JP2002527404A - 腫瘍イメージングおよび抗腫瘍治療の標的としてのＦｌｔ４（ＶＥＲＧ−３） - Google Patents

腫瘍イメージングおよび抗腫瘍治療の標的としてのＦｌｔ４（ＶＥＲＧ−３）

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、精製されたＦｌｔ４受容体チロシンキナーゼポリペプチドおよびその断片、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、そのポリペプチドに特異的に結合する抗体、およびそのための使用を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本願は１９９８年１０月９日に出願された米国特許出願番号第０９／１６９，
０７９号、１９９７年７月２８日に出願された米国特許出願番号第０８／９０１
，７１０号、１９９４年１１月１４日に出願された米国特許出願番号第０８／３
４０，０１１号（現米国特許第５，７７６，７５５号）、および１９９４年６０
月９日に出願された米国特許出願番号第０８／２５７，７５４号（すでに放棄）
（なお、後者２つは１９９２年１０月９日に出願された米国特許出願番号第０７
／９５９，９５１号（すでに放棄）の一部継続である）の優先権を主張する継続
出願である。これらの出願は総て引用することによりそのまま本明細書の一部と
される。
【０００２】発明の分野 本発明は概して、受容体遺伝子、特には受容体チロシンキナーゼ遺伝子、組換
えＤＮＡベクターへのそれらの挿入、ならびに得られたタンパク質の、宿主菌株
および宿主真核細胞での生産に関する。さらに詳しくは、本発明は、Ｆｌｔ４、
すなわち受容体チロシンキナーゼ、Ｆｌｔ４をコードするヌクレオチド配列、Ｆ
ｌｔ４をコードするＤＮＡおよびそれらの遺伝子産物の作製方法、かかる受容体
をコードする核酸を特異的に認識する（ハイブリダイズする）核酸プローブ、か
かる受容体を特異的に認識する抗体、ならびに例えば動物およびヒト組織におい
てリンパ管および高内皮細静脈（ＨＥＶ）を同定する、および病理学的症状にお
いてＦｌｔ４発現細胞の増殖を増強または阻害するためにかかるプローブおよび
抗体ならびその他のＦｌｔ４結合化合物を使用する方法に向けられる。
【０００３】背景 分化細胞および組織の発達、維持および修復に役割を果たす細胞の挙動は大部
分、増殖因子および同様のリガンドならびにそれらの受容体を介して運ばれる細
胞内シグナルによって調節される。受容体は応答細胞の細胞表面に位置し、増殖
因子ならびにその他のホルモン様リガンドとして知られるペプチドまたはポリポ
リペプチドと結合する。この相互作用の結果、応答細胞で速やかに生物学的変化
が起こり、同時に迅速かつ長期にわたる細胞内遺伝子発現の再調整が起こる。種
々の細胞表面に会合したいくつかの受容体が特異的増殖因子と結合し得る。 チロシンのリン酸化は原形質膜を横切る鍵となるシグナル変換様式の１つであ
る。いくつかのチロシンキナーゼ遺伝子は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリ
ン、インスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ
−Ａおよび−Ｂ）および繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）などのポリペプチド増殖
因子およびホルモンのトランスメンブラン受容体をコードしている[Heldin et a
l., Cell Regulation, 1: 555-566 (1990); Ullrich et al., Cell, 61: 243-54
(1990)] 。いくつかの造血増殖因子の受容体はチロシンキナーゼであり、これ
らにはコロニー刺激因子−１受容体であるｃ−ｆｒｎｓ[Sherr et al., Cell, 4
1: 665-676 (1985)］、および原始的な造血増殖因子受容体であるｃ−ｋｉｔ[Hu
ang et al., Cell, 63: 225-33 (1990)]が含まれる。
【０００４】 これらの受容体はその特異性と親和性が異なっている。一般に、受容体チロシ
ンキナーゼは、特異的増殖因子、トランスメンブランドメインと結合し得る細胞
外ドメイン、通常タンパク質のα−らせん部分であるトランスメンブランドメイ
ン、膜近傍ドメイン（受容体が例えばタンパク質リン酸化によって調節され得る
場合）、チロシンキナーゼドメイン（受容体の酵素成分）、ならびに多くの受容
体で、チロシンキナーゼの基質の認識および結合に関与するカルボキシ末端から
なる糖タンパク質である。
【０００５】 いくつかの受容体チロシンキナーゼでは、選択的スプライシングおよび選択的
ポリアデニル化のプロセスは、同じ遺伝子に由来するいくつかの異なるポリペプ
チドを作り出すことができる。これらは上記で挙げられた種々のドメインを含ん
でも含んでいなくともよい。結局、いくつかの細胞外ドメインは細胞によって分
泌された個々のタンパク質として発現されてもよく、いくつかの形態の受容体は
チロシンキナーゼドメインを欠いていてもよく、短いカルボキシ末端含むトラン
スメンブランドメインを介して原形質膜に挿入された細胞外ドメインのみを含ん
でもよい。
【０００６】 脈管系、胚の脈管形成および脈管形成、血液凝固、創傷治癒および再生、なら
びにいくつかの疾病の生理学には血管を裏打ちする血管内皮が関与している。脈
管樹状構造の発達は脈管形成を通じ、いくつかの理論に従って起こり、血管から
の出芽による動脈およぼ静脈の発達の少し後にリンパ系の形成が始まる。F.R.,
Am. J. Anat. 9:43 (1909);およびvan der Putte, S.C.J, Adv. Anat. Embryol.
Cell Biol. 51:3 (1975)参照。
【０００７】 胎児期の後、内皮細胞は、新血管新生に関する脈管形成時以外は極めてゆっく
り増殖する。脈管形成を刺激する増殖因子は特異的内皮細胞表面受容体チロシン
キナーゼを介してそれらの作用を発揮する。
【０００８】 受容体チロシンキナーゼのリガンドのうち、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）
はひな漿尿膜では弱くとも脈管形成性があることが分かっている。形質転換増殖
因子α（ＴＧＦα）はいくつかの腫瘍細胞種により、またマクロファージにより
分泌される脈管形成因子である。ｃ−ｍｅｔ前癌遺伝子によりコードされる受容
体のリガンドである肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）もまた、培養内皮細胞におけるＴ
ＧＦαのそれに対する応答同様、強力な脈管形成性、誘導性がある。
【０００９】 種々の証拠が、内皮細胞の増殖、分化、ならびにある種の分化した機能の刺激
に腫瘍な役割を果たし得る内皮細胞特異的増殖因子および受容体が存在すること
を示している。最も広く研究されている増殖因子は、ＰＤＧＦファミリーのメン
バーである血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）である。血管内皮増殖因子はジス
ルフィド結合２３ｋＤａサブユニットの二量体糖タンパク質であり、これは内皮
細胞に対するその分裂促進活性およびその血管透過誘導能（従ってその別名は血
管透過性因子）のために発見された。報告されているその他のＶＥＧＦの作用と
しては、細胞内Ｃａ２＋の可動化、プラスミノーゲンアクチベーターおよびプラ
スミノーゲンアクチベターインヒビター−１合成の誘導、内皮細胞におけるヘキ
ソース輸送の刺激、ならびにin vitroにおける単球移動の促進が挙げられる。異
なるｍＲＮＡスプライシング変異体によってコードされる４つのＶＥＧＦイソ型
は同じように内皮細胞の有糸分裂誘発を刺激し得ることが分かっている。ＶＥＧ
Ｆの１２１および１６５アミノ酸イソ型は可溶性形態で分泌されるが、１８９お
よび２０６アミノ酸残基のイソ型は細胞表面に会合したままであり、強いヘパリ
ン親和性を有する。関連の胎盤増殖因子としては、可溶性の非ヘパリン結合形態
およびヘパリン結合形態（ＰｌＧＦ、それぞれ１３１および１５２アミノ酸）も
記載されており、これは胎盤、栄養膜腫瘍やヒト培養内皮細胞で発現する。
【００１０】 ＶＥＧＦ発現のパターンは正常な脈管系の発達および維持、ならびに腫瘍の脈
管形成におけるその関与が示唆されている。ネズミの発達中、交尾後７．５日の
内胚葉は総てＶＥＧＦを発現し、心室神経外胚葉は毛細血管挿入期にＶＥＧＦを
産生する。ウズラ発達２日目では、卵黄嚢の血管新生領域ならびに胚全体でＶＥ
ＧＦの発現が見られる。さらにマウス成体において有窓内皮に隣接する内皮細胞
は持続性のＶＥＧＦ発現を示し、このことはこの特異的内皮表現型および機能の
維持における役割を示唆している。
【００１１】 高い親和性の２つのＶＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦＲ−１／Ｆｌｔ１（ｆｍｓ様チ
ロシンキナーゼ−１）およびＶＥＧＦＲ−２／Ｋｄｒ／Ｆｌｋ−１（キナーゼイ
ンサートドメイン含有受容体／胎児肝キナーゼ−１）が同定されている。これら
の受容体はＰＤＧＦ受容体ファミリーに分類されている。しかしながらＶＥＧＦ
受容体はそれらの細胞外ドメインに７つの免疫グロブリン様ループ（ＰＤＧＦフ
ァミリーのその他のメンバーでは５つであるのに対して）とより長いキナーゼイ
ンサートを有する。ＶＥＧＦ受容体の発現はいくらかは単球や黒色腫細胞系統に
も存在するが、主として血管内皮細胞で起こる。内皮細胞だけがＶＥＧＦに応答
して増殖することが報告されているが、異なる供給源からの内皮細胞は異なる応
答を示す。このように、ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦ−２によって媒介される
シグナルは細胞種特異的であることが明らかである。
【００１２】 ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２はＶＥＧＦ１６５と高い親和性（それぞ
れＫｄ２０ｐＭおよび２００ｐＭ）。Ｆｌｋ−１受容体もＶＥＧＦに応答して自
己リン酸化を受けることが示されているが、Ｆｌｔ１のリン酸化はほとんど検出
されていない。ＶＥＧＦＲ−２によって媒介されるシグナルはこの受容体を過剰
発現するブタ大動脈内皮細胞の著しい形態変化、アクチン再構成および波打ち運
動を引き起こす。これらの細胞では、ＶＥＧＦＲ−２もリガンド誘導性の走化性
および細胞分裂促進を媒介したが、一方、ＶＥＧＦＲ−１トランスフェクト細胞
はＶＥＧＦに対する細胞分裂応答を欠いていた。これに対してＶＥＧＦはＶＥＧ
ＦＲ−１を発現するラット洞様内皮細胞に対して強い増殖刺激作用を持っていた
。ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２と共沈降するリンタンパク質は異なって
いるが、このことは異なるシグナル伝達分子が受容体特異的細胞内配列と相互作
用することを示唆するものである。
【００１３】 in situハイブリダイゼーション研究では、マウスＶＥＧＦＲ−２ｍＲＮＡ発
現は、内皮が由来する卵黄嚢および胚内中胚葉（交尾後（ｐ．ｃ．）推定７．５
日の胚）、ならびにその後、予定血管芽細胞、心内膜、および大・小血管内皮（
１２．５日ｐ．ｃ．）で認められた。増殖中の血管芽内皮細胞および胎児および
生後初期の脳の分枝中の血管にＶＥＧＦＲ−２ｍＲＮＡが豊富であり、成体の脳
で発現が低いことは、ＶＥＧＦＲ−２が脈管形成および血管形成の主要なレギュ
レーターであることを示唆するものである。ＶＥＧＦＲ−１発現はマウス胎児に
おける初期の血管発達および治癒中の皮膚創傷における新血管新生に同様に関連
している。しかしながら成体の器官で高レベルのＶＥＧＦＲ−１の発現が検出さ
れたことは、ＶＥＧＦＲ−１が細胞増殖には関連のない休止した成熟血管内皮に
おける機能を有していることを示唆している。鳥類のＶＥＧＦＲ−２相同体は原
腸形成の開始から中胚葉で認められたが、ＶＥＧＦＲ−１相同体は初期に内皮マ
ーカーを同時発現する細胞で認められた。in vitroエピブラスト培養では、これ
らの細胞の脈管形成分化に必要なＦＧＦ−２はＶＥＧＦＲ−２発現をアップレギ
ュレートした。両ＶＥＧＦ受容体の発現はその後の発達ではより制限されるよう
になることが分かっている。ヒト胎児組織では、ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦ
Ｒ−２は重複するがわずかに異なる発現パターンを示した。これらのデータはＶ
ＥＧＦおよびその受容体がパラ分泌様式で働いて内皮細胞の分化と組織の新血管
新生を調節することを示唆している。
【００１４】 最近、ＶＥＧＦは内皮細胞の増殖および脈管形成の低酸素症誘発性の刺激因子
であことが示され、特異的モノクローナル抗体を用いるＶＥＧＦ活性の阻害が実
験的腫瘍の増殖およびそれらの脈管形成密度を低下させることが示されている[F
errara et al., Endocrine Reviews, 18: 4-25 (1997); Shibuya et al, Adv. C
ancer Res., 67:281-316 (1995); Kim et al., Nature, 362: 841-844 (1993)]
。
【００１５】 数立方ミリメートルの大きさを超える固形腫瘍の増殖は血管供給に依存し、こ
のことは脈管形成を魅力ある抗癌療法とする。内因性脈管形成阻害剤、またはア
ンギオスタチン、プラスミノーゲン断片、およびエンドスタチン、コラーゲン１
８断片を含む「スタチン類」で助長的な結果が報告されている[O'Reilly et al,
Cell, 79: 315-328 (1994); O'Rreilly et al., Cell, 88: 277-85 (1997)]。
両因子は通常、一次腫瘍によって産生され、転移休眠を維持する。いずれかのス
タチンの全身投与は動物モデルの一次腫瘍の休眠を誘導および維持することも示
されている。受容体およびスタチンによるシグナル伝達、ならびにそれらを活性
化するプロテアーゼはまだ同定されていない。癌およびその他の病理学的病状の
治療における脈管形成の制御するためにはさらなる治療分子の必要性が存在する
。
【００１６】 一次乳癌はいくつかの脈管形成性ポリペプチド（そのうちＶＥＧＦが最も存在
量が多い）を発現することが示されている[例えば、Relf et al, Cancer Res.,
57: 963-969 (1997)参照]。腫瘍細胞は侵襲性および非侵襲性いずれの腺管癌(in
situ)乳癌でも高レベルのＶＥＧＦｍＲＮＡを含んでいた[Brown et al., Hum.
Pathol., 26: 86-91 (1995)]。in situ癌腫に隣接する内皮細胞はＶＥＧＦＲ−
１およびＶＥＧＦＲ−２ｍＲＮＡを発現した。ＶＥＧＦおよびその受容体は、い
くつかの独立した研究で腫瘍の血管密度と疾病の予後との間に相関が認められて
いることから、悪性乳癌の脈管形成の進行に寄与している可能性がある[Weidner
et al., J. Natl. Cancer Inst., 84 1875-1887 (1992)]。診断およびスクリー
ニングを改良し、ならびに治療的介入の標的として機能させるには、乳癌および
乳癌に関連する脈管形成のさらなるマーカーの必要性が存在する。
【００１７】 リンパ系の主要な機能は、組織からの環流を与え、多くの血管外物質を再び血
液へ輸送することである。さらに、成熟のプロセスでは、リンパ球は血液から出
発し、リンパ器官やその他の器官を通って移動してリンパ管に入り、胸管を通っ
て血液に戻る。特殊な細静脈である高内皮細静脈（ＨＥＶ）は再びリンパ球と結
合して、それらの組織への管外遊出を引き起こす。このようにリンパ管および特
にリンパ節は免疫および種々の腫瘍の転移の進行に重要な役割を果たす。
【００１８】 ２０世紀のはじめから、胎児のリンパ系の起源に関して３つの異なる理論が示
されている。しかしながらリンパ管はそれらのための利用できる特異的マーカー
が知られていないので同定が困難であった。
【００１９】 リンパ管は最も一般にはリンパ管造影によって研究されている。リンパ管造影
では、Ｘ線造影剤が直接リンパ管に注入される。この造影剤はリンパ節に回収さ
れるが、ここで半年まで留まり、この期間の間Ｘ線解析によりリンパ節の大きさ
や構造の追跡調査が可能となる。この診断はリンパ節に転移のある癌患者や、リ
ンパ腫などのリンパ性腫瘍においては特に重要である。しかしながら当技術分野
ではリンパ組織を造画する材料および方法の改良が必要とされている。
【００２０】発明の概要 本発明は、第５染色体に位置し、未知のヒト白血病細胞由来チロシンキナーゼ
相同体ＰＣＲ−ｃＤＮＡ断片として同定される、新規な受容体チロシンキナーゼ
遺伝子を得ようとするものである[Aprelikova et al., Cancer Res., 52: 746-7
48 (1992)]。この遺伝子およびそのコードタンパク質はＦｌｔ４と呼ばれる。こ
の略号はｆｍｓ様チロシンキナーゼ４から来ている。
【００２１】 Ｆｌｔ４はＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２遺伝子の産物に構造的に密接
に関連のある受容体チロシンキナーゼである。この類似性および続いて発見され
たこれら３つの受容体のリガンド間の類似性により、Ｆｌｔ４受容体は加えてＶ
ＥＧＦＲ−３と呼ばれている。Ｆｌｔ４およびＶＥＧＦＲ−３は本明細書では相
互交換的に用いられる。これら３つの受容体間の類似性にもかかわらず成熟型の
Ｆｌｔ４はＶＥＧＦとは異なっており、これは細胞外ドメインのタンパク質分解
切断において１２５／１２０ｋＤと７５ｋＤの２つのジスルフィド結合ポリペプ
チドが得られる。Ｆｌｔ４遺伝子は４．５と５．８ｋｂのｍＲＮＡをコードし、
これは選択的３’エキソンを示し、それぞれ１９０ｋＤと１９５ｋＤのポリペプ
チドをコードしている。
【００２２】 識別のさらなる証拠としては、ＶＥＧＦはＦｌｔ４に対して特異的結合を示さ
ず、その自己リン酸化を誘導しないということである。
【００２３】 Ｆｌｔ４、Ｆｌｔ１およびＫＤＲ／Ｆｌｔ−１受容体ｍＲＮＡシグナルの比較
からは、研究された組織においては重複するが異なる発現パターンが示されてい
る[Kaipainen, et al., J. Exp. Med., 178: 2077 (1993)]。Ｆｌｔ４遺伝子の
発現はＶＥＧＦＲ−１またはＶＥＧＦＲ−２の発現よりも制限されていると思わ
れる。Ｆｌｔ４の発現はまず、交尾後８．５日のマウス胚の頭部間葉織の血管芽
細胞、主静脈、および胚外では尿膜におけるin situハイブリダイゼーションに
よって検出可能となっている。交尾後１２．５日の胚においては、Ｆｌｔ４シグ
ナルは発達中の静脈および予定リンパ内皮で認めらるが、動脈内皮は陰性である
と思われる。その後の発達段階では、Ｆｌｔ４ｍＲＮＡは発達中のリンパ管に限
られるようになる。成人組織ではリンパ内といくつかの高内皮静脈だけがＦｌｔ
４ｍＲＮＡを発現し、転移性のリンパ節およびリンパ管腫のリンパ洞で高い発現
が起こる。これらの結果はリンパ管の静脈起源説を支持するものである。
【００２４】 ヒト赤白血病細胞系統からクローン化されたＦｌｔ４受容体チロシンキナーゼ
ｃＤＮＡのタンパク質産物はＮ−グリコシル化されており、その細胞外ドメイン
に７つの免疫グロブリン様ループを含んでいる。Ｆｌｔ４およびＫＤＲの細胞質
チロシンキナーゼドメインはＦｌｔ１およびＫＤＲの対応するドメインとアミノ
酸レベルで約８０％同一であり、血小板由来増殖因子、コロニー刺激因子−１、
幹細胞因子の受容体、およびＦｌｔ３受容体と約６０％同一である。Pajusola e
t al., Cancer Res., 52: 5738 (1992)参照。
【００２５】 本発明は、Ｆｌｔ４タンパク質およびそのペプチド断片の産生およびその他の
供給源からの関連遺伝子の発見に有用なＦｌｔ４受容体チロシンキナーゼをコー
ドする単離ポリペプチド（例えば、所定の構造のＤＮＡまたはＲＮＡセグメント
）を提供する。
【００２６】 本発明は、微生物または真核細胞に挿入可能であって、コードされているタン
パク質を発現できる、Ｆｌｔ４受容体チロシンキナーゼまたは関連のタンパク質
をコードする異種セグメントを含む組換えＤＮＡベクターを提供する。
【００２７】 本発明は、有用な量のＦｌｔ４受容体チロシンキナーゼおよび多くの種に由来
する同一機能を有するタンパク質を産生可能な真核細胞を提供する。
【００２８】 本発明は、実験室内で、または微生物によって合成的に産生し得るペプチド（
このペプチドは天然のＦｌｔ４受容体チロシンキナーゼタンパク質の活性を模倣
する）を提供する。もう１つの具体例では本発明は、Ｆｌｔ４受容体チロシンキ
ナーゼタンパク質の活性を阻害するペプチドに向けられる。
【００２９】 （ａ）Ｆｌｔ４短鎖型（そのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列は配列
番号１および２に示されている）、および（ｂ）そのカルボキシ末端に異なるヌ
クレオチドおよび対応するアミノ酸残基を有する第２の形態、すなわちＦｌｔ４
長鎖型（そのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列は配列番号３および４に
示されている）からなる群から選択されるペプチドが特に好ましい。Ｆｌｔ４長
鎖型は１３６３個のアミノ酸残基長を有する。
【００３０】 上記で示されたタンパク質またはペプチドのいずれかをコードするヌクレオチ
ド配列を含んでなるＤＮＡおよびＲＮＡ分子、組換えＤＮＡベクター、および改
変された微生物または真核細胞も本発明の一部をなす。特に、下記の２つのＤＮ
Ａ配列番号、すなわち（ａ）Ｆｌｔ４短鎖型［配列番号２］をコードする配列番
号１のようなＤＮＡ配列、および（ｂ）Ｆｌｔ４長鎖型［配列番号４］をコード
する、配列番号１のヌクレオチド３９１３〜４４１６が変化したＦｌｔ４をコー
ドする配列番号３のようなＤＮＡ配列の総てもしくは一部を含んでなる配列、相
補的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、または対応するＲＮＡ配列が特に好ましい。
【００３１】 遺伝子操作およびオリゴヌクレオチドプローブの作製の技術によるかかるペプ
チドの産生に関する本発明の好ましい態様を実施するのに用いられる、さらに大
きな配列のセグメントを含むＤＮＡおよびＲＮＡ分子も提供される。
【００３２】 本明細書ではＦｌｔ４タンパク質をコードするＤＮＡ配が同定されているので
、市販の装置を用いて例えばポリメラーゼ連鎖反応、または合成化学によってＦ
ｌｔ４タンパク質をコードするＤＮＡを作製し、その後、その遺伝子を組換えＤ
ＮＡ技術の公知の手法を用い、利用可能な多くのＤＮＡベクターのいずれかへ挿
入すればよい。さらに、本明細書に開示されたペプチドのいずれかの直接合成を
容易に利用できるようにする自動装置も利用できる。
【００３３】 本発明はまたＦｌｔ４ペプチドおよびその他の構築物、ならびにリンパ内皮細
胞の特異的マーカーとしてのＦｌｔ４の使用に向けられる。
【００３４】 具体例では、本発明は、Ｆｌｔ４を認識する核酸プローブおよび抗体、特にモ
ノクローナル抗体、ならびにかかる抗体を含む組成物に向けられる。
【００３５】 また具体例では、本発明は、組織サンプルおよび器官においてリンパ管をモニ
ターする方法に向けられる。さらに本発明の目的としては、リンパ組織および特
にはリンパ管の状態（炎症、感染、外傷、増殖など）を示す臨床的検出法を提供
すること、ならびに生物においてリンパ管、例えばリンパ管形成を検出する方法
を提供することがある。
【００３６】 本発明のさらなる目的としては、Ｆｌｔ４受容体タンパク質またはその種々の
エピトープを特異的に認識するモノクローナル抗体を提供することにある。組織
、特にリンパ組織においてＦｌｔ４受容体を検出および定量する診断目的でこれ
らのモノクローナル抗体を使用することも本発明の目的である。抗Ｆｌｔ４抗体
に関して、「Ｆｌｔ４を特異的に認識する」、「Ｆｌｔ４と特異的に結合する」
、「Ｆｌｔ４に特異的」などは抗体が、ＶＥＧＦＲ−２／Ｋｄｒ／Ｆｌｋ−１お
よびＶＥＧＦＲ−１／Ｆｌｔ１をはじめとするその他の内皮細胞表面受容体より
も優先的にＦｌｔ４と結合する（免疫反応する）ことを意味する。このように、
Ｆｌｔ４「に特異的」なＦｌｔ４抗体またはその他のＦｌｔ４結合化合物はその
他の抗原のエピトープには結合できないか、またはこれらの実施上無視できるよ
うな、それらのＦｌｔ４結合親和性より十分に低い親和性でしか他の抗原には結
合しないので、本明細書に記載の本発明の方法に従って組織または生物学的サン
プル中のＦｌｔ４を同定および／または標識する（例えば、造画、検出、スクリ
ーニングまたは標的治療）に有用である。
【００３７】 本発明のもう１つの態様は、細胞サンプルのＦｌｔ４受容体の存在を決定する
方法であって、（ａ）細胞サンプルを本発明の抗体、特にモノクローナル抗体に
曝して；（ｂ）該モノクローナル抗体とＦｌｔ４受容体との結合を検出する工程
を含んでなる方法に関する。
【００３８】 本発明はリンパ管形成、ならびに炎症性、感染性および免疫学的症状において
Ｆｌｔ４の機能を調整する（例えば、弱めるまたは増大させる）方法にさらに向
けられる。例えば１つの具体例において、かかる方法は、特にＦｌｔ４の機能が
転移性癌、リンパ腫、炎症（慢性または急性）、感染症および免疫学的症状など
の疾病と関連している場合に、かかる反応にあずかるＦｌｔ４内皮細胞部位を封
鎖するに十分な量のＦｌｔ４結合化合物を提供することによりＦｌｔ４によって
媒介されるリンパ管形成を阻害することを含んでなる。
【００３９】 本発明は特異的Ｆｌｔ４刺激リガンドおよびモノクローナル抗体と、リンパ系
内皮を刺激するためのその使用、またＦｌｔ４機能に関連する様々な病状におけ
るものなど、要すれば、Ｆｌｔ４の機能を阻害するリガンドの研究により誘導さ
れた抗体とともに、断片およびペプチドにもさらに向けられる。
【００４０】 本発明はＦｌｔ４受容体チロシンキナーゼのリガンドの細胞系統供給源を提供
する。これらの細胞からのコンディショニング培地を用いてＦｌｔ４リガンドを
精製し、当技術分野の常法を用いてクローニングする。このコンディショニング
培地または精製リガンドを用いてＦｌｔ４リガンドのアッセイ系および二量体化
阻害剤、ならびにＦｌｔ４シグナル変換の阻害剤を得られるが、これらによりか
かる阻害剤の同定および調製が可能となる。
【００４１】 本発明の好ましい具体例では、ＰＣ−３細胞系統のコンディショニング培地は
Ｆｌｔ４受容体を刺激してある内皮細胞の増殖および分化、ならびに分化した機
能を調節し得るタンパク質またはその断片を含んでなる。Ｆｌｔ４リガンドまた
はそのペプチドもしくは誘導体は内皮細胞の増殖、分化、およびその分化した機
能の調節において、またリガンドのアゴニストおよびアンタゴニストの生成にお
いて有用である。特にＦｌｔ４リガンドはリンパ系内皮の調節において有用であ
る。しかしながら、Ｆｌｔ４リガンドはまた精製または組換え起源からの作製の
際に、関連したＫＤＲ／ａＦｌｋ−１受容体も刺激すると思われる。
【００４２】 Ｆｌｔ４刺激リガンドの同定により直接的にこのリガンドの阻害剤またはＦｌ
ｔ４機能の阻害剤についてアッセイすることが可能になる。かかる阻害剤をＦｌ
ｔ４リガンド含有コンディショニング培地に単純に加え、それらが自己リン酸化
を阻害する場合、それらはＦｌｔ４シグナリング阻害剤として作用していること
になる。例えば組換えまたは合成ペプチド（限定されるものではないが、Ｆｌｔ
４細胞外ドメインの断片を含む）をＦｌｔ４−リガンド相互作用またはＦｌｔ４
二量体化の阻害についてアッセイすることができる。かかる推定Ｆｌｔ４阻害剤
および、さらにはＦｌｔ４受容体−リガンド相互作用を妨害するＦｌｔ４リガン
ドに対する抗体、ペプチドまたは他の化合物、ならびにＦｌｔ４リガンドをコー
ドするｍＲＮＡ配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドが内皮細胞の調
節において、また内皮細胞機能に関連した疾病の治療において有用である。
【００４３】 ＶＥＧＦ−Ｃと呼ばれるＦｌｔ４リガンドの詳細な特性が、１９９８年２月２
日に出願され、国際公開第ＷＯ９８／３３９１７号として公開されたＰＣＴ特許
出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／０１９７３号；１９９６年８月１日に出願され、国際
公開第ＷＯ９７／０５２５０号として公開されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＦＩ
９６／００４２７号；および優先権を得た米国特許出願優先権証明書で提供され
ており、これらは総て引用することにより本明細書の一部とされる。プレプロＶ
ＥＧＦ−Ｃの推定アミノ酸配列は本明細書において配列番号２１で示されている
。
【００４４】 ＶＥＧＦ−Ｄと呼ばれる第２のＦｌｔ４リガンドの詳細な説明がAchen, et al
., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 95 (2): 548-553 (1998)、およびＧｅｎｂ
ａｎｋ受入番号ＡＴ０００１８５で提供されており、これら双方とも引用するこ
とにより本明細書の一部とされる。プレプロＶＥＧＦ−Ｄの推定アミノ酸配列は
本明細書において配列番号２２で示されている。
【００４５】 本発明はまた細胞におけるＦｌｔ４チロシンキナーゼ（Ｆｌｔ４）の発現によ
って特徴づけられる疾病を患う哺乳類生物を治療する方法であって、哺乳類生物
に、Ｆｌｔ４リガンドタンパク質と生物の細胞で発現されるＦｌｔ４との結合を
阻害するのに有効な化合物を含んでなる組成物を投与し、それによりＦｌｔ４機
能を阻害する工程を含んでなる方法に向けられる。該疾病は所望でないリンパ管
形成を特徴とする疾病など、すでに上述した疾病である。さらに、Ｆｌｔ４発現
が少なくともいくつかの乳癌、およびあるいはその他の癌に関連する血管の脈管
構造においても（すなわち相当する正常（健康な）組織の血管の脈管構造におけ
るかろうじて検出可能な、または検出されないレベルの発現を大いに上回るレベ
ルにおいて）起こることがわかってきた。よって、好ましい具体例において細胞
は内皮細胞（リンパ系または血管）を含んでなる。もう１つの具体例において細
胞はＦｌｔ４を発現するあるリンパ腫などの腫瘍細胞を含んでなる。特にヒトの
治療が意図される。
【００４６】 「Ｆｌｔ４リガンドタンパク質と生物の細胞で発現されるＦｌｔ４との結合を
阻害するのに有効な化合物」とは、ＰＣ−３コンディショニング培地から単離可
能な血管内皮増殖因子Ｃとして本明細書に記載されるＦｌｔ４リガンドの結合を
阻害するいずれの化合物をも意味する。かかる化合物はまた血管内皮増殖因子Ｄ
とＦｌｔ４との結合を阻害するのにも有効であると考えられる。典型的な化合物
として次のポリペプチド：（ａ）抗Ｆｌｔ４抗体の抗原結合断片を含んでなるポ
リペプチド；（ｂ）可溶性Ｆｌｔ４断片（例えば細胞外ドメイン断片）を含んで
なるポリペプチド（この断片およびポリペプチドはＦｌｔ４リガンドと結合し得
る）；（ｃ）脊椎動物血管内皮増殖因子Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）ポリペプチドの断片
または類似体を含んでなるポリペプチド（このポリペプチドおよび断片または類
似体は天然の宿主細胞（すなわちそれらの表面で天然のＦｌｔ４タンパク質を発
現する生物の細胞）で発現されるＦｌｔ４と結合するが、これを刺激することは
できない）；および（ｄ）脊椎動物血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）ポリペ
プチドの断片または類似体を含んでなるポリペプチド（このポリペプチドおよび
断片または類似体は天然の宿主細胞で発現されるＦｌｔ４と結合するが、これを
刺激することはできない）が挙げられる。
【００４７】 標準in vitroスクリーニングアッセイにより、例えばＶＥＧＦ−Ｃおよび組換
えにより発現されるＦｌｔ４を用いて同定可能な小分子阻害剤もまた意図される
。抗Ｆｌｔ４抗体の抗原結合断片を含んでなるポリペプチドが非常に好ましい。
かかるポリペプチドには、例えばＦｌｔ４と特異的に結合するポリクローナルお
よびモノクローナル抗体；かかる抗体の断片；キメラおよびヒト化抗体；Ｆｌｔ
４と特異的に結合し、また別の抗原とも特異的に結合する二重特異性抗体などが
挙げられる。循環中のＦｌｔ４リガンドと結合し、それによりリガンドとＦｌｔ
４との結合を阻害する化合物の使用についても意図される。かかる化合物には、
抗ＶＥＧＦ−Ｃもしくは抗ＶＥＧＦ−Ｄ抗体またはその抗原結合断片を含んでな
るポリペプチドが挙げられる。関連の変法では、本発明は下流で細胞内Ｆｌｔ４
シグナル伝達を妨害し、それによりＦｌｔ４機能を阻害する治療方法を意図する
。
【００４８】 好ましい変法では、化合物は本明細書の他の部分で記載した検出可能な標識、
または細胞傷害性薬剤をさらに含んでなる。典型的な細胞傷害性薬剤には、植物
毒（例えばリシン、サポニン）、細菌または真菌毒、放射性同位元素（例えば２
１１−アスタチン、２１２−ビスマス、９０−イットリウム、１３１−ヨウ素、
９９ｍ−テクニチウム、および本明細書に記載のその他のもの）、抗代謝剤（例
えばメトトレキサート、５−フルオロデオキシウリジン）、アルカリ化剤（例え
ばクロラムブチル）、有糸分裂阻害剤（例えばビンカアルカロイド）、およびＤ
ＮＡインタカレート剤（例えば、アドリアマイシン）が挙げられる。
【００４９】 また、投与を改良するには組成物が医薬上許容される希釈剤、アジュバントま
たは担体媒質をさらに含んでなることが好ましい。
【００５０】 本明細書において詳細に説明するように、Ｆｌｔ４発現は主として健康な成人
のリンパ系内皮に限定される場合、少なくともある腫瘍を取り囲む血管構造で確
認されてきた。従って、本発明は血管の内皮細胞におけるＦｌｔ４チロシンキナ
ーゼ（Ｆｌｔ４）の発現によって特徴づけられる腫瘍性疾患を患う哺乳類生物を
治療する方法であって、かかる治療を必要とする哺乳類生物に、Ｆｌｔ４リガン
ドタンパク質と生物の血管内皮細胞で発現されるＦｌｔ４との結合を阻害するの
に有効な化合物を含んでなる組成物を投与し、それによりＦｌｔ４によって媒介
される血管内皮細胞の増殖を阻害する工程を含んでなる方法をさらに含む。特に
癌腫（乳癌）、扁平上皮癌、リンパ腫、黒色腫および肉腫から選択される腫瘍性
疾患の治療を意図する。しかしながら、本明細書において詳細に記載されるスク
リーニング手法により本明細書において記載される抗Ｆｌｔ４治療管理に従いや
すい候補となる、血管内皮細胞におけるＦｌｔ４発現によって特徴づけられるそ
の他の腫瘍が確認されることは容易に理解されよう。
【００５１】 特に血管内皮細胞におけるＦｌｔ４発現によって特徴づけられる乳癌の治療を
意図する。「血管の内皮細胞におけるＦｌｔ４チロシンキナーゼの発現によって
特徴づけられる腫瘍性疾患」とは、本明細書において例示されるように健康な組
織の血管で通常観察される、かろうじて検出可能な、または検出されないレベル
をかなり上回るレベルにおいてＦｌｔ４が血管構造で同定可能である疾患を意味
する。
【００５２】 治療上有効な量の化合物は、当技術分野で認知される用量漸増および用量−反
応アッセイを用いて経験的に決定される。「腫瘍の治療に治療上有効な」とは、
癌治療を受ける患者に対して許容できないレベルの副作用がなく、腫瘍増殖を弱
めるのに有効な量、もしくは腫瘍増殖を抑えるのに有効な量、または腫瘍を全体
的に縮小するまたは排除するのに有効な量を意味する。化合物が抗体またはその
他のポリペプチドを含んでなる場合、特に体重ｋｇ当たり約０．１〜１００ｍｇ
抗体の用量、さらに好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇであると考えられる。典型的
に長期循環半減期を示すヒト化抗体については、特に毎日〜１ヶ月おきの範囲に
及ぶ間隔で、さらに好ましくは毎週、もしくは１週間おき、または３週間おきの
投与が考えられる。治療の経過、患者の副作用、および循環する抗体レベルをモ
ニターすることにより、任意の投与管理についてのさらなる指針が提供される。
その他の抗体を基礎材料にした癌治療用物質（例えば抗ＨＥＲ２、抗ＥＧＦ受容
体）についての公開されかつ進行中の臨床試験のデータによっても有用な投与管
理指針が提供される。
【００５３】 本明細書において記載される治療方法に関し、好ましい化合物には抗Ｆｌｔ４
抗体の抗原結合断片を含んでなるポリペプチド、および可溶性Ｆｌｔ４細胞外ド
メイン断片を含んでなるポリペプチドが挙げられる。ヒトおよびヒト化抗Ｆｌｔ
４抗体が極めて好ましい。
【００５４】 本発明の治療方法の期待される利点は、Ｆｌｔ４が通常健康な組織の血管構造
ではいずれの重大なレベルでは発現されないということにある。極めて好ましい
具体例において、治療用化合物は二重特異性抗体またはその断片を含んでなり、
該抗体または断片はＦｌｔ４と特異的に結合し、かつ血管内皮マーカー抗原と特
異的に結合する。「血管内皮マーカー抗原」とは、増殖中の血管内皮細胞で発現
され、好ましくはリンパ系内皮細胞では発現されないいずれかの細胞表面抗原を
意味する。典型的な血管内皮マーカーには、ＰＡＬ−Ｅ［deWaal, et al., Am.
