PT91371B

PT91371B - Processo para a preparacao de conjugados de medicamentos citotoxicos, nomeadamente conjugados de medicamentos de metotrexato

Info

Publication number: PT91371B
Application number: PT91371A
Authority: PT
Inventors: David Arthur Johnson; Bennett Coleman Laguzza; William Leonard Scott
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1988-08-08
Filing date: 1989-08-03
Publication date: 1995-05-04
Also published as: NZ230199A; MX165003B; JPH02256700A; EP0354729B1; US5028697A; HUT50850A; KR900002803A; ZA895909B; DE68912232D1; DE68912232T2; AU3933889A; IL91181A0; PT91371A; EP0354729A3; DK382889D0; DK382889A; CN1040204A; AU619328B2; HU208161B; EP0354729A2

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 91 371

REQUERENTE: ELI LILLY AND COMPANY , norte-americana, industrial,com sede em Lilly Corporate Center,Indianapolis,Indiana 46285,Estados Unidos da América do Norte.

EPÍGRAFE: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS

DE MEDICAMENTOS CITOTÚXICOS,NOMEADAMENTE CONJUGADOS DE MEDICAMENTOS DE METOTREXATO

INVENTORES: David Arthur Johnson,Bennett Coleman Laguz za e William Leonard Scott.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Estados Unidos da América do Norte em 08 de Agosto de 1988, sob o n- 07/229,941.

MC:

R F '5732

MEMÓRIA DESCRITIVA

Resumo

O presente invento diz respeito a um processo para a preparação de conjugados de anticorpos e os medicamentos de metotrexato citotóxicos, através de grupos de ligação entre o medicamento e o anticorpo, que são grupos orgânicos simples, em que a ligação ao anti

ELI LILLY AND COMPANY

PROCESSO PARA A PREPARAÇAO DE CONJUGADOS DE MEDICAMENTOS CITOTOXICOS. NOMEADAMENTE CONJUGADOS DE MEDICAMENTOS DE METOTREXATO

-2é um grupo de acilo e a ligação ao medicamento é uma alqui_ lideno-hidrazida.

Estes conjugados apresentam a formu 1 a (I) :

Ab/C0-X=N-HN-M7_m I em que m é de 1 a 10; Ab é o anticorpo; X é um grupo de ligação, por exemplo de formula (CH₂)_nC(R)= ou (CH₂)_n-Ar-CH=; R é hidrogénio, fenilo ou fenilo substituído; Ar é

H n é de 0 a 5; M é um medicamento do metotrexato de formula (VI):

Ο Λ

R^-3 é, por exemplo, NH2 ou CH2 ; R⁴ é, por exemplo, CO ou S02 ; Z é por exemplo CO-(CH₂)₂-CH(COR⁶)-NH, em que R⁶é, por exemplo, hidroxi.

processo de preparação consiste em se fazer reagir um anticorpo que foi sujeito a derivação da formula:

Ab/”CO-X=R⁸7 - m o

em que R é 0, (OCH₂)₂ ou (OCH₂CH₂)₂, com uma hidrazida do medicamento de fórmula:

h₂nhn-m

invento em consideração diz re£ peito aos campos de acção da química orgânica, da imunologia e da quimica farmacêutica, e estabelece conjugados de medicamentos citotóxicos. proveitosos para a administração visada de medicamentos citotóxicos, a pacientes com ne cessidade de tal tratamento. 0 objectivo dos conjugados dos medicamentos é alcançado com o emprego de anticorpos, que aceitam um antigénio. associado à célula a ser tratada com o medicamento citotóxico. anticorpos esses que. por esse meio, transportam o medicamento citotóxico â célula.

Os intermediários, empregados na sintese dos conjugados são, também estabelecidos.

tratamento quimioterapêutico dos pacientes cencerosos está bem demonstrado, na pratica médica. Os medicamentos empregados, são. contudo, citotóxicos, apresentam efeitos secundários dignos de nota, e têm de ser administrados com o máximo cuidado. Os medicamentos da familia dos metotrexatos são eficientes e empregados muitas vezes, mas são particularmente perigosos .

invento em consideração emprega um anticorpo especifico de direcção da células, para dirigir o medicamento à célula a ser morta pelo medicamento, reduzindo, poresse meio, o risco do paciente.

Visto que o medicamento é dirigido â célula especifica, menos medicamentos circulam no organismo do paciente e. por isso, os efeitos secundários e a toxicidade geral são reduzidos.

