WO2005094895A1 - Herstellung und verwendung des konjugats methotrexat-albumin als mittel zur immunsuppression bei gvhd - Google Patents

Herstellung und verwendung des konjugats methotrexat-albumin als mittel zur immunsuppression bei gvhd Download PDF

Info

Publication number
WO2005094895A1
WO2005094895A1 PCT/EP2005/003460 EP2005003460W WO2005094895A1 WO 2005094895 A1 WO2005094895 A1 WO 2005094895A1 EP 2005003460 W EP2005003460 W EP 2005003460W WO 2005094895 A1 WO2005094895 A1 WO 2005094895A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
organic compound
protein
carboxyl group
use according
methotrexate
Prior art date
Application number
PCT/EP2005/003460
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hannsjörg SINN
Original Assignee
Albupharm Heidelberg Gmbh & Co
Sinn Hannsjoerg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Albupharm Heidelberg Gmbh & Co, Sinn Hannsjoerg filed Critical Albupharm Heidelberg Gmbh & Co
Priority to US10/594,876 priority Critical patent/US7781406B2/en
Priority to EP05730909A priority patent/EP1732611A1/de
Priority to CA002561394A priority patent/CA2561394A1/en
Publication of WO2005094895A1 publication Critical patent/WO2005094895A1/de

