DE60107547T2

DE60107547T2 - Verbindungen zur pdt

Info

Publication number: DE60107547T2
Application number: DE60107547T
Authority: DE
Inventors: Paul Loughborough BRADLEY; Mehar Brampton MANKU
Original assignee: Biolitec Pharma Marketing Ltd
Current assignee: Biolitec Pharma Marketing Ltd
Priority date: 2000-03-10
Filing date: 2001-03-08
Publication date: 2005-12-15
Anticipated expiration: 2021-03-09
Also published as: US7375215B2; JP2003525942A; AU3760101A; KR20020093833A; BR0109135A; US20060040912A1; ATE283858T1; DE60107547D1; WO2001066550A3; EP1263761B1; EP1263761A2; WO2001066550A2; GB0005855D0; CA2402433A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Poly-(alkylenoxid)-substituierte photosensibilisierende Verbindungen und ihre Verwendung bei der photodynamischen Therapie von krebsartigen und anderen erkrankten Geweben.
Hintergrund
Eine photodynamische Therapie (PDT) beinhaltet die Verabreichung eines photosensibilisierenden Mittels zur Lokalisierung eines erkrankten Zielgewebes unter anschließender Bestrahlung des Zielgewebes, das die Verbindung enthält, mit Licht einer spezifischen geeigneten Wellenlänge. Die resultierende photoaktivierte Verbindung führt in Gegenwart von Sauerstoff zu einer Nekrose des Gewebes.
Der Erfolg dieser Behandlungsart hängt von der Verabreichung einer Verbindung ab, die im Vergleich zu normalem Gewebe selektiv im Tumorgewebe festgehalten wird. Somit ist bei Bestrahlung des Tumors mit Licht, das die photoaktivierende Wellenlänge aufweist, das Ausmaß der Schädigung, das durch die Nekrose verursacht wird, proportional höher als im normalen Gewebe. Jedoch kommt es typischerweise zu einer gewissen Schädigung von normalem Gewebe und ein spezieller Nebeneffekt, der bei Verwendung zahlreicher Photosensibilisatoren auftritt, ist eine Rötung und Schwellung der Haut bei anschließender Belichtung mit normalen Lichtintensitäten und insbesondere mit Sonnenlicht. Derartige Nebenwirkungen werden auf ein Minimum beschränkt, indem man die Patienten für einen längeren Zeitraum nach der Behandlung in gedämpftem Licht hält, was ihre Lebensqualität einschränkt. Eine wirksamere Zufuhr des Photosensibilisators zum Tumorgewebe unter Erzielung eines wesentlich höheren Verhältnisses der Arzneistoffkonzentration im Tumor zur Konzentration im normalen Gewebe könnte somit in erheblichem Umfang die mit dieser Behandlung verbundenen potentiellen Nebenwirkungen für die Haut verringern.
Eine Gruppe von photosensibilisierenden Mitteln ist Gegenstand der Patente EP-0 337 601 und US-4 992 257. Bei diesen Verbindungen handelt es sich um Dihydroporphyrine (Chlorine) (1) und um die entsprechenden Tetrahydroporphyrine (Bacteriochlorine) (2) und (3) der folgenden Formeln:
worin n jeweils einen Wert von 1 bis 3 hat und die einzelnen Substituenten R, die gleich oder verschieden sind, eine Hydroxylgruppe (-OH) bedeuten, die jeweils frei vorliegen oder mit einer Alkyl- oder Acylgruppe substituiert sind. Es werden auch Salze, innere Salze, Metallkomplexe oder Hydrate oder andere Solvate dieser Verbindungen umfasst.
Es ist ersichtlich, dass die vorstehenden Formeln spezielle Tautomere unter verschiedenen Möglichkeiten wiedergeben, einschließlich die nachstehend angegebenen Chlorine (wiedergegeben ohne meso-Phenylgruppen):
Die Erfindung umfasst sämtliche Tautomeren der vorstehenden Verbindungen und ist nicht auf die in den Diagrammen dargestellten Verbindungen beschränkt.
Veröffentlichte Vorschläge
Es ist bekannt, dass eine Modifikation von Verbindungen durch PEGylierung, d.h. die direkte oder indirekte Anheftung von Polyethylenglykolketten (PEG) und im Prinzip von anderen Poly-(alkylenoxid)-ketten zur Erzielung wertvoller Eigenschaften führt. PEG ist nicht-toxisch, verleiht Arzneistoffmolekülen eine gute Wasserlöslichkeit und verändert die biologische Verteilung, was zu einem günstigen pharmakokinetischen Profil führen kann. Das allgemeine Gebiet der polyethersubstituierten Antitumormittel ist in der DKFZ-Patentanmeldung PCT EP-91/00992 (WO-91/18630) beschrieben. Die Auswahl der Verknüpfung zwischen der Polyetherkette und dem Antitumormittel wird dort nicht besonders berücksichtigt. Beim einzigen beschriebenen Beispiel wird ein Triazin durch anfängliche Aktivierung des Polyethers mit Cyanurchlorid eingeführt. Vor kurzem hat DKFZ ein Verfahren zur Herstellung von Chlorinen und Bacteriochlorinen mit einem Gehalt an einem Polyether beschrieben (WO-98/01156). Das Verfahren beinhaltet zunächst das Anheften des Polyethers an das Porphyrin unter anschließender Reduktion zu den entsprechenden Chlorinen und Bacteriochlorinen. Auch hier wird der Art der Verknüpfung zwischen dem Polyether und dem Antitumormittel keine spezielle Beachtung geschenkt. Beim einzigen beschriebenen Beispiel handelt es sich um eine Amidverknüpfung.
Eine PEGylierung von Verbindungen (1), (2) und (3) über Triazin-, Ether- und Esterverknüpfungen wurde von uns in PCT GB-95/00998 (WO-95/29915) beschrieben. Jedoch führen die Labilität der Esterverknüpfungen und erhebliche Schwierigkeiten bei der Vergrößerung des Herstellungsmaßstabs für die mit Triazin und Ether verknüpften Reste zu einer erheblichen Einschränkung der praktischen Verwertbarkeit dieser Verbindungen.
Enzon hat ferner über Polyetherzusammensetzungen mit einem Gehalt an Isocyanat- und/oder Isothiocyanatgruppen für ein kovalentes Anheften von biologisch wirksamen Substanzen, wie Peptiden oder Chemotherapeutika, berichtet (WO-94/04193). Jedoch wird bezüglich Isocyanaten und Isothiocyanaten über Verbindungen berichtet, bei denen biologisch wirksame Substanzen an beiden Enden der Polyetherkette angebracht sind.
Außerhalb des PDT-Gebiets wurde Hexan-1,6-diisocyanat zur Verknüpfung von PEG mit Atropin (Zalipsky et al., Eur. Polym. J., Bd. 19 (12) (1983), S. 1177–1183) und mit 5-Fluorouracil (Ouchi et al., Drug Design and Discovery, Bd. 9 (1992), S. 93–105) verwendet. Bayer (US-4 684 728) berichtet über ein Verfahren zur Verbesserung der Löslichkeit von wenig löslichen biologisch aktiven Verbindungen in Wasser durch Umsetzung unter Bildung eines Derivats, das den aktiven Rest, eine Verknüpfungsgruppe, z.B. eine gegebenenfalls substituierte Diisocyanatgruppe und eine Polyetherkette trägt. Auf irgendeinen Nutzen bezüglich des therapeutischen Profils derartiger Verbindungen, abgesehen von der Einfachheit der Zubereitung und der Verabreichung einer wasserlöslichen Verbindung, wird nicht hingewiesen.
