JPS62142123A - ヒト免疫グロブリン結合抗腫瘍剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒト免疫グロブリン結合抗腫瘍剤に関する。

近年、免疫化学の発展にともない、多くの腫瘍関連抗原
が発見され、それに対して選択的に結合する肺癌特異抗
体が開発されてきた。さらに、これらの腫瘍特異抗体に
抗腫瘍性物質を結合さゼ、腫瘍部位へのみ薬剤を集中移
行さゼようという試みがなされている。ここで腫瘍特異
抗体は、腫瘍細胞あるいは腫瘍関連抗原を家兎、馬、羊
等に免疫する手法を用いて作製し、動物血清から免疫グ
ロブリン画分を得て使用している。最近では、腫瘍細胞
あるいは腫瘍関連抗原をマウスに免疫した俊、抗体産生
細胞を取り出し、Ｎ５−１等のマウスミエローマ細胞と
細胞融合させることによりモノクローンの抗腫瘍抗体細
胞を得て、そこから抗腫瘍抗体を取り出している。

これらの試みは、抗腫瘍抗体単独あるいはある種の細胞
毒性物質を抗腫瘍抗体に結合させた形で行なわれている
が、実用化には至っていない。その理由は、上記の抗腫
瘍抗体は、異種動物に免疫して作製している為に、人に
対しては異種蛋白となるからである。つまり異種動物か
ら得られる抗体をヒトに投与した場合、２回目以後の投
与ではアナフィラキシ−等の血清病をさけることが出来
ない為に、１回しか使用出来ないからであり、これは最
大の欠点であった。これを解決するには同種抗体を用い
ることが必要であり、ヒトリンパ球を用いたモノクロー
ナル抗体は理想であるが、まだ研究途上である。

そこで、これらの欠点を改善し、実用性に関する事項を
解決するには、同種抗体の中から腫瘍細胞に集まる抗体
を検索する必要があった。そこで、本発明名らは、鋭意
種々の抗体の　　Ｉ−標識物の生体内分布の検討を行な
った。その結果、一般自然抗体が腫瘍部位に到達し、し
かも長く残留することを見出した。それら免疫グロブリ
ンに抗腫瘍性物質を結合させて、これを担癌個体に投与
すれば薬剤は腫瘍部位に長く留り、抗腫瘍効果を示すこ
とを知って、本発明を完成した。ヒト免疫グロブリン結
合抗腫瘍剤は、異種動物由来抗腫瘍抗体に比べて頻回投
与が可能になったという点又腫瘍部位に長くとどまる点
で最大の特色と利点を有している。したがって本発明は
、実用性の高いヒト免疫グロブリン結合抗腫瘍剤を含有
する新しいタイプの薬剤を１２供するものである。本発
明は、クロラムブヂル、メルフアラン、△ＣＮＵ、シク
ロホスファミドなどのアルキル化剤、ンイ］−マイシン
Ｃ１塩酸ドキソルビシン、塩酸ダウノルビシン、プレオ
マイシン、アクヂノマイシンＤ１ネオカルチノスタチン
などの抗生物質、シタラビン、８−アナグアニン、５−
フルオロウラシル、メソトレキセート、アミノプテリン
ナトリウム、ロイケリンなどの代謝拮抗剤からなる群に
属する細胞毒性の高い抗ＩＦ１！瘍性物質を、極めて穏
和な条件下で、ヒト免疫グロブリンに結合させた新規な
化合物に基づく抗腫瘍剤であり、抗腫７２効果にすぐれ
ながら、細胞毒性は原料の１つである抗腫瘍性物質に比
べて格段に低い抗腫瘍剤を提供することを目的とする。

以下に本発明の詳細な説明する。

近年、種々の抗腫瘍剤が広く使用されており、ある程度
の効果をあげている。これらの抗腫瘍剤として、クロラ
ムブヂル、メルフアラン、ＡＣＮＵ１シクロボスフ７ミ
ド、シタラビン、８−アリ“グアニン、５−フルオロウ
ラシル、メソトレギセ−ト、アミノプテリンナトリウム
、マイトマイシンＣ１塩酸ドキソルごシン、プレオマイ
シン、ダウノルビシン、アクチノマイシンＤ１ザルコマ
イシンのごときものが使用されているが、これらの物質
は、それ自体何れも高い細胞毒性を有していて、投与し
た模に、白血球減少、脱毛、胃腸障害等の副作用を呈す
ることが知られており、その為に、これらの薬剤の使用
に限度があるのが実情である。

また従来から、腫瘍細胞あるいは腫瘍関連抗原に対する
抗体を製造または単離して、これをその腫瘍の治療に用
いる試みがなされているが、望ましい抗腫瘍効果は得ら
れていない。さらに、最近、抗腫瘍抗体に抗腫瘍性物質
を化学的に結合させて１７られる新規な物質による抗腫
瘍効果を期待することが提案されているが、上記物質を
得るための化学反応の条件が過酷すぎるために、十分な
成果は得られていない。また、これらの実験で用いられ
る抗体は、異種動物の抗体を使用していたために、血清
病等の副作用をさけることは出来なかった。

そこで本発明者らは、異種動物から１４られる抗腫瘍抗
体をアフィニティークロマトで精製を行なうという方法
を発明した（特願昭５３−１６１３８８、昭５４−１４
２１５２、昭５４−１４２１５３）。この方法を用いれ
ば高度に抗体を′Ｍ製することが可能であるが、頻回投
与を行なうという点で問題が残っている。