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection

Definitions

  • the present invention relates to the use of drug-protein conjugates for modulating and in particular for avoiding transplant-associated immune reactions. Furthermore, new, advantageous production methods for the conjugates which can be used according to the invention are provided.
  • Active substance-protein conjugates are used to obtain longer half-lives when administering therapeutic and / or diagnostic active substances by coupling foreign substances to a protein in the body (cf. DE 41 22 210 A1 or WO96 / 32133).
  • a protein in the body cf. DE 41 22 210 A1 or WO96 / 32133.
  • the uptake of proteins by proliferating tumor cells is used to accumulate the active substance bound to proteins in such cells, whereas healthy tissue has no reason to take up proteins. This enables the active substances to be accumulated in tumor cells.
  • DE 41 22 210 A1 describes conjugates of a tumor-active compound which has at least one carboxyl group and a protein which is not regarded as foreign by the organism, the protein being in native form. These conjugates are used for the treatment of tumor diseases, but not for transplant-associated immune reactions. A method for producing such conjugates is also described.
  • European patent application EP 0 879 604 A1 describes conjugates comprising a folic acid antagonist and a carrier, preferably native ones
  • Protein process for their preparation and their use for the treatment of tumor diseases, inflammation and / or Autoimmune diseases, but not known for the treatment of transplant-associated immune reactions.
  • Allogeneic bone marrow transplants are being used to an increasing extent in high-dose radiation therapy, therapy in haematological-oncological diseases, for example of leukemia, lymphoma, aplastic anemia or renal cell carcinoma.
  • haematological-oncological diseases for example of leukemia, lymphoma, aplastic anemia or renal cell carcinoma.
  • GVHD graft versus host disease
  • the immunomodulatory drugs used up to now have reduced the mortality of acute and chronic GVHD in part, but fail in some of the patients and are sometimes associated with considerable side effects. As a result of broad immunosuppression, the risk of systemic infection dominates here. In addition, there are a number of drug-specific organ toxicities of the drugs previously used, which lead to complications, particularly under the often lengthy use over weeks or months.
  • This object is achieved according to the invention by using a conjugate comprising an organic compound containing carboxyl groups and a protein for producing a medicament for modulating a transplant-associated immune reaction.
  • conjugates of carboxyl group-containing organic compounds and proteins in particular albumin or transferrin, can also be used successfully for modulating transplant-associated immune reactions.
  • the conjugates used according to the invention contain an organic compound containing carboxyl groups, which is in particular an active ingredient, more preferably a low molecular weight active ingredient with a molecular weight 1000 1000 Da and more preferably 500 500 Da.
  • the active substance is particularly preferably a cytostatic or an immunosuppressant.
  • Methotrexate or aminopterin is particularly preferably used, most preferably methotrexate.
  • the folic acid antagonist methotrexate or 4-amino-4-deoxy-10-methylfolic acid (C20H22N8O5) is a cytostatic.
  • This drug is a proven low molecular weight drug in the prophylaxis of GVHD and has a dose-dependent immunosuppressive effect.
  • a high concentration and in particular an immunosuppressive amount of the active ingredient can be achieved at the desired site of action, with administration being overall low and thus free of side effects.
  • the conjugate according to the invention comprises proteins in native form.
  • the protein preferably has a molecular weight of 18 18,000 Da, more preferably 50 50,000 Da.
  • a corresponding native protein in particular albumin
  • albumin is favorably selected, for example a human protein for administration to humans and for administration to animals, for example mice, corresponding to an rvlaus protein.
  • Suitable proteins are, for example, albumin, in particular human serum albumin (HSA) or transferrin.
  • HSA human serum albumin
  • Albumin is particularly preferably used as the protein.
  • conjugates are also extremely suitable for the prophylaxis or treatment of transplant-associated immune reactions, such as GVHD.
  • the conjugates used according to the invention enable a significantly more targeted and optimized effect, in particular of cytostatics and other active substances in inflammatory tissue and proliferating metabolically active cells.
  • the relevant cells are reactive lymphocytes and cells of the monocyte phagocyte system (MPS), here in particular the dendritic cells of the reactive lymphatic tissues.
  • MPS monocyte phagocyte system
  • the conjugates used according to the invention do not cause a general immune suppression in the entire organism but rather cause a selective modulation and in particular suppression of transplant-associated immune reactions and preferably of GVHD.
  • the optimized uptake is brought about in particular by the favorable kinetics of albumin, for example with a plasma half-life of approximately 19 days in humans, and by the importance of albumin as a potential nutrient for proliferating cells.
  • the conjugates according to the invention enable the active substance to be accumulated in the relevant cells over a long period Period. Due to the long biological half-life, for example, the activity level in the blood of the conjugate MTX-HSA is about 300 times greater than that of the low-molecular MTX alone.
  • conjugates used according to the invention Due to the long residence time of the conjugates used according to the invention in the body, prophylaxis and / or treatment of GVHD can be carried out successfully, even if the intervals between the individual administrations of the conjugate are more than 5 days, preferably more than 10 days, in particular more than 13 days or may even be more than 20 days. In this way it is possible to administer a corresponding maintenance dose to patients without the occurrence of side effects for years, for example every 2 to 3 weeks.
  • the conjugates according to the invention containing an active ingredient covalently bound to a protein, in particular to albumin, preferably methotrexate, are suitable for modulation and in particular for avoiding transplantation-associated immune reactions.
  • Modulation is understood here to mean any influence or change in the immune reactions and in particular an increase or decrease in the immune response, in particular by at least 10%, preferably by at least 20%. It is particularly preferred to achieve a substantial reduction by, for example, at least 50%, more preferably by at least 70%, or to avoid the transplantation-associated immune reactions.
  • This effect opens up a wide range of uses for the conjugates according to the invention for avoiding immunological complications in transplants, in particular in allogeneic or autologous bone marrow transplants, but also for avoiding recipient-mediated rejection reactions in organ transplants, in particular in organ donor transplants from, for example, kidney, heart or Liver.
  • the conjugates according to the invention can therefore advantageously be used for the treatment or / and prophylaxis of GVHD and in particular of acute or chronic GVHD.
  • the conjugates according to the invention are particularly suitable for administration to humans.
  • the conjugates according to the invention are generally administered intravenously.
  • 0.1 to 1000 mg conjugate per kg body weight, in particular 1 to 100 mg conjugate per kg body weight are preferably administered as the dose unit.
  • an effect can already be achieved at a low dosage of, for example, 5 5 mg and in particular ⁇ 3 mg conjugate per kg of body weight.
  • the molar ratio of active ingredient to carrier protein is preferably 1: 1000 to 2: 1, in particular 1: 100 to 1.1, particularly preferably 0.9 to 1.1: 1.
  • albumin still shows native behavior when loaded with methotrexate 1: 1.
  • a dose unit of active ingredient is preferably 0.1 to 100 mg per kg body weight, in particular 1 to 10 mg per kg body weight, often small dose units of 5 5 mg, in particular 2 2 or ⁇ 1 mg per kg body weight being particularly preferred. Because of the long residence time of the conjugates in humans, administration of at most one dose unit per day, preferably per week, more preferably per 2 weeks, is sufficient. For animals, for example mice, one dose unit is preferably administered per day.
  • Efficient covalent coupling of the active ingredient to the carrier molecule is important for the preparation of the conjugates used according to the invention.
  • the coupling must not lead to an undesirable change in the carrier protein and / or the active substance.
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • insoluble substances are formed during the activation, some of which fail during the activation and some when the activated active substance is introduced into an aqueous protein solution and, in order that the conjugate can be administered medically, in addition to that through time-consuming and expensive filtration steps actual product cleaning must be separated and are never 100% (because of the lipophilic domains in the albumin).
  • This object was achieved according to the invention by a process for producing a conjugate containing i) a carboxyl group-containing organic compound, in particular methotrexate and ii) a protein, in particular albumin, which is characterized in that a carboxyl group-containing organic compound and a protein in the presence of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide and implemented by N-hydroxysuccinimide.
  • the activation is preferably carried out at a temperature of 10 to 100 ° C, more preferably 20 to 70 ° C and even more preferably 40 to 65 ° C for a reaction time of 1 minute to 10 hours, more preferably 10 to 30 minutes.
  • the activated active substance is preferably reacted with the carrier protein at a temperature between 10 and 50 ° C., in particular between 20 and 40 ° C.
  • the carboxyl-containing compound in particular methotrexate, is preferably activated with 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide and N-hydroxysuccinimide in an organic solvent, preferably in dimethylacetamide.
  • organic solvent preferably in dimethylacetamide.
  • suitable organic solvents are, for example, DMSO (dimethyl sulfoxide) or dioxane.
  • the activation is preferably carried out with the exclusion of water, in particular in the presence of 5 5% by weight of water, more preferably 1 1% by weight of water and most preferably completely anhydrous.
  • a major advantage of the production process according to the invention is that the activating reagents used, that is to say 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide and N-hydroxysuccinimide, are highly water-soluble. Coupling reagents that are not used during the reaction can thereby be removed in a simple manner from the product obtained, for example by washing with water. In contrast, with the coupling reagents used in the prior art, for example when using di-cyclohexyl-carbodimide (DCC), a non-separable residue of coupling reagent remains in the conjugate.
  • DCC di-cyclohexyl-carbodimide
  • Another preferred aspect of the invention relates to an optimized production process of a conjugate according to the invention comprising i) an organic compound containing carboxyl groups and ii) a protein which is characterized in that a
  • the carboxyl group-containing organic compound is preferably a
  • Methotrexate aminopterin and / or N-phthaloyl-L-glutamic acid, especially preferred around methotrexate.
  • the protein is preferably albumin.
  • Another advantage of the optimized method is that after the activated active ingredients AMPT, MTX or NPLG have been added to the protein, in particular albumin, a direct control of the coupling efficiency can be carried out without N-hydroxysuccinimide.
  • N-hydroxysuccinimide When using N-hydroxysuccinimide, this also has a high UV absorption in HPLC when the UV measuring cell is set to 280 nm and interferes or complicates one with its retention time of about 11.5 minutes, in which other low-molecular compounds also appear direct determination of the coupling yield. This means that in many cases the yield cannot be determined until the conjugate has been purified. Thanks to the optimized process without the use of N-hydroxysuccinimide, this factor can now be excluded. This is also of great advantage for product safety. Another advantage of the optimized method is that the coupling yield is surprisingly 98 to 99% on average.
  • the carboxyl group-containing organic compound in particular methotrexate and the protein, in particular albumin, in a molar ratio of 10: 1 to 1:10, in particular 1.5: 1 to 1: 1.5.
  • conjugates produced by the methods according to the invention can be used for numerous uses and in particular for intravenous administration.
  • such conjugates for example when using a carboxyl group-containing organic compound with an immunosuppressive effect, can advantageously be used for the production of medicaments for modulating a transplant-associated immune reaction, in particular for the production of a medicament for the prophylaxis and / or treatment of GVHD.
  • Conjugates produced according to the invention are also suitable for the production of medicaments for the treatment or / and diagnosis of inflammation, infection and / or skin diseases.
  • Figure 1 shows an HPLC chromatogram of the methotrexate-human serum albumin (MTX-HSA) conjugate prepared according to Example 1, which works according to the manufacturing process using N-hydroxysuccinimide (NHSI) and thus the synthesis of a reactive ester as an intermediate.
  • MTX-HSA methotrexate-human serum albumin
  • FIG. 2 shows the chromatogram of the MTX-HSA conjugate prepared in accordance with Example 3 without using NHSI, the carboxyl group activated with 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydroxychloride (EDC) being used directly for coupling the MTX.
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydroxychloride
  • Methotrexate is activated using 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (HSI) and then converted to MTX-HSA with albumin (HSA).
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodimide hydrochloride
  • HSI N-hydroxysuccinimide
  • Example 2 s animal experiments: (approval no. LVL M-V310-4 / 7221.3-1.2-015 / 03 State Veterinary Office Mecklenburg-Western Pomerania Rostock)
  • the long circulating, macromolecular MTX-HSA was the first statistically significant experiment with GVHD animals at the Rostock University Clinic in the department of Prof. Dr. M. Freund under the direction of PD.Dr.G. Hardening and Dr. D. Wolff.
  • 105 rats received 2 mg / kg methotrexate albumin intraperitoneally on day 0, 4, 8 and 12, while 10 further rats only received the equivalent amount of albumin intraperitoneally at the same times.
  • Methotrexate is dissolved together with 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) 0 carbodiimide hydrochloride (EDC) in DMSO, reacted by heating (activated) and then converted to MTX-HSA with albumin (HSA).
  • EDC carbodiimide hydrochloride

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Wirkstoff-Protein-Konjugaten zur Modulierung und insbesondere zur Vermeidung von Transplantation-assoziierten Immunreaktion. Weiterhin betrifft die Erfindung neue, vorteilhafte Herstellungsverfahren für die erfindungsgemäss einsetzbaren Konjugate.

