KR20050008788A

KR20050008788A - 고처리량 스크리닝을 위한 불소 ｎｍｒ의 용도

Info

Publication number: KR20050008788A
Application number: KR10-2004-7019714A
Authority: KR
Inventors: 클라우디오 달비트; 브라이언 제이. 스톡만; 마리아 플로코; 마리나 베로네시
Original assignee: 파마시아 앤드 업존 캄파니 엘엘씨
Priority date: 2002-06-05
Filing date: 2003-06-05
Publication date: 2005-01-21
Also published as: EP1511852A4; EP1511852A2; DE60332727D1; AU2003243406A1; CN1668757A; WO2004051214A3; IL165527A0; CA2488473A1; NO20045487L; US20040091937A1; CA2488473C; EP1511852B1; JP2005536763A; ATE469238T1; WO2004051214A2

Abstract

¹⁹F 검출을 사용하는 경쟁 결합 실험을 사용한 고 처리량 리간드-계 NMR 스크리닝.

Description

고처리량 스크리닝을 위한 불소 ＮＭＲ의 용도 {USE OF FLUORINE NMR FOR HIGH THROUGHPUT SCREENING}

본 출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함되며, 2003년 3월 14일 출원된 미국 가출원 제60/454,766호의 우선권을 주장한다.

현재 시장의 많은 약물들이 고처리량 스크리닝 (HTS)으로부터 동정된 선도물질로부터 개발되었다. HTS에서 사용된 치료법적 관심의 표적은 종종 다른 방식으로 발현될 수 있는 복제된 유전자로부터 생성된 재조합형 단백질이다. 큰 화합물의 컬렉션이 억제제의 동정을 위한 이들 단백질에 대해 통상적으로 스크리닝된다.

지난 10년동안, 특허(proprietary) 화합물 컬렉션의 크기는 조합 화학의 다른 프로젝트에의 체계적인 적용의 결과로 기하급수적으로 증가하였다. 현재 조합 화학은 종래의 의약 화학 및 천연 공급원으로부터 가용한 다른 화합물 라이브러리를 보충하는 다수의 화합물 라이브러리를 발생시키고 있다. 로보틱스 및 자동화의 개발과 적용은 단기간에 다수의 화합물을 시험하는 것을 가능하게 하였다. 몇몇의 신규한 검출 시스템이 잠재적인 선도 분자의 동정을 위해 사용되고 있다.

최근에는, 핵자기 공명 (NMR)이 제약적인 관심이 있는 표적물과 상호작용하는 소분자의 검출을 위한 강력한 방법으로서 등장했다. NMR이 민감한 기술은 아니지만, 다른 검출 시스템에서 관찰되는 인공물 (artifact)을 덜 필요로 한다는 장점을 가진다. 최근의 극저온 NMR 탐침 (probe) 기술의 개발은 스크리닝을 위해 필요한 단백질의 양 또는 시간을 감소시켰다.

NMR 방법은 동위원소 표지된 단백질에 대해 다수의 화합물 컬렉션을 스크리닝하기 위해 사용되어왔다. 표적 단백질의¹⁵N-¹H HSQC 스펙트럼에서 교차 피크의 화학적 쉬프트 변화가 화합물의 혼합물 존재 하에서 모니터링되었다. 이어서 혼합물의 해체해석 (deconvolution)은 단백질 (즉, 화학적 쉬프트의 변화에 대한 원인이 되는 화합물)과 상호작용하는 분자를 동정하게 한다. 단백질의 3차원적 구조가 공지되어 있고 단백질 골격 공명의 서열 특정 NMR 할당값이 얻어졌을 때, 상기 방법은 리간드 결합 부위 및 리간드 결합 모드의 중요한 구조적 정보를 제공한다.

NMR 스크리닝을 수행하는 또다른 방법은 리간드 공명의 검출에 기반한 것이다. 몇몇 NMR 인자들이 리간드 동정을 위한 도구로서 문헌에 제안되어왔다. 이들 방법론은 스크리닝된 혼합물의 신속한 해체해석을 가능하게 하고, 중간 내지 저친화력 리간드의 동정에 특히 적합하다.

그러나, 이들 기술은 몇가지 단점을 나타낸다. 첫째로, 결합 부위에 관하여 어떤 구조적 정보도 직접적으로 얻을 수 없다. 둘째로, 수용체에 공유적으로 결합하는 고친화력 리간드 및 분자는, 이들 실험에 통상적으로 사용된 단백질에 대해 다수의 과량의 시험 화합물 때문에 검출이 되지 않는다. 이는 낮은 반응속도를 갖는 단백질 또는 화합물에 더 강하게 상호작용하는 화합물은, 단백질 내에서의 이들 화합물의 체류 시간이 NMR 실험에 사용된 혼합 시간 (예를 들면 1 내지 2초)의 범위 보다 길기 때문에 검출되지 않을 것이라는 것이다. 셋째, 잠재 리간드이며 용해도가 낮은 화합물은, 이 방법이 리간드 신호의 관찰을 요구하기 때문에 검출하기 어렵다.

따라서, 필요한 것은 통상적인 리간드-관찰된 스크리닝 실험과 관련된 단점 없이, 단백질과 같은 표적 분자에서의 리간드를 검출하기 위해 사용될 수 있는 추가적인 NMR 방법이다.

도 1.¹⁹F 라모르 주파수의 함수로서의, 큰 거대 분자에 결합될 때 용액중 유리된 소분자의¹⁹F신호의 CSA 상호작용으로 인한 선폭의 차이. 이 시뮬레이션은, 100 ppm의¹⁹F CSA를 갖는 축방향의 대칭적인 CSA 텐서와 용액중에 유리되었을 때 소분자에 대해 200 ps의 τ_c의 상관 시간을 가정하고서 수학식 1의 마지막 기간(last term)을 사용하여 수행하였다. 거대 분자의 다른 크기에 대응하는 거대 분자의 다른 상관 시간이 고려되었다 (커브로 나타낸 값). 수직 은선은 시판가능한 몇 분광기를 나타내고 있다. 이들 분광기의¹H 라모르 주파수에 대응하는 값은 수직 선으로 나타내고 있다.

도 2. p21 활성화 키나제의 약한 친화력 리간드 화합물 A (K_D=10 μM)의 50 μM로 수행된 NMR 스크리닝 및 해체해석. 기준 분자는 6원 방향족 고리에 결합된 CF₃기를 함유한다. 화학적 쉬프트는 TFA를 기준으로 하였다. 두 스펙트럼은 스핀-에코 스킴을 가지지 않고 기록되거나 (좌측), τ=0.1로 스핀-에코 스킴을 가지고 기록되었다 (우측). 스파이 분자 단독으로 (a), 20μM의 7가지 화합물의 혼합물 (분자 스펙스 AB-323/25048456 (스펙스 (리즈위크, 네덜란드 소재)에 의해 공급됨), 에틸 2-퀴녹살린카르복실레이트, 메틸 이소퀴놀린-3-카르복실레이트, 7-페닐-4-프테리디놀, 2-아미노-6-메틸퀴나졸린-4-올, 5-메틸벤지미다졸 및 화합물 B의 존재 하에서 (b), 화합물 B없는 화학 혼합물의 존재 하에서 (c), 단지 화합물 B만의 존재 하에서 (d), 단백질 1.5 μM의 존재 하에서 스펙트럼이 획득되었다. 단백질 부재하에서 PBS에서 기준 화합물의 스펙트럼이 (e)에 도시되어 있다. 3.1초의 반복 시간으로 총 128 스캔이 각 실험마다 획득되었다.

도 3. p21 활성화 키나제 및 비-상호작용성 트리플루오로아세트산 (TFA) 분자에 대한 약-친화력 리간드 화합물 A의 존재 하에 기록된 1차원적¹⁹F 스펙트럼. 화학적 쉬프트는 TFA를 기준으로 하였다. 3.1초의 반복 시간으로 총 128 스캔이 각 실험마다 획득되었다. 화합물 A 및 TFA의 농도는 각각 50, 15 μM이었다. 스펙트럼은 단백질의 부재하 (a) 및 약 1.5 μM 존재 하 (b)에서 기록되었다. 스펙트럼 (c)는 두 스펙트럼 (a) 및 (b)의 차이에 대응한다. 스펙트럼 차에 존재 하는 신호는 스파이 분자로부터만 발생한다.

도 4. p21 활성화 키나제 및 비-상호작용성 트리플루오로아세트산 (TFA) 분자에 대한 약-친화력 리간드 화합물 A의 존재 하에 기록된 1차원적¹⁹F 스펙트럼으로 수행된 HTS 및 해체해석. 화학적 쉬프트는 TFA를 기준으로 하였다. (a-d) 50μM의 화합물 A 및 15 μM의 TFA로 수행된 NMR 스크리닝 및 해체해석. (a) 단백질의 부재하에 기록된 스펙트럼, (b-d) 단백질 1.5 μM의 존재 하에서 기록된 스펙트럼.(b) 혼합물의 부재하에서 기록된 스펙트럼, (c) 20 μM의 6가지 화합물의 혼합물 (분자 스펙스 AB-323/25048456, 에틸 2-퀴녹살린카르복실레이트, 메틸 이소퀴놀린-3-카르복실레이트, 7-페닐-4-프테리디놀, 2-아미노-6-메틸퀴나졸린-4-올, 5-메틸벤지미다졸)의 존재 하에서 기록된 스펙트럼, (d) 20 μM의 화합물 B를 첨가한 동일한 화학 혼합물의 존재 하에서 기록된 스펙트럼. 경쟁 분자 화합물 B의 존재는 단백질 (d)로부터 기준 화합물의 거의 완전한 치환이 생기게 하며, 스펙트럼은 PBS 중 2개의 분자에 대한 스펙트럼 (a)과 유사하다.

도 5. MDDR 라이브러리 안에 F 원자 함유 분자의 비율. 검색은 1981년부터 2000년까지 5년 간격으로 수행되었다. 각 간격의 비율은 상기의 막대에 의해 나타내어 있다.

도 6. HSA 농도의 함수로 기록된¹⁹F 스핀-에코 스펙트럼. 컨트롤 분자 (2)의 CF₃공명은 +15.46 ppm에 있으며, 스파이 분자(1)의 CF₃공명은 +14.62 ppm에 있다. 스펙트럼은 40 ms의 180˚펄스 (2τ)사이의 간격을 갖는 320 ms의 총 스핀-에코 기간으로 획득되었다. 3.5초의 반복 시간 및 25 ppm의 스펙트럼 폭으로 총 96 스캔이 각 스펙트럼에 대해 획득되었다. 데이터는 후리에 (Fourier) 트랜스포메이션하기 전에 1 Hz의 지수 함수로 곱해졌다. 두 분자의 농도는 25 μM이었고, HSA의 농도는 상측에서 하측으로, 0, 300, 500, 700, 및 900 nM이었다. 신호 강도 비 I(1)/I(2)는 상측에서 하측으로 0.86, 0.66, 0.38, 0.21 및 0.07 이다.

도 7. HSA 농도의 함수로 기록된¹⁹F 스핀-에코 스펙트럼. 기준 분자 (3)의CF₃공명은 -64.06 ppm (하측 스펙트럼)에 있으며, 컨트롤 분자(2)의 CF₃공명은 +15.46 ppm (상측 스펙트럼)에 있다. 스펙트럼은 40 ms의 180˚펄스 (2τ)사이의 간격을 갖는 80 ms의 총 스핀-에코 기간으로 획득되었다. 3.5초의 반복 시간 및 25 ppm의 스펙트럼 폭으로 총 96 스캔이 하측 스펙트럼에 대해 기록되고, 총 64 스캔이 상측 스펙트럼에 대해 기록되었다. 데이터는 후리에 (Fourier) 트랜스포메이션하기 전에 1 Hz의 지수 함수로 곱해졌다. (3)과 (2) 농도는 각각 50 μM, 25 μM이었고, HSA의 농도는 좌측에서 우측으로, 0, 150, 300, 450, 및 600 nM이었다. 기입된 눈금 강도에서의 신호 강도 비 I(3)/I(2)는 좌측에서 우측으로 0.94, 0.69, 0.53, 0.36 및 0.25 이다.

