WO2006114286A9 - Herstellung von albumin-fluorescein-konjugaten für die intraoperative diagnostik - Google Patents

Herstellung von albumin-fluorescein-konjugaten für die intraoperative diagnostik

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WO2006114286A9
WO2006114286A9 PCT/EP2006/003832 EP2006003832W WO2006114286A9 WO 2006114286 A9 WO2006114286 A9 WO 2006114286A9 EP 2006003832 W EP2006003832 W EP 2006003832W WO 2006114286 A9 WO2006114286 A9 WO 2006114286A9
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Hannsjoerg Sinn
Marcel Muelbaier
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Hannsjoerg Sinn
Marcel Muelbaier
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    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0041—Xanthene dyes, used in vivo, e.g. administered to a mice, e.g. rhodamines, rose Bengal
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA

Definitions

  • the present invention relates to conjugates comprising a fluorescent dye and a protein, Arnzeistoff comprising such conjugates, in particular for the preparation of solid tumors, inflammatory processes and / or sentinel lymph nodes, their use and methods for their preparation.
  • Fluorescent dyes are organic colorants whose optical effect is based on their ability to absorb UV radiation or visible light rays and emit them as longer wavelength light, which occurs in the case of phosphorescence with or in the case of fluorescence without delay.
  • fluorescent dyes are xanthene dyes such as fluorescein, erythrosine, aminoerythrosine, eosin yellowish and amino eosin yellowish, and derivatives and analogs thereof.
  • the covalent binding of low molecular weight active substances, such as methotrexate, to the macromolecule is described, for example, in DE 41 22 210 A1 or in WO 96/32133, where the conjugates formed there are used for the treatment of tumor diseases or for the treatment of inflammations, infections and / or skin diseases be used.
  • the uptake of proteins by proliferating tumor cells is exploited to enrich the protein-bound drug in such cells, while healthy tissue has no cause for protein uptake.
  • an accumulation of the active ingredients in tumor cells or in inflammatory tissues can be obtained.
  • serum albumin accounts for the largest percentage of circulating proteins in the organism and is approved as a substance for clinical applications and readily available at any time, this macromolecule has excellent carrier properties.
  • conjugates consist of biomolecules or cells which are optionally provided with anchor groups and coated by a reticular layer with superparamagnetic or ferromagnetic properties.
  • the anchor group may be a fluorescent dye and the biomolecule may be a protein such as serum protein, particularly albumin, and more preferably human serum albumin.
  • the anchor groups may be linked to the biomolecules by covalent bonding and / or via fluorescent dyes.
  • fluorescein isothiocyanate (F ⁇ TC) -labeled bovine serum albumin is disclosed as a conjugate consisting of anchor group and biomolecule, wherein fluorescein is covalently coupled via isothiocyanate as a linker or spacer to the protein.
  • the conjugate with an iron solution and a base such as NaOH, KOH or concentrated ammonia added to effect the formation of a metal oxide layer on the labeled BSA (see Examples 1 and 3).
  • a base such as NaOH, KOH or concentrated ammonia
  • DE 101 08 857 A major disadvantage of DE 101 08 857 is also in the treatment of the labeled BSA with strongly alkaline solutions, which is no longer based on a protein in its natural form, but from a massively denatured protein. Thus, the conjugate of BSA and FITC disclosed in DE 101 08 857 is no longer suitable for clinical use.
  • EP 1 419 787 describes a composition containing pharmaceutically acceptable particles which are used as contrast agents for the Lymph node presentation can be used.
  • particles which consist inter alia of proteins, in particular albumin and particularly preferably human serum albumin are stained with a dye, which may be a fluorescent dye.
  • the staining of the particles can take place via covalent interactions.
  • a significant disadvantage of the conjugate disclosed in EP 1 419 787 lies in the listed high molar ratio of dye to protein, which is at least 20: 1, more preferably 20: 1 to 90: 1, since at such a high loading no more of a Protein in its natural form, but is based on a massively denatured protein.
  • conjugate comprising a fluorescent dye and a protein, which is characterized in that the fluorescent dye is bound to the protein via a direct covalent coupling. More preferably, the conjugate comprising a fluorescent dye and a protein is a conjugate characterized in that the fluorescent dye is directly covalently bound to the protein and that the protein is in its natural form.
  • a direct covalent coupling of the fluorescent dye to the support means that the fluorescent dye is replaced by a linker or a fluorescent dye. Spacer-free bond is bound to the transport protein.
  • Suitable groups of transport proteins for such direct covalent binding may include carboxy, hydroxy and sulfide groups, and especially the terminal ones Be amino group of lysine.
  • Suitable groups of fluorescent dyes according to the invention for forming a direct covalent bond with the transport protein may be, for example, hydroxy groups which are activated with cyanogen bromide, N-hydroxysuccinimide ester, carbonyldiimidazole, chlorotriazine, thionyl chloride, divinylsulfone, chloroacetic acid, epoxides, sodium periodate, tosyl and tresyl chloride or for example, amino groups which are activated with glutaric dialdehyde, chlorotriazine, glycidol or by diazotization.
  • the fluorescent dye may be covalently bound to the protein via an ester group formed of an OH group of the fluorescent dye and an acid group of the protein.
  • the fluorescent dye is covalently bound to the protein via an acid amide bond formed from a carboxyl group of the fluorescent dye and an amino group of the protein.
  • the conjugates according to the invention have a particularly long shelf life or storage stability. Shelf life is the time in which the content of the drug or, in the case of mixtures, the content of the least stable component has decreased by 10% of the declared amount. If this time is less than three years, the pack must be marked with an expiry date which indicates the date on which 90% of the drug remains unchanged.
  • the conjugate according to the invention preferably has a shelf life of ⁇ 2 years, more preferably ⁇ 4 years, more preferably ⁇ 7 years, and most preferably > 10 years up.
  • the covalent coupling is preferably carried out by means of a carbodiimide as activating reagent, wherein the carbodiimide is particularly preferably N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide.
  • a conjugate is preferred which is obtainable by reacting a fluorescent dye and a protein in the presence of a carbodiimide as activating reagent without N-hydroxysuccinimide and / or without N-hydroxysuccinamide. It is particularly preferable to react a fluorescent dye and a protein in the presence of a carbodiimide as activating reagent without further activating reagent.
  • a conjugate is obtainable, which is obtainable by first from the fluorescent dye Succinimidylester by means of a carbodiimide and N-hydroxysuccinimide is formed and then the succinimidyl ester of the fluorescent dye is reacted with the protein.
  • the protein used in the conjugates according to the invention is preferably albumin, in particular serum albumin and most preferably human albumin or human serum albumin (HSA).
  • albumin in particular serum albumin and most preferably human albumin or human serum albumin (HSA).
  • Human albumin is an endogenous, ubiquitously distributed and non-immunogenic protein. It has a molecular weight of about 68 kDa and is thus not excreted via the kidney. Albumin accounts for approximately 60% of the total plasma protein level. In the healthy organism, it fulfills transport functions for many substances and serves as a reserve energy source in acute emergencies, which is available everywhere and at any time in the organism. Under physiological conditions, it is not absorbed by healthy cells. In contrast, cells associated with tumors, particularly cells associated with solid tumors, as well as cells associated with inflammatory processes and sentinel lymph nodes, have a high turnover of proteins, especially plasma proteins, predominantly albumin.
  • the macromolecule albumin alone determines the biokinetic behavior of the compound, but not the low-molecular-weight fluorescent dye. Due to the long biological half-life of the albumin conjugates the previously very narrow window of drug availability is significantly broadened without further side effects occur. Observed side effects of fluorescent dyes, especially fluorescein or, for example, indocyanine green are classified into mild side effects, moderate side effects and severe side effects. The mild side effects include transient reactions that do not require therapeutic intervention and that recede spontaneously without further complications. These include, for example, nausea, vomiting or itching. About the moderate side effects Temporary reactions that require medical intervention but regress without further problems are counted.
  • the protein used according to the invention for the formation of the conjugates preferably has a molecular weight of ⁇ 18,000 Da, more preferably ⁇ 30,000 Da, and particularly preferably 50,000 Da.