そこで各種の抗体を用いて肺癌到達性を鋭意検討したと
ころ、自然抗体が高濃度で、腫瘍部位に移行し、その滞
留時間も他の臓器よりも長いことが判明した。この事実
に基づいて、クロラムブチル、メルフアラン、ＡＣＮＵ
、シクロホスファミド、シタラビン、８−アザグアニン
、５−フルオロウラシル、メソトレキセート、アミノブ
テリシナ１ヘリウム、マイトマイシンＣ１塩酸ドキソル
ごシン、プレオマイシン、ダウノルビシン、アクチノマ
イシンＤ１ザルコマイシンをヒト免疫グロブリンに結合
せしめたところ好ましい抗腫瘍効果が１ｑられることが
判明した。さらにこの組合せの中で５メルフアランとそ
のエステル類は合成的に容易に１ｑられる抗腫瘍剤であ
り、安定性も高いことから、ヒ］・免疫グロブリンとメ
ルフ７ラン及びそのエステルとの結合体が最も好ましい
。自然抗体はヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）及び低分子抗
体（Ｆ　（ａｂ’）　２　）を包含する。

と１〜免疫グロブリンと抗腫瘍性物質の結合は次の方法
により製造される。

抗腫瘍性物質を水性溶媒に溶解せしめる。水性溶媒は酸
性水溶液、アルカリ性水溶液、中性水溶液、リンＦｍ緩
衝液、ホウ酸ナトリウム等である。

これに結合剤、例えばカルボジイミド、デキス１〜ラン
、グルタルアルデヒド、ジェヂルマロンイミデート、イ
ソシアナート、ポリグルタミン酸より選択されたものを
加え、更にヒト免疫グロブリン（Ｆ　（ａｂ’　）　２
も含む）を加え反応させる。反応温度は一３０℃乃至５
０℃、好ましくはＯ’Ｃ乃至３０’Ｃであり、反応時間
は１分乃至４８時間、好ましくは１０分乃至２５時間で
ある。反応物を塩析、沈澱、再結晶、溶出、カラム分別
等の手段により精製し、結合体を得る。

本発明のヒト免疫グロブリンと抗腫瘍性物質との結合体
（以下、本物質と略称する）の哺乳動物に対する急性毒
性をマウスに４０００ｍｇ／Ｋｇの投与量で静脈注射し
て調べたが、１週間の’ｌ察では死亡が認められなかっ
た。

さらに、ヒ１へ免疫グロブリンをペプシン（Ｎ　ｉ　５
ｏｎｏｆｆ　５ｃｉｅｎｃｅ　１３２１７７０　（１９
７０）　）　、プラスミン（Ｓｇｏｕｒｉｓ　Ｖｏｘ　
Ｓａｎｇ　１８７１　（１９６７））　、４ノーモライ
シン（特願昭５Ｏ−１９８７１）　、パパイン、トリプ
シン、キモトリプシンで酵素水解して得られる低分子抗
体についても、抗腫瘍剤を結合せしめて検討を行なった
。これらの物質例えばｒ（ａｂ’）２でも毒性は４００
０ＩＩＩｇ／に９以上であった。

したがって、本物質は、毒性が極めて低く、頻回投与も
可能でさらに各種の人癌に対して有効である。例えば、
急性白血病、悪性リンパ種、癌腫、内陸、悪性繊毛上皮
腫、急性骨髄性白血病、メラノーマ、急性リンパ性白血
病、骨髄癌等にも効である。本物質を抗腫瘍剤として用
いる場合の製剤化法、および投与の方法としては、抗Ｍ
瘍剤に関する公知の方法を適用し得る。投与方法として
は、経口、非経口たとえば注射または直腸投与があげら
れる。投与形態としては、粉末、顆粒、錠剤、カプセル
、または注射剤、座薬のいずれであってもよい。特に錠
剤あるいは注射による投与が好ましい。注ＯＡ薬の製剤
には、生理的食塩水、滅菌水、リンゲル液等の水溶性溶
剤、非水溶性溶剤、等張化剤、無痛化剤、安定剤、防腐
剤、懸濁化剤、緩衝剤、乳化剤等を任意に用いうる。

その−例を示すと、本物質１ｒｊとマンニトール５９を
蒸溜水に溶解して５０ａｅとして常法で除菌した後、そ
れを注射用小瓶に分けたり、又はそのまま凍結乾燥して
注射剤とする。そして水剤は、使用に際し、生理的食塩
水で希釈して注射液とする。

本？５！ｉは製剤化中一般に０．０１〜９０％、好まし
くは０．１〜６０％含有することが出来る。

本物質の投与量は主として痛状に左右されるが成人１人
１日当り０．１〜１０ｇ、好ましくは１〜６９である。

本発明によると、ヒト免疫グロブリンおよび酵素処理ヒ
ト免疫グロブリンの向腫瘍性ならびに、抗腫瘍性物質の
抗腫瘍性は失われることなく上記化合物に保たれている
ので、本物質は、投与されると効率よく目的とする腫瘍
部位に到達し、長期間残存し、抗腫瘍効果を発揮する。