도 8. 결합된 기준 분자의 비율 ([EL]/[L_TOT])을 y축으로, 도 7의 두¹⁹F 신호의 신호 강도 비를 x축으로 한 그래프. 맨 우측 점은 단백질의 부재하의 값에 해당한다. 두 비율 ([EL]/[L_TOT])은 (3)에 대한 41 ± 3.3 μM의 ITC-유도된 K_D값의 한계를 사용하여 이전에 기술한 바와 같이 계산되었다. 원에 의해 나타내어진 값은 44.3 μM의 K_D로 계산되었고, 사각형으로 나타내어진 값은 37.7 μM으로 계산되었다. 커브는 실험 점의 가장 잘 맞는 피트 (fit)를 나타낸다.

도 9. 컨트롤 분자 (2) (상측) 및 스파이 분자 (3) (하측)로 수행된¹⁹F NMR 스크리닝. 스펙트럼은 40 ms의 180˚펄스 (2τ)사이의 간격을 갖는 160 ms의 총 스핀-에코 기간으로 기록되었다. 3.5초의 반복 시간 및 25 ppm의 스펙트럼 폭으로 총 96 스캔이 기록되었다. 데이터는 후리에 트랜스포메이션하기 전에 1 Hz의 지수 함수로 곱해졌다. (3)과 (2)의 농도는 각각 50 μM, 25 μM이었다. 좌측의 스펙트럼은 단백질의 부재하에 기록되었지만, 다른 모든 스펙트럼은 600 nM HSA의 존재 하에 기록되엇다. 후자는 화학 혼합물의 부재하 (좌측에서 두번째), 50 μM 5-CH₃D, L Trp, 수쿠로오스의 존재 하 (좌측에서 세번째), 50 μM 5-CH₃D, L Trp, 수쿠로오스 및 25 μM의 (4)의 존재 하에서 (우측) 기록되었다.

도 10.¹⁹F NMR 스크리닝의 검출 한계. 실험은 컨트롤 분자 (2) (상측) 및 스파이 분자 (3)로써 수행하였다. 스펙트럼은 40 ms의 180˚펄스 (2τ)사이의 간격을 갖는 320 ms (상측) 및 1.2 s (하측)의 총 스핀-에코 기간으로 기록되었다. 3.5초의 반복 시간 및 25 ppm의 스펙트럼 폭으로 총 64 (상측) 및 128 (하측) 스캔이 기록되었다. 데이터는 후리에 트랜스포메이션하기 전에 1 Hz의 지수 함수로 곱해졌다. (3)과 (2)의 농도는 각각 50 μM, 25 μM이었다. 좌측의 스펙트럼은 단백질의 부재하에 기록되었지만, 다른 모든 스펙트럼은 150 nM HSA의 존재 하에 기록되었다. 후자는 화학 혼합물의 부재하 (좌측에서 두번째), 25 μM의 (4)를 함유하는 혼합물의 존재 하에서 (우측) 기록되었다.

도 11. 비-중수소화된 버퍼 및 세제의 존재 하에 수행된¹⁹F NMR 스크리닝. (상측) 100 mM HEPES 중 1% 글리세롤 및 HSA의 600 nM 용액의, 스파이 분자(3)의 50 μM 및 컨트롤 분자 (2)의 25 μM의 존재 하에서의 양자 스펙트럼. 워터-서프레션 (water supression) 후, 단지 가시한 신호는 버퍼 및 글리세롤의 것들이다.2.7초의 반복 시간으로 총 128 스캔이 기록되었다. (하측) 혼합물의 부재하에서 (좌측에서 첫번째 및 세번째), 그리고 25 μM의 (4)를 함유하는 혼합물의 존재 하에서 (좌측에서 두번째 및 네번째) 동일한 용액에 대해 기록된¹⁹F 스펙트럼. 스펙트럼은 40 ms의 180˚펄스 (2τ)사이의 간격을 갖는 160 ms의 총 스핀-에코 기간으로 기록되었다. 3.5초의 반복 시간 및 25 ppm의 스펙트럼 폭으로 총 64 (좌측) 및 128 (우측) 스캔이 기록되었다. 데이터는 후리에 트랜스포메이션하기 전에 1 Hz의 지수 함수로 곱해졌다.

도 12. 화합물 1-4의 구조.

발명의 요약

본 발명은 합리적인 약물 설계에 관한 것이다. 구체적으로는, 본 발명은 표적 분자 (예를 들면, 통상적으로 단백질)과 상호작용하는 화합물에 대한 스크리닝의 핵자기 공명 (NMR) 방법을 제공한다. 본 방법은 결합 상호작용을 검출하기 위해¹⁹F NMR, 특히¹⁹F NMR 경쟁 결합 실험의 사용을 포함한다.

경쟁 결합 실험은 경쟁 분자의 존재 하에서 기준 화합물의 치환을 포함한다. 바람직하게는, 기준 화합물은 마이크로몰 범위에서 결합 친화력을 갖는 표적 분자에 결합한다. 1 마이크로몰 보다 약한 (즉, 더 많은) 결합 친화력을 갖는 화합물 결합도 본 발명의 방법을 사용하여 평가될 수 있지만, 바람직하게는 시험 화합물은 1 마이크로몰보다 강한 (예를 들면 나노몰 범위) 결합 친화력을 갖는 표적 분자와 상호작용한다.

본 방법론 (특히 경쟁 결합 실험을 포함할 때)은 통상적인 리간드-관찰된 스크리닝 실험과 관련된 단점 없이 적절하게 셋업된 경쟁 결합 실험에 기반한 효과적인 고처리량 스크리닝 (HTS)를 수행하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 본 방법은 단일 포인트 측정을 사용하여 동정된 리간드의 K_D의 추정을 제공한다. 이 접근법으로서, 예를 들면 단백질 또는 DNA 및 RNA 단편에 대해 단기간에 수천개의 화합물을 스크리닝하는 것이 가능하다.

본 발명은 또한 식물 및 균류 추출물과 같은 화학 혼합물 (즉, 2개 이상의 시험 화합물의 혼합물)의 신속한 스크리닝을 위한 유용한 응용처를 찾을 수 있다. 신속한 스크리닝 기술은 통상적으로, 다수의 시험 샘플을 제공하는 것을 포함하며 여기서 각 시험 샘플은 2개 이상의 시험 화합물의 혼합물을 포함한다.

본 발명의 방법은 적어도 다음 단계를 사용하여 표적 분자에 리간드를 동정하는 것을 포함한다: 표적 분자와 상호작용하는¹⁹F 표지된 기준 화합물을 제공하는 단계; 표적 분자의 존재 하에서¹⁹F 표지 기준 화합물의 1D¹⁹F 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하는 단계; 하나 이상의 시험 화합물을 포함하는 시험 샘플 (바람직하게는 다수의 시험 샘플)을 제공하는 단계; 각 시험 샘플 및 표적 분자의 존재 하에서¹⁹F 표지 기준 화합물의 1D¹⁹F 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하는 단계; 표적 분자의 존재 하의¹⁹F 표지 기준 화합물의 스펙트럼을, 각 시험 샘플 및 표적 분자의 존재 하의¹⁹F 표지 기준 화합물의 스펙트럼과 비교하여¹⁹F 표지 기준 화합물 공명 중 하나 이상에서의 변화를 측정하는 단계; 및 표적 분자와 상호작용하며¹⁹F 표지 기준 화합물을 변위시키는 하나 이상의 시험 화합물을 동정하는 단계. 시험 화합물 (즉, 잠재 리간드)는, 리간드가 표적 분자로부터 기준 화합물을 치환하는 경우 리간드이다.

바람직하게는 본 발명의 방법은, 표적 분자의 부재하에서 잠재 기준 화합물의 워터로그시 (WaterLOGSY) 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하는 단계; 표적 분자의 존재 하에서 잠재 기준 화합물의 워터로그시 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하는 단계; 및 워터로그시 스펙트럼을 비교하여 잠재 기준 화합물이 표적 분자와 상호작용하는지 여부를 밝히는 단계를 포함하는 기준 화합물을 동정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 방법의 특정한 실시양태에 대해, 기준 화합물은 정의된 선폭, 진폭, 및 빈도를 갖는 에레틱 (ERETIC) 신호와 함께 제공된다. 이들 방법을 위해, 표적 분자의 존재 하에¹⁹F-표지 기준 화합물의 1D¹⁹F 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하는 것은, 표적 분자의 존재 하에 에레틱 신호를 갖는¹⁹F-표지 기준 화합물의 스펙트럼을 수집하는 것을 포함하며; 그리고 각 시험 샘플 및 표적 분자의 존재 하에¹⁹F-표지 기준 화합물의 1D¹⁹F 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하는 것은 각 시험 샘플 및 표적 분자의 존재 하에 에레틱 신호를 갖는¹⁹F-표지 기준 화합물의 스펙트럼을 수집하는 것을 포함한다.

본 발명의 방법의 특정 실시양태에 대해서는,¹⁹F-표지 기준 화합물은¹⁹F-표지 비-상호작용성 화합물과 함께 제공된다. 이들 방법을 위해, 표적 분자의 존재 하에¹⁹F-표지 기준 화합물의 1D¹⁹F 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하는 것은 표적 분자의 존재 하에¹⁹F-표지 기준 화합물 및¹⁹F-표지 비-상호작용성 화합물의 스펙트럼을 수집하는 것을 포함하며; 그리고 각 시험 샘플 및 표적 분자의 존재 하에¹⁹F-표지 기준 화합물의 1D¹⁹F 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하는 것은 각 시험 샘플 및 표적 분자의 존재 하에¹⁹F-표지 기준 화합물 및¹⁹F-표지 비-상호작용성 화합물의 스펙트럼을 수집하는 것을 포함한다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 리간드를 표적 분자에 동정하기 위한 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 상기 방법은, 하나 이상의 시험 화합물의 제1 1D¹⁹F 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하는 단계; 표적 분자에 상기 하나 이상의 시험 화합물을 노출시키는 단계; 표적 분자에 노출된 하나 이상의 시험 화합물의 제2 1D¹⁹F 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하는 단계; 및 제1 및 제2 스펙트럼을 비교하여 하나 이상의 공명에서의 변화를 측정하고 표적 분자와 상호작용하는 하나 이상의 시험 화합물을 동정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 도시적인 실시양태의 상세한 설명

본 발명은¹⁹F NMR, 특히¹⁹F NMR 경쟁 결합 실험의 용도에 관한 것이다. 이는, 본 발명이¹⁹F 실험을 사용한 리간드-계 스크리닝 (바람직하게는, 경쟁 스크리닝)에 관한 것이라는 것이다. 불소-19의 검출은 이 실험에서 양자 검출에 비해 많은 장점을 가진다.