Erörteruag der vorliegendes Arbeit
Fortschritte in der photodynamischen Therapie zur klinischen Behandlung von Krankheiten, insbesondere von Krebs, hängen von der Entwicklung von verbesserten Photosensibilisatoren ab. Zu den angestrebten Eigenschaften eines idealen Photosensibilisators gehören eine selektive Lokalisierung von erkranktem Gewebe, eine Aktivierung bei langen Wellenlängen, so dass sich eine maximale Eindringtiefe in das Gewebe ergibt, und ein hoher Wirkungsgrad als Sensibilisator. Im Hinblick auf Zubereitung und Verabreichung stellt die Wasserlöslichkeit ebenfalls eine günstige Eigenschaft dar. Bei der photodynamischen Therapie handelt es sich um eine duale Therapie, die aus der kombinierten Wirkung von Photosensibilisator und Licht besteht. In der klinischen Praxis wird zunächst der Arzneistoff verabreicht und einige Zeit später durch Licht aktiviert. Die Zeitspanne zwischen der Verabreichung des Arzneistoffes und der Lichtanwendung wird als Arzneistoff-Licht-Intervall bezeichnet. Es ist erstrebenswert, die Anwendung von Licht dann vorzunehmen, wenn sich der Photosensibilisator in maximaler Weise im Zielgewebe angereichert hat und aus dem normalen umgebenden Gewebe beseitigt worden ist. Der Hauptfaktor, der für das Arzneistoff-Licht-Intervall bestimmend ist, ist das pharmakokinetische Arzneistoffprofil, das selbst von Gewebe zu Gewebe variiert. Das Arzneistoff-Licht-Intervall muss für die klinische Praxis geeignet sein. Vom klinischen Standpunkt aus wäre eine Pharmakokinetik ideal, die in einem Tumor so rasch wie möglich eine maximale Arzneistoffkonzentration ergibt, z.B. von einigen Stunden bis zu höchstens 3 Tagen, zusammen mit einer anschließenden raschen Beseitigung aus dem Körper. Dies würde einen flexiblen Behandlungszeitplan ermöglichen.
In der europäischen Patentschrift 0 337 601 (US-4 992 257) beschreiben die Anmelder Verbindungen, die zahlreiche der angestrebten Eigenschaften aufweisen, insbesondere einen äußerst hohen Photowirkungsgrad, d.h, die Fähigkeit zur Erzeugung von freien Radikalspezies, wie Singulett-Sauerstoff durch Absorption von Licht. Die langen Absorptionswellenlängen der Moleküle, z.B. bei 652 nm und 734 nm, dringen in wirksamer Weise in das Gewebe ein, so dass die Sensibilisatoren zur Behandlung von tiefen Tumoren verwendet werden können.
Jedoch erfüllen die offenbarten Verbindungen nicht alle Anforderungen gleich gut. Ein verbleibender Nachteil besteht im Grad der Photosensibilität von normalem Gewebe, insbesondere der Haut, der im Anschluss an die Verabreichung des Sensibilisators auftritt. Dieser Nachteil ergibt sich aus einer unerwünschten Ablagerung des Sensibilisators in der Haut und anderem normalen Gewebe und stellt eine Folge der Tatsache dar, dass der Arzneistoff nicht in perfekter Weise zielgerichtet den Tumor erfasst hat. Die Photosensibilität der Haut kann je nach den verabreichten Arzneistoffen bis zu 4 Wochen dauern. Bei der üblichen klinischen Dosis von 0,15 mg·kg^–1 dauert die Hautempfindlichkeit beispielsweise für m-THPC (ein Tetraphenylchlorinderivat, bei dem jede Phenylgruppe eine m-Hydroxygruppe trägt) mindestens 2 bis 3 Wochen. Dies begrenzt die Freiheit des Patienten und stellt eine unerwünschte Einschränkung dar.
Wir haben nach Wegen gesucht, die Photosensibilität von normalem Gewebe, insbesondere der Haut, zu überwinden, indem wir m-THPC in ein Polyethylenglykolderivat umwandelten. Diese "PEGylierung" verändert in grundlegender Weise die Verteilung im Körper in günstiger Weise, indem die Zielgenauigkeit auf den Tumor gesteigert und gleichzeitig die Aufnahme durch die Haut verringert wird. Die Verteilung der Verbindung wird durch PEGylierung verändert, und zwar aufgrund von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Wasser und Sauerstoff an den Polyethylenglykolketten, wenn die Verbindung in das Blut injiziert wird. Um den Photosensibilisator herum entsteht eine "Wasserhülle", die verhindert, dass die Verbindung am Endothel von Blutgefäßwänden festklebt und anschließend in das umgebende Gewebe, einschließlich der Haut, gelangt. Dies begünstigt durch die verstärkte Permeabilitäts- und Retentionswirkung (EPR-Wirkung) die Aufnahme im Tumor. Tumore sind in Bezug auf das Gefäßsystem und die Lymphdrainage gestört, was zu einer erhöhten Anreicherung von Substanzen, wie Arzneistoffen, im Tumor, verglichen mit normalem Gewebe, führt (R. Duncan und F. Spreafico, Clin. Pharmacokinet., Bd. 27 (1994), S. 290–306). Diese Wirkung kann mit höhermolekularen Verbindungen verstärkt werden. Die Nettowirkung der PEGylierung besteht darin, dass die Verbindung in günstiger Weise aus der Haut und anderen normalen Geweben in den Tumor zurückgeleitet wird, was den Grad der Hautempfindlichkeit vermindert.
Es wurde experimentell bestätigt, dass die PEGylierung beispielsweise für eine günstige Neuverteilung im Gewebe sorgen kann. Dies wurde in einem experimentellen Mäusemodell gezeigt, bei dem für das mit Triazin verknüpfte Derivat während PDT ein erheblicher Unterschied zwischen Muskel- und Tumor-Photosensibilität festgestellt wurde (Grahn et al., Proc. SPIE, Bd. 3191 (1997), S. 180–186). 3 Tage nach Verabfolgung des PEGylierten m-THPC wurde festgestellt, dass der Muskel nicht mehr photosensitiv war, während der Tumor seine maximale Empfindlichkeit gegenüber Licht für mindestens 15 Tage nach der Arzneistoffverabreichung behielt. Dies ermöglichte einen langen Zeitraum für die tumorselektive Behandlung, ergab aber die weniger wünschenswerte Eigenschaft des Tumorfortbestands bei diesem Derivat.
Eine andere, früher durchgeführte Arbeit mit Triazinverknüpften PEG-Derivaten (PCT-Patentanmeldung der Anmelderin WO-95/29915 (PCT/GB95/00998)) bestätigte, dass die Pharmakokinetik bei der Triazinverknüpfung für eine routinemäßige klinische Anwendung eher zu ausgedehnt war. Insbesondere war die Ausscheidung aus der Leber sehr langsam, was von pharmazeutischen Standpunkt aus unerwünscht ist.
Es wurde nach einem alternativen Linker für das Triazinmolekül gesucht, einschließlich eines Glycidethers mit Amino-PEG und eines Hexylbiscarbamat-Linkers. Die PEGylierten Derivate von m-THPC mit Triazin- und Carbamatverknüpfungen weisen im Vergleich miteinander und mit m-THPC sehr unterschiedliche und unerwartete pharmakokinetische Eigenschaften auf. Die mit Triazin verknüpfte Verbindung (SPC 0038B) wird aus der Leber langsamer als m-THPC ausgeschieden, während das Carbamatderivat (SPC 0172) innerhalb einer mit m-THPC vergleichbaren Zeitspanne ausgeschieden wird. Die Löslichkeiten der Verbindungen und somit die Einfachheit der pharmazeutischen Zubereitung wurden auf Werte bis zu 52 mg/ml in Wasser erhöht, verglichen mit m-THPC, das in wässrigen Lösungsmitteln unlöslich ist.