本発明は、必ずしも抗体を抗腫瘍抗体から選ばなくても
すむために工業的には大変有利であると言える。

以下に、本発明を実施例によって更に詳細に説明する。

実施例　１ ヒト免疫　ロブリンの分布 実用性のある抗体はいかなる抗体であるかを検索する為
に、抗３−１８０ウサギ免疫グロブリン、正常ＩＣＲマ
ウス免疫グロブリン、ヒト免疫グロプリンの生体内分布
を調べる為に各物質に　　Ｉ−標識を行なった。

すなわち、Ｗ、　Ｉｌ、　ｔ！ｕｒｔｅｒらＢｉｏｃｈ
ｅｍ、　Ｊ、　８９１１４（１９６３）の方法に従って
免疫グロブリンのタンパク質部分に　　■−標識を行な
った。方法はいずれも同様であるので一例をあげる。マ
イトマイシンＣ結合抗３−１８０抗体を５ＩＩｔｇ／ｍ
の濃度になる様に０．５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７，４
）に溶かした。その０．５−をスビック管に入れ、そこ
に０．２５　ｍＣｉのＮａ　　　Ｉを加える。さらに０
．０５Ｍのリン酸緩衝液２００成に溶かしたａ、”ｔｍ
ｇのクロラミンＴを加えて０℃で１５分間反応さゼた。

続いて０．０５Ｍのリン酸緩衝液に溶かしたご口亜ｌｌ
Ａ酸ナトリウム（Ｌ７５■）とＫｌ（１０＃Ｉｇ）を加
えて反応を停止した。反応液を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−
２５（φ２．２ｃｍ　ｘ　４０ｃｍ　）カラムを用いて
、未反応の放射性ヨード及び試薬を除去した。このよう
にして　　１−標識マイトマイシン結合抗３−１８０ウ
リ°ギ免疫グロブリンを１９だ。

以下同様にして　　Ｉ−標識正帛［ＣＲマウス免、１２
５ 疫グロブリノ、　　　Ｉ標識ヒト免疫グロブリンを得た
。これらを用いて生体内分布の検問を行なつた。

ずなわら、Ｓ　−１８０担癌ＩＣＲマウス（移植後２週
間）を用いて、静脈内に投与し、２４時間後と１４４時
間後に動物を屠殺して、解剖し、血液Ｓ−１８０腫瘍部
位、肝臓、腎臓、牌臓、消化器等の各臓器を取り出して
ウェル型のγ−カウンターでカウントを行ない、投与薬
剤の各組織重量当りの到達薬剤量という形で分布を以下
のように表示した（表−１）。

さらに　１４４時間後における各臓器に残存する量の合
計に対する各臓器における吊の率を残存率として表わす
と下記表−２のようになる。

これらの結果は腫瘍抗原を異種動物に免疫して得られる
異種抗体が優れた到達率を示すことを表わしている。し
かし、同種の自然抗体も特異抗体に比べてＩｌ？瘍到達
率は１７５〜１／１０と落ちるが、他の臓器に□比べる
と腫瘍部位での残存率が高いということがここに判明し
た。このことから自然抗体がキャリヤーとして実用性の
高い抗体であることを知るに至った。

実施例　２ ヒト　　をロブリンの−１ ヒト正常人血清１０００ｍに対し１０００−の０．００
５Ｍリン酸緩衝食塩水（以下、ＰＢＳと略）を加えて希
釈する。この希釈血清に２０００ｄの飽和硫安水溶液（
ｐＨ７，２）を撹拌しながら徐々に加える。４℃で６０
分放置すると塩析物が析出沈澱してくるので８０００　
ｒｐｏ＋で３０分間遠心分離を行ない沈澱を集める。

この沈澱をＰＢＳに溶かし、全量を１０００ｍとする。

これに対し撹拌しながら、徐々に飽和硫安の２５０蛇を
加え２０％飽和とする。溶液が白濁し、沈澱を生ずる場
合はフィブリノーゲンであるので遠心除去を行なう。こ
の上清に飽和硫安の２５０ｄを加え３３％飽和とする。

６０分間放置した後ａｏｏｏ　ｒｐｍで３０分間遠心分
離を行ない沈澱を集める。この沈澱を１０００ｄのＰＢ
Ｓに溶解した後５００ＩｎＩｌの飽和硫安を加える。６
０分撹拌後ａｏｏｏｒｐｍで３０分間遠心分離を行ない
沈澱を集める。得られた沈澱を３００戒のＰＢＳに溶か
して、ＰＢＳに対して透析を行ない硫安を除いた。さら
に透析終了後、ＤＥＡＥ−セルロースカラム（直径５ｃ
ＩＲ×５０ＣＩりを用いて、０．００５Ｈｐｌｌ　８．
０です通りするフラクションを集めた。す通りの両分を
蒸溜水に対して透析して脱塩の後、凍結乾燥してヒト免
疫グロブリン１２．５　’Ｊを得た。

実施例　３ 正常人由来ヒト免疫グロブリンとマイトマイシンＣ１塩
酸ドキソルビシン、塩酸ダウノルビシン、プレオマイシ
ン、アクチノマイシン、ザルコマイシンの各々とを反応
せしめて、ヒト免疫グロブリン結合抗生物質を合成した
。以下に合成例を述べる。