J. Pathol., 150: 1951-1957 (1994)］、ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２
［Ferrara et al., Endocrine Reviews, 18: 4-25 (1997)］、Ｔｉｅ［Partanen
et al., Mol. Cell. Biol. 12: 1698-1707 (1992)］、エンドグリン［引用する
ことにより本明細書の一部とされる米国特許第５，７７６，４２７号］、および
フォン・ビルブラント因子が挙げられる。かかる二重特異性抗体はＦｌｔ４およ
び血管内皮マーカーの双方を発現する腫瘍関連脈管構造に選択的に存在すると考
えられる。極めて好ましい具体例において、化合物は腫瘍細胞を壊死させる、お
よび／または腫瘍細胞への脈管構造供給を立つ目的で二重特異性抗体と共役した
抗腫瘍薬または細胞傷害性薬剤をさらに含んでなる。典型的な薬剤には、上述の
ものおよびまた宿主において腫瘍に対する免疫応答を刺激するスタチン類、サイ
トカイン類、ケモカイン類などの治療用タンパク質も挙げられる。
【００５５】 もう１つの具体例において、化合物はＦｌｔ４／Ｆｌｔ４リガンド複合体（例
えば、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄと結合したＦｌｔ４からなる複合体）か
らなるエピトープを認識する抗体（または二重特異性抗体）を含んでなる。
【００５６】 治療用化合物を、脈管形成因子を阻害する可能性を有する広域スペクトルを有
する薬剤と複合化して、またはこの薬剤と同時投与することもさらに意図される
。かかる薬剤には、例えば ヘパリンと結合する脈管形成因子を阻害するヘパリ
ン結合剤（ペントサンおよびスラミン類似体）；およびフマギリンなどの内皮細
胞増殖および移動を止める化学薬剤が挙げられる。
【００５７】 また抗Ｆｌｔ４化合物と、抗Ｆｌｔ４化合物により腫瘍血管に向けられ、次い
で腫瘍増殖部位で局所的に活性化される（例えば照射）プロドラッグとの共役も
意図される。かかるプロドラッグ戦略の使用にはＦｌｔ４を発現する薬剤の健康
なリンパ管への副作用が最小限になるという利点があると考えられている。
【００５８】 同様に、本発明は、血管の内皮細胞におけるＦｌｔ４チロシンキナーゼ（Ｆｌ
ｔ４）の発現によって特徴づけられる腫瘍性疾患を患う哺乳類生物を治療する方
法であって、血管の内皮細胞におけるＦｌｔ４の発現によって特徴づけられる腫
瘍性疾患状態を患う哺乳類生物を同定し、かかる治療を必要とする哺乳類生物に
、Ｆｌｔ４リガンドタンパク質と生物の血管内皮細胞で発現されるＦｌｔ４との
結合を阻害するのに有効な化合物を含んでなる組成物を投与し、それによりＦｌ
ｔ４によって媒介される血管内皮細胞の増殖を阻害する工程を含んでなる方法を
含む。
【００５９】 本発明はまた生物学的サンプルをＦｌｔ４受容体チロシンキナーゼタンパク質
（Ｆｌｔ４）の存在についてスクリーニングする方法であって、（ａ）化合物と
生物学的サンプル中のＦｌｔ４とが結合する条件下でＦｌｔ４を含むと推定され
る生物学的サンプルと、Ｆｌｔ４結合化合物を含んでなる組成物とを接触させ；
（ｂ）生物学的サンプル中のＦｌｔ４と結合していないＦｌｔ４結合化合物を除
去する条件下で生物学的サンプルを洗浄し；さらに（ｃ）洗浄工程後にそのサン
プルにおいてＦｌｔ４受容体チロシンキナーゼタンパク質に結合したＦｌｔ４結
合化合物を検出することにより、サンプルをＦｌｔ４の存在についてスクリーニ
ングする工程を含んでなる方法を提供する。好ましくは、化合物は（ａ）抗Ｆｌ
ｔ４抗体の抗原結合断片を含んでなるポリペプチド；および（ｂ）Ｆｌｔ４リガ
ンドまたはＦｌｔ４結合断片またはその類似体を含んでなるポリペプチドからな
る群から選択されるポリペプチドを含んでなる。特異的にＦｌｔ４と結合し、 かつ検出可能なマーカーをさらに含んでなる抗体が非常に好ましい。
【００６０】 本発明はＦｌｔ４受容体チロシンキナーゼタンパク質（Ｆｌｔ４）を発現する
細胞を含むと推定される脊椎生物組織のイメージング法であって、（ａ）脊椎生
物組織とＦｌｔ４結合化合物を含んでなる組成物とを接触させ；さらに（ｂ）そ
の組織に結合したＦｌｔ４結合化合物を検出することにより組織を造画する工程
を含んでなる方法にも向けられる。好ましくはその組織はヒト組織であり、その
方法は接触工程の後、造画工程の前に、組織から組織中のＦｌｔ４と結合してい
ないＦｌｔ４化合物を除去する条件下で組織を洗浄する工程をさらに含んでなる
。
【００６１】 関連した変法では、本発明は脊椎生物由来の組織の腫瘍イメージング法であっ
て、（ａ）腫瘍を含むと推定される脊椎生物組織と、Ｆｌｔ４結合化合物を含ん
でなる組成物とを接触させ；（ｂ）その組織において細胞に結合したＦｌｔ４結
合化合物を検出し；さらに（ｃ）Ｆｌｔ４結合化合物が結合した血管内皮細胞を
同定することにより固形腫瘍を造画し、そこでＦｌｔ４を発現する血管が組織に
おける腫瘍の存在および位置に相関している工程を含んでなる方法を提供する。
【００６２】 １つの好ましい具体例において、その方法は組織と、リンパ系内皮細胞には実
質的に存在しない血管内皮マーカー（例えばＰＡＬ−Ｅ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥ
ＧＦＲ−２）と特異的に結合する第２の化合物とを接触させ；さらに組織におい
て細胞と結合した第２の化合物を検出する工程をさらに含んでなり、造画工程が
、Ｆｌｔ４結合化合物と第２の化合物の双方で標識された血管を同定することを
含んでなり、ここでＦｌｔ４結合化合物と第２の化合物の双方で標識された血管
が組織における腫瘍の存在および位置に相関している。第２の化合物の使用は医
師がＦｌｔ４を発現している血管とその表面でＦｌｔ４を発現する正常なリンパ
管とをより迅速に識別する補助となることが理解されよう。
【００６３】 本発明は腫瘍性疾患の状態のスクリーニング方法であって、（ａ）腫瘍性疾患
の状態にあると推定される哺乳類生物由来の組織と、Ｆｌｔ４受容体チロシンキ
ナーゼと特異的に結合する抗体または抗体断片を含んでなる組成物とを接触させ
；（ｂ）哺乳類生物において細胞に結合した抗体または抗体断片を検出し；さら
に（ｃ）哺乳類生物において細胞に結合した抗体の量または分布から腫瘍性疾患
をスクリーニングする工程を含んでなる方法にさらに向けられる。本明細書にお
いて記載されるようにＦｌｔ４（通常血管構造においては検出されないか、また
はかろうじて検出可能である）は少なくともいくつかの腫瘍の血管構造で強く染
色される。よって、１つの具体例においてスクリーニング工程では血管内皮細胞
に結合した抗体または抗体断片の検出は腫瘍性疾患の存在に相関している。この
方法での「検出」とは、本明細書において記載されるように相当する正常（健康
な）組織で起こるかろうじて検出可能な、または検出されないレベルを有意に上
回るレベルにおける検出を意味する。かかる特徴的な発現は健康な生物由来の組
織を用いて行う対照との比較により確認できる。特に哺乳類組織の腫瘍のスクリ
ーニングを意図する。上述のように、かかる方法の実施は血管内皮マーカーと特
異的に結合する第２の化合物を哺乳類に投与することによりさらに容易になり、
そこで検出工程は腫瘍内皮細胞と結合した第１および第２の化合物を検出するこ
とを含んでなる。
【００６４】 上述から本発明の方法における使用が記載された様々な化合物もまた本発明の
態様とされることがさらに理解されよう。かかる化合物には、例えば上述の抗Ｆ
ｌｔ４抗体および二重特異性抗体が挙げられる。同様に、本明細書に記載された
治療もしくは診断、または造画のための医薬の製造における、本明細書に記載さ
れたいずれの化合物の（単独または組み合わせての）使用もまた本発明の態様と
される。医薬は医薬上許容される希釈剤、アジュバントまたは担体などをさらに
含んでなってもよい。
【００６５】 同様に、本発明は本発明の方法を実施するため、その使用が容易になるように
パッケージされた本発明の化合物または組成物を含んでなるキットを含む。最も
簡単な具体例において、かかるキットは、密閉ボトルまたは密閉容器などのラベ
ルの貼られた容器にパッケージされた、または本発明の方法を実施するために化
合物または組成物の使用を記載するパッケージに入っている本発明の化合物また
は組成物を含む。好ましくは化合物または組成物は単位投与形にパッケージされ
る。もう１つの具体例では、本発明のキットはリンパ系内皮には実質的に存在し
ないが、血管内皮細胞の表面で発現されるマーカー（抗原）と結合する第２の化
合物とともにパッケージされたＦｌｔ４結合化合物を含む。 本発明のさらなる特徴および変法は、詳細な説明をはじめとする本出願全容か
ら当業者には明らかであり、かかる総ての特徴は本発明の態様とされる。また本
明細書において記載された本発明の特徴は、特徴の組合せが本発明の態様または
具体例として特に上述されるか否かには関係なく、さらなる具体例に再び組み入
れることが可能であり、これはまた本発明の態様とされる。また本発明に重要で
あるとして本明細書において記載されるかかる制限のみを制限とみるべきであり
；重要であるとは本明細書において記載されなかった制限のない本発明の変法も
本発明の態様とされる。
【００６６】 上述のものに加え、本発明はさらなる態様として、特に上述された変法よりも
とにかく範囲の制限された本発明の総ての具体例を含む。出願人は本明細書に添
付される請求の全範囲を発明したが、本明細書に添付される請求の範囲は他者の
先行技術研究をその範囲内に含むものではない。よって、特許庁もしくはその他
の団体または個人により請求の範囲内にある制定法上の先行技術が出願人の目に
留まる場合には、かかる請求の範囲の内容を再び定義して、特にかかる請求の範
囲からかかる制定法上の先行技術または制定法上の先行技術の明白な変形を排除
する適用できる特許法の下、出願人は修正された権利を行使する権利を有する。
かかる補正の請求の範囲により定義された本発明の変形もまた本発明の態様とさ
れる。
【００６７】詳細な説明 Ｆｌｔ４と呼ばれる新規受容体チロシンキナーゼのクローニング、配列決定お
よび発現について以下に記載する。Ｆｌｔ４遺伝子は数多くの増殖因子および増
殖因子受容体が存在する染色体領域５ｑ３５に位置している。Ｆｌｔ４の細胞外
ドメインは１２の有力なグリコシル化部位をはじめとする７つの免疫グロブリン
様ループで構成されている。構造上の類似性から、Ｆｌｔ４およびこれまでに知
られているＦｌｔ１ならびにＫＤＲ／ＦＬＫ１受容体がIII型チロシンキナーゼ
のサブファミリーを構成していると考えられる。Ｆｌｔ４遺伝子はその３’配列
において異なり、かつＨＥＬおよびＤＡＭＩ白血病細胞で特異的に発現されるこ
とが分かっている５．８ｋｂおよび４．５ｋｂのｍＲＮＡとして発現される。 ウイルムス腫瘍細胞系統、網膜芽腫細胞系統および非分化奇形癌細胞系統はＦ
ｌｔ４を発現したが、分化奇形癌細胞は陰性であった。ほとんどの胎児組織もま
たＦｌｔ４ｍＲＮＡを発現し、脾臓、脳中間帯および肺で最も高いレベルを示し
た。ヒト成人組織では最も高い発現レベルは、発現の減少順に胎盤、肺、腎臓、
心臓および肝臓で見られた。in situハイブリダイゼーションでは、Ｆｌｔ４オ
ートラジオグラフの粒子の大きさにより胎児肺の内皮細胞が修飾された。
【００６８】 胎児組織におけるＦｌｔ４の免疫組織化学的染色により内皮細胞の染色が確認
された。Ｆｌｔ４の発現パターンはＦｌｔ１およびＫＤＲとの比較において１８
週齢ヒト胎児組織で極めて異なっている。Kaipainen et al., J. Exp. Med, 178
: 2077 (1993)参照。
【００６９】 実施例４および１１に記載されるようにＦｌｔ４ｃＤＮＡを含有する発現ベク
ターを作製し、ＣＯＳおよびＮＩＦＩ３Ｔ３細胞で発現させた。
【００７０】 本発明のＦｌｔ４ＤＮＡおよびポリペプチドはＦｌｔ４リガンドの精製、およ
び様々な生物における内皮細胞の増殖および分化の調節に有用であると考えられ
る。またこれらはある疾病の診断／治療においても価値のあることが証明されよ
う。
【００７１】 次の説明では、組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）技術に用いられる数多くの用語が広
く使用される。明細書および請求項の十分に、かつ首尾一貫した理解が得られる
ように、かかる用語に与えられるべき範囲など、次の定義を提供する。
【００７２】 遺伝子 ＲＮＡポリメラーゼの鋳型を含むＤＮＡ配列。遺伝子から転写された
ＲＮＡはタンパク質をコードしていてもよいし、コードしていなくともよい。タ
ンパク質に関してコードするＲＮＡをメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と呼び
、真核生物ではＲＮＡポリメラーゼIIにより転写される。しかしながら、ＲＮＡ
ポリメラーゼII鋳型を含む遺伝子を構築することも知られており、そこでは通常
は翻訳されないが、特異なｍＲＮＡのものに相補的な配列を有するＲＮＡ配列が
転写される。かかる遺伝子構築物を本明細書では「アンチセンスＲＮＡ遺伝子」
と呼び、かかるＲＮＡ転写物を「アンチセンスＲＮＡ」と呼ぶ。アンチセンスＲ
ＮＡはアンチセンスＲＮＡ配列にある翻訳停止コドンの存在により通常翻訳する
ことができない。
【００７３】 「相補的ＤＮＡ」または「ｃＤＮＡ」遺伝子は介在配列（イントロン）を欠い
たｍＲＮＡの逆転写により合成された組換え遺伝子を含む。
【００７４】 クローニングビヒクル 宿主細胞において自律的に複製が可能であり、かつそ
こでかかるＤＮＡ配列をビヒクルの本質的生物学的機能を失うことなく、限定し
得る様式で切断し、そこにＤＮＡをスプライシングしてその複製およびクローニ
ングをなし遂げる、１または少数のエンドヌクレアーゼ認識部位により特徴づけ
られるプラスミドまたはファージＤＮＡもしくはその他のＤＮＡ配列。クローニ
ングビヒクルはクローニングビヒクルで形質転換した細胞の同定における使用に
好適なマーカーをさらに含む。例えばマーカーはテトラサイクリン耐性またはア
ンピシリン耐性である。「ベクター」は時に「クローニングベクター」の代わり
に使用される。
【００７５】 発現ベクター クローニングビヒクルに類似しており、宿主への形質転換の後
にそれにクローニングできる遺伝子を発現し得るビヒクルまたはベクター。クロ
ーニングされた遺伝子は通常、プロモーター配列などの（すなわち機能し得る形
で連結された）ある調節配列の制御下に置かれている。発現調節配列はベクター
が原核生物または真核生物宿主において機能し得る形で連結された遺伝子を発現
するよう設計されているかどうかによって異なり、エンハンサーエレメント、終
結配列、組織特異性エレメント、および／または翻訳開始および終結部位などの
転写エレメントを含んでいると考えられる。
【００７６】 本発明は組換えＦｌｔ４タンパク質（短鎖型および長鎖型）の発現とこれらの
タンパク質の機能的誘導体の両方に関係する。
【００７７】 機能的誘導体 Ｆｌｔ４タンパク質の「機能的誘導体」は、非組換えＦｌｔ４
タンパク質の生物学的活性と実質的に同じ生物学的活性（機能的または構造的の
いずれか）を持ったタンパク質である。Ｆｌｔ４タンパク質の機能的誘導体は特
異的な機能を行うためのかかる修飾の必要性により、共有結合した炭水化物など
の翻訳後修飾を含んでもよいし、含まないともよい。「機能的誘導体」とは、分
子の「断片」、「変異体」、「類似体」および「化学的誘導体」を包含するよう
意図されている。
【００７８】 本明細書において使用されるように、分子が通常の分子の一部ではなく、さら
なる化学的部分を含む場合にはそれは別の分子の「化学的誘導体」であるとする
。かかる部分は分子の可溶性、吸収、生物学的半減期などを改質する。またこの
部分は分子の毒性を弱めて分子等のいずれの所望でない副作用を排除しまたは弱
める。かかる作用を媒介し得る部分についてはRemington's Pharmaceutical Sci
ences (1980)で開示される。かかる部分と分子との結合手順は当技術分野で公知
である。
【００７９】 断片 Ｆｌｔ４タンパク質などの分子の「断片」とは、ペプチドコアまたはペ
プチドコアの変異体などの分子のいずれの部分をもいう。
【００８０】 変異体 Ｆｌｔ４タンパク質などの分子の「変異体」とは、構造および生物学
的活性において完全分子またはその断片のいずれかと実質的に同じ分子をいう。
よって、２つの分子が同じ活性をもっている場合、たとえその一方の分子の組成
物または二次、三次もしくは四次構造がもう一方のもので見られるものと同じで
なく、またアミノ酸残基の配列が同じでない場合でもそれらは本明細書において
使用される変異体と考えられる。
【００８１】 類似体 Ｆｌｔ４タンパク質または遺伝子配列の「類似体」とは、機能におい
て本明細書のＦｌｔ４タンパク質または遺伝子配列と実質的に同じタンパク質ま
たは遺伝子配列をいう。
【００８２】好ましい具体例の説明 本発明は出願人らが「Ｆｌｔ４」と呼ぶもの、チロシンキナーゼの受容体、Ｆ
ｌｔ４をコードする核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、アン
チセンスＲＮＡなど）、Ｆｌｔ４遺伝子配列およびその産物からのＦｌｔ４ペプ
チドまたはＦｌｔ４タンパク質の産生、組換えＦｌｔ４発現ベクター、Ｆｌｔ４
類似体および誘導体、ならびにＦｌｔ４および関連タンパク質、Ｆｌｔ４リガン
ド、Ｆｌｔ４アンタゴニストおよび抗Ｆｌｔ４抗体の診断用および／または治療
用の使用に向けられる。
【００８３】組換えＦｌｔ４の産生 好適な宿主細胞においてＦｌｔ４をコードする配列またはその機能的に同等な
ものをクローニングし発現させることにより、生物学的に活性なＦｌｔ４が産生
され得る。
【００８４】 組換えＤＮＡ技術を用いるＦｌｔ４の産生は記載目的のために段階的な工程に
分割できる：（１）所望のＦｌｔ４のコード配列（遺伝子）の単離または作製；
（２）所望のＦｌｔ４の合成にあたることのできる発現ベクターの構築；（３）
Ｆｌｔ４遺伝子を複製し、発現し、かつ／または遺伝子産物をプロセッシングし
て所望のＦｌｔ４を産生し得る適当な宿主細胞のトランスフェクトまたは形質転
換；ならびに（４）所望のＦｌｔ４産物の同定および精製。
【００８５】Ｆｌｔ４遺伝子の単離または作製 Ｆｌｔ４またはその機能的に同等なもののヌクレオチドコード配列を用いて、
所望のＦｌｔ４産物の発現にあたるであろう組換え発現ベクターを構築すること
ができる。本発明の方法の実施において、本明細書に示されるヌクレオチド配列
またはその機能的に同等なものの断片を用いて、適当な宿主細胞において組換え
Ｆｌｔ４産物の発現を命令する組換え分子を作製することができる。Ｆｌｔ４を
コードするヌクレオチド配列はＦｌｔ４様活性を示す、および／またはＦｌｔ４
をコードするｍＲＮＡを発現する種々の細胞供給源から得ることができる。出願
人らはをヒト胎盤、白血病細胞およびいくつかの腫瘍細胞系統をはじめとするＦ
ｌｔ４のいくつかの好適なヒト細胞供給源を同定している。
【００８６】 Ｆｌｔ４コード配列はかかる細胞供給源から単離および精製されたＲＮＡから
のｃＤＮＡクローニングによってまたはゲノムクローニングによって得てもよい
。Ｆｌｔ４配列は、例えば、当技術分野で十分に公知の技術を用いてポリメラー
ゼ鎖反応によってｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ物質から増幅させてもよい。ｃＤ
ＮＡまたはゲノムライブラリーのクローンのいずれかは当技術分野で十分に公知
の技術を用いて調製することができ、またＦｌｔ４遺伝子のいずれかの部分に実
質的に相補的なヌクレオチドプローブを用いて特定のＦｌｔ４ＤＮＡをスクリー
ニングすることもできる。発現ベクターを構築するためには、全長クローン、す
なわち、所望のＦｌｔ４の全コード領域を含むものを選択することもできる。あ
るいは、当技術分野で標準的な技術を用いて化学合成によってＦｌｔ４をコード
するＤＮＡ全部をまたは部分的に合成してもよい。ヌクレオチドコード配列の内
在する縮重のために、実質的に同一のまたは機能的に同等なアミノ酸配列をコー
ドするその他のＤＮＡ配列を本発明の方法の実施に用いてもよい。Ｆｌｔ４ヌク
レオチド配列のかかる変更としては同一または機能的に同等な遺伝子産物をコー
ドする配列をもたらす、種々のヌクレオチドの欠失、付加または置換が挙げられ
る。遺伝子産物が配列内にサイレント変化をもたらし、従って生理活性産物を産
生するアミノ酸残基の欠失、付加または置換を含む場合もある。かかるアミノ酸
置換は含まれる残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性および／または両親
媒性における類似性に基づいてなされ得る。例えば、負に荷電したアミノ酸とし
てはアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、正に荷電したアミノ酸とし
てはリジンおよびアルギニンが挙げられ、同様の親水性値を有し荷電していない
極性頭部基または非極性頭部基を有するアミノ酸としては以下のロイシン、イソ
ロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、
トレオニン、フェニルアラニン、チロシンが挙げられる。
【００８７】Ｆｌｔ４発現ベクターの構築 この情報を用いて、Ｆｌｔ４受容体チロシンキナーゼを適当な量で提供し得る
種々の組換えＤＮＡベクターが提供される。本明細書で同定される鍵となる構造
特性を有する合成タンパク質、ならびに他の供給源由来の同一ファミリーのタン
パク質をコードする関連構造のさらなる組換えＤＮＡベクターを組換えＤＮＡ技
術の標準的な技術を用いてＦｌｔ４受容体チロシンキナーゼｃＤＮＡから作製す
ることができる。形質転換発現Ｆｌｔ４受容体チロシンキナーゼがこの技術の例
として作製されている（実施例３および４参照）。新規に発見された配列および
構造情報を用いて、真核細胞のトランスフェクションによりＦｌｔ４受容体チロ
シンキナーゼおよび生物学的目的のためのその種々のドメインを調製することが
できる。
【００８８】Ｆｌｔ４遺伝子産物を発現するトランスフェクタントまたは形質転換体の同定 組換えコード配列を含み、生物学的に活性な成熟産物を発現する宿主細胞は少
なくとも４種の一般的なアプローチによって同定できる：（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡ
、ＤＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−アンチセンスＲＮＡハイブリダイゼーション；
（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在または不在；（ｃ）宿主細胞におけるＦｌ
ｔ４ｍＲＮＡ転写物の発現によって測定される転写レベルの評価；および（ｄ）
免役アッセイおよび最終的には生物学的活性によって測定される成熟遺伝子産物
の検出。
【００８９】 第１のアプローチでは、発現ベクターに挿入されたＦｌｔ４コード配列の存在
がＦｌｔ４コード配列と相同なヌクレオチド配列からなるプローブを用いるＤＮ
Ａ−ＤＮＡハイブリダイゼーションによって検出され得る。
【００９０】 第２のアプローチでは、組換え発現ベクター／宿主系がある「マーカー」遺伝
子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、メトトレキサート耐性
、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける封入体形成など）の存在または不
在に基づいて同定され、選択され得る。例えば、Ｆｌｔ４コード配列がベクター
のマーカー遺伝子配列内に挿入されれば、そのコード配列を含む組換え体をマー
カー遺伝子機能の不在によって同定することができる。あるいは、マーカー遺伝
子はＦｌｔ４コード配列の発現を制御するのに用いられるものと同一のまたは異
なるプロモーターの制御の下にＦｌｔ４配列と直列に配置され得る。誘導または
選択に応じたマーカーの発現はＦｌｔ４コード配列の発現を示す。
【００９１】 第３のアプローチでは、Ｆｌｔ４コード領域の転写活性がハイブリダイゼーシ
ョンアッセイによって評価され得る。例えば、Ｆｌｔ４コード配列またはその特
定の部分と相同なプローブを用いるノーザンブロッティングによってポリアデニ
ル化ＲＮＡを単離、解析することができる。あるいは、宿主細胞の総核酸を抽出
し、かかるプローブに対するハイブリダイゼーションについてアッセイしてもよ
い。
【００９２】 第４のアプローチでは、Ｆｌｔ４の発現が、例えば、ウエスタンブロット、放
射性免役沈降、酵素結合型免役アッセイなどの免役アッセイによって免疫学的に
評価され得る。しかしながら、発現系の成功についての最終的な試験には生物学
的に活性なＦｌｔ４遺伝子産物の検出が必要である。宿主細胞が遺伝子産物を分
泌する場合には、培養されたトランスフェクト宿主細胞から得られる細胞を含ま
ない培地をＦｌｔ４活性に関してアッセイすればよい。遺伝子産物が分泌されな
い場合には、細胞溶解物をかかる活性に関してアッセイすればよい。いずれの場
合にも、Ｆｌｔ４へのリガンド結合またはＦｌｔ４のその他の生理活性を測定す
るアッセイを用いればよい。
【００９３】Ｆｌｔ４誘導体、類似体およびペプチド Ｆｌｔ４に関連する誘導体、類似体およびペプチドの作製および使用も考慮さ
れ、かつ、本発明の範囲内にある。かかる誘導体、類似体またはペプチドは特定
の適用に依存して生物学的活性を天然のＦｌｔ４と比較して増強しているかまた
は低下させている場合もある。本発明のＦｌｔ４関連誘導体、類似体およびペプ
チドは当技術分野で公知の種々の手段によって作製できる。ゲノムおよびタンパ
ク質レベルでの処置および操作は本発明の範囲内にある。ペプチド合成は当技術
分野で標準的なものであるが、これを用いてＦｌｔ４ペプチドを得てもよい。タ
ンパク質レベルでは、限定されるものではないが、エンドペプチダーゼ（例えば
、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、Ｖ８プロテアーゼなど）またはエ
キソペプチダーゼによる特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、酸化な
どをはじめとする当技術分野で公知の技術によって多数の化学修飾を用いてＦｌ
ｔ４様誘導体、類似体またはペプチドを作製してもよい。
【００９４】 好ましい誘導体、類似体およびペプチドはＦｌｔ４リガンド結合性活性を保持
するものである。Ｆｌｔ４リガンドを結合するがそれに応じてシグナルを伝達し
ない誘導体、類似体およびペプチドはＦｌｔ４阻害剤として有用である。Ｆｌｔ
４リガンドを結合し、かつ、それに応じて、例えば、細胞内Ｆｌｔ４自己リン酸
化を含む過程を通してシグナルを伝達する誘導体、類似体およびペプチドは天然
Ｆｌｔ４として同様に有用である。かかる結合および／または自己リン酸化アッ
セイにおいて使用するのに好ましいＦｌｔ４リガンドは本明細書に記載のＰＣ−
３コンディショニング培地から単離可能な約２３ｋｄのポリペプチドを含んでな
るリガンドである。血管内皮増殖因子−Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）と呼ばれるこのリガ
ンドは１９９６年８月１日に出願され、国際公開ＷＯ９７／０５２５０として公
開され、優先権は米国特許出願優先権証明書にある、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／Ｆ
Ｉ９６／００４２７に詳細に特徴づけられている（なお、これらは総て引用する
ことにより本明細書の一部とされる）。
【００９５】抗Ｆｌｔ４抗体 本発明の範囲内にはＦｌｔ４または関連タンパク質を認識するポリクローナル
およびモノクローナル抗体の作製もある。 当技術分野で公知の種々の手順をＦｌｔ４のエピトープに対するポリクローナ
ル抗体の作製に用いることができる。抗体の作製に関しては、種々の宿主動物（
限定されるものではないが、ウサギ、マウス、ラットなどをはじめとする）をＦ
ｌｔ４または合成Ｆｌｔ４ペプチドの注射によって免疫することができる。宿主
種にもよるが、限定されるものではないが、フロイントの（完全および不完全）
アジュバント、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、リゾレシチンなどの界面活