  • a protein is preferably used which is native to the patient for whom the conjugate is intended.
  • native protein is meant a protein derived from the same species as the species to which the protein is administered. This means, for example, that when administered to human, human proteins, when administered to mice according to mouse proteins, etc. are used.
  • the coupling of the fluorescent dye to the carrier protein, preferably albumin is preferably carried out without limiting the biological activity of the active ingredient and without losing the natural character of the protein used as a carrier, in particular the albumin.
  • a protein which is present in its natural form is, in particular, an undenatured, unaltered protein, in particular a protein which is not altered in terms of its properties, such as, for example, its structure, its physiological properties, etc.
  • the conjugates of the invention preferably contain a fluorescent dye and a protein in the molar ratio of 2: 1 to 0.1: 1, more preferably 1, 1: 1 to 0.5: 1, and particularly preferably 1, 1: 1 to 0.9: 1. In particular, a molar ratio of about 1: 1 advantageous.
  • albumin in a 1: 1 loading with a fluorescent dye still shows biologically active behavior.
  • albumin as a carrier of the fluorescent dye, still has the distribution space in the body that is identical with natural HSA even after loading. This makes it unnecessary to know the tumor position, so that it is possible to administer the conjugate systemically, so that the tumor can be displayed positively after 48 to 72 hours.
  • Another advantage of having the natural character of the albumin is that the staining of sentinel lymph nodes, especially if they are affected by tumor cells, on the one hand on the natural distribution pattern of albumin in Extravasalraum and on the other hand on the high albumin uptake of the tumor cells.
  • the coupling is preferably carried out without changing the physical properties of the dye.
  • a covalent coupling is preferably chosen such that it can be cleaved again in physiologically modified tissues, so that the biological activity of the original active substance is retained and can be utilized.
  • the cleavage is preferably enzymatic.
  • fluorescent dye protein conjugates in particular of fluorescent dye-albumin conjugates without changing the biological activity of the drug and without loss of the native character of the protein used as a carrier, in particular the albumin.
  • fluorescent dyes which have no photodynamic activity has proven particularly suitable.
  • Photodynamic activity is a term for the phenomenon that organisms are damaged by certain, especially colored substances such as eosin, in the light, but not in the dark. The reason for this is the conversion of the oxygen by the photosensitizers effective photodynamically active substances in singlet oxygen.
  • the photodynamically active substances include both drugs and antibiotics, especially tetracyclines, phenothiazines and sulfonamides, as well as polycyclic aromatics and carcinogens.
  • Phenomena of the photodynamic effect are not only the skin lesions resulting from sun exposure in Porphyriekranken, but also in grazing animals, especially albinos, the buckwheat (contains Fagopyrin) or St. John's wort (contains hypericin) have taken to be observed, possibly fatal skin diseases (Lichttod , Fagopyrismus, Hypericismus). Practical application finds the photodynamic effect in some insecticides and photochemotherapy with hematoporphyrin and other porphyrin derivatives. Such harmful for organisms harmful photodynamic effect is therefore just not desirable when administering the conjugates of the invention.
  • non-photodynamic fluorescent dyes which are selected from fluorescein-2,7-bis (methyliminodiacetic acid) and / or carboxyfluorescein has proven particularly suitable.
  • Particularly preferred according to the present invention is the fluorescent dye fluorescein-2,7-bis (methyliminodiacetic acid).
  • the fluorescent dye itself is low molecular weight.
  • the low molecular weight fluorescent dyes according to the invention is bound to the transport protein, since in this way alone the macromolecule albumin the biokinetic behavior, but not the low molecular weight Fluorescent dye determined.
  • the fluorescent dye used according to the invention for the formation of the conjugates preferably has a molecular weight of ⁇ 2,000 Da and particularly preferably ⁇ 1,000 Da, and particularly preferably ⁇ 650 Da.
  • the conjugate according to the invention is active ingredient in a drug.
  • a drug has in particular low side effects and can be administered, for example, on an outpatient basis.
  • the administration is preferably intravenous.
  • a unit dose preferably contains 0.1 to 1.0 mg of active ingredient of fluorescent dye per kilogram of body weight, and more preferably 0.3 to 0.5 mg per kilogram of body weight.
  • the dose may in particular be chosen to be lower than in the conventional diagnosis with fluorescent dyes and is preferably ⁇ 0.7 mg, and more preferably ⁇ 0.3 mg of active ingredient fluorescent dye per kilogram of body weight.
  • the drug comprises as active ingredient a conjugate, which in turn comprises a non-photoactive fluorescent dye and albumin as protein.
  • the fluorescent dye-protein conjugate is particularly useful for the preparation of a medicament for the presentation, preferably intraoperative, of tumors, more preferably solid tumors and / or metastases, and more preferably brain tumors, and inflammatory processes preferably used by rheumatoid arthritis and lymph nodes, particularly sentinel lymph nodes used.
  • An intraoperative presentation is understood to mean a presentation during an operation.
  • the conjugate is administered systemically preferably two to three days before the operation, so that the positive representation of the tumors and / or metastases, the inflammatory processes as well as the lymph node occurs during surgery.
  • the representation is preferably used for the diagnosis and / or for the detection of tumors, inflammatory processes and lymph nodes in vivo in animals, especially mammals, and particularly preferably in humans.
  • conjugates of the invention in the combination therapy, for example together with other dyes or drugs.
  • the doses of the respective components can be further reduced.
  • Another object of the present invention is a process for the preparation of a fluorescent dye-protein conjugate, comprising reacting a fluorescent dye, preferably a low molecular weight fluorescent dye with a protein, preferably with a high molecular weight carrier protein by a direct covalent coupling.
  • the preparation of the conjugate according to the invention should particularly preferably take place without any restriction of the native character of the protein, in particular of the albumin.
  • Coupling has proven to be particularly advantageous in which a succinimidyl ester is first formed from the low molecular weight fluorescent dye by means of a carbodiimide and N-hydroxysuccinimide and subsequently the succinimidyl ester of the fluorescent dye is reacted with a protein.
  • Efficient covalent coupling of the active ingredient to the carrier molecule is important for the preparation of the conjugates used according to the invention.
  • the coupling must not lead to an undesired change in the carrier protein and / or the active ingredient.
  • Conventional activation of the carboxyl group-containing organic compounds with dicyclohexylcarbodiimide (DCC) requires more than 12 hours (P. Hammer, and W. Heeschen (Dairy Science, 1995, 50 (9), pp 513-514 at room temperature or at +4 0 C) , EP 41 22 210 A1, EP 0 879 604 A1, EP 0 820 308).
  • the carbodiimide is N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide hydrochloride.
  • the activation is preferably carried out at a temperature of 10 to 100 0 C, more preferably from 20 to 90 0 C and even more preferably from 50 to 75 0 C for a reaction time of 1 minute to 10 hours, more preferably from 20 to 50 minutes.
  • the reaction of the activated active substance with the carrier protein is preferably carried out at a temperature between 10 and 50 ° C., in particular between 20 and 40 ° C.
  • the activation of the carboxyl-containing compound in particular of calcein or carboxyfluorescein with EDC and N-hydroxysuccinimide in an organic solvent, preferably in dimethyl sulfoxide (DMSO) is performed.
  • organic solvent preferably in dimethyl sulfoxide (DMSO)
  • suitable organic solvents include dimethylacetamide or dioxane.
  • a significant advantage of the manufacturing process using the activating reagents EDC and N-hydroxysuccinimide is that they have a high water solubility. As a result, unused coupling reagents can be easily obtained from the reaction during the reaction
  • Product for example, be removed by washing with water.
  • a further preferred aspect of the invention relates to an optimized production method of a conjugate according to the invention comprising reacting a fluorescent dye with albumin by a direct covalent coupling, characterized in that a Fluorescent dye and albumin in the presence of a carbodiimide, preferably in the presence of N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethyl-carbodiimide without N-hydroxysuccinimide or N-hydroxysuccinamide or any other activating reagent.