Description

Herstellung und Verwendung des Konjugats Methotrexat-Albumin als Mittel zur Immunsuppression bei GVHD
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Wirkstoff-Protein- Konjugaten zur Modulierung und insbesondere zur Vermeidung von Transplantation-assoziierten Immunreaktionen. Weiterhin werden neue, vorteilhafte Herstellungsverfahren für die erfindungsgemäß einsetzbaren Konjugate bereitgestellt.
Wirkstoff-Protein-Konjugate werden verwendet, um durch Kopplung von kör- perfremden Wirkstoffen an ein körpereigenes Protein längere Halbwertszeiten bei Verabreichung von therapeutischen oder/und diagnostischen Wirkstoffen zu erhalten (vgl. DE 41 22 210 A1 oder WO96/32133). Bei der Behandlung von Tumorerkrankungen wird die Aufnahme von Proteinen durch proliferierende Tumorzellen ausgenützt, um den an Proteine ge- bundenen Wirkstoff in solchen Zellen anzureichern, während gesundes Gewebe keine Veranlassung zur Proteinaufnahme hat. Dadurch kann eine Anreicherung der Wirkstoffe in Tumorzellen erhalten werden.
So beschreibt DE 41 22 210 A1 Konjugate aus einer tumoraktiven Verbindung, die mindestens eine Carboxylgruppe aufweist, und einem Protein, das vom Organismus nicht als fremd angesehen wird, wobei das Protein in nativer Form vorliegt. Diese Konjugate werden zur Behandlung von Tumorerkrankungen, jedoch nicht bei Transplantations-assoziierten Immunreaktionen eingesetzt. Weiterhin wird ein Verfahren zur Herstellung solcher Konjugate beschrieben.
Aus der europäischen Patentanmeldung EP 0 879 604 A1 sind Konjugate, umfassend einen Folsäureantagonisten und einen Träger, bevorzugt natives
Protein, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung zur Behandlung von Tumorerkrankungen, Entzündungen und/oder Autoimmunerkrankungen, jedoch nicht zur Behandlung von Transplantations-assoziierten Immunreaktionen bekannt.
Allogene Knochenmarktransplantationen (KMT) werden in zunehmenden Maß bei der hochdosierten Strahlentherapie, Therapie haematologisch-on- kologischer Erkrankungen, beispielsweise von Leukämien, Lymphomen, aplastischer Anämie oder Nierenzellkarzinomen eingesetzt. Sie sind jedoch nach wie vor, insbesondere bedingt durch immunologische Komplikationen, beispielsweise in Form der Graft-Versus-Host-Krankheit (GVHD) mit einer erheblichen direkten und indirekten Morbidität und Mortalität assoziiert, was ihre breitere Anwendbarkeit einschränkt.
Levy offenbart in seiner Veröffentlichung (Chem. Abstracts 83 in Agents and Actions, 1975, 5. Ausgabe, Nr. 3, S. 268 - 271) die immunsuppressive Wirkung von Cyclophosphamid und Methotrexat, welche immunmodulierende Medikamente sind, auf die Graft-Versus-Host-Krankheit (GVHD) im Ratten- und Mausmodell.
Die bis zum jetzigen Zeitpunkt eingesetzten immunmodulierenden Medi- kamente konnten zwar die Mortalität der akuten und chronischen GVHD zum Teil vermindern, versagen jedoch bei einem Teil der Patienten und sind teilweise auch mit erheblichen Nebenwirkungen verbunden. Hier dominiert als Folge einer breiten Immunsuppression die Gefahr der systemischen Infektion. Dazu kom mt eine Reihe Medikamenten-spezifischer Organtoxizitäten der bisher eingesetzten Medikamente, die insbesondere unter der häufig langwierigen Anwendung über Wochen oder Monate zu Komplikationen führen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb, ein Arzneimittel bereitzustellen, mit dem die im Stand der Technik auftretenden Schwierigkeiten überwunden werden können und mit dem insbesondere die Ü erlebensrate bei allogenen Knochenmarktransplantationen verbessert werden kann. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung eines Konjugats, umfassend eine Carboxylgruppen-haltige organische Verbindung und ein Protein zur Herstellung eines Arzneimittels zur Modulierung einer Transplantations-assoziierten Immunreaktion.
Es wurde nun festgestellt, dass Konjugate aus Carboxylgruppen-haltigen organischen Verbindungen und Proteinen, insbesondere Albumin oder Transferrin auch erfolgreich zur Modulierung von Transplantations-assozi- ierten Immunreaktionen eingesetzt werden können.
Die erfindungsgemäß eingesetzten Konjugate enthalten eine Carboxylgruppen-haltige organische Verbindung, bei der es sich insbesondere um einen Wirkstoff, mehr bevorzugt um einen niedermolekularen Wirkstoff mit einem Molekulargewicht ≤ 1000 Da und mehr bevorzugt ≤ 500 Da handelt. Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Wirkstoff um ein Cytostatikum bzw. um ein Immunsuppressivum. Besonders bevorzugt wird Methotrexat bzw. Aminopterin, am meisten bevorzugt Methotrexat eingesetzt. Der Fol- säure-Antagonist Methotrexat oder 4-Amino-4-desoxy-10-methylfolsäure (C20H22N8O5) ist ein Cytostatikum. Dieser Wirkstoff ist ein bewährter niedermolekularer Wirkstoff bei der Prophylaxe von GVHD und hat eine Dosisabhängige immunsuppressive Wirkung. In der erfindungsgemäß verabreichten Konjugatform kann bei insgesamt geringer und somit nebenwirkungsfreier Verabreichung eine hohe Konzentration und insbesondere eine immun- suppressive Menge des Wirkstoffs am gewünschten Wirkort erreicht werden.
Das erfindungsgemäße Konjugat umfasst Proteine in nativer Form. Das Protein weist bevorzugt als Molekulargewicht von ≥ 18.000 Da, mehr bevor- zugt ≥ 50.000 Da auf. Günstigerweise wird, je nach Patient, dem das Konjugat verabreicht werden soll, ein entsprechendes natives Protein, insbesondere Albumin ausgewählt, also beispielsweise für die Verabreichung an Menschen ein humanes Protein und bei der Verabreichung an Tiere, bei- spielsweise Mäuse, entsprechend ein rvlaus-Protein. Geeignete Proteine sind z.B. Albumin, insbesondere humanes Serumalbumin (HSA) oder Trans- ferrin. Besonders bevorzugt wird Albumin als Protein eingesetzt.
Die kovalente Bindung niedermolekularer Wirkstoffe an das Makromolekül Albumin wird beispielsweise in der DE 41 22 210 A1 oder in der WO 96/32133 beschrieben, wobei dort das Konjugat zur Behandlung von Tumorerkrankungen bzw. zur Behandlung von EΞntzündungs-, Infektions- und/oder Hauterkrankungen eingesetzt wird. Es wurde nun festgestellt, dass sich sol- ehe Konjugate auch hervorragend zur Prophylaxe bzw. Behandlung von Transplantations-assoziierten Immunreaktionen, wie beispielsweise GVHD eignen. Die erfindungsgemäß eingesetzten Konjugate ermöglichen eine deutlich gezieltere und optimierte Wirku ng, insbesondere von Cytostatika und anderen Wirkstoffen in entzündlichem Gewebe und proliferierenden Stoffwechsel-aktiven Zellen. Bei einer Transplantation sind die relevanten Zellen reaktive Lymphozyten und Zellen des monozyten Phagozytensystems (MPS), hier insbesondere die dendritischen Zellen der reaktiven lymphatischen Gewebe. Es wurde zudem überraschenderweise festgestellt, dass die erfindungsgemäß eingesetzten Konjugate nicht eine generelle Immun- suppression im gesamten Organismus verursachen sondern vielmehr eine selektive Modulierung und insbesondere Suppression von Transplantations- assoziierten Immunreaktionen und bevorzugt von GVHD bewirken.