性物質、プルロニック(pluronic)ポリオール、ポリアニオン、オイルエマルショ
ン、スカシ貝ヘモシアニン、ジニトロフェノールおよびＢＣＧ（バチルス・カル
メット−グエリン(Bacillus Calmette-Guerin)）およびコリネバクテリウム・パ
ルバム(Corynebacterium parvum)などの有用である可能性のあるヒトアジュバン
トをはじめとする種々のアジュバントを用いて免疫学的応答を増大させることが
できる。
【００９６】 Ｆｌｔ４のエピトープに対するモノクローナル抗体は連続培養細胞系統によっ
て抗体分子を産生させるいずれの技術を用いて調製してもよい。これらとしては
、限定されるものではないが、Kohler et al., Nature, 256,:495-497 (1975)に
よって最初に記載されたハイブリドーマ技術、およびより最近ではヒトＢ細胞ハ
イブリドーマ技術[Kosbor et al., Immunology Today, 4:72 (1983)]およびＥＢ
Ｖハイブリドーマ技術[Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Thera
py, Alan R Liss, Inc., pp77-96 (1985)]が挙げられる。また、Ｆｌｔ４に対す
る抗体は細菌において、クローニングされた免疫グロブリンｃＤＮＡからも産生
され得る。組換えファージ抗体系の使用に関しては、細菌培養物において抗体を
迅速に産生し、選抜し、またその構造を遺伝子操作することが可能であり得る。
【００９７】 分子のイディオタイプを含む抗体断片も公知の技術によって作製することがで
きる。例えば、かかる断片としては、限定されるものではないが、抗体分子のペ
プシン消化によって生じ得るＦ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスル
フィド橋の還元によって作製できるＦａｂ’断片、および抗体分子をパパインお
よび還元剤で処理することによって作製できる２種のＦａｂ断片が挙げられる。
【００９８】 Ｆｌｔ４に対する抗体は成熟Ｆｌｔ４およびＦｌｔ４前駆およびサブコンポー
ネント種の定性および定量検出、Ｆｌｔ４ポリペプチドのアフィニティー精製、
およびＦｌｔ４生合成、代謝および機能の解明に用いることができる。Ｆｌｔ４
チロシンキナーゼ活性の検出をかかるアッセイにおけるＦｌｔ４特異的シグナル
の作製および増幅の酵素的な手段として用いることができる。また、Ｆｌｔ４に
対する抗体は診断および治療薬として有用であり得る。
【００９９】Ｆｌｔ４、Ｆｌｔ４をコードする核酸分子および抗Ｆｌｔ４抗体の使用 出願人らは、Ｆｌｔ４、Ｆｌｔ４類似体および誘導体、Ｆｌｔ４をコードする
核酸分子、アンチセンス核酸分子および抗Ｆｌｔ４抗体の診断用のおよび／また
は治療用の使用をはじめとする本発明の組成物の広範な種々の使用を考慮してい
る。
【０１００】 Ｆｌｔ４をコードする核酸分子またはその断片をプローブとして用いてＦｌｔ
４をコードするｍＲＮＡを検出および定量することができる。核酸プローブを用
いて公知の遺伝子配列の総てまたは一部を含んでなる配列を検出するアッセイは
当技術分野では十分に公知である。Ｆｌｔ４ｍＲＮＡレベルは出現および／また
は存在する腫瘍形成ならびにその他のヒトの疾病の発症および／または進行を示
し得る。００００従って、Ｆｌｔ４ｍＲＮＡを検出し、定量し得るアッセイは貴
重な診断手段を提供し得る。
【０１０１】 アンチセンスＦｌｔ４ＲＮＡ分子は、治療目的がＦｌｔ４の存在の排除を望む
、またはそのレベルのダウンレギュレートを望む場合には、Ｆｌｔ４をコードす
るｍＲＮＡの翻訳を阻害するために治療上有用である。Ｆｌｔ４アンチセンスＲ
ＮＡは、例えば、Ｆｌｔ４が、例えばその過剰発現によって原因剤として関与す
る疾病の治療においてＦｌｔ４拮抗剤として有用であり得る。さらに、Ｆｌｔ４
アンチセンスＲＮＡはＦｌｔ４機能的機構の排除において有用である。Ｆｌｔ４
をコードする核酸分子は本出願において個別に論じられる組換えＦｌｔ４タンパ
ク質および関連分子の産生のために用いることができる。
【０１０２】 アンチＦｌｔ４抗体を用いて、種々の範囲においてＦｌｔ４を診断し、定量す
ることができる。例えば、Ｆｌｔ４の種々のドメインに対する抗体をＦｌｔ４免
役アッセイまたはＦｌｔ４の免役組織化学的評価のベースとして用いてもよい。
Ｆｌｔ４のチロシンキナーゼ活性はこれらのアッセイにおいてＦｌｔ４シグナル
を作製するための酵素的増幅反応として有用であり得る。また、アンチＦｌｔ４
抗体も細胞表面のＦｌｔ４量の研究において有用であり得る。
【０１０３】 Ｆｌｔ４リガンドアゴニストまたはアンタゴニストとして機能し、それによっ
てＦｌｔ４活性の低下が可能となる抗体を作製できる。また、合成法によって、
または組換え法によってランダムオリゴヌクレオチドからランダムペプチドも作
製でき、Ｆｌｔ４受容体への特異的結合を示すものをＦｌｔ４細胞外ドメインを
用いて選抜することができる。かかるペプチドセグメントはまた、当技術分野で
標準的な方法を用いて、Ｆｌｔ４の細胞外ドメインを用いてファージディスプレ
ーライブラリーから選抜することもできる。かかるペプチドはアゴニストまたは
アンタゴニスト活性を有し得る。Ｆｌｔ４抗体はまた、種々の化合物へ結合した
後にＦｌｔ４発現細胞および組織または腫瘍のin vivoイメージングのための貴
重な診断手段を提供し得る。
【０１０４】 Ｆｌｔ４に対するモノクローナル抗体を好適な強磁性、常磁性、電子密度、音
波発生または放射活性剤に共有または非共有のいずれかで結合させ、標的とされ
るイメージング剤を作製することができる。モノクローナル抗体のエピトープ結
合性ドメインを用いて作製された分子のタンパク質分解または化学的処理によっ
て生じた抗体断片は完全な抗体に代用することができる。次いで、このイメージ
ング剤を診断目的のためのヒト身体のＸ線、磁性共鳴、音波ホログラフィーまた
はシンチグラフィーイメージングの造影剤として利用できるであろう。
【０１０５】Ｆｌｔ４の分子生物学 配列番号１および３に示されるＦｌｔ４ｃＤＮＡクローンの完全配列は、別の
スプライシング次第で、４１９５または４７９５のヌクレオチドにわたり、１２
９８個または１３６３個のアミノ酸からなるオープンリーディングフレームを含
む。ヌクレオチドおよび推定されるＦｌｔ４アミノ酸配列（短鎖型）が配列番号
１および２に示されている。図２はＦｌｔ４アミノ酸配列とＦｌｔ１チロシンキ
ナーゼアミノ酸配列との比較を示している。Shibuya et al., Oncogens, 5: 519
-524 (1990)参照。
【０１０６】 大部分が疎水性のアミノ酸からなる推定シグナルペプチド配列がイニシエータ
ーメチオニンに続いている。対応するＡＴＧの周囲の配列は共通翻訳開始配列と
一致している[Kozak, Nucl. Acids Res., 15: 8125-8135 (1987)]。両Ｆｌｔ４
ポリペプチドの予想される細胞外部分は７７５個のアミノ酸長であり、アスパラ
ギン結合型グリコシル化についての１２個の可能性ある部位（ＮＸＳ／Ｔ）を含
んでいる。また、タンパク質の免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーに
ついて記載されたスペーシングパターンを示す数個のアミノ酸残基も含んでいる
[Williams et al., Annu. Rev. Immunol., 6: 381-405 (1988)]。それは１２個
のシステイン残基を有し、７個の免役グロブリン様ドメインを構成し得る。予想
されるＩｇ様ドメインIVはシステイン残基を欠いている。また、図２はＦｌｔ１
の細胞外ドメイン示しており（配列番号５）、これはＦｌｔ４の最も近いヒト相
同体である。この図からシステイン残基の整列およびＩｇ様領域の極めて類似し
た組成がわかる。
【０１０７】 Ｆｌｔ４の細胞質ドメインは２３個の疎水性アミノ酸残基からなる推定膜貫通
領域によって細胞外部分から分離されている。この配列は細胞質側で塩基性領域
によってフランクされており、このことは膜貫通ドメインと細胞質ドメインの間
の結合を示唆するものである。チロシンキナーゼ相同ドメインは残基８４３で始
まり、ＡＴＰ結合ポケットおよびＹ１０６８でのｃ−ｓｒｃのＹ４１６に相同な
推定自己リン酸化部位を含む（図２）。Ｆｌｔ４のチロシンキナーゼ触媒ドメイ
ンは、大部分が親水性でＦｌｔ１に相同性を示さない６５個のアミノ酸配列（ａ
ａ９４４〜１００８）によって２つのサブドメインに分割されている。Ｆｌｔ１
とは異なり、Ｆｌｔ４はそのキナーゼ挿入部分にチロシン残基を含まない。
【０１０８】 Ｆｌｔ４ｍＲＮＡの第２種は別の３’末端を有し、これは長鎖型のＦｌｔ４タ
ンパク質をコードしている。
【０１０９】 図３Ａ〜Ｃでは、別のスプライシングによる短および長鎖型のＦｌｔ４ｍＲＮ
Ａの産生が例示されている。図３ＡはクローンＪ．１．１およびＩ．１．１のｃ
ＤＮＡ挿入部分の３’末端の概略構造を示している。クローンＪ．１．１のＴＡ
Ｇ終結コドンならびにポリアデニル化部位（ポリＡ）が示されている。クローン
Ｉ．１．１は陰をつけたセグメントでクローンＪ．１．１と異なっている（それ
ぞれ、Ｆｌｔ４ｍＲＮＡの長鎖型および短鎖型）。ＴＡＡおよびポリＡはクロー
ンＩ．１．１の終結コドンおよびポリアデニル化部位を示している。さらに、Ｅ
ｃｏＲＩおよびＡｖａＩの制限エンドヌクレアーゼ切断部位が示されている。下
記に示されるものはｃＲＮＡ保護分析に用いたクローンＩ．１．１の２５６ｂｐ
のＥｃｏＲＩ−ＡｖａＩ挿入部分である。濃く陰をつけたセグメントのほとんど
はin vitroでアンチセンス鎖を転写するための線状化センスＲＮＡ鋳型中のポリ
リンカーに由来する配列を示している。ＲＮアーゼ保護分析にかんがみた保護断
片の概略構造も示されている。図３Ｂおよび３Ｃは２５６ｂｐの３５Ｓ標識アン
チセンスＲＮＡプローブならびに示された細胞系統由来（Ｔｅｒａ−２は奇形癌
細胞系統であり、ここでは１０日間のレチノイン酸（ＲＡ）処理をともなうかと
もなわないで分析されている）のポリアデニル化ＲＮＡによって保護された場合
の、長鎖型および短鎖型のＦｌｔ４ＲＮＡに相当する２１１および１２４ｂｐの
消化断片のオートラジオグラムを示している。（負）対照レーンは転移ＲＮＡを
用いた保護の結果を示している。Ｔｅｒａ−２細胞の分化の際のＦｌｔ４ｍＲＮ
Ａのダウンレギュレーションが注目される。クローン１３のＴｅｒａ−２細胞は
Dr. C. F. Graham(Department of Zoology, University of Oxford, UK)から提
供された。継代１８〜４０の間の細胞をこの研究に用いた。細胞は１０％ウシ胎
児血清および抗生物質を添加したイーグルの最小必須培地（ＭＥＭ）で維持した
。分化を誘導するためには、細胞をゼラチンコートした組織培養等級皿で１．５
×１０３細胞／ｃｍ２の密度で培養した。翌日、２×１０−６ＭのＲＡを培地に
加えた。細胞をＲＡの存在下で１０日間まで培養した。
【０１１０】 図３Ａ〜Ｃに示される結果は別のスプライシングによって生成したこれら２種
のＦｌｔ４（長鎖および短鎖）型のカルボキシ末端の生成を例示している。 その推定されるアミノ酸配列によれば、Ｆｌｔ４はクラスIIIＲＴＫに属する
。より詳しくは、Ｆｌｔ４はそれらの細胞外部分に７個のＩｇループを含み、従
って、５個のＩｇループを含むクラスIIIＲＴＫのその他のメンバーとは異なる
、ＲＴＫのサブファミリーに属する。Ｆｌｔ４はｖ−ｒｏｓ関連ＤＮＡとしてヒ
トゲノムＤＮＡライブラリーからクローニングされたＦＬＴファミリーの原型受
容体、Ｆｌｔ１[Shibuya et al., Oncogene, 5: 519-524 (1990)]とおよびマウ
ス肝臓の造血幹細胞濃縮画分からクローニングされたマウスＦＬＫ１受容体[Mat
thews et al., Cell, 65: 1143-1152 (1991);Matthews et al., Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA, 88: 9026-9030 (1991)]と最も密接に相同である。Ｆｌｔ４の細
胞外ドメインはヒトＦｌｔ１およびマウスＦＬＫ１とそれぞれ３３％および３７
％のアミノ酸配列同一性を示す。Ｆｌｔ１およびＦＬＫ１はＦｌｔ４同様、肺、
心臓および腎臓などの種々の正常組織において広く発現されている。さらに、最
近同定されたヒト内皮細胞受容体チロシンキナーゼＫＤＲ[Terman et al., Onco
gene, 6: 1677-1683 (1991)]はＦｌｔ４およびＦｌｔ１ファミリーメンバーと相
当な相同性を示す。利用できる配列データから、ＫＤＲはチロシンキナーゼ（Ｔ
Ｋ）ドメインにおいてＦｌｔ４と８１％同一であると算出できる。さらに、ＫＤ
Ｒの細胞外ドメインもまた、７個のＩｇループ構造を有し、そのＴＫ１およびＴ
Ｋ２ドメインはマウスＦＬＫ１受容体の相当するドメインと９５％および９７％
同一である。このことはＫＤＲはマウスＦＬＫ１のヒト相同体であるということ
を示唆するものである。
【０１１１】 Ｆｌｔ４ＴＫドメインはＦｌｔ１およびＦＬＫ１／ＫＤＲのＴＫドメインと約
８０％同一であるが、ＲＴＫクラスIIIのその他の受容体のＴＫドメインとは約
６０％しか同一でない。これらの他の受容体はまた、細胞外領域に５個のＩｇ様
ドメインしか有さず、Ｆｌｔ４、Ｆｌｔ１およびＦＬＫ１／ＫＤＲをクラスIII
ＲＴＫ内の個別のＦＬＴサブファミリーに分類できる。
【０１１２】 ＰＤＧＦＲのキナーゼ挿入部分、ｃ−ｆｍｓおよびｃ−ｋｉｔ中の配列Ｄ／Ｅ
−Ｄ／Ｅ−Ｙ−Ｍ／Ｖ−Ｐ／Ｄ／Ｅ−Ｍ[Cantley, et al., Cell, 64: 281-302
(1991)]（配列番号６）中に位置するチロシン残基は自己リン酸化部位であり、
リン酸化されるとホスファチジルイノシトール３’キナーゼ（ＰＩ−３Ｋ）のＳ
Ｈ２ドメインを結合する[Reedljk et al., EMBO J., 11: 1365-1372 (1992)]。
興味深いことに、これらのクラスIIIＲＴＫとは異なり、ＦＬＴサブファミリー
のメンバーまたはＦｌｔ３／ＦＬＫ２受容体はかかる共通モチーフを含まない。
【０１１３】 ８個のヒトクラスIIIＲＴＫ遺伝子は３個の異なる染色体に集中している。 染色体４はｃ−ｋｉｔ、ＰＤＧＦＲ−αおよびＫＤＲ遺伝子を含んでいる[Yarde
n et al., EMBO J., 6: 3341-3351 (1987);Stenman et al., Genes, Chromosome
s, Cancer, 1:155-158 (1989);Terman et al., Oncogene, 6: 1677-1683 (1991)
]。Ｆｌｔ１およびＦｌｔ３遺伝子は染色体１３ｑ１２に位置しており[Satoh et
al., Jpn. J. Cancer Res., 78:772-775 (1987);Rosnet et al., Genomics, 9:
380-385 (1991)]、他方、Ｆｌｔ４は染色体５バンドｑ３５に局在している[Apr
elikova et al., Cancer Res., 52: 746-748 (1992)]、ｆｍｓおよびＲＤＧＦＲ
−β遺伝子の近くにある[Warringron et al., Genomics, 11: 701-708 (1991)]
。染色体５の長腕は白血病細胞において認められる転座に関与している。難治性
貧血および大球症を患う患者の骨髄細胞において染色体５の長腕部の欠失が認め
られた[Van Den Berghe et al., Nature, 251: 437-439 (1974)]。過剰の芽細胞
をともなう難治性貧血[Swolin et al., Blood, 58: 986-993 (1981)]、原因不明
骨髄化生[Whang-Pang et al., Leuk. Res. 2: 41-48 (1978)]、慢性骨髄性白血
病[Tomiyasu et al., Cancer Genet. Cytogenet., 2: 309-315 (1980)]、真性赤
血球増加症[Van Den Berghe et al., Cancer Genet. Cytogenet., 1: 157-162 (
1979)]および本態性血小板血症[Nowell et al., Cancer, 42: 2254-2260 (1978)
]などのいくつかのその他の脊髄増殖性疾患において異常な５ｑ染色体が認めら
れている。
【０１１４】 Ｆｌｔ４ｍＲＮＡ発現に関する発見はそのタンパク質産物はある白血球細胞に
特有のものであるということを示唆する。巨核芽球細胞および内皮細胞間で共有
されるいくつかの分化抗原が、例えば、血小板糖タンパク質IIIａとして存在す
ると示されている[Ylanne et al., Blood, 72: 1478-1486 (1988);Kiefler et a
l., Blood, 72:1209-1215 (1988);Berridge et al., Blood, 66: 76-85 (1985)]
。さらに、Ｆｌｔ４は胎児期に例えば、肺および腎臓の特定の内皮細胞によって
発現されている。
【０１１５】 発達の際のＦｌｔ４の役割をさらに理解するために、マウスＦｌｔ４の部分ｃ
ＤＮＡをクローニングした。これらのプローブをin situハイブリダイゼーショ
ンに用いて、マウス発達の際のＦｌｔ４ｍＲＮＡ発現を分析した。Ｆｌｔ４はリ
ンパ系の脈管形成および腫瘍起因性脈管形成の際に発現されると決定された。ま
た、Ｆｌｔ４が健常および病的状態のヒト成人組織双方のリンパ系内皮ならびに
いくつかの高内皮細静脈（ＨＥＶ）において認められたので、これらの発見が健
常および病的ヒト成人組織においても妥当であると確認された。
【０１１６】 マウスＦｌｔ４ｃＤＮＡ断片のクローニングによりそれらの推定されるアミノ
酸配列が相当するヒト配列とほとんど同一であると示された（研究された両セグ
メントにおけるアミノ酸同一性約９６％）。マウスＦｌｔ４ｃＤＮＡの同一性に
関するさらなる証拠がノーザンハイブリダイゼーション研究から得られ、これで
は両種に由来するプローブによりマウス組織から特有の５．８ｋｂのｍＲＮＡシ
グナルが生じた。成体マウスの種々の組織から単離されたＲＮＡの分析から、肝
臓、肺、心臓、脾臓および腎臓におけるＦｌｔ４発現が示されたが、脳および精
巣では全くハイブリダイズしないか、またはほとんどハイブリダイズしなかった
。このパターンはGalland et al., Oncogene, 8: 1233 (1993)によって早くに報
告されたパターンと同様である。ＲＮアーゼ保護の結果からＦｌｔ４遺伝子はマ
ウス発達の際に必要とされ、８．５日ｐ．ｃ．胚から始まり、相対的発現レベル
は全く安定しているようであると示唆された。
【０１１７】 in situハイブリダイゼーションのために、細胞外ドメインの配列をコードす
るマウスＦｌｔ４ｃＤＮＡの２つの断片を選抜した。これによりハイブリダイゼ
ーションパターンの、細胞外領域においてＦｌｔ４と極めて低い程度にしか配列
同一性を示さない関連ＦＬＫ−１およびＦｌｔ１受容体パターンとの明確な区別
が可能となった。Mellauer et al., Cell, 72: 835 (1993);Yamaguchi et al.,
Development, 118: 489 (1993);Peters et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
90: 8915 (1993);Finnerty et al., Oncogene, 8: 2293 (1993)参照。
【０１１８】 Ｆｌｔ４はＦＬＫ−１、Ｆｌｔ１、ＴｉｅおよびＴｅｋ内皮受容体チロシンキ
ナーゼ遺伝子と同様に、７．５日交尾後（ｐ．ｃ．）胚において発現されなかっ
た。８．５日ｐ．ｃ．胚では最も強いＦｌｔ４シグナルが尿膜、頭部間葉の血管
芽細胞、背部大動脈、および主要静脈に局在していた。心内膜で弱いシグナルが
認められた。対照的に、卵黄嚢の血管芽細胞は、ＦＬＫ−１およびＦｌｔ１、Ｔ
ｉｅおよびＴｅｋに関してとは異なり陰性であった。Korhonen et al., Oncogen
e, 8: 395 (1993);およびPeters et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 89
15 (1993)参照。Ｆｌｔ４発現の静脈系への限定は１１．５日マウス胚由来のサ
ンプルにおいてさらにより明確であり、これではＴｉｅｍＲＮＡが動脈でも発現
された。１２．５日ｐ．ｃ．胚では、Ｆｌｔ４シグナルは発達中の静脈のおよび
推定上リンパ系内皮を修飾したが、内皮Ｔｉｅ受容体チロシンキナーゼに関して
とは異なり、動脈内皮は陰性であった。発達の後期段階の間に、Ｆｌｔ４ｍＲＮ
Ａは発達中のリンパ管に相当する、血液細胞を含まない血管神経叢に限定される
ようになった。成人ヒト組織ではリンパ系内皮といくつかの高内皮細静脈のみが
Ｆｌｔ４ｍＲＮＡを発現した。リンパ洞および高内皮細静脈、転移リンパ節およ
びリンパ管腫では発現が増加した。マウス胚からのデータの解釈が困難であるた
め、リンパ系はヒトにおいてよりいっそう明確にされているのでヒト内皮を研究
した。また、種々の内皮から確立された細胞はＦｌｔ４発現の特異性がin vitro
条件で持続しているかどうか調べるために細胞培養物で研究することができよう
。内皮細胞系統はin vitro培養では分化した特性を失っていると知られている。
従って、Ｆｌｔ４ｍＲＮＡに関して陰性であるとは予想しなかった。培養大動脈
内皮細胞もＦｌｔｍＲＮＡを欠いていた。しかしながら、微小血管系から、なら
びに大腿部および腹部中央の静脈から増殖させたヒト内皮細胞からシグナルが得
られた。従って、少なくともＦｌｔ４発現の特異性のいくつかは細胞培養物にお
いて保持された。
【０１１９】 成人ヒト組織のin situハイブリダイゼーション分析により、発達中のマウス
胚において認められたＦｌｔ４のリンパ系への限定が確認された。Ｆｌｔ４発現
はリンパ系内皮におよびヒトリンパ節洞に認められた。興味深いことに、立方体
様内皮を有し、白血球のリンパ節への輸送において機能すると示されているいく
つかのＨＥＶもまたＦｌｔ４陽性であった。さらに、平行ハイブリダイゼーショ
ン分析により、これらの転移構造において正常なリンパ節と比較してＦｌｔ４ｍ
ＲＮＡレベルが高まったと示された。また、Ｆｌｔ４は、結合組織間質と増殖性
の内皮が並んだリンパチャンネルからなる良性腫瘍であるリンパ管腫において極
めて顕著であった。Ｆｌｔ４ｍＲＮＡはこれらの腫瘍のリンパ系内皮に限定され
ており、それらの動脈、静脈、毛細血管には存在しなかった。ヒト肺では、リン
パ構造は唯一の同定されたＦｌｔ４陽性管であった。
【０１２０】 前記の結果はＦｌｔ４はヒト成人組織におけるリンパ管およびいくつかの高内
皮細静脈の新規マーカーであるということを示すものである。この結果はまたリ
ンパ管の静脈起源に関する理論を支持する。Ｆｌｔ４は増殖因子受容体としてこ
れらの管の分化および機能に関与し得る。Ｆｌｔ４リガンド、ＶＥＧＦ−Ｃを介
してＦｌｔ４を通して媒介される生物学的作用の詳細な特性決定は１９９６年８
月１日に出願され、国際公開ＷＯ９７／０５２５０として公開された、ＰＣＴ特
許出願ＰＣＴ／ＦＩ９６／００４２７に提供されている。
【０１２１】 これらの結果と本発明のＦｌｔ４結合化合物とを組み合わせて、特に、可視化
され得る、放射活性、電子密度またはその他のレポーター物質と結合した本発明
の抗体を用いることによる、リンパ系内皮の選択的標識化が可能となる。リンパ
系にＦｌｔ４受容体インターナリゼーション誘導性モノクローナル抗体またはリ
ガンドを含む物質を注射し、それによって規定の分子をリンパ系内皮に輸送する
ことも可能であり得る。また、本発明のＦｌｔ４結合化合物を、高められたレベ
ルのＦｌｔ４受容体を発現する、高内皮細静脈、特に活性化ＨＥＶの検出のため
に用いることも可能であり得る。本発明者らの知見の限りでは、リンパ系内皮の
かかる特異的なマーカーは目下のところ利用できない。
【０１２２】 以下の実施例は単に本発明を例示するために記載されるものであり、その範囲
を何ら限定するものではない。 実施例１ Ｆｌｔ４をコードするｃＤＮＡクローンの単離および特徴づけ λバクテリオファージｇｔ１１のオリゴ−ｄＴプライマーヒトＨＥＬ細胞ｃ
ＤＮＡ[好意によりDr. Mortimer Poncz, Childrens Hospital of Philadelphia,
PA; Poncz et al., Blood, 69: 219-223(19871) から提供を受けた] を同じラ
イブラリーからＰＣＲ−増幅したｃＤＮＡ断片でスクリーニングした [Apreliko
va et al., Cancer Rex. 52, 746-748(1992)]。陽性のプラークを同定し、記載
されているように精製した[Sambrook et al., Molecular Cloning- A Laborator
y Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)]。λバクテリオファ
ージのｃＤＮＡ挿入物をＥｃｏＲＩ断片として単離し、ＧＥＭ３Ｚｔ（＋）プラ
スミド（Promega）にサブクローニングした。全長のＦｌｔ４蛋白質コード領域
を単離した。ＨＥＬ−ライブラリーから単離した３つの重複クローン（図1に例
示）を、得られた配列により設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いたジ
デオキシ鎖成長停止反応を使用して配列決定した。ｃＤＮＡｓの全ての部分の両
鎖を配列決定した。配列分析は、ＧＣＧパッケージプログラムを使用して実施し
た[Devereux et al., Nucleic Acids Res., 12: 387-395(1984)およびthe Prosi
te program for Apple MacIntosh]。
【０１２３】 図1Aは、分析したＦｌｔ4ｃＤＮＡクローンの構造略図を例示している。矢印
は、図1Bに図示するノーザンブロットのプローブに使用するサブクローニングし
た制限断片（サイズはkb単位）を示す。Ｅ＝ＥｃｏＲＩ部位、Ｓ＝ＳｐｈＩ部位
。図１Ｂは、図１Ａに示すプローブを用いたＤＡＭＩおよびＨＥＬ白血病細胞Ｒ
ＮＡｓのノーザンハイブリダイゼーション分析を例示する。
【０１２４】 結果 ＨＥＬ細胞ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲクローニング方法によって単離し
た２１０ｂｐ鎖長のＦｌｔ4ｃ断片を、オリゴｄＴ−プライマーヒト赤白血病細
胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための分子プローブとして使用し
た。
【０１２５】 クローンのヌクレオチド配列分析は、１２９８アミノ酸（ａａ）残基のオープ
ンリーディングフレーム（配列番号：2、図2）を明らかにした。図中の翻訳イニ
シエーターメチオニンの周囲には典型的なコンセンサス配列が配置され[Kozac,
Nucleic Acids Res., 12: 857-872(1984)]、その次に、小胞体内に転座するため
のシグナル配列を特徴とする疎水性アミノ酸配列が配置されている。
【０１２６】 Ｆｌｔ4の細胞外ドメインは７つの免疫グロブリン様ループ内に配列されるこ
ともある（図2）。図はまた、Ｆｌｔ4と、非常に類似した構造を含有するＦｌｔ
１の比較を示す。Ｆｌｔ１のアミノ酸配列を配列番号：５に記載する。
【０１２７】 アミノ酸残基７７５〜７９８は、受容体の膜貫通ドメインとして機能すると思
われる疎水性配列鎖およびそれに続くポリペプチドの細胞質側と推定されるもの
のいくつかの塩基性残基を形成する。膜近傍ドメインは、ａａ８４２のチロシン
キナーゼ配列相同性の開始部位手前の４４残基である。６５ａａのキナーゼ挿入
配列に相同性が中断されている場合には、この相同性は受容体のカルボキシ末端
部分の１１７５ａａにおいて最初に欠損している。アミノ酸配列データベースの
関連するチロシンキナーゼドメインの検索（SwissprotおよびNBRF）は、触媒作
用を有するチロシンキナーゼ領域の、それぞれ、約８０％および６０％の相同性
を有するＦｌｔ１およびＰＤＧＦＲＢチロシンキナーゼを同定している。
【０１２８】 実施例２ 抗−Ｆｌｔ4抗血清の調製 大腸菌(Ｅ. ｃｏｌｉ)内でＧＳＴ−Ｆｌｔ４融合蛋白質を作製するために、Ｆ
ｌｔ4短鎖型の予測されるｃ−末端をコードする６５７塩基対のＥｃｏＲＩ断片