３−１マイトマイシンＣの結合 １．０ｇのヒト免疫グロブリンを１００−の蒸溜水に溶
解する。そこに１１１．３ｍｇのマイトマイシンＣを溶
解させる。１．ＯＮの塩酸水溶液でｐＨを５．５に調整
しつつ、４℃で２６２．６ｍｇの１−エヂルー３−（３
−ジメブールアミノブロビル）−カルボジイミド塩酸塩
を加えて下記の時間反応させ、酢酸−酢酸ナトリウム緩
衝液（ａｌｌ　５．５）　　５ｍｌの添加で反応を停由
させた。次いで、反応液を限外ろ過器を用いて１０ｄに
濃縮脱塩を行なった。１０１ｄの濃縮液をヒファデック
スＧ−２５（ファルマシア・ジャパン社）を充填した直
径５ＣＩＩＩ、高ざ９０　ｃｔｔｒのカラムを通して、
反応液中の高分子量物質及び低分子量物質を完全に分離
した。溶出液を超遠心分離で４０．０００グ×６０分遠
心分離して得られた上清液を０℃で凍結乾燥して製品た
る本物質を得た。ヒト免疫グロブリンに対する各反応時
間におけるマイトマイシンＣの結合品を３６０　ｒｏｎ
の紫外線吸収を用いて測定した結果は、表−３に示すご
とくであった。

表　　−３ 上記の操作に準じてヒト免疫グロブリン１．Ｊ７と塩酸
ドキソルビシン、塩酸ダウノルビシン、プレオマイシン
およびアクチノマイシンＤのそれぞれと反応ｕしめて約
８００ＷＪの本物質を得た。塩酸ドキソルビシンのヒト
免疫グロブリン（り）当りの結合間は反応時間６０分、
２４時間で夫々４．８ＩＪｇ。

９５埒であった。

実施例　４ 正常人由来ヒト免疫グロブリンとクロラムブチル、メル
フアラン（フェニルアラニンマスタード）へ〇ＮＵ、ウ
ラムスチン、シクロホスファミド、メルフアランメチル
エステルの各々と反応せしめて、アミド結合によるそれ
ぞれの化合物を合成した。以下その合成例を述べる。

４−１メルフアランの結合 １．０ｇのヒト免疫グロブリンを１００Ｉｄの蒸溜水に
溶解する。そこに　１００４１９のメルフ７ランを懸濁
させる。１．ＯＮの塩酸水溶液でｐＨを５．５に調節し
つつ、４℃で、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ
プロピル）−カルボジイミド塩酸塩を加えて２４時間反
応さけ、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐｔｌ　５．５
）　　５ｍの添加で反応を停止させた。次いで反応液を
限外ろ過器を用いて１０ｄに濃縮脱塩を行なった。１０
威の濃縮液をセファデックスＧ−２５（ファルマシア・
ジャパン社）を充填した直径５Ｃ屑、高ざ９０　Ｃｔｎ
のカラムを通して反応液中の高分子ｔ２）物質及び低分
子量物質を完全に分離した。溶出液を超遠心分離で４０
，０００ｇｘ　６０分遠心分離して得られた上清液を０
℃で凍結乾燥して製品たる化合物を得た。この物質中の
タンパク含量はアルブミンを標準とした銅−フォリン法
により、アルキル化活性はＥｐＳｔＱｉｎの方法（Ｅｐ
ｓｔｃ’ｉｎ　Ｊ、＾ｎａ１．　Ｃｈｃｍ。

２７１４２３　（１９５５））でそれぞれ測定した。こ
の結果ヒト免疫グロブリン１■に対してメルフアランが
６埒結合していることがわかった。

上記の操作に準じてヒト免疫グロブリン１．０ｇとクロ
ラムブチル、ＡＣＮｔＪ、ウラムスチンのそれぞれと反
応眩しめで約９００５Ｉ９の本物質を得た。

ヒト免疫グロブリン（ｑ）当りのクロラムブチルの結合
間は反応時間６０分、２４時間で夫々５．１１埒ｇ。

１１７埒であった。

４−３メルフアランメチルエステルの結合１．０９のヒ
ト免疫グロブリンを１００ｄの蒸溜水に溶解する。そこ
に　１００１ｒｔＬｌのメルフアランメチルエステル塩
酸塩を溶解させる。１．ＯＮの塩酸水溶液でｐＨを５，
５に調節しつつ、４℃で１−１ブルー３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を加えて２
４時間反応ざ往酢酸−酢酸す１ヘリウム緩衝液（ｐＨ５
，５）　　５ｍの添加で反応を停止させた。次いで反応
液を限外ｅ過器を用いて１０ｍ１に濃縮脱塩を行なった
。１０威の濃縮液をセファデックスＱ−２５（ファルマ
シア・ジャパン社）を充填した直径５ｃｍ、高さ９０ｃ
ｍのカラムを通して反応液中の高分子量物質及び低分子
■物質を完全に分離した。溶出液を超遠心分離で４０，
０００ｇ　ｘ　６０分遠心分離して（９られた上清液を
０℃で凍結乾燥して製品たる化合物を得た。ヒト免疫グ
ロブリンｍ３あたりの結合間は１０埒であった。

実施例　５ 正常人由来ヒト免疫グロブリンとシタラビン、８−アザ
グアニン、５−フルオロウラシル、メソトレキセートお
よびアミノプテリンナトリウムの各々と反応せしめて、
アミド結合によるそれぞれの化合物を合成した。以下に
その合成例を述べる。

