ES2357406T3 - Flt4 (VEGFR-3) COMO DIANA PARA LA OBTENCIÓN DE IMÁGENES DE TUMORES Y TERAPIA ANTITUMORAL. - Google Patents

Abstract

Un compuesto eficaz para inhibir la unión de una proteína ligando del receptor tirosina quinasa Flt4 (Flt4) a Flt4 expresado en células endoteliales vasculares de un mamífero para usar en un procedimiento de tratamiento de un mamífero que padece de una enfermedad neoplásica que se caracteriza por la expresión de Flt4 en células endoteliales de vasos sanguíneos adyacentes a un neoplasma maligno, inhibiendo la proliferación mediada por Flt4 de dichas células endoteliales vasculares, en el que dicho compuesto comprende un polipéptido seleccionado del grupo constituido por: (a) un polipéptido que comprende un anticuerpo anti-Flt4 o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti-Flt4; (b) un polipéptido que comprende un fragmento de Flt4 soluble, en el que dicho fragmento y dicho polipéptido son capaces de unirse a un ligando de Flt4; (c) un polipéptido que comprende un fragmento o análogo de un polipéptido precursor del factor de crecimiento endotelial vascular C (VEGF-C) de vertebrado,en el que dicho polipéptido y dicho fragmento o análogo se unen a, pero no son capaces de estimular, dicho Flt4 expresado en células huésped nativas; (d) un polipéptido que comprende un fragmento o análogo de un polipéptido precursor del factor de crecimiento endotelial vascular D (VEGF-D) de vertebrado en el que dicho polipéptido y dicho fragmento o análogo se unen a, pero no son capaces de estimular, dicho Flt4 expresado en células huésped nativas; (e) un anticuerpo anti-VEGF-C o polipéptido que comprende un fragmento de unión a antígeno del mismo; y (f) un anticuerpo anti-VEGF-D o polipéptido que comprende un fragmento de unión a antígeno del mismo.

Description

La presente invención se refiere, en general, a genes para receptores, específicamente a genes para receptores tirosina quinasas, a su inserción en vectores de ADN recombinante y a la producción de las proteínas resultantes en cepas huésped de microorganismos y células huésped eucariotas. Más específicamente, la presente invención se refiere a Flt4, un receptor tirosina quinasa; a secuencias de nucleótidos que codifican Flt4; a anticuerpos que reconocen específicamente dichos receptores; y a procedimientos que usan dichas sondas y anticuerpos y otros compuestos de unión a FIt4, por ejemplo para identificar vasos linfáticos y venulas endoteliales altas (HEV) en tejidos animales y humanos y aumentar o prevenir el crecimiento de células que expresan Flt4 en trastornos patológicos.

El comportamiento celular responsible del desarrollo, mantenimiento y reparación de células diferenciadas y tejidos está regulado, en su mayor parte, por señales intercelulares transportadas por medio de factores de crecimiento y ligandos similares y sus receptores. Los receptores están ubicados sobre la superficie celular de células receptoras y se unen a péptidos o polipéptidos conocidos como factores de crecimiento y otros ligandos similares a hormonas. Los resultados de esta interacción son cambios bioquímicos rápidos en las células receptoras, así como un reajuste rápido y a largo plazo de la expresión génica celular. Distintos receptores asociados con varias superficies celulares pueden unirse a factores de crecimiento específicos.

La fosforilación de tirosina es una de las formas clave de transducción de señal a través de la membrana plasmática. Varios genes de tirosina quinasa codifican receptores transmembranales para factores de crecimiento polipeptídicos y hormonas, tales como factor de crecimiento epidérmico (EGF), insulina, factor de crecimiento l similar a insulina (IGF-I), factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF-A y -B) y factores de crecimiento fibroblásticos (FGF) [Heldin y col., Cell Regulation, 1: 555-566 (1990); Ullrich y col., Cell, 61: 243-54 (1990)]. Los receptores de varios factores de crecimiento hematopoyéticos son tirosina quinasas; éstas incluyen c-fms, que es el receptor del factor 1 estimulador de colonias [Sherr y col., Cell, 41: 665-676 (1985)] y c-kit, un receptor del factor de crecimiento hematopoyético primitivo [Huang y col., Cell, 63: 225-33 (1990)].

Estos receptores difieren en su especificidad y su afinidad. En general, los receptores tirosina quinasas son glucoproteínas que consisten en un dominio extracelular capaz de unirse a un(os) factor(es) de crecimiento específico(s), un dominio transmembranal que es generalmente una porción alfa-helicoidal de la proteína, un dominio yuxtamembranal (donde puede ser regulado el receptor por, por ejemplo, fosforilación proteica), un dominio de tirosina quinasa (que es el componente enzimático del receptor) y una cola carboxi-terminal, que en muchos receptores está implicada en el reconocimiento y la unión de los sustratos por la tirosina quinasa.

En varios receptores tirosina quinasas, los procesos de ayuste alternativo y poliadenilación alternativa son capaces de producir varios polipéptidos distintos a partir del mismo gen. Éstos pueden contener o no los diversos dominios enumerados anteriormente. Como consecuencia, algunos dominios extracelulares pueden expresarse como proteínas separadas segregadas por las células y algunas formas de los receptores pueden carecer de dominio de tirosina quinasa y contener sólo el dominio extracelular insertado en la membrana plasmática a través del dominio transmembranal más una cola carboxi-terminal corta.

La fisiología del sistema vascular, la vasculogenesis y la angiogenesis embriónica, la coagulación sanguínea, la cicatricación de heridas y la reproducción, así como varias enfermedades, implican al endotelio vascular que recubre los vasos sanguíneos. El desarrollo del árbol vascular tiene lugar mediante angiogénesis y, de acuerdo con algunas teorías, la formación del sistema linfático comienza poco después del desarrollo arterial y venoso, brotando a partir de las venas. Véase Sabin, F.R., Am. J. Anat., 9:43 (1909); y van der Putte, S.C.J, Adv. Anat. Embryol. Cell Biol., 51:3 (1975).

Después del periodo fetal, las células endoteliales proliferan muy lentamente, excepto durante angiogénesis asociada con neovascularización. Los factores de crecimiento que estimulan la angiogénesis ejercen sus efectos a través de receptores tirosina quinasas específicos de la superficie de células endotelial.

Entre los ligandos para receptores tirosina quinasas, se ha demostrado que el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) es angiogénico, aunque débilmente, en la membrana corioalantoica de pollo. El factor de crecimiento transformante α (TGFα) es un factor angiogénico segregado por diversos tipos de células tumorales y por macrófagos. El factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), el ligando del receptor codificado protooncogénicamente cmet es también muy angiogénico, induciendo respuestas similares a las del TGFα en cultivos de células endoteliales.

La evidencia muestra que existen factores de crecimiento y receptores específicos de células endoteliales que pueden ser responsables principales de la estimulación del crecimiento, la diferenciación y de determinadas funciones diferenciadas de células endoteliales. El factor de crecimiento estudiado con más detalle es el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), un miembro de la familia de los PDGF. El factor de crecimiento endotelial vascular es una glucoproteína dimérica de subunidades de 23 kDa unidas a disulfuro, descubierta debido a su actividad mitogénica hacia las células endoteliales y su capacidad para inducir permeabilidad a los vasos (de aquí su nombre alternativo de factor de permaeabilidad vascular). Se ha informado de otros efectos del VEGF que incluyen la mobilización de Ca2+ intracelular, la inducción de la síntesis del activador plasminógeno y del inhibidor-1 del activador plasminógeno, la estimulación del transporte de hexosa en células endoteliales y la promoción de la migración de monocitos in vitro. Cuatro isoformas de VEGF, codificadas por distintas variantes de ayuste de ARNm, parecen ser capaces igualmente de mitógenesis estimulante de células endoteliales. Las isoformas de VEGF de 121 y 165 aminoácidos se segregan en una forma soluble, mientras que las isoformas de 189 y 206 restos de aminoácidos permanecen asociadas con la superficie celular y tienen una gran afinidad por la heparina. Las formas solubles que no se unen a heparina y que se unen a heparina se han descrito para el factor de crecimiento de placenta relacionado (PIGF; 131 y 152 aminoácidos, respectivamente), que se expresan en placenta, tumores trofoblásticos y células endoteliales humanas cultivadas.

El patrón de expresión de VEGF sugiere su implicación en el desarrollo y mantenimiento del sistema vascular normal y en angiogénesis de tumores. Durante el desarrollo murino, el endodermo de 7,5 días postcoitales expresa VEGF y el neuroectodermo ventricular produce VEGF en el estadio de crecimiento hacia dentro de los capilares. El día dos del desarrollo de la codorniz, el área vascularizada del saco de la yema, así como la totalidad del embrión muestran expresión de VEGF. Además, las células epiteliales próximas al endotelio fenestrado en ratones adultos muestran expresión de VEGF persistente, sugiriendo un papel en el mantenimiento de este fenotipo endotelial específico y en su función.

Se han caracterizado dos receptores de alta afinidad para VEGF, VEGFR-1/Flt1 (tirosina quinasa-1 similar a fins) y VEGFR-2/Kdr/Flk-1 (dominio del inserto quinasa que contiene receptor/quinasa-1 de hígado fetal). Estos receptores se clasifican en la familia del receptor de PDGF. No obstante, los receptores de VEGF tienen siete bucles similares a inmunoglobulina en los dominios extracelulares (como oposición a cinco en otros miembros de la familia PDGF) y un inserto de quinasa más largo. La expresión de receptores de VEGF tiene lugar principalmente en células endoteliales vasculares, aunque algunos también pueden estar presentes en monocitos y en líneas celulares de melanomas. Se ha informado que sólo las células endoteliales proliferan en respuesta a VEGF, y las células endoteliales de fuentes diferentes muestras respuestas diferentes. De este modo, las señales mediadas a través de VEGFR-1 y VEGFR-2 parecen ser específicas del tipo celular.

Los VEGFR-1 y VEGFR-2 se unen a VEGF165 con afinidad alta (Kd aproximadamente 20 pM y 200 pM, respectivamente). También se ha demostrado que el receptor Flk-1 se somete a autofosforilación en respuesta al VEGF, pero la fosforilación de Flt1 fue apenas detectable. El VEGFR-2 mediaba señales que causan cambios sorprendentes en la morfología, la reorganización de actina y el ondulamiento de la membrana de células endoteliales aórticas porcinas que sobreexpresan este receptor. En estas células, el VEGFR-2 también mediaba quimiotaxis inducida por ligando y mitogénesis, mientras que el VEGFR-1 transfectaba células que carecían de respuestas mitógenas al VEGF. En contraste, el VEGF tenía un efecto estimulador del crecimiento fuerte sobre células endoteliales sinusoidales de rata que expresan VEGFR-1. Las fosfoproteínas que coprecipitan con VEGFR-1 y VEGFR-2 son distintas, sugiriendo que que interactúan diferentes moléculas señalizadores con las secuencias intracelulares específicas del receptor.

En estudios de hibridación in situ, se encontró la expresión de ARNm de VEGFR-2 en saco de yema y mesodermo intraembriónico (embriones estimados 7,5 días poscoito (p.c.), a partir de los cuales deriva el endotelio y, posteriormente, en angioblastos presuntivos, endocardio y endotelio de vasos grandes y pequeños (12,5 días p.c.). El abundante ARNm de VEGFR-2 en células endoteliales proliferantes de brotes vasculares y vasos ramificantes de cerebro embriónico y posnatal temprano y la espresión decreciente en cerebros adultos sugirieron que el VEGFR-2 es un regulador principal de la vasculogénesis y la angiogénesis. La expresión de VEGF-1 se asoció de modo similar al desarrollo vascular temprano en embriones de ratones y a la neovascularización en la cicatrización de heridas de la piel. No obstante, se detectaron altos niveles de expresión de VEGFR-1 en órganos adultos, sugiriendo que el VEGFR-1 tiene una función en el endotelio en reposo de vasos maduros no relacionada con el crecimiento celular. El homólogo aviar del VEGFR-2 se observó en el mesodermo a partir de la aparición de gastrulación, mientras que el homólogo de VEGFR-1 se encontró primeramente en células que coexpresan marcadores endoteliales. En cultivos in vitro de epiblasto de codorniz, el FGF-2, que se necesita para la diferenciación vasculógena de estas células, reguló al alza la expresión de VEGFR-2. Se encontró que la expresión de ambos receptores VEGF se vuelve más limitada en el desarrollo posterior. En tejidos fetales humanos, el VEGFR-1 y el VEGFR-2 mostraron patrones de expresión superpuestos, pero ligeramente diferentes. Estos datos sugieren que el VEGF y sus receptores actúan de un modo paracrino para regular la diferenciación de células endoteliales y la neovascularización de tejidos.

Se ha demostrado recientemente que el VEGF es un estimulador inducido por hipoxia del crecimiento y la angiogénesis de células endoteliales, y se ha demostrado que la inhibición de la actividad del VEGF usando anticuerpos monoclonales específicos reduce el crecimiento de tumores experimentales y su densidad en vasos sanguíneos. [Ferrara y col., Endocrine Reviews, 18: 4-25 (1997); Shibuya y col., Adv. Cancer Res., 67: 281 -316 (1995); Kim y col., Nature, 362: 841 -844 (1993).]

Joukov y col., EMBO J., vol. 15, nº. 2, 1996, páginas 290-298, divulga que un factor de crecimiento endotelial vascular novedoso, VEGF-C, es un ligando del Flt4 (VEGFR-3) y del receptor tirosina quinasa KDR (VEGFR-2).

El crecimiento de tumores sólidos más allá de unos pocos milímetros cúbicos de tamaño depende del suplemento vascular, haciendo de la angiogénesis una diana atractiva para la terapia contra el cáncer. Se ha informado de resultados alentadores con inhibidores angiógenos endógenos o "estatinas" que incluyen angiostatina, un fragmento de plasminógeno, andendostatina, un fragmento de colágeno 18. [O'Reilly y col., Cell, 79: 315-328 (1994); O'Reilly y col., Cell, 88: 277-85 (1997).]. Ambos factores se producen normalmente por tumores primarios y mantienen la metástasis en estado latente. La administración sistémica de ambas estatinas ha demostrado que también induce y mantiene el estado latente de tumores primarios en modelos animales. Los receptores y la señalización por estatinas, así como las proteasas que los activan, permanecen sin identificar. Existe la necesidad de moléculas terapéuticas adicionales para controlar la angiogénesis en el tratamiento de cáncer y otros estados patológicos.

Se ha demostrado que los cánceres de mama primarios expresan varios polipéptidos angiógenos, de los cuales el VEGF fue el más abundante. [Véase, por ejemplo, Relf y cols., 57: 963-969 (1997).] Las células tumorales contenían altos niveles de ARNm de VEGF en carcinomas de mama ductales (in situ) invasivos y no invasivos. [Brown y col., Hum. Pathol.,

26: 86-91 (1995).] Las células endoteliales adyacentes a los carcinomas in situ expresaron ARNm de VEGFR-1 y VEGFR-2. El VEGF y sus receptores pueden contribuir a la progresión angiógena de tumores de mama malignos, debido a que en varios estudios independientes, se han encontrado correlaciones entre la densidad vascular de los tumores y el pronóstico de la enfermedad. [Weidner y col., J. Natl. Cancer Inst., 84:1875-1887 (1992).] Existe la necesidad de marcadores adicionales para cáncer de mama y angiogénesis relacionada con el cáncer de mama para mejorar el diagnóstico y el análisis y para servir como diana para la intervención terapéutica.

Una función principal del sistema linfático es proporcionar el retorno del fluido desde los tejidos y transportar muchas sustancias extravasculares de nuevo a la sangre. Además, durante el proceso de maduración, los linfocitos abandonan la sangre, migran a través de órganos linfoides y otros tejido y penetran en los vasos linfáticos, y retornan a la sangre a través del conducto torácico. Las vénulas especializadas, las venulas endoteliales altas (HEV), se unen de nuevo a los linfocitos y provocan su extravasación al interior de los tejidos. Los vasos linfáticos, y especialmente los ganglios linfáticos, cumplen así un papel importante en inmunología y en el desarrollo de metástasis de distintos tumores.

Desde los comienzos del siglo XX, se han presentado tres teorías diferentes referentes al origen embrionario del sistema linfático. No obstante, ha sido difícil identificar los vasos linfáticos, debido a la ausencia de marcadores específicos conocidos disponibles para ellos.

El modo más común de estudiar los vasos linfáticos es con la ayuda de linfografía. En linfografía, el medio de contraste de rayos X se inyecta directamente en un vaso linfático. Este medio de contraste se distribuye a lo largo de los vasos de drenaje eferentes del sistema linfático. El medio de contraste se recoge en los ganglios linfáticos, donde permanece hasta medio año, durante el cual los análisis de rayos X permiten un seguimiento del tamaño y la arquitectura de los ganglios linfáticos. Este diagnóstico es especialmente importante en pacientes con cáncer con metástasis en los ganglios linfáticos y en tumores malignos linfáticos, tales como linfomas. El documento WO 95/33772 divulga anticuerpos anti-FLT4, especialmente anticuerpos monoclonales anti-FLT4, que son útiles como marcadores específicos para células endoteliales de vasos linfáticos y las HEV, como instrumento de diagnóstico para detectar cambios en el tejido linfático, especialmente en vasos linfáticos y las HEV en estados patológicos. No obstante, se precisan en la técnica materiales y procedimientos mejorados para obtener imágenes de tejidos linfáticos.

La presente invención trata sobre un gen para un receptor tirosina quinasa novedoso ubicado en el cromosoma 5, identificado como un fragmento de PCR-ADNc homólogo de tirosina quinasa desconocido a partir de células de leucemia humana [Aprelikova y col., Cancer Res., 52: 746-748 (1992)]. Este gen y su proteína codificada se denominan Flt4. Esta abreviatura viene de las palabras en inglés fms-like tyrosine kinase 4 (tirosina quinasa similar a fms 4).

El Flt4 es un receptor tirosina quinasa estrechamente relacionado en estructura a los productos de los genes VEGFR-1 y VEGFR-2. En virtud de esta similaridad y las similaridades descubiertas subsiguientemente entre ligandos de estos tres receptores, el receptor Flt4 se ha denominado alternativamente VEGFR-3. En el presente documento se usan indistintamente los nombres Flt4 y VEGFR-3. A pesar de la similaridad entre los tres receptores, la forma madura de Flt4 difiere de los VEGFR en que ésta se escinde proteolíticamente en el dominio extracelular en dos polipéptidos unidos por disulfuro de 125/120 kD y 75 kD. El gen Flt4 codifica ARNm de 4,5 y 5,8 kb que muestran exones 3' alternativos y codifica polipéptidos de 190 kD y 195 kD, respectivamente.

Una evidencia posterior de la distinción es que el VEGF no muestra una unión específica al Flt4 y no induce su autofosforilación.

Una comparación de las señales de ARNm de Flt4, Flt1 y el receptor KDR/Flk-1 mostró solapamiento, pero patrones de expresión distintos en los tejidos estudiados. Kaipainen, y col.,

J. Exp. Med, 178:2077 (1993). La expresión del gen Flt4 parece ser más restrictiva que la expresión de VEGFR-1 o VEGFR-2. La expresión de Flt4 se vuelve primeramente detectable mediante hibridación in situ en los angioblastos del mesénquima de la cabeza, la vena cardinal y extraembriónicamente en el alantoides de embriones de ratón 8,5 días poscoitales. En embriones 12,5 días poscoitales, la señal de Flt4 se observa al desarrollarse el endotelio linfático presuntivo y venoso, pero parece ser negativa para el endotelio arterial. Durante los últimos estadios de desarrollo, el ARNm de Flt4 se restringe a los vasos linfáticos en desarrollo. Sólo el endotelio linfático y algunas vénulas endoteliales altas expresan ARNm de Flt4 en tejidos humanos adultos y tiene lugar un aumento de la expresión en senos linfáticos en ganglios linfáticos metastáticos y en linfangiomas. Los resultados apoyan la teoría del origen venoso de los vasos linfáticos.

El producto proteico del ADNc del receptor tirosina quinasa Flt4, clonado a partir de una línea celular de eritroleucemia humana, está N-glucosilado y contiene siete bucles similres a inmunoglobulina en su dominio extracelular. El dominio de tirosina quinasa citoplasmático de Flt4 es aproximadamente un 80 % idéntico en el nivel aminoacídico a los dominios correspondientes de Flt1 y KDR y aproximadamente un 60 % idéntico a los receptores para el factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor estimulante de colonias 1, factor de celulas madre y el receptor Flt3. Véase Pajusola y col., Cancer Res., 52:5738 (1992).

La presente invención se refiere a polinucleótidos aislados (por ejemplo, segmentos de ADN o ARN de estructura definida) que codifican un receptor tirosona quinasa Flt4 útil en la producción de proteína Flt4 y fragmentos peptídicos de las mismas y en la recuperación de genes relacionados a partir de otras fuentes.

La presente invención se refiere a un vector de ADN recombinante que contiene un segmento heterólogo que codifica el receptor tirosina quinasa Flt4 o una proteína relacionada que sea capaz de insertarse en un microorganismo o célula eucariota y que sea capaz de expresar la proteína codificada.

La presente invención se refiere a células eucariotas capaces de producir cantidades útiles del receptor tirosina quinasa Flt4 y proteínas de función similar a partir de muchas especies.

La presente invención proporciona péptidos que se pueden producir sintéticamente en un laboratorio o por microorganismos, cuyos péptidos inhiben la actividad de proteínas del receptor tirosina quinasa Flt4.

Ejemplos de péptidos Flt4 son péptidos del grupo que consiste en: (a) a forma corta de Flt4, cuya secuencia de nucleótidos y aminoácidos deducidos se presenta en las SEQ. ID Nº. 1 y 2; y (b) una segunda forma con diferentes nucleótidos y restos de aminoácidos correspondientes en su extremo carboxi-teminal, es decir, una forma de Flt4 larga, cuya secuencia de nucleótidos y aminoácidos deducidos se presenta en las SEQ. ID Nº. 3 y 4. La forma larga de Flt4 tiene una longitud de 1363 restos de aminoácidos.

Moleculas de ADN y ARN, vectores de ADN recombinate y microorganismos modificados o células eucariotas que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de las proteínas o péptidos indicados anteriormente están relacionadas con la presente invención. En particular, las secuencias que comprenden la totalidad o parte de las dos secuencias de ADN siguientes, una secuencia de ADN o ARN complementario o una secuencia de ARN correspondiente son especialmente preferentes: (a) una secuencia de ADN tal como SEQ ID Nº: 1, que codifica la forma corta de Flt4 [SEQ ID Nº:2], y (b) una secuencia de ADN tal como SEQ ID Nº: 3, que codifica un Flt4 en el que los nucleótidos 3913-4416 de SEQ ID Nº:1 están modificados, que codifica la forma larga Flt4 [SEQ ID Nº:4],

También se alude a las moléculas de ADN y ARN que contienen segmentos de la secuencia larga para su uso en la realización de aspectos preferentes de la presente invención relacionados con la producción de dichos péptidos mediante técnicas de ingeniería genética y la producción de sondas de oligonucleótidos.

Debido a que la secuencia de ADN que codifica la proteína Flt4 se identifica en el presente documento, el ADN que codifica la proteína Flt4 puede producirse, por ejemplo mediante la reacción en cadena de la polimerasa o mediante química sintética usando instrumental disponible comercialmente, después de lo cual puede insertarse el gen en cualquiera de los vectores de ADN disponibles usando técnicas conocidas de tecnología de ADN recombinante. Además, también está disponible el equipo automático que hace fácilmente disponible la síntesis de cualquiera de los péptidos divulgados en el presente documento.

La presente invención también se refiere a péptidos Flt4 y a otras construcciones.

En una realización específica, la invención se refiere a sondas de ácido nucleico y se refiere a anticuerpos que reconocen el Flt4, especialmente a anticuerpos monoclonales, y a composiciones que contienen dichos anticuerpos.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente la proteína receptora Flt4 o varias epítopos de la misma. Un objeto de la invención es el uso de estos anticuerpos monoclonales para propositos de diagnóstico para detectar y medir la cantidad de receptores Flt4 en tejidos. En el contexto de anticuerpos anti-Flt4, las expresiones "reconocen específicamente Flt4", "se unen específicamente a Flt4", "específico para Flt4," y similares significan que un anticuerpo se unirá (reacciona inmunitariamente con) Flt4 de forma preferente a otros receptores de superficie de células endoteliales, incluidos VEGFR-2/Kdr/Flk-1 y VEGFR-1/Flt1. Así, los anticuerpos anti-Flt4 u otros compuestos que se unen a Flt4 que son "específicos de" Flt4 son útiles para la identificación y/o etiquetado de Flt4 en tejidos o muestras biológicas de acuerdo con los procedifmientos de la invención tal como se describen en el presente documento (por ejemplo, obtención médica de imágenes, detección, análisis o terapia dirigida), debido a que no se unen en absoluto a epítopos de otros antígenos, o se unen a otros antígenos sólo con una afinidad que es suficientemente inferior a su afinidad de unión a Flt4 para ser insignificante en estos contextos prácticos.

La presente invención se refiere a un procedimiento para determinar la presencia de receptores Flt4 en una muestra celular, que comprende las etapas de (a) exponer una muestra celular a un anticuerpo, especialmente un anticuerpo monoclonal, de la presente invención; y

(b) detectar la unión de dicho anticuerpo monoclonal a receptores Flt4.

La invención se refiere a una fuente de líneas celulares para un ligando del receptor tirosina quinasa Flt4. Usando el medio acondicionado a partir de estas células, el ligando de Flt4 puede purificarse y clonarse usando procedimientos estándar de la técnica. Usando el medio acondicionado o el ligando purificado, se obtiene un sistema de ensayo para ligandos de Flt4 e inhibidores de dimerización, así como inhibidores de la transducción de señal de Flt4, lo que permite la identificación y preparación de tales inhibidores.

El medio acondicionado a partir de la línea celular PC-3 puede comprender una proteína o un fragmento de la misma, que es capaz de estimular el receptor Flt4 y regular el crecimiento y diferenciación, así como las funciones de diferenciación de determinadas células endoteliales. El ligando de Flt4 o sus péptidos o derivados son útiles en la regulación del crecimiento celular endotelial, la diferenciación y sus funciones de diferenciación y en la generación de agonistas y antagonistas para el ligando. No obstante, el ligando de Flt4, cuando se purifica, o se produce a partir de una fuente recombinante, también puede estimular el receptor KDR/Flk-1 relacionado.

La identificación del ligando estimulante de Flt4 hace directamente posible analizar inhibidores de este ligando o inhibidores de la función de Flt4. Dichos inhibidores se añaden simplemente al medio acondicionado que contiene el ligando de Flt4 y si inhiben la autofosforilación, actúan como inhibidores señalizadores de Flt4. Por ejemplo, pueden analizarse péptidos recombinantes o sintéticos (incluidos, pero no limitados a, fragmentos del dominio extracelular de Flt4) por inhibición de la interacción de ligando de Flt4 o dimerización de Flt4. Dichos inhibidores putativos de Flt4 y, además, anticuerpos contra el ligando de Flt4, péptidos u otros compuestos que bloquean la interacción receptor Flt4-ligando, así como oligonucleótidos antisentido complementarios a la secuencia de ARNm que codifica el ligando de Flt4 son útiles en la regulación de células endoteliales y en el tratamiento de enfermedades asociadas con la función celular endotelial.

Una caracterización detallada del ligando de Flt4, denominado VEGF-C, se proporciona en la solicitud de patente PCT/US98/01973, presentada el 2 de febrero de 1998, y publicada como publicación internacional Nº WO 98/33917; en la solicitud de patente PCT/FI96/00427, presentada el 1 de agosto,1996, y publicada como publicación internacional WO 97/05250; y en los documentos de prioridad de la solicitud de patente de Estados Unidos que dependen de la misma por prioridad. La secuencia de aminoácidos para prepro-VEGF-C se expone en el presente documento en SEQ ID Nº: 21.