Die Linkergruppe soll einen stabilen Punkt der PEG-Anheftung bereitstellen, eine vernünftige in-vivo-Zirkulation ermöglichen und durch eine zweckmäßige und robuste Synthese verfügbar sein. Sie soll jedoch nicht den PDT-Wirkungsgrad des Arzneistoffmoleküls beeinträchtigen. Das Verfahren von Zalipsky wurde modifiziert und für eine 2-stufige Synthese aus den Chlorin- und Bacteriochlorinmolekülen zu den entsprechenden PEGylierten Derivaten verwendet. Eine Analyse dieser Verbindungen durch Gelpermeationschromatographie (GPC) erlaubte eine Trennung von weniger stark PEGylierten Formen, jedoch erwies sich die Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) bei einer Trennung zwischen den Peaks von 0,8 min als überlegen. Reaktionsprodukte wurden ferner durch Spektroskopie im UV-sichtbaren Bereich analysiert, was zu einer quantitativen Messung des Molekulargewichts (MG) unter Anwendung der folgenden Formel führte: Scheinbares MG = MG (Chlorin) × A(1 %, 1 cm) (Chlorin)/A(1 %, 1 cm) (PEG-chlorin).
Die Arbeiten der Anmelderin bauen auf früheren Arbeiten auf, bei denen versucht wurde, einen idealen Sensibilisator zu entwickeln. Überraschenderweise ergeben die mit Carbamat verknüpften Polyethylenglykolderivate ein hervorragendes und bevorzugtes pharmakokinetisches Profil in klinischer Hinsicht und weisen ein geringeres Potential zur Herbeiführung einer kutanen Hautempfindlichkeit auf. Ferner zeigen Studien an Balb/c-Mäusen mit colo26, einem murinen kolorektalen Krebs, dass die photodynamische Wirkung des mit Carbamat verknüpften Derivats im Tumor nach 2 Tagen ein Maximum erreicht und dass das Derivat die gleiche PDT-Aktivität wie m-THPC selbst aufweist. Diese Aktivität ist erheblich höher als die der mit Triazin verknüpften Verbindung. Somit scheint insgesamt die PEGylierte, mit Carbamat verknüpfte Verbindung neue Merkmale aufzuweisen, die die angestrebten Eigenschaften des Sensibilisators verbessern.
Erfindung
Erfindungsgemäß werden Tetrakis-(hydroxyphenyl)-chlorin, Bacteriochlorin oder Isobacteriochlorin bereitgestellt, die an einer oder mehreren der Hydroxylgruppen durch Additionsreaktion mit einem Diisocyanat, Diisothiocyanat oder Isocyanat-Isothiocyanat an einer Isocyanat- oder Isothiocyanatgruppe davon derivatisiert sind, wobei die andere Isocyanat- oder Isothiocyanatgruppe selbst derivatisiert ist, und zwar durch eine Additionsreaktion mit der Hydroxylgruppe eines C_1-2-ω-alkylierten oder -acylierten Poly-(alkylenoxids) oder mit einer Hydroxylgruppe eine Verknüpfungsrestes, der selbst einen Rest eines solchen Poly-(alkylenoxids) trägt.
Die Umsetzungen, die in einer beliebigen zweckmäßigen Reihenfolge durchgeführt werden können, führen zu Verbindungen der Formeln:
und zu Imino-Tautomeren davon, worin n eine Zahl von 1 bis 3 bedeutet und die Reste R', die gleich oder verschieden sein können, eine Hydroxylgruppe (OH-Gruppe) darstellen, die selbst frei oder durch einen C₁- bis C₁₂-Alkyl- oder -Acylrest substituiert ist, jedoch in mindestens einem Fall und vorzugsweise in mehr als einem Fall die Formel
aufweist, worin
(i) die Reste X gleich oder verschieden sind und ein O oder S bedeuten,
(ii) Y ein O darstellt (eine Carbamat- oder Thiocarbamatverknüpfung),
(ii) A einen Kohlenwasserstoffrest mit 2 bis 40 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 4 bis 20 Kohlenstoffatomen und insbesondere mit 6 Kohlenstoffatomen bedeutet (dieser Rest kann verzweigt oder unverzweigt, cyclisch oder acyclisch, gesättigt oder ungesättigt, aliphatisch oder aromatisch sein),
(iv) B einen fakultativen Rest ((CH₂)_p– O)_q darstellt, worin p eine Zahl von 1 bis 4 und q die Zahl 0 oder 1 bedeuten,
(v) D ein Poly-(alkylenoxid), vorzugsweise Polyethylenglykol, mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von mindestens 200 und nicht mehr als 40 000, vorzugsweise von 750 bis 20 000 und insbesondere von 2 000 bis 5 000 Da darstellt,
(vi) E einen Alkyl- oder Acylrest mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen und vorzugsweise eine Methylgruppe bedeutet,
Von jeder der vorstehenden Verbindungen lassen sich Derivate, wie Salze mit Mineralsäuren (z.B. Hydrochloride, Sulfate), interne Salze, Metallkomplexe (z.B. mit Zn, Ga) oder Hydrate und andere Solvate bilden.
Zu geeigneten Diisocyanaten gehören Butan-1,4-diisocyanat, Hexan-1,6-diisocyanat, Octan-1,8-diisocyanat, Dodecan-1,12-diisocyanat, 2-Methylpentan-1,5-diisocyanat, Toluol-2,4-diisocyanat, Toluol-2,6-diisocyanat, Cyclohexan-trans-1,4-diisocyanat, Dicyclohexylmethan-4,4'-diisocyanat, Diphenylmethan-3,4-diisocyanat, Xyloldiisocyanat und 2,4,4-Trimethylhexylmethylendiisocyanat. Entsprechende Diisothiocyanate und Isocyanat-Isothiocyanate sind ebenfalls geeignet. Der besonders bevorzugte Linker ist Hexan-1,6-diisocyanat.
Somit können die erfindungsgemäßen Verbindungen für die photodynamische Therapie eines Krebstumors oder eines anderen erkrankten Gewebes eingesetzt werden. Die Verbindungen können auch zur Behandlung von Barrett-Oesophagus, altersbedingter Makulardegeneration, Keratinose, diabetischer Neuropathie, peripheren Gefäßkrankheiten, koronaren Arterienkrankheiten und Störungen aufgrund von bakteriellen oder viralen Infektionen verwendet werden.
Chemie
Die Verbindungstypen (12), (13) und (14) lassen sich in einem zweistufigen Verfahren herstellen.

(i) Aktivierung von Poly-(alkylenoxid) durch Umsetzung mit einem Diisocyanat, Diisothiocyanat oder einem Isocyanat-Isothiocyanat (z.B. Hexan-1,6-diisocyanat) in einem geeigneten inerten, wasserfreien Lösungsmittel (z.B. Toluol) mit oder ohne Katalysator (z.B. Dibutylzinndilaurat) mit oder ohne eine tertiäre organische Base (z.B. Triethylamin) bei einer Temperatur von 0 bis 110 °C.
(ii) Kupplung des aktivierten Poly-(alkylenoxids) an das reduzierte Porphyrin in einem geeigneten inerten Lösungsmittel (z.B. Toluol) mit oder ohne Katalysator (z.B. Dibutylzinndilaurat) mit oder ohne eine tertiäre organische Base (z.B. Triethylamin) bei einer Temperatur von 0 bis 110 °C.

Die Synthese der Verbindungen lässt sich auch durch Umkehr der Reihenfolge der Stufen erreichen, nämlich durch eine Aktivierung des reduzierten Porphyrins durch Umsetzung mit dem Diisocyanat, Diisothiocyanat oder Isocyanat-Isothiocyanat unter anschließender Kupplung mit dem Poly-(alkylenoxid). Jedoch wird der erstgenannte Weg bevorzugt.
