CN102249940B - 脂水两亲性亚苄基环戊酮染料及其合成方法与在双光子光动力治疗中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一类脂水两亲性亚苄基环戊酮染料及其合成方法与在双光子光动力治疗中的用途。本发明提供一种通式(I)化合物，其中R₁为-(C₂H₄O)_m-R₅基团；R₂、R₃、R₄的定义同说明书中定义。本发明的通式(I)化合物结构简单、分子量小，具有确定的化学结构，具有脂水双亲的特点，易于制备、纯化和进一步修饰，满足临床用药的基本要求。本发明的脂水两亲性的亚苄基环戊酮染料在700～1000nm波段范围的超快激光照射下都具有较大的双光子吸收，都能产生单线态氧和超氧负离子等活性氧物种，杀死肿瘤细胞、病变细胞、细菌等生物体，在双光子光动力治疗中具有很好的应用前景。

Description

脂水两亲性亚苄基环戊酮染料及其合成方法与在双光子光动力治疗中的用途

技术领域

本发明属于光动力治疗领域，特别是涉及一类两亲性亚苄基环戊酮染料、其合成方法、以及其在双光子光动力治疗中的用途。 

技术背景

目前国内外报道的用于光动力治疗的光敏剂主要有血卟啉衍生物、氨基乙酰基丙酸、二氢卟吩、金属酞菁、苯并卟啉衍生物等这些光敏剂的工作波长主要集中在630～700nm波段，采用单光子吸收工作原理，对人体组织的光动力杀伤深度一般只有几毫米，因而在临床上的应用范围有限。现有的光动力治疗技术主要适用于皮肤或官腔内壁表浅肿瘤的治疗，而对于组织深部的肿瘤还难以发挥很好的疗效。同时，由于大光斑照射对所有吸收了染料的细胞都起作用，治疗过程中不能避免对肿瘤组织周围正常细胞的损伤。 

双光子光动力治疗技术是近年来新兴的一种光动力治疗技术，它的主要工作光波长集中在生物组织光学窗口，即700～300nm，具有对生物组织穿透性好、空间选择性高、损伤小等特点，能够大幅度提高光动力杀伤深度。同时，双光子吸收过程只能发生在激光焦点处，可以实现对单个细胞的选择性杀伤，因而能更有目的的准确选择需要消除的病变细胞，最大限度的降低对周围正常细胞的伤害。 

由于传统光动力治疗用血卟啉类衍生物的双光子吸收截面很小，例如光卟啉，即Photofrin，在850nm波长处的双光子吸收截面只有7.4GM，参见AliaksandrKarotki等人的题为“Simultaneous two-photon excitation of photofrin in relation tophotodynamic therapy”，Photochem.Photobiol.，2006，vol.82，pp443-452的文章，限制了双光子技术的直接应用，因而如何提高现有光疗染料的双光子吸收截面或者制备出新的具有大双光子吸收截面的光疗染料是双光子光动力学治疗能够有效实施需要解决的问题。目前文献报道的双光子光疗染料普遍存在分子结构复杂、合成难度大的问题，将来走向实用化的可能性很小。因而研究开发既具有大双光子吸收截面又具有高光动力活性、化学性质纯、生物毒性低、生产工艺简单、价格相对低廉的光疗染料已成为发展双光子光动力治疗技术急需解决的问题。 

现有技术已经公开了一系列的亚苄基环戊酮染料，例如中国专利申请公开号CN1635029A；CN1634909A；以及武杰等人的题为“Two-photon absorptionproperty and photopolymerization sensitizing efficiency of asymmetricalbenzylidene cyclopentanone dyes”，Dyes and Pigments，2008，vol.76，pp690-695；薛建强等人的题为“Novel benzylidene cyclopentanone dyes for two-photonphotopolymerization”，J.Photochem.Photobiol.A：Chem.，2008，vol.195，pp261-266等文章。这些染料具有分子结构简单、容易合成、双光子吸收截面大、活性氧量子产率高的特点，在双光子光动力治疗领域具有很大的应用潜力。然而，这些染料的水溶性很差，不能直接应用于双光子光动力治疗。因此，需要对已知的亚苄基环戊酮染料进行化学修饰使其具有一定的水溶性并使其具有合理的脂水分配比。 

发明内容

本发明的一个目的在于提供一类脂水两亲性的亚苄基环戊酮染料，该类染料具有分子结构简单、合成容易的特点。 

本发明的另一目的在于提供一类脂水双亲，并且其脂水分配比能够满足临床光动力治疗使用要求的亚苄基环戊酮染料。 

本发明的再一目的在于提供一种脂水两亲性的亚苄基环戊酮染料的合成方法，该方法具有操作简单、可以放量合成，产品产率高、纯度高的特点。 

本发明的又一目的在于提供一种脂水两亲性的亚苄基环戊酮染料的用途，该类染料在700～1000nm波长光照下具有大的双光子吸收截面，高的活性氧量子产率，能用于双光子光动力治疗。 

