EP1893242A2 - Verfahren zur herstellung von albumin-konjugaten mit einem röntgenkontrastmittel als wirkstoff - Google Patents

Verfahren zur herstellung von albumin-konjugaten mit einem röntgenkontrastmittel als wirkstoff

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Publication number
EP1893242A2
EP1893242A2 EP06724795A EP06724795A EP1893242A2 EP 1893242 A2 EP1893242 A2 EP 1893242A2 EP 06724795 A EP06724795 A EP 06724795A EP 06724795 A EP06724795 A EP 06724795A EP 1893242 A2 EP1893242 A2 EP 1893242A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
ray contrast
contrast agent
protein
albumin
protein conjugate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP06724795A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Marcel MÜLBAIER
Hannsjörg SINN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SCHMIEDEBERG-SINN CHRISTA
Original Assignee
AlbuPharm Heidelberg GmbH and Co KG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by AlbuPharm Heidelberg GmbH and Co KG filed Critical AlbuPharm Heidelberg GmbH and Co KG
Publication of EP1893242A2 publication Critical patent/EP1893242A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/04—X-ray contrast preparations
    • A61K49/0433—X-ray contrast preparations containing an organic halogenated X-ray contrast-enhancing agent
    • A61K49/0438—Organic X-ray contrast-enhancing agent comprising an iodinated group or an iodine atom, e.g. iopamidol

Definitions

  • the present invention relates to X-ray contrast agent-protein conjugates, and more particularly to X-ray contrast agent-albumin conjugates, drugs 5 comprising X-ray contrast agent-protein conjugates, methods of making such conjugates and their use.
  • X-ray contrast agents are substances which are introduced into the body in imaging processes for enhancing contrast differences.
  • Contrast is understood in imaging diagnostics to be a brightness difference within the generated image.
  • contrast agents are often used in medicine to intensify less pronounced contrast differences between individual tissue types.
  • contrast agents serve as markers of physiological processes such as blood flow, glomerular filtration and tubular secretion. They are either introduced directly into cavities or arrive at the destination by means of transport mechanisms (for example, organs).
  • contrast agents The function of the contrast agents is based on the fact that they increase the density of the irradiated organ by radiation absorption (positive contrast agents, for example barium and iodine compounds) or lower (negative contrast agents, for example CO 2 -GaS, air, noble gases).
  • positive contrast agents for example barium and iodine compounds
  • negative contrast agents for example CO 2 -GaS, air, noble gases
  • X-ray opaque polymer compounds comprising at least one biodegradable and at least one iodinated X-ray opaque end group, wherein the biodegradable region and the iodinated X-ray impermeable end group are linked by at least one biodegradable bond.
  • DE 692 28 999 discloses polyaminated macromolecular compounds of biological or synthetic origin, which are characterized in that they carry at least three iodinated radiopaque derivatives, as well as processes for their preparation and their use as contrast agents.
  • a high number of undesired side effects unacceptable for a diagnostic agent results.
  • observed side effects include discomfort or problems in the area of the injection site, the entire cardiovascular system, the kidney and the central nervous system.
  • these side effects vary depending on the indication, ranging from sensation of heat and pain at the injection site such as redness, wheal, but also nausea, vomiting, heat, coughing, including severe reactions such as bronchospasm, asthma attack, severe cardiovascular - reactions such as circulatory collapse or tonic-chronic convulsions with possible fatal consequences.
  • An object of the present invention was therefore to provide X-ray contrast agents in a form with which the difficulties encountered in the prior art can be overcome and with the particular targeted the pathologically altered tissue sites with a much lower dose of X-ray contrast medium with long half-life radiographically can be made visible and thus fewer side effects can be achieved in the organism.
  • an X-ray contrast agent-protein conjugate comprising a carboxyl group-containing X-ray contrast agent and a protein.
  • the main advantage of using the protein conjugate over the low-molecular contrast agent is that the macromolecular contrast agent is now released only in the region of the pathologically altered tissue sites, especially in the area of proliferating tumor tissue by enzymatic cleavage of the protein and accumulates there. In all other tissue types the concentration for a safe contrast is too low. Since, on the one hand, the administered dose is substantially lower and in vivo healthy cells do not take up or break down albumin or its native conjugates, the usual side effects are greatly diminished or no longer appear at all.
  • a further advantage of the protein conjugate as a contrast agent lies in the fact that enrichment in solid tumors widens the previously very narrow time window of contrasting without any side effects occurring. Furthermore, by the targeted coupling of the contrast agent to protein, in particular albumin, according to the invention, the osmolality of the contrast agent can be adjusted to a tolerable level for the organism.
  • the X-ray contrast agent is coupled directly covalently to the protein.
  • proteins in particular carrier proteins
  • a targeted production of stable, hydrolysis-insensitive X-ray contrast protein conjugates without changing the physical properties of the X-ray contrast agent can be achieved without loss of natural properties of the carrier protein and without formation of ammonia.
  • the shelf life of these conjugates can be considerably extended. Therefore, the conjugates according to the invention have a particularly long shelf life or storage stability. Shelf life refers to the time in which the content of the drug or, in the case of mixtures, the content of the most unstable component is declared to be 10% Quantity has decreased.
  • the conjugate according to the invention preferably has a shelf life of ⁇ 2 years, more preferably ⁇ 4 years, more preferably ⁇ 7 years, and most preferably ⁇ 10 years.
  • Direct covalent coupling of the X-ray contrast agent to the support means that the X-ray contrast agent is bound to the transport protein by a linker or spacer-free bond.
  • the X-ray contrast agent is covalently bound to the protein via an acid amide bond formed from a carboxyl group of the X-ray contrast agent and an amino group, preferably a lysine group of the protein.
  • the X-ray contrast agent and a protein can be reacted with a linker, wherein the reaction preferably takes place via a linkage via covalent bonds.
  • the X-ray contrast agent is covalently bound to the protein via an acid amide bond formed from a carboxyl group of the X-ray contrast agent and an amino group of the protein.
  • the covalent coupling is preferably carried out by means of a carbodiimide as activating reagent, wherein the carbodiimide is particularly preferably N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide.
  • a conjugate is obtainable which is obtainable by using an X-ray contrast agent and a protein in the presence of a Carbodiimids as activating reagent without N-hydroxysuccinimide and / or without N-hydroxysuccinamide.
  • an X-ray contrast agent and a protein are reacted in the presence of a carbodiimide as activating reagent without further activation reagent.
  • the conjugate is obtainable by first forming a succinimidyl ester from the X-ray contrast agent using a carbodiimide and N-hydroxysuccinimide and then reacting the succinimidyl ester of the X-ray contrast agent with the protein.
  • the conjugate is obtainable by preparing an acid chloride of the X-ray contrast agent from the carboxyl group-containing X-ray contrast medium by means of thionyl or oxalyl chloride, which is then reacted directly with the protein.
  • iodine compounds in particular of triiodobenzoic acid as X-ray contrast agent, has proven particularly suitable.
  • suitable triiodobenzoic acids are selected from the group consisting of 2,3,5-triiodobenzoic acid, diatrizoic acid, loxitalaminic acid, loxiglinic acid and / or lotroxic acid.
  • the 2,3,5-triiodobenzoic acid obtainable in the trade 5 is bound to a carrier protein.
  • the protein used in the conjugates according to the invention is preferably albumin, in particular serum albumin and most preferably human albumin or human serum albumin (HSA).
  • Human albumin is an endogenous, ubiquitously distributed and non-immunogenic protein.
  • the biokinetic behavior and thus also the biological half-life of the conjugate according to the invention is determined solely by the macromolecule albumin, but not by the low-molecular-weight contrast medium.
  • the protein used according to the invention for the formation of the conjugates preferably has a molecular weight of ⁇ 18,000 Da, more preferably ⁇ 30,000 Da, and particularly preferably 50,000 Da.
  • the coupling of the X-ray contrast agent to the carrier protein, preferably albumin, is preferably carried out without limiting the biological activity of the active ingredient and without losing the natural character of the protein used as a carrier, in particular the albumin.
  • a protein which is present in its natural form is, in particular, an undenatured, unaltered protein, in particular a protein which is not changed in terms of its properties, such as, for example, its structure, its physiological properties, etc.
  • the conjugates of the invention preferably contain an X-ray contrast agent and a protein in the molar ratio of 2: 1 to 0.1: 1, more preferably 1, 1: 1 to 0.5: 1, and most preferably 1, 1: 1 to 0.9 In particular, a molar ratio of about 1: 1 is advantageous.
  • albumin shows biologically active behavior in a 1: 1 load with an X-ray contrast medium.
  • knowledge about the tumor position is dispensable, so that it is possible to administer the conjugate systemically, so that the tumor can then be displayed positively.
  • the conjugate it is not necessary for the conjugate to be injected directly into or in the immediate vicinity of the tumor.
  • a further advantage of the presence of the natural character of the albumin is that the staining of the tumor cells takes place on the one hand on the natural distribution pattern of albumin in the extravascular space and on the other hand on the high albumin uptake of the tumor cells.
  • the coupling is preferably carried out without changing the physical properties of the contrast agent.
  • a protein is preferably used which is native to the patient for whom the conjugate is intended. That is, the protein is in native form, and further, for example, when administered to humans, human proteins, mouse administration corresponding to mouse proteins, etc. are used.
  • a native protein is a protein derived from the same species as the species to which the protein is administered.
  • the coupling of the X-ray contrast agent to the carrier protein, preferably albumin preferably takes place without limiting its native character.
  • Particularly preferred is a covalent coupling of the active ingredient to the carrier protein.
  • the covalent coupling is preferably chosen so that it is cleavable again under physiological conditions or in healthy and pathologically altered tissues, so that the biological activity of the original active substance is retained and can be utilized.
  • the cleavage is preferably enzymatic.
  • the binding to the protein can be done either directly or via a linker.
  • X-ray contrast protein-protein conjugates in particular of X-ray contrast agent-albumin conjugates without changing the biological activity of the drug and without loss of the native character of the protein used as a carrier, in particular the albumin.
  • low molecular weight X-ray contrast media are particularly preferably bound to the transport protein, since in this way alone the macromolecule albumin determines the biokinetic behavior, but not the low molecular weight X-ray contrast medium.
  • the X-ray contrast agent used according to the invention for the formation of the conjugates preferably has a molecular weight of ⁇ 2,000 Da 1, particularly preferably ⁇ 1,000 Da, and particularly preferably ⁇ 500 Da.
  • the conjugate according to the invention is active ingredient in a diagnostic or therapeutic agent.
  • a drug has in particular low side effects and can be administered, for example, on an outpatient basis.
  • the administration is preferably intravenous.
  • a dosage unit preferably contains 1 to 2 mg of active ingredient X-ray contrast agent per kilogram of body weight and in particular 0.9 to 1, 5 mg of active ingredient per kilogram of body weight.
  • the dose can be chosen to be lower than in the conventional therapy with X-ray contrast agents and is preferably ⁇ 2 mg and more preferably ⁇ 0.5 mg of X-ray contrast agent per kilogram of body weight.
  • the X-ray contrast agent-protein conjugate is used for the preparation of a medicament for the presentation of tumors. It is particularly preferably used for the positive presentation of solid tumors.