  • the fluorescent dye is fluorescein-2,7-bis (methyliminodiacetic acid) and / or carboxyfluorescein, more preferably fluorescein-2,7-bis (methyliminodiacetic acid). It is further preferred that the molar ratio of fluorescent dye to protein is 2: 1 to 0.1: 1.
  • the optimized process which operates without N-hydroxysuccinimide or N-hydroxysuccinamide or other additional activating reagents, has a positive effect on the simplification of the preparation in the cleaning procedure.
  • EDC N-hydroxysuccinimide
  • HSA N-hydroxysuccinimide
  • Another advantage of the optimized method is that after addition of the activated active ingredient to the protein presented, in particular albumin, without N-hydroxysuccinimide, a direct control of the coupling efficiency can take place.
  • N-hydroxysuccinimide When N-hydroxysuccinimide is used, this also has a high UV absorption on HPLC when the UV measuring cell is set to 280 nm and disturbs or impedes by its retention time of about 11.5 minutes, during which other low molecular weight compounds also appear direct determination of the coupling yield. This means that in many cases a yield determination is possible only at the end of the purification of the conjugate. Due to the optimized process without the use of N-hydroxysuccinimide or N-hydroxysuccinamide this factor can now be excluded. This is also a great advantage for product safety. Another The advantage of the optimized process is that the coupling yield is surprisingly on average 98 to 99%.
  • conjugates prepared by the methods of the invention because of their high purity, can be used for numerous uses, and in particular for intravenous administration.
  • conjugates for example when using a fluorescent dye, advantageously for the preparation of medicaments for the intraoperative presentation of tumors, inflammatory processes and lymph nodes can be used.
  • Figure 1 shows an HPLC chromatogram of fluorescein-2,7-bis (methyliminodiacetic acid) (calcein) alone
  • Figure 2 shows the chromatogram of the fluorescein-2,7-bis (methyliminodiacetic acid) -HSA conjugate prepared according to Example 1.
  • Fluorescein bis (methyliminodiacetic acid) (calcein, fluorexone, Sigma, Taufmün) or carboxyfluorescein, N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC, Sigma, Taufmün), N-hydroxysuccinimide (NHS, Aldrich, Taufmün) and Dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma, Taufmün).
  • fluorescein-2,7-bis (methyliminodiacetic acid) instead of fluorescein-2,7-bis (methyliminodiacetic acid), other fluorescent dyes can also be used for conjugation with albumin or another protein of choice.
  • dimeric SA fraction 8.89 min monomeric SA fraction: 9.69 min (see FIG. 2) low molecular weight calcein: 11, 25 min (see FIG. 1)

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Konjugate umfassend einen Fluoreszenzfarbstoff und ein Protein, Arnzeimittel umfassend solche Konjugate, insbesondere zur Darstellung von soliden Tumoren, entzündlichen Prozessen und/oder sentinellen Lymphknoten, deren Verwendung sowie Verfahren zu deren Herstellung.

Description

Herstellung von Albumin-Fluorescein-Konjugaten für die intraoperative Diagnostik
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft Konjugate umfassend einen Fluoreszenzfarbstoff und ein Protein, Arnzeimittel umfassend solche Konjugate, insbesondere zur Darstellung von soliden Tumoren, entzündlichen Prozessen und/oder sentinellen Lymphknoten, deren Verwendung sowie Verfahren zu deren Herstellung.
Fluoreszenzfarbstoffe sind organische Farbmittel, deren optische Wirkung auf ihrer Fähigkeit beruht, UV-Strahlung oder Strahlen sichtbaren Lichts zu absorbieren und als Licht größerer Wellenlänge auszusenden, was im Falle der Phosphoreszenz mit bzw. im Falle der Fluoreszenz ohne zeitliche Verzögerung erfolgt. Beispiele für Fluoreszenzfarbstoffe sind Xanthenfarbstoffe wie Fluorescein, Erythrosin, Aminoerythrosin, Eosin gelblich und Aminoeosin gelblich sowie Derivate und Analoga davon.
Schon vor mehr als fünfzig Jahren versuchten vor allem Neurochirurgen Gehirntumore, insbesondere deren Randzonen, durch Gabe von Fluorescein gegenüber dem umgebenden Normalgewebe besser kenntlich zu machen, und so die Effektivität des Eingriffs zu verbessern und damit die Bildung von Rezidiven möglichst zu unterbinden.
Bedingt durch die kurze Verweilzeit von niedermolekularem Fluorescein in der Zirkulation wurden diese Versuche jedoch bald wieder eingestellt. Nachteilig erwies sich bei einzelnen Versuchen, dass diese niedermolekularen Verbindungen ein sehr schmales Zeitfenster für die Kontrastierung des Tumors aufweisen sowie nur ein geringer Anteil des verabreichten Medikaments an den Zielort gelangt. In letzter Zeit werden zunehmend Wirkstoff-Protein-Konjugate verwendet, um durch Kopplung von körperfremden Wirkstoffen an ein körpereigenes Protein längere Halbwertszeiten bei Verabreichung von therapeutischen und/oder diagnostischen Wirkstoffen zu erhalten. Die kovalente Bindung niedermolekularer Wirkstoffe, wie zum Beispiel Methotrexat, an das Makromolekül wird beispielsweise in DE 41 22 210 A1 oder in WO 96/32133 beschrieben, wobei dort die gebildeten Konjugate zur Behandlung von Tumorerkrankungen beziehungsweise zur Behandlung von Entzündungen, Infektionen und/oder Hauterkrankungen eingesetzt werden. Insbesondere bei der Behandlung von Tumorerkrankungen und entzündlichen Prozessen wird die Aufnahme von Proteinen durch proliferierende Tumorzellen ausgenützt, um den an Proteine gebundenen Wirkstoff in solchen Zellen anzureichern, während gesundes Gewebe keine Veranlassung zur Proteinaufnahme hat. Dadurch kann eine Anreicherung der Wirkstoffe in Tumorzellen bzw. in entzündlichen Geweben erhalten werden.
Nachdem Serumalbumin den größten Prozentsatz der im Organismus zirkulierenden Proteine ausmacht und als Substanz für klinische Anwendungen zugelassen und jederzeit verfügbar ist, weist dieses Makromolekül hervorragende Eigenschaften als Trägersubstanz auf.
Erste Versuche, diese vielversprechenden Eigenschaften von Albumin für einen Transport von Fluorescein zum Zielort zu nutzen, wurden erfolgreich von H. Sinn in der deutschen Patentanmeldung DE 19 602 295 beschrieben. Nachteilig bei dem in einer Vielzahl von operativen Eingriffen eingesetzten Konjugat ist allerdings dessen mangelnde Stabilität. Durch Hydrolyse des eingesetzten Linkers Cyanurchlorid bildete sich während längerer Lagerung einerseits wieder freies, niedermolekulares Fluorescein und andererseits in nachweisbaren Mengen Ammoniak, welches ein aufgrund seiner stechend riechenden, giftigen und reizenden Eigenschaften gesundheits- und umweltschädliches Gas darstellt. DE 101 08 857 offenbart bioaktive und biokompatible Konjugate mit magnetischen Eigenschaften und Verfahren zu deren Herstellung. Diese Konjugate bestehen aus Biomolekülen oder Zellen, welche gegebenenfalls mit Ankergruppen versehen und von einer netzartigen Schicht mit superparamagnetischen oder ferromagnetischen Eigenschaften überzogen sind. Die Ankergruppe kann ein Fluoreszenzfarbstoff sein und das Biomolekül kann ein Protein, wie beispielsweise Serumprotein, insbesondere Albumin und besonders bevorzugt Humanserumalbumin sein. Die Ankergruppen können an den Biomolekülen durch kovalente Bindung und/oder über Fluoreszenzfarbstoffe verknüpft sein. In den Beispielen von DE 101 08 857 ist Fluoresceinisothiocyanat (FΙTC)-markiertes Rinderserumalbumin als Konjugat bestehend aus Ankergruppe und Biomolekül offenbart, wobei Fluorescein über Isothiocyanat als Linker bzw. Spacer kovalent an das Protein gekoppelt ist. Dabei wird das Konjugat mit einer Eisenlösung sowie einer Base, wie beispielsweise NaOH, KOH oder konzentriertem Ammoniak, versetzt, um die Ausbildung einer Metalloxidschicht auf dem markierten BSA zu bewirken (siehe Beispiele 1 und 3). Eine Aussage zu dem Molverhältnis zwischen FITC und dem markierten BSA, welches gewährleistet, dass keine zu hohe Beladung des Proteins vorliegt, sodass das Protein in seiner natürlichen Form vorliegt und nicht massiv denaturiert ist, wird jedoch nicht getroffen. Für eine klinische Anwendung kommt jedoch nur ein nicht denaturiertes, applikationsfähiges Produkt in Betracht, da nur bei einem solchen Produkt gewährleistet ist, dass der Wirkstoff direkt am Wirkort freigesetzt wird und somit nebenwirkungsfrei ist. Ein wesentlicher Nachteil von DE 101 08 857 liegt ausserdem in der Behandlung des markierten BSA mit stark alkalischen Lösungen, wodurch keinesfalls mehr von einem Protein in seiner natürlichen Form, sondern von einem massiv denaturierten Protein auszugehen ist. Somit ist das in DE 101 08 857 offenbarte Konjugat aus BSA und FITC nicht mehr zur klinischen Anwendung geeignet.