本发明提供一种通式(I)的化合物： 

其中：R₁为-(C₂H₄O)_m-R₅基团； 

R₂为甲基、乙基、或-(C₂H₄O)_n-R₆基团； 

R₃为甲基、乙基、或-(C₂H₄O)_p-R₇基团； 

R₄为甲基、乙基、或-(C₂H₄O)_q-R₈基团； 

R₁、R₂、R₃和R₄可以是相同或不同的取代基团； 

所述的-(C₂H₄O)_m-R₅基团中m＝3，4，5，6，7或8，优选3或4；R₅为甲基、乙基、丙基或异丙基，优选甲基； 

所述的-(C₂H₄O)_n-R₆基团中n＝3，4，5，6，7或8，优选3或4；R₆为甲基、乙基、丙基或异丙基，优选甲基； 

所述的-(C₂H₄O)_p-R₇基团中p＝3，4，5，6，7或8，优选3或4；R₇为甲基、乙基、丙基或异丙基，优选甲基； 

所述的-(C₂H₄O)_q-R₈基团中q＝3，4，5，6，7或8，优选3或4；R₈为甲基、乙基、丙基或异丙基，优选甲基。 

本发明提供一种脂水两亲性的亚苄基环戊酮染料的合成方法，包括以下步骤： 

(1)带有聚乙二醇PEG基团的对甲苯磺酸脂A的合成，反应方程式如下： 

其中：x＝2，3，4，5，6或7，优选2或3；R₉为甲基、乙基、丙基或异丙基，优选甲基。 

具体步骤： 

参照文献，即Arthur Snow等人的题为“Conversion of alcohols to thiols viatosylate intermediates”，Synthesis，2003，vol.4，pp509-512文章中的合成方法，向三口反应器中加入一定量的NaOH和质量为其5～20倍的水，搅拌均匀。然后，按PEG与NaOH摩尔比1∶1～5的比例向上述NaOH水溶液中加入PEG和体积为PEG体积1～10倍的四氢呋喃混合溶液。用冰浴控温，在0～5℃下搅拌半小时并通氮气以充分除氧后，将摩尔量是PEG量0.5～1倍的对甲苯磺酰氯溶于体积为PEG体积1～5倍的四氢呋喃中，将该四氢呋喃溶液缓慢滴加到上述已加入了PEG、四氢呋喃和NaOH水溶液的三口反应容器中。在0～10℃下反应2～6小时后，撤去冰浴，室温下继续反应4～12小时。反应液用乙醚萃取，乙醚萃取液用水涤至中性，经干燥、过滤、旋蒸除去乙醚得到相应的连接有PEG基团的对甲苯磺酸酯A，备用。 

其中，上述干燥操作中用到的干燥剂为无水硫酸钠、无水硫酸镁、无水氯化钙中的一种或几种的组合。 

(2)带有PEG基团的苯甲醛衍生物E的合成，反应方程式： 

其中：R₁₀为甲基或乙基； 

R₁为-(C₂H₄O)_m-R₅基团； 

R₂为甲基、乙基、或-(C₂H₄O)_n-R₆基团； 

R₁和R₂可以是相同或不同的取代基团； 

所述的-(C₂H₄O)_m-R₅基团中m＝3，4，5，6，7或8，优选3或4；R₅为甲基、乙基、丙基或异丙基，优选甲基； 

所述的-(C₂H₄O)_n-R₆基团中n＝3，4，5，6，7或8，优选3或4；R₆为甲基、乙基、丙基或异丙基，优选甲基； 

具体步骤： 

(i)参照文献，即Thomas Bouder等人的题为“Synthesis and coordinationstudies of new mono-and di-hydroxy functionalized4，4’-dialkeny1-2，2’-bipyridines”，Tetrahedron letters，1998，vol.39，pp6869-6872文章中的合成方法，向一个三口反应器中加入摩尔比为1∶2～5的N，N-二羟乙基苯胺和乙酸酐(Ac₂O)，混合均匀后再加入摩尔量是N，N-二羟乙基苯胺2～5倍的吡啶。将上述混合液在N₂气氛下加热回流2～10小时，冷却，旋蒸除去低沸点物质乙酸酐和吡啶，减压蒸馏收集188～190℃/0.1MP馏分，得到金黄色油状液体，即中间产物B。 

(ii)向三口烧瓶中加入一定量的中间产物B和质量为其2～5倍的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，搅拌使其溶解均匀。将摩尔量是中间产物B的1～2倍的三氯氧磷(POCl₃)于0～5℃滴加到质量是POCl₃的2～10倍的DMF中，搅拌反应1～10小时后，将其缓慢滴加到上述三口烧瓶中，滴加完毕后，将反应温度升至50～150℃并搅拌反应2～10小时，冷却后倾入Na₂CO₃摩尔量是POCl₃ 的5～20倍、浓度为0.5～2mol/L的Na₂CO₃冰水溶液中，搅拌12～48小时，过滤收集固体产品得淡黄色固体，即中间产物C。 

(iii)参照文献，即Matthew Davis等人的题为“Solvent-free claisencondensation of isophorone and verbenone withpara-hydroxyethylaminobenzaldehydes”，Synthetic Communications，2007，vol.37，pp921-926文章中的合成方法，将上述中间产物C溶于质量为其1～5倍的甲醇中，在搅拌下加入NaOH的摩尔量是中间产物C的2～5倍、浓度为5～20mol/L的NaOH水溶液，持续搅拌2～10小时，停止反应，将反应液旋蒸除去甲醇，用二氯甲烷萃取水相，得到的二氯甲烷萃取液用水洗涤至中性，经干燥、过滤、旋蒸除去二氯甲烷得到黄色油状液体4-(N，N-二(2-羟基-乙基)氨基)苯甲醛。 

其中，上述干燥操作中用到的干燥剂为无水硫酸钠、无水硫酸镁、无水氯化钙中的一种或几种的组合。 

(iv)参照文献，即Christian B.Nielsen等人的题为“Synthesis andcharacterization of water-soluble phenylene-vinylene-based singlet oxygensensitizers for two-photon excitation”，The Journal of Organice Chemistry，2005，vol.70，pp7065-7079文章中的合成方法，将4-(N，N-二(2-羟基-乙基)氨基)苯甲醛或商业可得的化合物D，即4-(N-甲基-N-(2-羟基-乙基)氨基)苯甲醛或4-(N-乙基-N-(2-羟基-乙基)氨基)苯甲醛，溶于质量为其10～30倍的经过干燥重蒸的四氢呋喃(THF)中，然后缓缓加入摩尔量是上述苯甲醛衍生物1～5倍的氢氧化钾和质量为上述苯甲醛衍生物10～30倍的经过干燥重蒸的THF混合而成的溶液中，反应混合液在N₂气氛下搅拌半小时后，加热回流1～5小时，得到中间反应液。将摩尔量是上述苯甲醛衍生物1～5倍的中间产物A缓慢滴加入上述中间反应液中，继续加热回流12～48小时，冷却，将最终反应液用酸中和至中性，用二氯甲烷萃取，经干燥、过滤、旋蒸除去二氯甲烷后得到粗产品，用色谱柱分离提纯得到黄色油状液体，即带有PEG基团的苯甲醛衍生物E。 

