JP2005536763A - 高処理量スクリーニングのためのフッ素nmrの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
実施例(I)における第1組の実験については、セリン/トレオニンp21活性化キナーゼのキナーゼドメイン(分子量約34000)を大腸菌中でGST融合タンパク質として発現させ、GSTタグの除去後に均質になるまで精製した。NMR試料をリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS、コード:P−3813、ロット番号100K8211(Sigma))、pH7.4中に入れた。ロックシグナルのために、D2Oをその溶液に添加した(最終濃度8%)。重水素化DMSO中の濃縮ストック溶液に小分子を調製して、253Kで保存した。
実施例(I)における第1組の実験に関しては、試料管理システム(SMS)自動試料採取器を装備したバリアン・イノーバ(Varian Inova)600MHz(19Fに関しては564MHz)NMR分光計を用いて、293Kで全てのNMRスペクトルを記録した。励起スカルプティングシーケンス(sculpting sequence)を用いて、1H検出実験における水抑制を達成した(T.-L. Hwang, J. Magn. Reson. A, 112, 275-279 (1995))。このスキームにおける2つの水選択的180°方形パルスおよび4つのパルス磁場勾配は、持続時間中がそれぞれ2.6および1ミリ秒(ms)であった。
励起光線に対して垂直に配置された補助光電子増倍管を用いたジャスコ(Jasco)J−715偏光分光測光装置で、蛍光測定値を得た。励起波長は310nm(帯域幅5nm)であり、385nmカットオフフィルターを用いた。親和性測定は、NMR実験に関して用いたのと同一供給元の脂肪酸フリーのHSAを用いて行なった。5μMのEDTAの存在下で、リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS、コード:P−3813、ロット番号100K8211(Sigma))、pH7.4中に検体およびHSA溶液を調製した。使用前に、緩衝液を0.2μmフィルターに通して濾過した。路長1.0cmの石英セル中に検体の3μM溶液2.0mLをアリコート化し、HSA(ストック濃度250μM)で溶液を滴定することによりアルブミン親和性を決定した。
OMEGA滴定微小熱量計(Microcal, Inc., Northampton, MA)を用いて、等温滴定熱量測定実験を実施した。滴定微小熱量計は、断熱閉鎖容器中に保持された試料および基準セルからなっていた。基準セルにPBSを充填した。PBS+2%DMSO中のHSAの23μM溶液を、1.37mL試料セル中に入れた。同一緩衝液中の0.8mMの検体を、250μL注射器中に保持した。25℃で保持された試料セル中に、コンピューター制御のステッパモーターにより、検体の30回注入(各々8μL、12秒/1回注入)を行った。注射器撹拌速度は400rpmであった。マイクロカル(Microcal)ナノボルトプリアンプに接続された熱電装置により、各注射器により吸着または放出される熱を測定した。結合相互作用に関する滴定等温線は、各注入に関する示差熱流で構成された。PBS中への検体の注入により得られる希釈熱は、無視できる程度であった。計器に含まれた反復非線形最小二乗アルゴリズムを用いて、結合等温線を単一結合部位モデル(T. Wiseman et al., Anal. Biochem., 179, 131-137 (1989))に適合させた。
結果および考察
19F緩和理論
19Fの縦緩和は、高分子と相互作用する小分子を同定するために必要とされる直接的なτc依存性を欠くため、競合結合実験のための良好なパラメーターではない。しかしながら、以下の方程式により示されるように、横緩和率R2は、それが異核種19F−1H双極子相互作用に関して、ならびに19F化学シフト異方性(CSA)相互作用に関して、0周波数で算定されるスペクトル密度を含むため(M. Goldman, Quantum Description of High-Resolution NMR in Liquids, Clarendon Press, Oxford, (1988))、優れたパラメーターである:
NMRスクリーニング実験は、典型的にはタンパク質より10〜100倍余分量のリガンドを用いて行われる(結合リガンドの小画分のみを生じる)ので、先の節における各項(Δσ、B0、δfree−δbound、1/K−1等)は、基準化合物の選択において重要になる。タンパク質に結合された基準化合物の19Fシグナルの化学シフトは、タンパク質に誘導されたシフトの寄与のために、遊離のリガンドの化学シフトと比較して非常に異なり得る(J.T. Gerig, Prog. NMR Spectrosc., 26, 293-370 (1994);およびJ. Feeney et al., J. Am. Chem. Soc., 118, 8700-8706 (1996))。従って、μM範囲での中程度の結合親和性を有する分子でさえ、一方は結合形態にそして他方は遊離形態に関する2つの別個の共鳴をもった19Fスペクトルを提示することができるであろう。これは、2つの共鳴の化学シフトの差が、遊離状態の種および結合状態の種の間での交換率と比較して大きいという事実から生じる。HTSにおいては、結合形態の非常にブロードな共鳴の観察を可能にするためにはタンパク質の濃度は低くなる(low)(数百nMから1〜5μM)ので、遊離リガンドの周波数でのシグナルのみがモニタリングされる。
結果および考察
理論
19F NMRシグナルの感度は、(γF/γH)3(式中、γFおよびγHはそれぞれフッ素およびプロトンの磁気回転比である)に比例する。19Fは唯一の安定なフッ素同位元素であり、スピン1/2を有するという事実のために感度が高く、プロトンの0.83倍である。フッ素シグナルは、プロトンデカップリングの存在下で一重項共鳴として出現し、従って強い。
表1は、3つの異なる市販化学ライブラリーの中の、フッ素原子を含有する分子の周波数を報告する。この表には、これらの実験にしばしば用いられる2つの基礎構造、モノフルオロベンゼンおよびトリフルオロメチルベンゼンの数も含まれている。フッ素原子を含有する分子が多数存在することにより、化学合成に頼らずにスパイ分子および対照分子を選択することは容易な作業になる。
CF3基を含有する基準分子は、フッ素シグナルの高感度という利点を有する。図6は、異なる濃度のHSAの存在下において取得時間中にプロトンデカップリングを用いて記録された、基準分子、即ち、5−[1−メチル−3(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−5−イル]−2−チオフェンカルボン酸(1)および対照分子1−[5−(トリフルオロメチル)1,3,4−チアジアゾール−2−イル]ピペラジン(2)の典型的スピン−エコー19Fスペクトルを示している。(2)を用いて実施されたITC測定は、NMRの結果と一致して、HSAとの結合の如何なる証拠(30μMのHSA中への800μMの(2)の8μL注入により、希釈の熱のみを検出した)も見出せなかった。両分子について、25μMの濃度のみをNMR実験に用いた。基準分子の低濃度は、非特異的結合および凝集から生じる問題を回避する。これらの分子に伴う欠点は、結合状態であっても観察された基のC3軸の回りでのフッ素原子の高速回転によって提示される。これは、遊離状態および結合状態の間で、基準分子のCF3シグナルに関する線幅の限定された差を生じる。
CF基を有する分子は、競合リガンドベースのスクリーニング実験に特に適している。19F CSAは非常に大きく、従って方程式(3)による基準分子の遊離状態および結合状態間の線幅における差を増大することができる。例えば芳香族CFに関するCSAは、モノフルオロベンゼンに関する71ppmから、ヘキサフルオロベンゼンに関する158ppmまでの範囲である(H. Raber et al., Chem. Phys., 26, 123-130 (1977))。更に、結合状態にある基準分子の19F CSAは、「オルト効果」により、またはタンパク質との水素結合におけるフッ素原子の直接的関与に起因して増大することができる。これら2つの現象は、遊離状態および結合状態についての等方性化学シフトにける差を大きくするという作用をも有する。弱い親和性基準化合物に関しては、方程式(6)の交換項は、タンパク質の存在下での基準化合物の線幅に有意に寄与し得る。フッ素シグナルは、通常は幾つかのプロトンとスカラー結合し、従って感度改善のためには、取得中のプロトンデカップリングを用いてスペクトルを記録する必要がある。図7は、HSA濃度の関数としてプロトンデカップリングを用いて記録された基準分子、即ち2−ヒドロキシ−3−フルオロ安息香酸(3)および対照分子(2)に関する典型的スピン−エコーフッ素スペクトルを示す。これらの分子に伴う欠点は、実験に必要とされるより高い濃度である。図7のスペクトルは、50μMの基準分子に関する濃度を用いて記録された。