  • the drug is a contrast agent in X-ray diagnostics.
  • Another essential aspect of the invention relates to the use of the conjugate as described herein and in particular in one of claims 7 to 23 for the manufacture of a medicament for the treatment of tumors.
  • the inventors have found for the first time that X-ray contrast agents can be used not only as a diagnostic agent but also as a therapeutic agent, in particular as a radiation sensitizer which can be enriched in the tumor.
  • the mode of operation of the contrast agents is based on the fact that they increase the density of the irradiated organ through radiation absorption. It has long been known that X-ray contrast agents, especially iodine-containing
  • X-ray contrast agents can cause side effects that may occur during or after the examination, ie after application of the X-ray contrast agent and are attributable to different causes.
  • the first mentioned side effects include feeling of heat and pain at the injection site, vasodilatation associated with hypotension and dizziness, diuresis, etc. This is due to the nonphysiologically high osmolarity values of the applied contrast medium solutions, which may be 1400 mOsm (milliosmol) and more, while the physiological value the osmolarity is only about 284 mOsm.
  • Such high osmolarities especially in the immediate vicinity of the application site, but not only there, cause massive disturbances in the water-electrolyte balance.
  • albumin as a carrier substance lies in the sum of the abovementioned properties of the albumin, in particular the high specificity and selectivity for tumor cells and the long half-life of the albumin.
  • X-ray contrast agents were previously used only for the presentation of blood vessels, but not for the positive representation of tumors.
  • An object of the present invention is now the use of the X-ray contrast medium-albumin conjugates according to the invention for the positive presentation of tumors.
  • contrast agent For this purpose, usually much higher amounts of contrast agent would be necessary, which can advantageously be dispensed with according to the invention by the binding of the contrast medium to albumin, which has a very high half-life.
  • a positive representation of tumors with the same or even a smaller amount of administered contrast agent is possible.
  • This substantial reduction in the amount of contrast agent required is a significant factor in reducing the risk of unwanted side effects.
  • iodine-containing contrast media Long-term adverse reactions, in particular iodine-containing contrast media, which occur a few days after the examination, include in patients with a tendency to or existing hyperthyroidism metabolic disorders. The most common are increased heart palpitations, high blood pressure, increased restlessness with insomnia as well as sweating and diarrhea. The cause of these unwanted, late side effects is iodide, which is released during the exam. Again, iodide is formed in the reaction of elemental iodine released from the contrast medium into the circulation upon absorption of the high-energy X-rays, with further reactants such as tyrosine residues of the albumin. This iodide, which is formed simultaneously with the reaction of elemental iodine with tyrosine residues, ultimately constitutes the trigger of hyperthyroidism.
  • the present inventors have also discovered for the first time a pharmacological effect of X-ray contrast agents, in particular of iodine-containing X-ray contrast agents, namely the destruction of tumor cells by means of these X-ray contrast agents.
  • X-ray contrast agents in particular of iodine-containing X-ray contrast agents
  • a targeted and specific destruction of tumor cells can only by the Coupling of the X-ray contrast agent to protein, in particular albumin can be achieved.
  • Another aspect of the present invention is the use of an X-ray contrast agent-protein conjugate of the invention
  • Preparation of a medicament for the treatment of tumors preferably takes place in that
  • Irradiation of the X-ray contrast agent toxic entities are released, which are preferably released during the absorption of high-energy X-rays from the contrast agent intracellularly as well as in the circulation.
  • the toxic entities in the context of the present invention are preferably radicals, in particular
  • Halogen radicals where of the halogen radicals, which are iodine as halogen,
  • Bromine, chlorine and / or fluorine may have, especially iodine radicals are particularly preferred. Besides, it can be toxic
  • entities may be benzoic acid radicals.
  • an energy source with energy of> 10 electron vol (eV), more preferably> 100 eV and most preferably> 1 kilo-electron volts (keV) is preferably used according to the invention.
  • the irradiation is carried out with an energy source that emits energy in the range of 20 to 25 keV.
  • the radiation dose used can be in the range of the radiation dose used for diagnosis or below in order to minimize the radiation exposure of the body. Alternatively, a higher dose of radiation than is necessary for diagnostics can be used.
  • the mechanism of action of the X-ray contrast agent-protein conjugate is in particular as follows: After administration of the conjugate, this becomes tumor tissue due to the natural distribution pattern of the albumin in the extravascular space and due to the high albumin uptake of the tumor cells with high specificity and selectivity transported, where albumin is then converted by the tumor cells.
  • albumin is then converted by the tumor cells.
  • intracellular toxic entities preferably radicals, particularly preferably halogen radicals, in particular iodine radicals, as well as e.g. Benzoic acid, which is difficult to dissolve at physiological pH.
  • iodine radicals preferably halogen radicals, in particular iodine radicals, as well as e.g. Benzoic acid.
  • Benzoic acid e.g. Benzoic acid
  • intracellular toxic entities can have fatal consequences when using a conventional non-specific X-ray contrast agent.
  • the binding energy between the iodine and the benzene ring is, for example, about 5 to 6 eV, while the energy of the radiation released by the irradiation source is much higher, about 1000 times, namely 20 to 25 keV.
  • the energy of the radiation irradiating the conjugate of the present invention is 10 times, preferably 100 times and most preferably 1000 times higher than the binding energy of the radical-cleavable bond in the X-ray contrast medium.
  • the energy of the radiation irradiating the conjugate of the present invention is 10 times, preferably 100 times and most preferably 1000 times higher than the binding energy of the radical-cleavable bond in the X-ray contrast medium.
  • these toxic entities accumulate specifically in the tumor cells, which purposefully destroys the contrast agent-containing tumor cell.
  • iodine-containing X-ray contrast agents are not resistant to high-energy radiation.
  • the inconstancy of the X-ray contrast agent 5 against UV radiation which is even about 100 times lower than X-ray radiation detected.
  • the protein X-ray contrast agent conjugate can be effectively used for the targeted destruction of o tumor cells, without an increase in the amount of conjugate and the radiation dose is required.
  • the radiation dose can also be increased.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of the conjugate of the invention for the manufacture of a medicament for the protection of non-tumor-infested tissue from radicals.
  • the albumin present in the conjugate according to the invention serves non-tumor (s), in particular healthy, tissues or body fluids in which the administered conjugate according to the invention is nonspecific, such as For example, tissue of the transport path to the tumor cells, surrounding tissue of the tumor tissue and blood circulation, to protect against radical stress during irradiation.
  • the albumin which is present in healthy tissue or in the bloodstream, acts via its tyrosine residues as radical scavenger for the iodine radicals of the X-ray contrast medium which are formed during the irradiation.
  • albumin has a total of two effects, namely on the one hand a prolonged half-life of the albumin in the body as well as a targeted uptake into tumor cells and on the other hand a protection against the resulting in the radiation radicals in non-tumorous tissue, which is still affected by the irradiation ,
  • another embodiment of the invention is a composition
  • a composition comprising an X-ray contrast agent-protein conjugate and at least one radical scavenger which further supports the antiradical activity of the protein, in particular the albumin.
  • the radical scavenger is present in unbound, non-conjugated form in the composition.
  • Radical scavengers are understood as meaning organic or inorganic substances whose chemical reaction with reactive radicals leads to more stable compounds. The addition of radical scavengers to a radical chain reaction thus interrupts the reaction chain.
  • radical scavengers which are pharmaceutically and physiologically acceptable. These include L-cysteine, cysteamine, melamine, glutathione, uric acid as well as lipoic acid and dihydrolipoic acid, which serve as scavengers in the body tissue to protect against damaging influences. Radical scavengers which are used for cancer prophylaxis are particularly preferred.
  • vitamin A examples include vitamin A, retinoids and ß-carotene (provitamin A) as well as the antioxidant vitamins C and E.
  • radical scavengers they protect DNA and cell membranes from oxidative damage by radicals, thereby protecting against mutations and maintaining cell integrity. Furthermore belong to it.
  • vitamin E and albumin are particularly preferred, since it is an efficient iodine radical scavenger due to its tyrosine residues.
  • Another aspect of the present invention is a diagnostic or therapeutic agent comprising as active ingredient an X-ray contrast agent-protein conjugate in combination with at least one radical scavenger.
  • both the conjugate according to the invention and the composition comprising this conjugate and at least one free-radical scavenger are used for the preparation of a medicament for protecting against non-tumor-attacked tissue from radicals.
  • Yet another aspect of the present invention relates to the use of the conjugate according to the invention for therapy control after treatment with the conjugate, in particular three to four weeks after the treatment. Due to the long biological half-life of the albumin as well as the iodine released upon irradiation of the X-ray contrast agent, it is still after a period of three to four weeks after administration of the conjugate a direct therapy control possible, preferably without the addition of further X-ray contrast agent-albumin conjugate, which additionally represents a burden on the body. Therefore, therapy with little side effects is possible at a later point in time, so that even if the procedure is repeated several times, the radiation dose is still within the range of diagnostic measures.
  • the X-ray contrast agent-protein conjugate according to the invention in particular the 2,3,5-triiodobenzoic acid-albumin conjugate, does not cause any side effects immediately after administration or long-term side effects a few days after the examination.
  • Another object of the present invention is a method for producing an X-ray contrast agent-protein conjugate, comprising reacting a carboxyl group-containing X-ray contrast agent, preferably a low molecular weight carboxyl-containing X-ray contrast agent with a protein, preferably a high molecular weight carrier protein.
  • a direct covalent coupling of the X-ray contrast agent to the protein for example albumin, without restricting its native and natural character. Coupling has proven to be particularly advantageous in which an activated acid is first formed from the low-molecular X-ray contrast medium by means of a carbodiimide and subsequently the activated acid of the X-ray contrast medium is reacted with a protein.
  • Efficient coupling of the active ingredient to the carrier molecule is important for the preparation of the conjugates used according to the invention.
  • the coupling must not lead to an undesired change in the carrier protein and / or the active ingredient.
  • Conventional activation of the carboxyl group-containing organic compounds with dicyclohexylcarbodiimide (DCC) requires at room temperature or at +4 0 C more than 12 hours (P. Hammer, and W. Heeschen, Dairy Science, 1995, 50 (9), pp 513-514, DP 41 22 210 A1; EP 0 879 604 A1; EP 0 820 308).
  • the carbodiimide is N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide hydrochloride.
  • the activation is preferably carried out at a temperature of 10 to 100 0 C, more preferably from 20 to 90 0 C, and more preferably from 50 to 75 0 C for enie reaction time of 1 to 10 hours, more preferably from 20 to 50 minutes.
  • the reaction of the activated active substance with the carrier protein is preferably carried out at a temperature between 10 and 50 ° C., in particular between 20 and 40 ° C.
  • the activation of the carboxyl group-containing compound, in particular of 2,3,5-triiodobenzoic acid with EDC in an organic solvent, preferably in dimethyl sulfoxide (DSMO) is performed.
  • organic solvents include dimethylacetamide or Dioxane.
  • the activation is preferably carried out in the absence of water, in particular in the presence of ⁇ 5% by weight of water, more preferably ⁇ 1% by weight of water and most preferably completely anhydrous.