불소는, 단백질에 결합될 때 리간드 신호의¹⁹F 횡축 이완 (transverse relaxation)에 대한 상당한 화학적 쉬프트 비등방성 (CSA)에 대한 기여도 때문에 이들 시험에 대한 바람직한 핵종이다. 이는¹⁹F 횡축 이완에 대한 CSA 기여가 불소 신호를 표적과 착물 형성의 효과에 특히 감응성이 되게 한다.¹⁹F 원자를 함유하는 저친화력 내지 중간 친화력 리간드가 신규 리간드의 검출 및 특성 기술을 위한 기준 분자로서 사용될 수 있다. 또한 불소의 검출은, 다수의 시험될 화합물이 불소 원자를 함유하지 않을 것이기 때문에, 양자 (¹H) NMR에서 발생하는 스펙트럼 중첩 문제를 상당히 감소시키거나 심지어 제거한다. 양자 NMR과 같이¹⁹F-NMR도 신속한 데이터 수집이 가능하고, 고도 민감성이어서 다수의 화합물 라이브러리의 고처리량 스크리닝을 가능하게 한다. 불소는 빈번히 생물학적 활성 화합물의 약물동력학적 특성을 개선시키기 위한 약물-설계 노력에서 사용된다. 가용 화학적 디렉토리 스크리닝 화합물 (ACD-SC)을 포함하는 분자의 약 12%가 불소 원자를 함유하기 때문에, 경쟁 스크리닝을 위한 기준 화합물은 통상적으로 화학적 합성에 대한 의뢰없이 얻어질 수 있다. 사실, 플루오로벤젠 및 트리플루오로메틸벤젠 기는 각각 약 150,000 및 약 40,000 분자에서 발견된다.

경쟁 결합 실험은 경쟁 분자의 존재 하에 기준 화합물을 치환하는 것을 포함한다. 바람직하게는 기준 화합물은 마이크로몰 범위에서 결합 친화력을 갖는 표적 분자와 결합한다. 1 마이크로몰 보다 약한 (즉, 그 초과인) 결합 친화력을 갖는 화합물 결합도 또한 본 발명의 방법을 사용하여 평가될 수 있기는 하지만, 시험 화합물은 바람직하게는 1 마이크로몰 보다 큰 (즉, 그 미만인) (예를 들면 나노몰 범위)인 결합 친화력을 갖는 표적 분자에 결합된다.

본원에 기재된 방법이 표적 분자에 상대적으로 강한 결합제인 리간드를 동정하는데 특히 유용하기는 하지만, 그들은 다양한 범위의 결합 친화력의 리간드를 동정하는데 유용할 수 있다. 상대적으로 강한 결합제는 약 1 마이크로몰 미만, 바람직하게는 약 500 nM미만, 더 바람직하게는 약 100 nM미만의 해리 결합 상수 K_D를 갖는 것들로서 통상적으로 정의된다.

경쟁 결합 실험은 수용성 버퍼에서 고도로 가용성인 화합물의 라이브러리를 스크리닝하는데에 국한되지 않는다. 통상적으로 단지 기준 화합물만이 수용성일 필요가 있으며, 제한된 용해도를 갖는 화합물도 또한 기준 화합물의 신호 상에 대한 간접 효과에 의해 검출될 수 있다. 기준 분자 (그 역할로 인해 스파이 분자로 지칭됨)는 스크리닝될 혼합물의 분자 및 수용체와 기준 분자의 가능한 비-특정적인 상호작용으로부터 발생하는 인공물 (artifact)을 피하기 위해 일반적으로 수용성이다. 기준 분자로써의 NMR 적정 실험은 통상적으로 처음에는 다른 리간드 농도 및 고정된 단백질 농도에서 수행하거나, 또는 고정된 리간드 농도 및 다른 단백질 농도에서 수행한다 (문헌 [C. Dalvit et al., J. Am. Chem. Soc., 124, 7702-7709 (2002)]참조). 이들 실험은 스크리닝 셋업 조건의 최적화를 위해서, 그리고 단일 포인트 측정으로부터 동정된 NMR 히트의 결합 상수를 유도하기 위해 사용된다. 강한 리간드는 스파이 분자 상의 그 큰 효과로 인해 쉽게 동정된다. 그러나, 현재의¹H NMR 경쟁 스크리닝 방법의 하나의 한계는, 특히 거대한 화학 혼합물이 스크리닝될 때 기준 화합물 및 시험 화합물 사이에 스펙트럼 중첩이 발생한다는 점에 의해 나타낼 수 있다. 다른 핵종 (예를 들면¹⁹F)의 NMR 검출에의 사용은 이 문제를 상당히 감소시킨다.

본 발명은 표적 분자와 상호작용하는 리간드를 동정하는 다양한 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서, 본 방법은 표적 분자에 리간드를 동정하기 위한 화합물을 스크리닝하는 것을 포함한다. 본 방법은, 하나 이상의 시험 화합물의 제1 1D¹⁹F 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하는 단계; 하나 이상의 시험 화합물을 표적 분자에 노출시키는 단계; 표적 분자에 노출된 하나 이상의 시험 화합물의 제2 1D¹⁹F 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하는 단계; 및 제1 및 제2 스펙트럼을 비교하여 하나 이상의 공명에서의 변화를 측정하고 표적 분자와 상호작용하는 하나 이상의 시험 화합물을 동정하는 단계를 포함한다.

특정 실시양태에서, 다음 단계가 사용된다: 표적 분자와 상호작용하는¹⁹F-표지 기준 화합물을 제공하는 단계; 표적 분자의 존재 하에¹⁹F-표지 기준 화합물의 1D¹⁹F 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하는 단계; 각 샘플이 하나 이상의 시험 화합물을 포함하는, 하나 이상의 시험 샘플 (바람직하게는 다수의 시험 샘플)을 제공하는 단계; 각 시험 샘플 및 표적 분자의 존재 하에¹⁹F 표지 기준 화합물의 1D¹⁹F 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하는 단계; 표적 분자의 존재 하에서의¹⁹F-표지 기준 화합물의 스펙트럼을, 각 시험 샘플 및 표적 분자의 존재 하에서의¹⁹F-표지 기준 화합물의 스펙트럼에 비교하여¹⁹F-표지 기준 화합물 공명 중 하나 이상에서의 변화를 측정하는 단계; 및 표적 분자와 상호작용하는 하나 이상의 시험 화합물을 동정하며, 여기서 시험 화합물이¹⁹F-표지 기준 화합물을 치환하는 단계 (통상적으로 이는 시험 화합물이 적어도 기준 화합물만큼 강한 결합 친화력을 갖기 때문에 발생한다).

통상적으로,¹⁹F-표지 기준 화합물 공명 중 하나 이상에서의 변화는 하나 이상의 기준 공명에서 신호 강도의 증가를 포함한다. 바람직하게는,¹⁹F-표지 기준 화합물 공명 중 하나 이상에서의 변화는 하나 이상의 기준 공명을 강하게 하는 것(sharpening)을 포함한다.

필요한 경우,¹⁹F 스펙트럼의 획득 (acquisition) 전에, 스핀-에코 타입 필터가 실시예 부분에서 기재한 바와 같이 사용될 수 있다.

본원에 기재된 임의의 방법에 대한 최적 실험 조건은 실시예 부분에서 기재한 바와 같이 결정될 수 있다. 구체적으로는, 이는 비교 단계에서 사용하기 위한 표적 분자의 존재 하에서의¹⁹F-표지 기준 화합물의 1D¹⁹F 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하기 전에 수행될 다음 단계를 통상적으로 포함한다: 표적 분자의 다른 농도 또는¹⁹F-표지 기준 화합물의 다른 농도에서 표적 분자의 존재 하에서¹⁹F-표지 기준 화합물의 1D¹⁹F 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하는 단계. 수집된 정보는 표적 분자와 상호작용하는 하나 이상의 시험 화합물을 동정하기 위한 최적 시험 조건을 결정하기 위해 사용된다.

다양한 펄스 서열이 각 시험 샘플 및 표적 분자의 존재 하에서¹⁹F-표지 기준 화합물의 1D¹⁹F NMR 스펙트럼을 수집할 때 사용될 수 있다. 스펙트럼의 효과적인 비교를 위해, 동일한 실험 조건을 갖는 것이 바람직하다; 그러나 적정 실험을 갖는 그래프가 스크리닝 전에 생성되었다면 표적 화합물 및¹⁹F-표지 기준 분자 농도는 변경될 수 있다. 일반적으로 온도 및 버퍼 조건은, 이들 실험조건에서의 변화가 기준 화합물의 결합 상수에 영향을 줄 수 있기 때문에 동일하다.

2종 이상의 시험 화합물의 혼합물을 위해 상기 일반화된 방법에서, 하나 이상의 시험 화합물을 동정하는 것이 바람직하게는 각 시험 화합물 및 표적 분자의 존재 하에서¹⁹F-표지 기준 화합물의 분리된 1D¹⁹F 핵자기 공명 스펙트럼을 기록하는 것을 포함할 수 있다. 이는 이어서 표적 분자의 존재 하에서의¹⁹F-표지 기준 화합물의 스펙트럼을, 각 시험 화합물 및 표적 분자의 존재 하에서의¹⁹F-표지 기준 화합물의 스펙트럼에 비교하여 선택된¹⁹F-표지 기준 화합물 공명에서의 변화를 측정하게 된다. 이들 실험의 펄스 서열은 일반적으로 동일하다. 그러한 실험은 통상적으로 해체해석 실험으로 당업계의 숙련자에게 지칭된다.

시험 화합물 및(또는) 기준 화합물의 해리 상수 (즉, 결합 친화력)는 필요한 경우, 다른 공지 기술 (예를 들면 등온 적정 열량계)도 물론 사용될 수 있지만 NMR 기술을 사용하여 측정될 수 있다. 바람직하게는 기준 화합물 결합 친화력은, 당업계의 숙련자에게 그 구체적인 상세한 부분이 공지되고 실시예 부분에 기술되어 있는 등온 적정 열량계 또는 형광 분광법을 사용하여 평가될 수 있다.

예를 들면, NMR-계 방법에서, 일반화 방법에서의 상기 열거된 단계에 부가하여,¹⁹F-표지 기준 화합물의 다른 농도에서 표적 분자의 존재 하에서의¹⁹F-표지 기준 화합물의 1D¹⁹F 핵자기 공명 스펙트럼을 수집할 수 있다. 다르게는, 또는 부가적으로는, 표적 분자의 다른 농도에서 표적 분자의 존재 하에서,¹⁹F-표지 기준 화합물의 1D¹⁹F 핵자기 공명 스펙트럼이 수집될 수도 있다. 이 정보는 실시예에 기술한 바와 같이 시험 화합물의 해리 상수를 결정하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 임의의 방법의 정밀도를 높이기 위해, 다양한 방법이 사용될 수 있다. 통상적으로 비-상호작용성 화합물일 수 있는 내부적 컨트롤제가 사용될 수 있다.

비-상호작용성 분자의 사용과 다른 방법으로, 에레틱 방법 (문헌 [S. Akoka et al., Anal. Chem., 71, 2554-2557 (1999); 및 V. Silvestre et al., S. Anal. Chez., 73, 1862-1868 (2001)] 참조)의 사용이 있다. 이 기술은 정의된 빈도, 선폭 및 진폭의 신호를 전기적 발생시키는 것에 의존한다. 의사-FID가 샘플로부터 발생하는 FID와 함께 획득된다. 인공적 신호의 진폭이 단백질의 부재하에서 기록된 기준 화합물의 신호 강도에 비교할 만하게 되도록 조절된다. 이 진폭 값은 이어서 적정 및 NMR-스크리닝 실험에 대해 사용되며, 리얼 (real) 및 인공적 신호의 신호 강도 비가 측정된다. 에레틱 신호를 첨가하는 것은 신호를 정규화하기 위해 가신호 (fake signal)을 첨가하는 것과 같다.