-50 invento em consideração estabelece um conjugado de medicamentos citotóxicos da formula

Ab/~CO-X=N-HN-M7_m em que m é um número inteiro de 1 a cerca de 10;

Ab é um anticorpo fisiologicamente aceitável, ou um seu

fragmento que reconhece antigénios, que nio associado a uma célula indesejável; X é um grupo de ligaçao da formula R I	reconhecem um antigé-
I (CH₂)_n-C=		II
(CH₂)_n-Ar-CH=		III
(CH₂)_n-CO-NH-(CH₂)_n-CH=,	OU	IV
R¹
1 CH-(CH₂)_n-NH-CO-R²-CH-;		V

-6R é hidrogénio, fenilo ou fenilo substituído por um, ou por dois, nitros, halogénio, ciano ou grupos de trifluorometilo;

H

R¹ é hidrogénio, amino. aminoalquilo de C^C^, hidroxialquilo de CpC^, ou guanidinoa 1 qui 1 o de C^-C^;

n é um numero inteiro de 0 a 5;

M é um medicamento de metotrexatos da formula

VI

		R⁵ R⁵
R³	é	N. CH,	S ou 0;
R⁴	é	CO, S0₂,	C0-(CH₂)_s ou CO-NH;
R⁵	é	h i drogén i o	ou C.\|-C₃alquilo;
s é	um	ou dois;

COR⁶

Z é (CO-(CH₂)₂-CH-NH)_t

VII

COR⁶

SO₂-(CH₂)_s-ch-nh ou

VIII

COR⁶ co-(ch₂)_u-ch-nh

IX t é um número inteiro de 1 u é um número inteiro de 1

R⁸ é hidroxi ou uma metade gicamente aceitável.

a 6;

a 22;

que completa um sal fisiolo invento estabelece, também, uma serie de anticorpos derivatizados da formula

Ab/~CO-X=R em que é 0, (OCHg^ ou (OCI^CHg^, e X e m têm as designações estabelecidas no precedente.

invento estabelece, também um processo para o controlo do desenvolvimento de uma célula indesejável, o qual compreende a administração perentérica de um conjugado do invento, o qual a um paciente, e composição farmacêuticas compreendendo um conjugado do invento, disperso nu meio parenteraImente administráve 1 .

Também se estabelece um processo para a preparação de conjugados da formula I, compreendendo a reacção dos anticorpos derivatizados do precedente com um medicamento, uma hidrazida da formula H^NHN-M.

Os conjugados de medicamentos em consideração são constituídos por um anticorpo, por um grupo de ligação e por um medicamento de metotrexato. na forma de hidrazida. As propriedades terapêuticas desejáveis dos conjugados são essencialmente obtidas do grupo de ligação, que é deste modo concebido para libertar o medicamento de metotrexato do anticorpo, depois de o medicamento ter sido libertado para a vizinhança da célula visada, pelo anticorpo.

-9Os tres componentes principais dos conjugados serão debatidos individualmente, a sintese dos conjugados será, em seguida, explicada e, finalmente, serão apresentados exemplos da sintese e da testagem biológica dos conjugados.

Anticorpo

A propriedade essencial da parce la do anticorpo dos conjugados é a sua capacidade em reconhecer um antigénio associado a uma célula indesejada. Deve compreender-se que os medicamentos de metotrexato são citotóxicos no grau mais elevado, a uma ampla diversidja de de células, e que esses medicamentos exibem o seu completo vigor, quando interiorizados na célula visada. Deste modo, o anticorpo é. de preferencia, escolhido pela sua capacidade em reconhecer em ligar e em ser interiorizado pela célula, que dever ser morta, de outro modo, ser controlada pelo medicamento de metotrexato.

A origem do anticorpo não é pormenor para constituir problemas ao invento em consideração. Pelo que pode o anticorpo ser escolhido em qualquer classe, ou subclasse, da imunoglobulina, incluindo IgG, IgA,

IgM, IgE, e IgD. De um modo idenctico, a especie de origem não é pormenor para constituir problemas, uma vez que o anticorpo tenha por alvo célula na qual o efeito do medicamento de metotrexato seja proveitoso.

No estado actual da técnica, os anticorpos monoclonais são os mais empregados nos conjugados dos medicamentos, e o seu emprego é o preferido no invento i

-10em consideração. Não obstante, não se excluem os anticorpos policlonais. Um tipo mais recente de anticorpos é o anticor po quimérico, que é preparado, no laboratorio, pela tecnologia recombinante que permite a expressão de um DNA modificado, que codifica a região de ligação dos antigénios de qualquer anticorpo desejado, e também codifica quaisquer outras sequências aminoácidos desejadas.