  • the preparation process is carried out using the activating reagents EDC and N-hydroxysuccinimide.
  • activating reagents EDC and N-hydroxysuccinimide.
  • An advantage of these activating reagents is that they have a high water solubility.
  • unused coupling reagents can be removed in a simple manner from the product obtained, for example by washing with water during the reaction.
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • a non-resolvable residue of coupling reagent remains in the conjugate.
  • a further preferred aspect of the invention therefore relates to a preparation method of a conjugate according to the invention comprising reacting an X-ray contrast medium with albumin, wherein an X-ray contrast medium and albumin in the presence of a carbodiimide, preferably in the presence of N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethyl- carbodiimide without N-hydroxysuccinimide or N-hydroxysuccinamide or without any other activating reagent.
  • the optimized process which operates without N-hydroxysuccinimide or N-hydroxysuccinamide or without other additional activating reagents, has a positive effect on the simplification of the preparation in the cleaning procedure.
  • EDC N-hydroxysuccinimide
  • HSA N-hydroxysuccinamide
  • the activation time of the X-ray contrast agent is only significantly less than that required when using HSI or HSA for 30 minutes.
  • a further advantage of the optimized method is that after addition of the activated active ingredient to the protein presented, in particular albumin, without N-hydroxysuccinimide, a direct control of the coupling efficiency can take place.
  • N-hydroxysuccinimide When N-hydroxysuccinimide is used, this also has a high UV absorption on HPLC when the UV measuring cell is set to 280 nm and disturbs or impedes a direct retention by a retention time of 11.5 minutes at which other low molecular weight compounds appear Determination of the coupling yield. This means that in many cases a yield determination is only possible at the end of the purification of the conjugate. Due to the optimized process without the use of N-hydroxysuccinimide or N-hydroxysuccinamide this factor can now be excluded. This is also a great advantage for product safety. Another advantage of the optimized process is that the coupling yield is surprisingly on average 98-99%. Thus, the overall cost of each conjugate is significantly reduced by this simplification of the production.
  • an acid chloride of the X-ray contrast agent is prepared from the low-molecular X-ray contrast agent by means of thionyl or oxalyl chloride, which is then reacted directly with the protein.
  • the reaction of the X-ray contrast agent, preferably 2,3,5-triiodobenzoic acid, with thionyl or oxalyl chloride is preferably carried out at a temperature of 10 to 100 0 C, more preferably from 20 to 90 0 C and even more preferably from 50 to 75 0 C for a reaction time of 1 minute to 10 hours, more preferably 2 minutes to 50 minutes, most preferably 5 to 15 minutes.
  • the molar ratio of X-ray contrast medium to protein is 2: 1 to 0.1: 1 and that the protein is albumin.
  • Figure 1 shows an HPLC chromatogram of 2,3,5-triiodobenzoic acid alone.
  • FIG. 2 shows the HPLC chromatogram of the 2,3,5-triiodobenzoic acid HSA conjugate prepared according to Example 1 (final product after purification).
  • FIG. 3 shows the HPLC chromatogram of the 2,3,5-triiodobenzoic acid-HSA conjugate prepared according to Example 2 directly after preparation and before purification.
  • Figure 4 shows the HPLC chromatogram of 2,3,5-triiodobenzoic acid alone.
  • FIG. 5 shows the HPLC chromatogram of the 2,3,5-triiodobenzoic acid HSA conjugate prepared according to Example 3.
  • 2,3,5-triiodobenzoic acid (MW 499.8) are mixed with 2 ml of thionyl chloride or oxalyl chloride and introduced into a preheated to 65 0 C water bath. After about 10 minutes, a slightly yellowish, clear solution of the desired acid chloride is present. The excess thionyl chloride or oxalyl chloride is removed completely in vacuo. The pale-colored solid residue is dissolved in 4 mL of 1,4-dioxane and an 880 ⁇ L aliquot (corresponding to 22 mg 2,3,5-triiodobenzoic acid is added directly to a 5%, 0.17 M bicarbonate solution of albumin ,
  • Quality control can be done immediately after production.
  • TJB 2,3,5-triiodobenzoic acid
  • another commercially available X-ray contrast agent diatrizoic acid, lotalaminic acid, etc.
  • X-ray contrast agent diatrizoic acid, lotalaminic acid, etc.
  • Each 20 ml are distributed on two Petri dishes (diameter 11, 5 cm).
  • Bowl 1 is placed in full sunlight for 1 hour.
  • Shell 2 is irradiated for 1 hour with a UV hand lamp (254 nm, 14 ⁇ W / cm 2 ) at a distance of 11 cm.
  • shell 1 While the solution of shell 1 is still colorless after exposure to daylight, shell 2 exhibits the typical intense blue coloration of the iodine-starch reaction. This is all the more remarkable because the energy of the UV radiation (as well as the intensity of the radiation source used) is about 100 times lower than the X-ray radiation of a computer tomograph.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Röntgenkontrastmittel-Protein-Konjugate und insbesondere Röntgenkontrastmittel-Albumin-Konjugate, Arzneimittel umfassend Röntgenkontrastmittel-Protein-Konjugate, Verfahren zur Herstellung solcher Konjugate sowie deren Verwendung.

Description

Verfahren zur Herstellung von Albumin-Konjugaten mit einem Röntgenkontrastmittel als Wirkstoff
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft Röntgenkontrastmittel-Protein-Konjugate und insbesondere Röntgenkontrastmittel-Albumin-Konjugate, Arzneimittel 5 umfassend Röntgenkontrastmittel-Protein-Konjugate, Verfahren zur Herstellung solcher Konjugate sowie deren Verwendung.
Röntgenkontrastmittel sind Substanzen, die bei bildgebenden Verfahren zur Verstärkung von Kontrastunterschieden in den Körper eingebracht werden. o Unter Kontrast versteht man in der bildgebenden Diagnostik einen Helligkeitsunterschied innerhalb des erzeugten Bildes. Zwar sind fast alle bildgebenden Verfahren geeignet, Körperstrukturen auch ohne Hilfe pharmazeutischer Präparate darzustellen, jedoch werden in der Medizin häufig Kontrastmittel verwendet, um wenig ausgeprägte 5 Kontrastunterschiede zwischen einzelnen Gewebetypen zu verstärken. Darüberhinaus dienen Kontrastmittel als Marker physiologischer Vorgänge, wie zum Beispiel des Blutflusses, der glomerulären Filtration und der tubulären Sekretion. Sie werden entweder in Hohlräume direkt eingebracht oder gelangen durch Transportmechanismen an den Zielort (zum Beispiel o Organe). Die Funktionsweise der Kontrastmittel beruht darauf, dass sie durch Strahlungsabsorption die Dichte des durchstrahlten Organs erhöhen (positive Kontrastmittel, zum Beispiel Barium- und Jodverbindungen) oder erniedrigen (negative Kontrastmittel, zum Beispiel CO2-GaS, Luft, Edelgase).
5 US 2005/0036946 beschreibt Röntgenstrahlen-undurchlässige Polymerverbindungen umfassend mindestens eine biologisch abbaubare und mindestens eine jodierte Röntgenstrahlen-undurchlässige Endgruppe, wobei die biologisch abbaubare Region und die jodierte Röntgenstrahlen- undurchlässige Endgruppe durch mindestens eine biologisch abbaubare o Bindung verknüpft sind. DE 692 28 999 offenbart polyaminierte makromolekulare Verbindungen biologischer oder synthetischer Herkunft, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie mindestens drei jodierte radiopake Derivate tragen sowie Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung als Kontrastmittel.
Bisher wurden als Kontrastmittel verschiedene Trijodbenzoesäuren in deren niedermolekularen Form, wie z.B. die Diatrizoesäure, loxitalaminsäure, loxiglinsäure, lotroxinsäure, lohexol, lopentol und lodixanol, eingesetzt. Nachteilig bei den bisher eingesetzten Substanzen ist insbesondere die kurze Verweilzeit in der Zirkulation, sodass sie nur ein sehr schmales Zeitfenster der Kontrastgebung aufweisen und nicht geeignet sind, solide Tumoren direkt durch einen erhöhten Kontrast abzubilden. Ein weiterer Nachteil der bisher eingesetzten Röntgenkontrastmittel besteht darin, dass sie nur wenig von lebenden Zellen aufgenommen werden, d.h. nur ein geringer Anteil des verabreichten Medikaments gelangt an den Zielort. Durch diese geringe Bioverfügbarkeit der Röntgenkontrastmittel und die damit notwendige hohe Dosierung resultiert eine für ein Diagnostikum inakzeptable hohe Zahl unerwünschter Nebenwirkungen. Beobachtete Nebenwirkungen sind beispielsweise Beschwerden bzw. Probleme im Bereich der Injektionsstelle, des gesamten Herz-Kreislauf-Systems, der Niere sowie des zentralen Nervensystems. Insbesondere sind bei jodhaltigen Kontrastmitteln diese Nebenwirkungen je nach Indikation unterschiedlich und reichen von Wärmegefühl und Schmerzen an der Injektionsstelle wie Hautrötung, Quaddelbildung, aber auch Übelkeit, Erbrechen, Hitzegefühl, Hustenreiz, u.a. bis hin zu schweren Reaktionen wie Bronchospasmus, Asthmaanfall, schwerste Herz-Kreislauf-Reaktionen wie Kreislaufkollaps oder tonisch-chronische Krämpfe mit möglicher Todesfolge. Die Ursache dieser massiven Nebenwirkungen liegt bei ionischen Kontrastmitteln an der um bis zu Faktor 8 höheren Osmolalität der Kontrastmittel im Vergleich zu normalen physiologischen Werten. Die Verabreichung solcher stark hypertoner Präparate hat massive Störungen des Elektrolythaushaltes zur Folge. Diese äußern sich unter anderem in Hypervolämie, Diurese, Vasodilatation und Blutdruckabfall. Des Weiteren sind Kontrastmittel in der Lage, allergische und pseudoallergische Reaktionen auszulösen. Zur Risikominderung bei Kontrastmittel- Untersuchungen werden daher oft prophylaktisch Corticoide verabreicht. Diese verfügen jedoch ihrerseits ebenfalls über ein großes Spektrum unerwünschter Nebenwirkungen wie akut/latente Nebenniereninsuffizienz, Cushing-Syndrom, Diabetes mellitus, erhöhtes Infektionsrisiko, Störungen der Wundheilungen, Atrophie des subkutanen Gewebes, Ulcera duodeni oder ventriculi, Myopathie, Osteoporosen sowie psychische Störungen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb, Röntgenkontrastmittel in einer Form bereit zu stellen, mit der die im Stand der Technik auftretenden Schwierigkeiten überwunden werden können und mit der insbesondere gezielt die pathologisch veränderten Gewebestellen mit einer wesentlich geringeren Dosis an Röntgenkontrastmittel bei gleichzeitig langer Halbwertszeit röntgenologisch sichtbar gemacht werden können und damit geringere Nebenwirkungen im Organismus erreicht werden können.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch Bereitstellung eines Röntgenkontrastmittel-Protein-Konjugats, umfassend ein Carboxylgruppen- haltiges Röntgenkontrastmittel und ein Protein. Durch Kopplung von Röntgenkontrastmitteln an Proteine, insbesondere Trägerproteine, werden die niedermolekularen Wirkstoffe, welche an sich schnell aus dem Körper eliminiert werden, vor den Ausscheidungs- bzw. Eliminationsmechanismen des Körpers verborgen und es wird eine lange Halbwertszeit und damit eine hohe Bioverfügbarkeit im Körper erreicht.