본 발명의 방법의 특정 실시양태에 대해, 기준 화합물이, 정의된 선폭, 진폭 및 진도를 갖는 에레틱 신호와 함께 제공된다. 이들 방법을 위해, 표적 해자의 존재 하에서¹⁹F-표지 기준 화합물의 1D¹⁹F 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하는 것은, 표적 분자의 존재 하에서 에레틱 신호를 갖는¹⁹F-표지 기준 화합물의 스펙트럼을수집하는 것을 포함하며; 그리고 각 시험 샘플 및 표적 분자의 존재 하에서¹⁹F-표지 기준 화합물의 1D¹⁹F 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하는 것은 각 시험 샘플 및 표적 분자의 존재 하에서 에레틱 신호를 갖는¹⁹F-표지 기준 화합물의 스펙트럼을 수집하는 것을 포함한다.

본 발명의 방법의 특정 실시양태에 대해,¹⁹F-표지 기준 화합물이¹⁹F-표지 비-상호작용성 화합물과 함께 제공된다. 이들 방법을 위해, 표적 분자의 존재 하에서의¹⁹F-표지 기준 화합물의 1D¹⁹F 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하는 것은 표적 분자의 존재 하에서¹⁹F-표지 비-상호작용성 화합물 및¹⁹F-표지 기준 화합물의 스펙트럼을 수집하는 것을 포함하며; 그리고 각 시험 샘플 및 표적 분자의 존재 하에서¹⁹F-표지 기준 화합물의 1D¹⁹F 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하는 것은 각 시험 샘플 및 표적 분자의 존재 하에서¹⁹F-표지 비-상호작용성 화합물 및¹⁹F-표지 기준 화합물의 스펙트럼을 수집하는 것을 포함한다. 그러한 비-상호작용성 화합물은 평가된 농도에서 그들이 표적 분자에 결합하지 않는다는 점에서, 컨트롤제로 작용한다.

본 발명의 경쟁 결합 실험과 함께, 당업계의 숙련자에게 공지된 분광 분석 또는 생화학적 분석과 같은 다른 방법뿐만 아니라 워터로그시 방법 (워터로그시)은 기준 화합물을 동정하기 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는 기준 화합물은 다음 단계에 의해 동정될 수 있다: 표적 분자의 부재하에 잠재 기준 화합물의 워터로그시 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하는 단계; 표적 분자의 존재 하에서 잠재 기준 화합물의 워터로그시 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하는 단계; 및 워터로그시 스펙트럼을 비교하여 표적 분자와 잠재 기준 화합물이 상호작용하는지 여부를 동정하는 단계.

워터로그시 방법 (또한 구배 분광법 Y를 통해 관찰된 물-리간드로서도 지칭됨)은, 벌크 물의 양자로부터 표적 분자 (예를 들면 단백질)와 상호작용하는 화합물의 양자까지의 자기화의 전달에 기반한 것이다. 워터로그시 기술을 사용하여, 결합 화합물은 물-리간드 핵 오버하우저 효과 (NOE)의 반대 부호 (opposite sign)에 의해 비결합제와 구별된다. 워터로그시 방법은 2002년 4월 5일 공개된 국제 공개 번호 WO 01/23330, 문헌[C. Dalvit et al., J. Biomol. NMR, 18, 65- 68 (2000)], 출원인이 대표자이며 동시에 계류중인 2002년 6월 5일 출원된 미국 출원 번호 60/386,896호 (어토니 도켓 번호 01168. PR01)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 표적 분자로는, 다수의 분자, 특히 폴리펩티드 (바람직하게는 단백질), 폴리뉴클레이티드, 유기 중합체, 기타 등등과 같은 거대 분자가 포함된다. 이들은 생체 세포내에 있을 수 있거나 라이세이트 (lysate)에 있을 수 있다.

본원에서 사용된 "폴리뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드인 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭하며, 이중 나선 및 단일 나선의 DNA와 RNA를 모두 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 코딩 및 비코딩 영역을 모두 포함할 수 있으며, 천연 공급원 (예를 들면, 세균)으로부터 직접 얻어질수 있거나, 또는 재조합형, 효소적, 또는 화학적 기술의 도움으로 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 위상기하학적 (topology)으로 선형 또는 원형일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면 발현 또는 복제 벡터와 같은 벡터의 일부분이거나 또는 단편일 수 있다.

본원에서 사용된 "폴리펩티드"는 아미노산 중합체를 지칭하나 특정 길이의 아미노산 중합체를 의미하지 않는다. 따라서, 예를 들면 용어 펩티드, 올리고펩티드, 단백질, 효소는 폴리펩티드의 정의 안에 포함된다. 이 용어는 또한 예를 들면 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화, 및 기타 등등과 같은 폴리펩티드의 발현후 변형을 포함한다.

기준 화합물은 충분히 낮은 결합 친화력을 갖는 선택된 표적 분자와 상호작용하는 것이다. 상대적으로 약하게 상호작용하는 기준 화합물은 10 마이크로몰 이상의 해리 결합 상수 K_D를 갖는 것으로 통상적으로 정의된다.

평가될 수 있는 시험 화합물은 다양한 임의의 화합물이며, 이는 표적에 다양한 결합력을 잠재적으로 가질 수 있다는 것이다. 중요하게는, 본 발명의 방법은 상대적으로 강한 결합제인 화합물을 검출할 능력을 가진다. 상대적으로 강한 결합제는 약 1 마이크로몰 미만의 해리 결합 상수 K_D를 갖는 것들로 통상적으로 정의된다. 본 발명의 방법을 사용하여 스크리닝될 수 있는 화합물로는 예를 들면 식물 추출물, 균류 추출물, 다른 자연 생성물 및 소 유기분자의 라이브러리가 포함된다.

본 발명은 넓은 범위의 용해도를 갖는 화합물의 라이브러리로부터 리간드를스크리닝할 수 있다 (본 방법은 특히 매우 낮은 용해도를 갖는 화합물로 수정할 수 있다). 현저하고 이롭게, 임의의 실시태양에서, 본 발명은 바람직하게는 비교적 저농도의 표적 (즉, 표적 분자)에서 결합 분석을 수행하는 것을 포함한다. 그러므로, 본 발명의 바람직한 실시태양은 단지 한계적으로 용해성인 화합물을 검출하도록 한다. 통상적으로 이들 화합물은 약 10 μM 이하의 물 중의 용해도를 갖는다.

바람직하게는, 필요에 따라 더 높은 농도를 사용할 수 있지만, 각 샘플 중의 각 시험 화합물의 농도는 약 100 μM 이하이다. 그러나, 본 발명의 방법의 현저한 장점은 매우 낮은 리간드 농도 (예를 들어, 약 10 μM 이하)를 사용할 수 있는 것이다.

표적 분자에 대한 시험 화합물의 정확한 농도 및 비는 표적 분자의 크기, 이용가능한 표적 분자의 양, 필요한 결합 친화도 검출 한계, 및 데이타 수집의 필요한 속도에 따라서 변할 수 있다. 바람직하게는, 표적 분자의 농도는 약 100 nM 내지 약 10 μM이다.

시험 혼합물에 사용되는 용매는 표적을 분해 (예를 들어, 변성)시키지 않는 한 폭넓게 다양한 임의의 것일 수 있다. 통상적으로 물 및 DMSO를 사용한다. 양자화 용매 및 디터전트를 사용할 수 있다.

필요하다면, 당업자에게 잘 알려진 다른 성분 (예를 들어, 완충액)을 임의의 잇점을 위하여 시험 혼합물에 첨가할 수 있다.

본 발명은 화학적 혼합물 (즉, 2 종 이상의 시험 화합물의 혼합물)의 빠른 스크리닝을 위한 유용한 응용을 발견할 수 있다. 빠른 스크리닝 기법은 통상적으로 시험 샘플이 2 종 이상의 시험 화합물의 혼합물을 포함하는 다수의 시험 샘플을 제공하는 것을 포함한다.

일단 리간드 (바람직하게는, 고친화력 리간드)가 동정되고 확인되면, 그것의 구조는 활성 또는 친화력에 대하여 분석되는 유사한 구조의 이용가능한 화합물을 동정하거나, 활성 또는 친화력에 대하여 분석되는 구조적으로 관련된 화합물을 합성하도록 하는데 사용된다. 그후 이들 화합물은 재고에서 얻거나 합성한다. 가장 흔히, 그후 그들은 효소 분석법을 이용하여 활성이 분석된다. 효소가 아니거나 이용가능한 효소 분석법이 없는 분자 표적의 경우에, 이들 화합물은 상기의 것과 유사한 NMR 기법을 이용하거나, 등온 변성 열량법 (isothermal denaturation calorimetry)와 같은 다른 물리적 방법으로 친화력을 분석할 수 있다. 약 1.0x 10^-6M 이상의 분자 표적에 대한 친화력으로 이 단계에서 동정된 화합물은 통상적으로 리드 화학적 주형 (lead chemical template)으로 생각된다.

일부 경우에, 리간드 결합은 추가로 복합 NMR 실험 또는 열량법 또는 X-선 결정학과 같은 다른 물리적 방법을 사용하여 연구한다.

¹H 및¹⁹F 검출에 최적화된 저온탐침 (cryoprobe) 기법은 추가로 이 스크리닝 공정의 처리량을 증가시킬 수 있다. 이 경우에, 제한 인자는 샘플을 바꾸고, 샘플 온도를 평형시키고, 샘플을 보정하는데 요구되는 시간일 것이다.

본 발명의 목적 및 장점은 추가로 이하의 실시예에 의하여 예시되지만, 인용된 특정 물질 및 그의 양 및 다른 조건 및 상세한 설명은 본 발명을 부당하게 제한하도록 해석되어서는 안된다.

물질 및 방법

실시예 (1)의 제1 실험 세트를 위하여, 세린/트레오닌 p21-활성화된 키나아제의 키나아제 도메인 (MW 대략 34000)을 이.콜리 (E. Coli)의 GST 융합 단백질로서 발현하고, GST 표지의 제거 후에 균질하게 정제하였다. NMR 샘플은 인산-완충 식염수 (PBS, 코드: P-3813, 시그마 (Sigma)의 로트 100K8211) pH 7.4 중에 있고, D₂0를 용액 (8 % 최종 농도)를 고정 신호 (lock signal)를 위하여 첨가하였다. 작은 분자는 중수소화 DMSO 중의 농축 저장 용액 중에 제조하고, 253 K에서 보관하였다.

실시예 (II)의 제2 실험 세트를 위하여, 지방산이 없는 인간 혈청 알부민 (A-3782)을 시그마에서 구입하여 추가의 정제 없이 사용하였다. NMR 샘플은 5 μM EDTA 존재 하의 인산-완충 식염수 (PBS, 코드: P-3813, 시그마에서의 로트 100K8211) pH 7.4에 두었다. D₂0를 고정 신호를 위하여 용액 (8 % 최종 농도)에 첨가하였다. 작은 분자를 중수소화 DMSO 또는 물 중의 농축 저장 용액에서 제조하고, 253 K에서 보관하였다.

NMR

실시예 (I)의 제1 실험 세트에서, 모든 NMR 스펙트럼을 샘플 처리 시스템 (Sample Management System (SMS)) 자동시료주입기가 장착된 바리안 이노바(Varian Inova) 600 MHz (¹⁹F에 대하여 564 MHz) NMR 분광계로 293 K에서 기록하였다.¹H 검출 실험에서 워터 서프레션은 여기 조각 시퀀스 (excitation sculpting sequence)로 얻었다 (T.-L. Hwang, J Magn. Reson. A, 112, 275-279 (1995)). 스킴 (scheme)의 2 개의 물 선택성 180 °사각 펄스 및 4 개의 펄스장 경사를 각각 2.6 및 1 밀리초 (ms) 지속 기간 동안 하였다.