Verabreichungswege
Parenterale Verabreichung oder auf einem beliebigen anderen geeigneten Weg in an sich bekannter Weise.
Pharmazeutische Darreichungsformen
Es kann sich um beliebige, auf dem einschlägigen Gebiet bekannte Darreichungsformen handeln, wozu (ohne Beschränkung hierauf) folgende Formen gehören:

i) injizierbare Lösung
ii) gefriergetrocknetes Pulver zur Rekonstitution und Injektion
iii) Infusionslösung zur Zugabe zu Kochsalzlösung oder einem anderen Träger
iv) Tablette oder Kapsel für die orale Verabreichung.

Herstellungsbeispiele
Beispiel 1
7,8-Dihydro-5,10,15,20-tetrakis-(3-hydroxyphenyl)-porphyrin, derivatisiert mit ω-Methoxypolyethylenglykol (durchschnittliches MG = 2000) über Biscarbamat-Verknüpfungen, abgeleitet von Hexan-1,6-diisocyanat.
[Verbindung (12): n = 1; meta-Substitution an allen Arylgruppen; X = O; A = (CH₂)₆; Y = O; q = O; D = PEG (durchschnittliches MG = 2000); E = CH₃].
Teil 1: Herstellung von aktiviertem mPEG-(ω-Methoxypolyethylenglykol)
Eine Lösung von mPEG (durchschnittliches MG = 2000, 40 g) in Toluol wurde 4 Stunden azeotrop getrocknet und innerhalb von 2 Stunden tropfenweise zu einem Gemisch von wasserfreiem Toluol (100 ml), Hexan-1,6-diisocyanat (16,2 ml) und Dibutylzinndilaurat (0,5 ml) gegeben. Nach Stehenlassen über Nacht unter wasserfreien Bedingungen wurde das Produkt durch Zugabe von Hexan (200 ml) gefällt. Der Feststoff wurde abfiltriert, aus Toluol/Hexan umgefällt und unter Vakuum getrocknet. Man erhielt das Produkt in Form eines weißen Pulvers (38 g). Eine Analyse durch nicht-wässrige Titration ergab einen Isocyanatgehalt von 95 % der Theorie. Molekulargewicht, bestimmt durch Titration der NCO-Gruppen: mPEG₂₀₀₀-Hexylcarbamatisocyanat 2160 (Theorie 2168). IR (Nujol, cm^–1) 3300 (NH); 2250 (NCO); 1715, 1535 (HN-COO); 1110 (CH₂OCH₂); δ_H (CCl₄) 1,3–1,6 (m, CH₂), 3,6 (s, OCH₂). Dieses Material wurde sofort im zweiten Teil der Synthese verwendet.
Teil 2: Kupplung von aktiviertem mPEG an m-THPC
Ein Gemisch aus 7,8-Dihydro-5,10,15,20-tetrakis-(3-hydroxyphenyl)-porphyrin (300 mg) und aktiviertem mPEG (hergestellt in Teil 1) (8,95 g) in wasserfreiem Toluol wurde über Nacht bei 30 bis 60 °C unter Stickstoff gerührt. Eine HPLC-Analyse eines Aliquotanteils ergab >95 % Tetra-PEGylierung. Das Produkt wurde gefällt, indem der gerührte Inhalt bei Raumtemperatur mit Hexan versetzt wurde. Der Feststoff wurde durch Filtration gewonnen, mit Hexan gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Sodann wurde das Produkt durch Umkehrphasenchromatographie unter Elution mit Methanol/Wasser gereinigt. Nach Entfernung des Methanols unter vermindertem Druck wurde die Lösung gefriergetrocknet. Man erhielt einen dunkelbraunen Feststoff.
Beispiel 2
7,8,17,18-Tetrahydro-5,10,15,20-tetrakis-(3-hydroxyphenyl)-porphyrin, derivatisiert mit ω-Methoxypoly-(ethylenglykol) (durchschnittliches MG = 2000) über Biscarbamatverknüpfungen, abgeleitet von Hexan-1,6-diisocyanat.
[Verbindung (13): n = 1, meta-Substitution an allen Arylgruppen; X = O; A = (CH₂)₆; Y = O; q = O; D = PEG (durchschnittliches MG = 2000); E = CH₃].
Unter Ersetzen von 7,8-Dihydro-5,10,15,20-tetrakis-(3-hydroxyphenyl)-porphyrin durch 7,8,17,18-Tetrahydro-5,10,15,20-tetrakis-(3-hydroxyphenyl)-porphyrin und unter Ersetzen von Toluol durch 1,4-Dioxan als Lösungsmittel in Beispiel 1, Teil 2, wurde die Titelverbindung in Form eines braunen Pulvers hergestellt.
Beispiel 3
7,8-Dihydro-5,10,15,20-tetrakis-(3-hydroxyphenyl)-porphyrin, derivatisiert mit ω-Methoxypoly-(ethylenglykol) (durchschnittliches MG = 5000) über Biscarbamatverknüpfungen abgeleitet von Hexan-1,6-diisocyanat.
[Verbindung (12): n = 1, meta-Substitution an allen Arylgruppen; X = O; A = (CH₂)₆; Y = O; q = 0; D = PEG (durchschnittliches MG = 5000); E = CH₃].
Unter Ersetzen von mPEG (durchschnittliches MG = 2000) durch mPEG (durchschnittliches MG = 5000) in Beispiel 1, Teil 1 [Molekulargewicht bestimmt durch Titration der NCO-Gruppen: mPEG₅₀₀₀-Hexylcarbamatisocyanat 4944 (Theorie 5168)] wurde die Titelverbindung in Form eines braunen Pulvers hergestellt.
Beispiel 4
7,8,17,18-Tetrahydro-5,10,15,20-tetrakis-(3-hydroxyphenyl)-porphyrin, derivatisiert mit ω-Methoxypoly-(ethylenglykol) (durchschnittliches MG = 5000) über Biscarbamatverknüpfungen, abgeleitet von Hexan-1,6-diisocyanat.
[Verbindung (13): n = 1, meta-Substitution an allen Arylgruppen; X = O; A = (CH₂)₆; Y = O; q = 0; D = PEG (durchschnittliches MG = 5000); E = CH₃].
Unter Ersetzen von mPEG (durchschnittliches MG = 2000) durch mPEG (durchschnittliches MG = 5000) in Beispiel 1, Teil 1 und unter Ersetzen von 7,8-Dihydro-5,10,15,20-tetrakis-(3-hydroxyphenyl)-porphyrin durch 7,8,17,18-Tetrahydro-5,10,15,20-tetrakis-(3-hydroxyphenyl)-porphyrin in Beispiel 1, Teil 2, wurde die Titelverbindung in Form eines braunen Pulvers hergestellt.
Biologie
Nachstehend wird über die durchgeführten Arbeiten berichtet.
SPC 0172 ist ein mit Carbamat verknüpftes PEG₂₀₀₀-m-THPC mit der Bezeichnung Tetrakis-(6'-(Methoxy-PEG₂₀₀₀-carbamat)-1'-isocyanat-hexamethylen)-Derivat von 7,8-Dihydro-5,10,15,20-tetrakis-(3-hydroxyphenyl)-porphyrin. Diese Verbindung ist in Beispiel 1 aufgeführt.
SPC 0038B ist die entsprechende Triazinverbindung Tetrakis-(ω-methoxypolyethylenglykol [MG = 2000]-triazin von 7,8-Dihydro-5,10,15,20-tetrakis-(3-hydroxyphenyl)-porphyrin.
m-THPC ist Temoporfin oder 7,8-Dihydro-5,10,15,20-tetrakis-(3-hydroxyphenyl)-porphyrin, die Basis von SPC 0172 und SPC 0038B.