Das erfolgreiche Umsetzen der Röntgenkontrastmittel mit Albumin war insofern überraschend, da die eingesetzten Röntgenkontrastmittel als äußerst reaktionsträge gelten und ein Fachmann erwartet hätte, dass deren Umsetzungen entsprechend, auch nach längerer Aktivierungszeit, nur unvollständig verlaufen. Eine weitere überraschende Wirkung dieser Röntgenkontrastmittel war ihre lange Verweilzeit nach enzymatischer Abspaltung des Proteins in der Zelle.
Der wesentliche Vorteil beim Einsatz des Proteinkonjugats gegenüber dem niedermolekularen Kontrastmittel besteht darin, dass das makromolekulare Kontrastmittel jetzt nur im Bereich der pathologisch veränderten Gewebestellen, insbesondere im Bereich des proliferierenden Tumorgewebes durch enzymatische Spaltung des Proteins freigesetzt wird und sich dort anreichert. In allen anderen Gewebearten ist die Konzentration für eine sichere Kontrastgebung zu gering. Da zum einen die verabreichte Dosis wesentlich geringer ist und in vivo gesunde Zellen kein Albumin oder dessen native Konjugate aufnehmen bzw. abbauen, treten die bisher üblichen Nebenwirkungen stark vermindert bzw. überhaupt nicht mehr in Erscheinung. Ein weiterer Vorteil des Proteinkonjugats als Kontrastmittel liegt darin, dass durch die Anreicherung in soliden Tumoren das bisher zeitlich sehr enge Zeitfenster der Kontrastgebung wesentlich verbreitert wird, ohne dass Nebenwirkungen auftreten. Weiterhin kann durch die erfindungsgemäße gezielte Kopplung des Kontrastmittels an Protein, insbesondere Albumin, die Osmolalität des Kontrastmittels auf ein für den Organismus tolerables Maß eingestellt werden.
Bevorzugt wird dabei das Röntgenkontrastmittel direkt kovalent an das Protein gekoppelt. Durch direkte Kopplung von Röntgenkontrastmitteln an Proteine, insbesondere Trägerproteine, kann eine gezielte Herstellung von stabilen, hydrolyseunempfindlichen Röntgenkontrastmittel-Protein- Konjugaten ohne Veränderung der physikalischen Eigenschaften des Röntgenkontrastmittels, ohne Verlust der natürlichen Eigenschaften des als Träger dienenden Proteins sowie ohne Bildung von Ammoniak erreicht werden. Dadurch kann die Lagerfähigkeit dieser Konjugate erheblich verlängert werden. Daher weisen die erfindungsgemäßen Konjugate eine besonders lange Haltbarkeit bzw. Lagerstabilität auf. Unter Haltbarkeit versteht man die Zeit, in der der Gehalt des Arzneistoffes oder bei Gemischen der Gehalt der labilsten Komponente um 10 % der deklarierten Menge abgenommen hat. Liegt diese Zeit unter drei Jahren, so muss die Packung mit einem Verfallsdatum versehen werden, das denjenigen Zeitpunkt angibt, an dem noch 90 % des Arzneistoffes unverändert vorliegen. Das erfindungsgemäße Konjugat weist bevorzugt eine Haltbarkeit von ≥ 2 Jahren, besonders bevorzugt von ≥ 4 Jahren, insbesondere bevorzugt von ≥ 7 Jahren und am meisten bevorzugt von ≥ 10 Jahren auf. Dadurch ist im Vergleich zu bisher üblichen Röntgenkontrastmittel-Protein- Konjugaten, welche einen Linker, wie beispielsweise Cyanurchlorid, umfassen, eine wesentlich längere Laufzeit und damit auch eine größere Arzneimittelsicherheit gegeben.
Eine direkte kovalente Kopplung des Röntgenkontrastmittels an den Träger bedeutet, dass das Röntgenkontrastmittel durch einen Linker- bzw. Spacer- freie Bindung an das Transportprotein gebunden ist. Bevorzugt ist das Röntgenkontrastmittel über eine Säureamidbindung, die aus einer Carboxylgruppe des Röntgenkontrastmittels und einer Aminogruppe, bevorzugt einer Lysingruppe des Proteins gebildet wird, kovalent an das Protein gebunden.
Alternativ kann das Röntgenkontrastmittel und ein Protein mit einem Linker umgesetzt werden, wobei die Umsetzung bevorzugt über eine Verknüpfung über kovalente Bindungen erfolgt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Röntgenkontrastmittel über eine Säureamidbindung, die aus einer Carboxylgruppe des Röntgenkontrastmittels und einer Aminogruppe des Proteins gebildet wird, kovalent an das Protein gebunden.
Bevorzugt erfolgt die kovalente Kopplung mittels eines Carbodiimids als Aktivierungsreagenz, wobei es sich bei dem Carbodiimid besonders bevorzugt um N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid handelt. Dabei ist insbesondere ein Konjugat bevorzugt, welches dadurch erhältlich ist, dass man ein Röntgenkontrastmittel und ein Protein in Gegenwart eines Carbodiimids als Aktivierungsreagenz ohne N-Hydroxysuccinimid und/oder ohne N-Hydroxysuccinamid umsetzt. Besonders bevorzugt wird ein Röntgenkontrastmittel und ein Protein in Gegenwart eines Carbodiimids als Aktivierungsreagenz ohne weiteres Aktivierungsreagenz umgesetzt. 5 Alternativ ist das Konjugat dadurch erhältlich, dass zunächst aus dem Röntgenkontrastmittel ein Succinimidylester mittels eines Carbodiimids und N-Hydroxysuccinimids gebildet wird und anschließend der Succinimidylester des Röntgenkontrastmittels mit dem Protein umgesetzt wird.
o In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Konjugat dadurch erhältlich, dass aus dem Carboxylgruppen-haltigen Röntgenkontrastmittel mittels Thionyl- oder Oxalylchlorid ein Säurechlorid des Röntgenkontrastmittels hergestellt wird, das anschließend direkt mit dem Protein umgesetzt wird. 5
Als besonders geeignet hat sich der Einsatz von Jodverbindungen, insbesondere von Trijodbenzoesäure als Röntgenkontrastmittel erwiesen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind o geeignete Trijodbenzoesäuren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 2,3,5-Trijodbenzoesäure, Diatrizoesäure, loxitalaminsäure, loxiglinsäure und/oder lotroxinsäure.
Besonders bevorzugt ist gemäß der vorliegenden Erfindung die im Handel 5 erhältliche 2,3,5-Trijodbenzoesäure an ein Trägerprotein gebunden.
Bevorzugt wird als Protein in den erfindungsgemäßen Konjugaten Albumin, insbesondere Serumalbumin und am meisten bevorzugt humanes Albumin bzw. humanes Serumalbumin (HSA) eingesetzt. Humanes Albumin ist ein o körpereigenes, ubiquitär verteiltes und nicht immunoges Protein.
Es weist ein Molekulargewicht von etwa 68 kDa auf und wird somit nicht über die Niere ausgeschieden. Albumin macht ungefähr 60 % der gesamten Plasma-Eiweißmenge aus. Es erfüllt im gesunden Organismus unter anderem für viele Stoffe Transportfunktionen und dient im akuten Notfall als Reserve-Energieträger, der überall und jederzeit im Organismus verfügbar ist.
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Unter physiologischen Bedingungen wird es von gesunden Zellen nicht aufgenommen. Im Gegensatz dazu weisen mit entzündlichen Prozessen assoziierte Zellen sowie mit Tumoren, insbesondere soliden Tumoren assoziierte Zellen einen hohen Umsatz an Proteinen, insbesondere an o Plasmaproteinen, vorwiegend an Albumin auf. Dies bedeutet, dass durch die erfindungsgemäße Kopplung von Röntgenkontrastmitteln an Proteine, insbesondere Albumin, eine gezielte Anreicherung des Kontrastmittels am Wirkort, insbesondere in soliden Tumoren sowie an anderen pathologisch veränderten Gewebestellen, erreicht werden kann. Durch diese 5 zielgerichtete Anreicherung kann die Dosierung an Wirkstoff wesentlich reduziert werden, was eine nebenwirkungsarme Behandlung fördert, da die Wirkstoffe jetzt nur noch im Bereich von pathologisch veränderten Gewebestellen freigesetzt werden. Ein weiterer Vorteil von Albumin liegt darin, dass es in klinisch verwendbarer Form jederzeit, auch in größeren o Mengen, verfügbar ist.
Das biokinetische Verhalten und damit auch die biologische Halbwertszeit des erfindungsgemäßen Konjugates wird allein durch das Makromolekül Albumin bestimmt, nicht aber durch das niedermolekulare 5 Röntgenkontrastmittel. Das erfindungsgemäß zur Bildung der Konjugate eingesetzte Protein weist bevorzugt ein Molekulargewicht von ≥ 18.000 Da, besonders bevorzugt ≥ 30.000 Da, und insbesondere bevorzugt von ≥ 50.000 Da auf.
o Die Kopplung des Röntgenkontrastmittels an das Trägerprotein, vorzugsweise Albumin, erfolgt bevorzugt ohne Einschränkung der biologischen Wirksamkeit des Wirkstoffs und ohne Verlust des natürlichen Charakters des als Träger benutzten Proteins, insbesondere des Albumins. Unter einem Protein, das in seiner natürlichen Form vorliegt, versteht man insbesondere ein nicht denaturiertes, nicht alteriertes Protein, insbesondere ein Protein, das hinsichtlich seiner Eigenschaften, wie beispielsweise seiner Struktur, seiner physiologischen Eigenschaften etc., nicht verändert ist. Die Konjugate der Erfindung enthalten bevorzugt ein Röntgenkontrastmittel und ein Protein im Molverhältnis von 2 : 1 bis 0,1 : 1 , besonders bevorzugt 1 ,1 : 1 bis 0,5 : 1 , und insbesondere bevorzugt 1 ,1 : 1 bis 0,9 : 1. Insbesondere ist ein Molverhältnis von etwa 1 : 1 vorteilhaft. So zeigt zum Beispiel Albumin bei einer 1 : 1 Beladung mit einem Röntgenkontrastmittel noch biologisch aktives Verhalten. Dadurch ist vorteilhafterweise gewährleistet, dass Albumin als Träger des Röntgenkontrastmittels auch nach der Beladung noch den mit natürlichem HSA identischen Verteilungsraum im Körper aufweist. Dadurch ist eine Kenntnis über die Tumorposition entbehrlich, sodass es möglich ist, das Konjugat systemisch zu verabreichen, sodass der Tumor anschließend positiv dargestellt werden kann. Somit ist es für eine Visualisierung der mit Tumor befallenen Zellen nicht erforderlich, dass das Konjugat direkt in den Tumor oder in dessen unmittelbare Nachbarschaft injiziert wird. Ein weiterer Vorteil des Vorliegens des natürlichen Charakters des Albumins liegt darin, dass die Anfärbung der Tumorzellen einerseits auf dem natürlichen Verteilungsmuster von Albumin im Extravasalraum und andererseits auf der hohen Albuminaufnahme der Tumorzellen erfolgt.