Deste modo, os anticorpos quiméricos, dos quais uma parcela é derivada de uma especie e outra parcela é derivada de uma outra especie, podem ser obtidos e empregados no invento em consideração.

A origem e a natureza do anticorpo não é, aliás, pormenor para constituir problemas, uma vez que tenha sido alvo a células a ser tratada, e não seja, ele proprio, toxico ao paciente. Os técnicos vulgares podem preparar facilmente, os conjugados, com um anticorpo candidato, e avaliá-los. Um certo debate do processo de avaliar os anticorpos e os conjugados será proporcionado por conven ienc i a .

Primeiramente, o anticorpo deve ser produzido por um hibridoma, que seja suficientemente estável para permitir a preparação de quantidades razoaveis do anticorpo. 0 anticorpo, ele proprio, deve ser susceptivel de purificação, e em seguida, e em particular, deve ser suficientemente solúvel em ãgua, para permitir as manipulações químicas a uma concentração razoável.

-11 Os conjugados, preparados com o anticorpo candidatos, são, primeiramente avaliados pela sua capacidade de ligação de antigénios. Uma redução razoável da capacidade de ligação do anticorpo livre é de ser esperar e é aceitavel. Em seguida, o conjugado é experimentado, para se determinar a sua citotoxicidade in vitro, contra as células positivas ao antigénio. Um conj£ gado eficiente pode ter uma citotoxicidade com tanto inferior â do medicamento livre, na mesma análise.

Um conjugado, que seja aceite nos dois primeiros testes, é, em seguida, avaliado num modelo de xenoenxertos de tumores humanos de ratos pelados, como preconiza Johnson e Laguzza, conc.res.47, 3118-22(1987).

conjugado de candidatos deve ser experimentado em ratos nus, contra o medicamento livre, uma mistura do medicamento livre e do anticorpo livre, e um conjugado com uma imunoglobulina não alvo, e deve exibir uma potência elevada ou uma segurança acima de tudo.

As doses da ordem dos estudos devem ser levados a efeito no modelo de xenoenxertos.

Os conjugados, que são potentes no modelo de xenoenxertos, são submetidos a testes nos animais que são conhecidos como exprimindo o antigénio de interesse num exemploar semelhante ao dos vistos em entes humanos.

-12Se o conjugado produz um grau di£ no de nota de ligação ao antigénio, em tais testes, e se ele é razoavelmente livre de toxicidade, a doses preditas pelo modelo de xenoenxertos como sendo terapêutico, o conji£ gado de candidatos pode ser considerado como tendo um potencial terapêutico.

Muitos anticorpos, conhecidos no momento actual, são acessíveis para o emprego no invento em consideração. 0 anticorpo especifico preferido é o L/1C2, que é produzido por um hibridroma em depósito na Colec ção do Tipo de Cultura Americana. Rockville. MD como HB9682.

anticorpo 5E9C11. produzido por um ATCC hibridoma HB21 , reconhece o receptor de transferrina . que se manifesta por muitos tumores. Um anticorpo, designa^ do por B72.3. adquirível no Instituto Nacional do Cancro, aceita entigénios manifestados tanto pelo carcinoma do seio, como pelo do cólon.

Dois anticorpos, de interesse pelas reactividades contra os antigénios não tumorosos. são ο 0KT3 e ο 0KT4. que se ligam às T-celulas periféricas e as células T-auxiliares humanas, respectivamente- Eles são produzidos por hibridomas em depósito no ATCC. como CRL8001 e CRL8002, respectivamente.

-13Fontes adicionais de anticorpos, proveitosos para diversos fins terapêuticos, são os que se seguem: Anticorpos anti-humanos de linfócitos e de monócitos, proveitosos para a modulação imune e para a terapia de tumores, são produzidos pelas ATCC culturas HB2,

HB22, HB44 , HB78 e HB136. Um anticorpo receptor de antitransferrina , proveitoso para a terapia de tumores, é produzido pela ATCC cultura HB84. A ATCC cultura HB8059 produz um anticorpo contra a monosia 1oganglios ida de carcinoma colorectal, e a cultura HB8136 produz um anticorpo contra o antigénio de superfície de células T humanas maduras, proveitosos para a modulação imune e para a terapia de leucemia das células T.