其中，上述中和操作中用到的酸为浓度为1mol/L以下的稀盐酸或稀硫酸；上述干燥操作中用到的干燥剂为无水硫酸钠、无水硫酸镁、无水氯化钙中的一种或几种的组合。 

(3)带有PEG基团的脂水两亲性染料H的合成，反应方程式： 

其中：R₁₁为甲基或乙基； 

R₁₂为甲基或乙基； 

优选R₁₁和R₁₂为相同的取代基； 

R₁选自-(C₂H₄O)_m-R₅基团； 

R₂选自甲基、乙基、或-(C₂H₄O)_n-R₆基团； 

R₃选自甲基、乙基、或-(C₂H₄O)_p-R₇基团； 

R₄选自甲基、乙基、或-(C₂H₄O)_q-R₈基团； 

R₁、R₂、R₃和R₄可以是相同或不同的取代基团； 

所述的-(C₂H₄O)_m-R₅基团中m＝3，4，5，6，7或8，优选3或4；R₅选自甲基、乙基、丙基或异丙基； 

所述的-(C₂H₄O)_n-R₆基团中n＝3，4，5，6，7或8，优选3或4；R₆选自基、乙基、丙基或异丙基； 

所述的-(C₂H₄O)_p-R₇基团中p＝3，4，5，6，7或8，优选3或4；R₇选自甲基、乙基、丙基或异丙基； 

所述的-(C₂H₄O)_q-R₈基团中q＝3，4，5，6，7或8，优选3或4；R₈选自甲基、乙基、丙基或异丙基。 

(i)将环戊酮和带有PEG基团的苯甲醛衍生物E或化合物F，例如商业可得的4-(N，N-二甲氨基)苯甲醛或4-(N，N-二乙氨基)苯甲醛，按照摩尔比是1∶1～2的比例加入反应容器，然后加入质量是E或F的10～30倍的乙醇-水溶液(其中乙醇的体积百分含量为20％～80％)，再加入摩尔量是E或F的0.01～0.4倍的碱性催化剂，在0℃条件下反应2～10小时，撤去冰浴，室温条件下反应1～5小时，经过过滤或旋蒸除去溶剂得到粗产品，用色谱柱分离提纯得到中间产物G。 

(ii)将上述中间产物G和带有PEG基团的苯甲醛衍生物E按照摩尔比是1∶1～2的比例加入反应容器，然后加入质量是E的10～30倍的乙醇溶剂，再加入摩尔量是E的摩尔量0.01～0.4倍的碱性催化剂，在25～80℃条件下反应5～40个小时，经过旋蒸除去溶剂得到粗产品，用色谱柱分离提纯得到本发明的目标染料H。 

(iii)将环戊酮和带有PEG基团的苯甲醛衍生物E按照摩尔比是1∶2～5的比例加入反应容器，然后加入质量是E的10～30倍的乙醇溶剂，再加入摩尔量是E的摩尔量0.01～0.4倍的碱性催化剂，在25～80℃条件下反应5～40个小时，经过旋蒸除去溶剂得到粗产品，用色谱柱分离提纯得到本发明的目标染料H。 

上述碱性催化剂可以是氢氧化钠、氢氧化钾、无水碳酸钠、无水碳酸钾、六氢吡啶中的一种或它们中任意两种以上的混合物。 

本发明的脂水两亲性的亚苄基环戊酮染料都具有脂水双亲的性质，随着PEG基团数量的增加以及链长的增长，染料的亲水性增加。 

本发明的脂水两亲性的亚苄基环戊酮染料在700～1000nm波长范围都具有较强的双光子吸收，其双光子吸收截面的测量是用美国光谱物理公司的锁模掺钛蓝宝石飞秒激光系统(Tsunami mode-locked Ti：Sapphire，重频80MHz，脉宽＜130fs)和掺钛蓝宝石再生放大系统(Spitfire F-1K，重频1000Hz，脉宽＜200fs)加OPA作为光源，用双光子激发荧光法测量。 

本发明的脂水两亲性的亚苄基环戊酮染料在700～1000nm波长范围的超快激光，例如使用美国光谱物理公司的锁模掺钛蓝宝石飞秒激光系统(Tsunamimode-locked Ti：Sapphire，重频80MHZ，脉宽＜130fs)产生的激光，照射下都能产生单线态氧和超氧负离子。细胞试验证明这些染料具有低的暗毒性和高的光动力活性，特别是双光子光动力活性，在制备双光子光动力药物方面具有很好的应用前景。 