５−１メソ１〜レギセートの結合 １０９のヒト免疫グロブリンを１００　ｍｉ！の蒸溜水
に溶解する。そこに　１５１３ｍ７のメソトレキセート
を溶解させる。１．ＯＮのＪ２２酸水溶液ｒｐＨを５５
に調節しつつ、４℃で１−エチル−３−（３−ジメチル
アミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を加えて下記
の時間反応させ、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐｔｌ
　５．５）　　Ｓａｔ！の添加で反応を停止させた。

次いで反応液を限外Ｐ″ａ器を用いて１０Ｉｌ！ｌ！に
濃縮し脱塩を行なった。１０ｍ１！の濃縮液をセファデ
ックスＧ−２５（ファルマシア・ジャパン社）を充填し
た直径５ｃＩ１１１高さ９０ｃｍ＋のカラムを通して反
応液中の高分子量物質及び低分子量物質を完全に分離し
た。

溶出液を超遠心分離で４０．ＯＯＯｇＸ　６０分遠心分
離して得られた上清液を０℃で凍結乾燥して製品たる化
合物を得た。ヒト免疫グロブリンに対するメソトレキセ
ートの結合量を３０５　ｎｍの吸収を用いて測定した結
果はηタンパク当り８．３４であった。

上記の操作に準じてヒト免疫グロブリン１．０ｇとシタ
ラビン、８−アナグアニン、５−フルオロウラシル、ア
ミノプテリンナトリウムのそれぞれと反応せしめて約９
１０ｍｇの結合化合物を得た。ヒト免疫グロブリンｍｇ
当りのシタラビン結合ｅは反応６０分、２４時間で夫々
４．７Ｊ、８．３埒であった。

ヒト免疫グロブリンの１ｇを１００ｄの０．１Ｎ酢酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ４，５）に溶解させる。酵素と蛋
白質との比率を１／１００　　（重過７重＠）としてペ
プシンを加え、３７℃で１６時間消化を行なう。

その液に固体のトリス塩酸塩を加えて（１Ｎ　８．０と
して反応を停止させる。反応液を限外濾過器により濃縮
して１０Ｉ＋！１！とする。直径５ｃｔｎで高ざ９０　
Ｃ，のカラムにセファデックスＧ　−１５０を充填し、
そこに濃縮液の５ｄをチャージし、ｐＨ７のＰＢＳで溶
出する。３つのピークに分離するが第１番目のピークを
Ｆ（ａｂ’）２として集める。この両分を透析チューブ
につめて脱塩し凍結乾燥を行ないヒト免疫グロブリンＦ
　（ａｂ’　）　２を得た。

実／１鋤例　７ ヒ１へ免疫グロブリンＦ（ａｂ゛２と　菅　　との１八
ヒト免疫グロブリンＦ（ａｂ’）２の５００１１１９を
５０ｍ１！の蒸溜水に溶解する。そこに５５．６■のマ
イトマイシンＣを溶解させる。１．ＯＮの塩酸水溶液で
ｐｔｌを５５に調整しつつ４℃で１３１．３■の１−エ
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジ
イミド塩酸塩を加えて下記の時間反応させ、酢酸−酢酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，５）　５ａｅの添加で反応
を停止させた。次いで反応液を限外濾過器を用いて５ｍ
ｌにし濃縮液をセファデックスＧ−２５（ファルマシア
・ジャパン社）を・充填した直？Ｍ　５ｃｍ、高さ９０
　Ｃｍのカラムを通して反応液中の高分子量物質及び低
分子油物質を完全に分離した。溶出液を超遠心分離で４
０，０ＯＯＸ　６０分遠心分離して得られた上清液を０
℃で凍結乾燥して製品たる化合物を得た。

ヒト免疫グロブリンＦ（ａｌ＋’）２に対する、各反応
時間におけるマイトマイシンの結合量を３６０　ｎｍの
紫外線吸収を用いて測定した結果は表−４に示すごとく
であった。

表　　−４ ７−２゛ 上記の操作に準じてヒト免疫グロブリンｒ（ａｂ’）２
５００１ｆｔｇと塩酸ドキソルビシン、塩酸ダウノルビ
シン、プレオマイシンおよびアクチノマイシンＤのそれ
ぞれと反応ぜしめて、約８００　ｍｑの結合化合物を得
た。塩酸ドキソルごシンのヒト免疫グロブリンＦ（ａｂ
’）２η当りの結合重は反応時間６０分、２４時間で夫
々８．５ｐ３．１９．６埒であった。

上記の操作に準じてヒト免疫グロブリンＦ　（ａｂ’　
）　２５００Ｒｇとクロラムブチル、メルフ７ラン、Ａ
ＣＮＵ、ウラムスチン、メルフアランメチルエステル、
シクロホスファミドの各々と反応Ｖしめて約４００１ｎ
ｇの結合化合物を得た。メルフアランのヒト免疫グロブ
リンＦ　（ａｂ’）　２Ｒｇ当りの結合間は反応時間９
０分、２４時間で夫々８．１μｓ、１７．６埒であった
。

上記の操作に準じてヒト免疫グロブリンＦ（ａｂ”）２
５００■とシタラビン、８−アザグアニン、５−フルオ
ロウラシル、メソトレキセート、アミノブテリンプトリ
ウムのそれぞれと反応せしめて約４００ｍりの結合化合
物を得た。メソ］−レキセードのヒト免疫グロブリンＦ
　（ａｂ’）　２ｍｙ当りの結合重は反応時間６０分、
２４時間で夫々　７５埒、１７３埒であった。