EP 1 419 787 beschreibt eine Zusammensetzung enthaltend pharmazeutisch akzeptable Partikel, die als Kontrastmittel für die Lymphknotendarstellung verwendet werden. Dabei werden Partikel, die u.a. aus Proteinen, insbesondere Albumin und besonders bevorzugt humanem Serumalbumin bestehen, mit einem Farbstoff, der ein Fluoreszenzfarbstoff sein kann, angefärbt. Die Anfärbung der Partikel kann über kovalente Wechselwirkungen erfolgen. Ein wesentlicher Nachteil des in EP 1 419 787 offenbarten Konjugates liegt jedoch in dem aufgeführten hohen Molverhältnis von Farbstoff zu Protein, welches mindestens 20 : 1 , besonders bevorzugt 20 : 1 bis 90 : 1 beträgt, da bei einer solch hohen Beladung keinesfalls mehr von einem Protein in seiner natürlichen Form, sondern von einem massiv denaturierten Protein auszugehen ist. Diese Denaturierung war jedoch gerade das Ziel von EP 1 419 787, welche z.B. durch Ultraschallbehandlung, vorzugsweise durch Erhitzen auf 75 0C bis 100 0C erfolgt (siehe Paragraph [0020]). Somit liegt ein denaturiertes, nicht mehr applikationsfähiges Produkt vor, welches für eine klinische Anwendung nicht in Betracht kommt. Es ist nicht mehr gewährleistet, dass das HSA auch nach der Beladung noch in seiner natürlichen Form vorliegt und den mit natürlichem HSA identischen Verteilungsraum im Körper aufweist. Damit ist auch nicht mehr gewährleistet, dass der Wirkstoff direkt am Wirkort freigesetzt wird und somit nebenwirkungsfrei ist. Dies ist auch der Grund dafür, dass das gemäß EP 1 419 787 beanspruchte Kontrastmittel zu dessen Anwendung die Kenntnis über die Tumorposition voraussetzt und dass die Partikelsuspension entweder direkt in den Tumor oder in dessen unmittelbare Nachbarschaft injiziert wird, um die benachbarten (sentinellen) Lymphknoten zur Resektion zu visualisieren. Eine physiologisch gesteuerte Verteilung von HSA im Körper zu den mit Entzündungen, insbesondere Tumoren, Infektionen und/oder Hauterkrankungen assoziierten Zellen im Anschluss an eine systemische Verabreichung der Konjugate ist jedoch mit den in EP 1 419 787 offenbarten Konjugaten nicht möglich.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb, ein Arzneimittel bereit zu stellen, mit dem diese im Stand der Technik auftretenden Schwierigkeiten überwunden werden können und mit dem insbesondere die Haltbarkeit und Stabilität von Protein-Fluoreszenzfarbstoff-Konjugaten erreicht werden kann.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch Bereitstellung eines Konjugats umfassend einen Fluoreszenzfarbstoff und ein Protein, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass der Fluoreszenzfarbstoff über eine direkte kovalente Kopplung an das Protein gebunden ist. Besonders bevorzugt ist das Konjugat, welches einen Fluoreszenzfarbstoff und ein Protein umfasst, ein Konjugat, das dadurch gekennzeichnet ist, dass der Fluoreszenzfarbstoff direkt kovalent an das Protein gebunden ist und dass das Protein in seiner natürlichen Form vorliegt.
Durch direkte Kopplung von Fluoreszenzfarbstoffen an Proteine, insbesondere Trägerproteine, kann eine gezielte Herstellung von stabilen, hyrdolyseunempfindlichen Fluoreszenzfarbstoff-Protein-Konjugaten ohne Veränderung der physikalischen Eigenschaften des Farbstoffes, ohne Verlust der natürlichen Eigenschaften des als Träger dienenden Proteins sowie ohne Bildung von Ammoniak erreicht werden. Dadurch kann die Lagerfähigkeit dieser Konjugate erheblich verlängert werden.
Toxische Effekte auf gesundes Gewebe oder Organe sind bei bzw. nach der Verabreichung der erfindungsgemäßen Konjugate nicht zu beobachten, da normale Zellen keine Veranlassung zur Proteinaufnahme haben. Im Gegensatz dazu werden Proteine und insbesondere Trägerproteine von proliferierenden Tumorzellen, sentinellen Lymphknotenzellen oder von mit entzündlichen Prozessen assoziierten Zellen aufgenommen und führen somit zu einer gezielten Wirkstoffanreicherung in diesen Zellen.
Eine direkte kovalente Kopplung des Fluoreszenzfarbstoffes an den Träger bedeutet, dass der Fluoreszenzfarbstoff durch eine Linker-bzw. Spacer-freie Bindung an das Transportprotein gebunden ist. Zu einer solchen direkten kovalenten Bindung geeignete Gruppen von Transportproteinen können Carboxy-, Hydroxy- und Sulfidgruppen, und insbesondere die endständige Aminogruppe von Lysin sein. Geeignete erfindungsgemäße Gruppen von Fluoreszenzfarbstoffen zur Ausbildung einer direkten kovalenten Bindung mit dem Transportprotein können beispielsweise Hydroxy-Gruppen sein, welche mit Bromcyan, N-Hydroxysuccinimidester, Carbonyldiimidazol, Chlortriazin, Thionylchlorid, Divinylsulfon, Chloressigsäure, Epoxiden, Natriumperiodat, Tosyl- und Tresylchlorid aktiviert werden oder beispielsweise Aminogruppen, welche mit Glutardialdehyd, Chlortriazin, Glycidol oder durch Diazotierung aktiviert werden. Weitere zur kovalenten Bindung geeignete Gruppen sind zum Beispiel Carboxygruppen, die durch Carbonydiimidazol, wasserlösliches Carbodiimid und aktivierte Ester aktiviert werden sowie Sulfidgruppen, die durch Disulfidaustausch aktiviert werden. Beispielsweise kann der Fluoreszenzfarbstoff über eine Estergruppe, die aus einer OH-Gruppe des Fluoreszenzfarbstoffes und einer Säuregruppe des Proteins gebildet ist, kovalent an das Protein gebunden sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Fluoreszenzfarbstoff über eine Säureamidbindung, die aus einer Carboxylgruppe des Fluoreszenzfarbstoffs und einer Aminogruppe des Proteins gebildet wird, kovalent an das Protein gebunden.
