检测分子(3)进行的¹⁹F-NMR筛选(底部)。该波谱是在160ms的总的自旋回波周期以及180个40ms的脉冲(2τ)之间的间隔条件下采集的。对于上面的图谱总共扫描96次，重复时间3.5s，谱宽25ppm。在傅里叶变换之前该数据被乘以一个1Hz的指数函数。(3)和(2)的浓度分别为50和25μM。左边的谱图是在不存在蛋白质的情况下记录的，而全部其他的谱图是在600nM HSA的存在下记录的。左起第2图是在不存在化学混合物的条件下记录的，左起第3图是在50μM的5-CH₃D，L色氨酸和蔗糖的存在下记录的，右图是在50μM的5-CH₃D，L色氨酸和蔗糖和25μM的(4)的存在下记录的。

图10.¹⁹F-NMR筛选的探测范围使用对照分子(2)进行的¹⁹F-NMR试验(上部)和使用间谍分子(3)进行的试验。该波谱是在320ms的总的自旋回波周期(上部)以及1.2s的总的自旋回波周期在180个40ms的脉冲(2τ)之间的间隔条件下采集的。共进行了64次(上部图谱)和128次(下部图谱)扫描，重复时间3.5s，谱宽25ppm。在傅里叶变换之前该数据被乘以一个1Hz的指数函数。(3)和(2)的浓度分别为50和25μM。左边的谱图是在不存在蛋白质的情况下记录的，而全部其他的谱图是在仅有150nM HSA的存在下记录的。左起第二个图谱是在不存在化学混合物的条件下记录的、右图是在包含25μM的(4)的混合物的存在下记录的。

图11.在非氘化缓冲剂和洗涤剂的存在下进行的¹⁹F-NMR筛选。上图是在50μM的间谍分子(3)和25μM的对照分子(2)的存在下，溶于100mM HEPES和1甘油的600nM的HSA溶液的质子波谱。在用水屏蔽后，唯一可见的信号是缓冲剂和甘油的信号。以2.7s的重复时间记录总共128次扫描。下部左起第1和第3图谱是在不存在混合物的溶液中记录的¹⁹F波谱，而左起第2和第4谱图是在包含25μM(4)的混合物的存在下的相同溶液中记录的。该波谱是在160ms的总的自旋回波周期以及180个40ms的脉冲(2τ)的间隔条件下采集的。总共记录64次(左图)和128次(扫描)，重复时间为3.5s，谱宽25ppm。在傅里叶变换之前该数据被乘以一个1Hz的指数函数。

图12.化合物1-4的结构。

发明的详细描述

本发明涉及¹⁹F-NMR，特别是¹⁹F-NMR竞争结合试验的用途。即，本发明涉及使用¹⁹F试验的基于配体的筛选(优选，竞争筛选)。在这些试验中氟-19检测相对于质子检测具有许多优点。

在这些试验中氟能作为一个优选的核是因为当它与蛋白质结合时，其显著的化学位移各向异性(CSA)有助于配体信号的¹⁹F自旋-自旋弛豫。也就是说，CSA对¹⁹F自旋-自旋弛豫贡献使得氟信号对于与标靶的配合形成的效果尤其敏感。可以使用包含低亲和性至中等亲和性的配体作为参考分子用于新配体的检测和表征。此外，由于大多数化合物中不含氟，因此氟的检测显著地减少或甚至消除了谱线的重叠，而这种谱线的重叠常在质子(¹H)NMR中出现。像质子NMR那样，¹⁹F-NMR也是高度灵敏的并能够快速采集数据，从而使得能够高通量地筛选巨大的化合物库。氟常被用于药物涉及中以提高生物活性化合物的药物(代谢)动力学性质。由于大约12％的包含有效化学目录筛选化合物(Available Chemical Directory Screening Compounds(ACD-SC))的分子都包含一个氟原子，一般可以不借助于化学合成就能获得用于竞争筛选的参考化合物。实际上，发现分别在大约150,000和40,000个分子中，分别含有氟代苯和三氟甲基苯基残基。

竞争结合试验包括在竞争分子的存在下置换一种参考化合物。优选，该参考化合物在微摩尔范围内的结合亲和力下与靶分子结合。尽管也可使用本发明的方法评价以弱于(即，超过)1微摩尔的亲和力结合的化合物，但优选测试化合物以强于(即，小于)1微摩尔(例如，该纳摩尔范围内)的结合亲和力与靶分子结合。

尽管此处所述的方法特别用于识别与靶分子相对强的结合剂的配体，该方法也可被用于识别较宽范围内的结合亲和力的配体。相对强的结合剂通常被定义为解离结合常数K_D小于大约1微摩尔，优选小于大约500nM，更优选小于大约100nM的那些。

竞争结合试验不局限于筛选高度可溶于缓冲水溶液的化合物库。一般地，仅有参考化合物是可溶于水的，并且仍可通过它们对参考化合物的信号的间接作用检测有限溶解度的化合物。为了避免对照分子与受体以及与用于筛选的混合物的分子的非特异性的相互作用所引起的干扰，对照分子(即，从起角色来看，被称为间谍分子)通常是水溶性的。使用对照分子的滴定NMR试验通常是首先在不同的配体浓度以及固定的蛋白质浓度、或者不同的蛋白质浓度以及固定的配体浓度下进行的(C.Dalvit等，J.Am.Chem.Soc.，124，7702-7709(2002))。这些试验被用于筛选体系条件的优化以及用于从单点测量中所识别出来的NMR采样的结合常数。由于强配体对间谍分子具有巨大的影响，因此可以被容易地识别出来。然而，目前的¹H-NMR竞争筛选法的代表性局限在于参考化合物与测试化合物之间的谱线重叠，特别是在筛选巨大的化学混合物时。通过利用其他的核(例如，¹⁹F)的NMR探测显著地减少了这些问题。

本发明提供了使用与靶分子相互作用的配体的各种方法。

在某些具体实施方案中，该方法包括筛选化合物以识别靶分子的配体。该方法包括：采集至少一种测试化合物的第一1D ¹⁹F核磁共振波谱；将该至少一种测试化合物暴露于靶分子下；采集至少一种已经暴露于靶分子的测试化合物的第二1D ¹⁹F核磁共振波谱；比较第一和第二波谱以测定一个或多个共振的变化，并识别至少一种与靶分子相互作用的测试化合物。

在某些具体实施方案中，使用如下步骤：提供与靶分子相互作用的¹⁹F-标记参考化合物；在靶分子的存在下采集该¹⁹F-标记参考化合物的1D ¹⁹F核磁共振波谱；提供至少一个测试样品(优选多个测试样品)，各测试样品包含至少一种测试化合物；在各测试样品和靶分子的存在下采集该¹⁹F-标记参考化合物的1D ¹⁹F核磁共振波谱；比较在靶分子的存在下该¹⁹F-标记参考化合物的波谱与在各测试样品和靶分子的存在下该¹⁹F-标记参考化合物的波谱，以测定一个或多个该¹⁹F-标记参考化合物共振中的变化；并识别其中至少一种与靶分子相互作用的测试化合物，其中测试化合物置换该¹⁹F-标记参考化合物(一般地，这时因为测试化合物具有至少与参考化合物一样紧密的结合亲和力的结果)。