실시예 (II)의 제2 실험 세트를 위하여, 모든 NMR 스펙트럼을 564 MHz의¹⁹F 라모 주파수에서 작동하는 브루커 아반스 (Bruker Avance) 600 NMR 분광계로 300 K에서 기록하였다. 이중 코일 {^l9F}-{¹H} 탐침은 내부 코일을¹⁹F로 조절하고, 외부 코일을¹H 주파수로 조절하여 사용하였다. 이들 탐침의 불소 배경은 측정을 방해하지 않았다. 이들 신호는 넓으므로, 스핀-에코 스킴으로 기록되는 기준 및 대조 분자의 스펙트럼을 볼 수 없었다. 모든 스펙트럼은 획득 기간 동안 적용된 약한 왈츠-16 양자 디커플링 (weak Waltz-16 proton decoupling)으로 기록하였다. 통상적으로 4-8 더미 스캔 (dummy scan)을 온도 평형을 위하여 기록하였다. 다른 길이 및 긴 2τ간격의 카르-퍼셀-메이봄-길 스킴 (Carr-Purcell-Meibom-Gill scheme)을 획득 기간 전에 사용하였다. 화학적 쉬프트는 트리플루오로아세트산을 기준으로 하였다.

형광

형광 측정은 여기 빔에 수직으로 위치한 보조 광전자증배기 튜브를 사용한자스코 J-715 편광분광기 (Jasco J-715 spectropolarimeter) 상에서 얻었다. 여기 파장은 310 nm (5 nm 대역폭) 및 385 nm 컷-오프 필터를 사용하였다. 친화력 측정은 NMR 실험에 사용되는 지방산이 없는 HSA의 동일원을 사용하였다. 분석물 및 HSA 용액을 5 μM EDTA 존재시에 인산-완충 식염수 (PBS, 코드: P-3813, 시그마의 로트 100K8211) pH 7.4 중에서 제조하였다. 완충액은 사용 전에 0.2 ㎛ 필터를 통하여 여과하였다. 알부민 친화력은 분석물의 3 μM 용액 2.0 mL을 경로길이 1.0 cm의 석영 큐벳으로 분취하고, 용액을 HSA (250 μM의 저장 농도)로 적정하여 측정하였다.

ITC 실험

등온 적정 열량계 실험을 마이크로칼, 인크 (Microcal, Inc.) (메사추세스주, 노르탬프턴)으로부터의 OMEGA 적정 미세열량계를 사용하여 수행하였다. 적정 미세열량계는 단열 인클로져 내에 수용된 기준 셀 및 샘플로 이루어져 있다. 기준 셀은 PBS로 채워져 있다. PBS + 2 % DMSO 중의 23 μM HSA 용액을 1.37 mL 샘플 셀 내에 위치시켰다. 동일한 완충액 중의 0.8 mM로 분석물을 250 ㎕ 주사기 내에 수용하였다. 분석물을 25 ℃에서 샘플 셀로 컴퓨터 조절 스텝퍼 모터에 의하여 30 회 주사 (각각 8 ㎕ 및 12 초/주사)하였다. 주사기 교반 속도는 400 rpm이었다. 각 주사로 흡착되거나 유리된 열은 마이크로칼 나노볼트 전증폭기 (Microcal nanovolt preamplifier)에 연결된 열전소자 (thermoelectric device)에 의하여 측정하였다. 결합 상호작용을 위한 적정 등온은 각 주사에 대한 다른 열 흐름을 포함하였다. 분석물을 PBS로 주사하여 얻어지는 희석열은 무시할 수 있다.결합 등온은 본 장치에 포함되는 반복 비선형 최소 제곱 알고리즘 (iterative nonlinear least-squares algorithm)을 이용한 단일 결합 부위 모델 (T. Wiseman et al., Anal. Biochem., 179, 131-137 (1989))에 맞추었다.

실시예 I.

결과 및 논의

¹⁹ F 이완 이론

¹⁹F의 종축 이완은 그것이 거대분자와 상호작용하는 작은 분자를 동정하는데 필요한 직접적인 τ_c의존성이 없기 때문에,경쟁 결합 실험에 있어서의 우수한 파라미터가 아니다. 그러나, 횡축 이완 속도 R₂는 그것이 이핵성¹⁹F-¹H 쌍극자 상호작용에 있어서 및 하기 식으로 기재되는¹⁹F 화학적 쉬프트 비등방성 (CSA) 상호작용에 있어서 0 주파수 (M. Goldman,Quantum Description of High-Resolution NMR in Liquids, Clarendon Press, Oxford, (1988))에서 계산되는 스펙트럼 밀도를 함유하기 때문에, 탁월한 파라미터를 나타낸다.

H_i는 기준 화합물 및 불소 원자에 근접한 단백질의 모든 양자에 해당하고,Δσ는¹⁹F 원자의 CSA이고, B_O는 자기장의 강도이고, γ_H및 γ_F는 각각 양자 및 불소 회전 자기 비율이고, ω_H및 ω_F는 각각 양자 및 불소 라모 주파수이고, τ_c는 상관 시간이고, r_FHi는 양자 H_i와 불소 원자 사이의 핵간 거리이다.

¹⁹F의 큰 CSA (수백 ppm) (J.T. Gerig, Methods in Enzymol., 177, 3-23 (1989); 및 J.T. Gerig, Prog. NMR Spectrosc., 26, 293-370 (1994)) 으로 인하여, 그것은 결합 리간드의 분획의 횡축 이완에 현저하게 기여할 것이다. 이완에의 CSA 기여는 자기장의 제곱에 직접 비례한다. 그러므로, 그 효과는 보다 높은 자기장에서 더욱 명백하다. 이는 용액 중에 유리된 작은 분자에 대한 CSA의 기여로 인하여 또한 다른 크기의 큰 거대분자에 결합하였을 때,¹⁹F 라인 폭 (linewidth)의 차이가 라모 주파수의 함수로서 플로팅되는 도 1의 시뮬레이션에서 이해될 수 있다. 시뮬레이션을 위하여 용액 중에 유리된 작은 분자의 100 ppm의 Δσ및 200 ps의 τ_c를 사용하였다. 도 1에서 이해할 수 있는 바와 같이, 현재 이용가능한 가장 강한 자기장은 CSA의 강한 기여로 인하여 강한 단백질-결합 리간드 및¹⁹F로 선택적으로 표지된 단백질의¹⁹F 실험에 최적이지 않다. 반대로, 강한 자기장은 약한 친화력 기준 분자로 수행되는 경쟁 결합 HTS 실험에 특히 적합하다. 유리 및 결합 상태 사이의 기준 분자의¹⁹F 공명 라인 폭의 차이는 자기장의 강도에 따라서 증가한다.또한, 유리 및 결합된 상태 사이의 불소 리간드 공명에 대한 화학적 쉬프트 차이 (δ_유리-δ_결합)은 더 커진다. 이는 기준 화합물의¹⁹F 라인 폭에 대한 교환 용어 R_2,ex의 현저한 기여를 야기한다 (J.W. Peng,. J. Magn. Reson., 153, 32-47 (2001)). [EL]/[L_TOT]는 결합 리간드의 분획이고, 1/K_-1은 단백질에 결합한 리간드의 체류 시간이다.

기준 화합물의 선별 및 스크리닝 파라미터

NMR 스크리닝 실험을 통상적으로 단백질 보다 10-100 배 과량의 리간드로 수행하면 (결합 리간드의 작은 분획 만을 야기), 앞 부분의 용어 (Δσ, B_O, δ_유리-δ_결합, 1/K_-1등) 가 기준 화합물의 선택에 있어서 중요해진다. 단백질에 결합한 기준 화합물의¹⁹F 신호의 화학적 쉬프트는, 단백질 유도된 쉬프트의 기여로 인한 유리 리간드의 화학적 쉬프트와 비교할 때 매우 다를 수 있다 (J. T. Gerig, Prog. NMR Spectrosc., 26, 293-370 (1994); 및 J. Feeney et al., J. Am. Chem. Soc., 118, 8700-8706 (1996)). 그러므로, μM 범위에서 중등의 결합 친화력을 갖는 분자도, 결합 형태에 대한 하나 및 유리 형태에 대한 다른 하나의 2 개의 상이한 공명의¹⁹F스펙트럼을 나타낼 수 있다. 이는 유리 및 결합 종 사이의 교환 속도에 비교할 때, 두 공명의 화학적 쉬프트의 차이가 더 크다는 사실에서 기인한다. HTS에서, 결합 형태의 매우 넓은 공명의 관찰이 가능하도록 하기에 단백질의 농도가 낮기 때문에 (수백 nM 내지 1-5 μM), 유리 리간드의 주파수에서의 신호 만이 모니터링될 것이다.

경쟁 스크리닝을 위한 임의의 주어진 플루오르화 리간드의 적합성을 평가하고 최적 실험 파라미터를 결정하기 위하여, 1D¹⁹F R₂여과 실험 또는 단순 1D¹⁹F 실험을 하여 후보 분자의 적정 실험을 결합 리간드의 분획의 함수로서 수행하였다 (C. Dalvit et al.,J ; Am. Chem. Soc., 124, 7702-7709 (2002)). 더 우수한 감도를 위하여, 실험을 획득 기간 동안¹H 디커플링하여 기록하였다. 후보 화합물 및 실험 조건은 그의 감도 및 표적에 결합 시에 현저한 섭동 (perturbation)을 나타내는 단일 불소 공명의 존재에 대하여 조사하였다.

일단 적합한 리간드를 동정하고 실험 조건을 설정하면, 그후 스크리닝은 도 2에 나타난 바와 같이 기준 분자의¹⁹F 신호의 횡축 이완의 변화 (CGMG 또는 스핀-에코 스킴으로 또는 단순히 라인 폭을 분석하여 수행된 R₂여과 실험을 통하여)를 모니터링하여 수행할 수 있다.

이 경우, 50 μM의 중등 친화력 리간드 화합물 A (K_D=10 μM)를 1.5 μM의 PAK4의 존재시에 기준 화합물로서 사용하였다. 스핀-에코 스킴 후의 화합물 A의신호의 현저한 증가를 고-친화력 리간드를 함유하는 화합물 혼합물의 존재시에 관찰하였다 (도 2a를 2b와 비교). 이 신호의 증가는 혼합물에 함유된 분자와의 경쟁으로 인하여 기준 분자 화합물 A의 결합이 감소함을 표시한다. 단순 디콘볼루션 실험 (2c 및 2d)은 활성 분자로서의 화합물 B를 동정하도록 하였다.

스핀-에코 형 시퀀스를 사용할 때, 등식 (2)의 교환 용어를 이용하기 위하여 하드 180 °펄스 사이의 충분히 긴 지연을 사용할 것을 권장한다. 이는, 동핵 스칼라 커플링 (homonuclear scalar coupling)이 없고 이핵성 스칼라 커플링 하의 발생 (evolution)에 초점을 다시 맞추기 때문에 가능하다. 그러나, 상기 지연은 정자기장의 비균질성으로 야기되는 이완을 피하기 위하여 너무 길면 안된다.