実施例　８ ザルローフ１８０固型腫瘍に対する抗腫瘍効果ＩＣＲマ
ウスを用いて継代培養したマウスザルコーマ１８０腫瘍
細胞を１０匹からなる肝の各ＩＣＲマウス腋下部の皮下
に１×１０６個／匹移植し、移植の２４時間後から各種
抗体、各市販抗腫瘍剤、ヒト免疫グロブリン、ヒト免疫
グロブリンＦ（ａｂ”）２および各種抗腫瘍性物質との
結合物のそれぞれの水溶液を１Ｂａきに１回合計１０回
各マウスの腹腔内に注射し、最後の注射の５日後にマウ
スを殺して腫瘍を摘出して秤吊し１０匹についての平均
値を求めた。この平均腫瘍ａｆｆｉ（Ｔ）を、結合力水
溶液の代りに生理的食塩水を１０回投与した対照群マウ
ス１０匹の平均腫瘍型ｆｎ（Ｃ）と比較することによっ
て、本発明結合物の腫瘍増殖抑制率を（１−Ｔ／Ｃ）　
Ｘ１００（％）として表−５，６および７に示す。表−
５はマイトマイシンＣとで合成した結合物、表−６はプ
レオマイシンとで合成した化合物、表−７は塩酸ドキソ
ルビシンとで合成した化合物による結果である。

表　　−５ 表　　−６ 表　　−７ 実施例　９ 古　内陸に対する抗腫瘍効果 口ｏｎｒｙｕラットを用いて継代培養した吉川肉腫腹水
細胞を１０匹からなる群の各Ｄｏｎｒｙｕラットの腹腔
内に１×１０６個／ド移植し、移植の２４時間後からヒ
ト免疫グロブリン、ヒト免疫グロブリンＦ　（ａｂ“）
２と各種抗腫瘍剤、それぞれ単独およびヒト免疫グロブ
リン、ヒト免疫グロブリンＦ（ａｂ’）２と各種抗′ｐ
ａ瘍性物賀との結合物のそれぞれの水溶液を１日置きに
５回、合計で５回、各々のラットの腹腔内に注射し、試
料投与群の平均生存日数（Ｔ＞および対照群の平均生存
日数（Ｃ）を求め、延命率（Ｔ　／　Ｃｘ　１００）を
算出した。結果を表−８乃至表−１０に示す。

表　　−８ 表　　−９ 表　　−１０ 実施例　１０ マウス白血病ｐ　−３８８に対する抗腫瘍効果Ｄ　Ｂ　
Ａ　／２マウスを用いて継代培養したＰ−３８８腹水細
胞を１０匹からなる群の各ＤＢ△／２マウスの腹腔内に
１×１０６個／匹移植し、移植の２４時間後から各種抗
腫瘍剤、それぞれ単独およびヒト免疫グロブリン、ヒ］
・免疫グロブリンＦ（ａｂ’）２と各種抗腫瘍性物質と
の結合物のそれぞれの水溶液を１日１回５日間連続、合
計で５回各マウスの腹腔内に注射し、試料投与群の平均
生存日数（Ｔ）および対照群の平均生存日数（Ｃ）を求
め、延命率（Ｔ　／　ＣＸ　１００）を搾出した９、結
宋を表−１１乃至表−１３に示す。

表　　−１１ 表　　−１２ 表　　−１３ Ｘｌ」Ｌ−ｕ ５００■のデキストランを５００戒の蒸溜水に溶解させ
、ｐｌ＋を１ＮのＮａＯＨを加えて１１とする。室温で
、２５０＃ＮＦ　／　ｍＩｌに調整したＢｒＣＮのアセ
トニトリル溶液を、すばやく撹拌しながら加える。

Ｎ　ａ　Ｏｔ−１を加えてｐＨを１０．８〜１１．０に
調整する。

ＢｒＣＮを加え終った後１０分ｐｌ＋を保っておく。そ
こに２．５ｄの水に溶解した１１０ＯＲのへ１サメチレ
ンジアミンを加えてｐｌ＋を１ＮのＨＣｌ）にて９．０
にあわせる。５分間、撹拌した後、２５０ｒｙｉのメル
フアランを加えて、ｐＨを６５にあとしｌ）Ｈを１５分
間そのままに保つ。反応終了後４℃で反応液を１０ｄに
濃縮する。１０ｄの濃縮液をセフ１デックスＧ−２５（
ファルマシア・ジャパン社）を充填した直径５ｃｍ　、
高さ９０　Ｃｔｎのカラムを通して反応液中の高分子量
物質及び低分子量物質を完全に分離した。溶出液を超遠
心分離で４０．００Ｊ７　ｘ　６０分、遠心分離して１
９られた上清液を０℃で凍結して製品たる化合物を得た
。この結合物はメルフアラン−デキストラン結合体で１
分子のデキストランあたり３０分子〜５０分子のメルフ
アランが結合していた。この結合体１００　ｍｇとヒト
免疫グロブリン１００ｍｇとをグルタルアルデヒドを用
いて結合体を作成した。同様にしてヒト免疫グロブリン
Ｆ　（ａｂ’）２を用いて結合体を得た。