Una descripción detallada de un segundo ligando de Flt4, denominado VEGF-D, se proporciona en Achen y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A., 95(2): 548-553 (1998), y en el Genbank con el número de acceso AJ000185.

La secuencia de aminoácidos deducida para prepro-VEGF-C se expone en el presente documento en SEQ ID Nº:22.

En un primer aspecto, la invención proporciona un compuesto eficaz para inhibir la unión de una proteína ligando del receptor tirosina quinasa Flt4 (Flt4) a Flt4 expresada en células endoteliales vasculares de un mamífero para usar en un procedimiento de tratamiento de un mamífero que padece de una enfermedad neoplásica caracterizada por la expresión de Flt4 en células endoteliales de vasos sanguíneos adyacentes a un neoplasma maligno, inhibiendo la proliferación mediada por Flt4 de dichas células endoteliales vasculares, en el que dicho compuestos comprende un polipéptido seleccionado del grupo constituido por:

(a)

un polipéptido que comprende un anticuerpo anti-Flt4 o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti-Flt4;

(b)

un polipéptido que comprende un fragmento de Flt4 soluble, en el que dicho fragmento y dicho polipéptido son capaces de unirse a un ligando de Flt4;

(c)

un polipéptido que comprende un fragmento o análogo de un polipéptido precursor del factor de crecimiento endotelial vascular C (VEGF-C) de vertebrado, en el que dicho polipéptido y dicho fragmento o análogo se une, pero no puede estimular, dicho Flt4 expresado en células huésped nativas;

(d)

un polipéptido que comprende un fragmento o análogo de un polipéptido precursor del factor de crecimiento endotelial vascular D (VEGF-D) de vertebrado, en el que dicho polipéptido y dicho fragmento o análogo se une, pero no puede estimular, dicho Flt4 expresado en células huésped nativas;

(e)

un anticuerpo anti-VEGF-C o polipéptido que comprende un fragmento de unión a antígeno del mismo; y

(f)

un anticuerpo anti-VEGF-D o polipéptido que comprende un fragmento de unión a antígeno del mismo.

En un segundo aspecto, la invención proporciona un compuesto que se une a Flt4 para usar en un procedimiento de diagnóstico en vivo de detección de enfermedades neoplásicas caracterizadas por la expresión de Flt4 en células endoteliales de vasos sanguíneos adyacentes a un neoplasma maligno.

En un tercer aspecto, la invención proporciona un compuesto eficaz para inhibir la unión de una proteína ligando del receptor tirosina quinasa Flt4 (Flt4) a Flt4 expresada en células endoteliales vasculares de un mamífero para fabricar un medicamento para tratar a un mamífero que padece de una enfermedad neoplásica caracterizada por la expresión de Flt4 en células endoteliales de vasos sanguíneos adyacentes a un neoplasma maligno, inhibiendo la proliferación mediada por Flt4 de dichas células endoteliales vasculares, en el que dicho compuestos comprende un polipéptido seleccionado del grupo constituido por:

(g)

un polipéptido que comprende un anticuerpo anti-Flt4 o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti-Flt4;

(h)

un polipéptido que comprende un fragmento de Flt4 soluble, en el que dicho fragmento y dicho polipéptido son capaces de unirse a un ligando de Flt4;

(i)

un polipéptido que comprende un fragmento o análogo de un polipéptido precursor del factor de crecimiento endotelial vascular C (VEGF-C) de vertebrado, en el que dicho polipéptido y dicho fragmento o análogo se une, pero no puede estimular, dicho Flt4 expresado en células huésped nativas;

(j)

un polipéptido que comprende un fragmento o análogo de un polipéptido precursor del factor de crecimiento endotelial vascular D (VEGF-D) de vertebrado, en el que dicho polipéptido y dicho fragmento o análogo se une, pero no puede estimular, dicho Flt4 expresado en células huésped nativas;

(k)

un anticuerpo anti-VEGF-C o polipéptido que comprende un fragmento de unión a antígeno del mismo; y

(l)

un anticuerpo anti-VEGF-D o polipéptido que comprende un fragmento de unión a antígeno del mismo; y

En un cuarto aspecto, la invención proporciona el uso de un compuesto que se une a Flt4 para la fabricación de una composición para usar en un procedimiento de diagnóstico en vivo de detección de enfermedades neoplásicas caracterizadas por la expresión de Flt4 en células endoteliales de vasos sanguíneos adyacentes a un neoplasma maligno.

En un quinto aspecto, la invención proporciona un procedimiento in vitro de detección de enfermedades neoplásicas caracterizadas por la expresión de Flt4 en células endoteliales de vasos sanguíneos adyacentes a un neoplasma sanguíneo, usando un compuestos que se une a Flt4.

De acuerdo con un sexto aspecto se proporciona una composición que comprende un polipéptido constituido por un fragmento de un dominio extracelular de Flt4, en el que el fragmento es capaz de unirse a un ligando de Flt4, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad neoplásica caracterizada por la expresión de Flt4 en células endoteliales vasculares.

De acuerdo con un séptimo aspecto se proporciona el uso de un polipéptido constituido por un fragmento de un dominio extracelular de Flt4, en el que el fragmento es capaz de unirse a un ligando de Flt4, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad neoplásica caracterizada por la expresión de Flt4 en células.

De acuerdo con un octavo aspecto de la invención se proporciona un anticuerpo biespecífico, o un fragmento del mismo, que se une a Flt4 y se une a un antígeno marcador endotelial de vasos sanguíneos seleccionado del grupo constituido por PAL-E, VEGFR-1, VEGFR-2, endoglina y factor de von Willebrand.

La invención se refiere también al tratamiento de un organismo mamífero que padece de una enfermedad caracterizada por la expresión de tirosina quinasa Flt4 (Flt4) en células endoteliales vasculares que comprende la etapa de administrar al organismo mamífero una composición, comprendiendo la composición un compuesto eficaz para inhibir la unión de una proteína ligando de Flt4 a Flt4 expresado en células endoteliales del organismo, inhibiendo, por lo tanto, la función de Flt4. Se ha descubierto que la expresión de Flt4 tiene lugar en la vasculatura de vasos sanguíneos asociada con al menos algunos cánceres de mama, y posiblemente otros cánceres (es decir, en un nivel que excede ampliamente los niveles apenas detectables o indetectables de expresión de la vasculatura de vasos sanguíneos de tejidos (sanos) normales correspondientes). Se considera específicamente el tratamiento de seres humanos.

Por “compuesto eficaz para inhibir la unión de una proteína ligando de Flt4 a Flt4 expresado en células endoteliales vasculares del organismo” se entiende cualquier compuesto que inhibe la unión del ligando de Flt4 descrito en el presente documento como factor de crecimiento endotelial vascular C, como aislable a partir de medio acondicionado PC-3. Se considera que dichos compuestos serán también eficaces para inhibir la unión del factor de crecimiento endotelial vascular D a Flt4. Ejemplos de compuestos incluyen los siguientes polipéptidos: (a) un polipéptido que comprende un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti-Flt4; (b) un polipéptido que comprende un fragmento soluble de Flt4 (por ejemplo, un fragmento del dominio extracelular), en el que el fragmento y el polipéptido son capaces de unirse a un ligando de Flt4; (c) un polipéptido que comprende un fragmento o análogo de un polipéptido factor de crecimiento endotelial vascular C (VEGF-C) de vertebrado, en el que el polipéptido y el fragmento o análogo se unen, pero no pueden activar, el Flt4 expresado en células huésped nativas (es decir, células del organismo que expresan la proteína nativa Flt4 sobre su superficie); y (d) un polipéptido que comprende un fragmento o análogo de un polipéptido factor de crecimiento endotelial vascular D (VEGF-D) de vertebrado, en el que el polipéptido y el fragmento o análogo se unen, pero no pueden activar, el Flt4 expresado en células huésped nativas. También se consideran inhibidores de moléculas pequeñas identificables mediante ensayos de análisis in vitro estándar, por ejemplo, usando VEGF-C y Flt4 expresado recombinantemente. Son muy preferentes polipéptidos que comprenden un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti-Flt4. Dichos polipéptidos incluyen, por ejemplo, anticuerpos policlonales y monoclonales que se unen específicamente a Flt4; fragmentos de dichos anticuerpos; anticuerpos quiméricos y humanizados; anticuerpos biespecíficos que se unen específicamente a Flt4 y también específicamente a otro antígeno.

También se considera el uso de compuestos que se unen a ligandos de Flt4 en circulación y, por lo tanto, inhiben la unión del ligando a Flt4. Dichos compuestos incluyen anticuerpos anti-VEGF-C o anti-VEGF-D o polipéptidos que comprenden fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En una variación relacionada, la invención contempla medicamentos para interrumpir corriente abajo la señalización de Flt4 intracelular, inhibiendo, por lo tanto, la función de Flt4.

En una variación preferente, el compuesto comprende además una etiqueta detectable tal como se describe en algún lugar del presente documento, o un agente citotóxico. Los ejemplos de agentes citotóxicos incluyen toxinas de plantas (por ejemplo, ricina, saporina), toxinas bacterianas o fúngicas, isótopos radioactivos (por ejemplo, astato-211, bismuto-212, itrio-90, yodo-131, tecnecio-99m y otros descritos en el presente documento), fármacos antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 5-fluorodeoxiuridina), agentes alquilantes (por ejemplo, clorambucilo), agentes antimitóticos (por ejemplo, alcaloides de la vinca) y agentes intercalantes de ADN (por ejemplo adriamicina).

Asimismo, para mejorar la administración, la composición comprende además, preferentemente, un diluyente, coadyuvante o medio vehicular farmacéuticamente aceptable.

Tal como se explica en detalle en el presente documento, la expresión de Flt4, aunque muy restringida al endotelio linfático en adultos sanos, se ha identificado en la vasculatura sanguínea que rodea determinados tumores. Por lo tanto, la invención se refiere a un procedimiento de tratamiento de un organismo mamífero que padece una enfermedad neoplásica caracterizada por la expresión de tirosina quinasa Flt4 (Flt4) en células endoteliales vasculares que comprende la etapa de administrar al organismo mamífero una composición, comprendiendo la composición un compuesto eficaz para inhibir la unión de una proteína ligando de Flt4 a Flt4 expresado en células endoteliales vasculares del organismo, inhibiendo, por lo tanto, la proliferación mediada por Flt4 de las células endoteliales vasculares. Se considera específicamente el tratamiento de enfermedades neoplásicas seleccionadas de entre carcinomas (por ejemplo, carcinomas de mama), carcinomas de células escamosas, linfomas, melanomas y sarcomas. No obstante, será fácilmente patente que las técnicas de análisis descritas en el presente documento en detalle identificarán otros tumores caracterizados por la expresión de Flt4 en células endoteliales vasculares, tumores que son susceptibles de experimentar los regímenes de tratamiento anti-Flt4 descritos en el presente documento. Se considera específicamente el tratamiento de carcinomas de mama caracterizados por la expresión de Flt4 en células endoteliales vasculares. Enfermedad neoplásica caracterizada por la expresión de tirosina quinasa Flt4 en células endoteliales vasculares significa una enfermedad en la que el Flt4 es identificable en la vasculatura sanguínea en un nivel muy superior a los niveles indetectables o apenas detectables observados normalmente en la vasculatura sanguínea de tejido sano, tal como se ejemplifica en el presente documento.

Las cantidades terapéuticamente eficaces de compuestos se determinan empíricamente usando ensayos reconocidos en la técnica de dosis crecientes y de respuesta a la dosis. Con terapéuticamente eficaz para el tratamiento de tumores se quiere decir una cantidad eficaz para reducir el crecimiento del tumor, o una cantidad eficaz para detener el crecimiento del tumor, o una cantidad eficaz para encoger o eliminar tumores en conjunto, sin niveles inaceptables de efectos secundarios para pacientes sometidos a terapia contra el cáncer. Cuando el compuesto comprende un anticuerpo u otro polipéptido, se consideran específicamente dosis del orden de 0,1 a 100 mg de anticuerpo por kilogramo de peso corporal, y más preferentemente de 1 a 10 mg/kg. Para anticuerpos humanizados, que muestran habitualmente una semivida en circulación larga, se consideran dosis en intervalos que varían desde diariamente a cada dos meses, y más preferentemente cada semana o cada dos semanas, o cada tres semanas. El seguimiento de la progresión de la terapia, los efectos secundarios en el paciente y los niveles de anticuerpo en circulación proporcionará una guía adicional para un régimen de dosificación óptimo. Los datos de ensayos clínicos publicados y en curso para otros tratamientos de cáncer basados en anticuerpos (por ejemplo, anti-HER2, receptor anti-EGF) también proporcionan una guía útil del régimen de dosificación.

Para medicamentos, composiciones y kits que se describen en el presente documento, los compuestos preferentes incluyen polipéptidos que comprenden un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti-Flt4 y polipéptidos que comprenden un fragmento del dominio extracelular de Flt4 soluble. Son muy preferentes los anticuerpos anti-Flt4 humanos o humanizados.

Una ventaja esperada de los medicamentos y composiciones de la presente invención se basa en el hecho de que el Flt4 no se expresa normalmente en niveles significativos en la vasculatura sanguínea de tejidos sanos. En una realización muy preferente, el compuesto terapéutico comprende un anticuerpo biespecífico, o un fragmento del mismo, en la que el anticuerpo o fragmento se une específicamente a Flt4 y se une específicamente a un antígeno marcador endotelial vascular sanguíneo. Con “antígeno marcador endotelial vascular sanguíneo” se quiere decir cualquier antígeno de superficie celular que se expresa en células endoteliales vasculares proliferantes y, preferentemente, que no se expresa en células endoteliales linfáticas. Los ejemplos de marcadores endoteliales vasculares sanguíneos incluyen PAL-E [deWaal y col.., Am. J. Pathol., 150:1951-1957 (1994)], VEGFR-1 y VEGFR-2 [Ferrara y col., Endocrine Reviews, 18: 4-25 (1997], Tie [Partanen y col., Mol. Cell Biol. 12: 1698-1707 (1999)], endoglina [documento de patente de Estados Unidos 5.776.427] y Factor de von Willebrand. Se espera que dichos anticuerpos biespecíficos se ubiquen en la vasculatura asociada al tumor que expresa tanto Flt4 como el marcador endotelial vascular sanguíneo. En una realización muy preferente, el compuesto comprende además un antineoplásico o un agente citotóxico conjugado con el anticuerpo biespecífico, con el fin de destruir células tumorales y/o destruir el suministro de vasculatura a las células tumorales. Los ejemplos de agentes incluyen los descritos anteriormente y también proteínas terapéuticas, tales como estatinas, citocinas, quimiocinas y similares, para estimular una respuesta inmunitaria al tumor en el huésped.

En una realización alternativa, el compuesto comprende un anticuerpo (o anticuerpo biespecífico) que reconoce un epítopo (o epítopos) compuesto por un complejo Flt4/ligando de Flt4 (por ejemplo, un complejo compuesto por Flt4 unido a VEGF-C o VEGF-D).

Se considera además que el compuesto terapéutico se conjugará o coadministrará con agentes de amplio espectro que tengan potencial para inhibir factores angiogénicos. Dichos agentes incluyen, por ejemplo, fármacos de unión a heparina (tales como análogos de pentosán o surimina) que pueden inhibir factores angiogénicos que se unen a heparina; y agentes químicos que bloquean el crecimiento y la migración de células endoteliales, tales como análogos de fumagilina.

También se considera la conjugación del compuesto anti-Flt4 con un profármaco que puede dirigirse a los vasos del tumor mediante el compuesto anti-Flt4 y después activarse (por ejemplo, por radiación) localmente en el sitio del crecimiento del tumor. El uso de dicha estrategia de profármacos tiene la ventaja esperada de minimizar los efectos secundarios del fármaco sobre los vasos linfáticos sanos que expresan Flt4.

De manera similar, la invención se refiere a un procedimiento para tratar un organismo mamífero que padece de una enfermedad neoplásica caracterizada por la expresión de tirosina quinasa Flt4 (Flt4) en células endoteliales vasculares, que comprende las etapas de: Identificar un organismo mamífero que padece un estado patológico neoplásico caracterizado por la expresión de Flt4 en células endoteliales vasculares y administrar al organismo mamífero con necesidad de dicho tratamiento una composición, comprendiendo la composición un compuesto eficaz para inhibir la unión de una proteína ligando de Flt4 a Flt4 expresado en células endoteliales vasculares del organismo, inhibiendo, por lo tanto, la proliferación mediada por Flt4 de las células endoteliales vasculares.

La invención también se refiere a un procedimiento para analizar la presencia de proteína de receptor tirosina quinasa Flt4 (Flt4) en una muestra biológica, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto una muestra biológica que se sospecha que contiene Flt4 con una composición que comprende un compuesto de unión a Flt4; (b) lavar la muestra biológica en condiciones que eliminarán el compuesto de unión a Flt4 que no está unido a Flt4 en la muestra y (c) analizar la presencia en la muestra de Flt4 detectando el compuesto de unión a Flt4 unido al receptor tirosina quinasa Flt4 en la muestra después de la etapa de lavado. Preferentemente, el compuesto comprende un polipéptido seleccionado de entre el grupo constituido por (a) un polipéptido que comprende un ligando de Flt4 o un fragmento de unión a Flt4 o un anticuerpo anti-Flt4 y (b) un polipéptido que comprende un ligando de Flt4 o un fragmento de unión a Flt4 o un análogo del mismo. Son muy preferentes los anticuerpos que se unen específicamente a Flt4 y que además comprenden una etiqueta detectable.

La invención también se refiere a un procedimiento para obtener imágenes de tejido de vertebrado que se sospecha que contiene células que expresan proteína del receptor tirosina quinasa Flt4 (Flt4), que comprende las etapas de (a) poner en contacto tejido de vertebrado con una composición que comprende un compuesto de unión a Flt4 y (b) obtener imágenes del tejido detectando el compuesto de unión a Flt4 unido al tejido. Preferentemente, el tejido es tejido humano, y el procedimiento comprende además la etapa de lavar el tejido, después de la etapa de puesta en contacto y antes de la etapa de obtención de imágenes, en condiciones que eliminan del tejido el compuesto Flt4 que no se ha unido a Flt4 en el tejido.

En una variación relacionada, la invención se refiere a un procedimiento para obtener imágenes de tumores en tejido procedente de un organismo vertebrado, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto tejido de vertebrado sospechoso de contener un tumor con una composición que comprende un compuesto de unión a Flt4; (b) detectar el compuesto de unión a Flt4 unido a células en dicho tejido; y (c) obtener imágenes de tumores sólidos identificando células endoteliales de vasos sanguíneos unidas mediante el compuesto de unión a Flt4, en el que los vasos sanguíneos que expresan Flt4 se correlacionan con la presencia y ubicación de un tumor en el tejido. En una realización preferente, el procedimiento comprende además etapas de poner en contacto el tejido con un segundo compuesto (tal como un anticuerpo) que se une específicamente a un marcador endotelial de vasos sanguíneos (por ejemplo, PAL-E, VEGFR-1, VEGFR-2) que está sustancialmente ausente del endotelio linfático; y detectar el segundo compuesto unido a células del tejido; en el que la etapa de obtención de imágenes comprende identificar vasos sanguíneos etiquetados tanto con el compuesto de unión a Flt4 como con el segundo compuesto, y en el que los vasos sanguíneos etiquetados tanto con el compuesto de unión a Flt4 como con el segundo compuesto se correlacionan con la presencia y ubicación de un tumor en el tejido. Se apreciará que el uso del segundo compuesto ayuda al facultativo a distinguir más rápidamente entre vasos sanguíneos que están expresando Flt4 y vasos linfáticos normales que expresan Flt4 en su superficie.

La invención también se refiere a un procedimiento para analizar un estado patológico neoplásico que comprende las etapas de (a) poner en contacto tejido de un organismo mamífero sospechoso de tener un estado patológico neoplásico con una composición que comprende un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une específicamente al receptor tirosina quinasa Flt4; (b) detectar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo unido a células del organismo mamífero, y (c) analizar la enfermedad neoplásica a partir de la cantidad o distribución del anticuerpo unido a células del organismo mamífero. Tal como se describe en el presente documento, el Flt4 (que habitualmente es no detectable o apenas detectable en la vasculatura sanguínea) está muy tintado en la vasculatura sanguínea de al menos algunos tumores. De este modo, en una realización, en la etapa de análisis, la detección del anticuerpo

o fragmento de anticuerpo unido a células endoteliales de vasos sanguíneos se correlaciona con la presencia de una enfermedad neoplásica. En este procedimiento, se entenderá que “detección” significa detección a un nivel significativamente superior a los niveles apenas detectables o no detectables que tendrían lugar en tejidos normales (sanos) correspondientes, tal como se describe en el presente documento. Dicha expresión diferencial puede confirmarse mediante comparación con un control realizada con tejido de un organismo sano. Se considera el análisis de tejido mamario para neoplasmas. Tal como se ha descrito anteriormente, la puesta en práctica de dichos procedimientos puede facilitarse, además, exponiendo la muestra de tejido a un segundo compuesto que se une específicamente a un marcador endotelial de vasos sanguíneos, en los que la etapa de detección comprende la detección de dicho primer y dicho segundo compuesto unido a células endoteliales neovasculares.

Los diversos compuestos descritos para su uso en la presente invención incluyen los anticuerpos anti-Flt4 y anticuerpos biespecíficos descritos anteriormente, por ejemplo. Asimismo, puede usarse cualquiera de los compuestos descritos en el presente documento (solos o en combinación) para la fabricación de un medicamento o composición para propósitos terapéuticos o diagnósticos o de obtención de imágenes descritos en el presente documento. El medicamento o composición puede comprender, además, diluyentes, coadyuvantes, vehículos o similares farmacéuticamente aceptables.

De modo similar, la invención incluye kits que comprenden compuestos o composiciones de la invención envasados de un modo que facilita su uso para realizar procedimientos para detectar células endoteliales neovasculares en un mamífero. En la realización más sencilla, tal kit incluye un compuesto o composición de la invención envasado en un recipiente tal como una botella o frasco sellado, con una etiqueta adjunta al recipiente o incluida en el envase que describe el uso del compuesto o composición para llevar a cabo el procedimiento. Preferentemente, el compuesto o composición está empaquetado en una forma de dosificación unidad. En otra realización, un kit de la invención incluye un compuesto de unión a Flt4 envasado junto con un segundo compuesto que se une a un marcador (antígeno) que se expresa en la superficie de células endoteliales de vasos sanguíneos pero está sustancialmente ausente del endotelio linfático.

FIG. 1A: es una representación fotográfica esquemática de la estructura de clones de ADNc de Flt4;

FIG. 1B: es una reproducción de un gel de hibridación de Norther;

FIGS. 2A-F: presentan una representación esquemática de características estructurales de Flt4 y una comparación con la secuencia de tirosina quinasa Flt4;

FIG. 3A: es una representación esquemática de los extremos 3' de insertos de ADNc de clones J.1.1 e I.1.1.;

FIG. 3B: es una reproducción fotográfica de autorradiogramas de hibridaciones con sonda de ARN antisentido y las formas larga y corta de ARN de Flt4;

FIG. 3C: es una reproducción fotográfica de autorradiogramas de hibridaciones con sonda de ARN antisentido y las formas larga y corta de ARN de Ftl4;

FIG. 4: es una reproducción fotográfica de un gel que ilustra un análisis de hibridación de secuencias de Flt4 en muestras de ADN de diferentes especies;

FIGS. 5A-5H: representan la caracterización inmunohistoquímica de vasos que expresan VEGFR-3 en carcinoma intraductal. En secciones adyacentes (FIGS. 5A, B), VEGFR3 y PAL-E decoran un patrón similar de vasos “collar” (cabezas de flechas) alrededor del conducto con presencia de células de carcinoma. Otro conjunto de secciones adyacentes se comparó con tinción para VEGFR-3 (FIG. 5C), laminina (FIG. 5D), colágeno XVIII (FIG. 5E) y SMA (FIG. 5F). Doble tinción para PAL-E y VEGFR-3 (FIG. 5G) y comparación con sección adyacente tintada sólo para VEGFR-3 (FIG. 5H). Los vasos adyacentes a los conductos afectados son doble positivos (cabezas de flechas), mientras que un vaso positivo a VEGFR-3 se presenta a corta distancia separado del conducto afectado del estroma interductal (flechas). Nótese que la lámina basal es positiva para PAL-E en el procedimiento de tinción doble. Magnificaciones: FIGS. 5A, B 400 x. FIGS. 5C, D, E, F 320 x. FIGS. 5E, F 480 x.

La clonación, secuenciación y expresión de un receptor tirosina quinasa novedoso, denominado Flt4, se describe a continuación. El gen Flt4 mapea la región cromosómica 5q35, en la que están ubicados muchos factores de crecimiento y receptores de factores de crecimiento. El dominio extracelular de Flt4 está constituido por siete bucles similares a inmunoglobulina que incluyen doce sitios potenciales de fosforilación. Sobre la base de similaridades estructurales, el Flt4 y el Flt1 conocido previamente y los receptores KDR/FLK1 pueden constituir una subfamilia de tirosina quinasas de clase III. El gen Flt4 se expresa como ARNm de 5,8 kb y 4,5 kb, que se encontró que difieren en sus secuencias 3' y se expresan diferencialmente en células de leucemia HEL y DAMI.

Una línea de células tumorales de Wilm, una línea celular de retinoblastomas y una línea celular de teratocarcinomas no diferenciada expresaron Flt4, mientras que células de teratocarcinomas diferenciada fueron negativas. La mayor parte de tejidos fetales también expresaron el ARNm de Flt4; el bazo, zonas intermedias de cerebro y los pulmones mostraron los mayores niveles. En tejidos adultos humanos los máximos niveles de expresión se encontraron en placenta, pulmón, riñón, corazón e hígado, en orden decreciente de expresión. En la hibridación in situ, los granos autorradiográficos decoraron células endoteliales de pulmón fetal. La tinción inmunohistoquímica de Flt4 en tejidos fetales confirmó la tinción de las células endoteliales. El patrón de expresión de Flt4 en comparación con Flt1 y KDR difiere en gran medida en tejidos de fetos humanos de 18 semanas. Véase Kaipainen y col., J. Exp. Med, 178:2077 (1993).

Los vectores de expresión que contienen ADNc de Flt4 se han producido y expresado en células COS y NIH3T3, tal como se describe en los ejemplos 4 y 11.

Los ADN de Flt4 y polipéptidos de la invención pueden usarse en la purificación del ligando de Flt4 y en la regulación del crecimiento y la diferenciación de células endoteliales en varios órganos. También pueden probar su validez en el diagnóstico/tratamiento de determinadas enfermedades.

En la descripción siguiente, se usa una serie de términos que se utilizan ampliamente en tecnología de ADN recombinante (ADNr). Las definiciones siguientes se proporcionan con el fin de proporcionar un entendimiento claro y consistente de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, incluido el alcance que se da a dichos términos.

Gen. Una secuencia de ADN que contiene una plantilla para una ARN polimerasa. El ARN transcrito a partir de un gen puede o no puede codificar una proteína. El ARN que codifica una proteína se denomina ARN mensajero (ARNm) y, en eucariotas, es transcrito por la ARN polimerasa II. No obstante, también se conoce la construcción de un gen que contiene una plantilla de ARN polimerasa II en la que se transcribe una secuencia de ARN que tiene una secuencia complementaria a la de un ARNm específico pero normalmente no se traduce. Dicha construcción génica se denomina en el presente documento un “gen de ARN antisentido" y dicho transcrito de ARN se denomina un “ARN antisentido”. Los ARN antisentido no son normalmente traducibles debido a la presencia de codones finalizadores de la traducción en la secuencia de ARN antisentido.

Un gen de “ADN complementario” o “ADNc” incluye genes recombinantes sintetizados por transcripción inversa de ARNm que carece de secuencias interpuestas (intrones).