基準分子および対照分子の選択後、タンパク質の関数としての滴定実験を図6および図7に示したように記録する。2つのフッ素シグナルの強度比を、図8の実施例に示したように、タンパク質結合基準分子の画分の関数としてプロットする。(C. Dalvit et al., J. Am. Chem. Soc., 124, 7702-7709 (2002);およびC. Dalvit et al., Comb. Chem. HTS, 5, 645-650 (2002))に記載されているように、他の技法(例えばITCまたは蛍光分光分析)から得られる解離結合定数を用いることにより、結合化合物の画分を算定する。これらの技法は、競合結合実験のための非常に重要なパラメーターである基準分子についての結合部位数(n)も提供する。ITC測定は、(1)に関しては4に近い、そして(3)に関しては1に近いn値を提供する。従って分子(1)は、実験結果の解釈に幾つかの制限を伴うスクリーニング目的のために依然として用いられ得るが、しかしそれはNMR−ヒット物の結合定数を得るためには用いられ得ない。分子(3)は、これらの実験に用いられる濃度でHSA上に唯一の結合部位しか存在しないのため、適切な基準分子である。その化学構造(アスピリン類似体)によれば、その推定結合部位はサドロウ(Sadlow)部位I(サブドメインIIAに位置する)である(T. Peters, Jr., All about Albumin Biochemistry, Genetics, and Medical Applications Academic Press, San Diego, U.S.A 1996)。タンパク質に結合した基準分子(3)の画分に関する2つの異なる値を、実験誤差により決定されるKDの2つの限界値を用いて、図8から抽出する。この特定の場合には、(3)に関するITC由来KDは41±3.3μMであり、従ってKDの2つの限界値はそれぞれ37.7および44.3μMに対応する。
弱い結合親和性基準分子についての大きなCSAおよび大きな交換寄与により、スクリーニングに必要なタンパク質の濃度を有意に低減することが可能である。これは図10において理解され得るが、この場合、わずか150μMの濃度のHSAの存在下において、(3)を用いてスクリーニングを実施する。大きな比[LTOT]/[ETOT](=330)および小さな比[EL]/[LTOT](=0.00165。41μMのKDを使用)にもかかわらず、結合リガンドの小画分の作用を観察し、そしてこのような低タンパク質濃度でスクリーニングを実施することが可能である。これはおそらくは幸運な場合を表している。固体状態のNMR研究によれば、フッ素原子に対してオルト位置にあるOH基の存在が、芳香族環に対して垂直な19F化学シフトテンソル構成成分における50ppmのシフトの原因であり、大きな19F CSAを生じる(H. Raber et al., Chem. Phys., 26, 123-130 (1977))。しかしながら、同様の挙動が、他のタンパク質を用いた場合、ならびにパラ−フルオロベンジル部分を含有する基準分子を用いた場合にも観察された(データは示されていない)。従って、交換項は観察された横緩和にも有意に関与すると考えられる。図10に報告したスペクトルは、128回のスキャンおよび10分間の全測定時間を用いて記録した。19F検出について最適化された極低温プローブ技法を使用することにより、検出限界を更に改善することができるであろう。次に、50〜100nMという低いタンパク質濃度を用いた。これは、多量に発現され得ないタンパク質(例えば膜タンパク質)に対する、多数の化学的混合物のスクリーニングを可能にする。フッ素スペクトルは、極低温プローブ技法を用いて非常に迅速に記録できる。極低温プローブ技法を用いた2倍の感度改善を控えめに推定すると、取得時間は4倍減少することになる。従って、図10のスペクトルはちょうど150秒で記録され、従ってこのスクリーニング工程の処理量を増強する。凍結プローブを用いて記録されたプロトン検出実験において遭遇する放射減衰の問題は、フッ素検出実験においては、スパイ分子および基準分子が低濃度であるために存在しないことが指摘されるべきである。