本发明具有如下特点： 

1.本发明中的脂水两亲性亚苄基环戊酮染料结构简单、分子量小，具有确定的化学结构，易于制备、纯化和进一步修饰，满足临床用药的基本要求。 

2.本发明中的脂水两亲性亚苄基环戊酮染料具有脂水双亲的特点，并且其脂水分配比能够满足临床光动力治疗的使用要求。 

3.本发明中脂水两亲性的亚苄基环戊酮染料的合成方法具有操作简单、产品产率高、纯度高的特点，可以放量合成。 

4.本发明中的脂水两亲性的亚苄基环戊酮染料在700～1000nm波长范围具有较高的生物光动力活性，在制备双光子光动力药物方面具有很好的应用前 景。 

附图说明

图1示出通过ESR检测到的实施例1中染料在二甲基亚砜中产生的单线态氧信号。 

图2示出通过ESR检测到的实施例1中染料在二甲基亚砜中产生的超氧负离子自由基信号。 

图3示出通过红外光纤光谱仪探测到的实施例1中染料在800nm超快激光照射下于正辛醇中产生的单线态氧磷光发射光谱。 

图4示出实施例1中染料在溶剂中的双光子荧光激发谱，其中四方点(■)为用锁模掺钛蓝宝石飞秒激光系统(Tsunami mode-locked Ti：Sapphire，重频80MHz，脉宽＜130fs)测试得到的数据，圆点(●)为用掺钛蓝宝石再生放大系统(Spitfire F-1K，重频1000Hz，脉宽＜200fs)测试得到的数据。 

图5示出经实施例1中染料孵育的肿瘤细胞在800nm超快激光照射前后的状态。 

图6示出经实施例2中染料孵育的肿瘤细胞在800nm超快激光照射前后的状态。 

图7示出通过ESR检测到的实施例3中染料在二甲基亚砜中产生的单线态氧信号。 

图8示出通过ESR检测到的实施例3中染料在二甲基亚砜中产生的超氧负离子自由基信号。 

图9示出实施例3中染料在溶剂中的双光子荧光激发谱，其中四方点(■)为用锁模掺钛蓝宝石飞秒激光系统(Tsunami mode-locked Ti：Sapphire，重频80MHz，脉宽＜130fs)测试得到的数据，圆点(●)为用掺钛蓝宝石再生放大系统(Spitfire F-1K，重频1000Hz，脉宽＜200fs)测试得到的数据。 

图10示出通过红外光纤光谱仪探测到的实施例4中染料在800nm超快激光照射下于正辛醇中产生的单线态氧磷光发射光谱。 

图11示出实施例4中染料在溶剂中的双光子荧光激发谱，其中四方点(■)为用锁模掺钛蓝宝石飞秒激光系统(Tsunami mode-locked Ti：Sapphire，重频80MHz，脉宽＜130fs)测试得到的数据，圆点(●)为用掺钛蓝宝石再生放大系统(Spitfire F-1K，重频1000Hz，脉宽＜200fs)测试得到的数据。 

图12示出经实施例4中染料孵育的肿瘤细胞在800nm超快激光照射前后的状态。 

图13示出通过红外光纤光谱仪探测到的实施例5中染料在800nm超快激光照射下于正辛醇中产生的单线态氧磷光发射光谱。 

图14示出实施例5中染料在溶剂中的双光子荧光激发谱，其中四方点(■)为用锁模掺钛蓝宝石飞秒激光系统(Tsunami mode-locked Ti：Sapphire，重频80MHz，脉宽＜130fs)测试得到的数据，圆点(●)为用掺钛蓝宝石再生放大系统(Spitfire F-1K，重频1000Hz，脉宽＜200fs)测试得到的数据。 

图15示出经实施例6中染料孵育的肿瘤细胞在800nm超快激光照射前后的状态。 

图16示出通过ESR检测到的实施例7中染料在二甲基亚砜中产生的单线态氧信号。 

图17示出通过ESR检测到的实施例7中染料在二甲基亚砜中产生的超氧负离子自由基信号。 

图18示出实施例8中染料在溶剂中的双光子荧光激发谱，其中四方点(■)为用锁模掺钛蓝宝石飞秒激光系统(Tsunami mode-locked Ti：Sapphire，重频80MHz，脉宽＜130fs)测试得到的数据，圆点(●)为用掺钛蓝宝石再生放大系统(Spitfire F-1K，重频1000Hz，脉宽＜200fs)测试得到的数据。 

图19示出实施例1-8中染料H1-H8的单线态氧量子产率、双光子吸收截面最大值及其对应的波长，测试中用到的溶剂为正辛醇。 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。 

实施例1 

(i)向一个250毫升三口烧瓶中加入8克(0.2mol)NaOH，40毫升水，搅拌使其溶解均匀。将14.42克(0.12mol)二聚乙二醇单甲醚加入30毫升四氢呋喃(THF)中溶解均匀，然后加入上述三口烧瓶中与NaOH溶液混合均匀。将22.88克(0.12mol)对甲苯磺酰氯和40毫升THF混合均匀，然后缓慢滴加入上述三口烧瓶中，滴加过程保持反应液温度不超过10℃，滴加完毕后，继续搅拌反应4小时，停止反应。反应液用乙醚萃取三次，萃取液用水洗至中性后加入无水硫酸钠干燥，经过滤、旋蒸除去乙醚，得到30.2克(产率：92％)相应的对甲苯磺酸酯A1，¹HNMR(400MHz CDCl₃)：δ(ppm)2.42(s，3H)，3.32(s，3H)，3.45(t，J＝2.4Hz，2H)，3.52(t，J＝2.2Hz，2H)，3.65(t，J＝4.8Hz，2H)，4.14(t，J＝4.0Hz，2H)，7.31(d，J＝8.2Hz，2H)，7.77(d，J＝6.8Hz，2H)。 

(ii)向一个250毫升三口烧瓶中加入25克(0.138mol)N，N-二羟乙基苯胺，31克(0.31mol)乙酸酐和25克(0.356mol)吡啶，搅拌混合均匀后在氮气保护下加热回流2小时。冷却至室温，旋蒸除去低沸点物质乙酸酐和吡啶，减压蒸馏收集188～190℃/0.1MP馏分，得到34.6克(产率94.5％)金黄色油状液体中间产物B，¹HNMR(400MHz CDCl₃)：δ(ppm)2.05(s，6H)，3.72(t，J＝6.2Hz，4H)，4.28(t，J＝6.2Hz，4H)，6.65～6.70(m，3H)，7.19(d，J＝7.3Hz，2H)。 