一般地，一个或多个该¹⁹F-标记参考化合物共振的变化包括至少一个参考共振的信号强度的增加。优选，一个或多个¹⁹F标记参考化合物共振的变化包括至少一个参考共振的锐化。

如果需要，在采集¹⁹F波谱之前，可以施加自旋回波型过滤器，如

实施例部分所述。

可以如实施例部分所述测定此处所述的任何方法最佳试验条件。具体地说，这通常包括在用于比较步骤的在靶分子的存在下采集该¹⁹F-标记参考化合物的1D ¹⁹F核磁共振波谱之前进行如下步骤：在不同浓度的靶分子或不同浓度的¹⁹F-标记参考化合物的存在下，采集该¹⁹F-标记参考化合物的1D ¹⁹F核磁共振波谱。所采集的信息用于测定识别至少一种与靶分子相互作用的测试化合物的最佳试验条件。

当在各测试样品和靶分子的存在下采集该¹⁹F-标记参考化合物1D¹⁹F核磁共振波谱时，可以使用各种脉冲序列。为有效比较波谱，需要具有相同的试验条件；然而，只要在筛选之前已经产生了滴定试验的图形，靶化合物和¹⁹F-标记对照分子的浓度就可以改变。通常，温度和缓冲条件是相同的，因为这些试验条件的改变可以影响参考化合物的结合常数。

在上述用于两种或多种测试化合物的混合物的一般化方法中，识别至少一种测试化合物可以优选包括在各靶分子的存在下分别记录该¹⁹F-标记参考化合物的1D ¹⁹F核磁共振波谱。随后比较在靶分子的存在下¹⁹F-标记参考化合物的波谱与在各测试化合物和靶分子的存在下¹⁹F-标记参考化合物的波谱，以测定所选择的¹⁹F-标记参考化合物共振的变化。这些试验的脉冲序列通常是相同的。这种通常被本领域技术人员称为去褶合试验。

若需要，可以使用NMR技术测定测试化合物和/或参考化合物的解离常数(即，结合亲和力)，尽管也可使用其他的已知的技术(例如，等温滴定量热法)。优选使用等温滴定量热法或荧光光谱法测定参考化合物的结合亲和力，其具体细节是本领域技术人员所属性的并且如实施例部分所述。

例如，在一种NMR方法中，除了上述一般化方法的步骤外，可以采集在不同浓度的¹⁹F-标记参考化合物条件下在靶分子的存在下¹⁹F-标记参考化合物的1D ¹⁹F的核磁共振波谱。做为选择或另外可以采集在不同浓度的靶分子的存在下¹⁹F-标记参考化合物的1D ¹⁹F核磁共振波谱。如实施例所述，该信息可被用于测定测试化合物的解离常数。

可以使用各种技术以提高本发明方法的精度。一般地，可以使用内标，该内标可以是一个无相互作用的化合物。

作为使用无相互作用的分子的一个替代方案是使用ERETIC方法(S.Akoka等，Anal.Chem.，71，2554-2557(1999)；和V.Silvestre等，S.Anal.Chem.，73，1862-1868(2001)。该技术依靠电子产生一个规定频率、线宽和振幅的信号。使用源于样品的FID采集一个假FID。调整该仿真信号的振幅，以形成一个与不存在蛋白质时所记录的参考化合物的信号相当的强度。该幅值然后被用于滴定和NMR筛选试验并测量真实和仿真信号的信号强度比。加入一个ERETIC信号类似于给正常化的信号增加一个伪信号。

对于本发明的某些具体实施方案，参考化合物是和具有规定线宽、振幅和频率的ERETIC信号一起提供的。对于这些方法，在靶分子的存在下采集¹⁹F-标记参考化合物的1D ¹⁹F核磁共振波谱包括：在靶分子的存在下采集带有ERETIC信号的¹⁹F-标记参考化合物的波谱；以及在各测试样品和靶分子的存在下采集¹⁹F-标记参考化合物的1D ¹⁹F核磁共振波谱包括在各测试样品和靶分子的存在下采集具有ERETIC信号的¹⁹F-标记参考化合物的波谱。

对于本发明的某些具体实施方案，¹⁹F-标记参考化合物是与¹⁹F-标记无相互作用的化合物一起提供的。对于这些方法，在靶分子的存在下采集¹⁹F-标记参考化合物的1D ¹⁹F核磁共振波谱包括：在靶分子的存在下采集¹⁹F-标记参考化合物和¹⁹F-标记无相互作用的化合物的波谱；以及在各测试样品和靶分子的存在下采集¹⁹F-标记参考化合物的1D ¹⁹F核磁共振波谱包括：在各测试样品和靶分子的存在下采集¹⁹F-标记参考化合物和¹⁹F-标记无相互作用的化合物的波谱。由于这种无相互作用的化合物在测试浓度下不与靶分子结合，它们被用作对照物。

结合本发明的竞争结合试验，可以使用WaterLOGSY方法以及本领域所公知的其他方法例如光谱或生物化学使用，以识别参考化合物。优选通过下列步骤识别参考化合物：在不存在靶分子的条件下采集一个潜在参考化合物的WaterLOGSY核磁共振波谱；在靶分子的存在下采集潜在参考化合物的WaterLOGSY核磁共振波谱；以及比较WaterLOGSY波谱以识别是否为与靶分子相互作用的潜在参考化合物。

该WaterLOGSY方法(亦被称为经由梯度波谱Y观测的水-配体)(Water-Ligand Observed via Gradient Spectroscopy Y)是以从大量水的质子向与靶分子(例如，蛋白质)相互作用的化合物的氢核的磁化传递为基础的。使用WaterLOGSY技术，通过它们的水-配体核欧沃豪斯效应(NOE)的反信号将结合化合物与非结合剂区分开来。该WaterLOGSY方法在下列文献中有更具体的描述：国际专利申请WO01/23330(2001年4月5日出版)、C.Dalvit等，J.Biomol.NMR，18，65-68(2000)、以及申请人于2002年6月5日提交的共同未决美国专利申请序列号No.60/386,896(代理编号No.01168.PRO1)。

可被用于本发明的方法的靶分子包括各种分子，特别是大分子，例如多肽(优选，蛋白质)、多核苷酸、有机聚合物等等。这些化合物可以在活细胞或溶菌产物中。

在此处所使用的“多核苷酸”是指任意长度的聚合形式的核苷酸，或者核糖核苷酸或脱氧核苷酸(deoxynucleotide)，并且包括双链或单链DNA以及RNA。多核苷酸可以包括编码和非编码区，并且可以直接由天然来源(例如，微生物)获取，或者可以借助于重组体、酶或化学技术制备。多核苷酸的拓扑结构可以是线性的或者环形的。多核苷酸可以是例如媒介物，例如表达或克隆媒介物，或者是一个片段。