をｐＧＥＸ−１λＴ細菌発現ベクター（Pharmacia）のグルタチオン−Ｓ−トラ
ンスフェラーゼコード領域内にクローニングした。得られた融合蛋白質を細菌内
で産生し、製造業者の指示により、グルタチオンアフィニティークロマトグラフ
ィーによって部分的に精製した。Ｆｌｔ4に対するポリクローナル抗体を産生す
るためにこの蛋白質をウサギの免疫化に使用した。３回めの追加抗原投与による
免疫化後の抗血清を使用した。
【０１２９】 実施例３ ＣＯＳ細胞におけるＦｌｔ4の発現 材料および方法 全長のＦｌｔ4蛋白質コード配列（３つのクローンを合わせたもの、図1）をＳ
Ｖｐｏｌｙ哺乳類発現ベクター [Stacey et al., Nucleic Acids Res., 18: 282
9(1990)] 構築物ＳＶ１４〜２のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入した。
発現ベクター（Ｆｌｔ4ｃＤＮＡのそれぞれの形態を含有する、ＳＶ−ＦＬＴ４
短鎖およびＳＶ−ＦＬＴ長鎖）をＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション
方法によってＣＯＳ細胞に導入した[MacCutchan et al., J. Natl. Cancer Inst
., 41: 351-357(1968)]。トランスフェクションの２日後に、細胞をリン酸緩衝
生理食塩液（PBS）で洗浄し、免疫沈降緩衝液（10 mM Tris pH 7.5、50 mM NaCl
、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0.5% Nonidet P40、0.1% SDS、0.1 TIU/ml
Aprotinin）中に回収した。溶解物を超音波処理し、１０，０００×ｇで１５分
間遠心分離し、３ｍｌの抗血清と共に氷上で終夜インキュベーションした。プロ
テインＡセファロース（Pharmacia）を添加し、回転させながらインキュベーシ
ョンを３０’継続した。沈殿物を免疫沈降緩衝液で４回、ＰＢＳで１回、水で１
回洗浄してから、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【０１３０】 結果 全長のＦｌｔ4短鎖および長鎖蛋白質コード領域をｐＳＶｐｏｌｙ発現ベクタ
ーのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングし、これらの発現ベクター
をＣＯＳ細胞にトランスフェクトすることによってＦｌｔ4ｃＤＮＡ配列の予測
される構造を試験した。これらの２つの構築物によって産生される蛋白質はＣ−
末端が異なる：長い方の鎖形態はさらに６５アミノ酸を含有する。トランスフェ
クションの２日後、細胞を溶解し、予測されるＦｌｔ4蛋白質の短鎖型の４０カ
ルボキシル末端アミノ酸残基を含有するＧＳＴ−Ｆｌｔ４融合蛋白質（すなわち
、Ｆｌｔ４の短鎖型および長鎖型の両方に共通する部分）に対して形成した抗体
を使用して免疫沈降した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって免
疫沈降ポリペプチドを分析した。免疫形成前の血清はいかなる特異的なバンドも
示さなかったが、Ｆｌｔ４−特異的抗体は約１７０ＫＤおよび１９０ＫＤの２つ
のバンドを認識する。これらの２つのバンドは識別的にグリコシル化される形態
のＦｌｔ4蛋白質を示す可能性がある。
【０１３１】 実施例４ ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＦｌｔ４の発現 全長のＦｌｔ４ｃＤＮＡ（短鎖型）を、モロニーマウス白血病ウイルス長鎖末
端反復プロモーターを含有するＬＴＲｐｏｌｙベクター（ATCC受託番号77109お
よびGeneBank受託番号X60280を有する、プラスミドベクターｐＬＴＲｐｏｌｙを
開示しているＬＴＲｐｏｌｙベクター（Makela et al., Gene, 118: 293-294(19
92)を参照）にサブクローニングした。ＮＩＨ３Ｔ３細胞に同時トランスフェク
トするためにこのＬＴＲ−Ｆｌｔ４発現ベクターをｐＳＶ２ｎｅｏマーカープラ
スミドと共に使用し、Ｇ４１８耐性クローンをＦｌｔ４発現について分析した。
【０１３２】 ウェスタン免疫ブロット分析は、１つの集密化した大型平板培地の細胞を２．
５％ＳＤＳ、１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．５で溶解した。細胞溶解物をＳＤ
Ｓ−ｐａｇｅで電気泳動し、ニトロセルロース膜にエレクトロブロットした。膜
を、Ｆｌｔ４カルボキシ末端ペプチドに対して形成された抗血清と共にインキュ
ベーションし、結合した抗体をワサビペルオキシダーゼ結合ブタ抗−ウサギ抗血
清（Dako）およびＥＣＬ試薬（Amersham）を使用して可視化した。代謝標識化は
、培養物を１００μＣｉ／ｍｌ３５Ｓ−メチオニンで１時間標識した。標識後、
細胞を２回洗浄し、増殖培地中で１または２時間インキュベーションし、溶解し
、抗−Ｆｌｔ４抗体で免疫沈降し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、オートラジオグ
ラフィーを実施した。
【０１３３】 結果 １７０および１９０ＫＤポリペプチドはＦｌｔ４短鎖型をトランスフェクトし
たＮＩＨ３Ｔ３細胞では検出できたが、ｐＳＶ２ｎｅｏだけをトランスフェクト
した細胞では検出できなかった。これら２つのバンド以外に、約１２０Ｋｄの主
要なバンドがＦｌｔ４産生クローンで観察された。代謝標識およびパルス−チェ
イス実験は、この蛋白質は、短鎖型Ｆｌｔ４ポリペプチドの翻訳後処理の結果と
して産生されることを示した。
【０１３４】 実施例５ Ｆｌｔ４クローンの染色体マッピング クラスＩＩＩ受容体遺伝子のいくつかの集合化が観察されたので、Ｆｌｔ４の
染色体局在化を求めることは非常に興味深い。従って、げっ歯類−ヒト細胞ハイ
ブリッドを分析し、ヒト染色体５へのＦｌｔ４の結合を示している。
【０１３５】 染色体５ｓの一部を保有するハイブリッドを使用して、領域５ｑ３３−＞５ｑ
ｔｅｒ内のＦｌｔ４遺伝子の局在化を求めた。これらのハイブリッドは、フィル
ターハイブリダイゼーションによってＦｌｔ４遺伝子座の存在について試験した
。Ｆｌｔ４−陽性ハイブリッドに共通で、Ｆｌｔ４−陰性ハイブリッドに欠損し
ている染色体５領域は５ｑ３３．１−ｑｔｅｒであった。従って、ハイブリッド
のヒト染色体５ｑ３３−ｑｔｅｒの存在はＦｌｔ４配列の存在と関連している。
局所的マッピングの結果は、Ｆｌｔ４遺伝子座はＣＳＲＩＲ／血小板誘導増殖因
子受容体−β（ＰＤＧＦＲＥ）遺伝子座およびβ−アドレナリン作動性受容体（
ＡＤＲＢＲ）遺伝子座のテロメアであり、その理由はこれらの遺伝子座は全て、
Ｆｌｔ４が陰性であるハイブリッドＧＢ１３中に存在するからであることを示し
た。
【０１３６】 実施例６ 腫瘍細胞系統および内皮細胞におけるＦｌｔ４ｍＲＮＡの発現 この検討に使用した白血病細胞系統（K562）はいくつかの以前の報告に報告さ
れている；[Lozzio et al., Blood, 45: 321-334(1975)]。ＨＬ−６０[Collins
et al., Nature, 270: 347-349(1977)]、ＨＥＬ[Martin et al, Science, 216:
1233-1235(1982)]、ＤＡＭＩ[Greenberg et al., Blood, 72: 1968-1977(1988)]
、ＭＯＬＴ−４[Minowada et al., J. Natl, Cancer Inst. 49: 891-895(1972)]
、ジャーカット [Schwenk et al., Blut. 31: 299-306(1975)] 、Ｕ９３７[Sun
dstom et al., Int. J. Cancer, 17: 565-577(1976)]、ＫＧ−１[Kieffler et a
l., Science, 200: 1153-1154(1978)]、ＪＯＫ−１[Andersson et al, 1982, in
R. F. Revoltekka(ed.), Expression of Differentiated Functions in Cancer
Cells, 239-245, Raven Press, New York]およびＭＬ−２[Gahrnberg et al.,1
985, in L. C. Anderson, et al(ed.), Gene Ezpression During Normal and Ma
lignant Differentiation, 107-123, Academic Press, London]。American Type
Culture Collectionから入手した以下の腫瘍細胞系統も分析した：ＪＥＧ−３
、絨毛癌；Ａ２０４、横紋筋肉腫；ＳＫ−ＮＥＰ−１，腎芽細胞腫；ＢＴ−４７
４、乳癌；Ｙ７９、網膜芽腫。白血病細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）お
よび抗体を含有するＲＰＭＩ中で増殖した。Dami細胞は１０％ウマ血清を加えた
Iscoveの改良ＤＭＥＭで培養した。第一継代ヒト臍静脈内皮細胞にＡ５４９肺癌
細胞を融合することによって得られた永久ハイブリッド内皮細胞系統（EAhy926
）[Edgell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 50: 3734-3737(1983)]を、１
０％ＦＣＳおよび抗体を含有するＤＭＥＭ−ＨＡＴ培地で培養した。
【０１３７】 記載されているように[Sambrook et al.,上記参照]、細胞系統からポリ（Ａ） − ＲＮＡを抽出した。５μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡ試料を、ホルムアルデヒドを
含有するアガロールゲルで電気泳動し、標準的な条件を使用してブロットした[S
ambrook et al.,上記参照]。Ｆｌｔ４ｃＤＮＡクローンの挿入物をランダムプラ
イミング方法によって標識し、ブロットにハイブリダイゼーションした。ハイブ
リダイゼーションは、５０％ホルムアルデヒド、５×デンハルト溶液（100×デ
ンハルト溶液は、各々2%のフィコール、ポリビニルピロリドンおよびウシ血清ア
ルブミンである）、５×ＳＳＰＥ（3M NaCl、200 mM NaH2PO4-H2O、20 mM EDTA
、pH 7.0）、０.１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）および０．１ｍｇ／ｍ
ｌの超音波処理したサケ精子ＤＮＡ中で４２℃において１８〜２４時間実施した
。フィルターは６５℃において１×ＳＳＣ（150 mM NaCl，15 mM、クエン酸ナト
リウム15 mM、pH 7.0）、０．１％ＳＤＳで洗浄し、Kodak ＸＡＲ−５フィルム
に露出した。
【０１３８】 ノーザン分析は、８種の白血病細胞系統（HEL、K562、DAMI、U937、MOLT4、HL
60、ジャーカットおよびKG-1）および内皮ハイブリッド細胞系統（EAhy926）か
ら抽出したポリ（Ａ）＋ＲＮＡを用いて実施した。ＧＡＰＤＨプローブを用いた
ハイブリダイゼーションを、分析に均一な量のＲＮＡを負荷するための内部対照
として使用した。ＨＥＬ赤白血病細胞およびＤＡＭＩ骨髄巨核芽球白血病細胞だ
けが５．８ｋｂおよび４．５ｋｂのＦｌｔ４ｍＲＮＡを発現した。Ｋ５６２赤白
血病、ジャーカットおよびＭＯＬＴ−４細胞白血病、並びにＨＬ−６０前骨髄細
胞白血病、Ｕ９３７単球性白血病およびＫＧ−１骨髄性白血病細胞はＦｌｔ４ｍ
ＲＮＡが陰性であった。
【０１３９】 ノーザン分析は５種の腫瘍細胞系統（JEG-3、A-204、SK-NEP-1、BT-474および
Y79）および上記白血病細胞系統のうちの２種（JOK-1、MOLT-4）から抽出したポ
リ（Ａ）＋ＲＮＡを用いて実施した。標識したＳ２．５ｃＤＮＡクローン（図1
参照）はハイブリダイゼーションプローブとして使用した。β−アクチンプロー
ブを用いたハイブリダイゼーションを、分析に均一な量のＲＮＡを負荷するため
の内部対照として使用した。ＳＫ−ＮＥＰ−１腎芽細胞腫およびＹ７９網膜芽腫
細胞だけがＦｌｔ４転写物を含有することが観察された。
【０１４０】 Ｔｅｒａ−２−奇形癌細胞は、ニューロン分化を誘発するために、基剤（−）
またはレチノイン酸（＋）で１０日間処理した後に分析した[Thompson et al.,
J. Cell Sci., 72: 37-64(1984)]。細胞から単離したポリ（Ａ）＋ＲＮＡのノー
ザンブロット分析では、未分化の細胞は５．８ｋｂおよび４．７ｋｂのＦｌｔ４
のｍＲＮＡを発現したが、１０日の分化後では、Ｆｌｔ４ｍＲＮＡはノーザンブ
ロットおよびハイブリダイゼーションでは検出できなかったことが見出された。
これらの結果は、Ｆｌｔ４はこれらの細胞の分化中にダウンレギュレーションさ
れたことを示している。
【０１４１】 Ｆｌｔ４ｍＲＮＡ発現も未分化およびＴＰＡ−分化ＨＥＬ細胞中で分析した。
ＨＥＬおよびＤＡＭＩ細胞系統は共に赤血球系／骨髄巨核芽球二重表現型を保有
し、腫瘍プロモーター１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテー
ト（ＴＰＡ）による処理によって骨髄巨核芽球マーカーのさらなる発現を誘発す
ることができる。本発明者らは、Ｆｌｔ４の発現が分化中にこれらの細胞におい
て刺激されるかどうかを分析した。ＨＥＬ細胞は、ＴＰＡまたはそれを溶解する
ために使用したＤＭＳＯで処理した２日後に分析した。Ｆｌｔ４シグナルを帯状
化後、レーンの均一な負荷を確認するためにフィルターにＲｂ−１およびβ−ア
クチンｃＤＮＡｓをプローブ化した。オートラジオグラフのデンシトメトリー走
査分析およびＧＡＰＤＨ遺伝子の構成的発現に対する正規化に基づいて、Ｆｌｔ
４ｍＲＮＡレベルは、細胞が骨髄巨核芽球分化を受けた場合にはＴＰＡ−誘導化
ＨＥＬ細胞では約３．４倍増加したことが求められた。
【０１４２】 実施例７ 胎児肺におけるＦｌｔ４の発現 インサイチューハイブリダイゼーション：１５週齢のヒト胎児の肺組織をUniv
ersity Central Hospitalおよびthe University of Turku, Finlandの合同倫理
委員会の許可を得て入手した。試料を４℃において１０％ホルマリンに１８時間
固定し、脱水し、ワックスに包埋し、６μｍの切片に切断した。ＳＰ６およびＴ
７ポリメラーゼ並びに[３５Ｓ]−ＵＴＰを使用して直線化したプラスミドから２
０６および１５７塩基（アンチセンスおよびセンス）のＲＮＡプローブを作製し
た。切片のインサイチューハイブリダイゼーションは、以下の改良を加えて、Wi
lkinson et al., Development, 99: 493-500(1987); Wilkinson, Cell. 50: 79-
88(1987)により実施した：１）トルエンの代わりに、パラフィンワックスに包埋
する前にキシレンを使用した；２）６μｍの切片を切断し、２％３−アミノプロ
ピル−トリエトキシシラン（Sigma）で前処理したガラススライドの表面のジエ
チルピロカルボネート処理した水の層の上に配置した、３）プローブのアルカリ
性加水分解を省いた、４）ハイブリダイゼーション混合物は６０％のホルムアミ
ド脱イオン水液を含有した；５）高度の緊縮条件は５０ｍＭＤＴＴおよび１×Ｓ
ＣＣを含有する溶液中で６５℃において８０分間とした；６）切片はＮＴＢ−２
エマルジョン（Kodak）をカバーし、４℃において保存した。１４日間の露出時
間後、スライドをKodak D-19現像液で２．５分間現像し、Unifix(Kodak)で５分
間固定した。切片はヘマトキシリン水溶液で染色した。
【０１４３】 アンチセンスプローブを使用したハイブリダイゼーション検討では、Ｆｌｔ４
ｍＲＮＡは１５週齢の胎児のある種の内皮細胞中に主に観察された。センス鎖プ
ローブおよびＲＮＡａｓｅ Ａ処理切片を用いた対照ハイブリダイゼーションは
バックグラウンド以上の信号を生じなかった。
【０１４４】 免疫ペルオキシダーゼ染色法は、１００倍希釈の抗−Ｆｌｔ４抗体、ペルオキシ
ダーゼ結合ブタ抗−ウサギ抗体および当技術上標準的な方法を使用した。免疫形
成前血清または免疫源遮断血清の対照染色は信号を生じなかった。１７週齢のヒ
ト胎児の肺組織を分析し、結果は、ｍＲＮＡインサイチューハイブリダイゼーシ
ョン実験の結果と一致しており、肺のある種の大血管の内皮細胞はウサギ抗−Ｆ
ｌｔ４抗血清で陽性に染色された。
【０１４５】 実施例８ ヒト以外の哺乳類種におけるＦｌｔ４遺伝子の同定 図４には、異なる種のＤＮＡ中のＦｌｔ４配列の存在を検討した実験の結果を
示す。Ｆｌｔ４遺伝子が進化によりどの程度保存されるかを明らかにするために
、２．５ｋｂのｃＤＮＡ断片（図1参照）を異なる動物および酵母から精製した
ゲノムＤＮＡｓにハイブリダイゼーションし、ＥｃｏＲＩで消化した。ハイブリ
ダイゼーション溶液は５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液（100×デンハ
ルト溶液は、各々2%のフィコール、ポリビニルピロリドンおよびウシ血清アルブ
ミンである）、５×生理食塩液−リン酸ナトリウム−ＥＤＴＡ（3M NaCl，200mM
NaH2PO4-H2O、20 mM EDTA、pH 7.0）、０．１％ドデシル硫酸ナトリウムおよび
０．１ｍｇ／ｍｌの超音波処理したサケ精子ＤＮＡを含んだ。ハイブリダイゼー
ションは、４２℃において２４時間実施した。フィルターは６５℃において１×
標準的な生理食塩液クエン酸塩（150 mM NaCl、15 mM クエン酸ナトリウム、pH
7.0）および０．１％ドデシル硫酸ナトリウム中で洗浄し、Kodak XAR-5フィルム
に露出した。特定のバンドはサル、ラット、マウス、イヌ、ウシ、ウサギおよび
ニワトリＤＮＡｓ中に見出されたが、酵母ＤＮＡは信号を生じなかった。Ｆｌｔ
４ｃＤＮＡはウズラから単離されている。Eichmann et al., Gene, 174(1):3-8(
1996年9月26日)およびGenebank 受託番号Ｘ８３２８７を参照。
【０１４６】 実施例９ 成人組織中のＦｌｔ４遺伝子の発現 成人組織中のＦｌｔ４ｍＲＮＡの発現は、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋
、腎臓および膵臓組織のポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（Multiple Tissue Northern Blot,
Clontech Inc.）を使用して、Ｆｌｔ４ｃＤＮＡプローブを用いたハイブリダイ
ゼーションによって分析した。構成的に発現される遺伝子のプローブを用いた対
照ハイブリダイゼーションはレーンの均一な負荷を示した。
【０１４７】 Ｆｌｔ４ｃＤＮＡ断片を用いた種々のヒト組織のポリ（Ａ）＋ＲＮＡのハイブ
リダイゼーションは、胎盤、肺、心臓および腎臓に５．８および４．５ｋｂの移
動度のｍＲＮＡバンドと６．２ｋｂの弱く標識されたバンドを示した。弱いｍＲ
ＮＡバンドが肝臓および骨格筋に見られたが、胎盤および脳は、含有されたとし
ても非常にわずかなＦｌｔ４ＲＮＡしか含有しないと思われる。
【０１４８】 実施例１０ ヒト胎児組織におけるＦｌｔ４の発現 ヒト胎児組織におけるＦｌｔ４ｍＲＮＡの発現を検討するために、１６〜１９
週のヒト胎児の以下に掲載する組織の総ＲＮＡを含有するノーザンブロットに１
．９ｋｂのＦｌｔ４ｃＤＮＡ断片をハイブリダイゼーションし（図1参照）、得
られたオートラジオグラフをデンシトメトリーで走査した。結果は、対応する臭
化エチジウム（EtBr）染色ゲルのＵＶ像から推定されるＲＮＡ量について正規化
した。以下の記号は増える順にｍＲＮＡのレベルを示す：−、＋、＋＋、＋＋＋
。
【０１４９】 表１ 胎児組織 ｍＲＮＡ 脳 髄膜 ＋ 皮質板 ＋＋ 中間帯 ＋＋＋ 上衣帯 ＋ 小脳 ＋＋ 脈絡叢 ＋ 肝臓 ＋ 胎盤 ＋ 小腸 − 心臓 ＋ 肺 ＋＋＋ 腎臓 ＋＋ 副腎 ＋＋ 皮膚 ＋＋ 脾臓 ＋＋＋ 胸腺 −
【０１５０】 ヒト胎児組織の分析は、胸腺および小腸を除いた全てがＦｌｔ４転写物を含有
することを示した。最も高い発現レベルは肺および脾臓で見られた。
【０１５１】 実施例１１ Ｆｌｔ４発現ベクター 全長のＦｌｔ４ｃＤＮＡ（短鎖型）は、１）５２．５ｋｂの断片の５’側末端
に[プライマーオリゴヌクレオチド5'-ACATGCATGC CACCATGCAG CGGGGCGCCG CGCTG
TGCCT GCGACTGTGG CTCTGCCTGG GACTCCTGGA-3'（配列番号：7）（順方向）および
5'-ACATGCATGC CCCGCCGGT CATCC-3'（逆方向）（配列番号：8）を使用してＳ２
．５ｋｂのクローン（図1参照）から増幅した]ＳｐｈＩ−切断Ｆｌｔ４ＰＣＲ断
片をライゲーションし、２箇所のＳｐｈＩ部位を使用して、ｐＳＰ７３ベクター
（Promega）にサブクローニングし、ｂ）オリゴヌクレオチドプライマー5'-CGGA
ATTCCC CATGACCCCAAC-3'(配列番号：9)（順方向）および5'-CCATCGATGG ATCCTAC
CTG AAGCCGCTTT CTT-3'(配列番号：１０（逆方向）を用いて０．６ｋｂのＥｃｏ
ＲＩ断片（図1参照）から増幅した末端の１３８ｂｐｓを含有するＰＣＲ断片を
、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位を使用して、構築物ａ)の３’側末端にライ
ゲーションし、ｃ）構築物ｂ）のＥｃｏＲＩ部位に１．２ｋｂのＥｃｏＲＩ断片
をライゲーションし、ｄ）得られた全長のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をＨ
ｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ切断ＳＶ−ポリ発現ベクターにライゲーションするこ
とによって作製した[Stacy et al., Nucl. Acids Res., 18: 2829(1990)]。
【０１５２】 実施例１２ Ｆｌｔ４リガンドの同定 ウシ胎仔血清（ＰＢＳ）の不在下においてＦ１２培地で７日間培養したＰＣ
−３前立腺腺癌細胞系統の調整培地を１６０００×ｇで２０分間遠心分離して除
去して、Ｆｌｔ４のチロシンリン酸化を誘導する能力についてスクリーニングし
た。
【０１５３】 組換えによりＦｌｔ４を発現するＮＩＨ３Ｔ３−細胞（実施例１３を参照）を
直径５ｃｍの細胞培養皿に再度接種し、１０％ウシ胎仔血清および抗体を含有す
るダルベッコの改良最小必須培地（ＤＭＥＭ）で集密化するまで増殖させた。集
密化した細胞をリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、ＤＭＥＭＥ／２
％ウシ血清アルブミン中で終夜飢餓化した。刺激は、飢餓培地を１ｍｌの調整培
地と交換し、細胞を３７℃において５分間インキュベーションした。
【０１５４】 ＰＣ−３調整培地での刺激後、細胞を含有する培養平板培地を氷上に置き、１
００ｍＭＮａＶＯ４を含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ ｍＭＮ
ａＣｌで２回洗浄した。洗浄液を培養皿から除去し、細胞を、アプロチニン、１
ｍM ＰＭＳＦおよび１ｍMＮａＶＯ４を含有するＲＩＰＡ緩衝液[10 mM Tris-HC
l pH 7.5、50 mM NaCl、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、0.5% Norrider P40
、0.1% ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）]で溶解し、溶解物を１０秒間、２回超
音波処理した。次いで、溶解物を１６，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清
を新しい管に移し、免疫沈降に使用した。
【０１５５】 Ｆｌｔ４Ｃ−末端に対するポリクローナル抗体（上記）を免疫沈降に使用した
。細胞溶解物の上清を２〜４μｌのウサギポリクローナル抗−Ｆｌｔ４抗血清と
共に氷上で２時間インキュベーションした。プロテインＡ−セファロース（Phar
macia）の約３０μｌの５０％（vol/vol）ＰＢＳ溶液を添加し、＋４℃において
回転させながら４５分間インキュベーションを継続した。免疫沈降物をＲＩＰＡ
緩衝液で３回洗浄し、ＰＢＳで１回洗浄した。
【０１５６】 次いで、免疫沈降物に７．５％ゲルでＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を実施し、ニトロセルロースにブロットした。これらの
ウェスタンブロットをモノクローナル抗−ホスホチロシン（抗-P-Tyr）抗体（20
00倍希釈のPT-66 Sigma、カタログ番号P-3300）と共にインキュベーションし、
次に化学発光検出システム（Amersham）を使用してペルオキシダーゼ結合ウサギ
抗−マウス抗体（1000倍希釈、Dako、カタログ番号P-161）で検出した。ブロッ
トを帯状化し、時折撹拌しながら、１００ｍＭ２−メルカプトエタノール、２％
ＳＤＳ、６２．５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ６．７中で５０℃において３０分間
以前の信号を除去し、抗−Ｆｌｔ４抗体（1000倍希釈）で再度染色し、次にペル
オキシダーゼ−結合ブタ抗−ウサギ抗体（1000倍希釈、Dako、P217）で染色した
。Ｆｌｔ４のチロシンリン酸化の陽性対照として、１００ｍＭのチロシルホスフ
ァターゼ阻害剤過バナジン酸ナトリウム（PerVO4）で２０分間処理したＦｌｔ４
発現ＮＩＨ３Ｔ３細胞の抗−Ｆｌｔ４免疫沈降物を使用した。過バナジン酸ナト
リウムナトリウムによる細胞の処理は、１００ｍＭ（最終濃度）のオルトバナジ
ン酸ナトリウムおよび２ｍＭ（最終濃度）の過酸化水素を細胞培地に添加し、３
７℃において５％ＣＯ２雰囲気下で２０分間細胞をインキュベーションすること
によって実施した。その手法によって、生細胞中の蛋白質チロシンホスファター
ゼの非常に強力な阻害剤であるバナジン酸の過酸化型（バナジルヒドロペルオキ
シド）が形成された。
【０１５７】 ＰＣ−３細胞調整培地は、Ｆｌｔ４のチロシンリン酸化処理された成熟型と共
に同時移動した１２０ｋＤのポリペプチドのチロシンリン酸化を刺激した。同時
移動は、抗−Ｆｌｔ４抗体でブロットを再度染色することにより確認した。
【０１５８】 １２０ｋＤのポリペプチドが調整培地の非特定成分でないことを証明するため
に、１５ｍｌの調整培地をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースにブロ
ットし、ブロットを抗−Ｐ−Ｔｙｒ抗体で染色した。いくつかのポリペプチドが
検出されたが、それらのどれもＦｌｔ４と同時移動しなかった。これは、１２０
ｋＤバンドが実際に刺激された細胞から免疫沈降されたチロシン−リン酸化蛋白
質であることを示している。室温において２時間ヘパリンセファロースＣＬ−６
Ｂ（Pharmacia）で前処理したＰＣ−３調整培地による刺激の分析は（レーン3）
、Ｆｌｔ４リガンドはヘパリンに結合しないことを示している。
【０１５９】 未張性培地はＦｌｔ４自己リン酸化を誘導しなかった。また、非トランスフェ
クトＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＦＧＦＲ−４をトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３
細胞はどちらもＰＣ−３細胞の調整培地による刺激の結果、１２０ｋＤのポリペ
プチドのチロシンリン酸化を示さなかった。ＰＣ−３調整培地をＣｅｎｔｒｉｃ
ｏｎ−１０濃縮剤（Amicon）を使用して４倍に濃縮した場合、刺激作用はかなり
増加した。また、分子量１０，０００未満（<10,000）の蛋白質を含有する、濃
縮後に得られたフロースルーはＦｌｔ４のリン酸化を刺激しなかった。製造業者
の指示により、ＣＮＢｒ−活性化セファロース（1 mg/ml）に結合したＦｌｔ４
細胞外ドメイン（Flt4EC-6XHis、以下参照）５０ｍｌを用いたＰＣ−３細胞の濃
縮した調整培地の前処理はＦｌｔ４のチロシンリン酸化を完全に消失させた。セ
ファロースＣＬ−４Ｂを用いた調整培地の同様の前処理は刺激作用に影響を与え