(iii)向一个500毫升三口烧瓶中加入34.6克(0.131mol)中间产物B和100毫升N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，搅拌均匀。将22克(0.144mol)三氯氧磷(POCl₃)滴加到100毫升0～5℃的DMF中，搅拌反应2小时后将其缓慢滴加到上述三口烧瓶中，滴加完毕后，将反应液温度升至150℃并搅拌反应2小时，冷却后倾入含有60克Na₂CO₃的2升冰水溶液中，搅拌48小时，有大量固体生成，过滤收集固体产品得淡黄色固体34克(产率89％)中间产物C，¹HNMR(400MHz CDCl₃)：δ(ppm)2.04(s，6H)，3.70(t，J＝6.2Hz，4H)，4.27(t，J＝6.2Hz，4H)，6.82(d，J＝8.8Hz，2H)，7.75(d，J＝8.8Hz，2H)，9.76(s，1H)。 

(iv)向一个500毫升三口烧瓶中加入19.5克(0.067mol)中间产物C和50毫升甲醇，搅拌使其溶解均匀。将5.33克(0.133mol)NaOH溶于10毫升水中，缓慢加入上述三口瓶中，搅拌反应2小时，停止反应，将反应液旋蒸除去甲醇，用二氯甲烷萃取水相，得到的二氯甲烷萃取液用水洗涤至中性后加入无水硫酸钠干燥，经过滤、旋蒸除去二氯甲烷得到13.6克(产率97.8％)黄色油状液体4-(N，N-二(2-羟基-乙基)氨基)苯甲醛，¹HNMR(400MHz CDCl₃)：δ(ppm)3.32(bs，2H)，3.71(t，J＝4.9Hz，4H)，3.93(t，J＝4.9Hz)，6.72(d，J＝8.9Hz，2H)，7.70(d，J＝8.9Hz，2H)，9.70(s，1H)。 

(v)将2.75克(0.013mol)4-(N，N-二(2-羟基-乙基)氨基)苯甲醛溶于50毫升经过干燥重蒸的THF中，然后缓缓加入1.68克(0.03mol)KOH和50毫升THF混合而成的溶液，滴加完毕，反应液在N₂气氛下搅拌半小时后再加热回流1小时，得到中间反应液。将8.16克(0.03mol)对甲苯磺酸酯Al溶于20毫升THF中，缓慢滴加入上述中间反应液中，继续加热回流48小时，冷却后，将最终反应液用稀盐酸中和至中性，用二氯甲烷萃取，萃取液经无水硫酸镁干燥、过滤、旋蒸除去二氯甲烷后得到粗产品，用色谱柱分离提纯得到3.78克(产率71％)黄色油状液体E1。¹HNMR(400MHz CDCl₃)：δ(ppm)3.35(s，6H)，3.53～3.65(m， 24H)，6.73(d，J＝9Hz，2H)，7.67(d，J＝9Hz，2H)，9.70(s，1H)。 

(vi)向一个100毫升三口烧瓶中加入20.75克(0.05mol)E1，2.1克(0.025mol)环戊酮和40毫升乙醇，搅拌使其溶解均匀后一次性加入0.25克KOH，加热使反应混合物回流5小时，停止加热待反应液冷却后经旋蒸除去乙醇得到粗产品，用色谱柱分离提纯得到15.71克(产率72％)本发明的目标染料H1。¹HNMR(400MHz CDCl₃)：δ(ppm)3.06(s，4H)3.38(s，12H)3.52～3.61(m，48H)6.74(d，J＝8.5Hz，4H)7.49(d，J＝8.5Hz，6H).HR-MS(ESI)：m/z Calcd forC₄₇H₇₅N₂O₁₃[M+H]⁺875.52636；found 875.52309. 

(vii)用PBS(pH＝7.4)缓冲溶液检测目标染料H1在水体系中的溶解度，25℃其最大溶解度达到1mg/ml以上。 

(viii)使用5，5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO)作为单线态氧(¹O₂)自旋捕获剂，在800nm超快激光激发下测试上述目标染料H1在二甲基亚砜(DMSO)中的顺磁共振谱图，得到如图1所示的等高三重峰，其超精细分裂常数α和g因子(g＝2.0056，α^N＝16.3G，)与DMPO-¹O₂加合物吻合，说明染料H1在双光子激发下与氧气作用产生了单线态氧。 

(ix)使用2，2，6，6-四甲基-4-哌啶酮(TEMP)作为超氧自由基(O₂ ^-·)自旋捕获剂，在800nm超快激光激发下测试上述目标染料H1在二甲基亚砜(DMSO)中的顺磁共振谱图，得到如图2所示的四重峰，其超精细分裂常数α和g因子(g＝2.0056，α^N＝12.48G， 

)与TEMP-O₂ ^-·加合物吻合，说明染料H1在双光子激发下与氧气作用产生了超氧自由基。 

(x)将上述目标染料H1溶于正辛醇中配置成浓度为2×10^-4M的溶液，在暗处通氧15分钟后，在800nm超快激光照射下通过红外光纤光谱仪检测单线态氧磷光光谱，得到图3所示谱图，1270nm处的峰是单线态氧跃迁回基态的磷光发射峰。说明染料H1在双光子激发条件下产生了单线态氧。 

(xi)将上述目标染料H1溶于正辛醇中配置成浓度为2×10^-4M的溶液，以罗丹明B的甲醇溶液做参比，采用双光子激发荧光法测试了染料溶液在700～1000nm超快激光下的双光子荧光激发谱，如图4所示，染料H1在整个测试波段都有较强的双光子吸收。 