此处所使用的“多肽”是指氨基酸的聚合物并且不是指具有规定长度的氨基酸的聚合物。因此，例如，术语肽、低聚肽、蛋白质和酶被包括在多肽的定义中。该术语还包括多肽的后表达修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等等。

参考化合物是一个与选定靶分子以非常浅的结合亲和力相互作用的化合物。相对弱的相互作用参考化合物一般被定义为解离结合常数K_D为至少10微摩尔的化合物。

可用来评价的测试化合物可以是任何重量的化合物，其与标靶潜在地具有各种结合亲和力。值得注目的是，本发明的方法具有能够检测为相对强的结合剂的化合物。相对强结合剂一般被定义为解离结合常数K_D为小于大约1微摩尔的化合物。以使用本发明的方法筛选的化合物包括，例如，植物提取物、真菌提取物、其他天然产品和小有机分子库。

本发明可以从具有大范围的化合物库中筛选配体(该方法特别适用于具有极低溶解性的化合物)。值得注目地和有利地，对于某些具体实施方案，本发明优选包括在相对低的标靶(即，靶分子)浓度下进行结合试验。因此，本发明的优选的具体实施方案允许检测仅能边缘溶解的化合物。一般地这些化合物在水中的溶解度不大于10μM。

尽管如果需要可使用更高的浓度，优选各样品中各测试化合物的浓度不大于大约100μM。然而，本发明的方法的显著优点在于可以使用极低的配体浓度(例如，不大于大约10μM)。

所使用的提取物浓度以及测试化合物对靶分子的比例可以随靶分子的尺寸、有效靶分子的量、所需要的结合亲和力检出限和所需要的数据采集的速度的改变而改变。优选靶分子的浓度约为100nM至大约10μM。

用于测试混合物的溶剂可以是各种溶剂，只要这些溶剂不是标靶降解(例如使变性)。一般地使用水和DMSO。可以使用质子化的溶剂和洗涤剂。

对本领域技术人员而言，已知，在需要时可以向该测试化合物中加入其他的组分(例如，缓冲剂)以获得某些优点。

还可发现本发明可用于化学混合物(即两种或多种测试化合物的混合物)的快速筛选。

快速筛选技术一般地包括提供多个测试样品，各测试样品包含两种或多种测试化合物的混合物。

一旦配体(优选高亲和性配体)已被识别和确认，其结构就被用于具有类似结构的用于测试活性或亲和性的有效化合物，或用于控制用来测试活性或亲和性的结构相关化合物。然后从市场购得这些化合物或者合成这些化合物。最常见的情形是，然后使用酶试验评价它们的活性。在分子标靶不是酶或者不能进行酶试验时，可以使用类似于上面的描述的使用NMR技术、或其他的物理方法例如等温变性量热法测试其亲和性。在该步骤中所识别的与分子标靶的亲和性为大约1.0×10^-6M或更大的化合物通常被当作先导化学模板。

在有些情况下，使用更复杂的NMR试验或其他的物理方法例如量热法或X-射线晶体衍射法研究配体结合。

用于优化¹H和¹⁹F检测的冷冻探针技术可以进一步提高这些筛选方法的处理能力。在这种情况下，限制因素将是样品变化所需的时间、平衡样品温度和样品。

实施例

通过下面的实施例进一步说明本发明的目的及优点，但是这些具体实施例中所述的具体材料及其使用的量，以及其他的条件和具体情况，不应被过度地解释为对本发明的限制。

材料和方法

对于本实施例(I)的第一组试验，丝氨酸/苏氨酸p21活化激酶的激酶域(MW大约34000)被表达为一个大肠杆菌中的GST融合蛋白质并在除去GST标记后将其纯化均匀。将NMR样品溶于pH7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS，代码：P-3813，Lot 100K8211，Sigma公司生产)。将D₂O加入到溶液(8％最终浓度)中以进行信号锁定。在氘代DMSO的储液中制备小分子并在253K温度下保存。

对于实施例(II)的第二组试验，脂肪酸游离人血清白蛋白(A-3782)是从Sigma公司购得并未经进一步纯化而使用。在5μM EDTA的存在下，将NMR样品溶于pH为7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS，代码：P-3813，Lot 100K8211，Sigma公司生产)中。将D₂O加入到溶液(8％最终浓度)中以进行信号锁定。在或者氘代DMSO或水的浓缩储液中制备小分子并在253K温度下存储。

NMR

对于实施例(I)的第一组试验，全部NMR波谱是在293K温度下，使用配备有取样管理系统(SMS)自动进样器的Varian Inova 600MHz(对于¹⁹F为564MHz)核磁共振波谱仪记录的。使用激动造型序列(T.-L.Hwang，J.Magn.Reson.A，112，275-279(1995))在¹H检测试验中实现对水的抑制。该模式的两个对水具有选择性的180°二次脉冲和四脉冲场梯度地脉冲宽度分别为2.6和1毫秒(ms)。

对于实施例(II)的第二组试验，全部核磁共振波谱是在300K温度下试验Bruker Avance 600核磁共振波谱仪在564MHz的¹⁹F拉莫尔频率下操作所记录的。所使用的双线圈{¹⁹F}-{¹H}探针中将内层线圈调整到¹⁹F的频率将外层线圈调整到¹H的频率。这些探针的氟背景不会对测量产生干扰。这些信号较宽并因此在使用自旋回波模式所记录的参考分子和对照分子的波谱中并不明显。在采样期间，全部的波谱都是使用一个弱Waltz-16质子去耦进行记录的。通常记录4-8次空扫以平衡温度。在采样之前使用了不同长度和2τ时间间隔的Carr-Purcell-Meibom-Gill模式，并且参照三氟乙酸对化学位移进行校正。

荧光

荧光测试是通过一个Jasco J-715分光偏振计使用垂直于该激发束的辅助光电倍增管来采集的。该激发波长是310纳米(频带宽度5纳米)并使用一个385纳米截止滤光片。使用与NMR试验中所使用的相同来源的脂肪酸游离HSA进行亲和性测试。在5μM EDTA的存在下在pH值为7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS，代码：P-3813，Lot 100K8211，Sigma公司生产)中制备分析物和HSA溶液。在使用前通过一个0.2μM的滤波器过滤该缓冲液。通过将2.0mL的3μM的分析物溶液等分到一个通道长度为1.0cm的小石英池中，并使用HSA(装料浓度250μM)滴定该溶液。