19Fリガンドベースの競合結合実験の特別な利点は、プロトン化溶媒、緩衝液または界面活性剤の存在下でさえ、スクリーニングを実施できることである。図11に、100mMのHEPESおよび1%グリセロールの存在下でのHSAのプロトンスペクトルを示す。緩衝液およびグリセロールの強度のシグナルは、スクリーニングを実施するために必要な基準分子および対照分子の弱いシグナルの観察を遮る。19F検出実験では、これらの問題には遭遇しない。従って、これらの困難な実験条件においても、図11に示したようなスクリーニングを実施することが可能である。これらの特性のため、フッ素リガンドベースの競合結合スクリーニング実験は、SDSまたはその他の界面活性剤中に溶解された膜タンパク質に対する分子のスクリーニングに特に有益である。いったん適切な基準分子が同定されれば、19Fリガンドベースの競合結合NMRスクリーニングが信頼できるヒットを提供する。膜および界面活性剤と簡単に結合する、そして異なるアッセイにおける潜在的リガンドとして現れる分子は、ここに記載した19F実験においては検出されない。基準分子と競合する分子のみが同定される。最後に、本実験は、植物および真菌抽出物のスクリーニングのために、ならびに生きている細胞内の分子のスクリーニングのためにも用いることができる。
従って、競合結合実験と組合せた19F原子を含有する弱い親和性リガンドの使用は、タンパク質、DNAまたはRNA断片に対する大きな化学的混合物の迅速スクリーニングを可能にする。本方法は更に、同定されたNMR−ヒット物の結合定数の直接的な決定を提供する。
Claims (20)
- 標的分子に対するリガンドを同定する方法であって:
前記標的分子と相互作用する19F標識された基準化合物を提供することと;
前記標的分子の存在下における、前記19F標識された基準化合物の1D19F核磁気共鳴スペクトルを収集することと;
少なくとも1つの被検化合物を含む被検試料を準備することと;
前記被検試料および前記標的分子の各々の存在下における、前記19F標識された基準化合物の1D19F核磁気共鳴スペクトルを収集することと;
前記標的分子の存在下における19F標識された基準化合物のスペクトルを、前記被検試料および標的分子の各々の存在下における19F標識された基準化合物のスペクトルと比較して、1つまたは複数の前記19F標識された基準化合物共鳴における変化を決定することと;
前記標的分子と相互作用する少なくとも1つの前記被検化合物を同定することと;
を含んでなり、
前記被検化合物が、前記19F標識された基準化合物を置換する方法。 - 請求項1に記載の方法であって、前記被検化合物が、少なくとも前記基準化合物の結合親和性と同程度の緊密な結合親和性を有する方法。
- 請求項1に記載の方法であって、1つまたは複数の基準化合物共鳴における変化が、少なくとも1つの基準共鳴におけるシグナル強度の増大を含んでなる方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記少なくとも1つの被検化合物を同定することが、前記被検化合物および前記標的分子の各々の存在下における、19F標識された基準化合物の別個の1D19F核磁気共鳴スペクトルを記録することを含んでなる方法。
- 請求項1に記載の方法であって:更に、
19F標識された基準化合物の異なる濃度において、前記標的分子の存在下における前記基準化合物の1D19F核磁気共鳴スペクトルを収集することと;
前記被検化合物の解離定数を決定することと;
を含んでなる方法。 - 請求項1に記載の方法であって:更に、
前記標的分子の異なる濃度において、前記標的分子の存在下における19F標識された基準化合物の1D19F核磁気共鳴スペクトルを収集することと;
前記被検化合物の解離定数を決定すること;
を含んでなる方法。 - 請求項1に記載の方法であって:前記比較するステップで用いるために、前記標的分子の存在下において、前記19F標識された基準化合物の1D19F核磁気共鳴スペクトルを収集する前に、更に、
前記標的分子の異なる濃度または前記19F標識された基準化合物の異なる濃度において、前記標的分子の存在下における前記19F標識された基準化合物の1D19F核磁気共鳴スペクトルを収集することと;