Im Hinblick auf das Röntgenkontrastmittel erfolgt die Kopplung bevorzugt ohne Veränderung der physikalischen Eigenschaften des Kontrastmittels.
Grundsätzlich wird bevorzugt ein Protein verwendet, welches für den Patienten, für welchen das Konjugat vorgesehen ist, nativ ist. Das heißt, dass das Protein in nativer Form vorliegt und weiterhin beispielsweise bei Verabreichung an Menschen humane Proteine, bei Verabreichung an Maus entsprechend Maus-Proteine, etc. eingesetzt werden. Somit ist ein natives Protein ein Protein, das von der gleichen Spezies stammt wie diejenige Spezies, an die das Protein verabreicht wird. Die Kopplung des Röntgenkontrastmittels an das Trägerprotein, vorzugsweise Albumin, erfolgt bevorzugt ohne Einschränkung dessen nativen Charakters. Besonders bevorzugt erfolgt eine kovalente Kopplung des Wirkstoffes an das Trägerprotein. Weiterhin wird die kovalente Kopplung bevorzugt so gewählt, dass sie unter physiologischen Bedingungen bzw. in gesunden und pathologisch veränderten Geweben wieder spaltbar ist, sodass die biologische Wirksamkeit des ursprünglichen Wirkstoffes erhalten bleibt und genutzt werden kann. Die Spaltung erfolgt vorzugsweise enzymatisch. Dabei kann die Bindung an das Protein entweder direkt oder über einen Linker erfolgen.
Erfindungsgemäß erfolgt somit eine Bildung von Röntgenkontrastmittel- Protei n-Konjugaten, insbesondere von Röntgenkontrastmittel-Albumin- Konjugaten ohne Veränderung der biologischen Wirksamkeit des Wirkstoffes und ohne Verlust des nativen Charakters des als Träger benutzten Proteins, insbesondere des Albumins.
Weiterhin werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt niedermolekulare Röntgenkontrastmittel an das Transportprotein gebunden, da auf diese Weise allein das Makromolekül Albumin das biokinetische Verhalten, nicht aber das niedermolekulare Röntgenkontrastmittel, bestimmt. Das erfindungsgemäß zur Bildung der Konjugate eingesetzte Röntgenkontrastmittel weist bevorzugt ein Molekulargewicht von < 2.000 Da1 besonders bevorzugt von < 1.000 Da, und insbesondere bevorzugt von < 500 Da auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Konjugat Wirkstoff in einem diagnostischen oder therapeutischen Mittel. Ein solches Arzneimittel weist insbesondere geringe Nebenwirkungen auf und kann beispielsweise auch ambulant verabreicht werden. Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise intravenös. Eine Dosiseinheit enthält vorzugsweise 1 bis 2 mg Wirkstoff Röntgenkontrastmittel pro Kilogramm Körpergewicht und insbesondere 0,9 bis 1 ,5 mg Wirkstoff pro Kilogramm Körpergewicht. Die Dosis kann insbesondere niedriger als bei der herkömmlichen Therapie mit Röntgenkontrastmitteln gewählt werden und beträgt vorzugsweise ≤ 2 mg und besonders bevorzugt ≤ 0,5 mg Röntgenkontrastmittel pro Kilogramm Körpergewicht.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Röntgenkontrastmittel-Protein-Konjugat zur Herstellung eines Arzneimittels zur Darstellung von Tumoren verwendet. Besonders bevorzugt wird es zur positiven Darstellung von soliden Tumoren verwendet. Insbesondere handelt es sich bei dem Arzneimittel um ein Kontrastmittel in der Röntgendiagnostik.
Ein weiterer wesentlicher Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung des wie hier beschriebenen und insbesondere in einem der Ansprüche 7 bis 23 definierten Konjugates zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Tumoren. Die Erfinder haben erstmalig herausgefunden, dass Röntgenkontrastmittel nicht nur als diagnostisches Mittel, sondern auch als therapeutisches Mittel, insbesondere als im Tumor anreicherungsfähigen Strahlensensitizer, eingesetzt werden können.
Die Funktionsweise der Kontrastmittel beruht darauf, dass sie durch Strahlungsabsorption die Dichte des durchstrahlten Organs erhöhen. Es ist seit langem bekannt, dass Röntgenkontrastmittel, insbesondere jodhaltige
Röntgenkontrastmittel, Nebenwirkungen auslösen können, die während oder nach der Untersuchung, also nach Applikation des Röntenkontrastmittels auftreten können und unterschiedlichen Ursachen zuzuordnen sind. Dabei ist zwischen akuten Nebenwirkungen unmittelbar bei der Applikation und langfristigen Nebenwirkungen einige Tage nach der Untersuchung zu unterscheiden. Zu den erstgenannten Nebenwirkungen gehören Wärmegefühl und Schmerzen an der Injektionsstelle, Vasodilatation verbunden mit Blutdruckabfall und Schwindelanfällen, Diurese etc. Die Ursache hierfür liegt in den unphysiologisch hohen Osmolaritätswerten der applizierten Kontrastmittellösungen, die 1400 mOsm (Milliosmol) und mehr betragen können, während der physiologische Wert der Osmolarität nur etwa 284 mOsm beträgt. Derartig hohe Osmolaritäten verursachen vor allem in unmittelbarer Nähe der Applikationsstelle, jedoch nicht nur dort, massive Störungen im Wasser-Elektrolyt-Haushalt.
Diese akuten Nebenwirkungen lassen sich vermeiden, indem niedermolekulare Verbindungen in geeigneter Weise an körpereigene Makromoleküle, wie zum Bespiel Albumin, chemisch gebunden werden. Der Grund für die Verwendung von Albumin als Trägersubstanz liegt in der Summe der oben aufgeführten Eigenschaften des Albumins, insbesondere der hohen Spezifität und Selektivität für Tumorzellen sowie der langen Halbwertszeit des Albumins. Im Stand der Technik wurden Röntgenkontrastmittel bisher lediglich zur Darstellung von Blutgefäßen eingesetzt, nicht jedoch zur positiven Darstellung von Tumoren. Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist nunmehr die Verwendung der erfindungsgemäßen Röntgenkontrastmittel-Albumin-Konjugate zur positiven Darstellung von Tumoren. Dazu wären üblicherweise wesentlich höhere Mengen an Kontrastmittel notwendig, worauf erfindungsgemäß durch die Bindung des Kontrastmittels an Albumin, welches eine sehr hohe Halbwertszeit aufweist, vorteilhafterweise verzichtet werden kann. So ist eine positive Darstellung von Tumoren mit der gleichen bzw. sogar einer geringeren Menge an verabreichtem Kontrastmittel möglich. Diese substantielle Reduktion der erforderlichen Kontrastmittelmengen ist ein wesentlicher Faktor bei der Verminderung des Risikos unerwünschter Nebenwirkungen.
Zu den langfristigen Nebenwirkungen, insbesondere jodhaltiger Röntgenkontrastmittel, die einige Tage nach der Untersuchung auftreten, gehören bei Patienten mit einer Neigung zu bzw. einer bestehenden Überfunktion der Schilddrüse Stoffwechselstörungen. Dabei kommen am häufigsten vermehrtes Herzklopfen, hoher Blutdruck, vermehrte Unruhe mit Schlaflosigkeit sowie Schweißausbrüche und Durchfall vor. Die Ursache für diese unerwünschten, späten Nebenwirkungen ist Jodid, das während der Untersuchung freigesetzt wird. Jodid entsteht wiederum bei der Reaktion von elementaren Jod, welches bei der Absorption der energiereichen Röntgenstrahlen von dem Kontrastmittel in die Zirkulation freigesetzt wird, mit weiteren Reaktionspartnern, wie zum Beispiel Tyrosinresten des Albumins. Dieses bei der Reaktion des elementaren Jods mit Tyrosinresten gleichzeitig gebildete Jodid stellt letztendlich den Auslöser der Hyperthyreose dar.
Die vorliegenden Erfinder haben nun zum ersten Mal herausgefunden, dass diese späten Nebenwirkungen, die einige Tage nach der Untersuchung auftreten, nicht nur Hyperthyreose aufgrund von freigesetztem Jodid, sondern auch eine Zerstörung von Zellen aufgrund der intrazellulären
Freisetzung von elementarem Jod darstellen. Der Stand der Technik ging bisher davon aus, dass Röntgenkontrastmittel lediglich eine physikalische Wirkung, jedoch keinerlei pharmakologische Wirkung aufweisen. Die konventionellen niedermolekularen, nicht tumorgängigen
Röntgenkontrastmittel des Standes der Technik wurden ausschließlich zur
Absorption von Strahlung für die Erstellung von Röntgenbildern zu diagnostischen Zwecken eingesetzt. Dem durch die Strahlungsabsorption freigesetzten Jod wurde jedoch nie Beachtung geschenkt, obwohl die zeitlich verzögerten Nebenwirkungen auf diesen Effekt der Jodfreisetzung durch Röntgenstrahlen zurückzuführen sind.
Die vorliegenden Erfinder haben zum ersten Mal auch eine pharmakologische Wirkung von Röntgenkontrastmitteln, insbesondere von jodhaltigen Röntenkontrastmitteln, entdeckt, nämlich die Zerstörung von Tumorzellen mittels dieser Röntgenkontrastmittel. Eine gezielte und spezifische Zerstörung von Tumorzellen kann jedoch nur durch die Kopplung des Röntgenkontrastmittels an Protein, insbesondere Albumin erreicht werden.
Daher stellt ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Röntgenkontrastmittel-Protein-Konjugates zur
Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Tumoren dar. Dabei erfolgt die Behandlung der Tumoren bevorzugt dadurch, dass bei
Bestrahlung des Röntgenkontrastmittels toxische Entitäten freigesetzt werden, die bevorzugt bei der Absorption der energiereichen Röntgenstrahlen von dem Kontrastmittel intrazellulär sowie in die Zirkulation freigesetzt werden. Bei den toxischen Entitäten handelt es sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt um Radikale, insbesondere um
Halogenradikale, wobei von den Halogenradikalen, welche als Halogen Jod,
Brom, Chlor und/oder Fluor aufweisen können, vor allem Jodradikale besonders bevorzugt sind. Außerdem kann es sich bei den toxischen
Entitäten beispielsweise um Benzoesäureradikale handeln.
Zur Bestrahlung wird erfindungsgemäß bevorzugt eine Energiequelle mit Energie von > 10 Elektronen-Vol (eV), stärker bevorzugt > 100 eV und am meisten bevorzugt > 1 Kiloelektronen-Volt (keV) verwendet. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bestrahlung mit einer Energiequelle, die Energie im Bereich von 20 bis 25 keV ausstrahlt. Die eingesetzte Strahlendosis kann erfindungsgemäß im Bereich der zur Diagnostik verwendeten Strahlendosis oder darunter liegen, um eine Strahlenbelastung des Körpers möglichst gering zu halten. Alternativ kann auch eine höhere Strahlendosis als zur Diagnostik notwendig ist, eingesetzt werden.