(xii)使用上述目标染料H1孵育的人体直肠癌1116细胞做双光子杀伤实验。细胞经过800nm超快激光为光源照射前后的状态见图5，照射部位的细胞发生明显的细胞水肿、细胞膜胀裂、细胞消融的现象，同时用于对照试验的空白组细胞在相同的光源照射下，没有发生上述现象，说明在双光子激发条件下，所制备目标染料H1对细胞产生了双光子光动力杀伤作用。 

实施例2 

(i)向一个250毫升三口烧瓶中加入8克(0.2mol)NaOH，80毫升水，搅拌使其溶解均匀。将19.7克(0.12mol)三聚乙二醇单甲醚加入50毫升THF中溶解均匀，然后加入上述三口烧瓶中与NaOH溶液混合均匀。将22.88克(0.12mol)对甲苯磺酰氯和40毫升THF混合均匀，然后缓慢滴加入上述三口烧瓶中，滴加过程保持反应液温度不超过10℃，滴加完毕后，继续搅拌反应6小时，停止反应。反应液用乙醚萃取三次，乙醚萃取液用水洗至中性后加入无水硫酸镁干燥，经过滤、旋蒸除去乙醚，得到34.7克(产率：91％)相应的对甲苯磺酸酯A2， ¹HNMR(400MHz CDCl₃)：δ(ppm)2.42(s，3H)，3.34(s，3H)，3.49(t，J＝2.4Hz，2H)，3.55(m，6H)，3.65(t，J＝4.8Hz，2H)，4.11(t，J＝4.0Hz，2H)，7.31(d，J＝8.1Hz，2H)，7.75(d，J＝6.7Hz，2H)。 

(ii)参照实施例1(ii)-(iv)的操作，得到黄色油状液体4-(N，N-二(2-羟基-乙基)氨基)苯甲醛。参照实施例1中(v)的操作，用摩尔量为2∶1的对甲苯磺酸酯A2与4-(N，N-二(2-羟基-乙基)氨基)苯甲醛反应，制备相应的带有两个PEG基团的苯甲醛衍生物E2，产率79％，¹HNMR(400MHz CDCl₃)：δ(ppm)3.36(s，6H)，3.52～3.63(m，32H)，6.71(d，J＝9Hz，2H)，7.66(d，J＝9Hz，2H)，9.68(s，1H). 

(iii)参照实施例1中(vi)的操作，用摩尔量为2∶1的E2与环戊酮反应，制备目标染料H2，产率61％，¹HNMR(400MHz CDCl₃)：δ(ppm)3.06(s，4H)3.38(s，12H)3.52～3.61(m，64H)6.74(d，J＝8.7Hz，4H)7.49(d，J＝8.7Hz，6H).HR-MS(ESI)：m/z Calcd for C₅₅H₉₁N₂O₁₇[M+H]⁺1051.63122；found 1051.63098. 

(iv)用PBS(pH＝7.4)缓冲溶液检测目标染料H2在水体系中的溶解度，25℃其最大溶解度达到1mg/ml以上。 

(v)参照实施例1(viii)-(xi)的操作，结果同样证明了目标染料H2在800nm超快激光照射下能产生单线态氧和超氧负离子，在700～1000nm波长范围内具有较强的双光子吸收。 

(vi)使用上述目标染料H2孵育的人体直肠癌1116细胞做双光子杀伤实验。细胞经过800nm超快激光为光源照射前后的状态见图6，照射部位的细胞发生明显的细胞水肿、细胞膜胀裂、细胞消融的现象，同时用于对照试验的空白组细胞在相同的光源照射下，没有发生上述现象，说明在双光子激发条件下，所制备目标染料H2对细胞产生了双光子光动力杀伤作用。 

实施例3 

(i)参照实施例1中(v)的操作，用摩尔量为1∶1的对甲苯磺酸酯Al与4-(N-甲基-N-(2-羟基-乙基)氨基)苯甲醛反应，制备相应的带有一个PEG基团的苯甲醛衍生物E3，产率75％，¹HNMR(400MHz CDCl₃)：δ(ppm)3.07(s，3H)，3.34(s，3H)，3.51～3.65(m，12H)，6.71(d，J＝9Hz，2H)，7.69(d，J＝9Hz，2H)，9.70(s，1H)。 

(ii)参照实施例1中(vi)的操作，用摩尔量为2∶1的E3与环戊酮反应，制备目标染料H3，产率72％，¹HNMR(400MHz CDCl₃)：δ(ppm)3.05(s，6H)3.08(s，4H)3.37(s，6H)3.51～3.67(m，24H)6.73(d，J＝8.6Hz，4H)7.51(d，J＝8.6Hz，6H).HR-MS(ESI)：m/z Calcd for C₃₅H₅₁N₂O₇[M+H]⁺611.36908；found 611.36926。 

(iii)用PBS(pH＝7.4)缓冲溶液检测目标染料H3在水体系中的溶解度，25℃其最大溶解度达到0.1mg/ml以上。 

(iv)参照实施例1(viii)-(xii)的操作，结果同样证明了目标染料H3在800nm超快激光照射下能产生单线态氧和超氧负离子，见附图7和8，在700～1000nm波长范围内具有较强的双光子吸收，见附图9，在双光子激发条件下对对肿瘤细胞能产生了双光子光动力杀伤作用。 