ITC试验

使用Microcal Inc.(Northampton，MA)制造的OMEGA滴定微量热计进行等温滴定量热试验。滴定微量热计由容纳在绝热外壳中的样品池和参比池组成。参比电池中装满PBS。在1.37mL的样品池中放入23μM的溶于PBS+2％DMSO的HSA溶液。0.8mM的溶于相同缓冲剂的分析物被放在一个250μL的注射器中。在25℃温度下，通过计算机控制的步进电动机向样品池中注射三十次分析物(每次注射8μL，每次12秒)。注射器搅动速度为400rpm。通过一个与Microcal毫微伏特放大器连接的热电装置测量各次注射吸收和释放的热。结合相互作用的滴定等温线由每次注射的微分热流组成。通过向PBS注入分析物的稀释热是微不足道的。结合等温线与包括在该仪器中的使用迭代非线性最小平方算法的单一结合部位模型(T.Wiseman等，Anal.Biochem.，179，131-137(1989))一致。

实施例I

结果和讨论

¹⁹F弛豫理论

¹⁹F的纵向弛豫不是竞争结合试验的有用参数，因为它缺乏识别与大分子相互作用的小分子所必需的直接τ_C相关性。然而，自旋-自旋弛豫速度R₂却是一个非常有效的参数，因为它包含了通过如下方程描述的异核¹⁹F-¹H偶极相互作用以及¹⁹F化学位移各向异性(CSA)相互作用在零频率下计算的谱线密度(M.Goldman，Quantum Description ofHigh-Resolution NMR in Liquids，Clarendon Press，Oxford，(1988))：

$\frac{2}{15}{\mathrm{\Δ\σ}}^2{B}_0^2{\mathrm{\γ}}_F^2{\mathrm{\τ}}_c\{\frac{2}{3}+\frac{1}{2(1+{\mathrm{\ω}}_F^2{\mathrm{\τ}}_c^2)}\}---\left(1\right)$

Hi表示与氟原子空间上接近的参考化合物以及蛋白质的全部质子，Δσ为¹⁹F原子的CSA以及B₀为磁场的强度，γ_H和γ_F分别为质子和氟的旋磁比，ω_H和ω_F分别为质子和氟的拉莫尔频率，τ_c为相关时间，且r_FHi为Hi质子和氟原子之间的核间距。

由于¹⁹F的CSA非常大(多达数百ppm)(J.T.Gerig，Methods inEnzymol.，177，3-23(1989)；和J.T.Gerig，Prog.NMR Spectrosc.，26，293-370(1994))，它将显著地增加结合配体部分自旋-自旋弛豫。CSA对弛豫的影响与磁场的平方成正比。因此，在更高磁场下的效果更为明显。可以从图1的模拟中理解这一点，其中由于游离于溶液的小分子的以及当与不同大小的大分子结合时的¹⁹F线宽的差异是一个与拉莫尔频率相关的曲线。对于有利于溶于中的小分子，模拟时使用Δσ为100ppm，τ_C为200ps。由图1可知，由于CSA的强烈影响，现有的最强的磁场对于强结合配体和被¹⁹F选择性标记的蛋白质的试验并不是最佳的。相反，强磁场特别适于使用弱亲和性参考分子进行的竞争结合HTS试验。游离和结合状态的参考分子之间的¹⁹F共振线宽的差异随磁场的强度而增加。此外，在游离与结合状态下的氟配体共振的化学位移差异(δ_游离-δ_结合)也变得更大。这些导致对交换术语R_2，ex对参考化合物的线宽的产生显著的影响(J.W.Peng，J.Magn.Reson.，153，32-47(2001))：

$R_{2,\mathrm{ex}}=\frac{\left[\mathrm{EL}\right]}{\left[L_{\mathrm{TOT}}\right]}{(1-\frac{\left[\mathrm{EL}\right]}{\left[L_{\mathrm{TOT}}\right]})}^2\frac{{4\mathrm{\π}}^2{({\mathrm{\δ}}_{\mathrm{free}}-{\mathrm{\δ}}_{\mathrm{bound}})}^2}{K_{-1}}---\left(2\right)$

[EL]/[L_TOT]为结合配体的份数，1/K_-1配体结合到蛋白质上的残留时间。

参考化合物以及筛选参数的选择

NMR筛选试验一般是相对于蛋白质在10-100倍过量的配体(仅产生少部分的结合配体)的条件下进行的，前述部分中的术语(Δσ，B₀，δ_游离-δ_结合，1/K_-1等)在参考化合物的选择中非常重要。由于蛋白质的影响所引起的移动，当与游离配体的化学位移相比时，与蛋白质结合的参考化合物的¹⁹F信号的化学位移可以是非常不同的(J.T.Gerig，Prog.NMR Spectrosc.，26，293-370(1994)；和J.Feeney等，J.Am.Chem.Soc.，118，8700-8706(1996))。因此甚至具有μM范围的中等结合亲和力的分子也可以显示出两个清楚的共振，一个为结合形式，另一个为游离形式。这是由在与游离化合物和结合化合物之间的交换速度相比时，两个共振化学位移的差异更大这一实事所导致的。在HTS中，仅监测在游离配体频率下的信号，因为蛋白质的浓度非常低(数百nM至1-5μM))，以允许观测结合形式的很宽的共振。

为了评价任何用于竞争筛选的给定氟化配体的适用性以及为了测定最佳试验参数，试验分子的滴定试验是通过采集1D ¹⁹F R₂过滤试验或简单的1D试验通过改变结合配体的份数(C.Dalvit等，J.Am.Chem.Soc.，124，7702-7709(2002))来进行的。为了获得更好的试验灵敏度，在采集周期期间使用¹H去耦。测试测试化合物以及试验条件，以确定它们的灵敏度以及用于确定一个在与标靶结合时显示出显著的微扰的单一氟共振的存在。

一旦识别了适宜的配体以及确定了试验条件，然后就可以通过如图2所示监测参考分子的¹⁹F信号的自旋-自旋弛豫的变化(或者经由使用CPMG或自旋回波模式进行的R₂过滤试验或简单地通过分析线宽)进行筛选。

在这种情况下，在1.5μM的PAK4的存在下使用50μM的中等亲和性配体化合物A(K_D＝10μM)作为参考化合物。在包含高亲和配体的下化合物混合物的存在下，在自旋回波之后可以看到化合物的信号显著增强(比较图2a与2b)。这种信号的增加显示由于与包含在混合物中的分子的竞争结合使得参考分子化合物A的结合减小。简单去褶合试验(2c和2d)允许识别作为活性分子的化合物B。

当使用自旋回波类型序列时，建议在硬180°脉冲之间使用足够长的延迟以便充分利用方程(2)的交换项。之所以能这样做是因为不存在同核标量耦合并且异核标量耦合下的逸出被重聚焦了。然而，延迟不应过长以避免静磁场的非均匀性所产生的弛豫。