Die optimierte Aufnahme wird insbesondere durch eine günstige Kinetik von Albumin, beispielsweise mit einer Plasma halbwertszeit von ca. 19 Tagen im Menschen, und durch die Bedeutung von Albumin als potenzieller Nährstoff für proliferierende Zellen bewirkt. Währen bei der Verabreichung von freien Wirkstoffen der Anteil der Wirkstoffe, die in den für Transplantations-assozi- ierte Immunreaktionen relevanten Zellen nur kurzzeitig zur Wirkung gekom- men sehr gering ist, ermöglichen die erfindungsgemäßen Konjugate eine Anreicherung des Wirkstoffs in den relevanten Zellen über einen langen Zeitraum. Aufgrund der langen biologischen Halbwertszeit ist z.B. der Aktivitätsanteil im Blut des Konjugats MTX-HSA etwa 300 mal größer als der des niedermolekularen MTX alleine.
Im Organismus werden unbekannte Substanzen üblicherweise schnell ausgeschieden bzw. abgefangen, beispielsweise wasserlösliche Verbindungen über die Nieren ausgeschieden oder wasserunlösliche Verbindungen innerhalb weniger Minuten von der Leber abgefangen. Körpereigene Eiweiße, beispielsweise Albumin haben dagegen eine lange Verweilzeit im Organis- mus. Es ist in hohen Mengen in Geweben vorhanden und nicht immunogen. Durch Kopplung von an sich schnell aus dem K örper entfernt werdenden Wirkstoffen an solche körpereigene Eiweiße werden die Wirkstoffe vor den Ausscheidungs- bzw. Abfangmechanismen des Körpers verborgen und können somit ebenfalls eine lange Halbwertszeit im Körper erreichen. Da- durch ist es aber möglich, nur geringe Mengen an Wirkstoff zu verabreichen und somit gegebenenfalls auftretende Nebenwirkungen praktisch vollkommen auszuschalten. Toxische Effekte auf gesundes Gewebe oder Organe erfolgt praktisch nicht, da normale Zellen keine Veranlassung zur Proteinaufnahme haben. Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, dass die er- findungsgemaßen Konjugate nicht nur in Tumorzellen sondern auch in für Transplantations-assoziierten Immunreaktionen relevanten Zellen aufgenommen werden und somit zu einer Wirkstoffanreicherung in diesen Zellen führen.
Aufgrund der langen Verweildauer der erfindungsgemäß eingesetzten Konjugate im Körper kann eine Prophylaxe oder/und Behandlung von GVHD erfolgreich durchgeführt werden, auch wenn die Intervalle zwischen den einzelnen Verabreichungen des Konjugats mehr als 5 Tage, vorzugsweise mehr als 10 Tage, insbesondere mehr als 13 Tage oder sogar mehr als 20 Tage betragen. Auf diese Weise ist es möglich, Patienten ohne das Auftreten von Nebenwirkungen über Jahre hinweg z.B. alle 2 bis 3 Wochen eine entsprechende Erhaltunsdosis zu verabreichen. Die erfindungsgemäßen Konjugate enthaltend einen kovalent an ein Protein, insbesondere an Albumin gebundenen Wirkstoff, bevorzugt Methotrexat, eignen sich zur Modulierung und insbesondere zur Vermeidung von Transplantation-assoziierten Immunreaktionen. Unter Modulierung wird dabei hierin jede Beeinflussung bzw. Veränderung der Immunreaktionen verstanden und insbesondere eine Verstärkung oder Verringerung der Immunreaktion, insbesondere um mindestens 10 %, bevorzugt um mindestens 20 %. Besonders bevorzugt wird eine wesentliche Verringerung um z.B. mindestens 50 %, mehr bevorzugt um mindestens 70 % oder eine Vermei- düng der Transplantations-assoziierten Immunreaktionen erreicht. Diese Wirkung eröffnet ein breites Einsatzspektrum für die erfindungsgemäßen Konjugate zur Vermeidung immunologischer Kom plikationen bei Transplantationen, insbesondere bei allogenen ode r autologen Knochenmarktransplantationen aber auch zur Vermeidung von Empfänger-ver- mittelten Abstoßungsreaktionen bei Organtransplantationen, insbesondere bei Fremdspender-Organtransplantationen von beispielsweise Niere, Herz oder Leber.
Die erfindungsgemäßen Konjugate können deshalb vorteilhafterweise zur Behandlung oder/und Prophylaxe von GVHD und insbesondere von akuter oder chronischer GVHD eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen Konjugate eignen sich insbesondere zur Verabreichung an Menschen.
Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Konjugate erfolgt in der Regel intravenös. Für eine wirksame Behandlung werden als Dosiseinheit vorzugsweise 0,1 bis 1000 mg Konjugat pro kg Körpergewicht, insbesondere 1 bis 100 mg Konjugat pro kg Körpergewicht verabreicht. Mit den erfindungsge- mäßen Konjugaten kann bei geringer Dosierung von z.B. ≤ 5 mg und insbesondere ≤ 3 mg Konjugat pro kg Körpergewicht bereits eine Wirkung erzielt werden. In den Konjugaten beträgt das Molverhältnis von Wirkstoff zu Trägerprotein vorzugsweise 1:1000 bis 2:1, insbesondere 1 :100 bis 1,1 , besonders bevorzugt 0,9 bis 1,1 :1. So zeigt z.B. Albumin bei einer 1 :1 Beladung mit Methotrexat immer noch natives Verhalten. Eine Dosiseinheit an Wirkstoff beträgt vorzugsweise 0,1 bis 100 mg pro kg Körpergewicht, insbesondere 1 bis 10 mg pro kg Körpergewicht, wobei oftmals geringe Dosiseinheiten von ≤ 5 mg, insbesondere ≤ 2 oder < 1 mg pro kg Körpergewicht besonders bevorzugt sind. Aufgrund der langen Verweilzeit der Konjugate im Menschen ist dabei eine Gabe von höchstens einer Dosiseinheit pro Tag, bevorzugt pro Woche, mehr bevorzugt pro 2 Wochen ausreichend. Für Tiere, z.B. Mäuse, wird bevorzugt eine Dosiseinheit pro Tag verabreicht.
Für die Herstellung der erfindungsgemäß eingesetzten Konjugate ist «ine effiziente kovalente Kopplung des Wirkstoffes an das Trägermolekül (also das Protein) von Bedeutung. Bei der Kopplung darf es insbesondere nicht zu einer unerwünschten Veränderung des Trägerproteins oder/und de>s Wirkstoffes kommen. Die bisher übliche Aktivierung Carboxylgruppen-haltiger organischer Verbindungen mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) erfordert bei Raumtemperatur oder bei +4 °C mehr als 12 Stunden (DP 41 22210 A1; EP 0 879 604 A1 ; EP 0 820 308). Bei diesem Verfahren bilden sich zudem bei der Aktivierung unlösliche Substanzen, die zum Teil bereits während der Aktivierung und zum Teil beim Eintragen des aktivierten Wirkstoffs in eine wässrige Proteinlösung ausfallen und, damit das Konjugat medizinisch verabreicht werden kann, durch zeitaufwändige und teure Filtrationsschritte zusätzlich zu der eigentlichen Produktreinigung abgetrennt werden müssen und nie 100 %-ig sind (wegen der lipophilen Domänen im Albumin).