Spektroskopische Tigenschaften von SPC 0172
SPC 0172 weist ein sehr ähnliches Absorptionsspektrum wie SPC 0038B auf, das wiederum ein ähnliches Spektrum wie m-THPC besitzt (Absorptionspeaks für m-THPC im Bereich von 500–700 nm bei 516, 542, 594 und 650 nm). 1 (Absorption A gegen Wellenlänge λ) zeigt die Absorptionsspektren im UV-sichtbaren Bereich von SPC 0172 und SPC 0038B in 0,25 μm wässriger Lösung, gemessen mit einem Hitachi U3000-Spektrophotometer. SPC 0172 weist einen etwas geringeren molaren Extinktionskoeffizienten beim roten Peak im Vergleich zu m-THPC auf (etwa 22 000 L mol^–1 cm^–1, verglichen mit etwa 30 000 L mol^–1 cm^–1).
Das Fluoreszenzemissionsspektrum in Ethanol von SPC 0172 ist sehr ähnlich mit dem Spektrum von SPC 0038B und m-THPC im gleichen Lösungsmittel. Alle drei Verbindungen zeigen einen Fluoreszenzemissionspeak zwischen 655 und 660 nm bei Anregung durch Licht im Soret-Bandbereich (405 nm). Die m-THPC-Fluoreszenz wird in wässriger Lösung aufgrund der Bildung von Aggregaten stark gedämpft. Sowohl SPC 0038B als auch SPC 0172 fluoreszieren in wässriger Lösung schwächer als in Ethanol (47 % bzw. 36 %), was zeigt, dass eine gewisse Aggregation oder eine andere Konformationsänderung stattfindet, wenn die Verbindungen in Wasser gelöst werden. Beide PEGylierten Photosensibilisatoren zeigen eine stark verbesserte Löslichkeit in Wasser (mindestens 50 mg/ml) im Vergleich zu m-THPC, das unlöslich ist.
Aufnahme durch Tumorzellen in Kultur
Colo26-kolorektale Mäusetumorzellen wurden in Kultur nach üblichen Verfahren gezüchtet. Konfluente Monoschichten der Zellen, die bei 37 °C im Dunklen gehalten wurden, wurden mit 1,5 μM m-THPC, SPC 0038B oder SPC 0172 belastet, das dem Inkubationsmedium für Zeitspannen von 3 bis 72 Stunden zugesetzt wurde. Am Ende der festgelegten Zeitspanne wurde das Kulturmedium, das den zugesetzten Photosensibilisator enthielt, entfernt und die Zellen wurden mit kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Die Zellen wurden durch Behandlung mit Trypsinlösung vom Kulturkolben abgelöst. Die Zahl der lebensfähigen Zellen wurde mit einem üblichen Hämozytometer bestimmt. Der Photosensibilisator wurde aus den Zellen durch Behandlung mit Methanol:DMSO (4:1, Vol./Vol.) extrahiert. Zellextrakte wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und für die spätere Analyse bei –70 °C aufbewahrt. Der Gehalt des Zellextrakts an Photosensibilisator wurde durch direkte Fluoreszenz unter Verwendung von Eichkurven des Photosensibilisators unter Korrektur auf den Wirkungsgrad der Extraktion aus der Zellsuspension bestimmt.
Die Aufnahme der drei Photosensibilisatoren ist in den Figuren dargestellt: 2 zeigt die Aufnahme von Temoporfin durch Tumorzellen in der Kultur; 3 zeigt die Aufnahme von SPC 0172 durch Tumorzellen in der Kultur; und 4 zeigt die Aufnahme von SPC 0038B durch Tumorzellen in der Kultur, alle bei 37 °C (Millionen Moleküle pro Zelle, m gegen die Zeit, t (Stunden)). Die Menge des Photosensibilisators wird als Anzahl der Moleküle des Photosensibilisators (in Millionen) angegeben, die in einer einzelnen Zelle zu jedem Zeitpunkt vorhanden ist. Die Daten in den 2 bis 4 geben die aus zwei Versuchen erhaltenen Mittelwerte wieder. Die Balken geben den Bereich an. Die Aufnahme von m-THPC erfolgt rasch und erreicht ein Maximum nach etwa 24 Stunden, wonach der Gehalt der Zellen an Photosensibilisator abfällt. Die Aufnahme von SPC 0038B erfolgt dagegen sehr langsam, wobei ein Anstieg der Arzneistoffkonzentration bei 72 Stunden im Vergleich zur 3-stündigen Inkubation kaum nachweisbar ist. Nach 72 Stunden ist der Gehalt der Zellen an Photosensibilisator etwa 100-fach niedriger als der von m-THPC. Die Aufnahme von SPC 0172 zeigt den gleichen langsameren Verlauf wie SPC 0038B, wobei die Aufnahme relativ linear bis zum letzten Messpunkt nach 72-stündiger Inkubation ist. Jedoch ist die Menge des aufgenommenen Photosensibilisators größer. Nach 72-stündiger Inkubation befindet sich in jeder Zelle etwa 5-mal mehr SPC 0172 als SPC 0038B, was aber wiederum wesentlich weniger als der maximale m-THPC-Gehalt in den Zellen ist.
Der Mechanismus der Photosensibilisatoraufnahme durch die Zellen bleibt zu untersuchen. Im Fall von kleinen hydrophoben Sensibilisatoren, wie m-THPC, die in biologischen Systemen allgemein den Zellen in Protein- oder Lipoprotein-gebundener Form präsentiert werden, wurde eine Rolle von speziellen Lipoprotein-Rezeptoren angenommen. Dem Aufnahmemechanismus von Photosensibilisator-PEG-Konjugaten hat man wesentlich weniger Aufmerksamkeit geschenkt, obgleich Untersuchungen mit dem Fluoreszenzmikroskop zeigen, dass die anfängliche intrazelluläre Verteilung auf begrenzte Herde im Zytoplasma in der Nähe der Plasmamembran beschränkt ist, was darauf schließen lässt, dass eine Endozytose und eine Maskierung in Vesikeln eine Rolle spielt. Ein Weg, durch den die Aufnahmemechanismen untersucht werden können, besteht in der Bestimmung des Einflusses der Temperatur. Im Allgemeinen werden aktive (energieabhängige) Aufnahmevorgänge in Zellen, die bei 4 °C gehalten werden, gehemmt, im Vergleich mit Zellen bei 37 °C. Passive (energieunabhängige) Aufnahmevorgänge sind wesentlich weniger temperaturabhängig. Der Einfluss der Temperatur auf die Aufnahme der drei Photosensibilisatoren bei 1,5 μM ist in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1 Einfluss der Temperatur auf die Photosensibilisator-Aufnahme durch Colo26-Zellen
Es ist ersichtlich, dass bei 4 °C die Aufnahme von m-THPC um einen Faktor von mehr als 250 gehemmt wird. Eine derart starke Temperaturabhängigkeit lässt darauf schließen, dass die Aufnahme dieser Verbindung durch einen aktiven, energieabhängigen Vorgang erfolgt. Die Aufnahme von SPC 0038B ist in der Kälte doppelt so hoch wie bei 37 °C, während die Aufnahme von SPC 0172 beim Abkühlen auf etwa 75 % des Werts bei 37 °C sank. Die Aufnahme der beiden PEGylierten Photosensibilisatoren blieb daher im Vergleich zum Effekt bei m-THPC von der Temperatur relativ unbeeinflusst. Dies lässt darauf schließen, dass SPC 0172 und SPC 0038B in Tumorzellen mittels eines energieunabhängigen Mechanismus aufgenommen werden. SPC 0172 wird von Tumorzellen durch diesen Mechanismus wirksamer aufgenommen als SPC 0038B.