除了氟化参考化合物，包含一个不与受体相互作用的氟化小分子(对比化合物)是有利的。图3显示在存在与不存在蛋白质的条件下所记录的间谍分子和无相互作用分子的¹⁹F波谱中的这一原理。当间谍分子的信号发生光谱变化时，小分子的信号不会发生变化。从图3的示差光谱可以看出这一点。该无相互作用的分子的信号为一个内标，该内标可用于使用单一使用校正间谍分子的信号变化。应当指出的是，即使小分子与受体具有弱相互作用(mM范围)，这也不会对测量产生干扰。当与弱结合常数相比小分子的浓度(10-30μM)的数量级更小，因此与受体结合的化合物的份数是可以忽略不计的。为了证明这一点，选择三氟乙酸(TFA)作为与受体无相互作用的小分子。应当指出的是在筛选中的一些化合物中可能含有痕量的TFA。因此，尽管它对于这里所提出的概念的证明是有效的，应当选择其他的参考化合物以用于更普遍的应用。同时使用间谍分子和参考化合物通过HTS和去褶合以识别先导化合物的应用如图4所示。该六化合物混合物的确不影响间谍分子共振的线宽(图4c)并且参考化合物A的信号明显不如TFA的信号强。然而，在七化合物混合物中存在一个强竞争分子(化合物B)将导致间谍分子共振的锐化，并且这两个信号具有相当的强度。

如C.Dalvit等，J.Am.Chem.Soc.，124，7702-7709(2002)所述，可以从与结合配体份数成曲线关系的¹⁹F共振的信号强度比例以及测量在竞争分子的存在下参考分子的信号强度的变化得到识别NMR采样的结合常数。在该具体情形中，NMR-采样化合物B的结合常数为200+/-100nM。当将¹⁹F试验用于HTS时，同样重要的是记录¹H波谱以测定包含该化学混合物的化合物的浓度，并由此得出一个NMR采样的可靠的结合常数。

在采集期开始之前，还可以在¹⁹F试验中施加一个¹H至¹⁹F NOE步骤，以避免从质子到氟原子自旋地磁化转移。可以通过不同的方式进行该步骤。对于不与大受体相互作用的小分子，能观察到¹⁹F信号的增强。对于与受体弱相互作用的分子，观察到非常到非常弱的信号增加或者信号减弱，这取决于结合受体的份数、蛋白质相关时间，以及，取决于NOE步骤是如何实施的。这些异核NOE的差异可被有效地用于竞争结合HTS试验。当在竞争分子的存在下，间谍分子被从受体上置换下来后，由于异核NOE使得线宽更小以及信号增强，其¹⁹F信号也变得更强。

实施例II

结果与讨论

原理

¹⁹F-NMR信号的灵敏度与(γ_F/γ_H)³成正比，其中γ_F和γ_H分别是氟和质子的旋磁比。由于¹⁹F是唯一的稳定的氟同位素并具有1/2自旋，其灵敏度很高，是质子的0.83倍。在质子去耦的条件下，氟信号表现为单共振峰，因此信号很强烈。

¹⁹F横向弛豫是用于通过竞争结合试验进行的监视的非常有用的参数。位于一点距离上的氟和质子之间的偶极相互作用(0.88倍)与相同距离的两个单独质子之间的偶极相互作用在大小上非常接近。因此对于参考分子的氟原子和质子的偶极作用是非常接近的。氟信号的横向弛豫速度R₂具有额外的影响，这种液相影响源于¹⁹F原子的大量的CSA相互作用并且可通过下式表示(D.Canet，Nuclear MagneticResonance Concepts and Methods，John Wiley & Sons，Chichester，(1996))：

$R_2^{\mathrm{CSA}}=\frac{2}{15}{\mathrm{\Δ\σ}}^2(1+\frac{{\mathrm{\η}}_{\mathrm{CSA}}^2}{3})B_0^2{\mathrm{\γ}}_F^2{\mathrm{\τ}}_c\{\frac{2}{3}+\frac{1}{2(1+{\mathrm{\ω}}_F^2{\mathrm{\τ}}_c^2)}\}---\left(3\right)$

其中Δσ为¹⁹F原子的CSA并可通过Δσ＝σ_zz-(σ_xx+σ_yy)/2得出。不同的σ是该组分的该化学位移磁张量。不对称参数η_CSA＝(3/2)(σ_xx-σ_yy)/Δσ并且对于轴对称的化学位移磁张量η_CSA＝0。B₀为磁场强度，γ_F是氟旋磁比，ω_F为氟拉莫尔频率，τc为相关时间。

如上述第一组试验(I)的讨论，所进行的模拟假定一个轴对称的CSA磁张量并且对于游离与结合态的配体假定其具有相同的CSA，如图1所示，仅由于CSA作用单独导致的游离合结合状态之间的参考分子的¹⁹F信号的线宽的差异可以非常大(C.Dalvit等，Comb.Chem.HTS，5，605-611(2002)以及上述实施例(I))。这些差异随受体的尺寸以及磁场强度的平方而增加。高磁场可以导致高分子(例如，¹⁹F选择性标记的蛋白质)或者强蛋白质结合受体的氟信号具有非常宽的线宽(＞200Hz)。(W.E.Hull等，J.Mol.Biol.，98，121-153(1975)；J.T.Gerig，Methods in Enzymol.，177，3-23(1989)；和J.T.Gerig，Prog.NMR Spectrosc.，26，293-370(1994))。这样的线宽使得高分子或高亲和性配体的氟共振的直接检测不能被用于筛选。相反，这样的磁场强度非常适合于使用弱亲和性参考分子的竞争结合试验，其中可以控制和检测的公开由观测的线宽得到的游离和结合状态之间的平均值(C.Dalvit等，Comb.Chem.HTS，5，605-611(2002)和上述实施例(I))。

在采集期开始前，脉冲序列一般采用Carr-Purcell Meibom Gill(CPMG)自旋回波模式(H.Y.Carr等，Phys.Rev.，94，630-638(1954)；和S.Meiboom等，Rev.Sci.Instrum.，29，688(1958))。在自旋回波模式末期，参考分子的信号强度I_(n2τ)由如下方程得到(T.C.Farrar等，Pulse and Fourier Transform NMR，Introduction toTheory and Methods，Academic Press，New York，1971)：

$I_{\left(n2\mathrm{\τ}\right)}=I_0{e}^{-{\mathrm{\γ}}_F^2{G}^2{D}_{\mathrm{obs}}\left(n2\mathrm{\τ}\right)\frac{{\mathrm{\τ}}^2}{3}}{e}^{-n2\mathrm{\τ}{R}_{2,\mathrm{obs}}}---\left(4\right)$

其中I₀是首次90°脉冲之后的信号强度，2τ是180°脉冲的序列之间的时间间隔，G是静态磁场的非均匀性，γ_F是氟的旋磁比，以及n是自旋回波模式的循环数。D_obs，所观测到的弱亲和性参考分子的迁移扩散系数，并由如下方程得出：