Es bestand deshalb der Bedarf ein Verfahren zur Herstellung von V\ irkstoff- Protein-Konjugaten bereitzustellen, bei dem diese Probleme nicht a uftreten und bei dem insbesondere keine wasserunlöslichen Nebenprodukte gebildet werden.
Diese Aufgabe wurde erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines Konjugats enthaltend i) eine Carboxylgruppen-haltige organische Verbindung, insbesondere Methotrexat und ii) ein Protein, insbesondere Albumin, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine Carboxylgruppen- haltige organische Verbindung und ein Protein in Gegenwart von 1 -Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)carbodiimid und von N-Hydroxysucciπimid umsetzt.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass durch die Verwendung von 1- Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC), insbesondere in Form des Hydrochlorids, eine Aktivierung der Carboxylgruppen-haltigen organischen Verbindung und eine Umsetzung mit einem Trägerprotein erreicht werden kann, ohne dass wasserunlösliche Nebenprodukte gebildet werden, die zeit- und kostenaufwändig abzutrennen wären . Durch dieses Verfahren werden Zwischenreinigungsschritte überflüssig und die Präpara- tionszeit und damit auch die Herstellungskosten werden wesentlich reduziert. Weiterhin werden Probleme, die bei der Injektion des Konjuats in einen menschlichen oder tierischen Körper durch unlösliche Substanzen oder Nebenprodukte hervorgerufen werden, vermieden.
Die Aktivierung erfolgt bevorzugt bei einer Temperatur von 10 bis 100 °C, mehr bevorzugt 20 bis 70 °C und noch mehr bevorzugt 40 bis 65 °C für eine Reaktionszeit von 1 Minute bis 10 Stunden, mehr bevorzugt von 10 bis 30 Minuten. Die Umsetzung des aktivierten Wirkstoffes mit dem Trägerprotein erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 10 u nd 50 °C, ins- besondere zwischen 20 und 40 °C.
Bevorzugt wird die Aktivierung der Carboxyl-haltigen Verbindung, insbesondere von Methotrexat mit 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid und N-Hydroxysuccinimid in einem organischen Lösungsmittel , bevorzugt in Dimethylacetamid durchgeführt. Weitere geeignete organische Lösungsmittel sind z.B. DMSO (Dimethylsulfoxid) oder Dioxan. Die Aktivierung wird vorzugsweise unter Ausschluss von Wasser durchgeführt, insbesondere in Gegenwart von ≤ 5 Gew.-% Wasser, mehr bevorzugt ≤ 1 Gew.-% Wasser und am meisten bevorzugt vollständig wasserfrei. Durch Aktivierung der Carboxylgruppen-haltigen Verbindung mit eingesetzten Substanzen EDC und N-Hydroxysucchinimid in einem organischen, wasserfreien Lösungsmittel reagieren diese nicht mit Protein, z.B. Albumin und verändern auch nicht dessen Struktur.
Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens besteht darin, dass die eingesetzten Aktivierungsreagenzien, also 1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)-carbodiimid sowie N-Hydroxysuccinimid eine hohe Wasserlöslichkeit aufweisen. Dadurch können bei der Umsetzung nicht verbrauchte Kopplungsreagenzien auf einfache Weise aus dem gewonnen Produkt, beispielsweise durch Waschen mit Wasser entfernt werden. Im Gegensatz dazu verbleibt bei den im Stand der Technik verwendeten Kopplungsreagenzien, beispielsweise bei der Verwendung von Di-cyclohexyl-carbodi- imid (DCC) ein nicht auftrennbarer Rest an Kopplungsreagenz im Konjugat. So ist bei einem Methotrexat-Albumin-Konjugats und Verwendung von DCC ein nicht abtrennbarer Rest von etwa 13 bis 15 Gew.-% an DCC im Konjugat zu beobachten, der wahrscheinlich an eine lipophile Domäne im Albumin gebunden ist. Dieser Rest kann nur mit Hilfe von HPLC nachgewiesen und nur unter erheblichem Aufwand präparativ abgetrennt werden.
Ein weiterer bevorzugter Aspekt der Erfindung betrifft ein optimiertes Herstellungsverfahren eines erfindungsgemäßen Konjugats enthaltend i) eine Carboxylgruppen-haltige organische Verbindung und ii) ein Protein, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine
Carboxylgruppen-haltige organische Verbindung und ein Protein in Gegenwart von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid umsetzt.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Carboxylgruppen-haltigen organischen Verbindung bevorzugt um ein
Cytostatikum oder Immunsuppressivum, besonders bevorzugt um
Methotrexat, Aminopterin und/oder N-Phthaloyl-L-Glutaminsäure, insbesondere bevorzugt um Methotrexat. Beim Protein handelt es sich bevorzugt um Albumin.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass sich das optimierte Verfahren, welches ohne N-Hydroxysuccinimid arbeitet, bei der Reinigungsprozedur positiv auf die Vereinfachung der Herstellung auswirkt. Durch die Verwendung von 1-Ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl) carbodiimidhydrochlorid (EDC) zur Aktivierung ohne den Zusatz von N- Hydroxysuccinimid (HSI) beträgt die Aktivierungszeit von Aminopterin (AMPT), Methotrexat (MTX) bzw. N-Phthaloyl-L-glutaminsäure (NPLG) nur noch 10 Minuten. Ein weiterer Vorteil des optimierten Verfahrens liegt darin, dass nach Zugabe der aktivierten Wirkstoffe AMPT, MTX oder NPLG zu dem vorgelegten Protein, insbesondere Albumin, ohne N-Hydroxysuccinimid eine direkte Kontrolle der Kopplungseffizienz erfolgen kann. Bei Verwendung von N-Hydroxysuccinimid besitzt dieses bei der HPLC bei einer Einstellung der UV-Messzelle auf 280 nm ebenfalls eine hohe UV- Absorption und stört oder erschwert durch seine Retentionszeit von etwa 11,5 Minuten, bei der auch andere niedermolekulare Verbindungen erscheinen, eine direkte Bestimmung der Kopplungsausbeute. Dies bedeutet, dass in vielen Fällen eine Ausbeutebestimmung erst am Ende der Reinigung des Konjugats möglich ist. Durch das optimierte Verfahren ohne Einsatz von N-Hydroxysuccinimid kann dieser Faktor nun ausgeschlossen werden. Dies ist auch für die Produktsicherheit von großem Vorteil. Ein weiterer Vorteil des optimierten Verfahrens liegt darin, dass die Kopplungsausbeute überraschenderweise durchschnittlich bei 98 bis 99 % liegt.