Pharmakokinetische Eigenschaften
Eine Bestimmung der relativen pharmakokinetischen Eigenschaften wurde durch Vergleich der Plasmakonzentration-Zeit-Profile für SPC 0172, SPC 0038B und m-THPC in Mäusen mit einem subkutan implantierten Tumor durchgeführt. Erwachsene weibliche Balb/c-Mäuse mit einem subkutan implantiertem syngenen Colo26-Tumor wurden gemäß Literaturangaben bereitgestellt (Ansell et al., Lasers in Medical Science, Bd. 12 (1997), S. 336–341). Gruppen von Mäusen mit einem Gewicht von 19–22 g erhielten die Photosensibilisatoren in einer Dosis von 0,88 μmol kg^–1 (äquivalent zu 0,6 mg kg^–1 im Fall von m-THPC) durch Injektion in die Schwanzvene. Die Lösungen für die Injektion der einzelnen Verbindungen wurden in einer Konzentration von 0,352 μmol ml^–1 hergestellt, so dass typischerweise eine Maus von 20 g eine Injektion mit einem Volumen von 50 μl erhielt. Für m-THPC, das in Wasser unlöslich ist, wurde die Injektionslösung unter Verwendung eines PEG400:Ethanol:Wasser-Trägers (30:20:50, Gew./Gew.) hergestellt, während SPC 0172 und SPC 0038B in Wasser für Injektionszwecke zubereitet wurden.
Die Tiere wurden 6, 24, 72 und 192 Stunden nach der Injektion der einzelnen Photosensibilisatoren getötet. Unmittelbar nach dem Töten wurde Blut durch Herzpunktur entnommen und 3 Minuten mit 13 000 × g zentrifugiert. Der erhaltene Überstand (Blutplasma) wurde abgesaugt und für die spätere Analyse bei –70 °C aufbewahrt. Der Gehalt der einzelnen Proben an Photosensibilisator wurde aufgrund der Fluoreszenz eines unter Verwendung von Methanol:DMSO (3:5, Vol./Vol.) erhaltenen Extrakts gemessen. Eine 50 μl-Portion der einzelnen Extrakte wurde in eine Einweg-Fluoreszenzküvette gebracht. Die Fluoreszenz wurde unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 418 nm und einer Emissionswellenlänge von 650 nm unter Einstellung einer Reaktionszeit von 8 Sekunden bestimmt. Der Test wurde unter Verwendung von Vorratslösungen der einzelnen Verbindungen in Methanol unter weiterer Verdünnung in Methanol:Wasser (1:1, Vol./Vol.) und unter Extraktion mit Methanol:DMSO gemäß den vorstehenden Angaben kalibriert. Für die einzelnen Photosensibilisatoren ergab sich eine lineare Fluoreszenzausbeute bis zu einer Probenkonzentration von 200 nmol pro ml. Das Messverfahren war so konzipiert, dass die einzelnen Proben in ausreichendem Maße verdünnt wurden, um eine Störung durch endogene Chromophore zu vermeiden (Absorption der Proben <<0,1 bei der Anregungswellenlänge). Die erzielten Ergebnisse sind in 5 (Nanomol pro ml, n gegen die Zeit, t (Stunden)) als Plasmakonzentrationen des Photosensibilisators nach Injektion von 0,88 Nanomol der einzelnen Photosensibilisatoren pro g Lebendgewicht dargestellt.
Die Daten zeigen, dass sich bei diesen Mäusen höhere Plasmakonzentrationen an SPC 0038B ergeben, verglichen mit m-THPC oder SPC 0172, bei intravenöser Verabreichung von äquimolaren Dosen. Ferner ist ersichtlich, dass die Plasmakonzentrationen sowohl von m-THPC als auch von SPC 0172 sich rascher als die von SPC 0038B auf Hintergrundwerte verringern. Tatsächlich bleibt SPC 0038B länger bestehen und weist eine längere terminale Beseitigungsphase aus dem Plasma auf, verglichen mit SPC 0172 oder m-THPC. Die Daten zeigen einen grundlegenden Unterschied im Plasmakonzentrations-Zeit-Profil für beide PEGylierten Photosensibilisatoren, wobei SPC 0172 niedrigere absolute Konzentrationen und eine raschere Beseitigung zeigt.
Andere Gewebe wurden den Mäusen zu den gleichen Zeitpunkten wie die Blutproben entnommen und einem ähnlichen Extraktions- und Fluoreszenzanalyse-Verfahren unterzogen, um die Photosensibilisator-Konzentrationen zu bestimmen. Die Konzentrationen in der Leber ergaben für die drei Photosensibilisatoren die gleichen Trends wie in Plasma. 6 (Nanomol pro g Feuchtgewicht, w, gegen die Zeit, t (Stunden)) zeigt die Photosensibilisator-Konzentrationen in der Leber nach einer Injektion von 0,88 nmol der einzelnen Photosensibilisatoren pro g Lebendgewicht. Erneut waren die Leberwerte für SPC 0038B höher und hielten länger an, während die Werte für SPC 0172 niedriger waren und eine raschere Beseitigung erfolgte.
Die Werte in der Haut sind in 7 dargestellt (Nanomol pro g Feuchtgewicht, w, gegen die Zeit, t (Stunden)). Es sind die Photosensibilisator-Konzentrationen im Anschluss an eine Injektion von 0,88 nmol der einzelnen Photosensibilisatoren pro g Lebendgewicht dargestellt. Es ergaben sich relativ hohe Konzentrationen an m-THPC in der Haut 24 Stunden nach der Verabreichung, wobei ab einem Zeitpunkt von 72 Stunden ein Abfall auf niedrigere Werte erfolgte. Die SPC 0172-Konzentrationen in der Haut waren während der gesamten Messdauer von 6 bis 192 Stunden nieder, was auf ein geringeres Potential zur Verursachung einer kutanen Photosensibilität schließen ließ. Die Konzentrationen von SPC 0038B in der Haut waren im Zeitraum von 72 bis 192 Stunden höher als die von SPC 0172 oder m-THPC, was auf ein höheres Potential zur Verursachung einer kutanen Photosensibilität während dieses Zeitraums schließen ließ.
Ferner wurde in dieser Arbeit die Selektvität für eine tumorspezifische Gewebeverteilung bewertet. Die Gewebeselektivität wurde als Tumor:Muskel-Konzentrationsverhältnis während der Dauer der Beobachtungsperiode (4 bis 192 Stunden nach der Verabreichung) bewertet. Dieses Verhältnis ergab ein direktes Maß der Konzentrationsdifferenzen in normalem Gewebe zu Tumorgewebe und ermöglicht die Auswahl einer optimalen Behandlungszeit für PDT, die das Potential zur Verursachung von Kolateralschäden an normalem Gewebe auf ein Minimum beschränkt. Die erzielten Ergebnisse sind in 8 dargestellt (Tumor:Muskel-Verhältnis, r, gegen die Zeit, t (Stunden)). Dargestellt ist das Tumor:Muskel-Konzentrationsverhältnis der drei Photosensibilisatoren.