$D_{\mathrm{obs}}=\frac{\left[\mathrm{EL}\right]}{\left[L_{\mathrm{TOT}}\right]}{D}_{\mathrm{bound}}+(1+\frac{\left[\mathrm{EL}\right]}{\left[L_{\mathrm{TOT}}\right]})D_{\mathrm{free}}---\left(5\right)$

其中，D_结合与D_游离分别是结合与游离态的参考分子的扩散系数。[EL]/[L_TOT]和(1-[EL]/[L_TOT])分别是结合与游离配体的系数。

弱结合参考分子的横向弛豫速度R_2，obs由如下方程得出：

$R_{2,\mathrm{obs}}=\frac{\left[\mathrm{EL}\right]}{\left[L_{\mathrm{TOT}}\right]}{R}_{2,\mathrm{bound}}+(1-\frac{\left[\mathrm{EL}\right]}{\left[L_{\mathrm{TOT}}\right]})R_{2,\mathrm{free}}+\frac{\left[\mathrm{EL}\right]}{\left[L_{\mathrm{TOT}}\right]}{(1-\frac{\left[\mathrm{EL}\right]}{\left[L_{\mathrm{TOT}}\right]})}^2\frac{{4\mathrm{\π}}^2{({\mathrm{\δ}}_{\mathrm{free}}-{\mathrm{\δ}}_{\mathrm{bound}})}^2}{K_{-1}}---\left(6\right)$

其中R_2，结合与R_2，游离分别是游离与结合状态的横向弛豫时间。最后一项为交换项，其中δ_结合与δ_游离分别是游离与结合状态的同位素化学位移，并且1/K_-1是配体结合到蛋白质上的残留时间。仅当该试验是使用长为2τ(其中τ＞＞1/K_-1)进行时，方程(6)才是有效的。使用τ＜5/K_-1进行的试验使得交换项对于所观测的横向弛豫速度的影响降低(Z.Luz等，J.Chem.Phys.，39，366-370(1963)；和A.Allerhand等，H.S.J.Chem.Phys.，41，2115-2126(1964))。

因此，使用一个长2τ期进行筛选。之所以可以这样做是因为异核¹H-¹⁹F标量耦合下的演化在该模式的末端被重聚焦了。然而，该2τ期不应非常长，以至于减少由参考分子的空间扩散导致的信号衰减(即，方程(4)的第一指数项)。

间谍分子以及对照分子的选择

表1给出了在三种不同商用化合物库中含有氟原子的分子的频率。该表中还包含在试验中所经常试验的单氟代苯和三氟甲基苯这两种子结构的数目。大量包含氟原子的分子使得不需要依靠化学合成进行间谍分子和对照分子的选择。

表1中的一个有趣特征在于在MDDR库中存在大量的含氟分子。如图5所示，对该库内的按时间顺序的调查显示，在过去20年间，所开发的包含至少一种氟原子的化合物的百分比增加了一倍。可以观察到从1981-1985年间的10.9％稳步增加到1996-2000年间的19.4％。氟原子已经日益被用于先导化合物的优化以改善其效力、物理化学性质和对于酶作用的新陈代谢稳定性的过程中。

在这两种分子的选择过程中应特别注意其溶解性。氟原子的存在增加了化合物的亲油性。不是非常容易溶于水溶液中的分子不适合用于筛选试验，因为它们可以以一种非专一的方式与受体结合。因此，对于潜在分子和对照分子的质子和氟波谱以及质子WaterLOGSY波谱实在不存在蛋白质的条件下，一般在高于筛选过程所使用的浓度2至4倍(即，100至200μM)的浓度下测试的。仅有那些根据NMR波谱是可溶解的并且在该浓度下不集结的分子被认为是用于筛选的参照和对照分子的潜在的化合物。

含有CF₃基团的化合物

含有CF₃基团的参考化合物的优点在于其具有较高的氟信号灵敏度。参考分子5-[1-甲基-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-5-基]-2-噻吩羧酸(1)和对照分子1-[5-(三氟甲基)-1，3，4-噻二唑-2-基]哌嗪(2)的典型的自旋回波¹⁹F波谱是在不同浓度的HAS的浓度下在采集期间试验质子去耦所记录的，如图6所示。与NMR试验的结果一致的是，使用(2)进行的ITC测试并没有发现任何与HAS结合的证据(将8μL、800μM的(2)注射到30μM HAS中仅观测到扩散热)。NMR试验中所使用的两种分子的浓度都仅为25μM。参考分子的低浓度避免了由于非特异性结合以及集聚所产生的问题。这些分子的缺点在于即便在结合状态下也可以观测到氟原子围绕着该基团的C₃轴的快速旋转。这导致游离状态和结合状态的参考分子间的CF₃信号的线宽的差异有限。

含有CF基团的化合物

含有CF基团的化合物特别适合用于基于竞争结合的筛选试验。¹⁹F-CSA可以非常大因此增加了方程(3)的参考分子的游离态与结合态的线宽的差异。例如芳族CF的CSA的范围在单氟代苯的71ppm至六氟代苯的158ppm之间(H.Raber等，Chem.Phys.，26，123-130(1977))。此外，由于其“邻位效应”或氟原子直接参与了与蛋白质的氢键，结合状态的参考分子的¹⁹F-CSA可以增加。这两个现象还将导致自由状态和结合状态的各向同性化学位移的巨大差别。对于弱亲和性参考化合物，方程(6)的交换项可以在蛋白质的存在下可以对参考化合物的线宽起到显著的作用。氟信号通常与几个质子偶合而裂分，因此，为了改善其灵敏度，必需在采样期间使用质子去耦来记录光谱。图7显示了使用质子去耦的随HSA浓度变化的参考分子2-羟基-3-氟苯甲酸(3)和对照分子(2)的代表性的自旋回波氟波谱。这些分子的一个缺点在于需要使用更高的浓度进行该试验。图7的波谱所使用的参考分子的浓度为50μM。

滴定和筛选试验

在选定了参考分子和对照分子之后，进行关于蛋白质的滴定，其结果如图6和图7所示。两个氟信号的强度比被绘制成关于蛋白质结合参考分子的曲线，如图8的实施例所述。使用通过其他技术(例如，ITC或荧光光谱学)得到的解离结合常数计算结合化合物的份数，如C.Dalvit等，J.Am.Chem.Soc.，124，7702-7709(2002)；和C.Dalvit等，Comb.Chem.HTS，5，645-650(2002)所述。这些技术还提供了对照分子的结合位点数，该结合位点数是竞争结合试验中一个非常重要的参数。ITC测试提供了一个n值，该n值对于(1)而言接近4、对于(3)而言接近1。因此，尽管分子(1)可在对试验结果的解析中受到一定限制的条件下被用于筛选试验，它不能被用于导出NMR采样的结合参数。分子(3)代表了一种合适的参考分子，因为它在这些试验所使用的浓度下与HSA仅具有一个结合位点。根据其化学结构，一种阿司匹林类似物，其公认的结合位点将是Sudlow位点I(位于子域IIA)(T.Peters，Jr.，All about Albumin Biochemistry，Genetics，andMedical Applications，Academic Press，San Diego，U.S.A.1996)所述。在图8中，使用两个通过实验误差测定的K_D极限值提取对于蛋白质结合参考分子(3)的部分的两个不同的值。在这种具体情形下，ITC所导出的(3)的K_D值位41±3.3μM，因此这两个K_D的极限值分别为37.7和44.3。