플루오르화 기준 화합물 이외에, 수용체와 상호작용하지 않는 플루오르화 작은 분자 (대조 화합물)를 포함하는 것이 바람직하다. 도 3은 스파이 분자 및 상호작용하지 않는 분자의¹⁹F 스펙트럼이 단백질의 부존재 및 존재 시에 기록되는, 이 원리를 나타낸다. 스파이 분자의 신호가 스펙트럼 변화를 거치는데 반하여, 작은 분자의 신호는 변화하지 않을 것이다. 이는 도 3의 스펙트럼의 차이로 이해할 수 있다. 상호작용하지 않는 분자의 신호는, 스파이 분자의 신호의 변화를 단일 실험으로 보정하는데 사용할 수 있는 내부 기준을 나타낸다. 작은 분자가 수용체와 약한 상호작용 (mM 범위)를 가진다고 해도, 이는 측정을 방해하지 않을 것이라는 것을 지적해야 한다. 작은 분자의 농도 (10-30 μM)는 약한 결합 상수에 비교할 때 더 작은 크기의 순서이고, 그러므로 수용체에 결합한 화합물의 분획은 무시할 수있다. 이를 증명하기 위하여, 트리플루오로아세트산 (TFA)을 수용체와 상호작용하지 않는 작은 분자로서 선택하였다. 스크리닝 중에 일부 화합물은 극미량의 TFA를 함유할 수 있다는 것을 주지하여야 한다. 그러므로, 여기 존재 하는 개념의 증거로서 유효하지만, 보다 일반적인 응용을 위하여 다른 대조 화합물이 선택되어야 한다. HTS 및 디콘볼루션을 통한 리드 동정을 위한 스파이 분자 및 대조 화합물의 사용의 유용성은 도 4에 나타나 있다. 6 화합물 혼합물은 스파이 분자 공명의 라인 폭에 영향을 주지 않으며 (도 4c), 기준 화합물 A의 신호는 TFA의 신호에 비교할 때 분명히 덜 강하다. 그러나, 7 화합물 혼합물 중의 강한 경쟁 분자 (화합물 B)의 존재는 스파이 분자 중의 공명을 예리하게 하고 (도 4d), 두 신호는 현재 필적할 강도를 갖는다.

문헌 [C. Dalvit et al.,J.Am. Chem. Soc., 124, 7702-7709 (2002)]에 기재된 바와 같이, 결합 리간드의 분획 및 경쟁 분자의 존재 시의 기준 분자의 신호 강도 변화의 측정의 함수로서 플로팅된 2 개의¹⁹F 공명의 신호 강도 비율로부터 동정된 NMR-히트의 결합 상수를 유도할 수 있다. 이 특정 경우에, NMR-히트 화합물 B에 대한 결합 상수는 200+/-100 nM으로 측정되었다.¹⁹F 실험을 HTS을 위하여 이용할 때, 화학 혼합물을 포함하는 화합물의 농도를 추정하기 위하여¹H 스펙트럼을 기록하는 것이 또한 중요하고, 이로써 NMR 히트의 결합 상수의 신뢰할 수 있는 값을 유도한다.

¹H 내지¹⁹F NOE 단계는 또한 양자로부터 불소 스핀으로 자기를 전달하기 위하여 획득 기간 전에¹⁹F 실험에 적용할 수 있다. 이 단계는 다른 방법으로 수행할 수 있다.¹⁹F 신호의 증강은 큰 수용체와 상호 작용하지 않는 작은 분자에서 관찰된다. 결합 리간드, 단백질 상관 시간 및 NOE 단계가 수행되는 방법에 좌우되어 매우 약한 신호 증강 또는 신호 감소는 수용체와 약하게 상호작용하는 분자에서 관찰된다. 이핵성 NOE의 이러한 차이는 경쟁 결합 HTS 실험에서 구조적으로 사용될 수 있다. 스파이 분자는 경쟁 분자의 존재 시에 수용체로부터 변위하고, 그것의¹⁹F 신호는 이핵성 NOE를 통한 신호 증강 및 더 작은 라인 폭 때문에 더 강해진다.

실시예 II

결과 및 토의

이론

¹⁹F NMR 신호의 감도는, γ_F및 γ_H가 각각 불소 및 양자의 회전자기 비율인 (γ_F/γ_H)³에 비례한다.¹⁹F가 유일하게 안정한 불소 동위원소이고 스핀 1/2를 갖는 사실 때문에, 그것의 감도는 양자의 0.83 배로 높다. 불소 신호는 양자 디커플링의 존재시에 일중항 공명으로 나타나므로 강하다.

¹⁹F 횡축 이완은 경쟁 결합 실험으로 수행된 스크리닝을 모니터링하기 위한 탁월한 파라미터를 나타낸다. 일정 거리 떨어져 있는 불소와 양자 사이의 쌍극자상호작용은 동일한 거리로 분리된 두 개의 양자들 사이의 쌍극자 상호작용과 크기(0.88 배)에서 매우 유사하다. 따라서 기준 분자의 양자 신호 또는 불소 신호의 라인 폭에 대한 쌍극자 기여들은 유사하다. 불소 신호의 횡축 이완 속도 R₂는¹⁹F 원자의 큰 CSA 상호작용으로부터 유래하는 추가적인 기여를 하고, 이하의 등식으로 주어진다. (D. Canet, Nuclear Magnetic Resonance Concepts and Methods, John Wiley & Sons, Chichester, (1996)).

여기서, Δσ은¹⁹F 원자의 CSA이고, Δσ=σ_zz-(σ_xx+ σ_yy)/2로 주어진다. 다른 σ들은 화학적 쉬프트 텐서의 성분들이다. 비대칭 파라미터는 _CSA= (3/2)(σ_xx-σ_yy)/ Δσ이고, 축 방향으로 대칭인 화학적 쉬프트 텐서는 _CSA=0이다. B_o는 자기장의 강도이고, γ_F는 불소 회전자기 비율이며, ω_F는 불소 라모 주파수이며, τ_c는 상관 시간이다.

제1 실험(I) 세트에서 위에서 논의된 바와 같이, 도 1에 도시된 바와 같이 리간드의 유리 및 결합 상태에 대해 동등한 CSA를 나타내고 축 방향으로 대칭인 CSA 텐서를 나타내면서 실행된 시뮬레이션은, CSA 기여 단독으로부터의 결합 상태와 유리 상태 사이에서 기준 분자의¹⁹F 신호의 라인 폭에서의 차이가 매우 커질 수 있다는 점을 나타낸다.(C. Dalvit et al., Comb. Chem. HTS, 5, 605-611 (2002) 및 상기 실시예 (I)). 이러한 차이는 수용체의 크기 및 자기장 강도의 제곱에 따라 증가한다. 강한 자기장들은 거대분자들 (예를 들면, 선택적으로¹⁹F로 표지된 단백질) 또는 강한 단백질-결합 리간드의 불소 신호들에 대해 극단적으로 넓은 라인 폭들 (> 200 Hz)을 유발한다 (W. E. Hull et al., J. Mol. Biol., 98, 121-153 (1975); J. T. Gerig, Methods in Enzymol.,177, 3-23 (1989); 및 J. T. Gerig, Prog. NMR Spectrosc., 26, 293-370 (1994)). 상기 라인 폭들은 고-친화력 리간드 또는 거대 분자의 불소 공명의 직접적인 검출을 스크리닝의 목적에 대하여 비실용적으로 만든다. 대조적으로, 강한 자기장들은 약한 친화력 기준 분자로 수행된 경쟁 결합 실험에 특히 적합하고, 여기서 유리 상태와 결합 상태 사이의 개체수의 평균은 조정되거나 모니터링될 수 있는 관찰된 라인 폭을 야기한다 (C. Dalvit et al., Comb. Chem. HTS, 5, 605-611 (2002) 및 상기 실시예 (I)).

통상적으로 사용되는 펄스 시퀀스들은 습득 기간전에 카르-퍼셀 메이봄 길(CPMG) 스핀-에코 스킴 (H. Y. Carr et al., Phys.Rev., 94,630-638 (1954);과 S. Meiboom et al., Rev. Sci. Instrum., 29, 688 (1958))을 사용하였다. 스핀-에코 스킴 I_(n2τ)의 말단부에서 기준 분자의 신호 강도는 이하 등식으로 주어진다 (T. C. Farrar et al., Pulse and Fourier Transform NMR, Introduction to Theory and Methods, Academic Press, New York,1971).

여기서, I₀는 초기 90°펄스 후의 신호 강도이고, 2τ는 연속된 180°펄스들 사이에서의 간격이며, G는 정자기장의 비균질성이며, γ_F는 불소의 회전자기 비율이며, n은 스핀-에코 스킴의 싸이클들의 수이다. D_obs, 약한 친화력 기준 분자에 대해 관찰된 병진 확산 계수는 등식으로 주어진다:

여기서, D_결합과 D_유리는 각각 결합 상태와 유리 상태에서 기준 분자의 확산 계수이다. [EL]/[L_TOT]과 (1-[EL]/[L_TOT])은 각각 결합 및 유리 리간드의 분획이다.

R_2,obs, 약한 친화력 기준 분자에 대한 횡축 이완 속도는 등식으로 주어진다:

여기서 R_2,결합과 R_2,유리는 각각 결합 상태 및 유리 상태에서 리간드에 대한 횡축 이완 속도 상수들이다. 마지막 용어는 교환 용어이고, 여기서 δ_결합과 δ_유리는 각각 결합 및 유리 상태에서 기준 분자의 불소 공명의 등방성 화학적쉬프트들이고, 1/K_-1는 단백질에 결합하는 리간드의 체류 시간이다. 등식 (6)은 실험들이 긴 2τ기간에 실행될 때에만 (여기서 τ≫ 1/K_-1) 유효하다. τ <5/K_-1로 기록된 실험은 교환 용어의 관찰된 횡축 이완 속도에 대한 기여를 감소시킨다 (Z. Luz et al., J. Chem. Phys., 39, 366-370 (1963); 및 A. Allerhand et al., H. S. J. Chem. Phys., 41, 2115-2126 (1964)).

따라서 스크리닝은 긴 2 τ기간을 사용함으로써 실행된다. 이것은 이핵성¹H-¹⁹F 스칼라 커플링들하에서의 발생은 스킴의 말단에서 다시 집중되기 때문에 가능하다. 그러나, 2 τ기간은 기준 분자의 공간 확상으로부터 유발된 신호의 감쇄를 줄이기 위해서는 너무 길지 않아야 한다 (즉, 등식 (4)의 제1 지수항).

스파이 분자와 대조 분자의 선택

표 1은 시판되는 세 가지 다른 화학적 라이브러리들에서 불소 원자를 함유하는 분자들의 주파수가 기록되어 있다. 표는 이러한 실험들에서 종종 사용되고 모노플루오로-벤젠 및 트리플루오로메틸-벤젠인, 두 가지의 하위구조들의 수를 또한 함유한다. 불소 원자를 함유하는 분자들의 많은 수는 화학적 합성에 의지하지 않고 스파이 분자와 대조 분자의 선택을 용이하게 만든다.

표 1로부터 나타나는 흥미로운 특징은 MDDR 라이브러리에 존재 하는 분자르 함유하는 많은 수의 불소이다. 이 라이브러리 내의 연대기적인 검색은, 도 5에 나타난 바와 같이, 지난 20 년에 걸쳐서 하나 이상의 불소 원자를 함유하는 개발 중의 화합물의 백분율이 2 배가 된 것을 나타낸다. 1981-1985 기간 중에 10.9 %에서 1996-2000 기간 중에 19.4 %의 안정된 증가를 관찰하였다. 불소 원자는 개선된 강도, 물리적-화학적 특성 및 효소의 공격에 대한 대사적 안정성에 있어서 가장 최적의 공정에 점점 더 도입되어 왔다.