Vehículo de clonación. Un ADN de plásmido o fago u otra secuencia de ADN que sea capaz de replicar autónomamente en una célula huésped, y que se caracteriza por un sitio o un pequeño número de sitios de reconocimiento de endonucleasa en los que dichas secuencias de ADN pueden escindirse de una forma determinada sin pérdida de una función biológica esencial del vehículo y en las que puede ayustarse ADN con el fin de provocar su replicación y clonación. El vehículo de clonacion puede contener además un marcador adecuado para usar en la identificación de células transformadas con el vehículo de clonación. Marcadores, por ejemplo, son de resistencia a tetraciclina o de resistencia a ampicilina. La palabra “vector" se usa algunas veces por "vehículo de clonación".

Vector de expresión. Un vehículo o vector similar a un vehículo de clonación y que es capaz de expresar un gen que ha sido clonado en él, después de transformación en un huésped. El gen clonado se sitúa generalmente bajo el control de (es decir, se une operablemente a) determinadas secuencias de control tales como secuencias promotoras. Las secuencias de control de expresión varían dependiendo de si el vector se designa para expresar el gen unido operablemente en un huésped procariota o eucariota y pueden contener adicionalmente elementos transcripcionales tales como elementos potenciadores, secuencias de terminación, elementos específicos de tejidos y/o sitios traduccionales de iniciación y terminación.

La presente invención se refiere a ambos, expresión de proteínas Flt4 recombinantes (formas corta y larga) y a los derivados funcionales de estas proteínas.

Derivado funcional. Un “derivado funcional” de proteínas Flt4 es una proteína que posee una actividad biológica (bien funcional o bien estructural) que es sustancialmente similar a una actividad biológica de proteínas Flt4 no recombinantes. Un derivado funcional de la proteína Flt4 puede o no contener modificaciones postraduccionales tales como carbohidrato unido covalentemente, dependiendo de la necesidad de dichas modificaciones para la realización de una función específica. El término “derivado funcional” se pretende que incluya los “fragmentos”, “variantes”, “análogos” y “derivados químicos” de una molécula.

Tal como se usa en el presente documento, se dice que una molécula es un "derivado químico" de otra molécula si contiene restos químicos adicionales que normalmente no forman parte de la molécula. Dichos restos pueden mejorar la solubilidad, absorción, semivida biológica de la molécula. Los restos pueden disminuir alternativamente la toxicidad de la molécula y eliminar o atenuar cualquier efecto secundario no deseado de la molécula, etc. Restos capaces de mediar tales efectos se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences (1980). Los procedimientos para acoplar dichos restos a una molécula son bien conocidos en la técnica.

Fragmento. Un "fragmento" de una molécula tal como una proteína de Flt4 se pretende que se refiera a cualquier porción de la molécula, tal como un núcleo peptídico o una variante del núcleo peptídico.

Variante. Una "variante" de una molécula tal como una proteína Flt4 se pretende que se refiera a una molécula sustancialmente similar en estructura y actividad biológica bien a la molécula entera o bien a un fragmento de la misma. De este modo, dado que dos moléculas poseen una actividad similar, se consideran variantes, tal como se usa este término en el presente documento, si la composición o la estructura secundaria, terciaria o cuaternaria de una de las moléculas no es idéntica a la encontrada en la otra, o si la secuencia de restos de aminoácidos no es idéntica.

Análogo. Un "análogo" de una proteína o secuencia genética de Flt4 se pretende que se refiera a una proteína o secuencia genética sustancialmente similar en función a la proteína o secuencia genética de Flt4 en el presente documento.

La presente invención se refiere a lo que los solicitantes han denominado "Flt4", un receptor para tirosina quinasa, moléculas de ácido nucleico que codifican Flt4 (por ejemplo ADNc, ADN genómico, ARN, ARn antisentido, etc.), la producción de péptidos Flt4 o proteínas Flt4 a partir de secuencias génicas de Flt4 y sus productos, vectores de expresión de Flt4 recombinantes, análogos y derivados de Flt4 y usos diagnósticos y terapéuticos de Flt4 y proteínas relacionadas, ligandos de Flt4, antagonistas de Flt4 y anticuerpos anti-Flt4.

El Flt4 biológicamente activo puede producirse mediante la clonación y la expresión de la secuencia que codifica Flt4 o su equivalente funcional en una célula huésped adecuada.

La producción de Flt4 usando tecnología de ADN recombinante puede dividirse en un procedimiento de etapas para el propósito de la descripción: (1) aislar o generar la secuencia codificante (gen) para el Flt4 deseado; (2) construir un vector de expresión capaz de dirigir la síntesis del Flt4 deseado; (3) transfectar o transformar células huésped apropiadas capaces de replicar o expresar el gen Flt4 y/o procesar el producto génico para producir el Flt4 deseado; y

(4) identificar y purificar el producto Flt4 deseado.

La secuencia codificante de nucleótidos de Flt4 o equivalentes funcionales de la misma, puede usarse para la construcción de vectores de expresión recombinantes que dirigirán la expresión del producto Flt4 deseado. En la puesta en práctica del procedimiento de la invención, la secuencia de nucleótidos descrita en la misma, o fragmentos o equivalentes funcionales de la misma, puede usarse para generar las moléculas recombinantes que dirigirán la expresión del producto Flt4 recombinante en células huésped apropiadas. Las secuencias de nucleótidos que codifican Flt4 pueden obtenerse a partir de una variedad de fuentes celulares que producen actividades similares a Flt4 y/o que expresan ARNm que codifica Flt4. Los solicitantes han identificado una serie de fuentes celulares humanas adecuadas para Flt4, incluidas células de leucemia de placenta humanas y algunas líneas celulares tumorales.

La secuencia que codifica Flt4 puede obtenerse clonando ADNc a partir de ARN aislado y purificado a partir de dichas fuentes celulares o mediante clonación genómica. La secuencia de Flt4 puede, por ejemplo, amplificarse mediante la reacción en cadena de la polimerasa a partir de ADNc o material de ADN genómico usando técnicas bien conocidas en la técnica. Puede prepararse tanto ADNc como colecciones genómicas de clones usando técnicas bien conocidas en la técnica y pueden analizarse para ADN de Flt4 particulares con sondas de nucleótidos que son sustancialmente complementarios a cualquier porción del gen Flt4. Pueden seleccionarse clones de longitud completa, es decir, los que contienen la totalidad de la región codificante del Flt4 deseado para la construcción de vectores de expresión. Alternativamente, pueden sintetizarse ADN que codifican Flt4 en su totalidad o en parte mediante síntesis química usando técnicas estándar de la técnica. Debido a la degeneración inherente de secuencias que codifican nucleótidos, pueden usarse en la puesta en práctica del procedimiento de la invención otras secuencias de ADN que codifican sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos o una secuencia de aminoácidos funcionalmente equivalente. Tales alteraciones de secuencias de nucleótidos de Flt4 incluyen deleciones, adiciones o sustituciones de nucleótidos diferentes que dan como resultado una secuencia que codifica el mismo producto génico o un producto génico funcionalmente equivalente. El producto génico puede contener deleciones, adiciones o sustituciones de restos de aminoácidos dentro de la secuencia que da como resultado cambios silenciosos, produciendo de este modo un producto bioactivo. Dichas sustituciones de aminoácidos pueden realizarse sobre la base de similaridad en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los restos implicados. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; los aminoácidos con grupos de cabeza polar no cargada o grupos de cabeza no polar que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen los siguientes: leucina, isoleucina, valina; glicina, alanina; asparagina, glutamina; serina, treonina; fenilalanina, tirosina.

Usando esta información, se proporcionan una variedad de vectores de ADN recombinante capaces de proporcionar el receptor tirosina quinasa Flt4 en cantidades razonables. Pueden producirse vectores de ADN recombinante adicionales de estructura relacionada que codifican proteínas sintéticas que tienen las características estructurales clave identificadas en el presente documento, así como proteínas de la misma familia de otras fuentes a partir de ADN del receptor tirosina quinasa Flt4 usando técnicas estándar de tecnología recombinante. Se ha producido un transformante que expresa el receptor tirosina quinasa Flt4 como ejemplo de esta tecnología (véanse los EJEMPLOS 3 y 4). Puede usarse la secuencia recién descubierta y la información estructural, a través de la transfección de células eucariotas, para preparar el receptor tirosina quinasa Flt4 y sus diversos dominios para propósitos biológicos.

Las células huésped que contienen la secuencia codificante recombinante y que expresan el producto maduro biológicamente activo pueden identificarse mediante al menos cuatro enfoques generales: (a) hibridación ADN-ADN, ADN-ARN o ARN-ARN antisentido; (b) la presencia o ausencia de funciones génicas “marcadoras”; (c) evaluando el nivel de transcripción medido por la expresión de transcritos de ARNm de Flt4 en la célula huésped; y

(d) detección del producto génico maduro medido por inmunoensayo y, en última instancia, por sus actividades biológicas.

En el primer enfoque, la presencia de secuencias codificantes de Flt4 insertadas en vectores de expresión puede detectarse por hibridación ADN-ADN usando sondas que comprenden secuencias de nucleótidos que son homólogas a la secuencia de codificación de Flt4.

En el segundo enfoque, el sistema vector/huésped de expresión recombinante puede identificarse y seleccionarse sobre la base de la presencia o ausencia de ciertas funciones génicas "marcadoras" (por ejemplo, actividad de timidina quinasa, resistencia a antibióticos, resistencia a metotrecato, fenotipo de transformación, formación de cuerpo de oclusión en baculovirus, etc.). Por ejemplo, si la secuencia codificante de Flt4 está insertada en una secuencia génica marcadora del vector, los recombinantes que contienen esa secuencia codificante pueden identificarse por la ausencia de la función génica marcadora. Alternativamente, un gen marcador puede situarse en tándem con la secuencia de Flt4 bajo del control de los mismos promotores o diferentes usados para controlar la expresión de la secuencia codificante de Flt4. La expresión del marcador en respuesta a inducción o selección indica la expresión de la secuencia codificante de Flt4.

En un tercer enfoque, la actividad transcripcional para la región codificante de Flt4 puede evaluarse mediante ensayos de hibridación. Por ejemplo, puede aislarse ARN poliadenilatado y analizarse mediante inmunotransferencia (Northern) usando una sonda homóloga a la secuencia codificante de Flt4 o porciones particulares de la misma. Alternativamente, pueden extraerse los ácidos nucleicos totales de la célula huésped y evaluarse para la hibridación de dichas sondas.

En un cuarto enfoque, la expresión de Flt4 puede evaluarse inmunológicamente, por ejemplo mediante inmunotransferencia (Western), inmunoanálisis tales como radioinmunoprecipitación , inmunoanálisis ligado a enzimas y similares. El último ensayo de los sucesos del sistema de expresión, no obstante, implica la detección de la actividad biológica del producto génico Flt4. Cuando la célula huésped segrega el producto génico, puede analizarse la actividad de Flt4 de los medios carentes de células obtenidos a partir de la célula huésped transfectante cultivada. Cuando el producto génico no se segrega, puede evaluarse dicha actividad en lisados celulares. En ambos casos, pueden usarse ensayos que miden la unión de ligando a Flt4 u otras actividades biológicas de Flt4.

También se contempla la producción y el uso de derivados, análogos y péptidos relaciones con el Flt4. Dichos derivados, análogos o péptidos pueden tener actividades biológicas mejoradas o disminuidas en comparación con el Flt4 nativo, dependiendo de su aplicación particular. Pueden producirse derivados, análogos y péptidos de la invención relativos a Flt4 mediante una variedad de medios conocidos en la técnica. Los procedimientos y manipulaciones en niveles genéticos y proteicos están dentro del alcance de la invención. La síntesis de péptidos, que es estándar en la técnica, puede usarse para obtener péptidos de Flt4. En el nivel proteico, pueden usarse numerosas modificaciones químicas para producir derivados, análogos o péptidos similares a Flt4 mediante técnicas conocidas en la técnica, incluidas, pero no limitadas a, escisión química específica por endopeptidasas (por ejemplo bromuros cianógenos, tripsina, quimiotripsina, proteasa V8 y similares) o exopeptidasas, acetilación, formilación, oxidación, etc.

Los derivados, análogos y péptidos preferentes son los que retienen la actividad de unión al ligando de Flt4. Los derivados, análogos y péptidos que se unen al ligando de Flt4 pero no transducen una señal en repuesta a ello son útiles como inhibidores de Flt4. Los derivados, análogos y péptidos que se unen al ligando de Flt4 y transducen una señal en repuesta a ello, por ejemplo, a través de un proceso que implica la autofosforilación de Flt4 intracelular, son útiles del mismo modo que el Flt4 nativo. Un ligando de Flt4 preferente para su uso en dichos ensayos de unión y/o fosforilación es un ligando que comprende un polipéptido de aproximadamente 23 kd que es aislable a partir de medio acondicionado con PC-3 tal como se describe en el presente documento. Este ligando, denominado factor de crecimiento endotelial vascular C (VEGF-C), ha sido caracterizado en detalle en la solicitud de patente PCT/F196/00427, presentada el 1 de agosto de1996, y publicada como publicación internacional WO 97/05250, y en los documentos de prioridad de la solicitud de patente de Estados Unidos que dependen de la misma por prioridad.

La invención también se refiere a la producción de anticuerpos policlonales y monoclonales que reconocen Flt4 de proteínas giradas.

Pueden usarse varios procedimientos conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos monoclonales de epítopos de Flt4. Para la producción de anticuerpos, pueden inmunizarse mediante inyección con Flt4 o un péptido Flt4 sintético varios animales huéspedes (incluidos, pero no limitados a, conejos, ratones, ratas, etc.). Pueden usarse varios coadyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de las especies huéspedes, e incluyen, pero no están limitados a, coadyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, emulsiones de aceite, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol y coadyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.

Puede prepararse un anticuerpo monoclonal para un epítopo de Flt4 usando una técnica que proporciona la producción de moléculas de anticuerpos mediante líneas celulares continuas en cultivo. Éstas incluyen, pero no están limitadas a, la técnica de hidridoma descrita originariamente por Kohler y col., Nature, 256:495-497 (1975), y la técnica más reciente de hibridoma de linfocitos B humanos [Kosbor y col., Immunology Today. 4: 72 (1983)] y la técnica de hibridoma EBV [Cole y col., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy. Alan R Liss, Inc., páginas 77-96 (1985)]. También pueden producirse anticuerpos contra Flt4 en bacterias a partir de ADNc de inmunoglobulinas clonados. Con el uso del sistema de anticuerpos de fagos recombinantes puede posibilitarse la producción de selección de anticuerpos en cultivos bacterianos y manipularse genéticamente su estructura.

Pueden generarse fragmentos de anticuerpos que contienen el idiotipo de la molécula mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, dichos fragmentos incluyen, pero no están limitados

a: el fragmento F(ab')2 que puede producirse por digestión de pepsina de la molécula de anticuerpo; el fragmento Fab' que puede generarse reduciendo los puentes disulfuro del fragmento F(ab')2, y los dos framentos Fab pueden generarse tratando la molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor.

Pueden usarse anticuerpos de Flt4 en la detección cualitativa y cuantitativa de Flt4 maduro y precursor y formas subcomponentes de Flt4, en la purificación de afinidad de polipéptidos de Flt4 y en la elucidación de la biosíntesis, el metabolismo y la función de Flt4. La detección de la actividad de tirosina quinasa Flt4 puede usarse como medio enzimático para la generación y amplificación de una señal específica de Flt4 en dichos ensayos. También pueden ser útiles anticuerpos de Flt4 como agentes diagnósticos y terapéuticos.

Los solicitantes contemplan una amplia variedad de usos para las composiciones de la presente invención, incluidos usos diagnósticos y/o terapéuticos de Flt4, análogos y derivados de Flt4, moléculas de ácidos nucleicos que codifican Flt4, moléculas de ácidos nucleicos antisentido y anticuerpos anti-Flt4.

Pueden usarse moléculas de ácidos nucleicos o fragmentos de las mismas que codifican Flt4 como sondas para detectar y cuantificar ARNm que codifican Flt4. Los ensayos que utilizan sondas de ácidos nucleicos para detectar secuencias que comprenden la totalidad

o parte de una secuencia génica conocida son bien conocidas en la técnica. Los niveles de ARNm de Flt4 pueden indicar la emergencia y/o la existencia de neoplasias, así como la aparición y/o progresión de otras enfermedades humanas. Por lo tanto, los ensayos que pueden detectar y cuantificar ARNm de Flt4 pueden proporcionar un diagnóstico valioso.

Las moléculas de ARN de Flt4 antisentido son útiles terapéuticamente para inhibir la traducción de ARNm que codifica Flt4 donde el objetivo terapéutico implica un deseo de eliminar la presencia de Flt4 o de regular a la baja sus niveles. El ARN antisentido de Flt4, por ejemplo, puede ser útil como agente antagonizante de Flt4 en el tratamiento de enfermedades en las que se ve implicado el Flt4 como agente causativo, por ejemplo debido a su sobreexpresión.

Adicionalmente, los ARN antisentido de Flt4 son útiles en la elucidación de mecanismos funcionales de Flt4. Pueden usarse moléculas de ácidos nucleicos que codifican Flt4 para la producción de proteínas de Flt4 recombinantes como se trata aparte en la presente aplicación.

Pueden usarse anticuerpos anti-Flt4 para diagnóstico y cuantificación de Flt4 en diversos contextos. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos contra varios dominios de Flt4 como base para ensayos inmunitarios o evaluaciones inmunohistoquímicas de Flt4. La actividad de tirosina quinasa de Flt4 puede ser útil en estos ensayos como reacción de amplificación enzimática para la generación de una señal de Flt4. También pueden ser útiles anticuerpos anti-Flt4 en estudios sobre la cantidad de Flt4 en superficies celulares.

Pueden producirse anticuerpos que funcionan como agonistas o antagonistas de ligandos de Flt4, con lo que se posibilita la regulación de la actividad de Flt4. Además, pueden producirse péptidos aleatorios por medios sintéticos o por medios recombinantes a partir de oligonucleótidos aleatorios y los que muestren unión específica al receptor Flt4 pueden seleccionarse con la ayuda del dominio extracelular de Flt4. También pueden seleccionarse dichos segmentos peptídicos a partir de colecciones de presentación de fagos usando el dominio extracelular de Flt4, usando procedimientos estándar de la técnica. Dichos péptidos pueden tener actividad agonista o antagonista. Los anticuerpos de Flt4 también pueden proporcionar herramientas de diagnóstico valiosas después de su conjugación con diversos compuestos para obtener imágenes en vivo de células que expresan Flt4 y tejidos o tumores.

Los anticuerpos monoclonales contra Flt4 pueden acoplarse covalente o no covalentemente a agentes supramagnéticos, paramagnéticos, electrón densos, ecogénicos o radioactivos para producir un agente dirigido de obtención de imágenes. El anticuerpo intacto podría sustituirse por fragmentos de anticuerpos generados por proteolisis o tratamientos químicos o las moléculas producidas usando los dominios de unión al epítopo de los anticuerpos monoclonales. Este agente de obtención de imágenes serviría después como reactivo de contraste para rayos X, resonancia magnética, sonografía o escintigrafía del cuerpo humano para propósitos de diagnóstico.

Las secuencias completas de los clones de ADNc de Flt4 se exponen en las SEQ ID Nº: 1 y 3 que constan de 4195 ó 4795 nucleotidos y contienen marcos de lectura abiertos de 1298 ó 1363 aminoácidos, dependiendo del ayuste alternativo. Los nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de Flt4 deducida (forma corta) se muestran en las SEQ ID Nº: 1 y 2. La figura 2 representa una comparación de la secuencia de aminoácidos de Flt4 con la secuencia de aminoácidos de la tirosina quinasa Flt1. Véase Shibuya y col., Oncogene, 5: 519-524 (1990).

Una secuencia peptídica de señal putativa de en su mayor parte aminoácidos hidrófobos sigue al iniciador metionina. La secuencia que rodea la ATG correspondiente está de acuerdo con la secuencia consenso de iniciación de traducción [Kozak, Nucl. Acids Res.,

15: 8125-8135 (1987)]. La porción extracelular predicha de ambos polipéptidos de Flt4 tiene 775 aminoácidos de longitud y contiene doce sitios potenciales para la glucosilación unida a aspargina (NXS/T). También contiene varios restos de aminoácidos que muestran un patrón de espaciamiento descrito para miembros de la superfamilia de proteínas de la inmunoglobulina [Williams y col., Annu. Rev. Immunol., 6: 381-405 (1988)]. Tiene 12 restos de cisteína y pueden organizarse en siete dominios similares a inmunoglobulina. El dominio IV similar a Ig predicho carece de restos de cisteína. La FIG. 2 también muestra el dominio extracelular de Flt1 (SEQ. ID Nº 5), que es el homólogo de Flt4 humano más cercano. A partir de esta figura se puede ver el alineamiento de los restos de cisteína y la composición muy similar de las regiones similares a Ig.

El dominio citoplásmico de Flt4 está separado de la parte extracelular por una región transmembranal putativa de 23 restos de aminoácidos hidrófobos. La secuencia está flanqueada en el lado citoplásmico por una región básica que sugiere la unión entre los dominios transmembranal y citoplásmico. El dominio homólogo de tirosina quinasa comienza en el residuo 843 e incluye un bolsillo de unión a ATP y un sitio de autofosforilación putativo homólogo a Y416 de c-src en Y1068 (FIG. 2). El dominio catalítico de tirosina quinasa de Flt4 se divide en dos subdominios por una secuencia de 65 aminoácidos (aa 944-1008) que es hidrófila en su mayor parte y no muestra homología a Flt1. A diferencia de Flt1, el Flt4 no contiene restos de tirosina en su inserto de quinasa.

Una segunda especie de ARNm de F114 tiene un extremo 3' alternativo que codifica una forma más larga de la proteína de Flt4.

En las FIGS. 3A-C, se ilustra la producción de las formas corta y larga del ARNm de Flt4 mediante ayuste alternativo. La FIG. 3A muestra la estructura esquemática de los extremos 3’ de los insertos de ADNc de clones J.1.1 e I.1.1. Se indican el codón de finalización TAG del clon J.1.1, así como el sitio de poliadenilación (poliA). El clon I.1.1 difiere del clon J.1.1 en el segmento sombreado (las formas larga y corta de ARNm de Flt4, respectivamente). TAA y poliA indican el codón de finalización y el sitio de poliadenilación del clon I.1.1. Además, se han indicado los sitios de escisión de endonucleasa de restricción para EcoRI y Aval. A continuación se muestra el inserto de 256 pb EcoRI-Aval del clon I.1.1. usado para el análisis de protección de ARNc. El segmento sombreado más intensamente indica secuencias del polienlazador en la plantilla de ARN sentido linearizada para la transcripción de la cadena antisentido in vitro. También se muestran esquemáticamente estructuras de los fragmentos protegidos después del análisis de protección de ARNasa. Las FIGS. 3B y 3C muestran autorradiogramas de la sonda de ARN antisentido de 256 pb etiquetada con 35S y los fragmentos digeridos de 211 y 124 pb que representan las formas larga y corta del ARN de Flt4 cuando se protegen por ARN poliadenilado a partir de las líneas celulares indicadas (Tera-2 es una línea celular de teratocarcinoma que se ha analizado aquí con o sin tratamiento con ácido retinoico (RA) durante 10 días). El carril de control (negativo) muestra resultados de protección con ARN de transferencia. Nótese la regulación a la baja de ARN de Flt4 durante la diferenciación de las células Tera-2. Las células Tera-2 del clon 13 se obtuvieron del Dr. C.F.

Graham (Departamento de Zoología, Universidad de Oxford, RU). Se usaron en este estudio células entre los pasajes 18-40. Las células se mantuvieron en medio esencial mínimo de Eagle (MEM) suplementado con suero de carnero fetal al 10 % y antibióticos. Para inducir la diferenciación, las células se plaquearon en discos de grado de cultivo de tejido recubierto con gelatina a una densidad de 1,5 X 103 células/cm2. El día siguiente, se añadió RA 2 x 10-6 M al medio. Las células se cultivaron en presencia de RA durante hasta 10 días.

Los resultados mostrados en las Figuras 3A-C ilustran la generación de los extremos carboxi-terminales de estas formas (corta y larga) de Flt4 generadas por ayuste alternativo.

De acuerdo con su secuencia de aminoácidos deducida, el Flt4 pertenece a los RTK de clase III. Más específicamente, el Flt4 pertenece a una subfamilia de RTK, que contiene siete bucles Ig en su parte extracelular y, de este modo, difiere de otros miembros de RTK de clase III que contienen cinco bucles Ig. El Flt4 es el homólogo más cercano al prototipo receptor de la familia FLT, Flt1, que se clonó como un ADN relacionado con v-ros a partir de una colección de ADN genómico humano [Shibuya y col., Oncogene, 5:519-524 (1990)] y al receptor FLK1 murino, que se clonó a partir de fracciones enriquecidas con células madre hemapoyeticas de hígado de ratón [Matthews y col., Cell, 65: 1143-1152 (1991); Matthews y col., Proc. Natl. Acad Sci. Estados Unidos, 88: 9026-9030 (1991)]. El dominio extracelular de Flt4 muestra el 33 % y el 37 % de identidad de secuencia de aminoácidos con el Flt1 humano y el FLK1 murino, respectivamente. El Flt1 y el FLK1, como el Flt4, se expresan ampliamente en varios tejidos normales, tales como pulmón, corazón y riñón. Además, un receptor tirosina quinasa de células endoteliales humanas identificado recientemente KDR [Terman y col., Oncogene, 6: 1677-1683 (1991)] muestra considerable homología con miembros de la familia Flt4 y Flt1. A partir de datos de secuencia disponibles, puede calcularse que el KDR es un 81 % idéntico a Flt4 en el dominio tirosina quinasa (TK). Además, el dominio extracelular de KDR también tiene una estructura de siete bucles Ig y sus dominios TK1 y TK2 son idénticos en un 95 % y un 97 % a los dominios correspondientes de receptor FLK1 murino. Esto sugiere que el KDR es un homólogo humano del FLK1 murino.

Aunque el dominio TK de Flt4 es aproximadamente un 80 % idéntico a los dominios TK de Flt1 y FLK1/KDR, sólo es aproximadamente un 60 % idéntico a los dominios TK de otros receptores del RTK de clase III . Como estos otros receptores tienen también sólo cinco dominios similares a Ig en la región extracelular, se pueden clasificar Flt4, Flt1 y FLK1/KDR en una subfamilia FLT aparte dentro de los RTK de clase III.

El resto de tirosina localizado en la secuencia D/E-D/E-Y-M/V-P/D/E-M [Cantley y col., Cell, 64:281 -302 (1991)] (SEQ. ID Nº 6) en insertos de quinasa de PDGFR, c-fms y c-kit es un sitio de autofosforilación que, cuando está fosforilado, se une al dominio SH2 de fosfatidiolinositol 3'-quinasa (PI-3K) [Reedijk y col., EMBO J., 11: 1365-1372 (1992)]. Interesantemente, aparte de estos RTK de clase III, los miembros de la subfamilia FLT o del receptor Flt3/FLK2 no contienen dichos motivos de consenso.