Überraschenderweise hat sich eine solche direkte kovalente Kopplung des Fluoreszenzfarbstoffes an das Protein im erfindungsgemäßen Konjugat als besonders stabil und hydrolyseunempfindlich erwiesen. Daher weisen die erfindungsgemäßen Konjugate eine besonders lange Haltbarkeit bzw. Lagerstabilität auf. Unter Haltbarkeit versteht man die Zeit, in der der Gehalt des Arzneistoffes oder bei Gemischen der Gehalt der labilsten Komponente um 10 % der deklarierten Menge abgenommen hat. Liegt diese Zeit unter drei Jahren, so muss die Packung mit einem Verfallsdatum versehen werden, das denjenigen Zeitpunkt angibt, an dem noch 90 % des Arzneistoffes unverändert vorliegen. Das erfindungsgemäße Konjugat weist bevorzugt eine Haltbarkeit von ≥ 2 Jahren, besonders bevorzugt von ≥ 4 Jahren, insbesondere bevorzugt von ≥ 7 Jahren und am meisten bevorzugt > 10 Jahren auf. Dadurch ist im Vergleich zu bisher üblichen Fluoreszenz- Protein-Konjugaten, welche als Linker Cyanurchlorid umfassen, eine wesentlich längere Laufzeit und damit auch eine größere Arzneimittelsicherheit gegeben.
Bevorzugt erfolgt die kovalente Kopplung mittels eines Carbodiimids als Aktivierungsreagenz, wobei es sich bei dem Carbodiimid besonders bevorzugt um N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid handelt. Dabei ist insbesondere ein Konjugat bevorzugt, welches dadurch erhältlich ist, dass man einen Fluoreszenzfarbstoff und ein Protein in Gegenwart eines Carbodiimids als Aktivierungsreagenz ohne N-Hydroxysuccinimid und/oder ohne N-Hydroxysuccinamid umsetzt. Besonders bevorzugt wird ein Fluoreszenzfarbstoff und ein Protein in Gegenwart eines Carbodiimids als Aktivierungsreagenz ohne weiteres Aktivierungsreagenz umgesetzt. Alternativ ist ein Konjugat bevorzugt, welches dadurch erhältlich ist, dass zunächst aus dem Fluoreszenzfarbstoff ein Succinimidylester mittels eines Carbodiimids und N-Hydroxysuccinimids gebildet wird und anschließend der Succinimidylester des Fluoreszenzfarbstoffs mit dem Protein umgesetzt wird.
Bevorzugt wird als Protein in den erfindungsgemäßen Konjugaten Albumin, insbesondere Serumalbumin und am meisten bevorzugt humanes Albumin bzw. humanes Serumalbumin (HSA) eingesetzt.
Humanes Albumin ist ein körpereigenes, ubiquitär verteiltes und nicht immunogenes Protein. Es weist ein Molekulargewicht von etwa 68 kDa auf und wird somit nicht über die Niere ausgeschieden. Albumin macht ungefähr 60 % der gesamten Plasma-Eiweißmenge aus. Es erfüllt im gesunden Organismus unter anderem für viele Stoffe Transportfunktionen und dient im akuten Notfall als Reserve-Energieträger, der überall und jederzeit im Organismus verfügbar ist. Unter physiologischen Bedingungen wird es von gesunden Zellen nicht aufgenommen. Im Gegensatz dazu weisen mit Tumoren assoziierte Zellen, insbesondere mit soliden Tumoren assoziierte Zellen sowie mit entzündlichen Prozessen und sentinellen Lymphknoten assoziierte Zellen einen hohen Umsatz an Proteinen, insbesondere an Plasmaproteinen, vorwiegend an Albumin auf. Dies bedeutet, dass durch die erfindungsgemäße Kopplung von Fluoreszenzfarbstoffen an Proteine, insbesondere an Albumin, eine spezifische Aufnahme und damit gezielte Anreicherung des Fluoreszenzfarbstoffs am Wirkort, insbesondere in soliden Tumoren und/oder Metastasen, mit entzündlichen Prozessen und sentinellen Lymphknoten assoziierten Gewebestellen sowie anderen pathologisch veränderten Gewebestellen erreicht werden kann. Durch diese zielgerichtete Anreicherung kann die Dosierung an Wirkstoff wesentlich reduziert werden, wodurch eine nebenwirkungsarme Behandlung gefördert wird, da die Wirkstoffe jetzt nur noch im Bereich von pathologisch veränderten Gewebestellen freigesetzt werden. Ein weiterer Vorteil von Albumin liegt darin, dass es in klinisch applikationsfähiger Form jederzeit, auch in größeren Mengen verfügbar ist.
Stellt man Konjugate aus Albumin und einem niedermolekularen Fluoreszenzfarbstoff her, so bestimmt allein das Makromolekül Albumin das biokinetische Verhalten der Verbindung, nicht aber der niedermolekulare Fluoreszenzfarbstoff. Durch die lange biologische Halbwertszeit der Albumin-Konjugate wird das bisher zeitlich sehr enge Fenster der Wirkstoffverfügbarkeit wesentlich verbreitert, ohne dass weitere Nebenwirkungen auftreten. Beobachtete Nebenwirkungen von Fluoreszenzfarbstoffen, insbesondere von Fluorescein oder beispielsweise Indocyaningrün werden in milde Nebenwirkungen, mäßige Nebenwirkungen sowie schwere Nebenwirkungen klassifiziert. Zu den milden Nebenwirkungen gehören vorübergehende Reaktionen, die keine therapeutischen Maßnahmen erfordern und sich rasch und ohne weiteren Komplikationen spontan zurückbilden. Hierzu zählen beispielsweise Übelkeit, Erbrechen oder Juckreiz. Zu den mäßigen Nebenwirkungen werden vorübergehende Reaktionen, die eine medizinische Maßnahme erfordern, sich jedoch ohne weitere Probleme wieder zurückbilden, gezählt. Hierzu gehören unter anderen Urtikaria, Synkope, Fieber und Gewebsnekrosen bei Extravasaten . Unter schwerwiegenden Nebenwirkungen werden länger dauernde schwere Reaktionen verstanden, die einer intensiven Behandlung bedürfen und mit kardialen, respiratorischen und/oder neurologischen Problemen einhergehen. Hierzu zählen unter anderem Bronchospasmus, Myokardinfarkt, Laryngospasmus, Asystolie, Anaphylaxie und tonisch klonischer Anfall. Diese Nebenwirkungen können durch das erfindungsgemäße Konjugat erheblich gesenkt bzw. vermieden werden.
Das erfindungsgemäß zur Bildung der Konjugate eingesetzte Protein weist bevorzugt ein Molekulargewicht von ≥ 18.000 Da, besonders bevorzugt ≥ 30.000 Da, und insbesondere bevorzugt von ≥ 50.000 Da auf.
Grundsätzlich wird bevorzugt ein Protein verwendet, welches für den Patienten, für den das Konjugat vorgesehen ist, nativ ist. Unter einem nativen Protein ist ein Protein zu verstehen, das von der gleichen Spezies stammt wie diejenige Spezies, an die das Protein verabreicht wird. Das bedeutet beispielsweise, dass bei Verabreichung an Mensch humane Proteine, bei Verabreichung an Maus entsprechend Maus-Proteine, etc. eingesetzt werden.
Die Kopplung des Fluoreszenzfarbstoffes an das Trägerprotein, vorzugsweise Albumin, erfolgt bevorzugt ohne Einschränkung der biologischen Wirksamkeit des Wirkstoffs und ohne Verlust des natürlichen Charakters des als Träger genutzten Proteins, insbesondere des Albumins. Unter einem Protein, das in seiner natürlichen Form vorliegt, versteht man insbesondere ein nicht denaturiertes, nicht alteriertes Protein, insbesondere ein Protein, das hinsichtlich seiner Eigenschaften, wie beispielsweise seiner Struktur, seiner physiologischen Eigenschaften etc. nicht verändert ist. Die Konjugate der Erfindung enthalten bevorzugt einen Fluoreszenzfarbstoff und ein Protein im Molverhältnis von 2 : 1 bis 0,1 : 1 , besonders bevorzugt 1 ,1 : 1 bis 0,5 : 1 , und insbesondere bevorzugt 1 ,1 : 1 bis 0,9 : 1. Insbesondere ist ein Molverhältnis von etwa 1 : 1 vorteilhaft. So zeigt z.B. Albumin bei einer 1 : 1 Beladung mit einem Fluoreszenzfarbstoff immer noch biologisch aktives Verhalten. Dadurch ist vorteilhafterweise gewährleistet, dass Albumin als Träger des Fluoreszenzfarbstoffs auch nach der Beladung noch den mit natürlichem HSA identischen Verteilungsraum im Körper aufweist. Dadurch ist eine Kenntnis über die Tumorposition entbehrlich, sodass es möglich ist, das Konjugat systemisch zu verabreichen, sodass der Tumor nach 48 bis 72 Stunden positiv dargestellt werden kann. Somit ist es für eine Visualisierung der sentinellen (benachbarten) Lymphknoten zu deren Resektion nicht erforderlich, dass das Konjugat direkt in den Tumor oder in dessen unmittelbare Nachbarschaft injiziert wird. Ein weiterer Vorteil des Vorliegens des natürlichen Charakters des Albumins liegt darin, dass die Anfärbung von sentinellen Lymphknoten, insbesondere wenn sie von Tumorzellen befallen sind, einerseits auf dem natürlichen Verteilungsmuster von Albumin im Extravasalraum und andererseits auf der hohen Albuminaufnahme der Tumorzellen erfolgt.