なかった。
【０１６０】 これらのデータは、ＰＣ−３細胞はＦｌｔ４の可溶性リガンドを生ずることを
証明している。上記の実験は、リガンドは組換えＦｌｔ４ＥＣドメインに結合す
ることを証明している。従って、そのリガンドは、アフィニティークロマトグラ
フィーにおいてＦｌｔ４ＥＣドメインを使用して精製することができる。精製し
た蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、二フッ化ポリビニリデン（PVDF）膜
にブロットし、そのアミノ末端配列を当技術上標準的な方法によって決定するこ
とができる。または、アミノ末端配列決定のために精製したリガンドをペプチド
まで消化してもよい。精製した蛋白質から得られたペプチド配列を、このような
配列をコードするオリゴヌクレオチドの混合物を合成するために使用する。当技
術上標準的な方法によって（Wen et al., Cell 69: 559-572(1992)）、このよう
なオリゴヌクレオチドおよびそれらの相補的なＤＮＡ鎖相対物を放射性標識し、
リガンドをコードするｃＤＮＡを得るためにＰＣ−３細胞から作製したｃＤＮＡ
ライブラリーのスクリーニングに使用することができる。または、このようなオ
リゴヌクレオチドおよびそれらの相対物を、鋳型としてＰＣ−３細胞ＲＮＡから
作製したｃＤＮＡを使用して、リガンドをコードする配列を増幅するためのポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして使用することができる。このよ
うなｃＤＮＡ合成方法およびＰＣＲ（RT-PCR）は当技術上標準的である（Innis
et al., 1990, PCR protocols, Academic Press; McPherson, M. J. et al., 19
91, PCR, a practical approach, IRL Press; Partanen et al.,Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA. 87: 8913-8917(1990)）。よりさらなる別法は、真核発現ベクタ
ーにクローニングしたｃＤＮＡｓを使用して（例えば、Invitrogen Librarianク
ローニングキットおよびpcDNAまたはpcDNA IIIなどの提供されているベクターを
使用する）ＰＣ−３細胞のＦｌｔ４リガンドをクローニングし、例えばＣＯＳ細
胞にトランスフェクトしたこのようなライブラリーをＦｌｔ４−アルカル性ホス
ファターゼ（Cheng and Flanagan, Cell, 79: 158-168,(1994)）、Ｆｌｔ４−免
疫グロブリン（Flt4-Ig）（Lyman et al., Cell, 75; 1157-1167(1993)）、また
は同様の親和性試薬を用いて当技術上標準的な方法によってスクリーニングする
ことである。
【０１６１】 実施例１３ 細胞系統およびトランスフェクション ＮＩＨ３Ｔ３細胞および２９３−ＥＢＮＡ細胞（Invitrogen）を１０％ＦＣＳ
を含有するＤＭＥＭで培養した。安定な発現のために、ＤＯＴＡＰトランスフェ
クション試薬（Boehringer-Mannheim）を使用してリポフェクション方法によっ
て、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に、Ｆｌｔ４ｃＤＮＡがモロニーマウス白血病ウィルスＬ
ＴＲプロモーターのコントール下で発現されるＬＴＲ−ＦＬＴ４ｌベクターおよ
びｐＳＶ−ｎｅｏベクターをトランスフェクトした（上記実施例4参照）。ＣＯ
Ｓ−１細胞はＤＥＡＥデキストラン方法によってトランスフェクトした（McClut
chan and Pagano, J. Natl. Cancer Inst., 41: 351-35(1968) ）。トランスフ
ェクトした細胞は５００ｍｇ／ｍｌネオマイシン中で選択した。
【０１６２】 実施例１４ Ｆｌｔ４融合蛋白質の構築および発現 ｐＶＴＢａｃ−ＦＬＴ４ＥＣ−６ｘＨｉｓ融合構築物。Ｆｌｔ４コードするｃ
ＤＮＡの末端は以下のように改変した：細胞外ドメイン（ＥＣ）をコードするＦ
ｌｔ４ｃＤＮＡ配列の３’側末端を、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Qiagen, Hilden, Ge
rmany）に結合するための６つのヒスチジン残基をコードする、オリゴヌクレオ
チド5'-CTGGAGTCGACTTGGCGGACT-3'（配列番号：13、下線はSalI部位、配列番号
：1のヌクレオチド2184〜2204に相当する配列を含有する）および5'-CGCGGATCCC
TAGTGATGGTGATGGTGATGTCTACCTTCGATCATGCTGCCCTTATCCTC-3'（配列番号：14、下
線はBamHI部位、配列番号：1のヌクレオチド2341〜2324に相当する配列を含む）
およびその次の停止コドンを使用して増幅した。増幅した断片はＳａｌＩおよび
ＢａｍＨＩで消化し、ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片としてＬＴＲ−ＦＬＴ４ｌベク
ター内にライゲーションし（実施例4参照）、Ｆｌｔ４膜貫通ドメインおよび細
胞質ドメインをコードする配列を含有する独自のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片に交
換した。
【０１６３】 Ｆｌｔ４シグナル配列コード領域を含有しないＦｌｔ４ｃＤＮＡの５’側末端
は、オリゴヌクレオチド5'-CCCAAGCTTGGATCCAAGTGGCTACTCCATGACC-3'（配列番号
：11、下線はHindIIIおよびBamHI部位、配列番号：1のヌクレオチド86〜103に相
当する配列を含有する）および5'-GTTGCCTGTGATGTGCACCA-3'（配列番号：12、配
列番号：1のヌクレオチド700〜681に相補的な配列を含有する）を使用してＰＣ
Ｒによって増幅した。この増幅した断片（配列番号：1のヌクレオチド86〜700を
含んだ）をＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩで消化した（ＳｐｈＩ部位、配列番号：
1のヌクレオチド588〜593に相当する、Ｆｌｔ４ｃＤＮＡの増幅した領域内にあ
る）。
【０１６４】 得られたＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｈＩ断片を使用して、すぐ上に上記した改変Ｌ
ＴＲ−ＦＬＴ４ｌベクターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｈＩ断片に交換した（HindII
I部位はFlt4挿入物とベクターのpLTRpoly部分の5'側結合部であり、SphI部位はF
lt4cDNA内にあり、配列番号：1のヌクレオチド588〜593に相当する）。次いで、
得られたＦｌｔ４ＥＣ−６ＸＨｉｓ挿入物をｐＶＴＢａｃプラスミドのＢａｍＨ
Ｉ部位のＢａｍＨＩ断片としてライゲーションした（Tessier et al., Gene 98:
177-183(1991)）。構築物をバキュロウィルスゲノムＤＮＡと共にリポフェクシ
ョンによってＳＦ−９細胞にトランスフェクトした。組換えウィルスを作製し、
Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞（Invitrogen）の感染に使用した。
【０１６５】 Ｆｌｔ４−ＡＰ融合構築物。Ｆｌｔ４ＥＣドメインをコードする配列の３’側
末端を、オリゴヌクレオチド5'CTGGAGTCGACTTGGCGGACT-3'（配列番号：15）およ
び5'-CGGGATCCCTCCATGCTGCCCTTATCCT-3'（配列番号：16）を使用して増幅し、Ｌ
ＴＲ−Ｆｌｔ４ｌベクターにＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片としてライゲーションし
、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする配列と交換した。次いで、
得られた挿入物を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片として、アルカル性ホスフ
ァターゼコード領域内のプラスミドＡＰｔａｇ−１のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩ
Ｉ部位にライゲーションした（Flanagan and Leder, 1990, Cell 63: 185-194）
。ＮＩＨ３Ｔ３細胞にＦｌｔ４−ＡＰ構築物およびｐＳＶｎｅｏ（Southern and
Berg., J. Mol. Appl. Genet. 1: 327-341(1982)）と共にＤＯＴＡＰトランス
フェクション試薬（Boehringer）を使用してリポフェクションによって同時トラ
ンスフェクトし、トランスフェクトした細胞を５００ｍｇ／ｍｌネオマイシンの
存在下で選択した。培地中に産生された組換え蛋白質は、アルカル性ホスファタ
ーゼ活性の染色について発色反応によって検出した（Cheng and Flangan, Cell
79: 157-168(1994)）。
【０１６６】 Ｆｌｔ４−Ｉｇ構築物。Ｆｌｔ４−免疫グロブリンキメラをコードする組換え
ＤＮＡは以下のように構築した：シグナル配列をコードするＦｌｔ４ヌクレオチ
ドを含むＦｌｔ４をコードするｃＤＮＡの５’側末端を、プライマー5'-GGCAAGC
TTGAATTCGCCACCATGCAGCGGGGCGCC-3'（配列番号：17）および5'-GTTGCCTGTGATGTG
CACCA-3'（配列番号：18）を使用してＰＣＲによって増幅し、ＨｉｎｄＩＩＩ−
ＳｐｈＩ断片としてＬＴＲ−ＦＬＴ４ｌベクターにライゲーションした。Ｆｌｔ
４ＥＣコード配列の３’側末端をオリゴヌクレオチド5'-CTGGAGTCGACTTGGCGGACT
-3'（配列番号：19）および5'-CGCGGATCCAAGCTTACTTACCTTCCATGCTGCCCTTATCCTCG
-3'（配列番号：20）を使用して増幅し、ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片としてＬＴ
Ｒ−ＦＬＴ４ｌベクターにライゲーションして、膜貫通ドメインおよび細胞質ド
メインをコードする配列と交換した。スプライスドナー部位を含有するこのＦｌ
ｔ４ＥＣ挿入物を、まずヒト免疫グロブリン重鎖ヒンジおよび不変領域エクソン
をコードするエクソンを含有するｐＨγＣＥ２にライゲーションした（Karjalai
nen, K., TIBTECH, 9: 109-113(1991)）。Ｆｌｔ４−Ｉｇキメラを含有するＥｃ
ｏＲＩ−ＢａｍＨＩ挿入物を当技術上標準的な方法によってブロットし（Klenov
）、ｐＲＥＰ７（Invitrogen）のブロットしたＨｉｎｄＩＩＩ部位にライゲーシ
ョンした。リン酸カルシウム沈降方法によって構築物を２９３−ＥＢＮＡ細胞に
トランスフェクトし、調整培地をプロテインＡ−セファロースアフィニティーク
ロマトグラフィーによるＦｌｔ４−Ｉｇ蛋白質の単離のために使用した。
【０１６７】 実施例１５〜１７ Ｆｌｔ４リガンドの精製および配列決定 血清欠損条件下下でＰＣ−３細胞によって産生された細胞培養上清をCetripre
pフィルターカートリッジを使用して３０〜５０倍に濃縮し、固定したＦｌｔ４
細胞質ドメインのカラムに負荷する。別の構築物および方法を使用して２つの親
和性基質を調製する。第一の場合では、Ｆｌｔ４ＥＣ−６ｘＨｉｓ融合蛋白質を
ＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂ（Pharmacia）に架橋し、第二の場合では、
Ｆｌｔ４−Ｉｇ融合蛋白質をプロテインＡ−セファロースにジメチルピメリジン
（Schneider et al., 1982, J. Biol. Chem., 257: 10766-10869）。アフィニテ
ィーカラムから溶出した物質をイオン交換および逆相高速液体クロマトグラフィ
ーおよびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用してさらに精製する。
クロマトグラフィー分画は、Ｆｌｔ４のチロシンリン酸化を刺激する能力につい
て試験する。精製した生物学的に活性なリガンド蛋白質を微小配列決定し、リガ
ンドをコードするｃＤＮＡを単離し、クローニングする目的のために、例えば、
ＰＣ−３細胞から単離したポリ（Ａ）−ＲＮＡから作製されるｃＤＮＡライブラ
リーから、得られたアミノ酸配列に基づいて、変性オリゴヌクレオチドを作製す
る。
【０１６８】 血管内皮増殖因子Ｃ（VEGF-C）と命名されるＦｌｔ４リガンドの詳細な特徴並
びに、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｃ変種および類似物をコードする未変性の
ヒト、ヒト以外の哺乳類および鳥類のポリヌクレオチド配列は、その全てが全体
の内容が参照として組み入れられている１９９８年２月に提出された国際特許出
願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／０１９７３号（国際公開公報第98/33917号として1998
年8月06日に公開）；Joukov et al., J. Biol. Chem., 273: 6599-6602(1998)；
Joukov et al.,EMBO J., 16(13): 3898-3911(1992)および１９９６年８月１日に
提出された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＦＩ９６／００４２７号（国際公開公報第
97/05250号として公開）に提供されている。そこに詳細に説明されているように
、ヒトＶＥＧＦ−Ｃは最初、４１９アミノ酸のプレプロ−ＶＥＧＦ−Ｃポリペプ
チドとしてヒト細胞中で産生される。ヒトプレプロ−ＶＥＧＦ−Ｃのアミノ酸配
列は配列番号２１に記載されており、ヒトＶＥＧＦ−ＣをコードするｃＤＮＡは
、ブタペスト条約の規定に従って、American Type Culture Collection(ATCC)、
１０８０１University Blvd. Manasses, VA 20110-2209(USA)に寄託されている
（寄託日、1995年7月24日、受託番号97231）。他の種のＶＥＧＦ−Ｃ配列も報告
されている。例えば、参照として本明細書に組み入れられているGenbank Access
ion Nos. MMU73620(Mus musculus)およびCCY15837(Cotunix cotunix)
【０１６９】 プレプロ−ＶＥＧＦ−Ｃは多段階で処理されて、約２１〜２３ｋＤｎｏ成熟し
た、最も活性なＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドを産生する（還元条件下でＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによって評価したとき）。このような処理には、シグナルペプチドの切断
（配列番号：21、残基1-31）；約２９ｋＤの部分的に処理された形態を作製する
ための、カルボキシル−末端ペプチドの切断（配列番号：21のアミノ酸228-419
にほぼ相当し、Balbiani環3蛋白質（BR3P）配列を回想する間隔をおいたシステ
イン残基パターンを有する[Dignam et al., Gene, 88:: 133-40(1990); Paulsso
n et al., J. Mol. Biol., 211: 331-49(1990)]；および約２１〜２３ｋＤの完
全に処理された成熟型を作製するための、アミノ−末端ペプチド（配列番号：21
のアミノ酸32-103にほぼ相当）の切断（あきらかに細胞外）が含まれる。実験に
よる証拠は、ＶＥＧＦ−Ｃの部分的に処理された形態（例えば、29 kD型）はＦ
ｌｔ４（ＶＥＧＦＲ−３）受容体に結合することができるが、ＶＥＧＦＲ−２へ
の高親和性結合は、ＶＥＧＦ−Ｃの完全に処理された形態にのみ生じる。ＶＥＧ
Ｆ−Ｃポリペプチドは天然には非ジスルフィド結合ダイマーとして結合すると思
われる。
【０１７０】 さらに、配列番号：２のアミノ酸配列１０３〜２２７はＶＥＧＦ−Ｃ機能を維
持するために必ずしも重大ではないことが実証されている。配列番号：２のアミ
ノ酸１１３〜２１３からなるポリペプチド（１０３〜１１２および２１４〜２２
７を欠失する）はＶＥＧＦ−Ｃ受容体に結合し、刺激する能力を維持し、残基約
１３１〜残基約２１１におよぶポリペプチドはＶＥＧＦ−Ｃ生物活性を維持して
いることが期待される。位置１５６のシステイン残基はＶＥＧＦＲ−２結合能力
にとって重要であることが示されている。しかし、ＶＥＧＦ−ＣΔＣ１５６ポリ
ペプチド（すなわち、欠失または置換によりこのシステインを欠失している類似
物）は、ＶＥＧＦＲ−３の強力な活性を維持している。配列番号：２の位置１６
５のシステインはどちらかの受容体の結合に必須であるが、位置８３または１３
７のシステインを欠失する類似物は両受容体との結合に関してＶＥＧＦ−Ｃと競
合し、両受容体を刺激する。
【０１７１】 ヒトＶＥＧＦ−Ｃと他の種のＶＥＧＦ−Ｃを並べると（一般に許容されている
任意の配列アルゴリズムを使用して実施される）、ＶＥＧＦ-Ｃ生物活性を破壊
することなく、改変が導入されていてもよい追加の残基を示唆している（ずなわ
ち、挿入、置換および/または欠失）。２つ以上の種の並べたＶＥＧＦ-Ｃポリペ
プチドが異なるアミノ酸、特に異なる化学的特性の側鎖を有する異なるアミノ酸
を有する任意の位置は、それと同時に機能の消失を伴うことなく、改変を受けや
すい位置であってもよい。ヒト、マウスおよびウズラＶＥＧＦ-Ｃを例示的に並
べたものはＰＣＴ／ＵＳ９８／０１９７３号の図５に記載されている。
【０１７２】 上記の考慮とは別に、数多くの同類アミノ酸置換を野生型ＶＥＧＦ-Ｃ配列に
実施することができ、特にこのような置換が小規模である場合には、ＶＥＧＦ-
Ｃ生物活性を維持するポリペプチドが得られると思われる。「同類アミノ酸置換
」は、ある種のアミノ酸と同様の化学的特徴の側鎖を有するアミノ酸の置換を意
味する。同類アミノ酸置換を作製するための同様のアミノ酸には、酸性側鎖（グ
ルタミン酸、アスパラギン酸）、塩基性側鎖（アルギニン、リジン、ヒスチジン
）、極性アミド側鎖（グルタミン、アスパラギン）、疎水性脂肪族側鎖（ロイシ
ン、イソロイシン、バリン、アラニン、グリシン）、芳香族側鎖（フェニルアラ
ニン、トリプトファン、チロシン）、小型側鎖（グリニン、アラニン、セリン、
スレオニン、メチオニン）または脂肪族ヒドロキシ側鎖（セリン、スレオニン）
を有するものを含む。ＶＥＧＦ-Ｃ生物活性を破壊することなく、１つまたは少
数の内部アミノ酸の付加または欠失も考慮される。
【０１７３】 上記から、多数のポリペプチドおよび変異体が高親和性でＦｌｔ４（ＶＥＧＦ
Ｒ−３）に結合することが考えられ、従って、Ｆｌｔ４結合化合物を使用して、
組織試料の画像形成またはスクリーニングを含む本発明の局面においてＦｌｔ４
結合化合物として有用である。得られたポリペプチドがＶＥＧＦＲ−３の高い結
合特異性を有するように、ＶＥＧＦＲ−３結合親和性を低下または排除する変更
を保有する型のＶＥＧＦ-Ｃは特に興味深い。上記のように、このような変更に
は、実質的にＶＥＧＦＲ−３結合親和性を排除するＣｙｓ１５６の欠損または交
換、または天然のプレプロ-ＶＥＧＦ-Ｃ蛋白質分解処理部位を破壊するアミノ酸
配列変更を含む（ＶＥＧＦＲ−2親和性は完全に処理されたＶＥＧＦ-Ｃで最も高
いからである）。また、Ｆｌｔ４結合親和性を維持するが、Ｆｌｔ４自己リン酸
化を活性化しないように改変されているＶＥＧＦ-Ｃ分子は、本明細書に記載す
る治療方法の有用なＦｌｔ４拮抗剤である。本明細書に記載するＦｌｔ４リガン
ドは、ヒトＦｌｔ４対立遺伝子変異体の正体を確認し、本明細書に教示するＦｌ
ｔ４配列に相同性を有する非ヒト遺伝子配列（例えば、実施例8および図4参照）
が実際にＦｌｔ４の非ヒト相対物であることを確認するための追加の指標として
アッセイに使用することができることは上記の教示からさらに明らかになる。プ
レプロ-ＶＥＧＦ-Ｃの推定されるアミノ酸配列を本明細書の配列番号：21に記載
する。
【０１７４】 血管内皮増殖因子Ｄ（VEGF-D）と命名されるＦｌｔ４リガンドの詳細な特徴並
びに、ＶＥＧＦ−ＤおよびＶＥＧＦ−Ｄ変異体および類似物をコードする未変性
のヒトポリヌクレオチド配列は、その全てが全体の内容が参照として組み入れら
れている１９９７年８月２１日に提出され、国際公開公報第９８／０７８３２号
として１９９８年２月２６日に公開された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／
１４６９６号；Achen et al., Proc. Natl. Acad. Scie U.S.A., 95(2):548-553
(1998)に提供されている。そこに詳細に説明されているように、ヒトＶＥＧＦ−
Ｄは最初、３５４アミノ酸のプレプロ−ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドとしてヒト細
胞中で産生される。ヒトプレプロ−ＶＥＧＦ−ＤのｃＤＮＡおよびアミノ酸配列
は配列番号２２に記載されている。他の種のＶＥＧＦ−Ｄ配列も報告されている
。例えば、参照として本明細書に組み入れられている、Genebank Accession No
ｓ.Ｄ８９６２８（Mus musculus）およびＡＦ０１４８２７（Rattus norvegicus
）参照。
【０１７５】 プレプロ−ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドは２１アミノ酸のシグナルペプチドと推
定され、明らかにプレプロ−ＶＥＧＦ−Ｄの処理と類似した方法で蛋白質分解的
に処理される。配列番号：２２の「組換えにより変異させたＶＥＧＦ−Ｄ欠損残
基１〜９２および２０２から３５４は、受容体をＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦ
Ｒ−３活性化する能力を維持し、非共有結合的に結合したダイマーとして結合す
ると思われる。本発明のＦｌｔ４結合化合物としてのＶＥＧＦ−Ｄポリペプチド
の利用性はＶＥＧＦ−Ｃについて上記したものと類似している。同様に、ＶＥＧ
Ｆ−Ｄの同様の変更（ＶＥＧＦ相同ドメインにおいて８つの保存されたシステイ
ンの２番目を排除する、Ｃｙｓ１３６または蛋白質分解処理部位を排除する）に
より、ＶＥＧＦＲ−２結合親和性が低下または排除された、従って、Ｆｌｔ４特
異性が増加したポリペプチドが得られる。Ｆｌｔ４結合親和性を維持するが、Ｆ
ｌｔ４自己リン酸化を活性化しないように改変されているＶＥＧＦ−Ｄ分子は、
本明細書に記載されている治療方法の有用はＦｌｔ４拮抗剤である。
【０１７６】 実施例１８ マウスＦｌｔ４ｃＤＮＡプローブのクローニング １２９ＳＶマウス（Stratagene）のλＦＩＸ（登録商標）ＩＩゲノムライゲー
ションの約１０６プラークを、細胞質ドメインをカバーする、上記Ｓ２．５ヒト
Ｆｌｔ４受容体ｃＤＮＡ断片でスクリーニングしたPajusola et al., Cancer Re
s. 52: 5738(1992)を参照。２．５ｋｂのＢａｍＨＩ断片を陽性プラークからサ
ブクローニングし、両方の末端から配列決定した。このサブクローンからポリメ
ラーゼ連鎖反応を使用して、増幅し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳＩＩ＋／−
ベクター（Stratagene）にマウスＦｌｔ４ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド１７４５
〜２０４９をカバーするエクソン断片クローニングした。Pinnerty et al., Onc
ogene, 8: 2293(1993)。 ヌクレオチド１〜１９２をカバーする第二の断片を同様にクローニングした。
【０１７７】 実施例１９ マウス組織におけるＦｌｔ４ｍＲＮＡの分析 Chomoczynski et al., Anal. Biochem., 162: 156(1987)により発生中の胚
（8〜18日p. c.および1日齢のマウス）から総ＲＮＡを単離した。8日p. c.胚の
試料は胎盤も含んでいた。
【０１７８】 ＲＮＡａｓｅ保護分析は、アンチセンス方向化のために[３２Ｐ]−ＵＴＰおよ
びＴ７ポリメラーゼを使用して、実施例１８により得た直線化したマウスＦｌｔ
４プラスミドからＲＮＡプローブを作製した。使用したβ−アクチンプローブは
報告されているマウスβ−アクチン配列のヌクレオチド１１８８〜１２７９に相
当する。Tokunaga, et al., Nucleic Acid Res., 14: 2829(1986) を参照。６％
ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルで精製後、標識した転写物を３０μｇの総Ｒ
ＮＡに５２℃において終夜ハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーショ
ンしなかったＲＮＡをＲＮＡａｓｅ Ａ（１０Ｕ／ｍｌ）およびＴ１（１ｍｇ／
ｍｌ）で３７℃においてｐＨ７．５で１時間消化した。ＲＮＡａｓｅは３７℃に
おいてプロテイナーゼＫ消化によって１５分間で不活性化し、試料を６％ポリア
クリルアミド／７Ｍ尿素ゲル中で分析した。
【０１７９】 この実験において分析したＦｌｔ４の発現パターンは、非常に弱いｍＲＮＡシ
グナルが肺、肝臓、心臓、腎臓、骨格筋および脾臓から得られたが、精巣および
脳は特異的なシグナルを明らかに生じなかった。ＲＮＡａｓｅ保護アッセイによ
って異なる発生段階において採取された一連のＲＮＡｓの分析は、Ｆｌｔ４ＲＮ
Ａは８ｐ．ｃ．から新生児マウスまでの胚形成期間中に大きなシグナル強度の変
化を生ずることなく発現されることを示した。
【０１８０】 実施例２０ マウス胚におけるＦｌｔ４のインサイチューハイブリダイゼーション Ｆｌｔ４転写物を細胞および組織によりよく割り付けるために、７．５および
８．５日ｐ．ｃ．マウス胚の切片に標識したＦｌｔ４ＲＮＡｓでハイブリダイゼ
ーションした。マウス胚はＣＢＡとＮＭＲＩマウスの交配から誘導した。妊娠マ
ウスは断頭によって犠牲にし、胚を速やかに凍結するか、またはリン酸緩衝生理
食塩液を介して４％パラホルムアルデヒドに移した。胚および単離したマウス器
官を４℃において１８時間固定し、脱水し、パラフィンに包埋し、６μｍの切片
に切断した。
【０１８１】 １９２および３０５ヌクレオチドのＲＮＡプローブ（アンチセンスおよびセン
ス）（実施例18参照）は、[３５Ｓ]−ＵＴＰを使用して直線化したプラスミドか
ら作製した。切片のインサイチューハイブリダイゼーションは、以下の改良を加
えて参照として本明細書に組み入れられているWilkinson et al., Development,
99: 493(1987);およびWilkinson et al., Cell. 50: 79(1987)により実施した
：１）トルエンの代わりに、パラフィンワックスに包埋する前にキシレンを使用
した；２）２）６μｍの切片を切断し、２％３−リエトキシシリルプロピルアミ
ンで前処理したガラススライドの表面のジエチルピロカルボネート処理した水の
層の上に配置した；３）プローブのアルカリ性加水分解を省いた；４）高度の緊
縮条件洗浄は３０ｍＭＤＴＴおよび１×ＳＣＣを含有する溶液中で６５℃におい
て８０分間とした。切片はＮＴＢ−２エマルジョン（Kodak）をカバーし、４℃
において保存した。スライドを１４日間の露出し、現像し、ヘマトキシリンで染
色した。センス鎖およびＲＮＡａｓｅ−Ａ処理した切片を用いた対照ハイブリダ
イゼーションはバックグラウンドを上回る特定のシグナルを生じなかった。
【０１８２】 Ｆｌｔ４ｍＲＮＡ発現は７．５日ｐ．ｃ．マウス胚では検出されなかったが、
はっきりしたシグナルが発生８．５日の発生中の大動脈で検出された。一方、発
生中の卵黄嚢はＦｌｔ４−陰性であった。胚外組織では、Ｆｌｔ４は羊水中で顕
著に発現されたが、卵黄嚢の発生中の血島は陰性であった。一方、頭部間葉の血
管芽細胞は強力にＦｌｔ４陽性であった。発生中の胎盤では、Ｆｌｔ４シグナル
は抹消洞様血管に最初に見られた。９．５日ｐ．ｃ．胎盤では、静脈小窩の内皮