Der Wirkungsmechanismus dse Röntgenkontrastmittel-Protein-Konjugats ist dabei insbesondere wie folgt: Nach Verabreichung des Konjugates wird dieses einerseits aufgrund des natürlichen Verteilungsmusters des Albumins im Extravasalraum und andererseits aufgrund der hohen Albuminaufnahme der Tumorzellen mit hoher Spezifität und Selektivität zum Tumorgewebe transportiert, wo Albumin dann von den Tumorzellen umgesetzt wird. Bei Bestrahlung des nun intrazellulär vorliegenden Röntgenkontrastmittels führt die energiereiche eingestrahlte Strahlung, welche eine höhere Energie als die Bindungsenergie zwischen den zu erzeugenden Radikalen im
5 Röntgenkontrastmittel aufweist, zur Bildung von intrazellulären toxischen Entitäten, bevorzugt Radikalen, besonders bevorzugt Halogenradikalen, insbesondere Jodradikalen, sowie z.B. Benzoesäure, welche bei physiologischem pH-Wert nur schwer löslich ist. Diese intrazellulären toxischen Entitäten können bei Verwendung eines herkömmlichen o unspezifischen Röntenkontrastmittels fatale Folgen haben. Die Bindungsenergie zwischen dem Jod und dem Benzolring beträgt beispielsweise etwa 5 bis 6 eV, während die Energie der von der Bestrahlungsquelle freigesetzten Strahlung weitaus höher liegt, ca. um das 1000fache, nämlich 20 bis 25 keV. Daher ist in einer bevorzugten 5 Ausführungsform der Erfindung die Energie der Strahlung, mit der das erfindungsgemäße Konjugat bestrahlt wird, um das 10fache, bevorzugt um das 100fache und am meisten bevorzugt um das 1000fache höher als die Bindungsenergie der in Radikale zu spaltenden Bindung im Röntgenkontrastmittel. Erfindungsgemäß reichern sich durch die Kopplung o des Röntgenkontrastmittels an Albumin jedoch diese toxischen Entitäten spezifisch in den Tumorzellen an, welche gezielt die kontrastmittelhaltige Tumorzelle zerstört. In Beispiel 4 ist dargelegt, dass jodhaltige Röntgenkontrastmittel nicht beständig gegenüber energiereicher Strahlung sind. Insbesondere ist die Unbeständigkeit des Röntenkontrastmittels 5 gegenüber UV-Strahlung, die sogar etwa 100 mal niedriger ist als Röntenstrahlung, nachgewiesen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Protein-Röntgenkontrastmittel-Konjugat effektiv zur gezielten Zerstörung der o Tumorzellen eingesetzt werden, ohne dass eine Erhöhung der Konjugatmenge sowie der Strahlendosis erforderlich ist. Bevorzugt kann die Strahlendosis auch erhöht werden. Einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungsgemäßen Konjugates zur Herstellung eines Arzneimittels zum Schutz von nicht mit Tumor befallenem Gewebe vor Radikalen. Da gesunde Zellen unter physiologischen Bedingungen kein Albumin verbrauchen, dient das im erfindungsgemäßen Konjugat vorliegende Albumin dazu, nicht mit Tumor befallene(s), insbesondere gesunde(s) Gewebe bzw. Körperflüssigkeiten, in welchem(n) das verabreichte erfindungsgemäße Konjugat unspezifisch vorliegt, wie z.B. Gewebe des Transportweges zu den Tumorzellen, umliegendes Gewebe des Tumorgewebes sowie Blutkreislauf, dazu, vor radikalischem Stress bei der Bestrahlung zu schützen. Das in gesundem Gewebe bzw. im Blutkreislauf vorliegende Albumin wirkt über seine Tyrosinreste als Radikalfänger für die bei der Bestrahlung entstehenden Jodradikale des Röntgenkontrastmittels.
Somit weist Albumin insgesamt zwei Effekte auf, nämlich zum einen eine verlängerte Halbwertszeit des Albumins im Körper sowie eine gezielte Aufnahme in Tumorzellen und andererseits einen Schutz gegen die bei der Bestrahlung entstehenden Radikale in von nicht mit Tumoren befallenem Gewebe, welches noch von der Bestrahlung betroffen ist.
Daher ist eine weitere Ausführunsform der Erfindung eine Zusammensetzung, die ein Röntgenkontrastmittel-Protein-Konjugat sowie mindestens einen Radikalfänger umfasst, der die antiradikalische Wirkung des Proteins, insbesondere des Albumins, weiterhin unterstützt. Überraschenderweise konnten damit synergistische Effekte im Hinblick auf den Schutz von nicht mit Tumor befallenem Gewebe vor Radikalen erreicht werden. Dabei liegt der Radikalfänger in ungebundener, nicht konjugierter Form in der Zusammensetzung vor.
Unter Radikalfängern versteht man organische oder anorganische Substanzen, deren chemische Reaktion mit reaktiven Radikalen zu stabileren Verbindungen führt. Der Zusatz von Radikalfängern zu einer radikalischen Kettenreaktion unterbricht also die Reaktionskette. Dabei sind erfindungsgemäß insbesondere Radikalfänger bevorzugt, welche pharmazeutisch und physiologisch annehmbar sind. Dazu gehören L- Cystein, Cysteamin, Melamin, Gluthation, Harnsäure sowie Liponsäure und Dihydroliponsäure, die im Körpergewebe als Radikalfänger zum Schutz gegen schädigende Einflüsse dienen. Besonders bevorzugt sind Radikalfänger geeignet, die zur Krebsprophylaxe dienen. Zu diesen gehören Vitamin A, Retinoide und ß-Carotin (Provitamin A) sowie die antioxidativen Vitamine C und E. Sie bewahren als Radikalfänger die DNA und Zellmembranen vor oxidativen Schäden durch Radikale und tragen so zum Schutz vor Mutationen und zur Erhaltung der Zellintegrität bei. Weiterhin gehören dazu. Besonders bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Vitamin E und Albumin als Radikalfänger, wobei Albumin insbesondere bevorzugt ist, da es aufgrund seiner Tyrosinreste ein effizienter Jodradikalfänger ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein diagnostisches oder therapeutisches Mittel dar, welches als Wirkstoff ein Röntgenkontrastmittel- Protein-Konjugat in Kombination mit mindestens einem Radikalfänger umfasst.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird daher sowohl das erfindungsgemäße Konjugat als auch die Zusammensetzung umfassend dieses Konjugat sowie mindestens einen Radikalfänger zur Herstellung eines Arzneimittels zum Schutz vor nicht mit Tumor befallenem Gewebe vor Radikalen eingesetzt.
Noch einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungsgemäßen Konjugates zur Therapiekontrolle nach einer Behandlung mit dem Konjugat, insbesondere drei bis vier Wochen nach der Behandlung. Bedingt durch die lange biologische Halbwertszeit des Albumins sowie auch des Jods, welches bei Bestrahlung des Röntgenkontrastmittels freigesetzt wird, ist auch noch nach einer Zeitspanne von drei bis vier Wochen nach Verabreichen des Konjugates eine direkte Therapiekontrolle möglich, bevorzugt ohne Zugabe von weiterem Röntgenkontrastmittel-Albumin-Konjugat, welches für den Körper zusätzlich eine Belastung darstellt. Daher ist eine nebenwirkungsarme Therapiekontrolle zu einem späteren Zeitpunkt möglich, sodass auch bei mehrfacher Wiederholung des Vorgangs die Strahlendosis immer noch im Bereich diagnostischer Maßnahmen liegt.
Somit verursacht das erfindungsgemäße Röntgenkontrastmittel-Protein- Konjugat, insbesondere das 2,3,5-Trijodbenzoesäure-Albumin-Konjugat weder Nebenwirkungen unmittelbar bei der Applikation noch langfristige Nebenwirkungen einige Tage nach der Untersuchung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Röntgenkontrastmittel-Protein-Konjugats, umfassend das Umsetzen eines Carboxylgruppen-haltigen Röntgenkontrastmittels, bevorzugt eines niedermolekularen Carboxylgruppen-haltigen Röntgenkontrastmittels mit einem Protein, bevorzugt einem hochmolekularen Trägerprotein. Bevorzugt erfolgt eine direkte kovalente Kopplung des Röntgenkontrastmittels an das Protein, beispielsweise Albumin, ohne dessen nativen und natürlichen Charakter einzuschränken. Besonders vorteilhaft hat sich eine Kopplung erwiesen, bei der zunächst aus dem niedermolekularen Röntgenkontrastmittel mittels eines Carbodiimids eine aktivierte Säure gebildet wird und anschließend die aktivierte Säure des Röntgenkontrastmittels mit einem Protein umgesetzt wird.
Für die Herstellung der erfindungsgemäß eingesetzten Konjugate ist eine effiziente Kopplung des Wirkstoffes an das Trägermolekül (also das Protein) von Bedeutung. Bei der Kopplung darf es insbesondere nicht zu einer unerwünschten Veränderung des Trägerproteins oder/und des Wirkstoffes kommen. Die bisher übliche Aktivierung Carboxylgruppen-haltiger organischer Verbindungen mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) erfordert bei Raumtemperatur oder bei +4 0C mehr als 12 Stunden (P. Hammer und W. Heeschen, Milchwissenschaft 1995, 50(9), S. 513 - 514, DP 41 22 210 A1 ; EP 0 879 604 A1 ; EP 0 820 308). Bei diesem Verfahren bilden sich zudem bei der Aktivierung unlösliche Substanzen, die zum Teil bereits während der Aktivierung und zum Teil beim Eintragen des aktivierten Wirkstoffs in eine wässrige Proteinlösung ausfallen und, damit das Konjugat medizinisch verabreicht werden kann, durch zeitaufwändige und teure Filtrationsschritte zusätzlich zu der eigentlichen Produktreinigung abgetrennt werden müssen und nie 100 %ig sind (wegen der lipophilen Domäne im Albumin). Daher wird erfindungsgemäß bevorzugt, dass es sich bei dem Carbodiimid um N- (3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimidhydrochlorid handelt.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass durch die Verwendung von EDT, insbesondere in Form des Hydrochlorids, eine Aktivierung der Carboxylgruppen-haltigen organischen Verbindung und eine Umsetzung mit einem Trägerprotein erreicht werden kann, ohne dass wasserunlösliche Nebenprodukte gebildet werden, die zeit- und kostenaufwändig abzutrennen wären. Durch dieses Verfahren werden Zwischenreinigungsschritte überflüssig und die Präparationszeit und damit auch die Herstellungskosten werden wesentlich reduziert. Wetierhin werden Probleme, die bei der Injektion des Konjugats in einem menschlichen oder tierischen Körper durch unlösliche Substanzen oder Nebenprodukte hervorgerufen werden, vermieden.
Die Aktivierung erfolgt bevorzugt bei einer Temperatur von 10 bis 100 0C, mehr bevorzugt von 20 bis 90 0C und noch bevorzugt von 50 bis 75 0C für enie Reaktionszeit von 1 bis 10 Stunden, mehr bevorzugt von 20 bis 50 Minuten. Die Umsetzung des aktivierten Wirkstoffes mit dem Trägerprotein erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 10 und 50 0C, insbesondere zwischen 20 und 40 0C.