Die Ergebnisse zeigen, dass sich ein optimales Tumor:Muskel-Konzentrationsverhältnis für SPC 0172 und somit für die Tumor-PDT 72 Stunden nach der Verabreichung ergibt. Der Verhältniswert von etwa 7,5 für SPC 0172 war ähnlich dem für SPC 0038B zum gleichen Zeitpunkt erhaltenen Wert und 2- bis 3-fach höher als der für m-THPC festgestellte Wert. Beide PEGylierten Photosensibilisatoren weisen daher im Vergleich zu m-THPC ein verbessertes Abzielverhalten auf den Tumor auf. Im Vergleich zu SPC 0172 fällt das günstige Tumor:Muskel-Verhältnis für SPC 0038B im Zeitraum nach 72 Stunden nicht ebenso rasch ab, was auf ein breiteres Fenster für Tumor-PDT schließen lässt, jedoch auch ein weniger attraktives Merkmal einer anhaltenden PDT-Bioaktivität im Zielgewebe ist. SPC 0172 weist von diesen beiden PEGylierten Photosensibilisatoren das geeignetste Profil für eine Tumor-PDT auf, wobei ein einziges Optimum nach 72 Stunden und niedrige Hautwerte auf ein vermindertes Potential zur Verursachung einer kutanen Photosensibilität schließen lassen.
Eine veröffentlichte Arbeit (Grahn et al., Proc. SPIE, Bd. 3191 (1997), S. 180–186) mit SPC 0038B in diesem Modell unterstützt die Beobachtung, dass dieser Photosensibilisator langsamer als m-THPC beseitigt wird. Diese Arbeit zeigte ferner, dass die im Muskel gemessenen Konzentrationen von SPC 0038B 72 Stunden nach der Injektion oder vorher ein Maximum erreichten, während die Konzentrationen im Tumor ihr Maximum im Zeitraum von 72 bis 144 Stunden erreichten und anschließend abfielen. Ein optimaler Arzneistoff-Licht-Behandlungsintervall für Tumor-PDT-spezifische Gewebenekrose später als 72 Stunden nach der Verabreichung war daher indiziert. Verbundene Messungen der Tumor-Bioaktivität ergaben, dass eine Langzeit-PDT-Tumornekrose bei SPC 0038B für PDT-Behandlungszeiten von 4 bis 15 Tagen erfolgte. Dieser Bericht bestätigt ferner das Fortbestehen von Leberkonzentrationen von SPC 0038B. Diese Daten zeigen auch eine Erscheinung von fortbestehenden Tumorwerten und ein anhaltendes Potential für PDT-vermittelte Tumornekrose bei SPC 0038B, was für ein ideales PDT-Mittel suboptimale Eigenschaften darstellt.
Kutane Photosensibilität
Die kutane Photosensibilität wurde in erwachsenen weiblichen Balb/c-Mäusen bestimmt, die unter üblichen Bedingungen gehalten wurden und nach Belieben Zugang zu Futter und Wasser hatten. Gruppen von Mäusen mit einem Gewicht von 19 bis 22 g erhielten die Photosensibilisatoren in einer Dosis von 0,88 μmol kg^–1 durch Injektion in die Schwanzvene. Die Lösungen für die Injektion der einzelnen Verbindungen wurden in einer Konzentration von 0,352 μmol ml^–1 hergestellt, so dass eine typische Maus von 20 g eine Injektion in einem Volumen von 50 μl erhielt. Die einzelnen Mäuse wurden unmittelbar vor der Injektion gewogen. Das injizierte Volumen wurde zur Erzielung der richtigen Dosis angepasst. Für m-THPC wurde die Injektionslösung unter Verwendung des üblichen PEG400:Ethanol:Wasser-Trägers zubereitet, während SPC 0172 und SPC 0038B in Wasser für Injektionszwecke zubereitet wurden.
24 oder 72 Stunden nach Injektion des Photosensibilisators wurde ein Ohr jeder Maus mit Vollspektrum-Xenonlicht aus einem klinischen 1 KW-Photobestrahlungsgerät (Modell UV-90, Applied Photophysics, London) bestrahlt. Das Licht wurde unter Verwendung eines Lichtleiters (Serial SU3) mit einem Durchmesser von 7 mm, der leicht am Ohr befestigt war, auf das Ohr geleitet. Die abgegebene Lichtdosis betrug 40 Joules pro cm², was durch eine Belichtung des Ohrs für 63 Sekunden mit 245 mW Licht aus dem Lichtleiter mit einer Kontaktfläche von 0,384 cm² erreicht wurde. Der Lichtleiter filterte IR- und UV-Licht heraus, um die Erwärmung des Ohrs und eine Schädigung durch UV-Bestrahlung auf ein Minimum zu beschränken.
Tiere, die mit Licht in den 24- oder 72-stündigen Arzneistoff-Licht-Intervallen behandelt worden waren, wurden 48 oder 24 Stunden nach der Bestrahlung der Ohren getötet. Das Ödem der bestrahlten Ohren und der Kontrollohren wurde durch Messung der Ohrdicke bestimmt. Die Dicke des Ohrs wurde an drei Seiten im oberen Drittel des Ohrs unter Verwendung eines mit einer fixierten Kraft eingestellten Mikrometers mit einer Vernier-interpolierten Auflösung von 2 μm und einer Genauigkeit von 10 μm (Neill-Instruments) gemessen.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Ohrschwellung oder Ohrdicke, als Ersatz-Endpunkt für die kutane Photosensibilität, bei SPC 0172 geringer als bei SPC 0038B oder m-THPC ist, und zwar im Anschluss an eine Bestrahlung mit Licht zu einem Zeitpunkt von 24 Stunden oder 72 Stunden nach der Verabreichung des Photosensibilisators (Tabelle 2). SPC 0038B erwies sich gegenüber m-THPC als überlegen, da es beim 24 Stunden-Arzneistoff-Licht-Intervall eine geringere Photosensibilität verursachte, diese Differenz jedoch durch den 72-Stunden Arzneistoff-Licht-Intervall beseitigt und sogar umgekehrt wurde. Diese Beobachtungen stimmen mit den Tendenzen der Hautkonzentrationen dieser Photosensibilisatoren, die früher festgestellt wurden, überein. Somit lässt sich feststellen, dass SPC 0172 gegenüber SPC 0038B oder m-THPC in Bezug auf das Potential zur Verursachung einer kutanen Photosensibilität überlegen ist.
Tabelle 2 Differenzen der Ohrdicke (Bestrahlung/Kontrolle) in μm für Mäuse bei Injektion von 0,88 μmol kg^–1 der Photoseasibilisatoren 24 oder 72 Stunden vor der Bestrahlung mit Licht
Tumor-PDT-Aktivität
Informationen über die Tumor-PDT-Aktivität wurde im vorerwähnten Modell mit Mäusen, denen der syngene Colo26-Tumor subkutan oben am linken Hinterbein (etwa 1 cm lateral vom Rückgrat) implantiert worden war, erhalten. Die Tumore wurden nach 12 bis 16 Tagen herangezogen, nachdem sie einen durchschnittlichen Durchmesser von 8 bis 10 mm erreicht hatten. Für die Arzneistoffinjektion und die Bestrahlung wurden die Tiere mit Hypnorm in Verdünnung mit Wasser (1:3) sediert.
SPC 0172 ergab eine Tumornekrose am Tag 1 nach der Arzneistoffinjektion mit einem erhöhten Ausmaß 2 Tage nach der Injektion (Tabelle 3). Die beobachtete Wirkung an 2 Tagen nach der Injektion umfasste eine vollständige Tumornekrose, eine gleichwertige Wirkung zur Wirkung von m-THPC bei der halben Dosis im gleichen Zeitraum. Die Prüfung der mit SPC 0172 behandelten Stellen ließ darauf schließen, dass die Tumornekrose nur von einer beschränkten Schädigung der umgebenden Haut und des darunter liegenden Muskels begleitet war, insbesondere im 2 Tage-Arzneistoff-Licht-Intervall.
Weitere Experimente unter Verwendung der gleichen Dosis an SPC 0172 und einer Lichtdosis von 20 Jcm^–2 wurden in einem Bereich von Arzneistoff-Licht-Intervallen durchgeführt. Eine Schädigung des Tumors in voller Dicke wurde bei sämtlichen Arzneistoff-Licht-Intervallen bis zu 72 Stunden beobachtet.