应当指出的是还可以在仅存在参考分子的条件下进行NMR试验(C.Dalvit等，Comb.Chem.HTS，5，605-611(2002)以及上述实施例(I))。然而，在这种情况下，所记录的两个试验必须是：一个不带CPMG序列(即2nτ＝0)以及另一个带有长为2nτ的CPMG序列。然后将从这两个波谱中所得出的信号强度绘制成关于结合参考分子份数的曲线。

然后利用图8来设定筛选所需的条件。图9显示了对照含有(3)作为参考分子的HSA进行的筛选过程。对于筛选，所选择的参考分子的总的自旋回波周期(2nτ)接近零。已知所存在的5-CH₃的D，L色氨酸和蔗糖的混合物(左起第三个波谱)是非结合剂，不会改变间谍分子的波谱。相反，丙酮苄羟香豆素(warfarin)衍生物4-羟基-3-[1-(对碘苯基)-3-氧代丁基]香豆素(4)的存在(右边的波谱)导致(3)的信号的再次出现。根据图8的图形，这是由于参考化合物从蛋白质上被置换下来所导致的。用于计算NMR采样的结合常数的置换程度如表2所示(C.Dalvit等，J.Am.Chem.Soc.，124，7702-7709(2002)；和C.Dalvit等，Comb.Chem.HTS，5，645-650(2002))。

由单点NMR所导出的(4)的结合常数及其与所测量的荧光值的比较
										I(3)/I(2)	KD	[I]	[LTOT]	[ETOT]	[EL]/[LTOT]	[EL]	KD app	KI NMR	KI fluo
0.698	44.3	25	50	0.6	0.00159	0.080	326.8	3.9	3.3+/-0.3
										0.698	37.7	25	50	0.6	0.00171	0.086	300.4	3.6

全部浓度和结合常数的值都是以μM表示的。K_D是由ITC所导出的(3)的结合常数，K_I ^fluo是由荧光导出的(4)的结合常数。[I]，[L_TOT]和[E_TOT]分别是(4)，(3)和HSA的浓度K_I ^NMR是由NMR测试所导出的(4)的结合常数。

为了导出一个可靠的结合常数值，还必需测试其质子波谱。这是通过简单比较参考分子信号的积分来计算NMR采样的浓度所必需的，其中浓度可从NMR采样的信号的积分得到。由NMR导出的K_D值优选与由完全滴定荧光测试所导出的值进行比较。自从其首次被应用以来(C.Dalvit等，J.Am.Chem.Soc.，124，7702-7709(2002)；和C.Dalvit等，Comb.Chem.HTS，5，645-650(2002))，就已经使用这种方法计算了数百种化合物的结合常数。对于纯粹竞争结合机制和单一结合部位而言，由单点NMR所导出的结合常数与由完全滴定荧光和ITC导出的结合常数之间完全吻合。该NMR方法还能够测定高亲和性结合常数，而该常数是不易由其它NMR方法得到的。

检测限

由于弱结合亲和性参考分子的巨大的CSA以及巨大的交换作用，因此有可能显著降低筛选需要蛋白质的浓度。可以从图10理解这一点，其中筛选是在浓度仅为150nM的HSA的存在下进行的。尽管[L_TOT]/[E_TOT]的比值巨大(＝330)而[EL]/[L_TOT]的比值小(＝0.00165，使用41μM的K_D)，有可能观察到小部分的结合配体的效果，并且在这种低蛋白浓度下进行筛选。这可能是一个幸运的情形。根据固态NMR试验，在氟原子邻位的OH基团会导致组分中垂直于芳环的¹⁹F化学位移张量的50ppm的位移，并导致巨大的¹⁹F-CSA(H.Raber等，Chem.Phys.，26，123-130(1977))。然而，使用其他的蛋白质以及使用包含一个对氟苯甲基残基的参考分子也可以观测到类似的情形(数据未示出)。因此，交换项可能所观测的自旋-自旋弛豫有显著的影响。图10所记录的波谱使用了128次扫描且总的测量时间为10分钟。用于优化¹⁹F探测的冷冻探针技术的使用能够进一步地改善其探测范围。然后可以使用浓度低至50至100nM的蛋白质浓度。这将能够对照那些不能以较高量表达的蛋白质(例如，膜蛋白质)筛选大量的化学混合物。可以使用冷冻探针技术非常快速地记录氟波谱。一个保守估计的使用冷冻探针技术的双倍灵敏度改善将使探测时间减少4倍。因此，仅在150s的时间内记录图10的波谱，从而提高了筛选过程的处理量。应当指出的是在氟检测试验中并不存在质子检测试验中所遇到的辐射衰减问题，因为间谍和对照分子的浓度低。

在质子化的溶剂和洗涤剂的存在下的筛选

基于¹⁹F配体的竞争结合实验的一个特别的优点是可以甚至在质子化的溶剂、缓冲剂或洗涤剂的存在下进行筛选。在100mM HEPES和1％甘油的存在下的HSA的质子波谱如图11所示。缓冲剂和甘油的强烈的信号屏蔽了进行筛选所需的参照和对照分子的弱信号。而在¹⁹F检测试验中就不存在这些问题。

因此可能即便在这些困难的试验条件下进行如图11所示的筛选。由于这些特性，基于氟配体的竞争结合筛选实验对于对照溶于SDS(十二烷基磺酸钠)或其他的洗涤剂的膜蛋白质进行的分子的筛选是特别有利的。一旦一种适宜的参照分子被识别了，该基于¹⁹F配体的竞争结合NMR筛选将提供一个可靠的采样。与膜简单结合的分子和洗涤剂以及那些在不同测试中表现为潜在配体的分子在此处所示的¹⁹F试验中将不会被检测到。仅有与参考分子竞争结合的分子才会识别出来。最后，该试验还可被用于植物和真菌提取物的筛选，以及用于活细胞内部分子的筛选。

结论

因此，使用一个包含¹⁹F原子的弱亲并结合配体结合竞争结合实验允许对照蛋白质、DNA或RNA片段快速筛选大量的化学混合物。此外，该方法能够对NMR采样的结合常数进行直接测定。