前記標的分子と相互作用する少なくとも1つの前記被検化合物を同定するための最適実験条件を決定することと;
を含んでなる方法。 - 前記標的分子は高分子である、請求項1に記載の方法。
- 前記高分子はポリペプチドまたはポリヌクレオチドである、請求項8に記載の方法。
- 前記高分子はタンパク質である、請求項8に記載の方法。
- 前記基準化合物はマイクロモル範囲の結合親和性で前記標的分子と結合する、請求項1に記載の方法。
- 前記基準化合物の結合親和性が等温滴定熱量測定または蛍光分光分析により決定される、請求項11に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法であって:更に、前記基準化合物を同定する工程を含んでなり、該工程は、
標的分子の非存在下における、潜在的な基準化合物のWaterLOGSY核磁気共鳴スペクトルを収集することと;
標的分子の存在下における、潜在的な基準化合物のWaterLOGSY核磁気共鳴スペクトルを収集することと;
前記二つのWaterLOGSYスペクトルを比較して、前記潜在的な基準化合物が標的分子と相互作用するか否かを同定することと;
を含んでなる方法。 - 前記被検試料は2つまたはそれ以上の前記被検化合物の混合物を含む、請求項1に記載の方法。
- 請求項14に記載の方法であって:更に、
前記被検化合物および前記標的分子の各々の存在下における、前記19F標識された基準化合物の1D19F核磁気共鳴スペクトルを収集することと;
前記標的分子の存在下における前記基準化合物のスペクトルを、前記被検化合物および標的分子の各々の存在下おける基準化合物のスペクトルと比較して、選択された19F標識された基準化合物共鳴における変化を決定することと;
を含んでなる方法。 - 前記被検化合物は前記基準化合物のものより緊密な結合親和性を有する、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法であって:
前記19F標識された基準化合物を準備することは、前記19F標識された基準化合物、ならびに定義された線幅、振幅および周波数を有するERETICシグナルを提供することを含み、
前記標的分子の存在下における19F標識された基準化合物の1D19F核磁気共鳴スペクトルを収集することは、前記標的分子の存在下において、ERETICシグナルを有する19F標識された基準化合物のスペクトルを収集することを含み、
前記被検試料および標的分子の各々の存在下における19F標識された基準化合物の1D19F核磁気共鳴スペクトルを収集することは、前記被検試料および前記標的分子の各々の存在下において、ERETICシグナルを有する19F標識された基準化合物のスペクトルを収集することを包含する方法。 - 請求項1に記載の方法であって:
前記19F標識された基準化合物を準備することは、前記19F標識された基準化合物および19F標識された非相互作用化合物を提供することを含み、
前記標的分子の存在下における19F標識された基準化合物の1D19F核磁気共鳴スペクトルを収集することは、前記標的分子の存在下における19F標識された基準化合物および19F標識された非相互作用化合物のスペクトルを収集することを含み、
前記被検試料および標的分子の各々の存在下における19F標識された基準化合物の1D19F核磁気共鳴スペクトルを収集することは、前記被検試料および標的分子の各々の存在下における19F標識された基準化合物および19F標識された非相互作用化合物のスペクトルを収集することを含む方法。 - 標的分子に対するリガンドを同定するための化合物をスクリーニングする方法であって:
少なくとも1つの被検化合物の一次1D19F核磁気共鳴スペクトルを収集することと;
少なくとも1つの被検化合物を標的分子に曝露することと;
該標的分子に曝露された少なくとも1つの被検化合物の二次1D19F核磁気共鳴スペクトルを収集することと;
前記一次および二次スペクトルを比較して、1つまたは複数の共鳴における変化を決定し、それによって標的分子と相互作用する少なくとも1つの被検化合物を同定することと;
を含んでなる方法。 - 請求項1に記載の方法であって、前記被検試料を提供することは複数の被検試料を提供することを含み、各被検試料は少なくとも1つの被検化合物を含む方法。
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