Los ocho genes RTK de clase III humanos están agrupados en tres cromosomas diferentes. El cromosoma 4 contiene los genes c-kit, PDGFR-α y KDR [Yarden y col., EMBO J., 6:3341 -3351 (1987); Stenman y col., Genes, Chromosomes, Cancer, 1: 155-158 (1989); Terman y col., Oncogene, 6: 1677-1683 (1991)]. Los genes Flt1 y Flt3 están localizados en el cromosoma 13q12 [Satoh y col., Jpn. J. Cancer Res., 78: 772-775 (1987); Rosnet y col., Genomics, 9: 380-385 (1991)], mientras que el Flt4 está ubicado en el cromosoma 5 banda q35 [Aprelikova y col., Cancer Res., 52: 746-748 (1992)]; cerca de los genes fms y PDGFR-β [Warrington y col., Genomics, 11: 701-708 (1991). El brazo largo del cromosoma 5 está implicado en translocaciones encontradas en células de leucemia. Se encontraron deleciones de parte del brazo largo del cromosoma 5 en células de médula ósea de pacientes con anemia que no responde a tratamiento [Van Den Berghe y col., Nature, 251: 437-439 (1974)]. Un cromosoma anormal 5q se encuentra en unas pocas otras enfermedades mieloproliferativas, tales como anemia que no responde a tratamiento con exceso de blastos [Swolin y col., Blood,

58: 986-993 (1981)], metaplasia mieloide agnógena [Whang-Peng y col., Leuk. Res., 2:41-48 (1978)], leucemia mielógena crónica [Tomiyasu y col., Cancer Genet. Cytogenet., 2: 309-315 (1980)], policitemia vera [Van Den Berghe y col., Cancer Genet. Cytogenet., 1:157-162 (1979)] y trombocitemia esencial [Nowell y col., Cancer, 42: 2254-2260 (1978)].

Los hallazgos de la expresión de ARN de Flt4 sugieren que su producto proteico es característico de determinadas células de leucemia. Se ha demostrado que existen varios antígenos de diferenciación compartidos entre células megacarioblásticas y endoteliales, siendo un ejemplo la glucoproteína de plaquetas IIIa [Ylanne y col., Blood, 72: 1478-1486 (1988); Kieffer y col., Blood, 72: 1209-1215 (1988); Berridge y col., Blood, 66: 76-85 (1985)]. Además, el Flt4 es expresado por determinadas células endoteliales de, por ejemplo, el pulmón y el riñón durante el periodo fetal.

Para entender mejor el papel de Flt4 durante el desarrollo, se clonaron ADN parciales para Dlt4 murino. Usando estas sondas en la hibridación in situ, se analizó la expresión de ARN de Flt4 durante el desarrollo del ratón. Se determinó que el Flt4 se expresa durante la vasculogénesis y la angiogénesis del sistema linfático. La relevancia de estos hallazgos se confirmó también en tejidos adultos humanos normales y patológicos, ya que el Flt4 se encontró en células endoteliales linfáticas de tejidos adultos humanos tanto en condiciones normales como patológicas, así como en algunas vénulas endoteliales altas (HEV).

La clonación de fragmentos de AND de Flt4 murino mostraron que su secuencia de aminoácidos deducida es casi idéntica a la secuencia humana correspondiente (identidad de aminoácidos de aproximadamente un 96 % en ambos segmentos estudiados). Evidencias posteriores para la identidad del ADNc de Flt4 murino se obtuvieron a partir de estudios de hibridación por inmunotransferencia (Northern), en los que las sondas de ambas especies proporcionaron la señal de ARNm de 5,8 kb típica a partir de tejidos de ratón. El análisis de ARN aislado a partir de varios tejidos de ratones adultos mostraron la expresión de Flt4 en el hígado, pulmón, corazón, bazo y riñón, con muy poca o ninguna hibridación en el cerebro y testículos. Este patrón es similar al patrón comunicado anteriormente por Galland y col., Oncogene, 8: 1233 (1993). Los resultados de la protección de RNasa sugieren que el gen Flt4 se necesario durante el desarrollo del ratón, comenzando por embriones de 8,5 días p.c., y los niveles de expresión relativa parecieron bastante estables.

Para la hibridación in situ, se seleccionaron dos fragmentos de ADNc de Flt4 de ratón con secuencias de codificación del dominio extracelular. Esto permitió una clara distinción de los patrones de hibridación a partir de FLK-1 relacionado y patrones del receptor Flt1, que muestra sólo un grado muy bajo de identidad de secuencia con Flt4 en la región extracelular. Véase Millauer y col., Cell, 72: 835 (1993); Yamaguchi y col., Development, 118:489 (1993); Peters y col., Proc. Natl. Acad Sci. Estados Unidos, 90: 8915 (1993); Finnerty y col., Oncogene, 8:: 2293 (1993).

El Fit4, similar a los genes del receptor tirosina quinasa FLK-1, Fit1, Tie y Tek endoteliales, no se había expresado en los embriones de 7,5 días poscoito (p.c.). En el embrión de 8,5 días p.c., las señales de Flt4 más fuertes se localizaron en el alantoides, los angioblastos del mesénquima de la cabeza, la aorta dorsal y la vena cardinal. Las señales débiles se observaron en el endocardio. En contraste, los angioblastos del saco de la yema fueron negativos, a diferencia de para FLK-1 y Fit1, Tie y Tek. Véase Korhonen y col., Oncogene, 8: 395 (1993); y Peters y col., Proc. Natl. Acad Sci. Estados Unidos, 90: 8915 (1993). La restricción de la expresión de Flt4 al sistema venoso fue incluso más clara en muestras de embriones de ratón de 11,5 días, en las que el ARN de Tie se expresó también en arterias. En embriones de 12,5 días p.c., la señal de Fit4 decoró el endotelio venoso y linfático presunto en desarrollo, pero a diferencia de para el receptor tirosina quinasa Tie endotelial, el endotelio arterial fue negativo. Durante estadios posteriores del desarrollo, el ARNm de Dlt4 se restringió a plexos vasculares desprovistos de células sanguíneas, que representan vasos linfáticos en desarrollo. Sólo el endotelio linfático y algunas vénulas endoteliales altas expresaron ARNm de Flt4 en tejidos humanos adultos. La expresión aumentada tuvo lugar en senos linfáticos y vénulas endoteliales altas, en ganglios linfáticos metastáticos y en linfangioma.

Debido a dificultades en la interpretación de datos a partir de embriones de ratón, se estudiaron endotelios humanos, debido a que el sistema linfático está mucho mejor definido en humanos. Además, se pudieron estudiar células establecidas a partir de diversos endotelios en cultivos celulares para ver si la especificidad de la expresión de Flt4 persiste en condiciones in vitro. Las líneas celulares endoteliales son conocidas por perder características de diferenciación sobre el cultivo in vitro. Por lo tanto, no se esperaba que fueran negativas para ARNm de Flt4. Las células endoteliales aórticas cultivas también carecieron de ARN de Flt4. Sin embargo, se obtuvieron señales a partir de células endoteliales humanas cultivadas a partir de microvasculatura y a partir de las venas femoral y umbilical. Así, al menos se retuvo en el cultivo celular algo de la especificidad de la expresión de Flt4.

El análisis de hibridación in situ de tejidos humanos adultos confirmó la restricción de Flt4 al sistema linfático vista en los embriones de ratón en desarrollo. La expresión de Flt4 se observó en los endotelios linfáticos y en los senos de ganglios linfáticos. De forma interesante, también algunos de los HEV, que tienen un endotelio cuboidal, mostrados para operar en el tráfico de leucocitos a los ganglios linfáticos, fue positivo en Flt4. Además, un análisis de hibridación paralelo mostró que los niveles de ARNm de Flt4 se mejoraron en estas estructuras en ganglios linfáticos metastáticos en comparación con los normales. El Flt4 también se destacó en linfangiomas, que son tumores benignos compuestos por estroma de tejido conectivo y canales linfáticos crecientes con revestimiento endotelial. El ARNm de Flt4 se restringió al endotelio linfático de estos tumores y se ausentó de sus arterias, venas y capilares. En el pulmón humano, las estructuras linfáticas fueron los únicos vasos que se identificaron positivos a Flt4.

Los resultados precedentes indican que el Flt4 es un marcador novedoso para vasos linfáticos y algunas vénulas endoteliales altas en tejidos adultos humanos. Los resultados también apoyan la teoría del origen venoso de los vasos linfáticos. El Flt4, como receptor del factor de crecimiento, puede estar implicado en la diferenciación y en las funciones de estos vasos. Una caracterización detallada de efectos biológicos mediada a través de Flt4 mediante el ligando de Flt4, VEGF-C, se proporciona en la solicitud de patente PCT/FI96/00427, presentada el 1 de agosto de 1996, y publicada como publicación internacional WO 97/05250.

Estos resultados, combinados con los compuestos de unión a Flt4 descritos en el presente documento, permiten un etiquetado selectivo del endotelio linfático, especialmente mediante el uso de anticuerpos de la presente invención acoplados a sustancias radioactivas, electrón densas u otras sustancias comunicadoras que puedan visualizarse. Puede ser posible inyectar al sistema linfático sustancias que contienen ligandos o anticuerpos monoclonales que inducen la internalización del receptor Flt4 y, mediante esto, transportar moléculas definidas previamente al endotelio linfático. Además, puede ser posible usar compuestos de unión a Flt4 descritos en el presente documento para la detección de vénulas endoteliales altas, HEV activados especialmente, que expresan niveles mejorados del receptor Flt4. Que nosotros sepamos, no hay disponibles actualmente marcadores específicos de este tipo para endotelio linfático.

Los ejemplos siguientes se dan sólo para ilustrar la presente invención, y no para limitar su alcance en modo alguno.

EJEMPLO 1 Aislamiento y caracterización de clones de ADNc que codifican Flt4

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS:

Una colección de ADNc de células HEL humanas cebado con oligo-dT en bacteriófago landa congt11 [Un amable regalo del Dr. Mortimer Poncz, ChDdrens Hospital of Philadelphia, PA, Estados Unidos; Poncz y col., Blood, 69: 219-223 (1987)] se analizó con un fragmento de ADNc amplificado por PCR de la misma colección [Aprelikova y col., Cancer Res., 52: 746-748 (1992)]. Se identificaron placas positivas y se purificaron tal como se describe [Sambrook y col., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)]. Se aislaron insertos de ADNc de bacteriófago landa como fragmentos de EcoRI y se subclonaron en un plásmido GEM3Zf(+) (Promega). Se aisló toda la región codificante de proteína de Flt4. Se secuenciaron tres clones coincidentes de la colección de HEL (tal como se ilustra en la figura 1) usando un procedimiento de terminación de cadena dideoxi con oligonucleótidos cebadores diseñados de acuerdo con las secuencias obtenidas. Todas las porciones de los ADN se secuenciaron en ambas cadenas. Los análisis de secuencia se realizaron usando los programas de envoltorio GCG [Devereux y col., Nucleic Acids Res., 12: 387-395 (1984) y el programa Prosite para Apple Macintosh],

La Figura 1A ilustra una estructura esquemática de los clones de ADNc de Flt4 analizados. Las flechas delinean fragmentos de restricción subclonados (cuyos tamaños se muestran en kb) usados para representar los análisis de inmunotransferencia (Northern) realizados en la Figura 1B. E=sitio EcoRI site, S=sitio SphI. La Figura 1B ilustra un análisis de hibridación por inmunotransferencia (Northern) de ARN de células de leucemia DAMI y HEL con las sondas que se muestran en la Figura 1A.

RESULTADOS: Se usó un fragmento de ADNc de Flt4 de 210 pb de longitud aislado por el

procedimiento de clonación PCR a partir de una colección de ADNc de células HEL como sonda molecular para analizar una colección de ADNc de células de eritroleucemia humanas cebado con oligo-dT.

El análisis de la secuencia de nucleótidos de clones reveló un marco de lectura abierto de 1298 restos de aminoácidos (aa) (SEQ ID Nº: 2, FIG. 2). El iniciador traduccional metionina marcado en la figura está rodeado por una secuencia consenso típica [Kozak, Nucleic Acids Res., 12: 857-872 (1984)] y seguido por una secuencia de aminoácidos hidrófoba característica de secuencias señalizadoras para translocación en el retículo endoplásmico.

El dominio extracelular de Flt4 puede alinearse en siete bucles similares a inmunoglobulina (FIG. 2). La figura también muestra la comparación de Flt4 con Flt1, que contiene estructuras muy similares. La secuencia de aminoácidos de Flt1 se expone como SEQ. ID Nº.: 5.

Los restos de aminoácidos 775-798 forman un tramo hidrófobo de secuencia, que es probablemente para operar como el dominio transmembranal del receptor, seguido de varios restos básicos en el lado citoplásmico putativo del polipéptido. El dominio yuxtamembranal tiene 44 restos de longitud antes del comienzo de una homología de secuencia de tirosina quinasa en el aa 842. Con la interrupción de homología en la secuencia de inserto de quinasa de 65 aa, esta homología se pierde primero en el aa 1175 en la cola carboxi-terminal del receptor. Una búsqueda de dominios de tirosina quinasa relacionados en la base de datos de secuencias de aminoácidos (Swissprot y NBRF) identifica las tirosina quinasas Flt1 y PDGFRB con homología de aproximadamente un 80 y un 60 % en las regiones de tirosina quinasa catalíticas, respectivamente.

EJEMPLO 2 Preparación de antisueros anti-Flt4

Un fragmento EcoRI de 657 pares de bases que codifica el extremo C-terminal predicho de la forma corta de Flt4 se clonó sin cambio de marco de lectura con la región codificante de glutation-S-transferasa en el vector de expresión bacteriano pGEX-1λT (Pharmacia) para producir una proteína de fusión GST-Flt4 en E. coli. La proteína de fusión resultante se produjo en bacteria y se purificó parcialmente por cromatografía de afinidad a glutatión de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La proteína se usó en la inmunización de conejos con el fin de producir anticuerpos policlonales contra Flt4. Los antisueros se usaron después de la tercera inmunización de refuerzo.

EJEMPLO 3 Expresión de Flt4 en células COS

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS:

La secuencia codificante de la proteína de Flt4 de tamaño completo (combinada a partir de tres clones, FIG. 1) se inserto en el sitio Hin-dIII-BamHI de la construcción del vector de expresión de mamíferos SVpoli [Stacey y col., Nucleic Acids Res., 18: 2829 (1990)] SV14-2. Los vectores de expresión (SV-FLT4 corto y SV-FLT4 largo, que contienen las formas respectivas de ADNc de Flt4) se introdujeron en células COS por el procedimiento de transfección de DEAE-dextrano [McCutchan y col., J. Natl. Cancer Inst., 41: 351-357 (1968)]. Dos días después de la transfección, las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se rasparon a un tampón de inmunoprecipitación (Tris 10 mM, pH 7,5, NaCI 50 mM, desoxicolato de sodio al 0,5 %, Nonidet P40 al 0,5 %, SDS al 0,1 %, Aprotinina 0,1 TIU/ml). Los lisados se sometieron a sonicación, se centrifugaron durante 15’ a 10.000 x g y se incubaron durante la noche en hielo con 3 ml de los antisueros. Se añadió la proteína A sefarosa (Pharmacia) y la incubación se continuó durante 30’ con rotación. Los precipitados se lavaron cuatro veces con el tampón de inmunoprecipitación, una vez con PBS y una vez con agua antes del análisis en SDS-PAGE.

RESULTADOS:

Las prediciones estructurales de la secuencia de ADNc de Flt4 se analizaron clonando las regiones de codificación de proteína larga y corta de Flt4 de longitud completa en los sitios HindIII-BamHI del vector de expresión pSVpoli y transfectando estos vectores de expresión a células COS. Las proteínas producidas por estas dos construcciones difieren en sus extremos C-terminales: la forma más larga contiene 65 aminoácidos adicionales. Dos días después de la transfección, las células se lisaron y se inmunoprecipitaron usando anticuerpos generados contra la proteína de fusión GST-Flt4 que contenían 40 restos de aminoácidos carboxilo terminales de la forma corta de la proteína de Flt4 predicha (es decir, una porción común a ambas formas corta y larga de Flt4). Los polipéptidos inmunoprecipitados se analizaron por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. El suero preinmunitario no reveló ninguna banda específica, mientras que los anticuerpos específicos de Flt4 reconocieron dos bandas de aproximadamente 170 y 190 KD Estas dos bandas pueden representar formas glucosiladas de forma diferencial de proteína de Flt4.

EJEMPLO 4 Expresión de Flt4 en células NIH3T3

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS:

El ADNc de Flt4 de longitud completa (forma corta) se subclonó en el vector LTRpoli (véase Makela y col., Gene, 118: 293-294 (1992), que describe el vector de plásmido pLTRpoli, que tiene el número de acceso ATCC 77109 y el número de acceso del GeneBank X60280) que contiene el promotor de repetición terminal largo del virus de leucemia murina de Moloney.

Este vector de expresión LTR-FLT4 se usó con el plásmido marcador pSV2neo para cotransfectar células NIH3T3, y los clones resistentes a G418 se analizaron para detectar la expresión de Flt4.

Para los análisis de inmunotransferencia (Western), las células se lisaron en una placa grande confluente en SDS al 2,5 %, Tris 125 mM, pH 6,5. Los lisados celulares se sometieron a electroforesis en SDS-page y a inmunotransferencia a una membrana de nitrocelulosa. La membrana se incubó con el antisuero obtenido contra el péptido carboxi-terminal Flt4, y se visualizaron anticuerpos unidos usando peroxidasa de rábano conjugada con antisuero anticonejo de cerdo (Dako) y reactivos ECL (Amersham). Para el etiquetado metabólico, los cultivos se etiquetaron con 100 µCi/ml de 35S-metionina durante una hora. Después del etiquetado, las células se lavaron dos veces y se incubaron en su medio de crecimiento durante 1 ó 2 horas, se lisaron, se inmunoprecipitaron con anticuepos anti-Flt4 y se analizaron por SDS-PAGE y autofluorografía.

RESULTADOS:

Los polipéptidos de 170 y 190 KD pudieron detectarse en la forma corta de Flt4 transfectada a células NIH3T3, pero no en células transfectadas con sólo pSV2neo. Además de estas dos bandas, se observó una banda principal de aproximadamente 120 Kd en los clones que producen Flt4. El etiquetado metabólico y los experimentos de pulso y caza mostraron que esta proteína se genera como resultado del proceso postraduccional de los polipéptidos Flt4 de forma corta.

EJEMPLO 5

Cartografiado cromosómico del locus Flt4

Debido a que se observaron algunas agrupaciones de genes de receptores de clase III, es de gran interés determinar la localización cromosómica de Flt4. De este modo, se analizaron híbridos celulares roedor-humano, indicando la unión de Flt4 al cromosoma 5 humano.

La localización del gen Flt4 en la región 5q33->5qter se determinó usando híbridos que portaban el cromosoma parcial 5s. Estos híbridos se analizaron para detectar la presencia del locus Flt4 mediante hibridación sobre filtro. La región del cromosoma 5 común a híbridos positivos a Flt4 y ausente en los híbridos negativos a Flt4 fue Sq33.1-qter. La presencia de Sq33-qter de cromosoma humano en los híbrido se correlaciona de esta modo con la presencia de secuencias de Flt4. Los resultados del cartografiado regional indican que el locus Flt4 es telomérico al locus del CSF1R/receptor-β del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRB), así como al locus del receptor β-adrenergico (ADRBR), ya que estos loci están todos presentes en el híbrido GB 13, que es negativo para Flt4.

EJEMPLO 6 Expresión del ARNm de Flt4 en líneas celulares tumorales y células endoteliales

Las líneas celulares de leucemia (K562) usadas en estudio se han comunicado en varias publicaciones previas; [Lozzio y col., Blood, 45: 321 -334 (1975)], HL-60 [Collins y col., Nature, 270: 347-349 (1977)], HEL [Martin y col., Science, 216: 1233-1235 (1982)], DAMI [Greenberg y col., Blood, 72: 1968-1977 (1988)], MOLT-4 [Minowada y col., J. Natl. Cancer Inst., 49: 891 -895 (1972)], Jurkat [Schwenk y col., Blut, 31: 299-306 (1975)], U937 [Sundstrom y col., Int. J. Cancer, 17: 565-577 (1976)], KG-1 [Koeffler y col., Science, 200:1153-1154 (1978)], JOK-1 [Andersson y col., 1982, en R. F. Revoltella (ed.), Expression of Differentiated Functions in Cancer Cells, 239-245, Raven Press, Nueva York] y ML-2 [Gahmberg y col., 1985, en L. C. Andersson, y col. (ed.), Gene Expression During Normal and Malignant Differentiation, 107-123, Academic Press, Londres], También se analizaron las siguientes líneas celulares de tumores, obtenidas de la Colección estadounidense de cultivos tipo: JEG-3, un coriocarcinoma; A204, un rabdomiosarcoma; SK-NEP-1, un nefroblastoma; BT-474, un carcinama de mama; Y79, in retinoblastoma. Las células de leucemia se cultivaron en RPMI que contenía suero de carnero fetal (FCS) al 10 % y antibióticos. Las células Dami se cultivaron en DMEM modificado de Iscove con suero de caballo al 10 %. Una línea celular híbrida endotelial permanente (EAhy926) obtenida condensando células endoteliales de vena umbilical humana de primer pasaje con las células de carcinoma de pulmón A549 [Edgell y col., Proc. Natl. Acad Sci USA,

50: 3734-3737 (1983)] se cultivó en medio DMEM-HAT que contenía FCS al 10 % y antibióticos.

Se extrajo ARN Poli(A)+ de las líneas celulares tal como se ha descrito [Sambrook y col., véase anteriormente]. 5 µg de muestras de ARN Poli(A)+ se sometieron a electroforesis en geles de agarosa que contenían formaldehído y se sometieron a inmunotransferencia usando condiciones estándar [Sambrook y col., véase anteriormente]. Los insertos de los clones de ADNc de Flt4 se etiquetaron mediante el procedimiento de cebado aleatorio y se hibridaron para las inmunotransferencias. La hibridación se realizó en formamida al 50 %, 5x solución de Denhardt (100x solución de Denhardt es un 2 % de cada uno de Ficoll™, polivinilpirrolidona y albúmina de suero bovino), 5 x SSPE (NaCI 3 M, NaH2P04-H20 200 mM, EDTA 20 mM, pH 7,0), SDS (dodecilsulfato de sodio) al 0,1 % y 0,1 mg/ml de ADN de esperma de salmón sonicado a 42 °C durante 18-24 h. Los filtros se lavaron a 65 °C en 1x SSC (NaCI 150 mM, citrato de sodio 15 mM, pH 7,0), SDS al 0,1 % y se expusieron a película Kodak XAR-5.

Los análisis de electrotransferencia se realizaron con el ARN poli(A)+ extraído de ocho líneas celulares de leucemia (HEL, K562, DAMI, U937, MOLT4, HL60, Jurkat y KG-I) y la línea celular híbrida endotelial (EAhy926). La hibridación con la sonda GAPDH se usó como control interno para la carga de cantidades uniformes de ARN al análisis. Sólo las células de eritroleucemia HEL y las células de leucemia megacarioblástica DAMI expresaron ARNm de Flt4 de 5,8 kb y 4,5 kb. Las leucemias eritroleucemia K562, Jurkat y de linfocitos T MOLT-4, así como las células de leucemia promielocítica HL-60, leucemia monocítica U937 y leucemia mieloide KG-1 fueron negativas para ARNm de Flt4.

Los análisis de inmunotransferencia (Northern) se realizaron con el ARN poli(A)+ extraído de cinco líneas celulares tumorales (JEG-3, A-204, SK-NEP-1, BT-474 y Y79) y dos de las líneas celulares de leucemia mencionadas anteriormente (JOK-1, MOLT4). Los clones de ADNc de S2,5 (véase la Fig. 1) se usaron como sonda de hibridación. La hibridación con una sonda de β-actina se usó como control interno para la carga de cantidades uniformes de ARN al análisis. Sólo se observó que contenían tránscritos de Flt4 las células de nefroblastoma SKNEP-1 y retinoblastoma Y79 .

Las células de teratocarcinoma Tera-2 se analizaron después de un tratamiento de 10 dias con vehículo (-) o ácido retinoico (+) para inducir diferenciación neuronal [Thompson y col.,

J. Cell Sci., 72: 37-64 (1984). En el análisis de inmunotransferencia (Northern) de ARN poli(A)+ aislado a partir de las células se encontró que las células no diferenciadas expresaban ARN de Flt4 de 5,8 kb y 4,7 kb, pero después de diferenciación de 10 días, no pudo detectarse ARNm de Flt4 en inmunotransferencia (Nothern) ni hibridación. Estos resultados indican que el Flt4 se reguló a la baja durante la diferenciación de estas células.

La expresión de ARNm de Flt4 se analizó también en células HEL no diferenciadas y diferenciadas con TPA. Tanto las líneas celulares HEL como DAMI poseen un fenotipo dual eritroide/megacarioblástico y pueden ser inducidas a expresión adicional de marcadores megacarioblásticos por tratamiento con el promotor tumoral 12-0-tetradecanilforbol-13-acetato (TPA). Analizamos si la expresión de Flt4 está estimulada en estas células durante su diferenciación. Se analizaron células HEL 2 días después del tratamiento con TPA o con DMSO usado para disolverlo. Después de retirar la señal de Flt4, el filtro se sondeó con ADNc de Rb-1 y de β-actina para confirmar una carga uniforme de los carriles. Sobre la base del análisis densitométrico de la autorradiografía y la normalización contra la expresión constitutiva del gen GAPDH, se determinó que el nivel de ARNm de Flt4 se incrementó aproximadamente 3,4 veces en células HEL inducidas por TPA, cuando las células se sometieron a diferenciación megacarioblástica.

EJEMPLO 7 Expresión de Flt4 en pulmón fetal

Hibridación in situ: Se obtuvo tejido de pulmón de un feto humano de 15 semanas con el permiso de la comisión ética mixta del Hospital Central Universitario y la Universidad de Turku, Finlandia. La muestra se fijó en formalina al 10 % durante 18 horas a 4 °C, se deshidrató, se incrustó en cera y se cortaron secciones de 6 µm. Las sondas de ARN de 206 y 157 bases (antisentido y sentido) se generaron a partir de ADN plásmido linearizadas usando polimerasas SP6 y T7 y (35S)-UTP. Se realizó la hibridación in situ de las secciones de acuerdo con Wilkinson y col., Development, 99:493-500 (1987); Wilkinson, Cell, 50:79-88 (1987), con las modificaciones siguientes: 1) en vez de tolueno, se usó xileno antes de la incrustación en cera de parafina; 2) se cortaron secciones de 6 µm, se situaron sobre una capa de agua tratada con pirocarbonato de dietilo sobre la superficie portaobjetos de vidrio con 3-aminopropiltrietoxisilano al 2 % (Sigma); 3) se omitió la hidrólisis alcalina de las sondas; 4) la mezcla de hibridación contenía formamida desionizada al 60 %; 5) el lavado de estringencia alta se realizó durante 80 minutos a 65 °C en una solución que contenía DTT 50 mM y 1 x SSC; 6) las secciones se cubrieron con emulsión NTB-2 (Kodak) y se almacenaron a 4 °C. Después de un tiempo de exposición de 14 días, los portaobjetos se revelaron durante 2,5 minutos en un revelador Kodak D-19 y se fijaron durante 5 minutos con Unifix (Kodak). Las secciones se tintaron con hematoxilina en agua.

En los estudios de hibridación usando la sonda antisentido, se observó ARNm de Flt4 principalmente en determinadas células endoteliales de los pulmones del feto de 15 semanas. Las hibridaciones control con la sonda de cadena sentido y con secciones tratadas con ARNasa A no dieron una señal sobre el fondo.

Para tinción con inmunoperoxidasa, se usaron una dilución 1:100 del anticuerpo antiFlt4, peroxidasa conjugada con anticuerpos anticonejo de cerdo y procedimiento estándar de la técnica. Las tinciones de control con suero preinmunitario o suero bloqueado con inmunógeno no dieron señal. Se analizaron tejidos de pulmón de fetos humanos de diecisiete semanas, y los resultados fueron consecuentes con los experimentos de hibridación de ARNm in situ: el endotelio de determinados vasos grandes del pulmón se tintó positivo con el antisuero anti-Flt4 de conejo.