Im Hinblick auf den Farbstoff erfolgt die Kopplung bevorzugt ohne Veränderung der physikalischen Eigenschaften des Farbstoffes.
Weiterhin wird erfindungsgemäß bevorzugt eine kovalente Kopplung so gewählt, dass sie in physiologisch veränderten Geweben wieder spaltbar ist, sodass die biologische Wirksamkeit des ursprünglichen Wirkstoffes erhalten bleibt und genutzt werden kann. Die Spaltung erfolgt vorzugsweise enzymatisch.
Erfindungsgemäß erfolgt somit eine Bildung von Fluoreszenzfarbstoff- Protein-Konjugaten, insbesondere von Fluoreszenzfarbstoff-Albumin- Konjugaten ohne Veränderung der biologischen Wirksamkeit des Wirkstoffes und ohne Verlust des nativen Charakters des als Träger benutzten Proteins, insbesondere des Albumins. Besonders geeignet hat sich der Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen erwiesen, die keine photodynamische Aktivität aufweisen. Photodynamische Aktivität ist eine Bezeichnung für die Erscheinung, dass Organismen durch bestimmte, insbesondere farbige Stoffe wie beispielsweise Eosin, im Licht geschädigt werden, im Dunkeln aber nicht. Ursächlich dafür ist die Umwandlung des Sauerstoffs durch die als Photosensibilisatoren wirksamen photodynamisch aktiven Stoffe in Singulett-Sauerstoff. Zu den photodynamisch aktiven Stoffen werden sowohl Pharmaka wie Antibiotika, insbesondere Tetracykline, Phenothiazine und Sulfonamide als auch polycyclische Aromaten und Carcinogene gezählt. Erscheinungen des photodynamischen Effektes sind nicht nur die unter Sonneneinstrahlung entstehenden Hautläsionen bei Porphyriekranken, sondern auch die bei Weidetieren, insbesondere bei Albinos, die Buchweizen (enthält Fagopyrin) oder Johanniskraut (enthält Hypericin) zu sich genommen haben, zu beobachtenden, gegebenenfalls tödlichen Hauterkrankungen (Lichttod, Fagopyrismus, Hypericismus). Praktische Anwendung findet der photodynamische Effekt bei manchen Insektiziden und bei der Photochemotherapie mit Hämatoporphyrin und anderen Porphyrinderivaten. Ein solcher für Organismen schädlicher photodynamischer Effekt ist daher bei Verabreichung der erfindungsgemäßen Konjugate gerade nicht erwünscht.
Besonders geeignet hat sich daher der Einsatz von nicht photodynamischen Fluoreszenzfarbstoffen erwiesen, die ausgewählt sind aus Fluorescein-2,7- bis(methyliminodiessigsäure) und/oder Carboxyfluorescein. Besonders bevorzugt ist gemäß der vorliegenden Erfindung der Fluoreszenzfarbstoff Fluorescein-2,7-bis(methyliminodiessigsäure).
Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt, dass der Fluoreszenzfarbstoff selbst niedermolekular ist. Dabei wird der niedermolekulare Fluoreszenzfarbstoffe erfindungsgemäß an das Transportprotein gebunden, da auf diese Weise allein das Makromolekül Albumin das biokinetische Verhalten, nicht aber der niedermolekulare Fluoreszenzfarbstoff bestimmt. Der erfindungsgemäß zur Bildung der Konjugate eingesetzte Fluoreszenzfarbstoff weist bevorzugt ein Molekulargewicht von < 2.000 Da und besonders bevorzugt < 1.000 Da, und insbesondere bevorzugt < 650 Da auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Konjugat Wirkstoff in einem Arzneimittel. Ein solches Arzneimittel weist insbesondere geringe Nebenwirkungen auf und kann beispielsweise auch ambulant verabreicht werden. Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise intravenös.
Eine Dosiseinheit enthält vorzugsweise 0,1 bis 1 ,0 mg Wirkstoff Fluoreszenzfarbstoff pro Kilogramm Körpergewicht, und insbesondere 0,3 bis 0,5 mg pro Kilogramm Körpergewicht. Die Dosis kann insbesondere niedriger als bei der herkömmlichen Diagnostik mit Fluoreszenzfarbstoffen gewählt werden und beträgt vorzugsweise ≤ 0,7 mg, und besonders bevorzugt ≤ 0,3 mg Wirkstoff Fluoreszenzfarbstoff pro Kilogramm Körpergewicht.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Arzneimittel als Wirkstoff ein Konjugat, welches wiederum einen nicht photoaktiven Fluoreszenzfarbstoff und Albumin als Protein umfasst.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Fluoreszenzfarbstoff-Protein-Konjugat zur Herstellung eines Arzneimittels zur Darstellung, bevorzugt zur intraoperativen Darstellung, von Tumoren, besonders bevorzugt von soliden Tumoren und/oder Metastasen und insbesondere bevorzugt von Hirntumoren, und entzündlichen Prozessen, besonders bevorzugt von rheumatoiden Gelenkarthrosen sowie Lymphknoten, besonders bevorzugt sentinellen Lymphknoten, verwendet. Unter einer intraoperativen Darstellung wird eine Darstellung während einer Operation verstanden. Dabei wird das Konjugat bevorzugt zwei bis drei Tage vor der Operation systemisch verabreicht, sodass die positive Darstellung der Tumoren und/oder Metastasen, der entzündlichen Prozesse sowie der Lymphknoten während der Operation auftritt. Dabei dient die Darstellung bevorzugt zur Diagnose und/oder zum Auffinden von Tumoren, entzündlichen Prozessen und Lymphknoten in vivo bei Tieren, insbesondere Säugetieren, und besonders bevorzugt bei Menschen.
Weiterhin ist es möglich, die erfindungsgemäßen Konjugate in der Kombinationstherapie einzusetzen, beispielsweise zusammen mit anderen Farbstoffen oder Arzneimitteln. In einer solchen Kombinationstherapie können sich die Dosen der jeweiligen Komponenten weiter reduzieren.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Fluoreszenzfarbstoff-Protein-Konjugats, umfassend das Umsetzen eines Fluoreszenzfarbstoffes, bevorzugt eines niedermolekularen Fluoreszenzfarbstoffes mit einem Protein, bevorzugt mit einem hochmolekularen Trägerprotein durch eine direkte kovalente Kopplung. Besonders bevorzugt sollte die Herstellung des erfindungsgemäßen Konjugates ohne Einschränkung des nativen Charakters des Proteins, insbesondere des Albumins, erfolgen. Besonders vorteilhaft hat sich eine Kopplung erwiesen, bei der zunächst aus dem niedermolekularen Fluoreszenzfarbstoff mittels eines Carbodiimids und N-Hydroxysuccinimids ein Succinimidylester gebildet wird und anschließend der Succinimidylester des Fluoreszenzfarbstoffes mit einem Protein umgesetzt wird.