およびライヘルト膜に部分的に融合した巨大細胞はＦｌｔ４を発現した。
【０１８３】 従って、Ｆｌｔ４発現は早期の内皮細胞前駆体、血管芽細胞では非常に顕著で
あるが、８．５日ｐ．ｃ．胚のある種の血管に制限されると思われた。Ｔｉｅ受
容体は発生中のマウス胚の全ての内皮細胞に発現することが知られているので、
これらの細胞のマーカーとなる。Korhonen, et al., Oncogene, 8: 395(1993)
；およびKorhonen et al., Blood, 80: 2548-2555(1992) 参照。Ｔｉｅプローブ
とは異なって、注目すべきことには、Ｆｌｔ４プローブは、あったとしても非常
に弱く、１１．５日ｐ．ｃ．胚の動脈内皮、例えば発生中の背大動脈または頚動
脈の内皮とハイブリダイゼーションした。代わりに、Ｆｌｔ４シグナルは発生中
の静脈でははるかにずっと顕著であった。例えば、Ｆｌｔ４シグナルは発生中の
後腎を取り巻く静脈内で検出されたが、Ｔｉｅプローブは後腎内部の毛細血管を
顕著に認識した。
【０１８４】 Ｆｌｔ４ｍＲＮＡは１２．５日ｐ．ｃ．マウス胚のいくつかの領域に分布して
いることが観察され、腋窩領域の拡張した血管に特に顕著であった。同様のＦｌ
ｔ４−陽性血管構造は頸静脈領域の中心−矢状断面において見られた（データは
示していない）。Ｆｌｔ４発現血管の網状組織様パターンは眼窩周囲領域および
発生中の脊椎周囲で見られた。また、発生中の皮膚の下層でも、Ｆｌｔ４陽性血
管網が明らかであった。より弱い毛細管シグナルは、発生中の脳を含むいくつか
の領域から得られた。Ｆｌｔ４ｍＲＮＡは頸部領域、発生中の鼻および発生中の
舌の基底部並びに尾領域の小血管中でも検出された。また、肝臓は、斑点状パタ
ーンでＦｌｔ４ｍＲＮＡが強力に陽性であった。
【０１８５】 さらに発生中では、Ｆｌｔ４ｍＲＮＡは胚のある種の血管により限定されるよ
うになると思われる。１４．５日ｐ．ｃ．胚はこの制限されたパターンの発現を
うまく示している。このような胚の中矢状切片では、最も顕著なＦｌｔ４信号は
その前部の発生中の脊柱に沿って観察された。このシグナルは、この発生時期に
おいて形成される最も大きいリンパ管である胸管の内皮細胞を起源としていると
考えられた。一方、背大動脈および下大静脈は陰性であった。腸間膜領域の拡張
した血管もＦｌｔ４が強力に陽性であった。さらに、１２．５日ｐ．ｃ．胚と同
様に、眼窩周囲、下顎並びに頸部領域の解剖学的境界に沿った血管網はＦｌｔ４
陽性内皮を含有した。同様の組織は心膜空間および皮下組織に存在した。注目す
べきことに、Ｆｌｔ４陰性血管とは異なって、全てのＦｌｔ４陽性血管はその内
腔に血球細胞が欠損していた。これらの発現パターンは、Ｆｌｔ４は、この発生
時期ではリンパ管の内皮に限定されることを示唆している。Ｆｌｔ４発現が観察
される追加の部位は発生中の骨髄の洞内である。
【０１８６】 Ｆｌｔ４プローブをハイブリダイゼーションした１６．５日ｐ．ｃ．胚の上部
胸部の横方向の切片を分析した。ヘマトキシリン−エオシン染色はこの領域の異
なる種類の血管を可視化するために実施した。これらには、サイズがより小さく
、周囲の血管および結合組織を欠損している頚動脈および腕頭動脈、大静脈およ
び胸管が含まれる。より高倍率下では、胸管並びにその付近の小血管の内皮細胞
はＦｌｔ４プローブとハイブリダイゼーションすることが観察された。
【０１８７】 実施例２１ 培養内皮細胞におけるＦｌｔ４ｍＲＮＡの分析 実施例２０に記載されたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果は、Ｆ
ｌｔ４が、動脈細胞ではなく、静脈内皮細胞で発現し、そしてリンパ管およびい
くつかの静脈内皮細胞において後期に発現していることを明らかにした。そのよ
うな調節がインビトロで維持されているかどうかを明らかにするために、本発明
者らは、ノーザンブロッティング分析およびハイブリダイゼーション分析を使用
して培養内皮細胞を調べた。
【０１８８】 ヒト大動脈、大腿深静脈、臍静脈および包皮微小血管から内皮細胞を単離およ
び培養して、この分野で以前に記載されているようにして特徴付けを行った。Ｖ
ａｎ Ｈｉｎｓｂｅｒｇ他、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、７：３８９（
１９８７）；およびＶａｎＨｉｎｓｂｅｒｇ他、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ
ａｓ、５７：１４８（１９８７）を参照のこと。ポリアデニル化ＲＮＡを単離す
るために、細胞を５代〜８代の継代（１：３のスプリット比）の後のコンフルエ
ンス密度で使用した。
【０１８９】 内皮細胞株のＢＡｈｙ９２６（Ｅｄｇｅｌｌ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．８０：３７３４〜３７３７（１９８３））、ＢＣＥ（Ｆｏｌｋｍａ
ｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６：５２１７〜５２２１（１
９７９））およびＬＥＩＩ（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．８２：６１３８（１９８５））はＦｌｔ４を発現しなかった。し
かし、培養されたヒト微小血管、静脈および臍静脈の内皮細胞は、Ｆｌｔ４に特
異的な５．８ｋｂおよび４．５ｋｂのｍＲＮＡに関して陽性であったが、大動脈
の内皮細胞は陰性であった。対照的に、別の内皮細胞レセプターのチロシンキナ
ーゼ遺伝子ｔｉｅは、調べたすべての内皮細胞タイプで４．４ｋｂのｍＲＮＡと
して発現していた。
【０１９０】 実施例２２ 成人ヒト組織におけるＦｌｔ４のｍＲＮＡ 実施例２０で得られた結果は、Ｆｌｔ４のｍＲＮＡが、発達中のリンパ管の内
皮細胞に大部分が限定されることを示していた。ヒトにおけるこの発見は重要と
考えられるために、本発明者らはまた、成人ヒト組織におけるＦｌｔ４の発現を
、ヒトＦｌｔ４プローブを使用して調べた。使用されたヒトＦｌｔ４プローブは
、ｃＤＮＡ（配列番号１）の塩基対１〜５９５を覆うＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩフラ
グメントであった。Ｐａｊｕｓｏｌａ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：５７３
８（１９９２）もまた参照のこと。フォンウィルブラント因子プローブは、塩基
対１〜２３３４を覆うＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントであった。Ｂｏ
ｔｔｈｒｏｎ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４１：７１２５（１
９８６）。
【０１９１】 本発明者らは、組織病理学的診断のために送られてきた固定化材料を日常的に
使用した。正常な肺組織を、類表皮ガンに冒された左下肺葉の切除物から得た。
腸間膜および腸間リンパ節を結腸腺ガン患者から得た。唾液腺に隣接する正常な
リンパ節を、その異常なサイズのために摘出した。２名の患者から得られた扁桃
および２つの虫垂は診断的な変化を有していなかった。２つのリンパ管筋腫症お
よび３つの嚢胞性リンパ管腫を調べたが、類似する結果が得られた。
【０１９２】 組織病理診断のために１０％ホルマリンで固定された日常的なサンプルである
ヒト組織の場合、正常なｉｎ ｓｉｔｕプロトコルはバックグラウンドを与えた
だけであったが、プロテイナーゼＫの代わりにマイクロ波での処理は特異的なハ
イブリダイゼーションを可能にした。Ｓｈｉ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
６：５７７４（１９９１）；Ｃａｔｏｒｅｔｔｉ他、Ｊ．ｏｆ Ｐａｔｈｏｌ．
１６８：３５７（１９９２）。
【０１９３】 腸間膜において、肺および虫垂のリンパ内皮細胞はＦｌｔ４シグナルを与えた
が、静脈、動脈および毛細血管は陰性であった。Ｆｌｔ４がＨＥＶで発現してい
るかどうかを調べるために、扁桃を調べた。実際、扁桃において、Ｆｌｔ４に特
異的なオートラジオグラフィーシグナルがいくつかのＨＥＶで検出された。
【０１９４】 実施例２３ 正常なリンパ節および転移性リンパ節ならびにリンパ管腫におけるＦｌｔ４ｍＲ
ＮＡの分析 ヒトの腸間リンパ節（実施例２２を参照）の一部をＦｌｔ４の発現について分
析した。Ｆｌｔ４の発現が、リンパ洞ならびに求心性および遠心性のリンパ管で
認められた。同じパターンが、腺ガン転移物を含むリンパ節で認められた。正常
なリンパ節および転移性リンパ節の両方におけるいくつかのＨＥＶもまた陽性で
あった。嚢胞性リンパ管腫におけるＦｌｔ４の発現は、すべての血管のフォンウ
ィルブラント因子に対するｉｎ ｓｉｔｕシグナルとの比較から明らかであるよ
うに、リンパ内皮細胞に特異的であった。
【０１９５】 これらの結果と一致して、Ｆｌｔ４に関する免疫染色は、考えられるリンパ内
皮細胞の増殖を特徴とする希な疾患である皮膚のリンパ管腫転移物の内皮細胞に
おいて強い陽性であった。Ｌｙｍｂｏｕｓｓａｋｉ他、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ
．１５３（２）：３９５〜４０３（１９９８年８月）、これは参考としてその全
体が本明細書中に組み込まれる。
【０１９６】 さらに、Ｆｌｔ４に対する免疫染色により、紡錘細胞がカポジ肉腫皮膚節病巣
組織サンプル内に同定された。Ｊｕｓｓｉｌａ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８
：１５９９〜１６０４（１９９８年４月）。Ｆｌｔ４の明らかなリンパ特異性を
考慮して、これらの結果は、カポジ肉腫内の特定の細胞はリンパ内皮細胞起源で
あるという示唆と一致すると考えることができる。例えば、Beckstead他、Ａｍ
．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１１９：２９４〜３００（１９８５）；Ｄｉｃｔｏｒ他、
Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３０：４１１〜４１７（１９８８）を参照のこと。
【０１９７】 実施例２４ 胎児内皮細胞中へのFlt4の局在化 実施例２で述べたように、短形の40個のカルボキシ基末端アミノ酸をエンコー
ドしたFlt cDNA断片を657bpEcoRJ断片として、グルタチオン-S-転移酵素コード
化部位を有するフレーム中のpGEX-1λT細菌性発現ベクターへクローン化した。
得られるGST-Flt4融合蛋白は、E.coli中に生産され、グルタチオン-Sepharose 4
Bカラムを用いてアフィニティークロマトグラフィーで精製した。精製したプロ
テインを凍結乾燥し、PBSに溶解し、フロインドアジュバントと混合し、ウサギ
の免疫化に使用した。抗血清を三番目の追加免疫の免疫化に使用した。
【０１９８】 17週及び20週齢のヒト胎児からの組織を、プロスタグランジンで誘発した合法
的流産児から得た。本研究は，Helsinki Central 病院の倫理委員会の承認を受
けた。妊娠期間は、胎児の足の長さから推定した。胎児組織はTissue-Tek中に包
埋し、ただちに凍結し、-70℃で保管した。
【０１９９】 Anti-Flt4抗血清を、GST-Sepharoseカラムに交叉吸着させ、anti-GST抗体を除
去し、次いで、GST-Flt4アフィニティークロマトグラフィーで精製した。厚さ６
μmの数個のクリオスタット組織切片をアセトンで固定し、メタノール中０.３%
のH2O2で３０分間処理し、内因性のペルオキシダーゼ活性をブロックした。洗浄
後、切片を５%標準豚スクラムで培養した。次に切片をFlt4に対する抗体で培養
し、洗浄した。結合した抗体はペルオキシダーゼ-複合豚 抗-ウサギIgGで検出し
、次いでペルオキシダーゼ活性のために基質として0.2% 3,3-ジアミノベンチジ
ン（Ameraham）を用いて染色した。
【０２００】 ヒト胎児腸間膜のAnti-Flt4免疫ペルオキシダーゼ染色により、幾つかの内腱
鞘血管Flt4蛋白が認められた。一方、抗原-ブロックしたanti-Flt4抗体およびプ
レ免疫血清による対照染色は陰性であった。比較のために、切片を、FactorVIII
に関係する抗原に対する抗血清で染色した。これは血管内皮細胞に特異的である
。Flt4の免疫ペルオキシダーゼ染色は、血管の内皮細胞上で観察された。これに
は、赤血球細胞は含まれていない。一方、血管は陰性であった。赤血球のない血
管はリンパ性の内皮細胞のようであり；そのような血管は特に腸間膜に多い。Fa
ctorVIIIに関係する抗原に対する抗体により、全ての内皮細胞を染色した。
【０２０１】 実施例２５ Ｆｌｔ４に対するモノクローナル抗体の産生 融合Ｉ： Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞においてＦｌｔ４ＥＣ−６ｘＨｉｓ−ｐＶＴＢａｃプ
ラスミド（実施例１４）を発現することによって、組換えＦｌｔ４細胞外ドメイ
ン蛋白質を産生した。組換えＦｌｔ４細胞外ドメインのＣＯＯＨ−末端にコード
される６ｘＨｉｓ標識を結合し、溶出するために、Ｆｌｔ４細胞外ドメイン（Ｆ
ｌｔ４ＥＣ）は、製造業者の指示により、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマト
グラフィーを使用して感染させたＨｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞の培養培地から精製し
た。
【０２０２】 ４月齢のＢａｌｂ／ｃ雄マウスに、フロイントの完全アジュバントで乳化した
組換え産生し、精製したＦｌｔ４細胞外ドメイン蛋白質（１５０μｇ／マウス）
を腹腔内注射することによって免疫した。１５０μｇの追加抗原投与は３〜４週
間間隔で投与し、最終抗原投与（１０μｇＦｌｔ４ ＢＣのＰＢＳ溶液、腹腔内
投与）はさらに３週間の間隔後に投与した。最後の追加抗原投与の４日後に、マ
ウスを犠牲にし、マウスの脾臓リンパ系細胞にＳＰ２／０形質細胞腫細胞を２：
１の比でそれぞれ融合した。
【０２０３】 融合した細胞を、９６ウェルの培養プレート（NUNC）の２０％ウシ胎仔血清お
よびＨＡＴ強化剤（ハイポキサンチン−アミノプテリン−チミジン；ＧＩＢＣＯ
，０４３−０１０６０Ｈ；５０倍希釈）を含有するＥｘ−Ｃｅｌｌ３２０培地（
SERALAB）に回収した。細胞を＋３７℃において、５％ＣＯ２雰囲気中で培養し
た。１０日後、ＨＡＴ−強化培地をＨＴ強化した細胞培養培地（ＧＩＢＣＯ，０
４３−０１０６５Ｈ；５０倍希釈）に交換した。ＨＴ培地はＨＡＴ培地と同じで
あるが、アミノプテリンを欠損している。
【０２０４】 ３週間後、特異的な抗体産生を、以下の実施例２６に記載した抗原特異的Immu
noFluoroMetric Assay,(IFMA)によって求めた。マスタークローンをStaszewski
et al., Yale Journal of Biology and Madicine, 57: 865-868(1984)によって
記載されているように限界希釈によってクローニングした。陽性クローンを２４
ウェルの組織培養プレート（NUNC）で増殖し、再度クローニングし、同じ方法に
よって試験した。陽性のクローンは蛍光活性化細胞選別（FACS）によって試験し
た。
【０２０５】 安定なクローンは、おそらくクラスＩｇＡに属するＩｇを産生した１つを除い
て、ＩｇＧ１クラスに属する免疫グロブリンを分泌した。モノクローナル抗体の
サブクラスは、ＩＦＭＡにおけるビオチン結合物（SEROTEC）としてマウスサブ
クラスに対するラットモノクローナル抗体を使用して求めた。
【０２０６】 Ｂａｌｂ／ｃマウスを使用して腹水中でモノクローナル抗体を産生した。上記
のハイブリドーマを、プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデ
カン９８％、ALDRICH-CHEMIE F 7924 Steinheim,カタログ番号T2,280-2）で動物
を前処理した後に、マウスに腹腔内注射した。０．５ｍｌのプリスタン（i.v.）
を、ハイブリドーマ細胞の約２週間前に注射した。注射した細胞の量は約７．５
〜９×１０６／マウスであった。ハイブリドーマの注射の１０〜１４日後に腹水
を採取した。
【０２０７】 融合ＩＩ： ２月齢のＢａｌｂ／ｃマウス（雌）に、フロイントの完全アジュバントで乳化
した組換え産生し、精製したＦｌｔ４細胞外ドメイン蛋白質（２０μｇ／マウス
）を腹腔内注射することによって免疫した。２０μｇの追加抗原投与は３〜４週
間間隔で投与し、最終抗原投与（１０μｇＦｌｔ４ ＢＣのＰＢＳ溶液、静脈内
投与）はさらに３週間の間隔後に投与した。最後の追加抗原投与の４日後に、マ
ウスを犠牲にし、マウスの脾臓リンパ系細胞にＳＰ２／０形質細胞腫細胞を２：
１の比でそれぞれ融合した。
【０２０８】 融合した細胞を、９６ウェルの培養プレート（FALCON）の２０％ウシ胎仔血清
およびＨＡＴ強化剤（ハイポキサンチン−アミノプテリン−チミジン；ＧＩＢＣ
Ｏ ＢＲＬ ２１０６０−０１７；５０倍希釈）を含有するＯｐｔｉＭＥＭ１（
およびＧｌｕｔａｍａｘ,１,５１９８５−０２６,ＧＩＢＣＯＢＲＬ）培地に回
収した。細胞を＋３７℃において、５％ＣＯ２雰囲気中で培養した。１０日後、
ＨＡＴ−強化培地をＨＴ強化した細胞培養培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，４１６０
５−０１２；５０倍希釈）に交換した。
【０２０９】 ３週間後、特異的な抗体産生を、以下の実施例２６に記載した抗原特異的Immu
noFluoroMetric Assay,(IFMA)によって求めた。マスタークローンをStaszewski
et al(1984)によって記載されているように限界希釈によってクローニングした
。陽性クローンを２４ウェルの組織培養プレート（FALCON）で増殖し、再度クロ
ーニングし、同じ方法によって試験した。陽性のクローンはＦＡＣＳによって試
験した。
【０２１０】 ２Ｅ１１および６Ｂ２クローンはＩｇＧ１クラスに属する免疫グロブリンを分
泌し、２Ｂ１２はＩｇＭに属するＩｇを分泌した。マウスサウブクラスＩｇＧ１ は、ＩＦＭＡにおいてビオチン結合物（SEROTEC）としてマウスサブクラス重鎖
に対するラットモノクローナル抗体を使用して求め、マウスサブクラスＩｇＭは
、Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit(Dipstick Format)(19663-012, Li
fe Technologies Inc.)を用いて求めた。
【０２１１】 実施例２６ Ｆｌｔ４に対するモノクローナル抗体の特異性 精製された組換えＦｌｔ４細胞外ドメイン−６ｘＨｉｓ融合生成物（実施例１
４および２５に記載されたように製造された）をMukkala et al., Anal.Biochem
,176(2),319-325(1989)に従ってユーロピウムで標識した。但し次のような改変
がなされた：イソチオシアネートＤＴＴＡ−Ｅｕ（Ｎ１キレート、ＷＡＬＬＡＣ
、フィンランド）の２５０倍モルの過剰量をＦｌｔ４溶液（ＰＢＳ中０．５ｍｇ
／ｍｌ）に加え、ｐＨを０．５Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９．８を加えるこ
とによってｐＨ約９に調整した。標識は＋４℃で一晩で実施した。未結合の標識
はＰＤ−１０（ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ、スウェーデン）をＴＳＡ緩衝液（５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、０．１５ＭＮａＣｌを含む）とともに用いるこ
とにより除去した。
【０２１２】 精製の後、１ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を表紙記されたＦｌｔ４
に加え、標識を＋４℃で保存した。Ｆｌｔ４一分子あたり導入されたユーロピウ
ムの平均数は、公知のＥｕＣｌ３標準に対するフルオレセンスの比を測定するこ
とにより決定した（hemmila et al., Anal. Biochem., 137:335-343(1984)）と
ころ、１．９であった。
【０２１３】 実施例２５で生産された抗体をサンドウィッチ型免疫蛍光アッセイを用いて、
ウサギ抗マウスＩｇ（Ｚ２５９、ＤＡＫＯＰＡＴＴＳ）でコーティングされたマ
イクロタイターストリップウェル（ＮＵＮＣ、ｐｏｌｙｓｏｒｂ）を用いて、ス
クリーニングした。あらかじめコートされたウェルをPlatewash1296-024(WALLAC
）とＤＥＬＦＩＡ洗浄溶液により一回洗浄した。ＤＥＬＦＩＡアッセイ緩衝溶液
を、前段階のスクリーニングアッセイにポジティブコントロールとして用いられ
る、細胞培養用のおよび脾臓摘出マウスの血清用の希釈緩衝液（１：１０００か
ら１：１００，０００の間の希釈）として、用いられた。
【０２１４】 ＋４℃での一晩の（あるいは室温で２時間の）インキュベーションはPlatesha
ker shaker（１２９６−００１、ＷＡＬＬＡＣ）で５分間振とうすることにより
開始した。次いで上記の洗浄溶液で４回洗浄した。
【０２１５】 ユーロピウムで標識されたＦｌｔ４はアッセイ緩衝溶液１００μｌ中１：５０
０の希釈で加えられた。
【０２１６】 増強溶液（ＤＥＬＦＩＡ）は２００μｌ／ウェルで加えられた。プレートは次
いでPlateshake shakerで５分間振とうされ蛍光の密度がＡＲＣＵＳ−１２３０
（ＷＡＬＬＡＣ）で１０〜１５分間で測定された（Lovgren et al., In:Collins
W.P.(Ed)Alternative Immunoassays, John Wiley & Sons Ltd.(1985),pp203-21
6）。ＤＥＬＦＩＡの結果は、試験されたすべてのモノクローナル抗体がＦｌｔ
４ＥＣ高原に結合したことを示している。Ｆｌｔ４（およびその抗体を生産する
ハイブリドーマ）と反応性であるモノクローナル抗体は、さらなるスクリーニン
グのために選択された。
【０２１７】 得られたモノクローナル抗体は、ＬＴＲ−ＦＬＴ４構築物を発現するＮＩＨ３
Ｔ３細胞およびネオマイシン耐性トランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞の二重抗体
免疫蛍光染色において使用した。細胞はＥＤＴＡを用いて培養プレートから剥離
させ、染色し、蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）において分析した。ＦＡＣ
Ｓ分析の結果は細胞染色陽性の割合と示唆されたモノクローナル抗体によって示
されている（下記表２参照）。 表２Ｍａｂクローン ＬＴＲ％ａ） Ｎｅｏ％ｂ） DELFIA−カウント １Ｂ１ ６７．３ １ ２０６２５ １Ｂ１Ｄ１１ ７５ １．２ １９６９４ １Ｂ１Ｆ８ ７６．１ １．４ １８５８０ ４Ｆ６ ６９．９ １．２ ２３２２９ ４Ｆ６Ｂ８Ｇ１２ ７５ ０．３ ２４３７４ ４Ｆ６Ｂ８Ｈ１１ ７５．９ ０．３ ２８２８１ ４Ｆ６Ｂ８Ｅ１２ ７４．８ ０．４ ２７０９７ ４Ｆ６Ｂ８Ｇ１０ ７５．３ ０．４ ２６０６３ ９Ｄ９ ４５．１ ０．７５ １７３１６ ９Ｄ９Ｄ１０ ７１．７ ２．３ １８２３０ ９Ｄ９Ｆ９ ７３ １．８ １１９０４ ９Ｄ９Ｇ６ ７４．３ ２．９ １６７４３ ９Ｄ９Ｇ７ ７０．７ １．３ １７００９ １０Ｅ４ ２４．２ １．４ ３９２０２ １０Ｅ４Ｂ１０Ｅ１２ ３２．３ ０．３ ４２４９０ １０Ｅ４Ｂ１０Ｇ１０ ３６．５ ０．３ ５４８１５ １０Ｅ４Ｂ１０Ｆ１２ ４５．６ ０．４ ４３９０９ １０Ｅ４Ｂ１０Ｇ１２ ４５．７ ０．５ ３５５７６ １１Ｇ２ ３０．２ １．６ １１３０４ １１Ｇ２Ｄ１２ ７４．４ １．５ １４６６０ １１Ｇ２Ｇ９ ７４．２ ０．９ １０２８３ １１Ｇ２Ｈ７ ７４．４ ２．１ ２５３８２ ａ）ＬＴＲ感染細胞から結果として得られたＦＡＣＳ ｂ）ＮＥＯ細胞（コントロール）から結果として得られたＦＡＣＳ
【０２１８】 ＬＴＲ−ＦＬＴ４ｌトランスフェクト細胞でのＦＡＣＳの結果は、抗体がＦｌ
ｔ４発現細胞を有効に認識することを示している。これらの同じ抗体はネオマイ
シンホスホトランフェラーゼトランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞のバックグラウ
ンド染色のみを示す。従って、これらの抗体は細胞表面でＦｌｔ４チロシンキナ
ーゼを特異的に認識する。
【０２１９】 抗Ｆｌｔ４ハイブリドーマ９Ｄ９Ｆ９と表示される１つのクローンは、ＩＦＭ
Ａにより免疫グロブリンクラスＩｇＧ１のものであると同定されたモノクローナ
ル抗体を安定して分泌することが分かった。ハイブリドーマ９Ｄ９Ｆ９はGerman
Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Department of Human and
Animal Cell Cultures and Viruses, Mascheroder Weg 1b, 3300 Braunschwein
g, Germany, March 23, 1995に寄託し、受託番号ＡＣＣ２２１０を得た。
【０２２０】融合II抗体 上記のユーロピウム標識Ｆｌｔ４細胞外ドメインタンパク質を用いても実施例
２５に記載の融合ll抗体をスクリーニングした。抗体は、ウサギ抗マウスＩｇ（
Ｚ２５９、ＤＡＫＯ）で被覆した微量滴定ウェル（Ｎｕｎｃ、ｐｏｌｙｓｏｒｂ
）Ｆｌｔ４特異的を用いてＩＦＭＡでスクリーニングした。ＤＥＬＺＦＩＡプレ
ート洗浄装置を用いてこのプレコートウェルを洗浄溶液（Ｗａｌｌａｃ）で１回
洗浄した。
【０２２１】 ＤＥＬＦＩＡアッセイバッファーを細胞培養上清（予備スクリーニングでは１
：２希釈）および脾臓摘出マウスの血清（１：１０００〜１：１００，０００希
釈）の希釈バッファーとして用い、これを陽性対照として用いた。標準としては
精製抗Ｆｌｔ４ ９Ｄ９Ｆ９（マウスサブクラスＩｇＧ１）を１．０ｎｇ／ｍｌ
〜２５０ｎｇ／ｍｌの間の濃度で用いた。まずサンプルを室温で５分間プレート
シェーク・シェーカーで振盪し、次ぎに４℃で約１８時間インキュベートした。
このフレームをまず４回洗浄し、次ぎにＥｕ標識Ｆｌｔ４（１００μｌアッセイ
バッファー中１：２０００）を加え、最後にそのフレームを室温で１時間インキ
ュベートした。記載のようにして洗浄した後、増強溶液（２００μｌ／ウェル、
Ｗａｌｌａｃ）を加え、フレームを５分間プレートシェーク・シェーカーで浸透
した。蛍光強度はＡＲＣＵＳ−１２３０（Ｗａｌｌａｃ）で測定した。上記のよ
うにしてＦｌｔ４発現ＮＴＨ３Ｔ３細胞を用いる二重抗体免疫蛍光染色アッセイ
でさらなるスクリーニングのために、Ｆｌｔ４に反応性のあるモノクローナル抗
体を選択した。
【０２２２】 得られたＦＬｔ４に対する融合IIモノクローナル抗体およびそれに対応するＦ
ＡＣＳ分析の結果（記載のモノクローナル抗体で陽性染色される細胞のパーセン
テージで表示）は表３に要約されている。
【０２２３】 抗Ｆｌｔ４抗体の定量のための標準曲線はアフィニティー精製した抗Ｆｌｔ４
９Ｄ９Ｆ９によって作製した。直線範囲は１．０ｎｇ／ｍｌから２５０ｎｇ／
ｍｌまでに達した。
【０２２４】 表面で全長Ｆｌｔ４を発現するｐＬＴＲＦＬＴ４ｌ構築物で同時トランスフェ
クトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞の細胞溶解物を、６．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳
動に付し、タンパク質を硝酸ニトロセルロース膜に移した（０．４５μｍ、SCHL
EICHER & SCHUELL）に移し、モノクローナル抗体を含有するハイブリドーマ細胞
培養上清（１：１０、５０ｍＭ ＴＲＩＳ−４％メタノールを含有する４０ｍＭ
グリシンバッファー、ＳＤＳ０．０４％）で免疫ブロッティングした。モノクロ
ーナルの特異性は、ＨＲＰコンジュゲートウサギ抗体Ｉｇ（Ｐ１６１、ＤＡＫＯ
、１５０ｍＭ生理食塩水、５％粉乳を含有する２０ｍＭ ＴＲＩＳバッファー、
ｐＨ７．５で１：１０００希釈）およびＥＣＬ（増強化学発光、AMERSHAM）でイ