두 분자를 선택할 때, 그의 용해도에 대하여 특별한 주의를 기울여야 한다. 불소 원자의 존재는 화합물의 친유성을 증가시킨다. 수용액에 매우 용해되지 않는분자는 그들이 수용체에 비특이적인 방법으로 결합할 수 있기 때문에 스크리닝 실험에 적합하지 않다. 그러므로, 양자 및 불소 스펙트럼 및 잠재적 스파이 및 대조 분자에 대한 양자 워터로그시 (WaterLOGSY) 스펙트럼을 스크리닝 공정에 사용되는 농도 보다 통상적으로 2 내지 4 배 높은 농도 (즉, 100 내지 200 μM)에서 단백질의 부재 시에 기록하였다. NMR 스펙트럼에 따라서 용해성이고 이 농도에서 응집하지 않는 분자 만이 스크리닝에 사용되는 기준 및 대조 분자의 잠재적인 후보로 생각된다.

CF ₃ 기를 갖는 분자

CF₃기를 함유하는 기준 분자는 불소 신호의 높은 감도의 장점을 갖는다. 다른 농도의 HSA의 존재 시에 획득 기간 중의 양자 디커플링으로 기록한 기준 분자 5-[1-메틸-3(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-5-일]-2-티오펜카르복실산 (1) 및 대조 분자 1-[5-(트리플루오로메틸)1,3,4-티아디아졸-2-일]피페라진 (2)의 통상적인 스핀-에코¹⁹F 스펙트럼은 도 6에 나타내었다. (2)로 수행한 ITC 측정은 NMR 결과와 일치하여 HSA에 대한 결합의 증거가 발견되지 않는다 (800 μM의 (2) 8 ㎕를 30 μM HSA에 주사하여 희석 열 (heat of dilution) 만이 관찰된다). 두 분자에 대하여 단지 25 μM의 농도가 NMR 실험에 사용되었다. 저농도의 기준 분자는 비-특이성 결합 및 응집으로부터 야기되는 문제점을 회피한다. 이들 분자의 단점은 결합 상태에서도 관찰되는 기의 C₃축에 대한 불소 원자의 빠른 회전으로 나타난다. 이는 유리 및 결합 상태 사이의 기준 분자의 CF₃신호에 대한 라인 폭의 제한된 차이를 야기한다.

CF 기를 갖는 분자

CF 기를 갖는 분자는 경쟁 리간드 기초 스크리닝 실험에 특히 적합하다.¹⁹F CSA는 매우 커서, 등식 (3)에 따라서 기준 분자의 유리 및 결합 상태 사이의 라인 폭의 차이가 증가할 수 있다. 예를 들면, 방향족 CF에 대한 CSA는 모노플루오로-벤젠에 대하여 71 ppm에서 헥사플루오로-벤젠에 대하여 158 ppm의 범위이다 (H. Raber et al., Chem.Phys., 26, 123-130 (1977)). 또한, 결합 상태의 기준 분자의¹⁹F CSA는 "오르토 효과"로 인하여 또는 단백질과의 수소 결합한 불소 원자를 직접 포함하여 증가할 수 있다. 이들 두 현상은 또한 유리 및 결합 상태에 대한 등방성 화학적 쉬프트에서 큰 차이를 내는 효과를 갖는다. 약한 친화력 기준 화합물에 잇어서, 등식 (6)의 교환 용어는 단백질의 존재 시에 기준 화합물의 라인 폭에 현저하게 기여한다. 불소 신호는 일반적으로 몇몇 양자와 스칼라 커플링되고, 이로써 감도 개선에 있어서 획득 중에 양자 디커플링의 스펙트럼을 기록하는 것이 필요하다. 도 7은 HSA 농도의 함수로서 양자 디커플링과 기록되는 기준 분자 2-히드록시 3-플루오로벤조산 (3) 및 대조 분자 (2)의 통상적인 스핀-에코 불소 스펙트럼을 나타낸다. 이들 분자의 결점은 실험을 위하여 고농도가 요구되는 것이다. 도 7의 스펙트럼은 50 μM의 기준 분자에 대한 농도로 기록되었다.

적정 및 스크리닝 실험

기준 및 대조 분자를 선택한 후에, 단백질에 대한 함수로서 적정 실험을 도 6 및 7에 나타난 바와 같이 기록하였다. 2 개의 불소 신호의 강도 비율을 도 8의 예에 나타난 바와 같이 단백질-결합 기준 분자의 분획의 함수로서 플로팅하였다. 결합 화합물의 분획은 문헌 [C. Dalvit et al., J. Am. Chem. Soc., 124, 7702-7709 (2002); 및 C. Dalvit et al., Comb. Chem. HTS, 5, 645-650 (2002)]에 기재된 바와 같이, 다른 기법 (예를 들면, ITC 또는 형광 분광법)으로부터 유도된 해리 결합 상수를 사용하여 계산하였다. 이들 기법은 또한 기준 물질에 대하여 다수의 결합 부위 (n)에 경쟁 결합 실험에 있어서 매우 중요한 파라미터를 제공한다. ITC 측정은 (1)에 대하여 4에 근접하고, (3)에 대하여 1에 근접한 n 값을 제공한다. 그러므로, 분자 (1)이 여전히 실험 결과의 해석에 있어서 약간의 제한을 가지고 스크리닝 목적에 사용되지만, 그것은 NMR-히트의 결합 상수를 유도하는데 사용될 수 없다. 분자 (3)은 이 실험에서 사용된 농도에서 HSA 상에 단 하나의 결합 부위의 존재로 인하여 적당한 기준 분자를 나타낸다. 그것의 화학 구조에 따라서, 아스피린 유사체, 그것의 추정되는 결합 부위는 수드로 부위 (Sudlow site) I (하위 도메인 IIA에 위치)일 것이다 (T. Peters, Jr., All about Albumin Biochemistry, Genetics, and Medical Applications Academic Press, San Diego, U.S.A. 1996). 단백질 결합 기준 분자 (3)의 분획에 대한 2 개의 다른 값은 실험 오차로 측정되는 K_D의 2 개의 극한값을 사용하여 도 8에서 추출하였다. 이 특정 경우에, (3)에 대하여 ITC 유도된 K_D는 41±3.3 μM이고, 이로써 K_D의 두 극한 값은각각 37.7 및 44.3 μM에 해당한다.

NMR 실험은 또한 기준 분자 만의 존재 시에 기록될 수 있다는 점을 지적해야 한다 ((C. Dalvit et al., Comb. Chem. HTS,5, 605-611 (2002) 및 상기 실시예 (I)). 그러나, 이 경우, 두 실험을 기록 하여야 한다: CPMG 시퀀스가 없는 하나 (즉, 2nτ=0) 및 긴 2nτ를 갖는 다른 하나. 그후 이들 두 스펙트럼으로부터 추출한 신호 강도 비율을 결합 기준 분자의 분획의 함수로서 플로팅하였다.

도 8의 그래프는 그후 스크리닝에 필요한 실험 조건을 설정하기 위하여 사용하였다. 도 9는 기준 분자로서 (3)을 갖는 HSA에 대하여 수행된 스크리닝 공정을 나타낸다. 스크리닝에 있어서, 전체 스핀-에코 기간 (2nτ)은 기준 분자의 신호가 0에 접근하도록 선택하였다. 비결합제로 알려진 5-CH₃DL Trp 및 수크로스 (좌측에서 3번째 스펙트럼)의 혼합물의 존재는 스파이 분자의 스펙트럼을 변경하지 않는다. 반대로, 와르파린 유도체 4-히드록시-3-[1-(p-요오도페닐)-3-옥소부틸]쿠마린 (4) (우측)은 (3)의 신호의 재현을 야기한다. 이는, 도 8의 그래프에 따라서, 단백질에서 기준 화합물의 변위로부터 야기된다. 그후 변위의 정도는 표 2에 나타난 바와 같이 NMR-히트의 결합 상수를 계산하는데 사용될 수 있다 (C. Dalvit et al.,J. Am. Chem. Soc., 124, 7702-7709 (2002); and C. Dalvit et al., Comb. Chem. HTS,5, 645-650 (2002)).

결합 상수에 대한 신뢰할 수 있는 값을 유도하기 위해서는, 양자 스펙트럼도기록해야 한다. 이는, 농도가 NMR-타격의 신호 전체로 알려져 있기 때문에 기준 분자의 신호 전체를 단순히 비교함으로써 NMR-타격의 농도를 산정하는 데에 필요하다. (4)에 대한 NMR-유도 K_D는 전(全) 적정 형광 측정으로부터 유도된 값에 비해 우수하다. 그 첫 적용(C. Dalvit et al., J. Am. Chem. Soc., 124, 7702-7709 (2002); and C. Dalvit et al., Comb. Chers. HTS, 5, 645-650 (2002)) 이래로, 이 접근을 사용하여 수백 개의 화합물들에 대한 결합 상수를 산정하였다. 순수 경쟁 결합 기전 및 단일 결합 부위, 단일점 NMR 유도 결합 상수와 전 적정 형광-유도 및 ITC-유도 결합 상수가 서로 잘 일치함이 발견되었다. 또한, 이 NMR 접근은 다른 NMR 방법으로는 용이하게 얻을 수 없는 고 친화력 결합 상수를 결정할 수 있게 한다.

검출 한계

큰 CSA 및 약한 결합 친화력 기준 분자에 대한 큰 교환 기여로 인하여, 스크리닝에 필요한 단백질의 농도를 크게 감소시키는 것이 가능하다. 이는 단지 150 nM의 농도에서 HSA의 존재 하에서 (3)을 사용하여 스크리닝이 수행되는 도 10에서 명확히 이해될 수 있다. 큰 비율 [L_TOT]/[E_TOT] (=330) 및 작은 비율 [EL]/[L_TOT] (=0.00165, 41 μM의 K_D사용)에도 불구하고, 결합된 리간드의 작은 분획의 효과를 관찰하고 이러한 낮은 단백질 농도에서 스크리닝을 수행하는 것이 가능하다. 이는 아마도 운이 좋은 경우일 것이다. 고체 상태 NMR 연구에 따르면, 불소 원자에 대한 오르토 위치에서의 OH기의 존재는 큰¹⁹F CSA를 유발하는 방향족 고리에 수직인¹⁹F 화학적 쉬프트 텐서 성분 중에서 50 ppm의 쉬프트를 담당한다(H. Raber et al., Chem. Phys., 26, 123-130 (1977)). 그러나, 다른 단백질들 및 파라-플루오로 벤질 잔기를 함유하는 기준 분자에서 유사한 거동이 관찰되었다 (데이터는 도시되지 않음). 따라서, 교환 기간도, 관찰된 횡축 이완에 상당히 기여하는 것으로 보인다. 도 10에 기록된 스펙트럼은 128 스캔으로 기록하였고 총 측정 시간은 10 분이었다.¹⁹F 검출에 최적화된 저온 탐침 기술의 사용은 검출 한계를 더 개선시킬 수 있었다. 그러면, 50 내지 100 nM로 낮은 단백질 농도를 사용할 수 있었다. 이는 다량으로 발현될 수 없는 단백질(예를 들면, 막 단백질)에 대해 다수의 화학적 혼합물의 스크리닝을 가능하게 할 것이다. 불소 스펙트럼은 저온 탐침 기술을 사용하여 매우 신속하게 기록될 수 있다. 저온 탐침 기술을 사용한 2 배 감도 개선은 대략 획득 시간을 4 배 감소시킬 것으로 평가된다. 따라서, 도 10의 스펙트럼은 단지 150 초만에 기록될 수 있어, 이 스크리닝 공정의 처리량을 향상시켰다. 스파이 및 대조 분자의 저 농도로 인해, 저온 탐침으로 기록되는 양자 검출 실험에서 직면하게 되는 방사 감쇠 문제가 불소 검출 실험에서는 존재 하지 않는다는 점에 주목해야 한다.

양자화 용매 및 세제 존재 하의 스크리닝.