５００ＩＩＩ！Ｊのデストランを５００−の蒸溜水に溶
解させ、ｐＨをＩＮ（ｒ）ＮａＯＨを加えて１１とする
。室温で２５０Ｒｇ／　ｔａｌｌの濃度に調整したＢｒ
ＣＮのアセトニトリル溶液をすばや＜ａ拌しながら加え
る。

ＮａＯＨを加えてｐＨを１０．８〜１１．０に調整する
。

ＢｒＣＮを加え終った後１０分間ｐＨを保っておく。

そこに２．５ｄの水に溶解した　１００ＩＩＦＩのへキ
サメチレンジアミンを加えてｐＨを１ＮのＨＣｆｆにて
９．０にありぼる。５分間ｈｌ拌した後、２５０ＩＩｔ
ｇのマイトマイシンＣを加えてＤＨを６．５におとし、
ｐＨを１５分間そのままに保つ。反応終了後、４℃で反
応液を１０ｄに濃縮する。１０ｄの濃縮液をセファデッ
クスＧ−２５（ファルマシア・ジャパン社）を充填した
直径Ｓｃｍ、高さ９０　Ｃｍのカラムを通して反応液中
の高分子性及び低分子吊物質を完全に分離した。

溶出液を超遠心分離で１１０，０ＯＯＪ　Ｘ　６０分遠
心分離して得られた上清液を０℃で凍結乾燥して製品た
る化合物を１９だ。この結合物はマイトマイシンＣ−デ
キストラン結合体で１分子のデキストランあたり３０分
子〜５０分子のマイトマイシンＣが結合していた。

この結合体１００　ｍｇとヒト免疫グロブリン１１００
ｒＩｔをグルタルアルデヒド最終１００μ３／へとなる
濃度で加えてｙ記で１時間反応を行ないヒト免疫グ「１
プリン結合デ４ストランーマイトマイシンＣを得た。

５ＱＱｑのデキストランを５００威の蒸溜水に溶解ざＩ
！、ｐＩ−（を１ＮのＮａＯＨを加えて１１とする。

室温で２５０■／ｄの濃度に調整したＢｒＣＮのアセ１
〜ニトリル溶液をすばやく撹拌しながら加える。

ＮａＯＨを加えてｐｔ−１を１０．計〜１１．０に調整
する。

ＢｒＣＮを加え終った後１０分間Ｄ　Ｈを保ってＪ３　
＜。

そこに２．５ｄの水に溶解した１　００　ｍ！ｌＦのへ
一１サメブレンジアミンを加えてｐＨを１Ｎの１−ＩＣ
ρにて９０にあわゼる。５分間撹拌した後、２５０Ｒｇ
のメソトレキｔ＝−１−を加えてＤＨを６．５におとし
てｐＨを１５分間そのままに保つ。反応終了後、４℃で
反応液を１０ｍに濃縮する。１０ｍ１の濃縮液をセファ
デックスＧ−２５（ファルマシア・ジＰパン社）を充填
した直径５ｃｍ、高さ９０　ｃｍのカラムを通して反応
液中の高分子性及び低分子１ｕ物′ｄを完全に分離した
。

溶出液を超遠心分離で４０，０００ｇｘ　６０分遠心分
離して得られた上清液をＯ′Ｃで凍結乾燥して製品たる
化合物を得た。この結合物はメソトレキセートーＦ　ｔ
’ストラン結合体で１分子のデキストランあたり３０分
子〜５０分子のメソトレキセートが結合してい　ｌこ　
。

この結合体１１００ｆＩｒとヒト免疫グロブリンｒ（ａ
ｂ’）２　１２０＃＋５１をグルタルアルデヒド最終１
００ｎ／ｄとなる濃度で加え結合体を作製した。

同様にしてヒト免疫グロブリンを用いて結合体を１９だ
。

実施ＶＡ１２ マイトマイシンＣ１１，３ｆｆｉｇを０．ＯＩＭのリン
酸緩衝液（ｐＨ６，８）　　１ｍに溶解させ、ここに１
％のグルタルアルデヒド水溶液２０／１ｉ２を加えて室
温で８時間撹拌する。そこに１００　ｍｇのヒト免疫グ
［１プリンを２０ｄのリン酸緩衝液（ｐＨ６，８）に溶
解した液を加えてさらに２時間室温で反応させる。反応
終了後、セファデックスＧ−２５（フフルマシア・ジャ
パン社）を充填した直径５ｃｆｆｉ、高さ９０　Ｃａｒ
のカラムを通して反応液中の高分子性及び低分子量物質
を完全に分離した。溶出液を超遠心分離で４０，０ＯＯ
ｔＪｘ　６０分遠心分離して得られた上清液を０℃で凍
結乾燥して製品たる化合物を得た。ヒト免疫グロブリン
に対するマイトマイシンＣの結合量は蛋白ｍ３あたり、
９．６Ｉｉ！ｊであった。

アドリアマイシン　１９６ｍｇを０．０１Ｍのリンｌｌ
ｌ’ｔｌｉｉ液（ｐＨ６，８）に１ｍに溶解させる。こ
こに１％のグルタルアルデヒド水溶液２０［を加えて室
温で８時間撹拌する。そこに　１００■のヒト免疫グロ
ブリンを２０ｄのリン酸緩衝液（ｐｔｌＧ、８）に溶解
した液を加えて、さらに２時間室温で反応させる。反応
終了後、セファデックスＧ−２５（ファルンシア・ジャ
パン社）を充填した直径５ｃｆｆｉ、高さ９０ｃｍのカ
ラムを通して反応液中の高分子性及び低分子量物質を完
全に分離した。溶出液を超遠心分離で４０．０００！７
ＸＧｏ分遠心分離して得られた上清液を０℃で凍結乾燥
して製品たる化合物を１ｎた。ヒト免疫グロブリンに対
するアドリアマイシンの結合間は蛋白ｍｇあたり、５．
６屑であった。