Für die Herstellung der erfindungsgemäß eingesetzten Konjugate ist eine effiziente kovalente Kopplung des Wirkstoffes an das Trägermolekül (also das Protein) von Bedeutung. Bei der Kopplung darf es insbesondere nicht zu einer unerwünschten Veränderung des Trägerproteins oder/und des Wirkstoffes kommen. Die bisher übliche Aktivierung Carboxylgruppen-haltiger organischer Verbindungen mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) erfordert bei Raumtemperatur oder bei +4 0C mehr als 12 Stunden (P. Hammer und W. Heeschen (Milchwissenschaft 1995, 50(9), S. 513-514), DP 41 22 210 A1; EP 0 879 604 A1 ; EP 0 820 308). Bei diesem Verfahren bilden sich zudem bei der Aktivierung unlösliche Substanzen, die zum Teil bereits während der Aktivierung und zum Teil beim Eintragen des aktivierten Wirkstoffs in eine wässrige Proteinlösung ausfallen und, damit das Konjugat medizinisch verabreicht werden kann, durch zeitaufwändige und teure Filtra-tionsschritte zusätzlich zu der eigentlichen Produktreinigung abgetrennt werden müssen und nie 100%-ig sind (wegen der lipophilen Domänen im Albumin). Daher wird erfindungsgemäß bevorzugt, dass es sich bei dem Carbodiimid um N- (3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid Hydrochlorid handelt.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass durch die Verwendung von EDC, insbesondere in Form des Hydrochlorids, eine Aktivierung der Carboxylgruppen-haltigen organischen Verbindung und eine Umsetzung mit einem Trägerprotein erreicht werden kann, ohne dass wasserunlösliche Nebenprodukte gebildet werden, die zeit- und kostenaufwändig abzutrennen wären. Durch dieses Verfahren werden Zwischenreinigungsschritte überflüssig und die Präparationszeit und damit auch die Herstellungskosten werden wesentlich reduziert. Weiterhin werden Probleme, die bei der Injektion des Konjugats in einen menschlichen oder tierischen Körper durch unlösliche Substanzen oder Nebenprodukte hervorgerufen werden, vermieden.
Die Aktivierung erfolgt bevorzugt bei einer Temperatur von 10 bis 100 0C, mehr bevorzugt von 20 bis 90 0C und noch mehr bevorzugt von 50 bis 75 0C für eine Reaktionszeit von 1 Minute bis 10 Stunden, mehr bevorzugt von 20 bis 50 Minuten. Die Umsetzung des aktivierten Wirkstoffes mit dem Trägerprotein erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 10 und 50 0C, insbesondere zwischen 20 und 40 0C.
Bevorzugt wird die Aktivierung der Carboxyl-haltigen Verbindung, insbesondere von Calcein oder Carboxyfluorescein mit EDC und N- Hydroxysuccinimid in einem organischen Lösungsmittel, bevorzugt in Dimethylsulfoxid (DMSO) durchgeführt. Weitere geeignete organische Lösungsmittel sind z.B. Dimethylacetamid oder Dioxan. Die Aktivierung wird vorzugsweise unter Ausschluss von Wasser durchgeführt, insbesondere in Gegenwart von ≤ 5 Gew.-% Wasser, mehr bevorzugt ≤ 1 Gew.-% Wasser und am meisten bevorzugt vollständig wasserfrei.
Ein wesentlicher Vorteil des Herstellungsverfahrens unter Einsatz der Aktivierungsreagenzien EDC sowie N-Hydroxysuccinimid ist, dass sie eine hohe Wasserlöslichkeit aufweisen. Dadurch können bei der Umsetzung nicht verbrauchte Kopplungsreagenzien auf einfache Weise aus dem gewonnen
Produkt, beispielsweise durch Waschen mit Wasser entfernt werden. Im
Gegensatz dazu verbleibt bei den im Stand der Technik verwendeten Kopplungsreagenzien, beispielsweise bei der Verwendung von Di- cyclohexyl-carbodiimid (DCC) ein nicht auftrennbarer Rest an
Kopplungsreagenz im Konjugat. So ist bei einem Fluoreszenzfarbstoff-
Albumin-Konjugat bei Verwendung von DCC ein nicht abtrennbarer Rest von etwa 13 bis 15 Gew.-% an DCC im Konjugat zu beobachten, der wahrscheinlich an eine lipophile Domäne im Albumin gebunden ist. Dieser
Rest kann nur mit Hilfe von HPLC nachgewiesen und nur unter erheblichem
Aufwand präparativ abgetrennt werden.
Wird insbesondere noch mit einem hohen Überschuss an DCC im Verhältnis zum zu koppelnden Wirkstoff, wie es in der Veröffentlichung von P. Hammer und W. Heeschen (siehe oben) beschrieben ist, gearbeitet, nämlich einem Molverhältnis DCC : Wirkstoff von etwa 10 : 1 , so ist eine vollständige Abtrennung des Proteins mittels Dialyse oder Ultrafiltration nicht mehr möglich. Dieses am Protein haftende, immer noch reaktive DCC führt jedoch im Laufe der Zeit durch intramolekulares und intermolekulares Crosslinking zu einer weiter fortschreitenden Alteration des Proteins, wodurch sich die Eigenschaften des Trägerproteins zeitabhängig verändern. Daher kommt für ein so hergestelltes Konjugat keine klinische Anwendung in Betracht.
Ein weiterer bevorzugter Aspekt der Erfindung betrifft ein optimiertes Herstellungsverfahren eines erfindungsgemäßen Konjugats umfassend das Umsetzen eines Fluoreszenzfarbstoffs mit Albumin durch eine direkte kovalente Kopplung, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Fluoreszenzfarbstoff und Albumin in Gegenwart eines Carbodiimids, bevorzugt in Gegenwart von N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl-carbodiimid ohne N-Hydroxysuccinimid oder N-Hydroxysuccinamid oder ein beliebiges weiteres Aktivierungsreagenz, umsetzt.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Fluoreszenzfarbstoff um Fluorescein-2,7-bis(methyliminodiessigsäure) und/oder Carboxyfluorescein, besonders bevorzugt um Fluorescein-2,7-bis (methyliminodiessigsäure). Weiterhin ist bevorzugt, dass das Molverhältnis von Fluoreszenzfarbstoff zu Protein 2 : 1 bis 0,1 : 1 beträgt.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass sich das optimierte Verfahren, welches ohne N-Hydroxysuccinimid oder N-Hydroxysuccinamid oder andere zusätzliche Aktivierungsreagenzien arbeitet, bei der Reinigungsprozedur positiv auf die Vereinfachung der Herstellung auswirkt. Durch die Verwendung von EDC alleine zur Aktivierung ohne den Zusatz von N-Hydroxysuccinimid (HSI) oder N-Hydroxysuccinimid (HSA) beträgt die Aktivierungszeit des Fluoreszenzfarbstoffs nur noch wesentlich weniger als die bei Verwendung von HSI oder HSA benötigten 30 Minuten. Ein weiterer Vorteil des optimierten Verfahrens liegt darin, dass nach Zugabe des aktivierten Wirkstoffs zu dem vorgelegten Protein, insbesondere Albumin, ohne N-Hydroxysuccinimid eine direkte Kontrolle der Kopplungseffizienz erfolgen kann. Bei Verwendung von N-Hydroxysuccinimid besitzt dieses bei der HPLC bei einer Einstellung der UV-Messzelle auf 280 nm ebenfalls eine hohe UV-Absorption und stört oder erschwert durch seine Retentionszeit von etwa 11 ,5 Minuten, bei der auch andere niedermolekulare Verbindungen erscheinen, eine direkte Bestimmung der Kopplungsausbeute. Dies bedeutet, dass in vielen Fällen eine Ausbeutebestimmung erst am Ende der Reinigung des Konjugats möglich ist. Durch das optimierte Verfahren ohne Einsatz von N-Hydroxysuccinimid oder N-Hydroxysuccinamid kann dieser Faktor nun ausgeschlossen werden. Dies ist auch für die Produktsicherheit von großem Vorteil. Ein weiterer Vorteil des optimierten Verfahrens liegt darin, dass die Kopplungsausbeute überraschenderweise durchschnittlich bei 98 bis 99 % liegt.