Somit sind die Gesamtkosten des jeweiligen Konjugats durch diese Vereinfachung der Herstellung deutlich gesenkt.
Erfindungsgemäß werden bei der Umsetzung die Carboxylgruppen-haltige organische Verbindung, insbesondere Methotrexat und das Protein, insbesondere Albumin, in einem Molverhältnis von 10:1 bis 1:10, insbesondere 1,5:1 bis 1:1,5 eingesetzt.
Die mit den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Konjugate können aufgrund ihrer hohen Reinheit für zahlreiche Verwendungen und insbesondere für eine intravenöse Verabreichung vorgesehen werden. Somit können solche Konjugate, beispielsweise bei Verwendung einer Carboxylgruppen- haltigen organischen Verbindung mit immunsuppressiver Wirkung vorteilhafterweise zur Herstellung von Arzneimitteln zur Modulierung einer Transplantations-assoziierten Immunreaktion, insbesondere zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe oder/und Behandlung von GVHD eingesetzt werden. Es ist aber auch möglich unter Verwendung von Carboxylgruppen-haltigen organischen Verbindungen mit cytostatischer Wirkung ein Arzneimittel zur Behandlung oder/und Prophylaxe oder/und Diagnose von Tumorerkrankungen herzustellen. Erfindungsgemäß hergestellte Konjugate eignen sich auch zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung oder/und Diagnose von Entzündungs-, Infektions- und/oder Hauterkrankungen.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele und die beigefügten Figuren weiter erläutert.
Figur 1 zeigt ein HPLC-Chromatogramm des gemäß Beispiel 1 hergestellten Methotrexat-Humanserumalbumin (MTX-HSA) Konjugats, das nach dem Herstellungsverfahren unter Verwendung von N-Hydroxysuccinimid (NHSI) und damit der Synthese eines reaktiven Esters als Zwischenstufe arbeitet.
Figur 2 zeigt das Chromatogramm des gemäß Beispiel 3 hergestellten MTX- HSA-Konjugates ohne Verwendung von NHSI, wobei die mit 1-Ethyl-3-(3- dimeethylaminopropyl)carbodiimid-hydroxychlorid (EDC) aktivierte Carboxylgruppe direkt zur Kopplung des MTX benutzt wird. Beispiel 1
Herstellungsbeispiel:
Methotrexat (MTX) wird mittels 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodi- imid-hydrochlorid (EDC) und N-Hydroxysuccinimid (HSI) aktiviert und an- schließend mit Albumin (HSA) zu MTX-HSA umgesetzt.
M ethotrexat-Akti vi eru ng :
20 mg Methotrexat (MTX; FG: 454, 45; Sigma-Aldrich, Taufkirchen) werden zusammen mit 25 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-hydro- Chlorid (EDC, FW: 191,7, Sigma-Aldrich, Taufkirchen) und 60 mg N-Hydroxysuccinimid (HSI, FW: 115,1 ; Sigma-Aldrich, Taufkirchen) in 2 ml Dime- thylacetamid (DMAA) gelöst. Die Reaktionsmischung wird in ein auf 60 °C vorgeheiztes Wasserbad gebracht. Nach einer Reaktionszeit von etwa 30 min wird die Aktivierungslösung, nach Abkühlung auf Raumtemperatur, langsam in eine 5 %-ige HSA-Lösung (10 ml 20 %-ige HSA-Originallösung werden mit 30 ml H2O dest. verdünnt) eingetragen.
Die Abtrennung der für die Kopplung von MTX erforderlichen Begleitstoffe (DMAA, HSI, Dimethylharnstoff und nicht gebundenes Methotrexat) erfolgt über Ultrafiltration (Dialyse) mit einer Ausschlussgrenze von 30 KD (YM 30).
Reinheitskontrolle (HPLC):
Vorsäule: 25 x 10 mm LiChrospher DIOL, 5 μm
Säule: 250 x 10 mm LiChrospher DIOL, 5 μm Laufmittel: Na-Citrat, 02 M, pH 7,4
Fluss: 1,0 ml/min
Druck: etwa 95 bar
UV-Monitor 280 nm
Retentionszeiten: dimere SA-Fraktion 5,8 min monomere SA-Fraktion 7,0 min niedermolekulares MTX 33,8 min Chromatogramm: siehe Figur 1
Beispiel 2 s Tierversuche: (Genehmigungs Nr. LVL M-V310-4/7221.3-1.2-015/03 Landesveterinäramt Mecklenburg-Vorpommern Rostock)
Mit dem lang zirkulierenden, makromolekularen MTX-HSA wurden erste statistisch signifikante Versuche mit GVHD-Tieren an der Universitätsklinik0 Rostock in der Abteilung von Prof. Dr. M. Freund unter der Leitung von PD.Dr.G. Härtung und Dr. D. Wolff durchgeführt. Dabei wurden 20 weibliche F1 hybrid BN/Lew-Ratten nach einer Ganzkörperbestrahlung mit 7,5 Gy (n = 10) oder 9 Gy (n = 10) mit 40 Millionen Knochenmarkszellen und 15 Millionen T-Lymphozyten von weiblichen Lew-Ratten transplantiert. 105 Ratten erhielten am Tag 0, 4, 8 und 12 jeweils 2 mg/kg Methotrexat-Albumin intraperitoneal, während 10 weitere Ratten lediglich die äquivalente Menge Albumin zu den identischen Zeitpunkten intraperitoneal erhielten. Im Ergebnis konnte nachgewiesen werden, dass lediglich eine Ratte aus der Gruppe, welche Methotrexat-Albumin erhielt, eine akute GVHD entwickelte,0 wärend in der Kontrollgruppe alle Tiere an den Folgen einer akuten GVHD verstarben. Signifikante Nebenwirkungen von Methotrexat-Albumin waren nicht nachweisbar, während beiden mit äquieffektiven MTX-Dosen behandelten Tieren deutliche Nebenwirkung zu beobachten waren. 5 Beispiel 3 Optimiertes Herstellungsbeispiel:
Methotrexat (MTX) wird zusammen mit 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)0 carbodiimid-hydrochlorid (EDC) in DMSO gelöst, durch Erwärmung zur Reaktion gebracht (aktiviert) und anschließend mit Albumin (HSA) zu MTX- HSA umgesetzt. Methotrexat-Akti vierung:
20 mg Methotrexat (MTX; FG: 454, 45; Sigma-Aldrich, Taufkirchen) werden zusammen mit 25 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid- hydrochlorid (EDC, FW: 191,7, Sigma-Aldrich, Taufkirchen) in 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst. Die Reaktionsmischung wird in ein auf 65 ° C vorgeheiztes Wasserbad gebracht. Nach einer Reaktionszeit von etwa 10 Minuten wird die Aktivierungslösung, nach Abkühlung auf Raumtemperatur, langsam in eine 5 %ige HSA-Lösung (10 ml 20 %ige HSA-Originallösung werden mit 30 ml Aqua dest. verdünnt) eingetragen.
Die Abtrennung der für die Kopplung von MTX (AMPT bzw. NPLG) erforderlichen Begleitstoffe (DMSO, Ethyl-3-dimethylaminopropylharnstoff und nicht gebundener Wirkstoff) erfolgt durch Ultrafiltration (Dialyse) mit einer Ausschlussgrenze von 30 KD (YM 30, Millipore).
Reinheitskontrolle (HPLC):
Vorsäule: Reprosil 200 SEC, 5 x 4 mm, 5 μm (Dr. Maisch)
Säule: Reprosil 200 SEC, 300 x 4,6 mm, 5 μm (Dr. Maisch)
Laufmittel: Na2HPO4, 0,19 M, pH 7,4 mit 5 % Methanol Fluss: 0,3 ml/min
Druck: etwa 51 bar
Retentionszeiten: dimere SA-Fraktion 8,2 min monomere SA-Fraktion 9,1 min niedermolekulares MTX 13,3 min
Chromatogramm: siehe Figur 2