Vergleichsdaten mit SPC 0038B bei dessen optimalem Arzneistoff-Licht-Intervall von 72 Stunden zeigen in diesem Modell eine 10- bis 20-fach geringere Wirkungsstärke in Bezug auf das Dosisniveau und den Grad der Tumornekrose im Vergleich zu SPC 0172 und m-THPC.
Die Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die in-vivo-Wirkungsstärke von SPC 0172 als Tumor-PDT-Mittel ähnlich wie die von m-THPC bei dessen optimaler Dosis (0,88 μmol kg^–1) ist, während SPC 0038B eine etwas geringere Wirkungsstärke aufweist.
Tabelle 3 In der Maus durch die drei Photosensibilisatoren induzierte Tumornekrose beim Mäusemodell mit implantiertem kolorektalem Tumor
Schlussfolgerung
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass PEGylierte Photosensibilisatoren im Vergleich zu dem Ausgangsphotosensibilisator m-THPC eine verbesserte Wasserlöslichkeit aufweisen, was sie für eine parenterale Verabreichung pharmazeutisch verträglicher macht. Sie werden von Tumorzellen im Vergleich zu m-THPC in einem unterschiedlichen, energieunabhängigen Mechanismus aufgenommen, wobei SPC 0172 wirksamer als SPC 0038B ist. Eine im Vergleich zu m-THPC verbesserte Zielerfassung des Tumors wurde durch diese PEGylierten Moleküle erreicht, wobei SPC 0172 ein im Vergleich zu SPC 0038B überlegenes pharmakokinetisches Profil zeigte: maximales Tumor:Normalgewebe-Verhältnis innerhalb von 72 Stunden nach der Verabreichung und raschere Beseitigung aus Geweben und Plasma. Ein geringeres Potential zur Verursachung einer photokutanen Photosensibilität ergab sich für SPC 0172 im Vergleich zu SPC 0038B oder m-THPC. Die Wirkungsstärke für SPC 0172 bezüglich einer Tumornekrose unter folgender PDT war ähnlich wie bei m-THPC, während SPC 0038B weniger aktiv war. Es ist daher offensichtlich, dass mit Carbamat verknüpfte PEGylierte Photosensibilisatoren, wie SPC 0172, idealere Tumor-PDT-Mittel als mit Triazin verknüpfte PEGylierte Photosensibilisatoren, wie SPC 0038B, darstellen und im Vergleich zu m-THPC verbesserte Merkmale aufweisen.

Claims

Tetrakis(hydroxyphenyl)-chlorin, Bacteriochlorin oder Isobacteriochlorin, derivatisiert an einer oder mehreren der Hydroxylgruppen durch Additionsreaktion mit einem Diisocyanat, Diisothiocyanat oder Isocyanat-Isothiocyanat an einer Isocyanat- oder Isothiocyanatgruppe davon, wobei die andere Isocyanat- oder Isothiocyanatgruppe selbst derivatisiert ist, und zwar durch eine Additionsreaktion mit der Hydroxylgruppe eines C_1-12-ω-alkylierten oder -acylierten Poly-(alkylenoxids) oder an eine Hydroxylgruppe eines Verknüpfungsrestes, der selbst einen Rest eines solchen Poly-(alkylenoxids) trägt.
Tetrakis(hydroxyphenyl)-chlorin, Bacteriochlorin oder Isobacteriochlorin der Formel (12), (13) oder (14) oder ein Iminotautomer hiervon gemäß Anspruch 1
worin n eine Zahl von 1 bis 3 bedeutet sowie die Substituenten R¹ gleich oder verschieden sind und jeweils eine Hydroxylgruppe (OH-Gruppe) darstellen können, die selbst frei oder durch einen C₁- bis C₁₂-Alkyl oder -Acylrest substituiert sein kann, jedoch in mindestens einem Fall die Formel (15)
aufweist, worin (i) die Reste X gleich oder verschieden sind und ein O oder S bedeuten, (ii) Y ein O darstellt (eine Carbamat- oder Thiocarbamatverknüpfung), (iii) A einen Kohlenwasserstoffrest mit 2 bis 40 Kohlenstoffatomen bedeutet (dieser Rest kann verzweigt oder unverzweigt, cyclisch oder acyclisch, gesättigt oder ungesättigt, aliphatisch oder aromatisch sein), (iv) B einen fakultativen Rest ((CH₂)_P – O)_q darstellt, worin p eine Zahl von 1 bis 4 und q die Zahl 0 oder 1 bedeuten, (v) D ein Poly-(alkylenoxid) mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von mindestens 200 und nicht mehr als 40.000 darstellt, (vi) E einen Alkyl- oder Acylrest mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen bedeutet, und irgendein pharmazeutisch annehmbares Derivat eines solchen Chlorins, Bacteriochlorins oder Isobacteriochlorins als Salz einer Mineralsäure oder einer anderen Säure oder als ein Metallkomplex oder ein Hydrat oder ein anderes Solvat.
Verbindung nach Anspruch 2, worin die Reste R¹ in mehr als einem Fall die Formel (15) aufweisen.
Verbindung nach Anspruch 2 oder 3, worin A 4 bis 20 Kohlenstoffatome enthält.
Verbindung nach Anspruch 2, 3 oder 4, worin A 6 Kohlenstoffatome enthält.
Verbindung nach einem der Ansprüche 2 bis 5, worin D ein Polyethylenglykol ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 2 bis 6, worin D ein Durchschnittsmolekulargewicht von 750 bis 20.000 Da aufweist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 2 bis 7, worin D ein Durchschnittsmolekulargewicht von 2.000 bis 5.000 Da aufweist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 2 bis 8, worin E eine Methylgruppe ist.
7,8-Dihydro-5,10,15,20-tetrakis(3-hydroxyphenyl)-porphyrin, derivatisiert mit ω-Methoxypolyethylenglykol (Durchschnittsmolekulargewicht = 2000) über Biscarbamatverknüpfungen, abgeleitet von Hexan-1,6-diisocyanat; 7,8,17,18-Tetrahydro-5,10,15,20-tetrakis (3-hydroxyphenyl)-porphyrin, derivatisiert mit ω-Methoxypoly-(ethylenglykol) (Durchschnittsmolekulargewicht = 2000) über Biscarbamatverknüpfungen, abgeleitet von Hexan-1,6-diisocyanat; 7,8-Dihydro-5,10,15,20-tetrakis(3-hydroxyphenyl)-porphyrin, derivatisiert mit ω-Methoxypoly-(ethylenglykol) (Durchschnittsmolekulargewicht = 5000) über Biscarbamatverknüpfungen, abgeleitet von Hexan-1,6-diisocyanat; 7,8,17,18-Tetrahydro-5,10,15,20-tetrakis(3-hydroxyphenyl)-porphyrin, derivatisiert mit ω-Methoxypoly-(ethylenglykol) (Durchschnittsmolekulargewicht = 5000) über Biscarbamatverknüpfungen, abgeleitet von Hexan-1,6-diisocyanat.
Verwendung eines Chlorins, Bacteriochlorins, Isobacteriochlorins oder irgendeiner anderen pharmazeutisch annehmbaren Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung eines Arzneimittels für die photodynamische Therapie eines Krebstumors oder einer anderen Gewebeerkrankung.
Verwendung der Verbindungen nach Anspruch 10 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Barrett-Ösophagus, altersbezogener makulärer Degeneration, Keratinose, diabetischer Neuropathie, einer peripheren Gefäßerkrankung, einer Koronararterienerkrankung und von Erkrankungen, die von bakteriellen oder viralen Infektionen ausgelöst werden.