同様にしてヒト免疫グロブリンＦ（ａｂ’）２を用いて
結合体を得た。

メソトレキセート　２００　ｍｇを０．０１Ｍのリン酸
緩衝液（ｐＨＧ、８）　　ｉｄに溶解させる。ここに１
％のグルタルアルデヒド水溶液２０成を加えて室温で８
時間１覚拌する。そこに１００ｍｇのヒト免疫グ１］プ
リンＦ　（ａｂ’　）　２を２Ｍのリン酸緩衝液（ｐｌ
＋　６．８）に溶解した液を加えて、さらに２時間室温
で反応させる。反応終了後、セファデックスＧ−２５（
ファルマシア・ジを・パン社）を充填した直径５Ｃｆｎ
、高ざ９０　Ｃｍのカラムを通して、反応液中の高分子
ｍ及び低分子量物質を完全に分離した１、溶出液を超遠
心分離で４０，０００４７　ｘ　６０分遠心分離して１
！Ｉられた上清液を０℃で凍結乾燥して製品たる化合物
を得た。

ヒト免疫グロブリンＦ（ａｂ’）２に対するメソＩ〜レ
キセードの結合間は蛋白ｎｒ９あたり、７８埒であつＩ
Ｃ。

実施例　１３ マイトマイシンＣ１１，３ηとヒト免疫グロブリンの１
００ｍｇを０．２Ｍのホウ酸ナトリウム（ｐＨ９，３＞
の１０ｍ１に溶解させる。そこに５ｍｇのジエチルマ［
１ンイミデー１へを加えて’Ｊ渇でｐＨを８６に保った
４Ｊ：ま、１時間撹拌させる。さらに２５ｍ３のジエブ
ルマロンイミデートを添加して１時間撹拌を行なった。

反応終了後、中性にｐＨをもどした侵、４５％の飽和硫
安を加えてヒト免疫グロブリン−マイトマイシンＣ結合
体を沈澱させた。７０００　ｐｐｍで１５分間遠心分離
を行ない沈澱を集めた。沈澱を５ｍＭのリン酸緩衝液５
ｄに溶解し、蒸溜水に対して透析を行ない硫安が検出さ
れなくなるまで（７２ｈｒ）透析した。透析終了後、セ
ファデックスＧ　”　２５　（ファルマシア・ジャパン
社）を充填した直径５Ｃｍ、高さ９０　ｃｍのカラムを
通して反応液中の低分子吊物質を完全にのぞいた。溶出
液を一２０℃で凍結乾燥して製品たる化合物を１９だ。

ヒト免疫グロブリンη当りの結合量は６．３埒であった
。

同様にしてヒト免疫グロブリンＦ（ａｂ’）２を用いて
結合体を１７だ。

上記の操作に準じてヒト免疫グロブリン１００ηとメル
フアラン、アミノプテリンナトリウムとの反応を行ない
８５Ｉｎｇの結合化合物を１９だ。

実施例　１４ 実施例１１、実施例１２、実施例１３で合成した化合物
について実施例８，９．１０の抗腫瘍試験を用いて効果
を調べた結果を表−１４乃至表−１６に示した。

表　　−１４ 表　　−１５

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）正常人由来の免疫グロブリンにアルキル化剤を結
   合した化合物を有効成分とする抗腫瘍剤。
2. （２）免疫グロブリンがＦ（ａｂ′）＿２であることを
   特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の抗腫瘍剤。
3. （３）アルキル化剤が、クロラムブチル、ＡＣＮＵ並び
   にシクロホスファミドから成る群から選択されることを
   特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の抗
   腫瘍剤。
4. （４）水溶性カルボジイミドを用いて結合されることを
   特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第３項のいずれか
   に記載の抗腫瘍剤。
5. （５）イソシアナート、ジエチルマロンイミデート、グ
   ルタルアルデヒド、ポリグルタミン酸又はデキストラン
   を用いて結合されることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項乃至第３項のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
6. （６）経口投与形態にあることを特徴とする特許請求の
   範囲第１項乃至第５項のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
7. （７）経口投与形態が顆粒であることを特徴とする特許
   請求の範囲第６項に記載の抗腫瘍剤。
8. （８）経口投与形態が錠剤であることを特徴とする特許
   請求の範囲第６項に記載の抗腫瘍剤。
9. （９）経口投与形態がカプセルであることを特徴とする
   特許請求の範囲第６項に記載の抗腫瘍剤。
10. （１０）非経口投与形態であることを特徴とする特許請
    求の範囲第１項乃至第５項のいずれかに記載の抗腫瘍剤
    。
11. （１１）非経口投与形態が座薬であることを特徴とする
    特許請求の範囲第１０項に記載の抗腫瘍剤。
12. （１２）非経口投与形態が注射剤であることを特徴とす
    る特許請求の範囲第１０項に記載の抗腫瘍剤。