Claims

Ansprüche
1. Verwendung eines Konjugats, umfassend eine Carboxylgruppen- haltige organische Verbindung und ein Protein zur Herstellung eines Arzneimittels zur Modulierung einer Transplantations-assoziierten Immunreaktion.
2. Verwendung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Vermeidung einer Transplantations-assoziierten Immunreaktion.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe oder/und Behandlung von GVHD (Graft Versus Host Disease).
4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine akute GVHD handelt.
5. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine chronische GVHD handelt.
6. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Transplantation um eine Knochenmarktransplantation handelt.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Transplantation um eine Organtransplantation, insbesondere um eine Nieren-, Herz- oder Lebertransplantation handelt.
8. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine allogene Transplantation handelt.
9. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Carboxylgruppen-haltige organische Verbindung ausgewählt ist aus Cytostatika oder Immunsuppressiva.
10. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Carboxylgruppen-haltigen organischen Verbindung um Methotrexat oder Aminopterin handelt.
11. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Polypeptid um ein natives humanes Polypeptid handelt.
12. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Polypeptid um Albumin, insbesondere um humanes Albumin handelt.
13. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Konjugat um ein Methotrexat-Albumin-Konjugat handelt.
14. Verfahren zur Herstellung eines Konjugats enthaltend i) eine Carboxylgruppen-haltige organische Verbindung und ii) ein Protein, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Carboxylgruppen-haltige organische Verbindung und ein Protein in Gegenwart von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbo- diimid und von N-Hydroxysuccinimid umsetzt.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Carboxylgruppen-haltigen organischen Verbindung um ein Cytostatikum oder ein Immunosuppressivum handelt.
16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Carboxylgruppen-haltigen organischen Verbindung um Methotrexat handelt.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein Albumin ist.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass man die Carboxylgruppen-haltige organische Verbindung in einem organischen Lösungsmittel, insbesondere in einem wasserfreien organischen Lösungsmittel mit 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid und N-Hydroxysuccinimid aktiviert und anschließend die aktivierte Carboxylgruppen-haltige organische Verbindung mit dem Protein umsetzt.
19. Verfahren zur Herstellung eines Konjugats enthaltend i) eine Carboxylgruppen-haltige organische Verbindung und ii) ein Protein, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Carboxylgruppen-haltige organische Verbindung und ein Protein in Gegenwart von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbonyldiimid umsetzt.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Carboxylgruppen-haltigen organischen Verbindung um ein Cytostatikum oder ein Immunsuppressivum handelt
21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Carboxylgruppen-haltigen organischen Verbindung um Methotrexat, Aminopterin und/oder N-Phthaloyl-L- Glutaminsäure handelt.
22. Verfahren nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Carboxylgruppen-haltigen organischen Verbindung um Methotrexat handelt.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein Albumin ist.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass man die Carboxylgruppen-haltige organische Verbindung in einem organischen Lösungsmittel, insbesondere in einem wasserfreien organischen Lösungsmittel, mit 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid umsetzt, durch Erwärmung aktiviert und anschließend die aktivierte Carboxylgruppen-haltige organische Verbindung mit dem Protein umsetzt.
PCT/EP2005/003460 2004-04-02 2005-04-01 Herstellung und verwendung des konjugats methotrexat-albumin als mittel zur immunsuppression bei gvhd WO2005094895A1 (de)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/594,876 US7781406B2 (en) 2004-04-02 2005-04-01 Production and use of the methotrexate-albumin conjugate as an immunosuppressive agent in GVHD
EP05730909A EP1732611A1 (de) 2004-04-02 2005-04-01 Herstellung und verwendung des konjugats methotrexat-albumin als mittel zur immunsuppression bei gvhd
CA002561394A CA2561394A1 (en) 2004-04-02 2005-04-01 Production and use of the methotrexate-albumin conjugate as an immunosuppressive agent in gvhd

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102004016355A DE102004016355A1 (de) 2004-04-02 2004-04-02 Herstellung und Verwendung des Konjugats Methotrexat-Albumin als Mittel zur Immunosuppression bei GVHD
DE102004016355.3 2004-04-02

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005094895A1 true WO2005094895A1 (de) 2005-10-13

Family

ID=34963916

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2005/003460 WO2005094895A1 (de) 2004-04-02 2005-04-01 Herstellung und verwendung des konjugats methotrexat-albumin als mittel zur immunsuppression bei gvhd

Country Status (5)

Country Link
US (1) US7781406B2 (de)
EP (1) EP1732611A1 (de)
CA (1) CA2561394A1 (de)
DE (1) DE102004016355A1 (de)
WO (1) WO2005094895A1 (de)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007134595A2 (de) * 2006-05-23 2007-11-29 Albupharm Heidelberg Gmbh & Co. Kg Neue, an der tumorphysiologie orientierte formulierung eines zytostatikums, insbesondere von cis-platin
US20120128703A1 (en) * 2005-03-11 2012-05-24 Kamen Barton A Aminopterin Dosage Forms and Methods for Inflammatory Disorders
US10913780B2 (en) 2016-03-24 2021-02-09 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Conjugates, their compositions, their uses, and their methods of making