ンキュベーションすることにより検出した。 表３ Ｍａｂクローン ＬＴＲ％ａ） ＮＥＯｂ） およそのＭａｂ産生量 ＷＢ ng/ml/10６細胞ｃ） ２Ｂ１２Ｅ１０ ３９．５ ６．０ ４４０ ＋ ２Ｅ１１Ｄ１１ ４４．６ ８．８ １１０ ＋ ２Ｅ１１Ｆ９ ４９．５ ４．５ １００ ＋ ２Ｅ１１Ｆ１２ ４６．０ ４．１ １８０ ＋ ２Ｅ１１Ｇ８ ４１．２ ７．８ １６０ ＋ ６Ｂ２Ｅ１２ ＮＦ ＮＦ １３９０ ＋ ６Ｂ２Ｆ８ ＮＦ ＮＦ ４７０ ＋ ６Ｂ２Ｇ６ ＮＦ ＮＦ ６３０ ＋ ６Ｂ２Ｈ５ ＮＦ ＮＦ ７４０ ＋ ６Ｂ２Ｈ８ ＮＦ ＮＦ １８００ ＋ ａ）ＬＴＲトランスフェクト細胞によるＦＡＣＳの結果 ｂ）ＮＥＯ細胞（対照）によるＦＡＣＳの結果 ｃ）標準として用いたアフィニティー精製した抗ＦＬＴ ９Ｄ９Ｆ９抗体に基づ
くＭａｂ産生の定量 ＮＦ ＦＡＣＳに作用しない ＷＢ ウエスタン免疫ブロッティングで首尾よく使用
【０２２５】 実施例２７ 細胞溶解物中のおよびヒト組織におけるパンパ内皮細胞で発現したＦｌｔを同定
するために抗Ｆｌｔ４抗体の使用 上記実施例に記載のハイブリドーマ９Ｄ９によって産生されたモノクローナル
抗体をＨＥＬ細胞の溶解物の免疫沈降およびウエスタンブロッティングに用いた
。実施例６で報告したように、Ｆｌｔ４ｍＲＮＡ発現はこれまでにＨＥＬ細胞で
認められていた。約２Ｘ１０７のＨＥＬ培養細胞を実施例１１で明示したＲＩＰ
Ａバッファーで溶解し、約２ｇの９Ｄ９抗体を用いて免疫沈降させた（実施例１
１においてポリクローナル抗体について記載した通り）。ウエスタン解析につい
ては、免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（６％ゲル）で電気泳動に付し、ニトロセ
ルロース膜へエレクトロブロッティングした。１μｇ／ｍｌ希釈の９Ｄ９抗体を
用いた免疫沈降物のウエスタンブロッティング解析で、Ｆｌｔ４ポリペプチドに
相当する１７５ｋＤと１２５ｋＤのポリペプチドバンドが検出された。
【０２２６】 ヒト皮膚組織の免疫染色は９Ｄ９モノクローナル抗体およびアルカリ性ホスフ
ァターゼＡＢＣ−ＡＰキット（Ｄａｋｏ）を用いて行った。要するに、６μｍの
成人皮膚サンプルを含むスライドを３０分間室温で乾燥させ、１０分間冷アセト
ンで固定し、その後５分間、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄した。
次ぎにこのサンプルを２％ウマ血清とともに室温で３０分間インキュベートし、
ＰＢＳ中で５分間３度洗浄した。
【０２２７】 免疫染色については、サンプルを９Ｄ９一次抗体とともに室温で１時間インキ
ュベートし、ＰＢＳ中で５分間３回洗浄した。洗浄後、サンプルをビオチニル化
ウサギ抗マウス二次抗体とともに室温で３０分間インキュベートし、再びＰＢＳ
で５分間３回洗浄した。
【０２２８】 結合した抗体は、ＡＢＣ−ＡＰ複合体とともにサンプルを室温で３０分間イン
キュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、ＡＰ−基質（Sigma Fast Red TR/Naphtol
AS-MX（カタログ番号Ｆ−４６４８））とともに室温で１５分間インキュベート
して水洗することにより検出した。次ぎにサンプルをメイヤーのヘマトキシリン
で３０秒間対比染色して水洗した。水をのせてカバーガラスをかけ、顕微鏡下で
サンプルを観察した。これらのヒト皮膚切片のリンパ内皮細胞で９Ｄ９抗体染色
が認められた。血管内皮細胞は極めて弱い染色しか示さなかったか、あるいは全
く染色されていなかった。リンパ内皮に対する明らかな特異性を確認するために
さらなる分析を用いた。Lymbouskaki et al., Am. J. Pathol., 153(2):395-403
（１９９８年８月）、およびJussila et al., Cancer Res., 58:1599-1604（１
９９８年４月）参照。なお、両者とも引用することによりそのまま本明細書の一
部とされる。
【０２２９】 これらの結果からさらに、リンパ内皮の有用なマーカーとしてのＦｌｔ４の有
用性、ならびに組織サンプルにおいてこれらの細胞で発現されたＦｌｔ４を同定
および視覚化するための抗Ｆｌｔ４抗体の有用性が確認される。
【０２３０】 実施例２８ 乳癌の脈管形成におけるＶＥＧＦ−Ｃ／ＶＥＧＦＲ−３シグナル伝達経路のアッ
プレギュレーション 上記の実施例はＦｌｔ４（ＶＥＧＦＲ−３）が正常な組織におけるリンパ内皮
の特異的脈管形成マーカーとして有用であることを示している。以下の手法はさ
らに、ＶＥＧＦＲ−３が悪性乳癌において脈管形成マーカーとして（例えば診断
およびスクリーニングのため）、また治療標的として有用であることを証明する
ものである。組織学的に正常な乳房組織に比べて侵襲性乳癌では、極めて高い数
のＶＥＧＦＲ−３陽性血管が認められた（Ｐ＜０．０００１）。
【０２３１】 材料および方法 ヘルシンキ大学病理学科のファイルから新たに凍結させた乳房組織サンプルを
入手した。このサンプルは腺管癌（ｎ＝６）、小葉癌（ｎ＝６）、分泌管内癌（
ｎ＝８）、繊維腺癌（ｎ＝４）および組織学的に正常な乳房細胞（ｎ＝１２）か
らなっていた。サンプルは総て摘出後直ちに液体窒素中で凍結させ、−７０℃で
保存した。
【０２３２】 ヒトＦｌｔ４（ＶＥＧＦＲ−３）に対するマウスモノクローナル抗体（Ｍａｂ
）は実質的に上記実施例、例えば実施例２５に記載のようにして作製した。ＶＥ
ＧＦＲ−３細胞外タンパク質ドメイン（ＶＥＧＦＲ−３ＥＣ）は培地から精製し
た昆虫細胞中の組換えバキュウロウイルスによって発現させた。次ぎに標的な方
法を用いてＶＥＧＦＲ−３ＥＣに対するマウスモノクローナル抗体を作製し、ハ
イブリドーマ腹水またはTecnomouse（登録商標）培養上清からＡタンパク質アフ
ィニティークロマトグラフィーによって免疫グロブリン画分を精製した。
【０２３３】 ５μｍの組織サンプルの凍結切片を風乾し、冷アセトン中で１０分間固定した
。この切片をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で再び水和し、室温下、５％正常
ウマ血清中で３０分間インキュベートした。次ぎにこの切片を加湿雰囲気下、室
温で２時間、１．０μｇ／ｍｌの濃度のＭａｂ ９Ｄ９Ｆ９（実施例２６）とと
もにインキュベートした。ＶＥＧＦＲ−３ＥＣの異なるエピトープに対するその
他の抗ＶＥＧＦＲ−３Ｍａｂについても検討し、２Ｂ１１Ｄ１１（実施例２６）
および７Ｂ８Ｆ９（実質的に実施例２６に記載のようにして作製）をそれぞれ９
．５および８．５μｇ／ｍｌの濃度で用いた。次ぎにビオチニル化抗マウス血清
中で３０分間インキュベートした後、Vectastain Elite Mouse IgG ABCキット(V
ector laboratories, Burlingame, USA)の試薬を用いて６０分間インキュベート
した。３−アミノ−９−エチルカルバゾール（AEC, Sigma, St. Louis, USA）で
１０分間ペルオキシダーゼ活性を進展させた。最後にこの切片をヘマトキシリン
で２０秒間染色した。陰性対照は一次抗体を除くか、または同じイソ型の無関係
の一次抗体を用いて行った。精製したバキュウロウイルス免疫原を用いてもう一
方の陰性対照として９Ｄ９抗体の結合をブロックした。これらの実験では、抗体
をＰＢＳ中で１０倍モル過剰のＶＥＧＦＲ−３ＥＣタンパク質とともに一晩イン
キュベートした。４０００ｒｐｍ、４℃、４分間の遠心分離後、上清を注意深く
回収し、次ぎに一次抗体として用いた。抗ＶＥＧＦＲ−３抗体で染色したものに
隣接する５μｍの凍結切片を、血管内皮マーカーＰＡＬ−Ｅ（０．１５μｇ／ｍ
ｌ, Monosan, Uden, the Netherlands）、ラミニン（ＬＡＭ−８９１, Sigma, S
t Louis, MOの上清の１：４０００希釈）、コラーゲンXVIII（１．９μｇ／ｍｌ
）、α−平滑筋アクチン（SMA, ０．５μｇ／ｍｌ, クローンＩＡ４, Sigma）、
ＶＥＧＦＲ−１（クローン１９の上清の１：２００希釈）またはＶＥＧＦＲ−２
（１：１００希釈）に関して免疫染色した。
【０２３４】 上記試料のすべての病理学検査は、上記染色手順後に行われた。血管の密度は
、ＧａｓｐａｒｉｎｉおよびＨａｒｒｉｓによって薦められたガイドラインに従
って、ＰＡＬ−Ｅ［ｄｅＷａａｌ等、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１５０：１９
５１〜１９５７（１９９７）］に対して染色されたスライドから得られた。［Ｇ
ａｓｐａｒｉｎｉＧ、およびＨａｒｒｉｓＡ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１
３：７６５〜７８２（１９９５）］ＶＥＧＦＲ−３の正の血管密度は同様に研究
された。スライドは最初に低倍率で走査され、次に腫瘍内血管密度は、最も高い
血管密度（「血管ホットスポット」）を有する領域または最も高いＶＥＧＦＲ−
３正血管密度を有する領域において４００倍の倍率の高電界（ｈｐｆ）当りの染
色された血管の数を数えることによって決められた。１スライドにつき最低５つ
の電界が計数された後、３つの最高計数値が平均された。
【０２３５】 二重染色は、２つの導管内の癌腫において小リンパ管および血管の免疫組織化
学染色を区別するために行われた。アセトン固定の５μｍの低温部分は、抗ＰＡ
Ｌ−Ｅ抗体で一時間、ビオチン化された馬の抗マウス抗体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉ
ｎＥｌｉｔｅＭｏｕｓｅＩｇＧ ＡＢＣキット、Ｖｅｃｔｏｒ研究所、米国バー
リンゲーム）で３０分間、ＡＢＣ−ペルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ、
１：１００）で４５分間培養され、最終的にＡＥＣで１０分間現像された。第二
工程は、上記部分が、ＩＳＨ信号向上のために文献に前に記載された手順に従っ
て、抗ＶＥＧＦＲ−３抗体で１時間（０．１４μｇ／ｍｌ）、次にビオチン化抗
マウス抗体によって３０分間（クローンの上澄みの１：２００の希釈）、ＡＢＣ
ペルオキシダーゼで３０分間（１：１００）、０．０１％の過酸化物を含有して
いるビオチン化チラミン溶液（１：２０００）で５分間、ＡＢＣアルカリ性ホス
ファターゼ（１：１００）で２０分間培養され、ＦａｓｔＢｌｕｅ（Ｓｉｇｍａ
、米国セントルイス）で２０分間現像された。［Ｋｅｒｓｔｅｎｓ等、Ｊ．Ｈｉ
ｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．、４３：３４７〜３５２（１９９５）］二
重に染色された部分に隣接している低温部分（５μｍ）はまた、ＶＥＧＦＲ−３
抗体でのみ上述したように免疫染色された。
【０２３６】 ポリクローン抗体は、成熟し分泌されたヒトの導管内皮成長因子ＣのＮ末端の
アミノ酸残基２〜１８に相当する合成ペプチド（ＶＥＧＦ−Ｃ）（ＶＥＧＦ−Ｃ
プレプロＶＥＧＦ−Ｃ ポリペプチドの残基１０４〜１２０）に対してウサギに
おいて文献に記載されたように生成された。［Ｊｏｕｋｏｖ等、ＥＭＢＯ Ｊ．
１６：３８９８〜３９１１（１９９７）、参照で全体において準用される］抗血
清は、エポキシで活性化されたセファロース６Ｂカラムに結合された免疫原性の
ポリペプチドを用いてアフィニティー精製され且つＶＥＧＦ−Ｃまたは対照β−
ガラクトシダーゼを表すアデノウイルス性ベクトルで感染された細胞を使用して
、ＶＥＧＦ−Ｃの特定の染色に対して試験された。
【０２３７】 ８つの導管内癌腫およびＶＥＧＦＲ−３に対して分析された侵入癌腫のすべて
は、ＶＥＧＦ−Ｃの発現をさらに分析するために選択された。抗ＶＥＧＦＲ−３
抗体で染色された部分に隣接している５ミクロメートルの低温部分は、冷アセト
ンにおいて１０分間空気乾燥且つ固定された。上記部分はＰＢＳにおいて再度水
和され、５％の正常なヤギの血清において３０分間培養された後、ＰＢＳにおい
て１：２００で希釈されたヒトのＶＥＧＦ−Ｃに対するウサギの多クローン性抗
体で２時間湿気のある雰囲気において室温で培養された。次のビオチン化抗ウサ
ギ血清における３０分間の培養後、ＶｅｃｔａｓｔａｉｎＥｌｉｔｅＲａｂｂｉ
ｔＩｇＧ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ研究所、米国バーリンゲーム）の試薬を
用いて６０分間の培養が行われた。上記部分は、上述したようにさらに処理され
た。負の対照として、精製された免疫原が使用されてＶＥＧＦ−Ｃ抗体の結合を
妨げた。これらの実験において、ＶＥＧＦ−Ｃ抗体は、ＰＢＳにおけるＶＥＧＦ
−Ｃタンパク質の１０倍モル超過で一晩培養された。４分間４０００ｒｐｍ＋４
℃の遠心分離後、上記上澄みは注意深く集められ且つ免疫染色に使用された。
【０２３８】 ヒト型ＸＶＩＩＩコラーゲンに対するモノクローン抗体は、ＤｉａＢｏｒＬｔ
ｄ．（オール、フィンランド）によって、ヒト型ＸＶＩＩＩコラーゲンのＮ端子
ＮＣ１領域の共通領域に相当する組み換えポリペプチドＱＨ４８．１８でマウス
を免疫化することによって生成された［Ｓａａｒｅｌａ等、ＭａｔｒｉｘＢｉｏ
ｌｏｇｙ、１６：３１９〜２８（１９９８）］。クローンは、ポリペプチドＱＨ
４８．１８を使用してＥＬＩＳＡ検定およびＷｅｓｔｅｒｎ分析によって、また
凍結ヒト組織部分の免疫蛍光染色によって篩い分けられた。ハイブリドーマ・ク
ローンの篩い分けの結果、３つの単クローン性抗体は、上述したすべての３つの
検定において正であった（ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎ、免疫蛍光染色）。最も
強い信号を出した抗体の１つ、ＤＢ１４４−Ｎ２は次の実験に使用された。該抗
体は、多クローン性の抗全ヒト（ＸＶＩＩＩ）のパターンに対して（例えば、成
人の皮膚および肝臓の試料において）同一の染色パターンを与えた。
【０２３９】 結果 Ａ． 組織的に正常な胸部組織および良性繊維腺腫におけるＶＥＧＦＲ−３ 正常な胸部組織におけるＶＥＧＦＲ−３の免疫組織化学染色は、導管内の間質
の毛管に非常に弱い染色を示した。これらの導管は特定のパターンを形成しなか
ったが、間質に分散されていた。正常な胸部組織試料におけるＶＥＧＦＲ−３正
導管の密度の範囲はｈｐｆ当り６〜１７で、中央値は９（ｎ＝１２）であった。
このような導管のほとんどは、血管の内皮マーカーＰＡＬ−Ｅおよび基底板成分
、コラーゲンＸＶＩＩＩに対して強く染色され、ここでＶＥＧＦＲ−３は正常な
胸部組織の血管において弱く表されたことを示唆する。しかしながら、間質にお
けるいくつかの細い導管は、ＶＥＧＦＲ−３に対して明瞭に染色されたが、ＰＡ
Ｌ−Ｅに対して負であり且つコラーゲン型ＸＶＩＩＩに対してのみ弱く正であっ
たが、ここで導管が小リンパ管であることを示唆した。ＶＥＧＦＲ−３正導管は
また、良性繊維腺腫において一様に見られたが、ここで導管の密度（中央値はｈ
ｐｆ当り８つの導管；範囲３〜１９；ｎ＝４）は、組織的に正常な胸部組織の密
度（中央値８つの導管、９；Ｐ＞０．１、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験）と異
ならなかった。
【０２４０】 Ｂ．分泌管内癌におけるＶＥＧＦＲ−３陽性癌 分泌管内癌において、 強く染色されたＶＥＧＦＲ−３陽性管の識別パターン
が観察された。この陽性管は、変質管の回りにアーチ状構造を形成していた（図
５Ａ）。また、この「ネックレス」パターンは、血管の内皮の標識ＰＡＫ−Ｅ（
図５Ｂ）についての隣接する区域の染色にも観察され、ＶＥＧＦＲ−３表現が毛
細管内皮で高められたことを示唆していた。血管とリンパ管とをさらに明確に区
別するとともに管壁内の平滑筋細胞および周皮細胞の存在を調べるために、平滑
筋αアクチン（ＳＭＡ）に対する抗体およびラミニンやＸＶＩＩＩタイプのコラ
ーゲンなどの基底板成分を使用して、追加の染色を行った。この染色によれば、
分泌管内癌に近接する小さい管は、同時にＶＥＧＦＲ−３および基底板蛋白質を
示したが、ＳＭＡに対してさらに弱く染色され、これらの管が管壁（図５Ｃ−図
５Ｆの白抜き矢印）内の周皮細胞／平滑筋細胞によって不完全に覆われることを
示した。対照的に、腺管内の病変から離間した大きな血管は、一般にＶＥＧＦＲ
−３に対して陰性であるが、ラミニン、コラーゲンＸＶＩＩＩおよびＳＭＡに対
して陽性である（赤矢印）。また、ＶＥＧＦＲ−３に対して陽性であるが、基底
板蛋白質、ラミニンおよびＸＶＩＩＩタイプのコラーゲンに対して非常に弱く染
色され、ＳＭＡに対して全く染色されない管が発見された（緑矢印）。これらは
、リンパ管を示すものと考えられた。
【０２４１】 Ｃ．血管およびリンパ管の差別的な二重染色 免疫組織化学的二重染色手順によりリンパ管と血管とをさらに明確に区別する
ために、２つの分泌管内癌を選んだ（de Wallら、Am.J.Pathol., １５０、１９
５１−１９５７頁（１９９７年）参照）。この方法を使用して、ＶＥＧＦＲ−３
陽性管を青く染色するとともに、ＰＡＬ−Ｅ陽性管および基底板を茶色に染色し
た。いずれの試験試料も同様の染色パターンを示し、腫瘍で満たした管を内側に
張った管は、主としてＰＡＬ−Ｅ陽性管である（図５Ｇおよび図５Ｈの矢印の頭
部）とともに、おそらくリンパ管であり、腺管内ストロマ内で少し離間したＶＥ
ＧＦＲ−３陽性管は、ＰＡＬ−Ｅ陰性管であった（図５Ｇおよび図５Ｈの黒矢印
）。陽性の二重染色の人為結果による誤った解釈を除外するために、隣接する５
μｍの区域をアンチＶＥＧＦＲ−３だけで染色した。この染色は、ＰＡＬ−Ｅ陽
性血管の幾つかがＶＥＧＦＲ−３に対しても陽性であることを確認した。
【０２４２】 Ｄ．分泌管内癌細胞内のＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２、
および隣接する管内のその受容体 ヒトＶＥＧＦ−Ｃに対する親和性生成したポリクロナール抗体を使用して、８
つの分泌管内癌試料を染色した。いずれの試験試料も少なくとも幾つかのＶＥＧ
Ｆ−Ｃを含んでいたが、染色の強度および表現パターンにおいてかなりの異質性
が観察された。ある場合には、殆どの癌細胞がＶＥＧＦ−Ｃに対して強い陽性で
あるとともに、他の癌細胞では、少しの癌細胞だけが染色信号を与えた。対照的
に、変質しない正常な管の上皮では、非常に少ない染色が観察され、または全く
染色が観察されなかった。抗原阻止実験は、ＶＥＧＦ−Ｃに対する染色が特異的
であることを示した。他のＶＥＧＦ−Ｃ受容体、ＶＥＧＦＲ−２だけでなくＶＥ
ＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ−１）も、分泌管内癌に隣接する同じ「ネックレス」管
内に表現された。
【０２４３】 Ｅ．侵入性乳癌におけるＶＥＧＦＲ−３陽性管およびＶＥＧＦ−Ｃ 検討した全ての侵入性腺管癌および小葉癌には、強く染色したＶＥＧＦＲ−３
陽性管も存在した。ＶＥＧＦＲ−３陽性管は、特異的な分布パターンを形成しな
いように見られ、これらの管の殆どは、ＰＡＬ−Ｅ抗原に対しても免疫反応的で
あった。腫瘍内のＶＥＧＦＲ−３陽性管の密度（中央値２１、範囲：ｈｐｆ当た
り９−５６の管、ｎ＝１２）は、正常な乳房の組織（中央値２１対９、Ｐ＜０．
０００１、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験）と比較して、侵入性乳癌ではかなり
高くなっていた。時折、ＶＥＧＦＲ−３陽性リンパ管への癌細胞の侵入を観察す
ることもできた。
【０２４４】 検討した侵入性癌の中で ＶＥＧＦ−Ｃの免疫染色が強く変化した。幾つかの
癌細胞はＶＥＧＦ−Ｃに対して強い陽性であり、他の癌細胞は非常に弱く染色さ
れ、ある場合には、染色が全く観察されなかった。腺管内の癌のように、これら
の区域における結合組織では、染色が非常に少なく観察され、または全く観察さ
れなかった。
【０２４５】 上記のデータは、殆ど大人の組織内の主にリンパ内皮の標識であるように見え
たＶＥＧＦＲ−３が、正常な乳房の組織の毛細管内皮にも非常に弱く示されるこ
とを明らかにしている。さらに重要なことは、腺管内の癌では、強く染色される
ＶＥＧＦＲ−３の陽性の管の「ネックレス」パターンが、腫瘍で満たされた管が
内側に張られたことを検出されたことである。これらの管の殆どは、血管内皮の
標識ＰＡＬ−Ｅおよび基底板成分、ラミニンおよびコラーゲンＸＶＩＩＩを示し
たが、ＳＭＡに対する抗体を使用して染色することによって示されるように、腫
瘍細胞からさらに離れた所に位置する血管よりも見かけ上少ない周皮細胞／平滑
筋細胞を有していた。これらの特徴は、「ネックレス」管が上述した血管形成で
あったことを示唆している。変質管から離れて配置された第２のグループの管は
、ＶＥＧＦＲ−３に対して陽性であったが、基底板成分に対して非常に弱い陽性
であり、ＰＡＬ−Ｅに対して陰性であり、これらはリンパ管であることを示唆し
た。また、これらの管は、ＳＭＡ陽性の周皮細胞成分も欠乏していた。侵入性乳
癌においても、ＶＥＧＦＲ−３はＰＡＬ−Ｅ陽性血管において上方に調整されて
いたが、見られた血管パターンは、腫瘍細胞の回りの結合組織のストロマ内にさ
らにランダムに組織されていた。これらの結果は、ＶＥＧＦＲ−３表現が、腫瘍
の成長と関連する血管形成中に乳癌において上方に調整されることを示している
。原位置の癌において発見された非常に多くの数のＶＥＧＦＲ−３陽性管は、癌
細胞がその癌細胞のすぐ近くの血管の成長を活性化する要因となるという仮説に
適合している。
【０２４６】 ＶＥＧＦ−Ｃは、ＶＥＧＦＲ−３とＶＥＧＦＲ−２の両方と高い親和性で結合
し、腺管内および侵入性癌細胞のいずれもＶＥＧＦ−Ｃ蛋白質に対して陽性に染
色することが多かったので、この成長の要因が、癌におけるＶＥＧＦＲ−３およ
びＶＥＧＦＲ−２陽性管に対する成長の要因候補である。これらのデータは、３
５の殆ど半分が（乳癌、扁平上皮癌、リンパ腫、黒色腫および肉腫を含む）悪性
の侵入性腫瘍を選択せず、ノーザンブロット法分析においてＶＥＧＦ−ＣｍＲＮ
Ａを含んでいた他の研究と一致している（Ｓａｌｖｅｎら、Am.J.Pathol., １５
３（１）、１０３−１０８頁（１９９８年７月）参照）。ここで報告したデータ
は、集合的に乳癌の治療の指示を提供し、ＶＥＧＦＲ−３やＶＥＧＦＲ−２のＶ
ＥＧＦ−Ｃ介在シミュレーションを阻止する因子を有する他の非リンパ癌も提供
する可能性がある。期待される遮断薬は、抗ＶＥＧＦ−Ｃ抗体、抗ＶＥＧＦＲ−
３抗体、抗ＶＥＧＦＲ−２抗体、ＶＥＧＦＲ−３およびＶＥＧＦＲ−２またはＶ
ＥＧＦＲ−１と結合する二特異性（bispecific）抗体、循環ＶＥＧＦ−Ｃを結合
するＶＥＧＦＲ−３の可溶性の細胞外領域の断片、ＶＥＧＦＲ−３やＶＥＧＦＲ
−２を結合させ且つこのような受容体の活性化を示すＶＥＧＦ−Ｃ断片および類
似体、 ＶＥＧＦＲ−３やＶＥＧＦＲ−２を結合させ且つ適当な治療薬と接合す
るＶＥＧＦ−Ｃのポリペプチド、断片および類似体、ＶＥＧＦＲ−３チロシンキ
ナーゼ阻害剤、およびこれらの受容体を結合させ且つ阻害する小さい分子を含む
。また、ＶＥＧＦ−ＤはＶＥＧＦＲ−３およびＶＥＧＦＲ−２の両方を結合させ
るので、抗ＶＥＧＦ−Ｄ抗体および抑制ＶＥＧＦ−Ｄの断片および類似体も適当
な遮断薬であることが期待される。ヒト抗体、または抗体薬をヒト治療のために
選択される程度までヒト化した抗体およびその断片が好ましい。また、本発明の
他の見地として、例えば、悪性および悪性の広がりのための診断およびスクリー
ニングのために、哺乳類の組織を生体外または生体内で評価するために、上述し
た遮断薬のいずれかを使用することが期待される。
【０２４７】 上述した遮断薬のいずれについても、放射性同位元素（例えば１４Ｃ、１３３ Ｉおよび１２５Ｉ）、発色団（例えばフルオレセイン、フィコビリプロティエン
、テトラエチルローダミン、蛍光による検出のために蛍光または着色生成物を生
成する酵素、電子顕微鏡検査による検出のための電子密度の高い生成物を生成す
る吸光度、可視色または凝集反応）、またはフェリチン、ペルオキシダーゼ、金
のビーズのような電子密度の高い分子などを含む検出可能なラベルの付加によっ
て、診断およびスクリーニングのために遮断薬をさらに改良してもよいことが期
待される。
【０２４８】 同様に、植物、動物、微生物または菌類の起源の毒素のような抗腫瘍性特性を
有する分子、放射性同位元素、薬剤、酵素、シトキン（cytokines）および他の
治療蛋白質を付加（例えば接合）またはこれらとともに投与することによって、
治療のために遮断薬をさらに改良してもよい（例えばPieterszおよびMcKenzie（
癌の治療用抗体接合体）、Immunological Reviews、１２９、５７―８０頁（１
９９２年）参照）。
【０２４９】 例２９ ヒトの治療薬として投与するための抗Ｆｌｔ４抗体 Ａ．抗Ｆｌｔ４モノクローナル抗体のヒト化 本明細書、例えば例２８に記載のＦｌｔ４の生物学は、Ｆｌｔ４レセプターの
リガンド依存性シグナル形成を遮断するＦｌｔ４インヒビター（アンタゴニスト
）に対する治療薬の使用を示している。Ｆｌｔ４中和抗体は、Ｆｌｔ４アンタゴ
ニストとして用いられる治療薬の一つのクラスを含んでなる。下記のものは、抗
Ｆｌｔ４モノクローナル抗体を「ヒト化」してそれらの血清中半減期を向上させ
かつヒト宿主における免疫原性を少なくする（すなわち、非ヒト抗Ｆｌｔ４抗体
に対するヒト抗体の応答を防止する）ことによって、モノクローナル抗体のヒト
における治療薬としての有用性を向上させるためのプロトコールである。
【０２５０】 ヒト化の原理は文献に記載されており、抗体タンパク質のモジュール配置によ
って促進される。補体結合の可能性を最小限にするには、ＩｇＧ４アイソタイプ
のヒト化抗体が好ましい。
【０２５１】 例えば、ヒト化のレベルは、本明細書記載の抗Ｆｌｔ４モノクローナル抗体の
ような目的とする非ヒト抗体タンパク質の可変ドメインをヒト抗体分子の定常ド
メインと共に含んでなるキメラ抗体を生成することによって達成される（例えば
、Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1989)を参照）。Ｆｌｔ４中和
抗Ｆｌｔ４抗体の可変ドメインは、Ｂ細胞ハイブリドーマのゲノムＤＮＡまたは
目的とするハイブリドーマから単離したｍＲＮＡから生成したｃＤＮＡからクロ
ーニングされる。Ｖ領域遺伝子断片をヒト抗体定常ドメインをコード化するエキ
ソンに連結し、生成する構築物を適当な方法に宿主細胞（例えば、骨髄腫または
ＣＨＯ細胞）中で発現させる。
【０２５２】 ヒト化のレベルを更に高くするため、非ヒトモノクローナル抗体遺伝子の抗原
結合相補性決定領域（「ＣＤＲ」）をコードする可変領域遺伝子断片の部分のみ
をヒト抗体配列中にクローニングする［例えば、Jones et al., Nature, 321:52
2-525 (1986); Riechman et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et
al., Science, 239:1534-36 (1988); およびTempest et al., Bio/Technology,
9:266-71 (1991)を参照］。必要ならば、ＣＤＲ３領域を取り巻くヒト抗体のβ
−シート骨格も改質して、もとのモノクローナル抗体の抗原結合ドメインの三次
元構造を一層緊密に反映させる（Kettleborough et al., Protein Engin, 4:773
-783 (1991);およびFoote et al., J. Mol. Biol., 224:487-499 (1992)を参照
）。
【０２５３】 もう一つの方法では、目的とする非ヒトモノクローナル抗体の表面を、非ヒト
抗体の内部を総て保持して残基を接触させたまま、非ヒト抗体の選択された表面
残基を変更することによって、例えば位置指定突然変異誘発によって、ヒト化す
る。Padlan, Molecular Immunol., 28(4/5):489-98 (1991)を参照されたい。
【０２５４】 上記の方法は、Ｆｌｔ４を中和するＦｌｔ４モノクローナル抗体およびそれら
を生成するハイブリドーマ、例えば抗体９Ｄ９Ｆ９を用いて用いられ、Ｆｌｔ４
発現が有害な症状を治療しまたは緩和する治療薬として有用なヒト化したＦｌｔ
４中和抗体を生成させる。
【０２５５】 Ｂ．ファージディスプレー由来のヒトＦｌｔ４中和抗体 ヒトＦｌｔ４中和抗体は、Aujame et al., Human Antibodies, 8(4):155-168
(1997); Hoogenboom, TIBTECH, 15:62-70 (1997); およびRader et al., Curr.