Outros anticorpos candidatos são facilmente instalados por peritos na técnica. Uma fonte, particularmente proveitosa de informação acerca de anticorpos facilmente acessíveis, é a Linscott^!s Directory of Immunological and Biological Reagents, publicada por Linscott' 's Directory 40 Glen Drive. Mil 1 Valley. Califórnia 94941.

A edição de 1984 regista mais do que 60 anticorpos monoclonais associados a tumores, e pelo menos, uma fonte comercj_ al para cada.

Deve compreender-se que uma diversidade de células indesejáveis podem ser tratadas com conjugados do invento emconsideração. Os medicamentos de metotrexato são amplamente conhecidos como sendo activos contra os diversos tipos de células cancerosas, e aceita-se que as células do cancro encontram-se entre as células prefe ridas como sendo o objectivo dos conjugados em consideração .

-14De um modo particular, as células que apoiam o desenvolvimento continuado de uma malignidade e as células do organismo imune, que controlam o desenvolvimento da imunidade antitumorosa , são também aceites.

Os tipos específicos das células relacionadas com o cancro, como sendo as visadas, incluem células do carcinoma escamosas, as células do adenocarcinoma as células do carcinoma pequenas células, as células do glioma, as células do melanoma. as células de carcinoma de células renais, as células de carcinoma de células transicio nais, as células de sarcomas, as células de apoio da vasculatura de tumores, e as células dos tumores linfóides. tais como as leucemias e os linfomas.

Não obstante, os medicamentos de metotrexato são também citotóxicos, para muitos outros tipos de células. Deste modo, os conjugados podem ser empregados, por adequada escolha de anticorpo, para matar, ou para modificar, tais indesejáveis células, como, por exemplo, as células infectadas com as partículas do virus as células T infectadas com diversos agentes perniciosos, e as células do organismo imune, que impulsiona, ou controla o desenvolvimento das doenças autoimunes.

Deve compreender-se que os fragmen tos escolhidos adequadamente dos anticorpos têm o mesmo efeito que o anticorpo intacto.

-15Deste. modo, na pratica deste invento, os fragmentos de anticorpos, de preferencia os fragmentos F(ab')₂. que reconhecem um antigénio associado com a células a ser tratada, podem ser tão proveitosos como os anticorpos imunes.

mecanismo exacto. pelo qual o gru po de ligação reage com o. e se liga ao. anticorpo, não se encontra representado na formula I. e não é rigorosamente conhecido. A reacção. presumivelmente, é uma acilaçâo. como se representa a seguir, e uma diversidade de situações nas moléculas do anticorpo, são submetidas â acilaçâo.

Mais vulgarmente, aceita-se que as acilações dos anticorpos prosseguem nos grupos de amino livre, as porções de lisina. Não obstante, a acilaçâo pode, também atacar os grupos de hidroxi. os grupos de fenol. os aneis de imidazol e. talvez , outras metades.

A Formula I indica que de 1 até cerca de 10 porções de grupos de ligação de medicamentos estão ligadas a cada molécula do anticorpo. Como é a evidente, o numero de tais porções, por molécula do anticorpo, é um numero medido, visto que um dado conjunto de conjugados contém, necessariamente, moléculas com uma gama de proporções de medicamento-grupo de ligação para anticorpo. 0 emprego, o mais eficiente, do anticorpo, dispendioso é obtido, como é evidente, quando um numero de moléculas do medicamento está ligado a cada molécula do anticorpo.

Não obstante, a ligação de um número execessivo de moléculas da porção do grupo de ligação medicamento tem, habitualmente um efeito contrário na capacidade do anticorpo em reconhecer ligar-se ao seu antigénio. e. assim, há que achar-se um valor de compromisso para m. De um modo geral, o valor

-16preferido para m é cerca de 4 a cerca de 10; um outro valor preferido é cerca de 3 a cerca de 8.

Medicamento Metotrexato medicamento citotóxico empregue nos conjugados em consideração é o metotrexato. a aminopte rina, ou um deu derivado de formula VI. compostos esses que são designados em conjunto como medicamentos de metotrexato. neste documento. Os compostos de metotrexato são empregados na forma de hidrazida. As formas estereospecificas dos diversos centros assimétricos do medicamento não estão indicados. Os técnicos vulgares compreenderão que a estereoquimica do medicamento pode afectar a sua actividade, como se encontra esclarecido nitidamente na técnica A estereoquimica habitual dos medicamentos de metotrexato é empregada, de preferencia, na preparação de intermediários para os conugados em consideração, mas a formula VI inclui todas as formas estereoquimicas.