EJEMPLO 8 Identificación de genes Flt4 en especies de mamíferos no humanas

En la FIG. 4 se muestran los resultados de un experimento que examinó la presencia de secuencias de Flt4 en ADN de diferentes especies. Con el fin de revelar como se han conservado los genes de Flt4 en evolución, se hibridó el fragmento de ADNc de 2,5 kb (véase la FIG.1) a ADN genómico purificado obtenido de diferentes animales y de levadura y se sometió a digestión con EcoR 1. La solución de hibridación comprendía formamida al 50 %, 5x solución de Denhardt (100x solución de Denhadt es 2 % de cada uno de Ficoll, polivinilpirrolidona y albúmina de suero bovino), 5x solución salina-fosfato de sodio-EDTA (NaCI 3 M, NaH2PO4-H2O 200 mM , EDTA 20 mM, pH 7,0), dodecilsulfato de sodio al 0,1% y 0,1 mg/ml de ADN de esperma de salmón sonicado. La hibridación se realizó a 42 °C durante 24 horas. El filtró se lavó a 65 °C en 1x solución salina de citrato estándar (NaCI 150 mM, citrato de sodio 15 mM, pH 7,0) y dodecilsulfato de sodio al 0,1 % y se expuso a película Kodak XAR-5. Se encontraron bandas específicas en ADN de mono, rata, ratón, perro, vaca, conejo y pollo, pero el ADN de levadura no dio señal. Se aisló ADNc de Flt4 de codornices. Véase Eichmann y col., Gene, 174(1): 3-8 (6 de septiembre de 1996) y número de acceso de Genbank X83287.

EJEMPLO 9 Expresión de gen Flt4 en tejidos humanos adultos

La expresión de ARNm de Flt4 en tejidos humanos adultos se analizó usando 2 µg de ARN de poli(A)+ de tejido de corazón, placenta, pulmón, hígado, músculo esquelético, riñón y páncreas (Multiple Tissue Northern Blot, Clontech Inc.) por hibridación con la sonda de ADNc de Flt4. Las hibridaciones control con muestras para genes expresados constitutivamente mostraron una carga uniforme de los carriles.

La hibridación de ARN poli(A)+ de diversos tejido humanos con el fragmento de ADNc de Flt4 mostró movilidad de bandas de ARNm de 5,8 y 4,5 kb y una banda débilmente etiquetada de 6,2 kb en placenta, pulmón, corazón y riñón. Se observaron bandas tenues en el hígado y en el músculo esquelético, mientras que parecía que el páncreas y el cerebro contienen muy poco ARN de Flt4.

EJEMPLO 10 Expresión de Flt4 en tejidos fetales humanos

Para examinar la expresión de ARNm de Flt4 en tejidos fetales humanos, se realizó la hibridación de una inmunotransferencia que contenía ARN total de los tejidos enumerados a continuación de fetos humanos de 16-19 semanas con el fragmento de ADNc de Flt4 de 1,9 kb (véase la Figura 1) y la autorradiografía resultante se examinó con un densitómetro. Los resultados se normalizaron para la cantidad de ARN estimado a partir de fotografías UV del gel tintado con bromuro de etidio (EtBr) correspondiente. Los símbolos siguientes denotan niveles de ARNm en un orden creciente: -,+,++,+++.

TABLA 1 Tejido fetal ARNm

Cerebro Meninges + Placa cortical ++ Zona intermedia +++ Zona ependimal +

(cont.) Cerebelo ++ Plexo coroide + Hígado + Páncreas + Intestino delgado -Corazón + Pulmón +++ Riñón ++ Adrenal ++ Piel ++ Bazo +++ Timo -

El análisis de tejidos fetales humanos mostraron que todos excepto el timo y el intestino delgado contienen tránscritos Flt4. Los niveles de expresión más altos se encontraron en pulmón y bazo.

5 EJEMPLO 11 Vector de expresión de Flt4

Se produjo ADNc de Flt4 de longitud completa (forma corta) mediante a) ligación de un fragmento PCR de Flt4 escindido con SphI [amplificado a partir del clon de S2,5 kb (véase la FIG. 1) usando los oligonucleótidos cebadores 5'-ACATGCATGC CACCATGCAG

10 CGGGGCGCCG CGCTGTGCCT GCGACTGTGG CTCTGCCTGG GACTCCTGGA-3' (SEQ ID Nº. 7) (directo) y 5'- ACATGCATGC CCCGCCGGT CATCC-3' (inverso)] (SEQ. ID Nº. 8) al extremo 5' del fragmento de S2,5 kb, se subclonó en el vector pSP73 (Promega), usando dos sitios SphI; b) ligación del fragmento PCR que contiene las últimas 138 pb amplificado a partir del fragmento de EcoRI de 0,6 kb (véase la FIG. 1) con los cebadores oligonucleótidos 5'

15 CGGAATTCCC CATGACCCCA AC-3' (SEQ. ID Nº 9) (directo) y 5'-CCATCGATGG ATCCTACCTG AAGCCGCTTT CTT-3' (SEQ. ID Nº 10) (inverso) al extremo 3' de la construcción a) usando el EcoRI y los sitios BamHI; c) ligación de un fragmento de EcoRI de 1,2 kb en el sitio EcoRI de la construcción b); d) ligación del fragmento resultante de longitud completa HindIII-BamHI en el vector de expresión SV-poli escindido con HindIII-BamHI [Stacey y col., Nucl. Acids Res., 18: 2829 (1990)].

EJEMPLO 12 Identificación de un ligando de Flt4

Se purificó por centrifugación a 16.000 x g medio acondicionado de la línea celular de adenocarcinoma prostático PC-3 (ATCC CRL 1435) cultivado durante 7 días en medio F12 en ausencia de suero fetal bovino (FBS) durante 20 minutos y se analizó para evaluar la capacidad de inducir fosforilación en tirosina de Flt4.

Se resembraron células NIH3T3 que expresan recombinantemente Flt4 (véase el Ejemplo 13) en placas de cultivo celular de 5 cm de diámetro y se cultivaron hasta confluencia en medio esencial mínimo modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía suero bovino fetal al 10 % y antibióticos. Las células confluentes se lavaron dos veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se privaron de alimento en DMEM/albúmina de suero bovino al 0,2 % durante la noche. Para la estimulación, el medio de inanición se reemplazó por 1 ml del medio acondicionado y las células se incubaron a 37 ºC durante 5 minutos.

Después de la estimulación con medio acondicionado de PC-3, las placas de cultivo que contenían las células se pusieron en hielo y se lavaron dos veces con Tris-HCI, pH 7,4, NaCI 150 mM que contenía NaV04 100 mM. La solución de lavado se retiró de las placas y las células se lisaron en tampón RIPA [Tris-HCI 10 mM pH 7,5, NaCI 50 mM, desoxicolato de sodio al 0,5 %, Nonidet P40 al 0,5%, dodecil sulfato de sodio (SDS)] al 0,1 % que contenía aprotinina, PMSF 1 mM y NaV04 1 mM, y los lisados se sometieron a sonicación durante 10 segundos dos veces. A continuación, los lisados se centrifugaron a 16.000 x g durante 30 minutos y los sobrenadantes se transfirierona tubos nuevos y se usaron para inmunoprecipitación.

Los anticuerpos policlonales contra el extremo C-terminal de Flt4 (descritos anteriormente) se usaron para la inmunoprecipitación. Los sobrenadantes de los lisados celulares se incubaron durante 2 horas en hielo con 2 a 4 µl de antisuero anti-Flt4 policlonal de conejo. Se añadieron aproximadamente 30 µm de una solución al 50 % (vol/vol) de proteína A-Sefarosa (Pharmacia) en PBS y se continuó con la incubación durante 45 minutos con rotación a +4 ºC. Los inmunoprecipitados se lavaron tres veces con tampón RIPA y una vez con PBS.

Los inmunoprecipitados se sometieron a continuación a electroforesis en gel de SDSpoliacrilamida (SDS-PAGE) en un gel al 7,5 % y se inmunotransfirieron sobre nitrocelulosa. Estas manchas de inmunotransferencia (Western) se incubaron con anticuerpos antifosfotirosina monoclonales (anti-P-Tyr)(dilución 1:2000 de PT-66 Sigma, cat. P-3300) y se continuó con la detección con anticuerpos anti-ratón de conejo conjugados con peroxidasa (dilución 1:1000, Dako, cat. P 161) usando el sistema de detección por quimioluminiscencia (Amersham). En algunos casos, se retiraron las manchas de inmunotransferencia para eliminar las señales previas durante 30 minutos a 50 °C en 2-mercaptoetanol 100 mM, SDS al 2 %, Tris-HCI 62,5 mM de pH 6,7 con agitación ocasional y retintado con anticuerpos anti-Flt4 (dilución 1:1000) y se continuó con tintado con anticuerpos anti-conejo de cerdo conjugados con peroxidasa (dilución 1:1000, Dako, P217). Como control positivo para la fosforilación en tirosina de Flt4, se usaron inmunoprecipitados anti-Flt4 de células NIH3T3 que expresan Flt4 tratadas con el inhibidor de tirosil fosfatosa pervanadato de sodio (PerVO4). 100 mM durante 20 minutos El tratamiento de células con pervanadato de sodio se realizó añadiendo ortovanadato de sodio 100 mM (concentración final) y peróxido de hidrógeno 2 mM (concentración final) al medio celular e incubación de las células durante 20 minutos a 37 ºC con un 5 % de CO2. Este procedimiento dio como resultado la generación de la forma peroxidada de vanadato (hidroperóxido de vanadilo), que es un inhibidor muy potente de las proteínas tirosina fosfatasas en células vivas.

El medio acondicionado con células PC-3 estimuló la fosforilación de tirosina de un polipéptido de 120 kD que comigró con tirosina fosforilada, forma madura procesada de Flt4. La comigración se confirmó después de retintar las inmunotransferencias con anticuerpos antiFlt4.

Para probar que el polipéptido de 120 kD no es un componente no específico del medio acondicionado, se separaron 15 ml de medio acondicionado por SDS-PAGE, se inmunotransfirieron sobre nitrocelulosa y la mancha de inmunotransferencia se tintó con anticuerpos anti-P-Tyr. Se detectaron varios polipéptidos, pero ninguno de ellos comigró con Flt4, indicando que la banda de 120 kD es efectivamente proteína fosforilada con tirosina inmunoprecipitada a partir de células estimuladas. El analisis de estimulación por medio acondicionado PC-3 pretratado con la heparina Sefarosa CL-6B (Pharmacia) durante 2 horas a temperatura ambiente (carril 3) muestra que el ligando de Flt4 no se une a la heparina.

El medio no acondicionado no induce la autofosforilación de Flt4. Además, ni las células NIH3T3 no transfectadas ni las células NIH3T3 transfectados con FGFR-4 mostraron fosforilación en tirosina del polipéptido de 120 kD tras estimulación con el medio acondicionado a partir de células PC-3. La actividad de estimulación se aumentó considerablemente cuando el medio acondicionado se concentró cuatro veces usando un concentrador Centricon-10 (Amicon). Además, el flujo obtenido después de la concentración, que contenía proteínas de peso molecular inferior a 10.000 (<10.000) no estimuló la fosforilación de Flt4. El pretratamiento del medio acondicionado concentrado de células PC-3 con 50 ml del dominio extracelular de Flt4 (Flt4EC-6xHis, véase a continuación) acoplado a Sefarosa activada por CNBr (1 mg/ml) de acuerdo con las instrucciones del fabricante abolió completamente la fosforilación en tirosina de Flt4. El pretratamiento análogo del medio acondicionado con Sefarosa CL-4B no afectó a la actividad estimulatoria.

Estos datos prueban que las células PC-3 producen ligando soluble para Flt4. Los experimentos anteriores prueban que el ligando se une al dominio recombinante EC de Flt4. Así, ese ligando puede purificarse usando el dominio recombinante EC de Flt4 en cromatografía de afinidad. La proteína purificada puede someterse a electroforesis en SDSPAGE, someterse a inmunotransferencia a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) y su secuencia amino terminal puede determinarse por procedimientos estándar de la técnica. Altenativamente, el ligando purificado puede digerirse dando péptidos para la determinación de sus secuencias amino terminales. Las secuencias peptídicas obtenidas a partir de proteína purificada se usan para la síntesis de una mezcla de oligonucleótidos que codifican tales secuencias. Dichos oligonucleótidos y sus equivalentes de cadenas de ADN complementario pueden etiquetarse radioactivamente y usarse para el análisis de colecciones de ADN obtenidas a partir de células PC-3 para obtener un ADNc que codifique el ligando, todo mediante procedimientos estándar de la técnica (Wen y col., Cell 69: 559-572 (1992)). Alternativamente, tales oligonucleótidos y sus equivalentes pueden usarse como cebadores en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar secuencias que codifican el ligando usando ADNc obtenido a partir de ARN de células PC-3 como plantilla. Dicho procedimiento de síntesis de ADNc y PCR (RT-PCR) es estándar en la técnica (Innis y col., 1990, PCR protocols, Academic Press; McPherson, M.J. y col., 1991, PCR, a practical approach, IRL Press; Partanen y col., Proc. Natl. Acad Sci., Estados Unidos, 87: 8913-8917 (1990)). Otra alternativa más es clonar el ligando de Flt4 de células PC-3 usando ADNc clonado en vector de expresión eucariotico [usando por ejemplo el kit de clonación Invitrogen Librarian y vectores proporcionados, tales como pcDNA I o pcDNA III) y analizando dichas colecciones transfectadas en, por ejemplo, células COS con Flt4-fosfatasa alcalina (Cheng y Flanagan, Cell, 79: 157-168, (1994)), Flt4-inmunoglobulina (Flt4-lg) (Lyman y col., Cell, 75:, 1157-1167 (1993)), o reactivos de afinidad similar, por procedimientos estándar de la técnica.

EJEMPLO 13 Líneas celulares y transfecciones.

Se cultivaron células NIH3T3 y células 293-EBNA (Invitrogen) en DMEM que contenía FCS al 10 %. Para obtener una expresión estable, se transfectaron células NIH3T3 con el vector LTR-FLT41 junto con el vector pSV-neo (véase el Ejemplo 4, anteriormente) donde el ADNc de Flt4 se expresa con el control del promotor LTR del virus de leucemia murino Moloney mediante el procedimiento de lipofección usando el reactivo de transfección DOTAP (Boehringer-Mannheim). Las células COS-1 se transfectaron por el procedimiento de DEAE dextrano (McClutchan y Pagano, J. Natl. Cancer Inst., 41: 351-35 (1968)). Las células transfectadas se seleccionaron en 500 mg/ml de neomicina.

EJEMPLO 14 Construcción y expresión de proteínas de fusión de Flt4 La construcción de fusión pVTBac-FLT4EC-6xHis. Los extremos de ADNc que

codifican Flt4 se modificaron como sigue: El extremo 3' de la secuencia de ADNc de Flt4 que codifica el dominio extracelular (EC) se amplificó usando oligonucleótidos 5'CTGGAGTCGACTTGGCGGACT-3' (SEQ ID Nº: 13, sitio SalI subrayado, que contienen la secuencia correspondiente a los nucleótidos 2184-2204 de la SEQ ID Nº: 1) y 5'CGCGGATCCCTAGTGATGGTGATGGTGATGTCTACCTTCGATCATGCTGCCCTTATCCTC -3' (SEQ ID Nº: 14, sitio BamhI subrayado, que contienen la secuencia correspondiente a los nucleótidos 2341-2324 de la SEQ ID Nº: 1) que codifica 6 restos de histidina para la unión a una columna Ni-NTA (Qiagen, Hilden, Germany) seguido por un codón de terminación. El fragmento amplificado se digirió con SalI y BamHI y se ligó como un fragmento SalI-BamHI en el vector LTR-FLT41 (véase el Ejemplo 4), reemplazando un fragmento SalI-BamHI que contenía secuencias que codifican los dominios transmembranal y citoplásmico de Flt4.

El extremo 5' del ADNc de Flt4 sin la región que codifica la secuencia señalizadora de Flt4 se amplificó por PCR usando oligonucleótidos 5'CCCAAGCTTGGATCCAAGTGGCTACTCCATGACC-3' (SEQ ID Nº: 11, sitios HindIII y BamHI subrayados, que contienen la secuencia correspondiente a los nucleótidos 86-103 de la SEQ ID Nº: 1) y 5'-GTTGCCTGTGATGT-GCACCA-3' (SEQ ID Nº: 12, que contienen la secuencia correspondiente a los nucleótidos 700-681 de la SEQ ID Nº: 1). Este fragmento amplificado (que incluye los nucleótidos 86-700 de la SEQ ID Nº: 1) se digirió con HindIII y SphI (el sitio SphI, correspondiente a los nucleótidos 588-593 de la SEQ ID Nº: 1, está dentro de la región amplificada del ADNc de Flt4).

El fragmento resultante HindIII-SphI se usó para reemplazar un fragmento HindIII-SphI en el vector LTR-FLT41 modificado descrito justo anteriormente (el sitio HindIII está en la unión 5' del inserto de Flt4 con la porción pLTRpoli del vector, el sitio SphI está en el ADNc de Flt4 y corresponde a los nucleótidos 588-593 de la SEQ ID Nº: 1). El inserto Flt4EC-6xHis resultante se ligó después como fragmento BamHI en el sitio BamHI en el plásmido pVTBac (Tessiery col., Gene 98: 177-183 (1991)). La construcción se transfectó junto con el ADN genómico de baculovirus a células SF-9 por lipofección. Se generó virus recombinante y se usó para la infección de células High-Five (Invitrogen).

La construcción de fusión Flt4-AP. El extremo 3' de la secuencia que codifica el dominio EC de Flt4 se amplificó usando oligonucleótidos 5'-CTGGAGTCGACTTGGCGGACT-3' (SEQ ID Nº: 15) y 5'-CGGGATCCCTCCATGCTGCCCT-TATCCT-3' (SEQ ID Nº: 16) y se ligó como fragmento SalI-BamHI en el vector LTR-FLT41, reemplazando las secuencias que codifican los dominios transmembranal y citoplámico. El inserto resultante se ligó después como fragmento HindIII-BamHI en los sitios HindIII-BgIHI de plásmido APtag-1 sin cambio de marco de lectura con la región codificante de alcalina fosfatasa (Flanagan y Leder, 1990, Cell 63,185-194). Las células NIH3T3 se cotransfectaron con esta construcción Flt4-AP y pSV2neo (Southern y Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1: 327-341 (1982)) por lipofección usando el reactivo de transfección DOTAP (Boehringer) y las celulas transfectadas se seleccionaron en presencia de 500 mg/ml de neomicina. La proteína recombinante producida en el medio se detectó por reacción colorimétrica para el tintado para analizar la actividad alcalina de fosfatasa (Cheng y Flanagan, Cell 79: 157-168 (1994)).

La construcción Flt4-lg. Se construyó un ADN recombinante que codifica una químera Flt4 inmunoglobulina como sigue. El extremo 5' del ADNc que codofica Flt4, incluidos nucleótidos Flt4 que codifican la secuencia señalizadora, se amplificó por PCR usando cebadores 5'-GGCAAGCTTGAATTCGCCACCATGCAGCGGGGCGCC-3' (SEQ ID Nº: 17) y 5'GTTGCCTGTGATGTGCACCA-3' (SEQ ID Nº: 18) y se ligó como fragmento HindIII-SphI en el vector LTR-FLT4I. El extremo 3' de la secuencia que codifica Flt4 EC se amplificó usando oligonucleótidos 5'-CTGGAGTCGACTTGGCGGACT-3' (SEQ ID Nº: 19) y 5'CGCGGATCCAAGCTTACTTACCTTCCATGCTGCCCTTATCCTCG-3' (SEQ ID Nº: 20) y se ligó como fragmento SalI-BamHI en el vector LTR-FLT41, reemplazando las secuencias que codifican los dominios transmembranal y citoplásmico. Este inserto Flt4EC que contiene un sitio donante de ayuste se ligó primero en pHyCE2 que contenía exones que codifican la región constante y bisagra de cadena pesada de inmunoblobulina humana (Karjalainen, K., TIBTECH, 9:109-113 (1991)). El inserto EcoRI-BamHI que contiene la químera Flt-Ig se atenuó después por procedimientos estándar de la técnica (Klenow) y se ligó al sitio HindIII atenuado en pREP7 (Invitrogen). La construcción se transfectó a células 293-EBNA mediante el procedimiento de precipitación de fosfato de calcio y el medio acondicionado se usó para el aislamiento de la proteína Flt4-Ig mediante cromatografía de afinidad a la proteína A-Sefarosa.

EJEMPLOS 15-17 Purificación y secuenciación del ligando Flt4

Se concentraron sobrenadantes producidos por células PC-3 en condiciones pobres de suero 30-50 veces usando cartuchos de filtro Centriprep y se cargaron en una columna de dominio extracelular de flt4 inmovilizado. Se prepararon dos matrices de afinidad usando los procedimientos y construcciones alternativos. En el primer caso, la proteína de fusión Flt4EC6xHis se reticuló con Sefarosa 4B activada con CNBr (Pharmacia) y en el segundo caso la proteína de fusión Flt4-lg se acopló a la proteína Sefarosa A usando pimelidato de dimetilo (Schneider y col., 1982, J. Biol. Chem. 257:10766-10769). El material eluido de la columna de afinidad se sometió a purificación adicional usando cromatografía de intercambio iónico y de alta presión en fase inversa y electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. Se analizaron fracciones de cromatografía para examinar la capacidad para estimular la fosforilación en tirosina de Flt4. La proteína ligando biológicamente activa purificada se microsecuenció y los oligonucleótidos degenerados se prepararon sobre la base de la secuencia de aminoácidos obtenida, con el fin de aislar y clonar un ADNc que codifica ligando; por ejemplo, a partir de una colección de ADNc generada a partir de ARN de poli(A)+ aislado de células PC-3.

Una caracterización detallada de un ligando Flt4, denominado factor de crecimiento endotelial vascular C (VEGF-C), así como secuencias de polinucleótido nativo humano, mamífero no humano y aviar que codifican VEGF-C y variantes y análogos de VEGF-C, se proporcionan en la solicitud de patente internacional número PCT/US98/01973, presentada el 2 de febrero de 1998 (publicada el 6 de agosto de 1998 como publicación internacional WO 98/33917); en Joukov y col., J. Biol. Chem., 273 (12): 6599-6602 (1998); en Joukov y col., EMBO J, 16(13): 3898-3911 (1997); y en la solicitud de patente internacional Nº PCT/FI96/00427, presentada el 1 de agosto de 1996 (publicada como publicación internacional Nº WO 97/05250). Tal como se ha explicado en detalle en el presente documento, el VEGF-C humano se produce inicialmente en células humanas como un polipéptido prepro-VEGF-C de 419 aminoácidos. Una secuencia de aminoácidos para prepro-VEGF-C humano se expone en SEQ ID Nº: 21, y un ADNc que codifica VEGF-C humano se ha depositado en la Colección estadounidense de cultivos tipo (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 (Estados Unidos), de acuerdo con lo previsto en el Tratado de Budapest (fecha de depósito: 24 de julio de 1995 y número de acceso ATCC 97231). También se han comunicado secuencias de VEGF-C de otras especies. Véase números de acceso de Genbank MMU73620 (Mus musculus); y CCY15837 (Coturnix coturnix), por ejemplo.

El polipéptido prepro-VEGF-C se procesa en múltiples etapas para producir un polipéptido VEGF-C maduro y más activo de 21-23 kD (tal como se ha evaluado por SDSPAGE en condiciones reductoras). Dicho procesamiento incluye la escisión de un péptido señalizador (SEQ ID Nº: 21, restos 1-31); escisión de un péptido carboxilo-terminal (correspondiente aproximadamente a los aminoácidos 228-419 de la SEQ ID Nº: 21 y que tiene un patrón de restos de cisteína espaciados reminiscentes de una secuencia de proteína anillo de Balbiani 3 (BR3P) [Dignam y col. Gene, 88:133-40 (1990); Paulsson y col, J. Mol. Biol, 211: 331-49 (1990)]) para producir una forma parcialmente procesada de aproximadamente 29 kD; y la escisión (aparentemente extracelularmente) de un péptido amino-terminal (correspondiente aproximadamente a los aminoácidos 32-103 de SEQ ID Nº: 21) para producir una forma madura totalmente procesada de aproximadamente 21-23 kD. La evidencia experimental demostró que las formas parcialmente procesadas de VEGF-C (por ejemplo, la forma de 29 kD) son capaces de unirse al receptor Flt4 (VEGFR-3), mientras que la unión de alta afinidad VEGFR-2 tiene lugar sólo con las formas totalmente procesadas de VEGF-C. Parece que los polipéptidos VEGF-C se asocian de forma natural como dímeros unidos no disulfuro.

Además, se ha demostrado que llos aminoácidos 103-227 de SEQ ID Nº: 2 son no todos críticos para mantener las funciones de VEGF-C. Un polipéptido constituido por aminoácidos 113-213 (y carente de restos 103-112 y 214-227) de SEQ ID Nº: 2 retiene la capacidad de unirse a y de estimular receptores VEGF-C, y se espera que un polipéptido que se extiende desde aproximadamente el resto 131 a aproximadamente el resto 211 retendrá la actividad biológica de VEGF-C. Se ha demostrado que el resto de cisteína en la posición 156 es importante para la capacidad de unión de VEGFR-2. No obstante, los polipéptidos VEGF-C ΔC156 (es decir, análogos que carecen de esta cisteína debido a deleción o sustitución) continúan siendo activadores potentes de VEGFR-3. La cisteína en posición 165 de la SEQ ID Nº: 2 es esencial para la unión a cualquier receptor, mientras que análogos que carecen de las cisteínas en las posiciones 83 ó 137 compiten con VEGF-C nativos por la unión con ambos receptores y estimulan ambos receptores.

Un alineamiento de VEGF-C humano con VEGF-C de otras especies (realizado usando cualquier algoritmo de alineamiento aceptado generalmente) sugiere restos adicionales en los que pueden introducirse modificaciones (por ejemplo, inserciones, sustituciones y/o deleciones) sin destruir la actividad biológica de VEGF-C. Cualquier posición en la que polipéptidos VEGFC alineados de dos o más especies tienen diferentes aminoácidos, especialmente diferentes aminoácidos con cadenas laterales de diferente carácter químico, es una posición probable susceptible de modificación sin la eliminación concomitante de función. En la figura 5 del documento WO 98/33917 se expone un ejemplo de alineamiento de VEGF-C humano, murino y de codorniz.

Además de las consideraciones anteriores, se entiende que pueden realizarse innumerables sustituciones conservativas de aminoácidos a una secuencia de VEGF-C de tipo silvestre que es probable que den como resultado un polipéptido que retiene las actividades biológicas de VEGF-C, especialmente si el número de dichas sustituiciones es pequeño. Con “sustitución conservativa de aminoácidos” se pretende decir sustitución de un aminoácido con un aminoácido que tiene una cadena lateral de un carácter químico similar. Aminoácidos similares para realizar sustituciones conservativas incluyen los que tienen una cadena lateral ácida (ácido glutámico, ácido aspártico); una cadena lateral básica (arginina, lisina, histidina); una cadena lateral amídica polar (glutamina, asparagina): una cadena lateral alifática hidrófoba (leucina, isoleucina, valina, alanina, glicina); una cadena lateral aromática (fenilalanina, triptofano, tirosina) una cadena lateral pequeña (glicina, alanina, serina, treonina, metionina); o una cadena lateral hidroxílica alifática (serina, treonina). También se considera la adición o deleción de uno o unos pocos aminoácidos internos sin destruir las actividades biológicas de VEGF-C.