实施例4 

(i)参照实施例1中(v)的操作，用摩尔量为1∶1的对甲苯磺酸酯A2与4-(N-甲基-N-(2-羟基-乙基)氨基)苯甲醛反应，制备相应的带有一个PEG基团的苯甲醛衍生物E4，产率72％，¹HNMR(400MHz CDCl₃)：δ(ppm)3.09(s，3H)，3.36(s，3H)，3.52～3.68(m，16H)，6.73(d，J＝8.8Hz，2H)，7.68(d，J＝8.8Hz，2H)，9.70(s，1H)。 

(ii)参照实施例1中(vi)的操作，用摩尔量为2∶1的E4与环戊酮反应，制备目标染料H4，产率72％，¹HNMR(400MHz CDCl₃)：δ(ppm)3.05(s，6H)3.07(s，4H)3.36(s，6H)3.51～3.67(m，32H)6.72(d，J＝8.5Hz，4H)7.49(d，J＝8.5Hz，6H).HR-MS(ESI)：m/z Calcd for C₃₉H₅₉N₂O₉[M+H]⁺ 699.42151；found699.42167。 

(iii)用PBS(pH＝7.4)缓冲溶液检测目标染料H4在水体系中的溶解度，25℃其最大溶解度达到1mg/ml以上。 

(iv)参照实施例1(viii)-(xii)的操作，结果同样证明了目标染料H4在800nm超快激光照射下能产生单线态氧，见附图10；和超氧负离子，在700～1000nm波长范围内具有较强的双光子吸收，见附图11；在双光子激发条件下对对肿瘤细胞能产生了双光子光动力杀伤作用，见附图12。 

实施例5 

(i)向一个100毫升三口烧瓶中加入8.85克(0.05mol)4-(N，N-二乙氨基)苯甲醛，4.2克(0.05mol)环戊酮，30毫升乙醇和10毫升水，搅拌使其溶解均匀后一次性加入0.1毫升哌啶，室温下搅拌反应2小时，有大量橙色沉淀析出，将橙色沉淀通过过滤分离出来，经干燥得到粗产品，用色谱柱分离提纯得5.1克(产率42％)橙色固体G1。¹HNMR(400MHz CDCl3)：δ(ppm)1.19(t，J＝7.2Hz，6H)，2.04(m，2H)，2.34(t，2H)，2.95(t，2H)，3.40(q，J＝7.2Hz，4H)，6.69(d，J＝8.5Hz，2H)，7.51(d，J＝8.5Hz，3H)。 

(ii)向一个100毫升三口烧瓶中加入10.3克(0.025mol)E1，6.08克(0.025mol)G1，40毫升乙醇和10毫升水，搅拌使其溶解均匀后一次性加入0.1毫升哌啶，70℃下搅拌反应8小时，待反应液冷却后旋蒸除去乙醇和水得到粗产品，用色谱柱分离提纯得到目标染料H5，产率69％，¹HNMR(400MHzCDCl₃)：δ(ppm)1.19(t，J＝7.2Hz，6H)3.05(s，4H)3.37(s，6H)3.43(q，J＝7.2Hz，4H)3.53～3.65(m，24H)6.74(d，J＝8.6Hz，4H)7.52(d，J＝8.6Hz，6H).HR-MS(ESI)：m/z Calcd for C₃₇H₅₅N₂O₇[M+H]⁺ 639.40038；found 639.40072。 

(iii)用PBS(pH＝7.4)缓冲溶液检测目标染料H5在水体系中的溶解度，25℃其最大溶解度达到0.1mg/ml以上。 

(iv)参照实施例1(viii)-(xii)的操作，结果同样证明了目标染料H5在800nm超快激光照射下能产生单线态氧，见附图13；和超氧负离子，在700～1000nm波长范围内具有较强的双光子吸收，见附图14，在双光子激发条件下对对肿瘤细胞能产生了双光子光动力杀伤作用。 

实施例6 

(i)参照实施例5中(ii)的操作，用摩尔量为1∶1.1的G1与E2反应，制备目标染料H6，产率65％，¹HNMR(400MHz CDCl₃)：δ(ppm)1.20(t，J＝7.3Hz，6H)3.05(s，4H)3.37(s，6H)3.41(q，J＝7.2Hz，4H)3.53～3.65(m，32H)6.71(d，J＝8.5Hz，4H)7.50(d，J＝8.5Hz，6H).HR-MS(ESI)：m/z Calcd for C₄₁H₆₃N₂O₉[M+H]⁺ 727.45281；found 727.45418。 

(ii)用PBS(pH＝7.4)缓冲溶液检测目标染料H6在水体系中的溶解度，25℃其最大溶解度达到1mg/ml以上。 

(iii)参照实施例1(viii)-(xii)的操作，结果同样证明了目标染料H6在800nm超快激光照射下能产生单线态氧和超氧负离子，在700～1000nm波长范围内具有较强的双光子吸收，在双光子激发条件下对对肿瘤细胞能产生了双光子光动力杀伤作用，见附图15。 

实施例7 

(i)参照实施例5中(ii)的操作，用摩尔量为1∶1.2的G1与E3反应，制备目标染料H7，产率65％，¹HNMR(400MHz CDCl₃)：δ(ppm)1.21(t，J＝7.2Hz，6H)，3.05(s，3H)3.07(s，4H)3.37(s，3H)3.43(q，J＝7.2Hz，4H)，3.52～3.67(m，12H)6.69(d，J＝8.5Hz，4H)，7.51(d，J＝8.5Hz，6H).HR-MS(ESI)：m/z Calcd forC₃₁H₄₃N₂O₄[M+H]⁺507.32173；found 507.32192. 