Somit sind die Gesamtkosten des jeweiligen Konjugats durch diese Vereinfachung der Herstellung deutlich gesenkt.
Die mit den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Konjugate können aufgrund ihrer hohen Reinheit für zahlreiche Verwendungen und insbesondere für eine intravenöse Verabreichung vorgesehen werden. Somit können solche Konjugate, beispielsweise bei Verwendung eines Fluoreszenzfarbstoffes, vorteilhafterweise zur Herstellung von Arzneimitteln zur intraoperativen Darstellung von Tumoren, entzündlichen Prozessen und Lymphknoten eingesetzt werden.
Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel und die beigefügten Figuren weiter erläutert.
Figur 1 zeigt ein HPLC Chromatogramm von Fluorescein-2,7-bis (methyliminodiessigsäure) (Calcein) alleine, und Figur 2 zeigt das Chromatogramm des gemäß Beispiel 1 hergestellten Fluorescein-2,7-bis (methyliminodiessigsäure)-HSA-Konjugats.
Beispiel 1
Fluorescein-2,7-bis(methyliminodiessigsäure)-HSA-Konjugat
Ausgangsstoffe:
Fluorescein-bis(methyliminodiessigsäure) (Calcein, Fluorexon, Sigma, Taufkirchen) oder Carboxyfluorescein, N-(3-Dimethylaminopropyl)- N'-ethylcarbodiimid Hydrochlorid (EDC, Sigma, Taufkirchen), N- Hydroxysuccinimid (NHS, Aldrich, Taufkirchen) und Dimethylsulfoxid (DMSO, Sigma, Taufkirchen). Anstelle der Fluorescein-2,7-bis(methyliminodiessigsäure) können auch andere Fluoreszenzfarbstoffe zur Konjugation mit Albumin bzw. einem anderen Protein der Wahl eingesetzt werden.
Standardansatz im Labormaßstab:
23,80 mg Calcein (MG 622,55) werden zusammen mit 21 ,99 mg EDC (MG 191 ,71) und 44,3 mg NHS (MG 115,9) in 1 mL DMSO gelöst. Die Reaktionsmischung wird für 30 Minuten in ein auf 65 0C vorgeheiztes Wasserbad eingebracht und nach Abkühlung auf Raumtemperatur langsam in eine 5%ige Albuminlösung (10 mL Originallösung von HSA, 20 mL Ampuwa und 10 mL 1 ,4-Dioxan) eingetragen. Es entsteht eine klare, intensiv gelbgefärbte Lösung. Die Ausbeute an gebundenem Fluorescein beträgt etwa 90%.
Reinheitskontrolle (HPLC):
Vorsäule: Reprosil 200 SEC, 5 x 4 mm, 5 μm (Dr. Maisch)
Säule: Reprosil SEC, 300 x 4,6 mm, 5 μm (Dr. Maisch)
Laufmittel: Na2HPO4, 0,18 M; pH 7,4 mit 5% Methanol Fluß: 0,3 ml/min
Druck: etwa 55 bar
UV/vis: 495 nm
Retentionszeiten:
dimere SA-Fraktion: 8,89 min monomere SA-Fraktion: 9,69 min (siehe Figur 2) niedermolekulares Calcein: 11 ,25 min (siehe Figur 1)
Die Abtrennung der im Endprodukt unerwünschten Begleitstoffe DMSO, NHS, N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl-Hamstoff und nicht kovalent gebundenes Calcein erfolgt durch Ultrafiltration (YM 30, Millipore). Chromatogramme: siehe Figur 1 und 2.

Claims

Ansprüche
1. Konjugat, umfassend einen Fluoreszenzfarbstoff und ein Protein, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzfarbstoff direkt kovalent an das Protein gebunden ist und dass das Protein in seiner natürlichen Form vorliegt.
2. Konjugat nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzfarbstoff über eine
Säureamidbindung an das Protein gebunden ist.
3. Konjugat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Kopplung mittels eines Carbodiimid erfolgt.
4. Konjugat nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Carbodiimid um N-(3- Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid handelt.
5. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch erhältlich, dass man einen Fluoreszenzfarbstoff und ein Protein in Gegenwart eines Carbodiimids als Aktivierungsreagenz ohne N-Hydroxysuccinimid und/oder ohne N-Hydroxysuccinamid umsetzt.
6. Konjugat nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Fluoreszenzfarbstoff und ein Protein in Gegenwart eines Carbodiimids als Aktivierungsreagenz ohne weiteres Aktivierungsreagenz umsetzt.
7. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch erhältlich, dass zunächst aus dem Fluoreszenzfarbstoff ein Succinimidylester mittels eines Carbodiimids und N-Hydroxysuccinimid gebildet wird und anschließend der Succinimidylester des Fluoreszenzfarbstoffes mit einem Protein umgesetzt wird.
8. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein Albumin ist.
9. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Albumin humanes Serumalbumin ist.
10. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein in nativer Form vorliegt.
11. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzfarbstoff keine photodynamische Aktivität aufweist.
12. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzfarbstoff Fluorescein- 2,7-bis(methyliminodiessigsäure) und/oder Carboxyfluorescein ist.
13. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzfarbstoff Fluorescein- 2,7-bis(methyliminodiessigsäure) ist.
14. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzfarbstoff selbst niedermolekular ist.
15. Konjugat nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Molverhältnis Fluoreszenzfarbstoff zu Protein 2 : 1 bis 0,1 : 1 beträgt.
16. Konjugat nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Molverhältnis Fluoreszenzfarbstoff zu Protein 1,1 : 1 bis 0,9 : 1 beträgt.
17. Arzneimittel, umfassend als Wirkstoff ein Konjugat, wobei das Konjugat einen Fluoreszenzfarbstoff und ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 16 umfasst.
18. Arzneimittel nach Anspruch 17, umfassend als Wirkstoff ein Konjugat, wobei das Konjugat einen nicht photoaktiven Fluoreszenzfarbstoff und Albumin umfasst.
19. Verwendung eines Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Darstellung von Tumoren, entzündlichen Prozessen und Lymphknoten.
20. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Darstellung intraoperativ erfolgt.
21. Verwendung nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Tumoren um solide Tumoren und/oder Metastasen, bei den entzündlichen Prozessen um rheumatoide Gelenkarthrosen und/oder bei den Lymphknoten um sentinelle Lymphknoten handelt.
22. Verwendung nach einem der Ansprüche 19 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Tumoren um Hirntumoren handelt.
23. Verfahren zur Herstellung eines Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 16, umfassend das Umsetzen eines Fluoreszenzfarbstoffes mit einem Protein durch eine direkte kovalente Kopplung.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass zunächst aus dem Fluoreszenzfarbstoff ein Succinimidylester mittels eines Carbodiimids und N- Hydroxysuccinimid gebildet wird und anschließend der Succinimidylester des Fluoreszenzfarbstoffes mit einem Protein umgesetzt wird.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Carbodiimid um N-(3- Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid handelt.
26. Verfahren zur Herstellung eines Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 16, umfassend das Umsetzen eines Fluoreszenzfarbstoffs mit einem Protein, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Fluoreszenzfarbstoff und ein Protein in Gegenwart eines Carbodiimids als Aktivierungsreagenz ohne N-Hydroxysuccinimid und/oder ohne N-Hydroxysuccinamid umsetzt.
27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Fluoreszenzfarbstoff und ein Protein in Gegenwart eines Carbodiimids als Aktivierungsreagenz ohne weiteres Aktivierungsreagenz umsetzt.
28. Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Carbodiimid um N-(3-Dimethylaminopropyl)- N'-ethyl-carbonyldiimid handelt.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzfarbstoff in einem organischen Lösungsmittel, insbesondere in einem wasserfreien organischen Lösungsmittel, mit N- (3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl-carbodiimid umgesetzt, durch Erwärmung aktiviert und anschließend der Fluoreszenzfarbstoff mit einem Protein umgesetzt wird.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass das Molverhältnis Fluoreszenzfarbstoff : Protein 2 : 1 bis 0,1 : 1 beträgt.
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Protein um Albumin handelt.
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