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0282057A2 (de) * 1987-03-11 1988-09-14 The Board Of Regents Of The University Of Michigan Chemo-Radio-Immunkonjugate

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5688488A (en) * 1989-04-03 1997-11-18 Purdue Research Foundation Composition and method for tumor imaging
US5993805A (en) * 1991-04-10 1999-11-30 Quadrant Healthcare (Uk) Limited Spray-dried microparticles and their use as therapeutic vehicles
DE4122210C2 (de) * 1991-07-04 1999-04-01 Deutsches Krebsforsch Konjugate aus tumoraktiver Verbindung und Serumalbumin sowie Verfahren zu deren Herstellung und ihre Verwendung
US6210677B1 (en) * 1993-01-29 2001-04-03 Robert C. Bohannon Method to reduce the physiologic effects of drugs on mammals
DE69713517D1 (de) * 1996-10-15 2002-07-25 Medical Analysis Systems Inc Verfahren zur Stabilisierung von Troponin I (CTnI) durch Konjugation mit einem activen Polymer
EP0879604B1 (de) 1997-05-09 2003-04-09 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Konjugat, umfassend einen Folsäureantagonisten und einen Träger
US20030149045A1 (en) * 1999-08-20 2003-08-07 Fatih M Uckun Therapeutic compounds
US20030032631A1 (en) * 2001-08-13 2003-02-13 Mcdonald George B. Method of treatment of cancer by controlling graft-versus-leukemia using topical active corticosteriods
US7119071B2 (en) * 2002-05-21 2006-10-10 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Amino terminal substance P compositions and methods for using the same

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0282057A2 (de) * 1987-03-11 1988-09-14 The Board Of Regents Of The University Of Michigan Chemo-Radio-Immunkonjugate

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KRATZ F: "Drug conjugates with albumin and transferrin", EXPERT OPINION ON THERAPEUTIC PATENTS 2002 UNITED KINGDOM, vol. 12, no. 3, 2002, pages 433 - 439, XP002337252, ISSN: 1354-3776 *
VALLERA DANIEL A ET AL: "Anti-graft-versus-host disease effect of DT-390-anti-CD3sFv, a single-chain Fv fusion immunotoxin specifically targeting the CD3-epsilon moiety of the T-cell receptor", BLOOD, vol. 88, no. 6, 1996, pages 2342 - 2353, XP000645998, ISSN: 0006-4971 *
WOLFF DANIEL ET AL: "Methotrexate-albumin and aminopterin-albumin are effective in prophylaxis of experimental acute GVHD.", BLOOD, vol. 102, no. 11, 16 November 2003 (2003-11-16), & 45TH ANNUAL MEETING OF THE AMERICAN SOCIETY OF HEMATOLOGY; SAN DIEGO, CA, USA; DECEMBER 06-09, 2003, pages 404b, XP008047268, ISSN: 0006-4971 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120128703A1 (en) * 2005-03-11 2012-05-24 Kamen Barton A Aminopterin Dosage Forms and Methods for Inflammatory Disorders
WO2007134595A2 (de) * 2006-05-23 2007-11-29 Albupharm Heidelberg Gmbh & Co. Kg Neue, an der tumorphysiologie orientierte formulierung eines zytostatikums, insbesondere von cis-platin
WO2007134595A3 (de) * 2006-05-23 2008-10-16 Albupharm Heidelberg Gmbh & Co Neue, an der tumorphysiologie orientierte formulierung eines zytostatikums, insbesondere von cis-platin
US10913780B2 (en) 2016-03-24 2021-02-09 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Conjugates, their compositions, their uses, and their methods of making

Also Published As

Publication number Publication date
EP1732611A1 (de) 2006-12-20
CA2561394A1 (en) 2005-10-13
US7781406B2 (en) 2010-08-24
US20070231338A1 (en) 2007-10-04
DE102004016355A1 (de) 2005-11-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE102005062440B4 (de) Proteinbasiertes Trägersystem zur Resistenzüberwindung von Tumorzellen
EP0841949B1 (de) Verwendung von saccharid-konjugaten
DE69535665T2 (de) Konjugate enthaltend ein antitumorales mittel und deren verwendung
DE69924870T2 (de) Peptidvektoren von Stoffen, die durch die Blut-Hirn-Schranke dringen
CH655010A5 (de) Pharmazeutischer wirkstoff mit antitumoraktivitaet.
EP0879604B1 (de) Konjugat, umfassend einen Folsäureantagonisten und einen Träger
EP1732611A1 (de) Herstellung und verwendung des konjugats methotrexat-albumin als mittel zur immunsuppression bei gvhd
EP0821593B1 (de) Konjugat aus einem wirkstoff, einem polyether und ggf. einem nicht als körperfremd angesehenen, nativen protein
DE4435087A1 (de) Konjugat zur Behandlung von Infektions-, Autoimmun- und Hauterkrankungen
DE2645610C2 (de) N-Acetylmuramyl-D-alanyl-D-isoglutamin, Verfahren zu dessen Herstellung und diese Verbindung enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen
EP0021184B1 (de) Sekretinpräparate mit verstärkter und protrahierter Wirkung, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie Dihydroxybenzoyl-L-tyrosin
WO2007134595A2 (de) Neue, an der tumorphysiologie orientierte formulierung eines zytostatikums, insbesondere von cis-platin
EP0820308B1 (de) Konjugat zur behandlung von entzündungserkrankungen
EP1841792B1 (de) Verfahren zur herstellung von albumin-konjugaten mit gyrasehemmern
WO2006114286A9 (de) Herstellung von albumin-fluorescein-konjugaten für die intraoperative diagnostik
WO2006056463A2 (de) Verfahren zur herstellung von albumin-konjugaten mit nichtsteroidalen antirheumatika (nsar)
DE102018110542A1 (de) D-Peptid-basiertes Prodrug (RD2-Folsäure) für die Therapie von Alzheimer
DE10220992A1 (de) Verwendung eines oder mehrerer Sauerstoffträger, ausgewählt aus Hämoglobin, Myoglobin und Derivaten hiervon zur Behandlung einer Organfunktionsstörung infolge eines akuten Versorgungsmangels und zur Behandlung/Vermeidung einer Gewebeschädigung infolge einer solchen Störung
WO2006119994A2 (de) Verfahren zur herstellung von albumin-konjugaten mit einem röntgenkontrastmittel als wirkstoff
DE102007041625A1 (de) Neue Gelatine-Wirkstoff-Konjugate
DE2043330A1 (de) Polymeres Derivat von 1 Methvl 5 (5 oxo 4 athyl tetrahydrofuryl (3) methyl) lmidazol und Zelluloseglykolsaure, sein Herstellungsverfahren und seine Anwendung

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DPEN Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2561394

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10594876

Country of ref document: US

Ref document number: 2007231338

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005730909

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2005730909

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10594876

Country of ref document: US