Bevorzugt wird die Aktivierung der Carboxylgruppen-haltigen Verbindung, insbesondere von 2,3,5-Trijodbenzoesäure mit EDC in einem organischen Lösungsmittel, bevorzugt in Dimethylsulfoxid (DSMO) durchgeführt. Weitere geeignete organische Lösungsmittel sind z.B. Dimethylacetamid oder Dioxan. Die Aktivierung wird vorzugsweise unter Ausschluss von Wasser, insbesondere in Gegenwart von ≤ 5 Gew.-% Wasser, mehr bevorzugt ≤ 1 Gew.-% Wasser und am meisten bevorzugt vollständig wasserfrei durchgeführt.
In einer alternativen Ausführungsform wird das Herstellungsverfahren unter Einsatz der Aktivierungsreagenzien EDC sowie N-Hydroxysuccinimid durchgeführt. Vorteilhaft an diesen Aktivierungsreagenzien ist, dass sie eine hohe Wasserlöslichkeit aufweisen. Dadurch können bei der Umsetzung nicht verbrauchte Kopplungsreagenzien auf einfache Weise aus dem gewonnenen Produkt, beispielsweise durch Waschen mit Wasser, entfernt werden. Im Gegensatz dazu verbleibt bei den im Stand der Technik verwendeten Kopplungsreagenzien, beispielsweise bei der Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) ein nicht auftrennbarer Rest an Kopplungsreagenz im Konjugat. So ist bei einem Röntgenkontrastmittel- Albumin-Konjugat bei Verwendung von DCC ein nicht abtrennbarer Rest von etwa 13 bis 15 Gew.-% an DCC im Konjugat zu beobachten, der wahrscheinlich an eine lipophile Domäne im Albumin gebunden ist. Dieser Rest kann nur mit Hilfe von HPLC nachgewiesen und nur unter erheblichem Aufwand präparativ abgetrennt werden.
Wird insbesondere noch mit einem hohen Überschuss an DCC im Verhältnis zum zu koppelnden Wirkstoff, wie es in der Veröffentlichung von P. Hammer und W. Heeschen (siehe oben) beschrieben ist, gearbeitet, nämlich einem Molverhältnis DCC : Wirkstoff von etwa 10 : 1 , so ist eine vollständige Abtrennung des Proteins mittels Dialyse oder Ultrafiltration nicht mehr möglich. Dieses am Protein haftende, immer noch reaktive DCC führt jedoch im Laufe der Zeit durch intra- und intermolekulares Crosslinking zu einer weiter fortschreitenden Alteration des Proteins, wodurch sich die Eigenschaften des Trägerproteins zeitabhängig verändern. Daher kommt für ein so hergestelltes Konjugat keine klinische Anwendung in Betracht. Ein weiterer bevorzugter Aspekt der Erfindung betrifft daher ein Herstellungsverfahren eines erfindungsgemäßen Konjugates, umfassend das Umsetzen eines Röntgenkontrastmittels mit Albumin, wobei man ein Röntgenkontrastmittel und Albumin in Gegenwart eines Carbodiimids, bevorzugt in Gegenwart von N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl- carbodiimid ohne N-Hydroxysuccinimid oder N-Hydroxysuccinamid oder ohne ein beliebiges weiteres Aktivierungsreagenz umsetzt.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass sich das optimierte Verfahren, welches ohne N-Hydroxysuccinimid oder N-Hydroxysuccinamid oder ohne andere zusätzliche Aktivierungsreagenzien arbeitet, bei der Reinigungsprozedur positiv auf die Vereinfachung der Herstellung auswirkt. Durch die Verwendung von EDC alleine zur Aktivierung ohne den Zusatz von N-Hydroxysuccinimid (HSI) oder N-Hydroxysuccinamid (HSA) beträgt die Aktivierungszeit des Röntgenkontrastmittels nur noch wesentlich weniger als die bei Verwendung von HSI oder HSA benötigten 30 Minuten. Ein weiterer Vorteil des optimierten Verfahrens liegt darin, dass nach Zugabe des aktivierten Wirkstoffs zu dem vorgelegten Protein, insbesondere Albumin, ohne N-Hydroxysuccinimid eine direkte Kontrolle der Kopplungseffizienz erfolgen kann. Bei Verwendung von N- Hydroxysuccinimid besitzt dieses bei der HPLC bei einer Einstellung der UV-Messzelle auf 280 nm ebenfalls eine hohe UV-Absorption und stört oder erschwert durch eine Retentionszeit von 11 ,5 Minuten, bei der auch andere niedermolekulare Verbindungen erscheinen, eine direkte Bestimmung der Kopplungsausbeute. Dies bedeutet, dass in vielen Fälle eine Ausbeutebestimmung erst am Ende der Reinigung des Konjugats möglich ist. Durch das optimierte Verfahren ohne Einsatz von N-Hydroxysuccinimid oder N-Hydroxysuccinamid kann dieser Faktor nun ausgeschlossen werden. Dies ist auch für die Produktsicherheit von großem Vorteil. Ein weiterer Vorteil des optimierten Verfahrens liegt darin, dass die Kopplungsausbeute überraschenderweise durchschnittlich bei 98 bis 99 % liegt. Somit sind die Gesamtkosten des jeweiligen Konjugats durch diese Vereinfachung der Herstellung deutlich gesenkt. Gemäß einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Kopplung wird aus dem niedermolekularen Röntgenkontrastmittel mittels Thionyl- oder Oxalylchlorid ein Säurechlorid des Röntgenkontrastmittels hergestellt, welches anschließend direkt mit dem Protein umgesetzt wird. Die Umsetzung des Röntgenkontrastmittels, bevorzugt 2,3,5-Trijodbenzoesäure, mit Thionyl- oder Oxalylchlorid erfolgt bevorzugt bei einer Temperatur von 10 bis 100 0C, mehr bevorzugt von 20 bis 90 0C und noch mehr bevorzugt von 50 bis 75 0C für eine Reaktionszeit von 1 Minute bis 10 Stunden, mehr bevorzugt von 2 Minuten bis 50 Minuten, am stärksten bevorzugt von 5 bis 15 Minuten.
Im Rahmen der Herstellungsverfahren des erfindungsgemäßen Konjugates ist bevorzugt, dass das Molverhältnis von Röntgenkontrastmittel zu Protein 2 : 1 bis 0,1 : 1 beträgt und dass es sich bei dem Protein um Albumin handelt.
Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel und die beigefügten Figuren weiter erläutert.
Figur 1 zeigt ein HPLC-Chromatogramm von 2,3,5-Trijodbenzoesäure alleine.
Figur 2 zeigt das HPLC-Chromatogramm des gemäß Beispiel 1 hergestellten 2,3,5-Trijodbenzoesäure-HSA-Konjugats (Endprodukt nach der Reinigung).
I
Figur 3 zeigt das HPLC-Chromatogramm des gemäß Beispiel 2 hergestellten 2,3,5-Trijodbenzoesäure-HSA-Konjugats direkt nach der Herstellung und vor der Reinigung.
Figur 4 zeigt das HPLC-Chromatogramm von 2,3,5-Trijodbenzoesäure alleine. Figur 5 zeigt das HPLC-Chromatogramm des gemäß Beispiel 3 hergestellten 2,3,5-Trijodbenzoesäure-HSA-Konjugates.
Ausgangsstoffe: 2,3,5-Trijodbenzoesäue (SIGMA-ALDRICH, Taufkirchen), Thionylchlorid (SIGMA-ALDRICH, Taufkirchen) und N-(3-Dimethylaminopropyl)- N'-ethylcarbodiimid Hydrochlorid (SIGMA-ALDRICH, Taufkirchen) und Albumin (Göricke, Dessau). Anstelle der 2,3,5-Substitution der Benzoesäure können auch andere Substitutionsmuster eingesetzt werden.
Standardansatz im Labormaßstab:
Beispiel 1
Etwa 21 ,7 mg 2,3,5-Trijodbenzoesäure (MG 499.8) werden zusammen mit etwa 12,6 mg N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid Hydrochlorid (MG 191 ,7; Molverhältnis 1 : 1 ,5) in einem Reagenzglas mit NS 14,5 Schliff und Stopfen vorgelegt. Nach der Zugabe von 1 ml_ Dimethylsulfoxid (DMSO) wird die Reaktionsmischung in ein auf 65 0C vorgeheiztes Wasserbad eingebracht. Nach einer Reaktionszeit von etwa 30 min liegt eine klare, farblose Lösung der aktivierten Trijodbenzoesäure vor, die nach Abkühlung auf Raumtemperatur sehr langsam in eine 5%ige Albuminlösung eingetragen wird. An der Einlaufstelle bildet sich kurzzeitig eine Trübung, die sich jedoch schnell wieder auflöst. Das Kontrollchromatogramm kann direkt im Anschluss an die Kopplung angefertigt werden. Die Ausbeute der Reaktion liegt bei 99%. Die Abtrennung der im Endprodukt enthaltenen, unerwünschten Begleitstoffe: DMSO, N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl-Hamstoff und nicht kovalent gebundene Trijodbenzoesäure erfolgt durch Ultrafiltration (YM 30, Millipore). Beispiel 2
Etwa 100 mg 2,3,5-Trijodbenzoesäure (MG 499,8) werden mit 2 mL Thionylchlorid bzw. Oxalylchlorid versetzt und in ein auf 65 0C vorgeheiztes Wasserbad eingebracht. Nach etwa 10 Minuten liegt eine leicht gelblich gefärbte, klare Lösung des gewünschten Säurechlorids vor. Das überschüssige Thionylchlorid bzw. Oxalylchlorid wird im Vakuum restlos entfernt. Der schwach gefärbte feste Rückstand wird in 4 mL 1 ,4-Dioxan gelöst und ein Aliquot von 880 μL (entsprechend 22 mg 2,3,5- Trijodbenzoesäure wird direkt in eine 5%ige, 0,17 M Bicarbonat-Lösung von Albumin eingetragen.
Die Qualitätskontrolle kann unmittelbar nach der Herstellung erfolgen.
Qualitätskontrolle (HPLC/SEC):
Vorsäule: Reprosil 200 SEC 5 x 4 mm, 5 μm (Dr. Maisch GmbH) Säule: Reprosil 200 SEC 300 x 4,6 mm, 5 μm (Dr. Maisch GmbH) Laufmittel: 0.18 M Na2HPO4; pH 7,4; 5% Methanol Fluß: 0,3 ml_/min
Druck: etwa 50 bar UV-VIS: 280 nm
Retentionszeiten: oligomere Albuminfraktion 5,92 min dimere Albumin-Fraktion 8,63 min monomere Albumin-Fraktion 9,55 min freie 2,3,5-Trijodbenzoesäure 16,88 min
Chromatogramme: Siehe Figuren 1 bis 3 Beispiel 3
Standardansatz im Labormaßstab:
Etwa 22 mg 2,3,5-Trijodbenzoesäure (MG 499.81, etwa 44 μmol) werden zusammen mit 1 ml Thionylchlorid in einem Reagenzglas mit NS 14,5 Schliff und einem kleinen Rückflusskühler vorgelegt. Das Reaktionsgemisch wird etwa 30 min auf 80 0C erwärmt und anschließend wird das überschüssige Thionylchlorid im Vakuum aus der inzwischen klaren Lösung entfernt. Der feste, trockene Rückstand wird in 2 ml 1 ,4-Dioxan gelöst und diese Lösung wird langsam in eine bicarbonatgepufferte, 5 %ige Albuminlösung eingetragen. An der Einlaufstelle bildet sich kurzzeitig eine weiße Trübung, die sich jedoch schnell wieder auflöst. Das Kontrollchromatogramm mittels Dünnschicht-Chromatographie (DC) oder Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (high Performance liquid chromatography (HPLC)) bzw. Größenauschlusschromatographie (size exclusion chromatography (SEC)) kann direkt im Anschluss an die Kopplung angefertigt werden. Die Ausbeute der Reaktion liegt bei ≥ 95 %.