De lo anterior, se apreciará que muchos polipéptidos VEGF-C y variantes del mismo se unirán a Flt4 (VEGFR-3) con alta afinidad y, por lo tanto, son útiles como compuestos de unión a Flt4 en aspectos de la invención que implican la obtención de imágenes o el análisis de muestras de tejidos usando un compuesto de unión a Flt4. Son de particular interés formas de VEGF-C que presentan alteraciones que disminuyen o eliminan la afinidad de unión a VEGFR2, de tal forma que el polipéptido resultante posee una especifidad de unión aumentada por VEGFR-3. Tal como se ha descrito anteriormente, tales alteraciones incluyen la deleción o reemplazo de Cys156, que elimina sustancialmente la afinidad de unión a VEGFR-3, o alteraciones en la secuencia de aminoácidos que destruyen los sitios de procesamiento proteolítico de prepro-VEGF-C naturales (debido a que la afinidad a VEGFR-2 es la más alta con VEGF-C totalmente procesado). Además, las moléculas de VEGF-C que han sido modificadas para retener la afinidad de unión a Flt4, pero que no pueden activar la autofosforilación de Flt4, son antagonistas de Flt4 útiles en procedimientos de tratamiento descritos en el presente documento. Además, será aparente a partir de las enseñanzas anteriores que el ligando de Flt4 descrito en el presente documento puede usarse en ensayos como indicios para confirmar la identidad de variantes alélicas de Flt4 humano, y para confirmar que las secuencias de genes no humanos que tienen homología con las secuencias de Flt4 que se enseñan en el presente documento (véanse, por ejemplo, el Ejemplo 8 y la Figura 4) son, de hecho, los equivalentes no humanos de Flt4. La secuencia de aminoácidos para prepro-VEGF-C se expone en el presente documento en SEQ ID Nº: 21.

Una descripción detallada de un segundo ligando de Flt4, denominado factor de crecimiento endotelial vascular D (VEGF-D), así como secuencias depolinucleótidos humanos que codifican VEGF-D, y variantes y análogos de VEGF-D, se proporcionan en la solicitud de patente internacional número PCT/US97/14696, presentada el 21 de agosto de 1997 y publicada el 26 de febrero de 1998 como publicación internacional número WO 98/07832; y Achen y col., Proc. Nat'l Acad Sci. U.S.A., 95(2): 548-553 (1998). Tal como se explica en detalle en dichos documentos, el VEGF-D humano se produce inicialmente en células humanas como un polipéptido prepro-VEGF-D de 354 aminoácidos. La secuencia de ADNc y de aminoácidos deducida para prepro-VEGF-D se expone en el presente documento en SEQ ID Nº: 22. También se han comunicado secuencias de VEGF-D de otras especies. Véase números de acceso de Genbank D89628 (Mus musculus); y AF014827 (Rattus norvegicus), por ejemplo, incorporados al presente documento por referencia.

El polipéptido prepro-VEGF-D tiene un péptido señalizador putativo de 21 aminoácidos y se procesa aparentemente proteolíticamente de un modo análogo al procesamiento de prepro-VEGF-C. Un VEGF-D “madurado recombinantemente” que carece de los restos 1-92 y 202-354 de SEQ ID Nº: 22 retiene la capacidad de activar los receptores VEGF-2 y VEGFR-3, y parece que se asocia como dímeros unidos no covalentemente. Las utilidades para polipéptidos VEGF-D como compuestos de unión a Flt4 en la presente invención son análogas a las descritas anteriormente para VEGF-C. Asimismo, se espera que alteraciones análogas en VEGF-D (eliminar la segunda de ocho cisteínas conservadas en el dominio de homología de VEGF-D, Cys136, o eliminar los sitios de procesamiento proteolítico) darán como resultado polipéptidos que presentan una reducción o eliminación de la afinidad de unión a VEGFR-2 y, por ello, un aumento de la especifidad a Flt4. Además, las moléculas de VEGF-D que han sido modificadas para retener la afinidad de unión a Flt4, pero que no pueden activar la autofosforilación de Flt4, son antagonistas de Flt4 útiles en procedimientos de tratamiento descritos en el presente documento.

EJEMPLO 18 Clonación de sondas de ADNc de Flt4 de ratón

Aproximadamente 106 placas de una colección genómica λFIX®II de ratones 129SV (Stratagene) se analizó con el fragmento de ADNc del receptor Flt4 humano S2.5 descrito anteriormente, que abarca el dominio extracelular. Véase también Pajusola y col. Cancer Res, 52:5738 (1992). Un fragmento de 2,5 kb de BamHI se subclonó a partir de una placa positiva y se secuenció desde ambos extremos. A partir de este subclón, se usó la reacción en cadena de la polimerasa para amplificar y clonar en el vector pBluescript KSII+/- (Stratagene) un fragmento de exón que abarca los nucleótidos 1745-2049 de la secuencia de ADNc de Flt4 de ratón. Véase Finnerty y col. Oncogene, 8:2293 (1993).

Se clono de forma similar un segundo fragmento que abarca los nucleótidos 1-192.

EJEMPLO 19 Análisis de ARNm de Flt4 en tejidos de ratón

Se aisló ARN total a partir de embriones desarrollados (8-18 días p.c. y ratón de un día) de acuerdo con Chom-czynski y col. Anal. Biochem, 162:156 (1987). La muestra del embrión de 8 días p.c. también incluyó la placenta.

Para el análisis de protección de Rnasa, se generó una sonda de ARN a partir de plásmido Flt4 murino linealizado obtenido de acuerdo con el Ejemplo 18 usando [32P]-UTP y T7 polimerasa para la orientación antisentido. La sonda de β-actina usada corresponde a los nucleótidos 1188-1279 de la secuencia de β-actina de ratón publicada. Véase Tokunaga y col. Nucleic. Acid Res, 14:2829 (1986). Después de la purificación en un gen de poliacrilamida al 6 %/urea 7M, los tránscritos se hibridaron a 30 µg de ARN total durante la noche a 52 °C. El ARN no hibridado se digirió con RNasa A (10 U/ml) y T1 (1 mg/ml) a 37 °C, pH 7,5, durante 1 hora. Las Rnasas se inactivaron mediante digestión con proteinasa K a 37 °C durante 15 minutos y las muestras se analizaron en un gel de poliacrilamida al 6 %/urea 7 M.

Los patrones de expresión del Flt4 analizado en este experimento mostraron que se obtuvieron señales de ARNm muy débiles de pulmón, hígado, corazón, riñón, músculo esquelético y bazo, mientras que no se obtuvo aparentemente ninguna señal específica de testículos y cerebro. Los análisis de una serie de ARN recogidos durante diferentes fases del desarrollo del ratón por ensayo de protección de RNasa mostró que el ARNm de Flt4 se expresó a través de embriogénesis de ratones desde el 8 p.c. a recién nacidos sin grandes variaciones en la intensidad de señal.

EJEMPLO 20 Hibridación in situ de Flt4 en embriones de ratón

Para asignar mejor trasncritos de Flt4 a células y tejidos, se hibridaron secciones de embriones de ratón de 7,5 y 8,5 días p.c. con ARN de Flt4 etiquetado. Los embriones de ratón se derivaron de emparejamiento de ratones CBA y NMRI. Los ratones preñados se sacrificaron mediante dislocación cervical y los embriones se congelaron inmediatamente o se transfirieron mediante solución salina tamponada a paraformaldehído al 4 %. Los embriones y órganos de ratón aislados se fijaron durante 18 horas a 4 °C, se deshidrataron, se incrustaron en parafina y se dividieron en secciones de 6 µm.

Las sondas de ARN (antisentido y sentido) de 192 y 305 nucleótidos (véase el Ejemplo 18) se generaron a partir de plásmidos linearizados usando [35S]-UTP. Se realizó la hibridación in situ de secciones de acuerdo con Wilkinson y col., Development, 99:493 (1987); y Wilkinson y col., Cell, 50:79 (1987), con las modificaciones siguientes: 1) en vez de tolueno, se usó xileno antes de la incrustación en cera de parafina; 2) se cortaron secciones de 6 µm, se situaron sobre una capa de agua tratada con pirocarbonato de dietilo sobre la superficie de portaobjetos de vidrio pretratados con 3-trietoxisililpropilamina al 2 %; 3) se omitió la hidrólisis alcalina de las sondas; y 4) el lavado de alta estringencia re realizó durante 80 minutos a 65 ºC en una solución que contenía DTT 30 mM y 1 x SSC. Las secciones se cubrieron con emulsión NTB-2 (Kodak) y se almacenaron a 4 °C. Los portaobjetos se expusieron durante 14 días, se revelaron y se tintaron con hematoxilina. Las hibridaciones control con cadena sentido y secciones tratadas con ARNasa A no dieron una señal específica sobre el fondo.

La expresión de ARN de Flt4 no se detectó en embriones de ratón de 7,5 días p.c., pero se detectaron señales brillantes en la aorta en desarrollo en los de 8,5 días de desarrollo. Por contra, el saco de yema en desarrollo fue negativo a Flt4. En los tejidos extraembriónicos, el Flt4 se expresó prominentemente en el alantoides, mientras que los islotes sanguíneos en desarrollo del saco de yema fueron negativos. Por otra parte, los angioblastos del mesénquima de la cabeza fueron muy positivos a Flt4. En la placenta en desarrollo, la señal se vio primeramente en las venas sinusoidales periféricas. En placenta de 9,5 días p.c., el endotelio de lagunas venosas y de las células gigantes parcialmente fusionadas con la membrana de Reichert expresaron ARNm de Flt4.

De este modo, aunque la expresión de Flt4 fue muy prominente en precursores de células endoteliales tempranas, los angioblastos, parece estar restringido sólo a determinados vasos de embriones de 8,5 días p.c. Se sabe que el receptor Tie se expresa en todas las células endoteliales de embriones de ratón en desarrollo y, de este modo, proporciona un marcador para estas células. Véase Korhonen y col. Oncogene, 8:395 (1993); y Korhonen y col., Blood, 80: 2548-2555 (1992). Notablemente, en contraste con la sonda de Tie, la sonda de Flt4 hibridó muy débilmente y, en todo caso, con endotelios anteriales de embriones de 11,5 días p.c., por ejemplo con el endotelio de las arterias aorta dorsal o carótida. Por contra, la señal de Flt4 fue más prominente en las venas en desarrollo. Por ejemplo, la señal se detectó en venas que rodean el metanefros en desarrollo, mientras que la sonda de Tie reconoció predominantemente capilares dentro del metanefros.

Se observó que el ARNm de Flt4 estaba distribuido por varias regiones del embrión de ratón de 12,5 días p.c., siendo particularmente prominente en el vaso dilatado de la región axilar. Una estructura de vaso positivo a Flt4 similar se observó en la sección sagital media de la zona yugular (no se muestran datos). Un patrón similar a plexo de vasos que expresan Flt4 aparece en la región periorbital y que rodea las vértebras en desarrollo. Además, justo debajo de piel en desarrollo, fue evidente una red vascular positiva a Flt4. Se obtuvieron señales capilares más débiles desde varias regiones, incluido el cerebro en desarrollo. También pudo detectarse ARNm de Flt4 en vasos pequeños de la región del cuello, en el morro en desarrollo y en la base de la lengua en desarrollo, así como en la región de la cola. Adicionalmente, el hígado fue muy positivo a ARNm de Flt4 en un patrón similar a mancha.

Durante el desarrollo posterior, parece que el ARNm de Flt4 se restringe más a determinados vasos del embrión. Un embrión de 14,5 días p.c. muestra muy bien estos patrones de expresión restringidos. En la sección sagital media de dichos embriones, la señal de Flt4 más prominente se observó a lo largo de la columna vertebral en desarrollo, en su parte anterior. Esta señal se considera que se origina a partir de células endoteliales del conducto torácico, que es el vaso linfático más grande formado en este momento del desarrollo. Por contra, la aorta dorsal y la vena cava inferior fueron negativas. Los vasos dilatados en la región mesentérica también fueron muy positivos a Flt4. Además, como en los embriones de 12,5 días p.c., las redes de vasos a lo largo de fronteras anatómicas en la región periorbital, el maxilar inferior, así como en las regiones del cuello contenían endotelios positivos a Flt4. Había estructuras similares presentes en el espacio pericárdico y a lo largo del tejido subcutáneo. Notablemente, en contraste con vasos negativos a Flt4, todos los vasos positivos a Flt4 carecieron de células sanguíneas en su lumen. Estos patrones de expresión sugieren que el Flt4 se confina a los endotelios de vasoso linfáticos en el momento del desarrollo. Un sitio adicional en el que se observó la expresión de Flt4 fue en el sinusoide de la médula ósea en desarrollo.

También se analizó una sección transversal del tórax superior de un embrión de 16,5 días p.c. hibridado con la sonda de Flt4. Se realizó la tinción con hematoxilin-eosina para visualizar los diferentes tipos de vasos en esta zona. Estos incluyen las arterias carótida y braquicefálica, la vena cava y el conducto torácico, que es más pequeño en tamaño y carece de tejido muscular y conectivo circundante. Con una magnificación superior, se observaron que células endoteliales del conduto torácico, así como de un vaso pequeño en la vecindad se hibridaron con la sonda de Flt4.

EJEMPLO 21 Análisis de ARNm de Flt4 en células endoteliales cultivadas

Los resultados de la hibridación in situ descrita en el Ejemplo 20 mostraron que el Flt4 se expresa en células endoteliales venosas y después en vasos linfáticos y algunas células endoteliales venosas, pero no en endotelios arteriales. Con el fin de determinar si dicha regulación se mantenía in vitro, estudiamos células endoteliales cultivadas usando inmunotransferencia (Northern) y análisis de hibridación.

Se aislaron células endoteliales de aorta, vena femoral, vena umbilical y de microvasos de prepucio humanos, se cultivaron y se caracterizaron tal como se ha descrito previamente en la técnica. Véase Van Hinsberg y col. Arteriosclerosis, 7:389 (1987); y Van Hinsbergy col., Thromb. Haemostas, 57:148 (1987). Se usaron en densidad confluente después de cinco a ocho pasos (relación de división 1:3) para el aislamiento de ARN poliaenilado.

Las líneas de células endoteliales EA-hy926 (Edgell y col., Proc. Natl. Acad. Sci, 80:3734-3737 (1983)), BCE (Folkman y col., Proc. Natl. Acad Sci, 76: 5217-5221 (1979)) y LEII (Schreiber y col., Proc. Natl. Acad Sci, 82: 6138 (1985)) no expresaron Flt4. No obstante, las células endoteliales microvasculares, venosas y de vena umbilical humanas cultivadas fueron positivas a el ARNm específico de Flt4 de 5,8 y 4,5 kb, mientras que las células endoteliales aórticas fueron negativas. Por contra, otro gen del receptor tirosina quinasa endotelial, tie, se expresó como un ARNm de 4,4 kb en todos los tipos de celulas endoteliales estudiados.

EJEMPLO 22 ARNm de Flt4 en tejidos humanos adultos

Los resultados obtenidos en el Ejemplo 20 indican que el ARNm de Flt4 se confina en gran medida al endotelio de vasos linfáticos durante el desarrollo. Debido a la importancia potencial de este hallazgo en humanos, estudiamos también la expresión de Flt4 en tejidos humanos adultos usando una sonda de Flt4 humano. La sonda de Flt4 humano usada fue un fragmento de EcoRI-SphI que abarcaba los pares de bases 1-595 del ADNc (SEQ ID Nº: 1). Véase también Pajusola y col. Cancer Res, 52:5738 (1992). La sonda de factor de von Willebrand fue un fragmento de EcoRI-HindIII que abarcaba los pares de bases 1-2334. Bonthron y col. Nucleic Acids Res, 141:7125 (1986).

Los inventores usamos material fijado rutinariamente enviado para diagnóstico histopatológico. Se obtuvo tejido de pulmón normal a partir de resección del lobulo de pulmón inferior derecho afectado por cáncer epidermoide. Se obtuvieron mesenterio y ganglios linfáticos mesenteriales de un paciente que tenía un adenocarcinoma colónico. Un ganglio linfático normal adyacente a la glándula salivar se enucleó debido a su anormal tamaño. Las amígdalas de dos pacientes y los dos apéndices no tuvieron cambios diagnósticos. Se estudiaron dos linfangiomiomas y tres linfangiomas císticos con resultados similares.

Para tejidos humanos , que fueron muestras rutinarias fijadas con formalina al 10 % para diagnóstico histopatológico, el protocolo normal in situ dio apenas señal de fondo, mientras que el tratamiento con microondas de proteinasa K permitió la hibridación específica. Shi y col., J. Biol. Chem, 266:5774 (1991); Catoretti y col., J. of Pathol, 168:357 (1992).

En el mesenterio, pulmón y endotelio linfático de apéndice dio señales de Flt4, mientras que venas, arterias y capilares fueron negativos. Para estudiar si se expresa Flt4 en las HEV, se estudiaron las amígdalas. Efectivamente, en las amígdalas, se detectaron granos autorradiográficos específicos de Flt4 en algunas HEV.

EJEMPLO 23

Análisis de ARNm de Flt4 en ganglios linfáticos normales y metástaticos y en linfangioma

Una porción de un ganglio linfático mesenterial humano (véase el Ejemplo 22) se analizó para examinar la expresión de Flt4. Se observó la expresión de Flt4 en los senos linfáticos y en vasos linfáticos aferentes y eferentes. Se observó el mismo patrón en un ganglio linfático que contenía metástasis de adenocarcinoma. Algunas HEV en ganglios linfáticos tanto normales como metástaticos también fueron positivos. La expresión de Flt4 en un linfangioma cístico fue específica a los endotelios linfáticos, como fue evidente mediante la comparación con las señales in situ para el factor de von Willebrandt en todos los vasos sanguíneos.

De acuerdo con estos resultados, la inmunotinción para Flt4 fue muy positiva en el endotelio de linfangiomatosis cutánea, un raro trastorno caracterizado por la proliferación de presunto endotelio linfático. Véase Lymboussaki y col., Am. J. Pathol., 153(2): 395-403 (agosto, 1998).

Adicionalmente, la inmunotinción para Flt4 identificó células fusiformes dentro de muestras de tejido de lesión nodular cutánea del sarcoma de Kaposi. See Jussila y col., Cancer Res., 58:1599-1604 (abril, 1998). En vista de la especifidad linfática aparente de Flt4, estos resultados pueden considerarse consecuentes con la sugerencia de que determinadas células de sarcoma de Kaposi son de origen endotelial linfático. Véase, por ejemplo, Beckstead y col. Am J. Pathol.,119: 294-300 (1985); y Dictor y col., Am J. Pathol., 130: 411-417(1988).

EJEMPLO 24 Localización de Flt4 en células endoteliales fetales

Tal como se describe en el Ejemplo 2, se clonó un fragmento de ADNc de Flt4 que codifica los 40 aminoácidos carboxi-terminales de la forma corta como un fragmento de EcoRI de 657 pb en el vector de expresión bacteriana pGEX-1λT (Pharmacia) sin cambio de marco de lectura con la región que codifica la glutation-S-transferasa. La proteína de fusión GST-Flt4 resultante se produjo en E.coli y se purificó mediante cromatografía de afinidad usando una columna de glutation-Sefarosa 4B. La proteína purificada se liofilizó, se disolvió en PBS, se mezcló con coadyuvante de Freund y se usó para la inmunización de conejos. Se usaron antisueros después de la tercera inmunización de refuerzo.

Se obtuvieron tejidos a partir de fetos humanos de 17 y 20 semanas de abortos legales inducidos con prostaglandinas. El estudio se aprobó por la comisión etica del Hospital Central de la Universidad de Helsinki. La edad gestacional se estimó por la longitud del pie del feto. El tejiodo fetal se embebió en Tissue-Tek (Miles), se congeló inmediatemente y se almacenó a 70 °C.

Se absorbió de forma cruzada antisuero anti-Flt4 en una columna de GST-Sefarosa para eliminar anticuerpos anti-GST y después se purificó por cromatografía de afinidad a GSTFH4. Varias secciones de criostat de 6 µm de espesor de los tejidos se fijaron con acetona y se trataron con H2O2 al 0,3 % en metanol durante 30 minutos para bloquear la actividad de peroxidasa endógena. Después del lavado, las secciones se incubaron con suero de cerdo normal al 5 %. Las secciones se incubaron a continuacion con anticuerpos contra Flt4 y se lavaron. Los anticuerpos unidos se detectaron con IgG anti-conejo de cerdo conjugado con peroxidasa, seguido de tinción para detectar la actividad de peroxidasa usando 3,3diaminobencidina (Amersham) al 0,2 % como sustrato. Las secciones se contratintaron en hematoxilina de Meyer.

La tinción de inmunoperoxidasa anti-Flt4 de mesenterio fetal humano mostró proteína Flt4 en el endotelio de varios vasos, mientras que las tinciones de control con anticuerpos antiFlt4 bloqueados con antígeno y sueros preinmunitarios fueron negativas. Para la comparación, se tintaron secciones con un antisuero contra el antígeno relacionado con el Factor VIII, que es específico para células endoteliales vasculares. Se observó la tinción de inmunoperoxidasa para Flt4 sobre células endoteliales de vasos, que no contenían eritrocitos, mientras que los vasos sanguíneos fueron negativos. Los vasos sin eritrocitos eran probablemente células endoteliales linfáticas; dichos vasos son particularmente frecuentes en el mesenterio. Los anticuerpos contra antígeno relacionado con Factor VIII tintaron células endoteliales en todos los vasos.

EJEMPLO 25 Producción de anticuerpos monoclonales contra el Flt4

Fusión I:

Se produjo proteína del dominio extracelular de Flt4 recombinante por expresión de la construcción del plásmido Flt4EC-6xHis-pVTBac (Ejemplo 14) en células High-Five. Los dominios extracelulares de Flt4 (Flt4EC) se purificaron a partir de medio de cultivo de las células High-Five infectadas usando cromatografia de afinidad Ni-NTA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen) para la unión y la elución de la etiqueta 6xHis codificada en el extremo COOH-terminal del dominio extracelular de Flt4 recombinante.

Se inmunizaron ratones macho Balb/c de cuatro meses mediante inyección intraperitoneal de la proteína del dominio extracelular de Flt4 producida recombinantemente (150 µg/ratón) emulsionada con coadyuvante completo de Freund. Se administraron inyecciones de refuerzo de 150 µg en intervalos de tres a cuatro semanas y se administró un refuerzo final (10 µg de Flt4 EC en PBS, administrado intraperitonealmente) después de otro intervalo de tres semanas. Cuatro días después de la dosis de refuerzo final, los ratones se sacrificaron y las células linfoides esplénicas murinas se fusionaron con células de plasmacitoma SP 2/0 en una relación 2:1, respectivamente.

Las células fusionadas se recolectaron en placas de cultivo de 96 pocillos (NUNC) en medio Ex-Cell 320 (SERALAB) que contenía suero de carnero fetal al 20 % y suplemento HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina; GIBCO, 043-01060H; diluido 50 veces). Se cultivaron células a +37 °C, en una atmósfera de CO2 al 5 %. Después de 10 días, el medio suplementado con HAT se cambió por medio de cultivo celular suplementado con HT (GIBCO, 043-01065H, diluido 50 veces). El medio HT es idéntico al medio HAT, pero carece de aminopterina.

En tres semanas, se determinó la producción de anticuerpo específico mediante ensayo inmuno fluorométrico (IFMA) específico de anticuerpo, descrito anteriormente en el Ejemplo 26. Los clones maestros se clonaron mediante diluciones limitadas tal como se describe por

Staszewski y col., Yale Journal of Biology and Medicine, 57:865-868 (1984). Los clones positivos se expandieron en placas de cultivo de tejido de 24 pocillos (NUNC), se reclonaron y se volvieron a analizar usando el mismo procedimiento. Los clones positivos se analizaron mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).

Los clones estables segregaron inmunoglobulinas pertenecientes a la clase lgG1, excepto uno, que produjo Ig perteneciente probablemente a la clase IgA. La subclase de anticuerpos monoclonales se determinó usando anticuerpos monoclonales de rata a subclase de ratón como conjugado de biotina (SEROTEC) en IFMA.

Los ratones Balb/c se usaron para producir anticuerpos monoclonales en líquido ascítico. Los hibridomas descritos anteriormente se inyectaron intraperitonelamente en ratones después de pretratamiento de los animales con pristana (2,6,10,14-tetrametilpentadecano al 98 %, ALDRICH-CHEMIE D7924 Steinheim, Nº cat T 2,280-2). Se inyectaron 0,5 ml de pristana (i.v.) aproximadamente dos semanas antes de las células de hibridoma. La cantidad de células inyectada fue aproximadamente de 7,5 a 9 x 106 por ratón. La ascitis se recogió 10 a 14 días después de la inyección de los hibridomas.

Fusión II:

Se inmunizaron ratones hembras Balb/c de dos meses mediante inyección intraperitoneal de la proteína del dominio extracelular de Flt4 producida recombinantemente (20 µg/ratón) emulsionada con coadyuvante completo de Freund. Se administraron inyecciones de refuerzo de 20 µg en intervalos de tres a cuatro semanas y se administró un refuerzo final (10 µg de Flt4 en PBS, administración i.v.) después de otro intervalo de tres semanas. Cuatro días después de la dosis de refuerzo final, los ratones se sacrificaron y las células linfoides esplénicas murinas se fusionaron con células de plasmacitoma SP 2/0 en una relación 2:1, respectivamente.

Las células fusionadas se recolectaron en placas de cultivo de 96 pocillos (FALCON) en medio OptiMEM 1 (con Glutamax, 1,51985-026, GIBCO BRL) que contenía suero de carnero fetal al 20 % y suplemento HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina, GIB-CO BRL 21060-017; diluido 1:50 veces). Se cultivaron células a +37 °C, en una atmósfera de CO2 al 5 %. Después de 10 días, el medio suplementado con HAT se cambió por medio de cultivo celular suplementado con HT (GIBCO, 41065-012, diluido 1:50 veces).

En tres semanas, se determinó la producción de anticuerpo específico mediante ensayo inmunofluorométrico (IFMA) específico de anticuerpo, descrito anteriormente en el Ejemplo 26. Los clones maestros se clonaron mediante diluciones limitadas tal como se describe por Staszewki y col. (1984). Los clones positivos se expandieron en placas de cultivo de tejido de 24 pocillos (FALCON), se reclonaron y se volvieron a analizar usando el mismo procedimiento. Los clones positivos se analizaron mediante FACS.

Los clones 2E11 y 6B2 segregaron inmunoglobulinas pertenecientes a la clase lgG1 y los clones 2B12 produjeron Ig perteneciente a la subclase IgM. La subclase lgG1 de ratón se determinó usando anticuerpos monoclonales de rata contra la cadena pesada de la subclase de ratón como conjugado de biotina (SEROTEC) en IFMA y la subclase IgM de ratón se determinó con el kit Mouse Monoclonal Antibody Isotyping (Dipstick Format) (19663-012, Life Technologies Inc.).

EJEMPLO 26 Especificidad de anticuerpos monoclonales contra el Flt4

El producto de fusión dominio extracelular de Flt4 recombinante-6xHis purificado (producido tal como se describe en los Ejemplos 14 y 25) se etiquetó con europio de acuerdo con Mukkala y col., Anal.Biochem, 176(2):319-325 (1989), con la modificación siguiente: se añadió un exceso molar de 250 veces de isotiocianato DTTA-Eu (quelato N1, WALLAC, Finlandia) a la solución de Flt4 (0,5 mg/ml en PBS) y se ajustó el pH a aproximadamente 9 añadiendo tampón de carbonato de sodio 0,5 M, pH 9,8. El etiquetado se realizó durante la noche a +4 °C. Se eliminó la etiqueta no unida usando PD-10 (PHARMACIA, Suecia) con tampón TSA (Tris-HCI 50 mM, pH 7,8, que contenía NaCI 0,15 M) como eluyente.

Después de la purificación, se añadió 1 mg/ml de albúmina de suero bovino (BSA) al Flt4 etiquetado y la etiqueta se almacenó a +4°C. El número promedio de iones de europio incorporados por molécula de Flt4 fue 1,9, tal como se determinó midiendo la fluorescencia en una relación de patrones de EuCI3 (Hemmila y col., Anal.Biochem, 137:335-343 (1984)).