试验¹⁹F竞争结合HTS试验不存在重叠问题，并且由于¹⁹F核的高灵敏度(是¹H灵敏度的0.83倍)，因此可能快速筛选巨大的化学品或天然产物提取物库。此外，可以在高浓度的非氘代洗涤剂的存在下进行蛋白质溶液的试验，因此，能够试验膜蛋白质进行HTS。此外，由于未使用所筛选的实际分子的共振，仅需要间谍分子和对照分子含有氟残基。因此，基于氟的竞争筛选在制药工业中应具有广泛的用途，并将扩展NMR筛选对于药物发现方法的影响。

该方法是一种快速方法并且仅需要有限量的蛋白质，因此相对于高通量筛选中所试验的其他的非NMR技术，该方法更有效。此外，该方法在单一试验内提供了一个有意义的NMR采样的结合常数值。

由于其不存在重叠现象，因此能够用于筛选来源于组合化学、药物化学或天然产物提取物的大量的化学混合物。还可以使用该方法进行对照溶于不同洗涤剂的膜蛋白质的筛选。最后，预期这些试验可以扩展至一个对照位于活细胞内部的受体的分子的筛选。

这里所引用的专利、专利文献以及出版物的全部公开内容通过全文引用的方式被单独包括在本申请中。在不背离本发明的精神与范围的前提下，对本发明之方法与组合物之各修改以及改变对本领域技术人员将是显而易见的。应了解，本发明不受这里所述的具体实施方案和实施例的过度限制。所给出的这些实施例和具体实施方案仅是对本发明范围的一种举例说明，本发明的范围仅受到如下所述的权利要求的限制。

Claims (20)

1.一种识别靶分子的配体的方法，该方法包括：

提供与靶分子相互作用的¹⁹F-标记参考化合物；

在靶分子的存在下采集¹⁹F-标记参考化合物的1D¹⁹F核磁共振波谱；

提供包含至少一种测试化合物的测试样品；

在各测试样品和靶分子的存在下采集¹⁹F-标记参考化合物的1D¹⁹F核磁共振波谱；

比较在靶分子的存在下该¹⁹F-标记参考化合物的波谱与在各测试样品和靶分子的存在下该¹⁹F-标记参考化合物的波谱，以测定一个或多个该¹⁹F-标记参考化合物共振的变化；和

识别至少一种与靶分子相互作用的测试化合物，其中该测试化合物置换¹⁹F-标记参考化合物。

2.如权利要求1所述的方法，其中测试化合物具有至少与参考化合物一样紧密的结合亲和力。

3.如权利要求1所述的方法，其中一个或多个参考化合物共振中的变化包括在至少一个参考共振中的信号强度的增加。

4.如权利要求1所述的方法，其中识别至少一种测试化合物包括在各靶分子的存在下记录¹⁹F-标记参考化合物的单独的1D¹⁹F核磁共振波谱。

5.如权利要求1所述的方法，该方法进一步包括：

在不同的¹⁹F-标记参考化合物的浓度下，在靶分子的存在下，采集参考化合物的1D¹⁹F核磁共振波谱；和

测定测试化合物的解离常数。

6.如权利要求1所述的方法，该方法进一步包括：

在不同浓度的靶分子的存在下，采集¹⁹F-标记参考化合物的1D¹⁹F核磁共振波谱；和

测定测试化合物的解离常数。

7.如权利要求1所述的方法，其中在采集在用于比较步骤的在靶分子的存在下的¹⁹F-标记参考化合物的核磁共振波谱之前，该方法包括：

在不同浓度的靶分子或在不同浓度的¹⁹F-标记参考化合物的存在下采集¹⁹F-标记参考化合物的1D¹⁹F核磁共振波谱；和

测定识别至少一种与靶分子相互作用的测试化合物的最佳实验条件。

8.如权利要求1所述的方法，其中靶分子是大分子。

9.如权利要求8所述的方法，其中大分子是多肽或多核苷酸。

10.如权利要求8所述的方法，其中大分子是蛋白质。

11.如权利要求1所述的方法，其中该参考化合物在微摩尔范围内的结合亲和力下与靶分子结合。

12.如权利要求11所述的方法，其中参考化合物的结合亲和力是通过等温滴定量热法或荧光光谱法测定的。

13.如权利要求1所述的方法，该方法进一步包括一个识别参考化合物的步骤，该步骤包括：

在不存在靶分子的条件下，采集潜在参考化合物的WaterLOGSY核磁共振波谱；

在靶分子的存在下采集潜在参考化合物的WaterLOGSY核磁共振波谱；和

比较WaterLOGSY波谱以识别潜在参考化合物是否与靶分子相互作用。

14.如权利要求1所述的方法，其中测试样品包括两种或多种测试化合物的混合物。

15.如权利要求14的方法，该方法进一步包括：

在各测试化合物和靶分子的存在下采集¹⁹F-标记参考化合物的1D19F核磁共振波谱；和

比较在靶分子的存在下该参考化合物的波谱与在各测试化合物和靶分子的存在下该参考化合物的波谱，以测定所选择的¹⁹F-标记参考化合物共振的变化。

16.如权利要求1所述的方法，其中测试化合物具有比参考化合物更紧密的结合亲和力。

17.如权利要求1所述的方法，其中：

提供¹⁹F-标记参考化合物包括提供¹⁹F-标记参考化合物和具有规定线宽、振幅和频率的ERETIC信号；

在靶分子的存在下采集¹⁹F-标记参考化合物的1D¹⁹F核磁共振波谱包括在靶分子的存在下采集带有ERETIC信号的¹⁹F-标记参考化合物的波谱；和

在各测试样品和靶分子的存在下采集¹⁹F-标记参考化合物的1D¹⁹F核磁共振波谱包括在各测试样品和靶分子的存在下采集带有ERETIC信号的¹⁹F-标记参考化合物的波谱。

18.如权利要求1所述的方法，其中：

提供¹⁹F-标记参考化合物包括提供¹⁹F-标记参考化合物和¹⁹F-标记无相互作用的化合物；

在靶分子的存在下采集¹⁹F-标记参考化合物的1D¹⁹F核磁共振波谱包括在靶分子的存在下采集¹⁹F-标记参考化合物和¹⁹F-标记无相互作用的化合物的波谱；和

在各测试样品和靶分子的存在下采集¹⁹F-标记参考化合物的1D¹⁹F核磁共振波谱包括在各测试样品和靶分子的存在下采集¹⁹F-标记参考化合物和¹⁹F-标记无相互作用的化合物的波谱。

19.一种筛选化合物以识别靶分子的配体的方法，该方法包括：

采集至少一种测试化合物的第一1D¹⁹F核磁共振波谱；

将至少一种测试化合物暴露于靶分子；

采集至少一种已经暴露于靶分子的测试化合物的第二1D¹⁹F核磁共振波谱；和

比较该第一和第二波谱以测定一个或多个共振的变化，并识别至少一种与靶分子相互作用的测试化合物。

20.如权利要求1所述的方法，其中提供测试样品包括提供多个测试样品，各测试样品包括至少一种测试化合物。

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