(ii)用PBS(pH＝7.4)缓冲溶液检测目标染料H7在水体系中的溶解度，25℃其最大溶解度达到0.1mg/ml以上。 

(iii)参照实施例1(viii)-(xii)的操作，结果同样证明了目标染料H7在800nm超快激光照射下能产生单线态氧和超氧负离子，见附图16和17，在700～1000nm波长范围内具有较强的双光子吸收，在双光子激发条件下对对肿瘤细胞能产生了双光子光动力杀伤作用。 

实施例8 

(i)参照实施例5中(ii)的操作，用摩尔量为1∶1.5的G1与E4反应，制备目标染料H8，产率72％，¹HNMR(400MHz CDCl₃)：δ(ppm)1.21(t，J＝7.2Hz，6H)3.05(s，3H)3.07(s，4H)3.37(s，3H)3.41(q，J＝7.2Hz，4H)3.52～3.67(m，16H)6.71(d，J＝8.4Hz，4H)，7.51(d，J＝8.4Hz，6H).HR-MS(ESI)：m/z Calcd forC₃₃H₄₇N₂O₅[M+H]⁺551.34795found 551.34846. 

(ii)用PBS(pH＝7.4)缓冲溶液检测目标染料H8在水体系中的溶解度，25℃其最大溶解度达到0.1mg/ml以上。 

(iii)参照实施例1(viii)-(xii)的操作，结果同样证明了目标染料H8在800nm超快激光照射下能产生单线态氧和超氧负离子，在700～1000nm波长范围内具有较强的双光子吸收，见附图18，在双光子激发条件下对对肿瘤细胞能产生了双光子光动力杀伤作用。 

可以设想，即使没有其他详情，本领域技术人员也能在最宽的范围内利用以上描述。因此，优选实施例仅应视为说明性的公开，决不能视为任何方式的限定。 

Claims (10)

1.一种通式(Ⅰ)的化合物：

其中：R₁为-(C₂H₄O)_m-R₅基团；

R₂为甲基、乙基、或-(C₂H₄O)_n-R₆基团；

R₃为甲基、乙基、或-(C₂H₄O)_p-R₇基团；

R₄为甲基、乙基、或-(C₂H₄O)_q-R₈基团；

R₁、R₂、R₃和R₄可以是相同或不同的取代基团；

所述的-(C₂H₄O)_m-R₅基团中m＝3，4，5，6，7或8；R₅为甲基、乙基、丙基或异丙基；

所述的-(C₂H₄O)_n-R₆基团中n＝3，4，5，6，7或8；R₆为甲基、乙基、丙基或异丙基；

所述的-(C₂H₄O)_p-R₇基团中p＝3，4，5，6，7或8；R₇为甲基、乙基、丙基或异丙基；

所述的-(C₂H₄O)_q-R₈基团中q＝3，4，5，6，7或8；R₈为甲基、乙基、丙基或异丙基。

2.如权利要求1所述的化合物，其中m，n，p，q为3或4；R₅，R₆，R₇，R₈为甲基。

3.如权利要求1所述的化合物，其中R₃为-(C₂H₄O)_p-R₇基团。

4.如权利要求1所述的化合物，其中R₃，R₄为相同的取代基。

5.一种通式(Ⅰ)化合物的合成方法，

其中：R₁为-(C₂H₄O)_m-R₅基团；

R₂为甲基、乙基、或-(C₂H₄O)_n-R₆基团；

R₃为甲基、乙基、或-(C₂H₄O)_p-R₇基团；

R₄为甲基、乙基、或-(C₂H₄O)_q-R₈基团；

R₁、R₂、R₃和R₄可以是相同或不同的取代基团；

所述的-(C₂H₄O)_m-R₅基团中m＝3，4，5，6，7或8；R₅为甲基、乙基、丙基或异丙基；

所述的-(C₂H₄O)_n-R₆基团中n＝3，4，5，6，7或8；R₆为甲基、乙基、丙基或异丙基；

所述的-(C₂H₄O)_p-R₇基团中p＝3，4，5，6，7或8；R₇为甲基、乙基、丙基或异丙基；

所述的-(C₂H₄O)_q-R₈基团中q＝3，4，5，6，7或8；R₈为甲基、乙基、丙基或异丙基，

该方法包括：

(i)在乙醇-水溶液中在碱性催化剂条件下，将环戊酮与通式(Ⅱ)化合物

其中：R₁，R₂如前面所定义，

或与通式(Ⅲ)化合物

其中：R₁₁为甲基或乙基；R₁₂为甲基或乙基，

反应，收集得到的通式(Ⅳ)中间产物

其中：R₃，R₄如前面所定义，

(ii)将由此得到的通式(Ⅳ)中间产物，在乙醇溶剂中在碱性催化剂条件下，与通式(Ⅱ)化合物反应，

(iii)收集得到的通式(Ⅰ)化合物。

6.如权利要求5所述的通式(Ⅰ)化合物的合成方法，其中通式(Ⅳ)中间产物的合成反应在冰浴条件下进行。

7.一种通式(Ⅴ)化合物的合成方法，

其中：R₁为-(C₂H₄O)_m-R₅基团；

R₂选自甲基、乙基、或-(C₂H₄O)_n-R₆基团；

所述的-(C₂H₄O)_m-R₅基团中m＝3，4，5，6，7或8；R₅选自甲基、乙基、丙基或异丙基；

所述的-(C₂H₄O)_n-R₆基团中n＝3，4，5，6，7或8；R₆选自甲基、乙基、丙基或异丙基，

该方法包括：

(i)在乙醇溶剂中在碱性催化剂条件下，将环戊酮与通式(Ⅱ)化合物反应，

其中：R₁，R₂如前面所定义，

(ii)收集得到的通式(Ⅴ)化合物。

8.以如权利要求1所述的通式(Ⅰ)化合物为活性成份的光动力药物。

9.以如权利要求1所述的通式(Ⅰ)化合物为活性成份的双光子光动力药物。

10.以如权利要求1所述的通式(Ⅰ)化合物在制备双光子光动力药物中的用途。

Images