Los anticuerpos producidos en el Ejemplo 25 se analizaron usando un ensayo inmunofluorométrico tipo Sandwich, usando pocillos de tiras de microvaloración (NUNC, polysorb) recubiertos con Ig anti-ratón (Z 259, DAKOPATTS). Los pocillos prerrecubiertos se lavaron una vez mediante Platewash 1296-024 (WALLAC) con solución DELFIAwash. El

5 tampón de ensayo DELFIA se usó como tampón de dilución para sobrenadantes de cultivo celular y para suero de ratón esplenectomizado (a diluciones de entre 1:1000 a 1: 100.000) usado como control positivo en el ensayo de análisis preliminar.

La incubación durante la noche a +4 °C (o alternativamente durante 2 horas a temperatura ambiente) se inició mediante agitación sobre un agitador Plateshake (1296-001, 10 WALLAC) durante 5 minutos y se continuó lavando cuatro veces con solución de lavado tal

como se ha descrito previamente.

El Flt4 etiquetado con europio se añadió a una dilución de 1:500 a 100 µl del tampón de ensayo. Después de 5 minutos sobre el agitador Plateshake y una hora de incubación a temperatura ambiente, las tiras se lavaron tal como se ha descrito anteriormente.

15 Se añadió solución de potenciación (DELFIA) a 200 µl/well. Las placas se agitaró a continuación durante 5 minutos sobre un agitador Plateshake y se midió la intensidad de la fluorescencia mediante ARCUS-1230 (WALLAC) durante 10-15 minutos.

(Lovgren y col., In: Collins W.P. (Ed.) Alternative Immunoassays, John Wiley & Sons Ltd. (1985), páginas 203-216). Los resultados de DELFIA mostraron que todos los anticuerpos 20 analizados se unieron al antígeno Flt4 EC. Se seleccionaron los anticuerpos monoclonales reactivos con Flt4 (y los hibridomas que producen los anticuerpos) para un análisis posterior. Los anticuerpos monoclonales resultantes se usaron en la tinción de inmunofluorescencia de anticuerpos doble de células NIH3T3 que expresan la construcción LTR-FLT41 y células NIH3T3 transfectadas resistentes a neomicina. Las células se separaron de las placas de

25 cultivo usando EDTA, se tintaron y se analizaron en un seleccionador de células activadas por fluorescencia (FACS). Los resultados del análisis FACS se proporcionan como porcentajes de células de tinción positiva con los anticuerpos monoclonales indicados (véase la Tabla 2, a continuación).

TABLA 2

Clones de Mab

LTR%a) NEO%b) Recuentos DELFIA

1B1

67,3 1 20625

1B1D11

75 1,2 19694

1B1F8

76,1 1,4 18580

4F6

69,9 1,2 23229

4F6B8G12

75 0,3 24374

4F6B8H11

75,9 0,3 28281

4F6B8E12

74,8 0,4 27097

4F6B8G10

75,3 0,4 26063

9D9

45,1 0,75 17316

9D9D10

71,7 2,3 18230

9D9F9

73 1,8 11904

9D9G6

74,3 2,9 16743

9D9G7

70,7 1,3 17009

(cont.)

10E4

24,2 1,4 39202

10E4B10E12

32,3 0,3 42490

10E4B10G10

36,5 0,3 54815

10E4B10F12

45,6 0,4 43909

10E4B10G12

45,7 0,5 35576

11G2 11G2D12

30,2 1,6 11304

74,4

1,5 14660

11G2G9

74,2 0,9 10283

11G2H7

74,4 2,1 25382

a) Resultados FACS con células transfectadas LTR b) Resultados FACS con células NEO (control)

Los resultados FACS con células transfectadas LTR-FLT4l indican que los anticuerpos reconocieron eficazmente las células que expresan Flt4. Estos mismos anticuerpos dan sólo

5 tinción de fondo de células NIH3T3 transfectadas con neomicina fosfotransferasa. De este modo, los anticuerpos reconocen específicamente la tirosina quinasa Flt4 sobre la superficie celular.

Un clon, denominado hibridoma 9D9F9 ant-Flt4, se encontró que segregaba de forma estable anticuerpo monoclonal que se determinó que era inmunoglobulina de clase IgG1, por

10 IFMA. El hibridoma 9D9F9 se depositó en la Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares, Departamente de cultivos celulares humanos y animales y virus, Mascheroder Weg 1b, 3300 Braunschweig, Alemania, 23 de marzo de 1995, y se le dio el número de acceso ACC2210.

Anticuerpos de Fusión II

La proteína del dominio extracelular de Flt4 etiquetada con europio descrita anteriormente también se usó para analizar los anticuerpos de Fusión II descritos en el ejemplo

25. Los anticuerpos se analizaron usando un IFMA específico de Flt4 usando pocillos de microvaloración (Nunc, Polysorb) recubiertos con Ig anti-ratón de conejo (Z 259, DAKO). Los pocillos prerrecubiertos se lavaron una vez con solución de lavado (Wallac) usando DELFIA Platewash.

Se usó tampón de ensayo DELFIA como tampón de dilución para sobrenadantes de cultivo celular (dilución 1:2 en análisis preliminar) y para suero del ratón esplenectomizado (dilucioones 1:1000 a 1:100.000) que se usó como control positivo. Como patrón, se usó 9D9F9 anti-Flt4 (subclase IgG1 de ratón) a concentraciones de entre 1,0 ng/ml y 250 ng/ml. Las muestras se agitaron primeramente a temperatura ambiente durante cinco minutos sobre un agitador Plateshake y después se incubaron durante aproximadamente 18 horas a +4 ºC. Los marcos se lavaron primeramente cuatro veces, después se añadió el Flt4 etiquetado con Eu (1:2000, en 100 µl de tampón de ensayo) y finalmente los marcos se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Después del lavado tal como se ha descrito, se añadió solución potenciadora (200 µl/well, Wallac) y los marcos se agitaron durante cinco minutos sobre el agitador Plateshake. Se midió la intensidad de fluorescencia mediante ARCUS-1230 (Wallac). Los anticuerpos monoclonales reactivos con Flt4 se seleccionaron para análisis posteriores en el ensayo de tinción de fluorescencia de anticuerpos doble usando células NIH3T3 que expresan flt4, tal como se ha descrito anteriormente.

Los anticuerpos monoclonales de Fusión II contra Flt4 resultantes y los resultados correspondientes de analisis FACS (expresados como porcentajes de células que tintaron positivo con el anticuerpo monoclonal indicado) se resumen en la Tabla 3.

Se realizó una curva estándar para la cuantificación de anticuerpos anti-Flt4 usando afinidad a 9D9F9 anti-Flt4 purificadas. El intervalo lineal alcanzó desde 1,0 ng/ml hasta 250 ng/ml.

Se sometió a electroforesis el lisado celular de células NIH3T3 cotransfectadas con la construcción pLTRFLT4l que expresan Flt4 de cadena completa sobre la superficie en SDSPAGE al 6,5 %, se transfirieron las proteínas sobre una membrana de nitrato de nitrocelulosa (0,45 µm, SCHLEICHER & SCHUELL) y se inmunotransfirieron con sobrenadante de cultivo celular de hibridoma que contenía anticuerpos monoclonales (1:10, TRIS 50 mM – tampón de glicina 40 mM que contenía metanol al 4 %, SDS al 0,04%). Las especificidades de los anticuerpos monoclonales se detectaron usando incubación con Ig anti-ratón de conejo conjugado con HRP (P 161, DAKO, diluido 1:1000 en tampón de TRIS 20 mM, pH 7,5, que contenía solución salina 150 mM, leche en polvo al 5 %) y ECL (quimioluminiscencia potenciada, AMERSHAM).

TABLA 3

Clones de Mab

% de LTRa) NEOb) Producción de Mab aproximada en ng/ml/106 células c) WB

2B12E10

39,5 6,0 440 +

2E11D11

44,6 8,8 110 +

2E11F9

49,5 4,5 100 +

2E11F12

46,0 4,1 180 +

2E11G8

41,2 7,8 160 +

6B2E12

NF NF 1390 +

(cont.)

6B2F8

NF NF 470 +

6B2G6

NF NF 630 +

6B2H5

NF NF 740 +

6B2H8

NF NF 1800 +

a) Resultados FACS con células transfectadas LTR b) Resultados FACS con células NEO (control) c) Cuantificación de la producción de Mab basada en anticuerpo 9D9F9 antiFLT purificado por afinidad usado como patrón NF sin función en FACS WB usado satisfactoriamente en inmunotransferencia (Western)

EJEMPLO 27 Uso de anticuerpos anti-Flt4 para identificar Flt4 en lisados celulares y expresado en células endoteliales linfáticas en tejido humano

5

Los anticuerpos monoclonales producidos por hibridoma 9D9 descritos en los ejemplos

10 precedentes se usaron en inmunoprecipitación e inmunotransferencia (Western) de lisados de células HEL. Tal como se comunicó en el Ejemplo 6, la expresión de ARNm de Flt4 se observó previamente en células HEL. Se lisaron aproximadamente 2x107 células HEL cultivadas en tampón RIPA especificado en el Ejemplo 11 y se inmunoprecipitaron con aproximadamente 2 microgramos del anticuerpo 9D9 (tal como se describe para anticuerpos policlonales en el

15 Ejemplo 11). Para el analisis de inmunotransferencia (Western), los inmunoprecipitados se sometieron a electroforesis mediante SDS-PAGE (6 % de gel) y se electroinmunotransfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Se detectaron bandas de polipéptido de 175 kD y 125 kD, correspondientes a polipéptidos Flt4 en el análisis de inmunotransferencia (Western) de los inmunoprecipitados usando una 1 microgramo/ml de dilución del anticuerpo 9D9.

Se realizó la inmunotinción de tejido de piel humano usando los anticuerpos monoclonales 9D9 y un kit de fosfatasa alcalina ABC-AP (Dako). Brevemente, los portaobjetos que contenían muestras de 6µm de piel de humano adulto se secaron durante 30 minutos a temperatura ambiente (TA), se fijaron durante diez minutos con acetona fría y después se lavaron una vez durante cinco minutos con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las muestras se incubaron después durante 30 minutos a TA con suero de caballo al 2 % y se lavaron tres veces durante cinco minutos en PBS.

Para la inmunotinción, las muestras se incubaron durante una hora a TA con el anticuerpos primario 9D9 y se lavaron tres veces durante cinco minutos con PBS. Después del lavado, las muestras se incubaron durante treinta minutos a TA con anticuerpos secundario anti-ratón de conejo biotinilados y se lavaron de nuevo tres veces durante cinco minutos con PBS.

Se detectaron los anticuerpos unidos incubando las muestras durante treinta minutos a TA con complejo ABC-AP, se lavaron tres veces con PBS, se incubaron durante quince minutos a TA con sustrato AP (Sigma Fast Red TR/Naphtol AS-MX (Nº cat F-4648)) y se enjuagaron con agua. Las muestras se contratintaron con hematoxilina de Mayer durante treinta segundos y se enjuagaron con agua. Se montaron en aquamount y se cubrieron con un cubreobjetos y las muestras se analizaron al microscopio. Se observó la tinción del anticuerpo 9D9 en células endoteliales linfáticas en estas secciones de piel humana. Los vasos sanguíneos mostraron tinción extremadamente débil o ninguna tinción. Los análisis adicionales han servido para confirmar la especifidad aparente para endotelios linfáticos. Véase Lymboussaki y col., Am. J. Pathol., 153(2):395-403 (agosto, 1998); y Jussila y col., Cancer Res., 58:1599-1604 (abril, 1998), los cuales se incorporan al presente documento por referencia en su totalidad.

Estos resultados confirman adicionalmente la utilidad de Flt4 como marcador útil para endotelios linfáticos y la utilidad de anticuerpos ant-Flt4 para identificar y visualizar Flt4 expresado en estas células, en una muestra de tejido.

EJEMPLO 28

Regulación al alza de las rutas de señalización VEGF-C/VEGFR-3 en angiogénesis de cáncer de mama

Los ejemplos anteriores demuestran que el Flt4 (VEGFR-3) es útil como marcador antigénico especifico para endotelios linfáticos en tejidos normales. Los procedimientos siguientes demuestran adicionalmente que el VEGFR-3 es útil como marcador antigénico (por ejemplo, para diagnóstico y análisis) y como diana terapéutica en tumores de mama malignos. Se encontró un número muy elevado de vasos positivos a VEGFR-3 en cáncer de mama invasivo, en comparación con tejidos de mama histológicamente normales (P<0,0001).

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS:

Se obtuvieron muestras de tejido de mama recién congeladas de los depósitos del Departamento de Patología, Universidad de Helsinki. Las muestra consistían en carcinoma ductal (n=6), carcinoma lobular (n=6), carcinoma intraductal (n=8), fibroadenoma (n=4) y tejido de mama histológicamente normal (n=12). Todas las muestras se enfriaron inmediantemente después de la excisión quirúrgica en nitrógeno líquido y se almacenaron a -70 °C.

Se produjeron anticuerpos monoclonales de ratón (Mabs) contra Flt4 (VEGFR-3) humano esencialmente tal como se describe en los ejemplos precedentes, por ejemplo, en el Ejemplo 25. El dominio proteico extracelular VEGFR-3 (VEGFR-3EC) se expresó mediante un baculovirus recombinante en células de insecto y se purificó a partir del medio de cultivo. Después se produjeeron anticuerpos monoclonales murinos contra VEG-FR-3--EC usando procedimientos estándar y la fracción de inmunoglobulina se purificó mediante cromatografía de afinidad a proteína A a partir de líquido ascítico de hibridoma o sobrenadantes de cultivo Tecnomouse®.

Críosecciones de cinco µm de las muestras de tejidos se secaron al aire y se fijaron en acetona fría durante 10 minutos. Las secciones se rehidrataron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se incubaron durante 30 minutos en suero de caballo normal al 5 % a temperatura ambiente. Las secciones se incubaron después durante 2 horas en una atmósfera húmeda a temperatura ambiente con los Mabs 9D9F9 (Ejemplo 26) a una concentración de 1,0 µg/ml. También se estudiaron otros Mab anti-VEGFR-3 contra distintos epítopos del VEGFR3EC; se usaron clones de 2E11D11 (Ejemplo 26) y 7B8F9 (preparados esencialmente tal como se describe en el Ejemplo 26) a las concentraciones de 9,5 y 8,5 µg/ml, respectivamente. Se realizó una incubación subsiguiente durante 30 minutos en suero anti-ratón biotinalado para una incubación de 60 minutos usando reactivos del kit Vectastain Elite Mouse IgG ABC (Vector laboratories, Burlingame, Estados Unidos). Se desarrollo actividad de peroxidasa con 3-amino9-etil carbazol (AEC, Sigma, St. Louis, Estados Unidos) durante 10 minutos. Finalmente, las secciones se tintaron con hematoxilina durante 30 segundos. Se realizaron controles negativos omitiendo el anticuerpo primario o usando anticuerpos primarios irrelevantes del mismo isotipo. Se usó inmunógeno baculovírico purificado para bloquear la unión de los anticuerpos 9D9 como otro control negativo. En estos experimentos, los anticuerpos se incubaron durante la noche con un exceso molar de 10 veces de la proteína VEGFR-3EC en PBS. Después de la centrifugación durante 4 minutos a 4000 rpm, +4 °C, el sobrenadante se recogió cuidadosamente y´se usó a continuación como anticuerpo primario. Las microsecciones de 5 µm adyacentes a las tintadas con los anticuerpos anti-VEGFR-3 se inmunotintaron para el marcador endotelial vascular sanguíneo PAL-E (0,15 µg/ml, Monosan, Uden, Países Bajos), laminina (dilución 1:4000 del sobrenadante de clon LAM-89, Sigma, St Louis, MO, Estados Unidos), colágeno XVIII (1.9 µg/ml), α-actina de músculo liso (SMA, 0,5 ng/ml, clon 1A4, Sigma), VEGFR-1 (dilución 1:200 del sobrenadante de clon 19) o VEGFR-2 (dilución 1:100).

El examen patológico de todas las muestras se realizó después de los procedimentos de tinción. Las densidades vasculares sanguíneas se obtuvieron a partir de portaobjetos tintados para PAL-E [de Waal y col. Am. J. Pathol, 150: 1951-1957 (1997)], siguiendo las directrices recomendadas por Gasparini y Harris. [Gasparini G y Harris A, J. Clin. Oncol, 13: 765-782 (1995).] Las densidades de vasos positivos a VEGFR-3 se estudiaron del mismo modo. Se examinó primero un portaobjetos a magnificación baja, y la densidad del vaso intratumoral se analizó después contando el número de vasos tintados para un campo de alta potencia (hpf) de magnificación de 400x en las zonas con la densidad vascular más alta (“puntos calientes vasculares”) o en las zonas con la densidad más alta de vasos positivos a VEGFR-3. Se contaron por portaobjetos un mínimo de 5 campos, después de lo cual se hizo la media de los 3 recuentos más altos.

Se realizó un tintado doble para diferenciar el tintado inmunohistoquímico de vasos linfáticos y sanguíneos en dos carcinomas intraductales. Las criosecciones de 5 µm fijadas a acetona se incubaron durante 1 hora con anticuerpos anti-PAL-E, con anticuerpo anti-ratón de caballo biotinilado (kit Vectastain Elite Mouse IgG ABC, Vector laboratories, Burlingame, Estados Unidos) durante 30 minutos, con ABC-peroxidasa (Vectastain, 1:100) durante 45 minutos, y se revelaron con AEC durante 10 minutos. Para la segunda etapa, las secciones se incubaron con anticuerpos anti-VEGFR-3 durante 1 hora (0,14 µg/ml), y después con anticuerpo anti-ratón biotinilado durante 30 minutos (dilución 1:200 del sobrenadante de clon), ABC-peroxidasa durante 30 minutos (1:100), solución de tiramina biotinilada(1:2.000) que contenía peróxido al 0,01 % durante 5 minutos, ABC-fosfatasa alcalina (1:100) durante 20 minutos, y se revelaron con Fast Blue (Sigma, St. Louis, Estados Unidos) durante 20 minutos, de acuerdo con un procedimiento descrito previamente en la bibliografía para mejora de la señal de ISH. [Kerstens y col., J. Histochem. Cytochem, 43:347-352 (1995).] Las criosecciones (5 µm) adyacentes a las secciones de doble tinción también se inmunotintaron sólo con anticuerpos VEGFR-3, tal como se ha descrito anteriormente.

Se produjeron anticuerpos policlonales en conejos contra un péptido sintético correspondiente a los restos de aminoácidos 2-18 del extremo N-terminal del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF-C) humano segregado (restos 104-120 del polipéptido VEGF-Cprepro-VEGF-C) tal como se describe en la bibliografía. [Joukov y col., EMBO J, 16:3898-3911 (1997). Los antisueros se purificaron por afinidad usando el polipéptido inmunógeno acoplado a una columna de sefarosa-6B activada con epoxi y se analizaron para detectar la tinción específica de VEGF-C usando células infectadas con un vector adenovírico que expresa VEGF-C o control β-galactosa.

Los ocho carcinomas intraductales y todos los carcinomas invasivos analizados para detectar VEGFR-3 se eligieron para análisis posteriores de la expresión de VEGF-C. Las criosecciones de cinco micrómetros adyacentes a las secciones tintadas con los antcuerpos anti-VEGFR-3 se secaron al aire y se fijaron en acetona fría durante 10 minutos. Las secciones se rehidrataron en PBS y se incubaron durante 30 minutos en suero de cabra normal al 5 % y después durante 2 horas en una atmósfera húmeda a temperatura ambiente con los anticuerpos policlonales de conejo contra VEGF-C humano, con dilución 1:200 en PBS. Una incubación subsiguiente durante 30 minutos en suero anti-conejo biotinalado fue seguida de una incubación de 60 minutos usando reactivos del kit Vectastain Elite Rabbit IgG ABC (Vector laboratories, Burlingame, Estados Unidos). Las secciones se procesaron posteriormente tal como se ha descrito anteriormente. Como control negativo, se usó inmunógeno purificado para bloquear la unión de los anticuerpos VEGF-C. En estos experimentos, los anticuerpos VEGF-C se incubaron durante la noche con un exceso molar de 10 veces de la proteína VEGFR-C en PBS. Después de 4 minutos de centrifugación a 4000 rpm a +4 °C, el sobrenadante se recogió cuidadosamente y se usó en la inmunotinción.

Se generaron anticuerpos a colágeno humano de tipo XVIII por DiaBor Ltd. (Oulu, Finlandia) por inmunización de ratones con el polipéptido recombinante QH48.18 [Saarela y col. Matrix Biology, 16: 319-28 (1998)], corresondientes a la región común del dominio NC1 N-terminal del colágeno humano de tipo XVIII. Los clones se analizaron mediante ensayo ELISA y análisis de inmunotransferencia (Western) usando el polipéptido QH48.18 y también mediante tinción inmunofluorescente de secciones de tejido humano congeladas. El análisis de los clones de hibridoma dio como resultado tres anticuerpos monoclonales, que fueron positivos en los tres ensayos mencionados (ELISA, inmunotransferencia (Western), tinción inmunofluorescente). Uno de los anticuerpos que dio las señales más fuertes, DB144-N2, se usó en los experimentos subsiguientes. Dio un patrón de tinción idéntico [por ejemplo, en muestras de riñón y piel de ser humano adulto) al del policlonal anti-all hu(XVIII).

RESULTADOS:

A. VEGFR-3 en tejido de mama histológicemante normal y en fibroadenomas benignos

La tinción inmunohistoquímica de VEGFR-3 en tejido de mama normal mostró una tinción muy débil en capilares del estroma interductal. Estos vasos no forman ningún patrón específico, pero están diseminados por todo el estroma. La densidad de los vasos positivos a VEGFR-3 en muestras de tejido de mama normal variaba de 6 a 17 por hpf, mediana igual a 9 (n=12). La mayor parte de los vasos se tintaron fuertemente para el marcador endotelial vascular sanguíneo PAL-E y para el componente de lámina basal, colágeno XVIII, sugiriendo que el VEGFR-3 se expresaba débilmente en los vasos sanguíneos de tejido de mama normal. Sin embargo, algunos vasos estrechos del estroma, que se tintaron claramente para VEGFR-3 fueron negativos para PAL-E y sólo débilmente positivos para el colágeno tipo XVIII, sugieriendo que eran vasos linfáticos. Los vasos positivos a VEGFR-3 también se encontraron uniformemente en fibroadenomas benignos, en los que la densidad (mediana 8 en vaso para hpf; intervalo 3-19; n= 4) no difieren de las del tejido de mama histológicamente normal (mediana 8 frente a 9; P>0,1, ensayo de Mann-Whitney).

B. Vasos positivos a VEGFR-3 en carcinomas intraductales

En carcinomas intraductales, se observó un patrón distintivo de vasos positivos a VEGFR-3 tintados fuertemente. Los vasos formaban estructuras tipo arco alrededor de los conductos afectados (Fig. 5A). Este patrón “collar” también se observó en la tinción de secciones adyacentes para el marcador endotelial de vasos sanguíneos, PAL-E (Figura 5B), sugieriendo que la expresión de VEGFR-3 mejoró en el endotelio capilar. Con el fin de diferenciar con más claridad entre vasos sanguíneos y linfáticos y para buscar la presencia de células de músculo liso y pericitos en las paredes de vasos, se realizaron tinciones adicionales usando anticuerpos contra α-actina de músculo liso (SMA) y componentes de lámina basal laminina y colágeno de tipo XVIII. De acuerdo con esta tinción, los vasos pequeños cercanos a los carcinomas intraductales expresaron simultáneamente VEGFR-3 y las proteínas de lámina basal, pero tintaron más debilmente para SMA, indicando que estaban cubiertos de forma incompleta por pericitos/células de músculo liso en la pared del vaso (flechas negras en las Figuras 5C-5F). En contraste, vasos sanguíneos más grandes a alguna distancia de las lesiones intraductales fueron en general negativos para VEGFR-3, pero positivos para laminina, colágeno XVIII y SMA (flechas rojas). Además, se encontraron vasos, que fueron positivos para VEGFR-3, pero sólo se tintaron muy débilmente para proteínas de lámina basal y colágeno de tipo XVIII y nada para SMA (flechas verdes). Se consideró que éstos representan vasos linfáticos.

C. Tinción doble diferencial de vasos sanguíneos y linfáticos

Se eligieron dos carcinomas intraductales para el procedimiento de tinción doble inmunohistoquímica para diferenciar más claramente vasos linfáticos de vasos sanguíneos.

[See de Waal y col. Am. J. Pathol, 150: 1951-1957 (1997).] Usando este procedimiento, los vasos positivos a VEGFR-3 se tintaron de azul, mientras que los vasos y láminas basales positivos a PAL-E se tintaron de marrón. Ambas muestras de ensayo mostraron un patrón similar de tinción: los vasos que revisten los ductos que presentan tumores fueron predominantemente positivos a PAL-E (cabeza de flecha en las Figuras 5G y 5H), mientras que los vasos positivos a VEGFR-3, presumiblemente linfáticos, situados a corta distancia en el estroma interductal fueron negativos a PAL-E (flechas negras en las Figuras 5G y 5H). Con el fin de excluir malas interpetraciones debido a posibles artefactos de tinción doble, las secciones de 5 µm adyacentes se tintaron sólo con anti-VEGFR-3. Las tinciones confirmaron que varios de los vasos sanguíneos positivos a PAL-E son también positivos a VEGFR-3.

D. VEGF-C, VEGFR-1 y VEGFR-2 en las células de carcinoma intraductal y sus recpetores en vasos adyacentes

Se usaron anticuerpos purificados por afinidad policlonales contra VEGF-C humano para tintar las 8 muestras de carcinoma intraductal. Todas las muestras analizadas contenían al menos algún VEGF-C, pero se observó una heterogeneidad considerable en la intensidad de la tinción y en los patrones de expresión. En algunos casos, la mayor parte de las células de carcinoma fueron muy positivas para VEGF-C, mientras que en otras, sólo algunas células de carcinoma dieron una señal de tinción. En contraste, se observó muy poca o ninguna señal en tejidos normales circundantes a los conductos afectados, aunque también se obtuvo una señal muy débil en epitelio ductal normal no afectado. Los experimentos de bloque de antígeno indicaron que la tinción para VEGF-C era específica. El otro receptor VEGF-C, VEGFR-2, así como el otro receptor VEGF (VEGFR-1), fueron expresados ambos en los mismos vasos “collar” adyacentes a las células de carcinoma intraductal.

E. Vasos positivos a VEGFR-3 y VEGF-C en carcinoma de mama invasivo

Los vasos positivos a VEGFR-3 fuertemente tintados también se presentaron en todos los carcinomas ductales y carcinomas lobulares estudiados. Los vaos positivos a VEGFR-3 no parecieron formar ningún patrón de distribución específico; la mayor parte de estos vasos también fueron inmunorreactivos para el antígeno PAL-E. La densidad del vaso positivo VEGFR-3 intratumoral (mediana 21, intervalo 9-56 vasos por hpf; n=12) se elevó significativamente en los carcinomas de mama invasivos cuando se comparó con tejido de mama normal (mediana 21 frente a 9; P<0,0001, ensayo de Mann-Whitney). Ocasionalmente, se pudo observar la invasión de las células del carcinoma en vasos linfáticos positivos a VEGFR-3.

La inmunotinción para VEGF-C varió intensamente entre los carcinomas invasivos estudiados (n=12). Algunas células de carcinoma fueron muy positivas a VEGF-C, mientras otras tintaron muy débilmente o, en algunos casos, no se observó tinción. Como en los carcinomas intraductales, se observó muy poca o ninguna tinción en el tejido conectivo de estas secciones.