Die Abtrennung der unerwünschten Begleitstoffe Dioxan und nicht gebundene Trijodbenzoesäure erfolgt mittels Ultrafiltration (YM 30, Millipore).
Qualitätskontrolle (HPLC/SEC): Vorsäule: Reprosil 200 SEC 10 x 4 mm, 5 μm (Dr. Maisch GmbH)
Säule: Reprosil 200 SEC 300 x 4,6 mm, 5 μm (Dr. Maisch GmbH)
Laufmittel: 0,13 M Na2HPO4; 7,5 % Methanol, pH 7,2;
Fluss: 0,3 ml_/min
Druck: etwa 50 bar UV-VIS: 254 nm Retentionszeiten: oligomere Albuminfraktion 6,00 min dimere Albuminfraktion 8,17 min monomere Albuminfraktion 9,00 min freie 2,3, 5-Trijodbenzoesäure 22,12 min
Chromatogramme: Siehe Figuren 4 und 5
Beispiel 4
Der Nachweis, dass jodhaltige Röntgenkontrastmittel gegenüber energiereicher Strahlung nicht beständig sind, kann mit einer einfachen Versuchsanordnung belegt werden:
Etwa 40 mg 2,3,5-Trijodbenzoesäure (TJB) oder ein anderes, im Handel erhältliches Röntgenkontrastmittel (Diatrizoesäure, lotalaminsäure etc.) werden in 40 ml einer etwa 0,1 %igen Stärkelösung unter leichter Erwärmung gelöst. Jeweils 20 ml werden auf zwei Petrischalen (Durchmesser 11 ,5 cm) verteilt. Schale 1 wird 1 Stunde in volles Sonnenlicht gestellt. Schale 2 wird 1 Stunde mit einer UV-Handlampe (254 nm, 14 μW/cm2) im Abstand von 11 cm bestrahlt.
Während die Lösung der Schale 1 nach der Tageslichtexposition immer noch farblos ist, zeigt sich bei der Schale 2 die typische, intensive Blaufärbung der Jod-Stärke-Reaktion. Dies ist umso bemerkenswerter, als die Energie der UV-Strahlung (ebenso die Intensität der verwendeten Strahlenquelle) etwa 100 mal niedriger ist als die Röntgenstrahlung eines Computertomographen.

Claims

Ansprüche
1. Verwendung eines Röntgenkontrastmittel-Protein-Konjugats, umfassend ein Carboxylgruppen-haltiges Röntgenkontrastmittel und ein Protein zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Darstellung von Tumoren.
2. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass bei Bestrahlung des Röntgenkontrastmittels toxische Entitäten freigesetzt werden.
3. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den toxischen Entitäten um Radikale, bevorzugt um Jodradikale, handelt.
4. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei Bestrahlung des Röntgenkontrastmittels eine Zerstörung der Tumorzellen erfolgt.
5. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Arzneimittel um ein Kontrastmittel in der Röntgendiagnostik handelt.
6. Verwendung nach Anspruch 1 oder 5 zur positiven Darstellung von Tumoren.
7. Röntgenkontrastmittel-Protein-Konjugat, umfassend ein Carboxylgruppen-haltiges Röntgenkontrastmittel und ein Protein.
8. Röntgenkontrastmittel-Protein-Konjugat nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Röntgenkontrastmittel direkt kovalent an das Protein gekoppelt ist.
9. Röntgenkontrastmittel-Protein-Konjugat nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Röntgenkontrastmittel über eine Säureamidbindung an das Protein gekoppelt ist.
10. Röntgenkontrastmittel-Protein-Konjugat nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Kopplung mittels eines Carbodiimid erfolgt.
11. Röntgenkontrastmittel-Protein-Konjugat nach Anspruch 10, dadurch erhältlich, dass man ein Carboxylgruppen-haltiges Röntgenkontrastmittel und ein Protein in Gegenwart eines Carbodiimid als Aktivierungsreagenz ohne N-Hydroxysuccinimid und/oder N-Hydroxysuccinamid umsetzt.
12. Röntgenkontrastmittel-Protei n-Konjugat nach Anspruch 11 , dadurch erhältlich, dass man ein Carboxylgruppen-haltiges Röntgenkontrastmittel und ein Protein in Gegenwart eines Carbodiimid als Aktivierungsreagenz ohne weiteres Aktivierungsreagenz umsetzt.
13. Röntgenkontrastmittel-Protein-Konjugat nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Carbodiimid um N-(3-Dimethylaminopropyl)- N'-ethylcarbodiimid handelt.
14. Röntgenkontrastmittel-Protein-Konjugat nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch erhältlich, dass aus dem Carboxylgruppen-haltigen Röntgenkontrastmittel mittels Thionyl- oder Oxalylchlorid ein Säurechlorid des
Röntgenkontrastmittels hergestellt wird, das anschließend direkt mit dem Protein umgesetzt wird.
15. Röntgenkontrastmittel-Protein-Konjugat nach einem der Ansprüche 7 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Röntgenkontrastmittel eine Jodverbindung ist.
16. Röntgenkontrastmittel-Protein-Konjugat nach einem der Ansprüche 7 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Röntgenkontrastmittel eine Trijodbenzoesäure ist.
17. Röntgenkontrastmittel-Protein-Konjugat nach einem der Ansprüche 7 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Trijodbenzoesäure um 2,3,5-Trijodbenzoesäure,
Diatrizoesäure, loxitalaminsäure, loxiglinsäure und/oder lotroxinsäure handelt.
18. Röntgenkontrastmittel-Protein-Konjugat nach einem der Ansprüche 7 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Röntgenkontrastmittel eine 2,3,5-Trijodbenzoesäure ist.
19. Röntgenkontrastmittel-Protein-Konjugat nach einem der Ansprüche 7 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein Albumin ist.
20. Röntgenkontrastmittel-Protein-Konjugat nach einem der Ansprüche 7 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Albumin humanes Serumalbumin ist.
21. Röntgenkontrastmittel-Protein-Konjugat nach einem der Ansprüche 7 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Albumin in seiner natürlichen Form vorliegt.
22. Röntgenkontrastmittel-Protein-Konjugat nach einem der Ansprüche 7 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass das Albumin in nativer Form vorliegt.
23. Röntgenkontrastmittel-Protein-Konjugat nach einem der Ansprüche 7 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Molverhältnis Röntgenkontrastmittel zu Albumin 2 : 1 bis 0,1 : 1 beträgt.
24. Zusammensetzung, umfassend ein Röntgenkontrastmittel-Protein- Konjugat nach einem der Ansprüche 7 bis 23 und mindestens einem
Radikalfänger.
25. Zusammensetzung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Radikalfänger Albumin ist und das
Röntgenkontrastmittel eine Jodverbindung ist.
26. Diagnostisches oder therapeutisches Mittel, umfassend als Wirkstoff ein Röntgenkontrastmittel-Protein-Konjugat, welches ein Carboxylgruppen-haltiges Röntgenkontrastmittel und ein Protein nach einem der Ansprüche 7 bis 23 umfasst.
27. Mittel nach Anspruch 26, weiterhin umfassend mindestens einen Radikalfänger.
28. Verwendung eines Konjugates nach einem der Ansprüche 7 bis 23 oder einer Zusammensetzung nach Anspruch 24 oder 25 zur
Herstellung eines Arzneimittels zum Schutz von nicht mit Tumor befallenem Gewebe vor Radikalen.
29. Verfahren zur Herstellung eines Röntgenkontrastmittel-Protein- Konjugats nach einem der Ansprüche 7 bis 23, umfassend das
Umsetzen eines Carboxylgruppen-haltigen Röntgenkontrastmittels mit einem Protein.
30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass eine direkte kovalente Kopplung des Carboxylgruppen-haltigen Röntgenkontrastmittels an ein Protein durchgeführt wird.
31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass zunächst aus dem Carboxylgruppen-haltigen Röntgenkontrastmittel eine aktivierte Säure mittels eines Carbodiimids gebildet wird und anschließend die aktivierte Säure des Röntgenkontrastmittels mit einem Protein umgesetzt wird.
32. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 31 , dadurch gekennzeichnet, dass das Röntgenkontrastmittel und das Protein in Gegenwart von Carbodiimid als Aktivierungsreagenz ohne N-Hydroxysuccinimid und/oder N-Hydroxysuccinamid umgesetzt wird.
33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass das Röntgenkontrastmittel und das Protein in Gegenwart von Carbodiimid als Aktivierungsreagenz ohne weiteres Aktivierungsreagenz umgesetzt wird.
34. Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Carbodiimid um N-(3-Dimethylaminopropyl)- N'-ethylcarbodiimid handelt.
35. Verfahren nach Anspruch 29 oder 30, dadurch gekennzeichnet, dass aus dem Carboxylgruppen-haltigen Röntgenkontrastmittel mittels Thionyl- oder Oxalylchlorid ein Säurechlorid des Röntgenkontrastmittels hergestellt wird, das anschließend direkt mit dem Protein umgesetzt wird.
36. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass das Molverhältnis Röntgenkontrastmittel zu Protein 2 : 1 bis 0,1 : 1 beträgt.
37. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 36 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Protein um Albumin handelt.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4883650A (en) * 1988-04-13 1989-11-28 Albert Einstein College Of Medicine - Of Yeshiva University Radioidohippuric acid ester, a conjugate thereof, and methods of making the same
WO1993010824A1 (fr) * 1991-12-04 1993-06-10 Guerbet S.A. Nouveau compose macromoleculaire polyamine iode, son procede de preparation et son utilisation comme agent de contraste
DE19636889A1 (de) * 1996-09-11 1998-03-12 Felix Dr Kratz Antineoplastisch wirkende Transferrin- und Albuminkonjugate zytostatischer Verbindungen aus der Gruppe der Anthrazykline, Alkylantien, Antimetabolite und Cisplatin-Analoga und diese enthaltende Arzneimittel
US6602989B1 (en) * 2000-05-17 2003-08-05 The Research Foundation Of State University Of New York Synthesis, characterization, and application of pyridylazo bioconjugates as diagnostic and therapeutic agents
US7790141B2 (en) * 2003-08-11 2010-09-07 Pathak Holdings, Llc Radio-opaque compounds, compositions containing same and methods of their synthesis and use

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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