특히¹⁹F 리간드-계 경쟁 결합 실험의 장점은 심지어 양자화 용매, 완충제 또는 세제의 존재 하에서도 스크리닝을 수행하는 것이 가능하다는 점이다. 100 mM HEPES 및 1% 글리세롤의 존재 하의 HSA의 양자 스펙트럼을 도 11에 도시한다. 완충제 및 글리세롤의 강한 신호는 스크리닝을 수행하는 데 필요한 기준 및 대조 분자의 약한 신호를 가려 관찰을 어렵게 한다. 이러한 문제들은¹⁹F 검출 실험에서는 나타나지 않는다. 따라서, 이러한 어려운 실험 조건에서도 도 11에 도시한 바와 같이 스크리닝을 수행하는 것이 가능하다. 이러한 성질로 인해, 불소 리간드-계 경쟁 결합 스크리닝 실험은 SDS 또는 다른 세제에 용해된 막 단백질에 대해 분자를 스크리닝하는 데에 특히 유리하다. 일단 적합한 기준 분자가 동정되면,¹⁹F 리간드-계 경쟁 결합 NMR 스크리닝은 신뢰할 수 있는 타격을 제공할 것이다. 막 및 세제에 단순히 결합하여 상이한 분석시험들에서 잠재적 리간드로 보이는 분자들은 본 명세세에 기재된¹⁹F 실험에서는 검출되지 않을 것이다. 기준 분자와 경쟁하는 분자들만이 동정된다. 결국, 상기 실험은 식물 및 곰팡이 추출물의 스크리닝 및 유기 세포 내 분자의 스크리닝에도 사용될 수 있다.

결론

따라서, 경쟁 결합 실험과 함께¹⁹F 원자를 함유하는 약한 친화력 리간드를 사용하는 것은 단백질, DNA 또는 RNA 단편에 대한 큰 화학적 혼합물의 신속한 스크리닝을 가능하게 한다. 또한, 상기 방법은 확인된 NMR-타격의 결합 상수를 직접 결정하도록 한다.

¹⁹F 경쟁 결합 HTS 실험을 사용한 경우에는 중첩의 문제가 발생하지 않고,¹⁹F 핵의 고 감도(¹H 감도의 0.83 배)로 인해, 큰 화학적 라이브러리 또는 천연물 추출물을 신속하게 스크리닝하는 것이 가능하다. 또한, 상기 실험은 고 농도의 비변성 세제의 존재 하에서 단백질 용액에 수행될 수 있기 때문에, 막 단백질을 갖는 HTS를 제공하게 한다. 또한, 스크리닝되는 실제 분자로부터의 공명이 사용되지 않기 때문에, 플루오로 잔기를 함유시키는 데 오직 스파이 및 대조 분자만이 요구된다. 따라서, 불소-based 경쟁 스크리닝은 제약 산업에서 널리 사용되어야 할 것이고, NMR-based 스크리닝의 영향을 약품 개발 공정분야까지 더 확장시켜야만 한다.

상기 방법은 신속하고 단백질의 제한된 양만을 요구하기 때문에, 고 처리량 스크리닝에서 사용되는 다른 정립된 비-NMR 기법보다 우수하다. 또한, 상기 방법은 단일 실험 내에서 NMR-타격의 결합 상수에 대한 의미있는 값을 제공한다.

중첩이 발생하지 않기 때문에 조합 화학, 의약 화학 또는 천연물 추출로부터 유래하는 큰 화학적 혼합물의 스크리닝이 가능하다. 또한, 이 접근으로 상이한 세제에 용해된 막 단백질에 대한 스크리닝도 가능하다. 결국, 이러한 실험은 유기 세포 내 위치한 수용체에 대한 분자들을 스크리닝하는 데 확장될 수 있을 것으로 예상된다.

본 명세서에서 언급된 특허, 특허 문서, 및 공보의 전체 내용은 본 명세서에 개별적으로 인용되었더라도 그 전문이 참고 문헌으로 인용된다. 당업자는 본 발명의 범위 및 기술 사상에서 벗어남이 없이 본 발명에 대한 다양한 변형 및 변화가 가능하다는 점을 명확히 이해할 것이다. 본 명세서에 기재된 예시적 실시양태 및실시예는 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니라는 점이 이해되어야 한다. 이러한 실시예 및 실시양태들은 단지 예로써 제공된 것이며 본 발명의 범주는 오직 하기에 나타낸 청구 범위에 의해서만 한정될 수 있는 것으로 의도된다.

Claims

표적 분자와 상호작용하는¹⁹F-표지 기준 화합물을 제공하는 단계;

상기 표적 분자의 존재 하에서¹⁹F-표지 기준 화합물의 1D¹⁹F 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하는 단계;

하나 이상의 시험 화합물을 포함하는 시험 샘플을 제공하는 단계;

각 시험 샘플 및 표적 분자의 존재 하에서¹⁹F-표지 기준 화합물의 1D¹⁹F 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하는 단계;

표적 분자의 존재 하에서의¹⁹F-표지 기준 화합물의 스펙트럼을, 각 시험 샘플 및 표적 분자의 존재 하에서의¹⁹F-표지 기준 화합물의 스펙트럼과 비교하여¹⁹F-표지 기준 화합물 공명들 중 하나 이상에서의 변화를 측정하는 단계; 및

표적 분자와 상호작용하며¹⁹F-표지 기준 화합물을 변위시키는 하나 이상의 시험 화합물을 동정하는 단계

를 포함하는, 표적 분자에 대한 리간드 동정 방법.
제1 항에 있어서, 상기 시험 화합물이 적어도 기준 화합물만큼은 강한 결합 친화력을 갖는 것인 방법.
제1 항에 있어서, 상기 기준 화합물 공명들 중 하나 이상에서의 변화가 하나 이상의 기준 공명에서의 신호 강도의 상승을 포함하는 것인 방법.
제1 항에 있어서, 상기 하나 이상의 시험 화합물을 동정하는 단계가 각각의 시험 화합물 및 표적 분자의 존재 하에서¹⁹F-표지 기준 화합물의 각각의 1D¹⁹F 핵자기 공명 스펙트럼을 기록하는 것을 포함하는 것인 방법.
제1 항에 있어서,

표적 분자의 존재 하에¹⁹F-표지 기준 화합물의 다양한 농도에서 상기 기준 화합물의 1D¹⁹F 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하는 단계; 및

상기 시험 화합물의 해리 상수를 결정하는 단계

를 추가로 포함하는 방법.
제1 항에 있어서,

표적 분자의 존재 하에 표적 분자의 다양한 농도에서¹⁹F-표지 기준 화합물의 1D¹⁹F 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하는 단계; 및

상기 시험 화합물의 해리 상수를 결정하는 단계

를 추가로 포함하는 방법.
제1 항에 있어서, 비교 단계에서 사용하기 위해 표적 분자의 존재 하에¹⁹F-표지 기준 화합물의 1D¹⁹F 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하기 전에,

표적 분자의 다양한 농도에서 또는¹⁹F-표지 기준 화합물의 다양한 농도에서 표적 분자의 존재 하에서¹⁹F-표지 기준 화합물의 1D¹⁹F 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하는 단계; 및

상기 표적 분자와 상호작용하는 하나 이상의 시험 화합물을 동정하기 위한 최적의 실험 조건을 결정하는 단계

를 포함하는 방법.
제1 항에 있어서, 상기 표적 분자가 거대분자인 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 거대분자가 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드인 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 거대분자가 단백질인 방법.
제1 항에 있어서, 상기 기준 화합물이 표적 분자와 마이크로몰 범위의 결합 친화력으로 결합하는 방법.
제11 항에 있어서, 상기 기준 화합물의 결합 친화력이 등온 적정 열량계 또는 형광 분광기에 의해 결정되는 것인 방법.
제1 항에 있어서, 상기 기준 화합물을 동정하는 단계가

표적 분자의 부재 하에서 잠재적 기준 화합물의 워터로그시(WaterLOGSY) 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하는 단계;

표적 분자의 존재 하에서 잠재적 기준 화합물의 워터로그시 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하는 단계; 및

상기 워터로그시 스펙트럼들을 비교하여 상기 잠재적 기준 화합물이 표적 분자와 상호작용하는지 여부를 밝히는 단계

를 추가로 포함하는 것인 방법.
제1 항에 있어서, 상기 시험 샘플이 두 가지 이상의 시험 화합물의 혼합물을 포함하는 것인 방법.
제14 항에 있어서,

각각의 시험 화합물 및 표적 분자의 존재 하에서¹⁹F-표지 기준 화합물의 1D¹⁹F 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하는 단계; 및

표적 분자의 존재 하의 기준 화합물의 스펙트럼을 각각의 시험 화합물 및 표적 분자의 존재 하의 기준 화합물의 스펙트럼과 비교하여, 선택된¹⁹F-표지 기준 화합물 공명에서의 변화를 측정하는 단계

를 추가로 포함하는 방법.
제1 항에 있어서, 상기 시험 화합물이 상기 기준 화합물보다 강한 결합 친화력을 갖는 것인 방법.
제1 항에 있어서,

상기¹⁹F-표지 기준 화합물을 제공하는 단계가¹⁹F-표지 기준 화합물 및 정해진 선폭, 진폭 및 주파수를 갖는 ERETIC 신호를 제공하는 단계를 포함하고;

표적 분자의 존재 하에서¹⁹F-표지 기준 화합물의 1D¹⁹F 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하는 단계가 표적 분자의 존재 하에서 ERETIC 신호를 갖는¹⁹F-표지 기준 화합물의 스펙트럼을 수집하는 단계를 포함하며;

각 시험 샘플 및 표적 분자의 존재 하에서¹⁹F-표지 기준 화합물의 1D¹⁹F 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하는 단계가 각 시험 샘플 및 표적 분자의 존재 하에서 ERETIC 신호를 갖는¹⁹F-표지 기준 화합물의 스펙트럼을 수집하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제1 항에 있어서,

상기¹⁹F-표지 기준 화합물을 제공하는 단계가¹⁹F-표지 기준 화합물 및¹⁹F-표지의 상호작용하지 않는 화합물을 제공하는 단계를 포함하고;

표적 분자의 존재 하에서¹⁹F-표지 기준 화합물의 1D¹⁹F 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하는 단계가 표적 분자의 존재 하에서¹⁹F-표지 기준 화합물 및¹⁹F-표지의 상호작용하지 않는 화합물의 스펙트럼을 수집하는 단계를 포함하며;

각 시험 샘플 및 표적 분자의 존재 하에서¹⁹F-표지 기준 화합물의 1D¹⁹F 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하는 단계가 각 시험 샘플 및 표적 분자의 존재 하에서¹⁹F-표지 기준 화합물 및¹⁹F-표지의 상호작용하지 않는 화합물의 스펙트럼을 수집하는 단계를 포함하는 것인 방법.
하나 이상의 시험 화합물의 제1 1D¹⁹F 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하는 단계;

하나 이상의 시험 화합물을 표적 분자에 노출시키는 단계;

표적 분자에 노출된 하나 이상의 시험 화합물의 제2 1D¹⁹F 핵자기 공명 스펙트럼을 수집하는 단계; 및

제1 스펙트럼과 제2 스펙트럼을 비교하여 공명들 중 하나 이상에서의 변화를 측정하고, 표적 분자와 상호작용하는 하나 이상의 시험 화합물을 동정하는 단계

를 포함하는, 표적 분자에 대한 리간드를 동정하기 위해 화합물을 스크리닝하는 방법.
제1 항에 있어서, 상기 시험 샘플을 제공하는 단계가, 각 시험 샘플이 하나 이상의 시험 화합물을 포함하는 것인 다수의 시험 샘플을 제공하는 단계를 포함하는 방법.