Opin. Biotechnol., 8:503-508 (1997)に記載のファージディスプレー法によっ
て生成し、上記文献の総ての内容は、その開示の一部として本明細書に引用され
る。例えば、Ｆａｂ断片または連結した単一鎖Ｆｖ断片の形態での抗体可変領域
を繊維状ファージマイナーコートタンパク質ｐIIIに融合させる。融合タンパク
質を発現しこれを成熟ファージコートに組み入れると、表面に抗体を示しかつ抗
体をコードする遺伝子材料を含むファージ粒子を生じる。このような構築物を含
んでなるファージライブラリーを細菌で発現させ、ライブラリーを標識または固
定したＦｌｔ４を抗原プローブとして用いてＦｌｔ４特異的ファージ抗体につい
てパンニング（スクリーニング）する。
【０２５６】 Ｃ．トランスジェニックマウス由来のヒトＦｌｔ４中和抗体 ヒトＦｌｔ４中和抗体は、Bruggemann and Neuberger, Immunol. Today, 17(8
):391-97 (1996)およびBruggemann and Taussig, Curr. Opin. Biotechnol., 8:
455-58 (1997)に本質的に記載されている方法でトランスジェニックマウスで生
成させる。生殖系列配置でヒトＶ遺伝子セグメントを有し、これらのトランスジ
ーンをリンパ系組織で発現するトランスジェニックマウスを、通常の免疫法を用
いてＦｌｔ４組成物で免役する。ハイブリドーマを、通常の方法を用いて免疫マ
ウス由来のＢ細胞を用いて生成させ、スクリーニングを行って抗Ｆｌｔ４ヒト抗
体（例えば、上記のもの）を分泌するハイブリドーマを同定する。
【０２５７】 Ｄ．二重特異性抗体 Ｆｌｔ４に特異的に結合しかつ病因および／または治療に関連する他の抗原に
特異的に結合する二重特異性抗体を、文献に記載されている標準的方法を用いて
生成させ、単離して、試験する。例えば、Pluckthum & Pack, Immunotechnology
, 3:83-105 (1997); Carter et al., J. Hematotherapy, 4: 463-470 (1995); R
enner & Pfreundschuh, Immunological Reviews, 1995, No. 145, pp. 179-209;
Pfreundschuhの米国特許第５，６４３，７５９号明細書; Segal et al., J. He
matotherapy, 4:377-382 (1995); Segal et al., Immunobiology, 185: 390-402
(1992); およびBolhuis et al., Cancer Immunol. Immunother., 34: 1-8 (199
1)を参照されたい。上記文献の総ての内容は、その開示の一部として本明細書に
引用される。
【０２５８】 例３０ 癌の治療のための抗Ｆｌｔ４療法の効果を示すための動物モデル 癌治療のための任意の認められた動物を用いて、癌治療のための抗Ｆｌｔ４療
法の効果を示すことができると考えられる。標準的な用量−応答研究を用いる乳
癌の治療の効果を示す代表的なモデルとしては、Tekmal and Durgam, Cancer Le
tt., 118 (1): 21-28 (1997); Moshakis et al., Br. J. Cancer, 43: 575-580
(1981); およびWilliams et al., J. Nat. Cancer Inst., 66: 147-155 (1981)
に記載されているものが挙げられる。ネズミモデルの他に、イヌおよびブタモデ
ルが考えられるが、少なくともある種の抗ヒトＦｌｔ４抗体（例えば、９Ｄ９抗
体）はイヌおよびブタ由来のＦｌｔ４も認識するからである。腫瘍の大きさおよ
び副作用を観察して、コントロールに対する治療効果を示す。
【０２５９】 本発明の概要または詳細な説明に引用されている特許明細書および文献などの
総ての文書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
【０２６０】 本発明を具体的態様について記載してきたが、本発明は更に改質することが可
能であり、また、本出願明細書は、一般的に本発明の原理に従って本発明の任意
の変化、用途または翻案をカバーし、本発明が関係する技術の範囲内での既知ま
たは通常の実施の範囲内に収まり、上記の本質的特徴に適用することができ、特
許請求の範囲に示されるような本開示からの離反を包含するものであることが理
解されるであろう。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 Ｆｌｔ４ｃＤＮＡクローン構造の略図である。
【図１Ｂ】 ノーザンハイブリダイゼーションゲルの写真複写である。
【図２】 Ａ〜Ｆ：Ｆｌｔ４の構造的特徴の略図とＦｌｔ１チロシンキナーゼ配列との比
較を示す。
【図３Ａ】 クローンＪ．１．１およびＩ．１．１のｃＤＮＡ挿入物３’末端の略図である
。
【図３Ｂ】 アンチセンスＲＮＡプローブと長鎖型および短鎖型Ｆｌｔ４ＲＮＡとのハイブ
リダイゼーションのオートラジオグラフの写真複写である。
【図３Ｃ】 アンチセンスＲＮＡプローブと長鎖型および短鎖型Ｆｌｔ４ＲＮＡとのハイブ
リダイゼーションのオートラジオグラフの写真複写である。
【図４】 異なる種由来のＤＮＡサンプルのＦｌｔ４配列のハイブリダイゼーション解析
を示すゲルの写真複写である。
【図５】 脈管内癌においてＶＥＧＦＲ−３を発現する血管の免疫組織化学的特徴を示す
。隣接する部分（図５Ａ、Ｂ）では、ＶＥＧＦＲ−３およびＰＡＬ−Ｅが癌細胞
で占められた脈管周囲に類似したパターンの「ネックレス」管（矢印）を与えて
いる。別の隣接する部分群とＶＥＧＦＲ−３（図５Ｃ）、ラミニン（図５Ｄ）、
コラーゲンＸＶIII（図５Ｅ）およびＳＭＡ（図５Ｆ）に関する染色とを比較し
た。ＰＡＬ−ＥおよびＶＥＧＦＲ−３（図５Ｇ）に関する二重染色とＶＥＧＦＲ
−３単独（図５Ｈ）に関して染色した隣接する部分との比較。影響を受けた脈管
に隣接する血管は二重陽性であり（矢印）、ＶＥＧＦＲ−３陽性血管は脈管間ス
トロマにある影響を受けた脈管から少し離れたところに存在する（矢印）。基底
膜が二重染色手順においてＰＡＬ−Ｅに関し陽性であることには留意のこと；拡
大写真：図５Ａ、Ｂ ４００倍、図５Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ ３２０倍、図５Ｅ、Ｆ
４８０倍。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 ヘルシンキ、ユニバーシティ、ライセンシ ング、リミテッド、オサケ、ユキチュア ＨＥＬＳＩＮＫＩ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＬＩＣＥＮＳＩＮＧ ＬＴＤ． ＯＹ フィンランド国ヘルシンキ、ビーキンカー リ、６ (72)発明者 カリ、アリタロ フィンランド国ヘルシンキ、ピー．オー． ボックス、21、（ハールトマニンカトゥ、 ３）、ユニバーシティー、オブ、ヘルシン キ、ハールトマン、インスティテュート (72)発明者 アルジャ、カイパイネン フィンランド国ヘルシンキ、ピー．オー． ボックス、21、（ハールトマニンカトゥ、 ３）、ユニバーシティー、オブ、ヘルシン キ、ハールトマン、インスティテュート (72)発明者 レイジャ、バルトーラ フィンランド国ヘルシンキ、ピー．オー． ボックス、21、（ハールトマニンカトゥ、 ３）、ユニバーシティー、オブ、ヘルシン キ、ハールトマン、インスティテュート (72)発明者 ロツタ、ユシラ フィンランド国ヘルシンキ、ピー．オー． ボックス、21、（ハールトマニンカトゥ、 ３）、ユニバーシティー、オブ、ヘルシン キ、ハールトマン、インスティテュート Ｆターム(参考） 4C084 AA17 AA20 ZB261 ZB262 ZC202 4C085 KA03 KA09 KA26 LL18

Claims (34)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 悪性腫瘍に隣接する血管の内皮細胞におけるＦｌｔ４受容体チロシンキナーゼ
    （Ｆｌｔ４）の発現によって特徴づけられる腫瘍性疾患を患う哺乳類生物を治療
    する方法であって、 かかる治療を必要とする哺乳類生物に、Ｆｌｔ４リガンドタンパク質と該生物
    の血管内皮細胞で発現されるＦｌｔ４との結合を阻害するのに有効な化合物を含
    んでなる組成物を投与し、それによりＦｌｔ４によって媒介される該血管内皮細
    胞の増殖を阻害する 工程を含んでなる、方法。
  2. 【請求項２】 悪性腫瘍に隣接する血管の内皮細胞におけるＦｌｔ４受容体チロシンキナーゼ
    （Ｆｌｔ４）の発現によって特徴づけられる腫瘍性疾患を患う哺乳類生物を治療
    する請求項１に記載の方法であって、 （ａ）哺乳類生物をスクリーニングしてこれらの生物に由来する悪性腫瘍に隣
    接する血管におけるＦｌｔ発現内皮細胞の有無を判定し； （ｂ）スクリーニング工程から、悪性腫瘍に隣接する血管におけるＦｌｔ発現
    内皮細胞の存在によって特徴づけられる悪性腫瘍を有すると判定される生物を選
    択し；さらに （ｃ）選択された生物に、Ｆｌｔ４リガンドタンパク質と該生物の血管内皮細
    胞で発現されるＦｌｔ４との結合を阻害するのに有効な化合物を含んでなる組成
    物を投与し、それによりＦｌｔ４によって媒介される該血管内皮細胞の増殖を阻
    害する 工程を含んでなる、方法。
  3. 【請求項３】 腫瘍性疾患が癌腫、扁平上皮癌、リンパ腫、黒色腫および肉腫からなる群から
    選択される、請求項１または２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 腫瘍性疾患が血管内皮細胞におけるＦｌｔ４の発現によって特徴づけられる乳
    癌である、請求項１または２に記載の方法。
  5. 【請求項５】 生物がヒトである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 【請求項６】 化合物が、 （ａ）抗Ｆｌｔ４抗体の抗原結合断片を含んでなるポリペプチド； （ｂ）可溶性Ｆｌｔ４断片を含んでなるポリペプチド（この断片およびポリペ
    プチドはＦｌｔ４リガンドと結合し得る）； （ｃ）脊椎動物血管内皮増殖因子Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）前駆ポリペプチドの断片
    または類似体を含んでなるポリペプチド（このポリペプチドおよび断片または類
    似体は天然の宿主細胞で発現されるＦｌｔ４と結合するが、これを刺激すること
    はできない）；および （ｄ）脊椎動物血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）前駆ポリペプチドの断片
    または類似体を含んでなるポリペプチド（このポリペプチドおよび断片または類
    似体は天然の宿主細胞で発現されるＦｌｔ４と結合するが、これを刺激すること
    はできない） からなる群から選択されるポリペプチドを含んでなる、請求項１〜５のいずれか
    一項に記載の方法。
  7. 【請求項７】 化合物が抗Ｆｌｔ４抗体の抗原結合断片を含むポリペプチドを含んでなる、請
    求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 化合物が二重特異性抗体またはその断片を含んでなり、該抗体または断片が、
    Ｆｌｔ４と特異的に結合する抗原結合ドメインと、リンパ系内皮には実質的に存
    在しない血管内皮マーカー抗原と特異的に結合する抗原結合ドメインとを含む、
    請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  9. 【請求項９】 血管内皮マーカー抗原がＰＡＬ−Ｅ、ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２か
    らなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 化合物が抗Ｆｌｔ４抗体またはその抗原結合断片を含んでなる、請求項１〜５
    のいずれか一項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 抗Ｆｌｔ４抗体はヒト化抗体である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の
    方法。
  12. 【請求項１２】 化合物が二重特異性抗体と結合した抗腫瘍薬をさらに含んでなる、請求項６〜
    １１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 化合物が検出可能な標識をさらに含んでなる、請求項１〜１２のいずれか一項
    に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 組成物が医薬上許容される希釈剤、アジュバントまたは担体媒質をさらに含ん
    でなる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 脊椎生物由来の組織の腫瘍のイメージング法であって、 （ａ）腫瘍を含むと疑いがある脊椎生物組織と、Ｆｌｔ４結合化合物を含んで
    なる組成物とを接触させ； （ｂ）その組織において細胞に結合したＦｌｔ４結合化合物を検出し；さらに （ｃ）Ｆｌｔ４結合化合物が結合した血管内皮細胞を同定することにより固形
    腫瘍を造画し、Ｆｌｔ４を発現する血管が組織における腫瘍の存在および位置に
    相関している 工程を含んでなる、方法。
  16. 【請求項１６】 組織がヒト組織を含んでなる、請求項１５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 接触工程の後、造画工程の前に、組織から組織中のＦｌｔ４と結合していない
    Ｆｌｔ４結合化合物を除去する条件下で組織を洗浄する工程をさらに含んでなる
    、請求項１５または１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 Ｆｌｔ４結合化合物が、 （ａ）抗Ｆｌｔ４抗体の抗原結合断片を含んでなるポリペプチド； （ｂ）脊椎動物血管内皮増殖因子Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）前駆ポリペプチドの断片
    または類似体を含んでなるポリペプチド（このポリペプチドおよび断片または類
    似体は細胞で発現されるＦｌｔ４と結合する）；および （ｃ）脊椎動物血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）前駆ポリペプチドの断片
    または類似体を含んでなるポリペプチド（このポリペプチドおよび断片または類
    似体は細胞で発現されるＦｌｔ４と結合する） からなる群から選択されるポリペプチドを含んでなる、請求項１５〜１７のいず
    れか一項に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 化合物が抗Ｆｌｔ４抗体の抗原結合断片を含むポリペプチドを含んでなる、請
    求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 Ｆｌｔ４結合化合物が抗Ｆｌｔ４抗体またはその抗原結合断片を含んでなる、
    請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 抗Ｆｌｔ４抗体がヒト化抗体である、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載
    の方法。
  22. 【請求項２２】 化合物がそれに共有結合した検出可能な標識をさらに含んでなる、請求項１５
    〜２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 組織と、リンパ系内皮細胞には実質的に存在しない血管内皮マーカーと特異的
    に結合する第２の化合物とを接触させ；さらに 組織において細胞と結合した第２の化合物を検出する 工程をさらに含んでなり、 造画工程が、Ｆｌｔ４結合化合物と第２の化合物の双方で標識された血管を同
    定することを含んでなり、ここでＨｌｔ４結合化合物と第２の化合物の双方で標
    識された血管が組織における腫瘍の存在および位置に相関している、 請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 血管内皮マーカーがＰＡＬ−Ｅ、ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２からな
    る群から選択される、請求項２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 Ｆｌｔ４結合化合物が二重特異性抗体またはその断片を含んでなり、該抗体ま
    たは断片が、Ｆｌｔ４と特異的に結合する抗原結合ドメインと、リンパ系内皮に
    は実質的に存在しない血管内皮マーカー抗原と特異的に結合する抗原結合ドメイ
    ンとを含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 腫瘍内皮細胞の変化によって特徴づけられる疾病のスクリーニング方法であっ
    て、 （ａ）腫瘍内皮細胞の変化によって特徴づけられる病状にあると疑われる脊椎
    生物から組織サンプルを採取し； （ｂ）その組織サンプルを、その生物の細胞によって発現されたＦｌｔ４受容
    体キナーゼ（Ｆｌｔ４）と特異的に結合する化合物を含んでなる組成物に曝し； （ｃ）その組織サンプルを洗浄し；さらに （ｄ）組織サンプルにおいて化合物の存在、量または分布を検出することによ
    って疾病をスクリーニングし、血管内皮細胞におけるＦｌｔ４発現が、腫瘍内皮
    細胞の変化によって特徴づけられる疾病のマーカーとして同定される 工程を含んでなる、方法。
  27. 【請求項２７】 組織サンプルを、血管内皮マーカーと特異的に結合する第２の化合物に曝すこ
    とをさらに含んでなり、かつ、スクリーニング工程が、Ｆｌｔ４に結合する化合
    物と腫瘍内皮細胞に結合した第２の化合物を検出して、Ｆｌｔ４および血管内皮
    マーカーの双方を発現する内皮細胞の存在、量または分布を求める、請求項２６
    に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 哺乳類の腫瘍内皮細胞を検出する方法であって、 （ａ）哺乳類Ｆｌｔ４受容体チロシンキナーゼ（Ｆｌｔ４）と特異的に結合す
    る第１の化合物を含んでなる組成物を哺乳類に投与し；さらに （ｂ）腫瘍内皮細胞と結合した第１の化合物を検出し、それによりその生物に
    おける腫瘍内皮細胞を検出する 工程を含んでなる、方法。
  29. 【請求項２９】 血管内皮マーカーと特異的に結合する第２の化合物を哺乳類に投与することを
    さらに含んでなり、かつ、検出工程が、腫瘍内皮細胞と結合した第１および第２
    の化合物を検出することを含んでなる、請求項２８に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 悪性腫瘍と隣接するＦｌｔ４発現血管によって特徴づけられる悪性腫瘍の診断
    スクリーニング、イメージングまたは治療のための医薬の製造における、Ｆｌｔ
    ４受容体チロシンキナーゼと結合する化合物の使用。
  31. 【請求項３１】 化合物が、 （ａ）抗Ｆｌｔ４抗体の抗原結合断片を含んでなるポリペプチド； （ｂ）可溶性Ｆｌｔ４断片を含んでなるポリペプチド（この断片およびポリペ
    プチドはＦｌｔ４リガンドと結合し得る）； （ｃ）脊椎動物血管内皮増殖因子Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）前駆ポリペプチドの断片
    または類似体を含んでなるポリペプチド（このポリペプチドおよび断片または類
    似体は天然の宿主細胞で発現されるＦｌｔ４と結合するが、これを刺激すること
    はできない）；および （ｄ）脊椎動物血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）前駆ポリペプチドの断片
    または類似体を含んでなるポリペプチド（このポリペプチドおよび断片または類
    似体は天然の宿主細胞で発現されるＦｌｔ４と結合するが、これを刺激すること
    はできない） からなる群から選択される、請求項３０に記載の使用。
  32. 【請求項３２】 化合物が抗Ｆｌｔ４抗体、またはその抗原結合断片を含んでなる、請求項３０
    に記載の使用。
  33. 【請求項３３】 化合物が二重特異性抗体またはその断片を含んでなり、該抗体または断片が、
    Ｆｌｔ４と特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、さらに、リンパ系内皮に
    は実質的に存在しない血管内皮マーカー抗原と特異的に結合する抗原結合ドメイ
    ンを含む、請求項３０に記載の使用。
  34. 【請求項３４】 抗体がヒト化抗体である、請求項３２および３３記載の使用。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010520989A (ja) * 2006-11-16 2010-06-17 ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ 生体試料の連続分析
US8822147B2 (en) 2006-11-16 2014-09-02 General Electric Company Sequential analysis of biological samples
US9201063B2 (en) 2006-11-16 2015-12-01 General Electric Company Sequential analysis of biological samples
US9677125B2 (en) 2009-10-21 2017-06-13 General Electric Company Detection of plurality of targets in biological samples

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6818220B1 (en) 1994-11-14 2004-11-16 Licentia Ltd. Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) protein and gene mutants thereof, and uses thereof
US6361946B1 (en) 1997-02-05 2002-03-26 Licentia Ltd Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) protein and gene, mutants thereof, and uses thereof
US7727761B2 (en) 1995-08-01 2010-06-01 Vegenics Limited Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) protein and gene, mutants thereof, and uses thereof
AU710696C (en) 1995-09-08 2002-10-24 Genentech Inc. VEGF-related protein
US7125714B2 (en) 1997-02-05 2006-10-24 Licentia Ltd. Progenitor cell materials and methods
WO2000021560A1 (en) * 1998-10-09 2000-04-20 Ludwig Institute For Cancer Research Flt4 (VEGFR-3) AS A TARGET FOR TUMOR IMAGING AND ANTI-TUMOR THERAPY
US7223724B1 (en) 1999-02-08 2007-05-29 Human Genome Sciences, Inc. Use of vascular endothelial growth factor to treat photoreceptor cells
EP1553414A1 (en) * 1999-04-13 2005-07-13 Medarex, Inc. Methods for the diagnosis and treatment of metastatic prostate tumors
AU3988401A (en) 2000-02-25 2001-09-03 Ludwig Inst Cancer Res Materials and methods involving hybrid vascular endothelial growth factor dnas and proteins
NZ518077A (en) 2000-08-04 2003-11-28 Human Genome Sciences Inc Biologically active fragments, analogues and derivatives of VEGF-2 for the treatment of peripheral artery diseases such as critical limb ischemia and coronary disease
US7611711B2 (en) 2001-01-17 2009-11-03 Vegenics Limited VEGFR-3 inhibitor materials and methods
ATE359300T1 (de) 2001-01-19 2007-05-15 Ludwig Inst Cancer Res Flt4 (vegfr-3) als ein ziel für krebs darstellung und anti-krebs-behandlung
DE60236646D1 (de) 2001-04-13 2010-07-22 Human Genome Sciences Inc Anti-VEGF-2 Antikörper
US9994853B2 (en) 2001-05-18 2018-06-12 Sirna Therapeutics, Inc. Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference
US7109165B2 (en) 2001-05-18 2006-09-19 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
WO2003002144A1 (en) * 2001-06-26 2003-01-09 Imclone Systems Incorporated Bispecific antibodies that bind to vegf receptors
US20030113324A1 (en) * 2001-10-01 2003-06-19 Kari Alitalo Neuropilin/VEGF-C/VEGFR-3 materials and methods
US9657294B2 (en) 2002-02-20 2017-05-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US9181551B2 (en) 2002-02-20 2015-11-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
EP1432724A4 (en) * 2002-02-20 2006-02-01 Sirna Therapeutics Inc RNA inhibition mediated inhibition of MAP KINASE GENES
US8003613B2 (en) 2003-11-17 2011-08-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Methods and compositions for inducing apoptosis
US7858769B2 (en) 2004-02-10 2010-12-28 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using multifunctional short interfering nucleic acid (multifunctional siNA)
WO2005087177A2 (en) 2004-03-05 2005-09-22 Ludwig Institute For Cancer Research Chimeric anti-vegf-d antibodies and humanized anti-vegf-d antibodies and methods of using same
US10508277B2 (en) 2004-05-24 2019-12-17 Sirna Therapeutics, Inc. Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference
WO2007022287A2 (en) 2005-08-15 2007-02-22 Vegenics Limited Modified vegf and pdgf with improved angiogenic properties
EP2538965B1 (en) 2010-02-25 2017-04-12 Schepens Eye Research Institute Therapeutic compositions for the treatment of dry eye disease
WO2012058210A1 (en) 2010-10-29 2012-05-03 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACIDS (siNA)
US20150246118A1 (en) 2012-10-26 2015-09-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Lyve-1 antagonists for preventing or treating a pathological condition associated with lymphangiogenesis
US9745558B2 (en) 2013-02-18 2017-08-29 Vegenics Pty Limited VEGFR-3 ligand binding molecules and uses thereof
US10274503B2 (en) 2013-05-08 2019-04-30 Vegenics Pty Limited Methods of using VEGF-C biomarkers for age-related macular degeneration (AMD) diagnosis
KR102131370B1 (ko) 2013-10-18 2020-07-08 삼성전자주식회사 Vegf-c에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 그의 용도
CN114262683B (zh) * 2022-03-01 2022-06-17 中国科学院动物研究所 一种表达vegfr3 d2多肽的细菌制剂及其构建方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998005323A2 (en) * 1996-08-02 1998-02-12 The Children's Medical Center Corporation Method of regulating the female reproductive system through angiogenesis inhibitors

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4652639A (en) 1982-05-06 1987-03-24 Amgen Manufacture and expression of structural genes
US4543439A (en) 1982-12-13 1985-09-24 Massachusetts Institute Of Technology Production and use of monoclonal antibodies to phosphotyrosine-containing proteins
AU3934085A (en) 1984-01-30 1985-08-09 Icrf Patents Ltd. Improvements relating to growth factors
IL85688A0 (en) 1987-03-11 1988-08-31 Erba Carlo Spa Immunoglobulin conjugates,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
ES2092468T3 (es) 1988-01-22 1996-12-01 Zymogenetics Inc Metodos para producir analogos de receptores secretados.
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5198359A (en) 1989-03-07 1993-03-30 Boehringer Ingelheim International Gmbh Recombinant protein receptor for il-2
EP0474744B1 (en) 1989-05-22 1994-08-03 Zymogenetics, Inc. Pdgf -alpha- receptor
US5183884A (en) 1989-12-01 1993-02-02 United States Of America Dna segment encoding a gene for a receptor related to the epidermal growth factor receptor
ES2147729T3 (es) 1991-01-31 2000-10-01 Cor Therapeutics Inc Dominios de la region extracelular de polipeptidos receptores de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano.
US5256766A (en) 1991-02-19 1993-10-26 The Regents Of The University Of California Recombinant thrombin receptor and related pharmaceuticals
CA2083401C (en) 1991-02-22 2003-03-25 Bruce I. Terman Identification of a novel human receptor tyrosine kinase gene
US5231001A (en) 1991-03-14 1993-07-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Trk tyrosine kinase receptor is the physiological receptor for nerve growth factor
US5185438A (en) 1991-04-02 1993-02-09 The Trustees Of Princeton University Nucleic acids encoding hencatoporetic stem cell receptor flk-2
US5270458A (en) 1991-04-02 1993-12-14 The Trustees Of Princeton University Nucleic acids encoding fragments of hematopoietic stem cell receptor flk-2
US5367057A (en) 1991-04-02 1994-11-22 The Trustees Of Princeton University Tyrosine kinase receptor flk-2 and fragments thereof
CA2078539C (en) 1991-09-18 2005-08-02 Kenya Shitara Process for producing humanized chimera antibody
JPH07506242A (ja) 1992-01-09 1995-07-13 ヘルシンキ　ユニバーシティ　ホルディング　リミテッド Ｔｉｅ，新規内皮細胞受容体チロシンキナーゼ
AU3482493A (en) 1992-01-22 1993-09-01 New England Deaconess Hospital Novel protein tyrosine kinases
US5635177A (en) 1992-01-22 1997-06-03 Genentech, Inc. Protein tyrosine kinase agonist antibodies
US6331302B1 (en) 1992-01-22 2001-12-18 Genentech, Inc. Protein tyrosine kinase agonist antibodies
US5776427A (en) 1992-03-05 1998-07-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for targeting the vasculature of solid tumors
US5776755A (en) 1992-10-09 1998-07-07 Helsinki University Licensing, Ltd. FLT4, a receptor tyrosine kinase
US6824777B1 (en) 1992-10-09 2004-11-30 Licentia Ltd. Flt4 (VEGFR-3) as a target for tumor imaging and anti-tumor therapy
CA2145985C (en) 1992-10-28 2003-09-16 Napoleone Ferrara Vascular endothelial cell growth factor antagonists
US5763441A (en) 1992-11-13 1998-06-09 Sugen, Inc. Compounds for the treatment of disorders related to vasculogenesis and/or angiogenesis
US5712395A (en) 1992-11-13 1998-01-27 Yissum Research Development Corp. Compounds for the treatment of disorders related to vasculogenesis and/or angiogenesis
DE4337197C1 (de) 1993-10-30 1994-08-25 Biotest Pharma Gmbh Verfahren zur selektiven Herstellung von Hybridomazellinien, die monoklonale Antikörper mit hoher Zytotoxizität gegen humanes CD16-Antigen produzieren, sowie Herstellung bispezifischer monoklonaler Antikörper unter Verwendung derartiger monoklonaler Antikörper und des CD30-HRS-3-Antikörpers zur Therapie menschlicher Tumore
US5700823A (en) 1994-01-07 1997-12-23 Sugen, Inc. Treatment of platelet derived growth factor related disorders such as cancers
US6608182B1 (en) 1994-03-08 2003-08-19 Human Genome Sciences, Inc. Human vascular endothelial growth factor 2
ES2249762T3 (es) 1994-03-08 2006-04-01 Human Genome Sciences, Inc. Factor de crecimiento del endotelio vascular 2.
GB9410534D0 (en) 1994-05-26 1994-07-13 Lynxvale Ltd Improvements in or relating to growth factor inhibitors
NZ288235A (en) * 1994-06-09 1999-05-28 Orion Corp Monoclonal antibody directed against the receptor tyrosine kinase flt4 and use in diagnosis and therapy
US5763733A (en) 1994-10-13 1998-06-09 Enzon, Inc. Antigen-binding fusion proteins
US6645933B1 (en) 1995-08-01 2003-11-11 Helsinki University Licensing Ltd. Oy Receptor ligand VEGF-C
WO1998033917A1 (en) 1994-11-14 1998-08-06 The Ludwig Institute For Cancer Research Vascular endothelial growth factor c (vegf-c) protein and gene, mutants thereof, and uses thereof
AU710696C (en) 1995-09-08 2002-10-24 Genentech Inc. VEGF-related protein
US6100071A (en) 1996-05-07 2000-08-08 Genentech, Inc. Receptors as novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity and processes for their production
DK0956339T3 (da) 1996-08-23 2006-01-30 Licentia Oy Rekombinant vaskulær endotelcellevækstfaktor D (VEGF-D)
KR100628697B1 (ko) 1997-12-24 2006-09-28 루드빅 인스티튜트 포 캔서 리서치 맥관 내피 성장인자 ｄ를 발현하는 발현 벡터와 셀라인,및 흑색종을 치료하는 방법
WO2000021560A1 (en) * 1998-10-09 2000-04-20 Ludwig Institute For Cancer Research Flt4 (VEGFR-3) AS A TARGET FOR TUMOR IMAGING AND ANTI-TUMOR THERAPY
KR101681886B1 (ko) 2015-04-06 2016-12-12 서울대학교산학협력단 지르코니아 결합능을 가지는 펩타이드

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998005323A2 (en) * 1996-08-02 1998-02-12 The Children's Medical Center Corporation Method of regulating the female reproductive system through angiogenesis inhibitors

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010520989A (ja) * 2006-11-16 2010-06-17 ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ 生体試料の連続分析
US8305579B2 (en) 2006-11-16 2012-11-06 Thomas Pirrie Treynor Sequential analysis of biological samples
US8822147B2 (en) 2006-11-16 2014-09-02 General Electric Company Sequential analysis of biological samples
US9201063B2 (en) 2006-11-16 2015-12-01 General Electric Company Sequential analysis of biological samples
US9518982B2 (en) 2006-11-16 2016-12-13 General Electric Company Sequential analysis of biological samples
US9677125B2 (en) 2009-10-21 2017-06-13 General Electric Company Detection of plurality of targets in biological samples

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