Los datos anteriores revelan que el VEGFR-3, que había parecido, por otra parte, ser un marcador endotelial predominantemente linfático en la mayor parte de tejidos adultos, se expresa muy débilmente también en endotelio capilar de tejido de mama normal. Más significativamente, en carcinomas intraductales, un patrón "collar" de vasos positivos a VEGFR3 fuertemente tintados se detectó recubriendo los conductos con presencia de tumores. La mayor parte de estos vasos expresaron el marcador endotelial de vasos sanguíneos PAL-E y los componente de lámina basal laminina y colágen XVIII, pero aparentemente tenían menos pericitos/células de músculo liso que los vasos sanguíneos localizados más lejos de las células tumorales, como se muestra mediante tinción usando anticuerpos contra SMA. Estas características sugieren que los vasos “collar” se sometieron a angiogénesis. Un segundo grupo de vasos situados a distancia de los conductos afectados fueron positivos para VEGFR3, pero muy débilmente positivos para los componentes de lámina basal y negativos para PALE, sugieriendo que eran vasos linfáticos. Estos vasos también carecieron de componentes pericíticos positivos a SMA. También en carcinomas de mama invasivos, el VEGFR-3 fue regulado al alza en vasos sanguíneos positivos a PAL-E, aunque los patrones de vasos observados fueron organizados más aleatoriamente en estroma de tejido conectivo alrededor de células tumorales. Los resultados indican que la expresion de VEGFR-3 se regula al alza en carcinomas de mama durante la angiogénesis asociada con el crecimiento tumoral. El número muy elevado de vasos positivos a VEGFR-3 encontrado en carcinoma in situ es compatible con la hipótesis de que las células de carcinoma producen factores que activan el crecimiento de vasos sanguíneos en la vecindad inmediata de las células de carcinoma.

Ya que el VEGF-C se une tanto a VEGFR-3 como a VEGFR-2 con gran afinidad, y ya que las células de carcinoma intraductal e invasivo tintaron frecuentemente positivo para proteína VEGF-C, este factor de crecimiento es un factor de crecimiento probable para los vasos positivos a VEGFR- 3 y VEGFR-2 en los carcinomas. Estos datos están de acuerdo con otro estudio, en el que casi la mitad de los treinta y cinco tumores invasivos malignos no seleccionados (incluidos carcinomas de mama, carcinomas de células escamosas, linfomas, melanomas y sarcomas) contenían ARNm de VEGF-C en los análisis de inmunotransferencia (Northern). [Véase Salven y col., Am. J. Pathol., 153(1): 103-108 (julio, 1998). Colectivamente, los datos comunicaod en el presente documento proporcionan una indicación para el tratamiento de carcinomas de mama y posiblemente otros carcinomas no linfáticos con agentes que bloquean la estimulación mediada por VEGF-C de VEGFR-3 y/o VEGFR-2. Los agentes de bloqueo que se consideran incluyen: anticuerpos anti-VEGF-C; anticuerpos anti-VEGFR-3; anticuerpos anti-VEGFR-2; anticuerpos biespecíficos que se unen a VEGFR-3 y a VEGFR-2 o a VEGF-1; fragmentos del dominio extracelular de VEGFR-3 solubles que se unirán al VEGF-C en circulación; fragmentos y análogos de VEGF-C que se unen a VEGFR-3 y/o VEGFR-2 y que inhiben la activación de estos receptores; polipéptidos, frgmentos y análogos de VEGF-C que se unen a VEGFR-3 y/o VEGFR-2 y que están conjugados con un agente terapéutico adecuado; inhibidores tirosina quinasa VEGFR-3; y pequeñas moléculas que se unen a estos receptores y los inhiben. Además, ya que el VEGF-D se une tanto a VEGFR-3 como a VEGFR2, se consifera que anticuerpos anti-VEGF-D y fragmentos y análogos de VEGF-D inhibitorios son agentes de bloqueo adecuados. Son preferentes los anticuerpos humanos o humanizados y los fragmentos de los mismos , en la medida en que los agentes anticuerpos se seleccionan para terapia humana. Adicionalmente, se considera, como un aspecto adicional de la presente invención, el uso de cualquiera de los agentes anteriores para evaluar tejido de mamífero in vitro o in vivo, por ejemplo, para los fines de diagnóstico y análisis de tumores malignos y la extensión de estos tumores malignos.

Para cualquiera de los agente anteriores, se considera que el agente puede mejorarse, además, para diagnóstico y análisis mediante la unión de una etiqueta detectable, incluidas, pero no limitadas a, isótopos radioactivos (por ejemplo, 14C, 133l y 125l), cromóforos (por ejemplo fluoresceína, ficobiliproteína; tetraetil rodamina; enzimas que producen un producto fluorescente o coloreado para detección por fluorescencia; absorbancia, color visible o aglutinación, que produce un producto electrón-denso para detección mediante microscopía electrónica); o moléculas electrón-densas tales como ferritina, peroxidasa o perlas de oro. Asimismo, los agentes pueden mejorarse adicionalmente para propósitos terapéuticos mediante unión (por ejemplo, conjugación) o coadministración con moléculas que tienen propiedades antineoplásicas, tales como toxinas de origen vegetal, animal, microbiano o fúngico; isótopos radioactivos, fármacos; enzimas; y/o citocinas y otras proteínas terapéuticas. (Véase, por ejemplo, Pietersz & McKenzie, "Antibody Conjugates for the treatment of Cancer," Immunological Reviews, 129:57-80 (1992).

EJEMPLO 29

Anticuerpos anti-Flt4 para la administración como producto terapéutico a humanos

A. Humanización de anticuerpos monoclonales anti-Flt4

La biología de Flt4 tal como se comunica en el presente documento, por ejemplo, en el Ejemplo 28, indica los usos terapéuticos de inhibidores de Flt4 (antagonistas) que bloquean la señalización mediada por ligando del receptor Flt4. Los anticuerpos de neutralización de Flt4 comprenden una clase de productos terapéuticos útiles como antagonistas de Flt4. A continuación se presentan protocolos para mejorar la utilidad de anticuerpos monoclonales anti-Flt4 como productos terapéuticos en seres humanos, mediante la “humanización” de los anticuerpos monoclonales para mejorar su semivida en suero y hacerlos menos inmunogénicos en huéspedes humanos (es decir, para prevenir la respuesta de anticuerpos humanos a anticuerpos anti-Flt4 no humanos).

Los principios de humanización se han descrito en la bibliografía y se facilitan mediante la gestión modular de proteínas anticuerpos. Para minimizar la posibilidad de complemento de unión, es preferente un anticuerpo humanizado del isotipo IgG4.

Por ejemplo, un nivel de humanización se logra generando anticuerpos quiméricos que comprenden los dominios variables de proteínas anticuerpos no humanas de interés, tales como los anticuerpos monoclonales anti-Flt4 descritas en el presente documento, con los dominios constantes de moléculas de anticuerpos humanos. (Véase, por ejemplo, Morrison y Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1989)). Los dominios variables de anticuerpos anti-Flt4 que neutralizan Flt4 se clonan a partir de AND genómico de una hibridoma de linfocito B o a partir de ADNc generado a partir de ARNm aislado a partir de un hibridoma de interés. Los fragmentos génicos de la región V se enlazan a exones que codifican dominios constantes de anticuerpos humanos y la construcción resultante se expresa en células huésped de mamífero adecuadas (por ejemplo, mieloma o células CHO).

Para lograr un nivel de humanización incluso mayor, se clonan en secuencias de anticuerpo humano sólo las porciones de los fragmentos génicos de la región variable que codifican regiónes de determinación complementaria (“CDR”) de unión a antígeno de genes de anticuerpos monoclonales no humanos. [Véase, por ejemplo, Jones y col. Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y col. Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen y col. Science, 239:1534-36 (1988); y Tempest y col., Bio/Technology, 9: 266-71 (1991).] Si es necesario, la región con estructura en lámina beta de los anticuerpos humanos que rodean la regiones CDR3 también se modifica para calcar con más exactitud la estructura tridimensional del dominio de unión a antígeno del anticuerpo monoclonal original. (Véase Kettleborough y col. Protein Engin, 4:773783 (1991); y Foote y col., J. Mol. Biol, 224:487-499 (1992).) En un enfoque alternativo, la superficie de un anticuerpo monoclonal no humano de interés se humaniza alterando restos superficiales seleccionados del anticuerpo no humano, por ejemplo, mediante mutagénesis directa en el sitio, mientras se retiene todos los restos del interior y de contacto del anticuerpo no humano. Véase Padlan, Molecular Immunol, 28(4/5):489-98 (1991).

Los enfoques anteriores se emplean usando anticuerpos monoclonales anti-Flt4 que neutralizan Flt4 y los hibridomas que los producen, tales como anticuerpos 9D9F9, para generar anticuerpos de neutralización de Flt4 humanizados útiles como productos terapéuticos para tratar o paliar afecciones en las que la expresión de Flt4 es perjudicial.

B. Anticuerpos de neutralización de Flt4 humanos para presentación en fagos

Los anticuerpos de neutralización de Flt4 humanos se generan mediante técnicas de presentación en fagos tales como las descritas en Aujame y col. Human Antibodies, 8(4):155168 (1997); Hoogenboom, TIBTECH, 15:62-70 (1997); y Rader y col., Curr. Opin. Biotechnol, 8:503-508 (1997). Por ejemplo, regiones variables de anticuerpos en forma de fragmentos Fab

o unidos a fragmentos Fv de cadena sencilla se fusionan con extremos amino terminales de proteínas de recubrimiento secundario de fagos filamentosos pIII. La expresión de la proteína de fusión y su incorporación en el recubrimiento de fago maduro da como resultado partículas de fago que presentan un anticuerpo en su superficie y contienen el material genético que codifica el anticuerpo. Una colección de fagos que comprende tales construcciones se expresa en bacterias, y la colección se examina (se analiza) para buscar fago-anticuerpos específicos de Flt4 usando Flt4 etiquetado o inmibilizado como antígeno-sonda.

C. Anticuerpos de neutralización de Flt4 humanos de ratones transgénicos

Se generaron anticuerpos de neutralización de Flt4 humanos en ratones transgénicos esencialmente como se describe en Bruggemann y Neuberger, Immunol Today, 17(8):391 -97 (1996) y Bruggemann y Taussig, Curr. Opin. Biotechnol, 8:455-58 (1997). Ratones transgénicos que portan segmentos de gen V humano en configuración de línea germinal y que expresan estos transgenes en su tejido linfoide se inmunizan con una composición de Flt4 usando protocolos de inmunización convencionales. Los hibridomas se generaron usando linfocitos B de ratones inmunizados usando protocolos convencionales y se examinaron para identificar hibridomas que segregan anticuerpos humanos anti-Flt4 (por ejemplo, tal como se ha descrito anteriormente).

D. Anticuerpos biespecíficos

Anticuerpos biespecíficos que se unen específicamente a Flt4 y que se unen específicamente a otros antígenos relevantes para anatomía patológica y/o tratamiento se producen, aíslan y analizan usando procedimientos estándar que se han descrito en la bibliografía. Véase, por ejemplo Pluckthun y Pack, Immunotechnology, 3:83-105 (1997); Carter y col., J. Hematotherapy, 4: 463-470 (1995); Renner y Pfreundschuh, Immunological Reviews, 1995, Nº. 145, páginas 179-209; Pfreundschuh, documento de patente de Estados Unidos Nº 5.643.759; Segal y col, J. Hematotherapy, 4: 377-382 (1995); Segal y col., Immunobiology, 185: 390-402 (1992); y Bolhuis y col. Cancer Immunol. Immunother, 34: 1-8 (1991).

EJEMPLO 30

Modelos animales para demostrar la eficacia de terapias anti-Flt4 para el tratamiento de cánceres

Se considera que cualquier animal aceptado para terapias de cáncer sería útil para demostrar la eficacia de terapias anti-Flt4 para tratamiento de cáncer. Ejemplos de modelos para demostrar la eficacia para tratamiento de cánceres de mama, usando estudios estándar de dosis-respuesta, incluyen los descritos en Tekmal y Durgam, Cancer Lett., 118(1): 21-28 (1997); Moshakis y col., Br. J. Cancer, 43: 575-580 (1981); y Williams y col., J. Nat. Cancer Inst., 66: 147-155 (1981). Además de modelos murinos, se consideran modelos de perros y cerdos porque al menos determinados anticuerpos Flt4 antihumanos (por ejemplo, los anticuerpos 9D9) también reconocen Flt4 de perros y cerdos. Se supervisan el tamaño del tumor y los efectos secundarios para demostrar la eficacia terapéutica frente a controles.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Helsinki University Licensing Ltd. OY Ludwig Institute For Cancer Research

<120> Flt4 (VEGFR-3) como Diana para la obtención de imágenes de tumores y terapia antitumoral

<130> 28113/34891

<140>

<141>

<150> 09/169,079

<151> 09-10-1998

<160> 22

<170> Patentin Ver. 2.0

<210> 1

<211> 4195

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (20)..(3913)

<400> 1

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<210> 2

<211> 1298

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 2

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imagen1

imagen1

<210> 3

<211> 4795

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

5

<220>

<221> CDS

<222> (20)..(4108)

10 <400> 3

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imagen1

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<210> 4

<211> 1363

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 4

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imagen1

imagen1

imagen1

<210> 5

<211> 1311

<212> PRT

<213> Homo Sapiens (FLT1)

<400> 5

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

<210> 6

<211> 6

<212> PRT 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Los aminoácidos en posiciones 1 y 2 se seleccionan cada uno independientemente del grupo constituido por ácido aspártico y ácido glutámico.

10

<220>

<223> El aminoácido en posición 4 se selecciona independientemente del grupo constituido por metionina y valina.

15 <220>

<223> El aminoácido en posición 5 se selecciona independientemente del grupo constituido por prolina, ácido aspártico y ácido glutámico.

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia consenso

5 <400> 6

Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Met 1 5

<210> 7 10 <211> 70

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 15 <223> Descripción de Secuencia Artificial: sonda de oligonucleótidos

<400> 7

imagen1

<210> 8

<211> 24 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: sonda de oligonucleótidos

30

<400> 8 acatgcatgc cccgccggtc atcc 24

<210> 9 35 <211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: sonda de oligonucleótidos

<400> 9 cggaattccc catgacccca ac 22

<210> 10

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: sonda de oligonucleótidos

<400> 10 ccatcgatgg atcctacctg aagccgcttt ctt 33

<210> 11

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: sonda de oligonucleótidos

<400> 11 cccaagcttg gatccaagtg gctactccat gacc 34

<210> 12

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: sonda de oligonucleótidos

<400> 12 gttgcctgtg atgtgcacca 20

<210> 13

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: sonda de oligonucleótidos

<400> 13 ctggagtcga cttggcggac t 21

<210> 14

<211> 60

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: sonda de oligonucleótidos

<400> 14 cgcggatccc tagtgatggt gatggtgatg tctaccttcg atcatgctgc ccttatcctc

<210> 15

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sonda de oligonucleótidos

<400> 15 ctggagtcga cttggcggac t 21

<210> 16

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: sonda de oligonucleótidos

<400> 16 cggatccct ccatgctgcc cttatcct 28

<210> 17

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: sonda de oligonucleótidos

<400> 17 ggcaagcttg aattcgccac cagcagcgg ggcgcc 36

<210>18

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: sonda de oligonucleótidos <400> 18 gttgcctgtg atgtgcacca 20

<210> 19

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: sonda de oligonucleótidos

<400> 19 ctggagtcga cttggcggac t 21

<210> 20

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: sonda de oligonucleótidos

<400> 20 cgcggatcca agcttactta ccttccatgc tgcccttatc ctcg 44

<210> 21

<211> 419

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21

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<210> 22

<211> 354

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 22

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Claims (31)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un compuesto eficaz para inhibir la unión de una proteína ligando del receptor tirosina quinasa Flt4 (Flt4) a Flt4 expresado en células endoteliales vasculares de un mamífero para usar en un procedimiento de tratamiento de un mamífero que padece de una enfermedad neoplásica que se caracteriza por la expresión de Flt4 en células endoteliales de vasos sanguíneos adyacentes a un neoplasma maligno, inhibiendo la proliferación mediada por Flt4 de dichas células endoteliales vasculares, en el que dicho compuesto comprende un polipéptido seleccionado del grupo constituido por:

   (a)

   un polipéptido que comprende un anticuerpo anti-Flt4 o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti-Flt4;

   (b)

   un polipéptido que comprende un fragmento de Flt4 soluble, en el que dicho fragmento y dicho polipéptido son capaces de unirse a un ligando de Flt4;

   (c)

   un polipéptido que comprende un fragmento o análogo de un polipéptido precursor del factor de crecimiento endotelial vascular C (VEGF-C) de vertebrado,en el que dicho polipéptido y dicho fragmento o análogo se unen a, pero no son capaces de estimular, dicho Flt4 expresado en células huésped nativas;

   (d)

   un polipéptido que comprende un fragmento o análogo de un polipéptido precursor del factor de crecimiento endotelial vascular D (VEGF-D) de vertebrado en el que dicho polipéptido y dicho fragmento o análogo se unen a, pero no son capaces de estimular, dicho Flt4 expresado en células huésped nativas;

   (e)

   un anticuerpo anti-VEGF-C o polipéptido que comprende un fragmento de unión a antígeno del mismo; y

   (f)

   un anticuerpo anti-VEGF-D o polipéptido que comprende un fragmento de unión a antígeno del mismo.

2. 2.

   Un compuesto que se une a Flt4 para usar en un procedimiento diagnóstico en vivo de detección de una enfermedad neoplásica que se caracteriza por la expresión de Flt4 en células endoteliales de vasos sanguíneos adyacentes a un neoplasma maligno.

3. 3.

   Uso de un compuesto eficaz para inhibir la unión de una proteína ligando del receptor tirosina quinasa Flt4 (Flt4) a Flt4 expresado en células endoteliales vasculares de un mamífero para la fabricación de un medicamente para tratar a un mamífero que padece de una enfermedad neoplásica que se caracteriza por la expresión de Flt4 en células endoteliales de vasos sanguíneos adyacentes a un neoplasma maligno, inhibiendo la proliferación mediada por Flt4 de dichas células endoteliales vasculares, en el que dicho compuesto comprende un polipéptido seleccionado del grupo constituido por:

   (a)

   un polipéptido que comprende un anticuerpo anti-Flt4 o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti-Flt4;

   (b)

   un polipéptido que comprende un fragmento de Flt4 soluble, en el que dicho fragmento y dicho polipéptido son capaces de unirse a un ligando Flt4;

   (c)

   un polipéptido que comprende un fragmento o análogo de un polipéptido precursor del factor de crecimiento endotelial vascular C (VEGF-C) de vertebrado en el que dicho polipéptido y dicho fragmento o análogo se unen a, pero no son capaces de estimular, dicho Flt4 expresado en células huésped nativas.

   (d)

   un polipéptido que comprende un fragmento o análogo de un polipéptido precursor del factor de crecimiento endotelial vascular D (VEGF-D) de vertebrado, en el que dicho polipéptido y dicho fragmento o análogo se unen a, pero no son capaces de estimular, dicho Flt4 expresado en células huésped nativas;

   (e)

   un anticuerpo anti-VEGF-C o polipéptido que comprende un fragmento de unión a antígeno del mismo; y

   (f)

   un anticuerpo anti-VEGF-D o polipéptido que comprende un fragmento de unión a antígeno del mismo.

4. 4.

   Uso de un compuesto que se une a Flt4 para la fabricación de una composición para usar en un procedimiento diagnóstico en vivo de detección de una enfermedad neoplásica que se caracteriza por la expresión de Flt4 en células endoteliales de vasos sanguíneos adyacentes a un neoplasma maligno.

5. 5.

   Un procedimiento in vitro de detección de una enfermedad neoplásica que se caracteriza por la expresión de Flt4 en células endoteliales de vasos sanguíneos adyacentes a un neoplasma maligno, usando un compuesto que se une a Flt4.

6. 6.

   Un compuesto para usar en un procedimiento de tratamiento tal como se reivindica en la reivindicación 1 o un uso tal como se reivindica en la reivindicación 3, en el que el mamífero ha sido analizado para detectar células endoteliales que expresan Flt4 en vasos sanguíneos adyacentes a un neoplasma maligno del mamífero, y mostrar de este modo que tiene un neoplasma maligno que se caracteriza por la presencia de células endoteliales que expresan Flt4 en vasos sanguíneos adyacentes a un neoplasma maligno.

7. 7.

   Un compuesto para usar en un procedimiento de tratamiento tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 6, para usar tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 ó 6, o un procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 5, en el que dicha enfermedad neoplásica se selecciona del grupo que consiste en carcinomas, carcinomas de células escamosas, linfomas, melanomas y sarcomas.

8. 8.

   Un compuesto para usar en un procedimiento de tratamiento tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 6 ó 7, para usar tal como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4, 6 ó 7, o un procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 5 ó 7, en el que dicha enfermedad neoplásica es un carcinoma de mama que se caracteriza por la expresión de Flt4 en células endoteliales vasculares.

9. 9.

   Un compuesto para usar en un procedimiento de tratamiento tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 6 – 8, para usar tal como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 ó 6 - 8, o un procedimiento tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 5, 7 u 8, en el que dicho medicamento o composición es para la administración a un ser humano.

10. 10.

    Un compuesto para usar en un procedimiento de tratamiento tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 6 – 9, para usar tal como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 ó 6 - 9, o un procedimiento tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 7 - 9, en el que dicho compuesto comprende un anticuerpo biespecífico o un fragmento del mismo, y dicho anticuerpo o fragmento incluye un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a Flt4 y un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno marcador endotelial vascular sanguíneo seleccionado del grupo constituido por PAL-E, VEGFR-1, VEGFR-2, endoglina y Factor de von Willebrand.

11. 11.

    Un compuesto para usar en un procedimiento de tratamiento tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 6 – 10, para usar tal como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 ó 6 – 10, o un procedimiento tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 7—10, en el que dicho compuesto comprende un anticuerpo anti-Ftl4 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

12. 12.

    Un compuesto para usar en un procedimiento de tratamiento tal como se reivindica en la reivindicación 10 ó 1, para usar tal como se reivindica en la reivindicación 10 u 11, o un procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 10 u 11, en el que el anticuerpo anti-Flt4 es un anticuerpo humanizado.

13. 13.

    Un compuesto para usar en un procedimiento de tratamiento tal como se reivindica en la reivindicación 10 ó 12, para usar tal como se reivindica en la reivindicación 10 ó 12, o un procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 10 ó 12, en el que dicho compuesto comprende además un antineoplásico conjugado a dicho anticuerpo o fragmento del mismo.

14. 14.

    Un compuesto para usar en un procedimiento de tratamiento tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 6 – 13, para usar tal como se reivindica

    en una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 ó 6 - 13, o un procedimiento tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 7 - 13, en el que dicho compuesto comprende además una etiqueta detectable.

15. 15.

    Uso tal como se reivindica en la reivindicación 3 o la reivindicación 4 o cualquiera de las reivindicaciones 6 - 14 cuando dependen de las reivindicaciones 3 ó 4, en el que dicho medicamento o composición comprende además un diluyente, coadyuvante o medio vehicular farmacéuticamente aceptable.

16. 16.

    Un compuesto para usar en un procedimiento diagnóstico en vivo tal como se reivindica en la reivindicación 2, el uso tal como se reivindica en la reivindicación 4 o un procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 5, en el que el procedimiento de detección de una enfermedad neoplásica es un procedimiento para obtener imágenes de tumores en tejidos de un organismo vertebrado, que comprende las etapas de:

    (a)

    poner en contacto el tejido del vertebrado sospechoso de contener un tumor con una composición que comprende un compuesto de unión a Flt4;

    (b) detectar dicho compuesto de unión a Flt4 unido a células de dicho tejido; y

    (c)

    obtener imágenes de tumores sólidos identificando células endoteliales de vasos sanguíneos unidas por medio de dicho compuesto de unión a Flt4.

17. 17.

    Un compuesto para usar en un procedimiento diagnóstico en vivo tal como se reivindica en la reivindicación 16, el uso tal como se reivindica en la reivindicación 16 o un procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 16, en el que dicho tejido comprende tejido humano.

18. 18.

    Un compuesto para usar en un procedimiento diagnóstico en vivo tal como se reivindica en la reivindicación 16 ó 17, el uso tal como se reivindica en la reivindicación 16 ó 17,

    o un procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 16 ó 17, en el que el procedimiento comprende además la etapa de lavar dicho tejido, después de dicha etapa de poner en contacto y antes de dicha etapa de obtener imágenes, en condiciones que eliminan de dicho tejido el compuesto de unión a Flt4 que no está unido a Flt4 en dicho tejido.

19. 19.

    Un compuesto para usar en un procedimiento diagnóstico en vivo tal como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 16 - 18, el uso tal como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 16 - 18, o un procedimiento tal como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 16 - 18, en los que dicho compuesto de unión a Flt4 es un compuesto que se une a Flt4 tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 10 - 14.

20. 20.

    Un compuesto para usar en un procedimiento diagnóstico en vivo tal como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 16 - 19, el uso tal como se reivindica en

    una cualquiera de las reivindicaciones 16 - 19, o un procedimiento tal como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 16 – 19, en el que el procedimiento comprende además las etapas de:

    poner en contacto el tejido con un segundo compuesto que se une específicamente a un marcador endotelial de vasos sanguíneos que está sustancialmente ausente de endotelios linfáticos; y detectar dicho segundo compuesto unido a células de dicho tejido;

    en el que dicha etapa de obtener imágenes comprende identificar vasos sanguíneos etiquetados con el compuesto de unión a Flt4 y el segundo compuesto, en el que los vasos sanguíneos etiquetados con el compuesto de unión a Flt4 y el segundo compuesto se correlacionan con la presencia y localización de un tumor en el tejido.

21. 21.

    Un compuesto para usar en un procedimiento de tratamiento tal como se reivindica en la reivindicación 1 o un uso tal como se reivindica en la reivindicación 3, en el que el compuesto es un fragmento de Flt4 soluble, y el fragmento es capaz de unirse a un ligando de Flt4.

22. 22.

    Un compuesto para usar en un procedimiento de tratamiento tal como se reivindica en la reivindicación 1 o un uso tal como se reivindica en la reivindicación 3, en el que el compuesto es una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento de Flt4 soluble, y el fragmento es capaz de unirse a un ligando de Flt4.

23. 23.

    Uso de una composición que comprende un polipéptido constituido por un fragmento de un dominio extracelular de Flt4, en el que el fragmento es capaz de unirse a un ligando de Flt4, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad neoplásica que se caracteriza por la expresión de Flt4 en células endoteliales vasculares.

24. 24.

    Uso de un polipéptido constituido por un fragmento de un dominio extracelular de Flt4, en el que el fragmento es capaz de unirse a un ligando de Flt4, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad neoplásica que se caracteriza por la expresión de Flt4 en células.

25. 25.

    Una composición tal como se reivindica en la reivindicación 23 o un uso tal como se reivindica en la reivindicación 24, en la que la enfermedad neoplásica es un carcinoma, carcinoma de células escamosa, carcinoma de mama, linfoma, melanoma o sarcoma.

26. 26.

    Una composición tal como se reivindica en la reivindicación 23 o la reivindicación 25 o uso tal como se reivindica en la reivindicación 24 o la reivindicación 25, en la que el polipéptido está conjugado a un profármaco o agente antiangiogénico.

27. 27.

    Una composición tal como se reivindicación en la reivindicación 23, reivindicación 25 ó 26, o uso tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 24 – 26, que es para la administración conjunta con un agente antiangiogénico.

28. 28.

    Un anticuerpo biespecífico, o un fragmento del mismo, que se une a Flt4 y se une a un antígeno marcador endotelial de vasos sanguíneos seleccionado del grupo que consiste en PAL-E, VEGFR-1, VEGFR-2, endoglina y Factor de von Willebrand.

29. 29. Un anticuerpo biespecífico o un fragmento tal como se reivindica en la 5 reivindicación 28, que está conjugado a un agente citotóxico.
30. 30. Un anticuerpo biespecífico o un fragmento tal como se reivindica en la reivindicación 28 ó 29, que está conjugado a un profármaco.
31. 31. Una composición que comprende un anticuerpo biespecífico o un fragmento tal

    como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 28 – 30 y un excipiente, diluyente o 10 vehículo farmacéuticamente aceptable.