A ligação entre a hidrazida do medicamento metotrexato e o grupo de ligação é uma ligação alquileno-hidrazida de alquilideno. Deve compreender-se contudo, que a ligação pode apresentar-se noutras formas em solução, particularmente em solução fisiológica. A ligação dupla pode ser aberta, permitindo que os grupos funcionais ou protões se liguem aos átomos de azoto ou de carbono. Como um resultado, um grupo de hidroxi ou outra espécie ligada ao oxigénio pode ligar-se a um lado da ligação dupla primitiva, como o podem, também, as metades ligadas ao amino. A água pode ligar-se, debilmente, a um dos átomos.

-lidos átomos. Uma metade do anticorpo, pode, também, constituir uma ligação débil a um dos átomos e mais do que uma de tais reacções pode surgir. .formando misturas. Tais produtos são transitórios, contudo, e, através deste document os conjugados serão descritos como na forma de hidrazida de alquilideno, visto que ela é a sua forma geral e estável.

Na formula VI, o termo alquilo C^-C^ inclui o metilo, o etilo, o propilo e o isopropilo, e, de preferencia, o metilo ou o hidrogénio.

Os diversos grupos, que podem variar no medicamento da formula VI, serão debatidos individualmente, e serão dadas algumas definições preferidas de cada um. Deve compreender-se que as hidrazidas dos medicamentos de metotrexato preferidas são constituídas pelos grupos constituídos preferidos, e os farmacêuticos, com conhecimento da bibliografia pertinente, podem preparar quaisquer tais hidrazidas de medicamentos.

grupo R é um grupo em ponte, que pode ser enxofre, oxigénio,amino ou metileno, podendo os últimos dois serem substituídos, facultativamente por alquilo C.,-C₃. Tais grupos tipicos são o amino, o metileno, o metilamino, o propilamino, o 1 ,1-propileno e 3 o 1 ,1 -isobuti1eno . Os grupos preferidos de R são o amino e o metilamino.

grupo R^ é um grupo em ponte, que pode ser o carbonilo, o sulfonilo, o acetilo, o propionilo ou o carboxamido.

-18Nos últimos tres casos, o grupo 4 de carbonilo é adjacente ao grupo Z. 0 grupo R , o mais preferido, é o carbonilo, e o acetilo e o propionilo, são, também preferidos.

grupo Z tem um grupo amino numa extremidade, que está ligada ao grupo R⁴ e tem um grupo car bonilo ou sulfonilo na outras extremidade, que está ligada ao grupo =N-HN. 0 grupo Z de formula VII é derivado do acido glutâmico e, quando t não é 1, constitui o residuo do acido poiiglutâmico. 0 grupo Z preferido da formula VII, não obstante, é aquele em que t é 1.

grupo Z da formula VIII termina num sulfonilo e, em conformidade, é o residuo do acido sulfonico correspondente. 0 grupo da formula VIII tem um, ou dois, grupos de metileno, de preferencia dois.

grupo Z da formula IX é um aminoácido de comprimento variável, que pode conter de 1 a 22 grupos de metileno. Uma classe preferida de grupos de formula IX contem de 1 a 10 grupos de metileno, e com mais preferencia de 3 a 8 grupos de metileno.

Os grupos Z os mais preferidos, são aqueles da formula VII, em que t é 1, e os da formula IX, em que u é de 3 a 8.

Nos grupos de formula VII, VIII e

IX, existe um grupo de carboxi R®, quer na forma livre,

-19quer na forma de sal. Os sais são formados com qualquer metade capaz de formar um sal fisiologicamente aceitável do acido carboxílico. Os sais de metais alcalinos e os sais de hidrohaletos são particularmente adequados. Deste modo, os sais de potássio, de sodio e de litio, bem como os sais de cloridratos, de bromidratos e de fluoridratos , são particularmente proveitosos na técnica do invento em conside ração.

Outros sais aceitáveis, na quimica farmacêutica, não obstante, são, também proveitosos. Por exemplo, os sais de aminas, tais como a trietilamina, a trietanolamina, a etildimetilamina e outras idênticas são proveitosas, bem como são os saisde amonio quaternários, incluindo os sais de tetraa1qui1amonio , os sais de (benzil ou feni1 )trialquilamonio e outros idênticos. Entre os sais de amonio, são tipicos e preferidos os sais de tetrabutilamonio, benziltrimeti1amónio e tetrameti1amonio . Os farmacêuticos utilizam, continuamente, sais de ácidos carboxilicos; não obstante, e os sais em consideração, em que, r6 é uma metade de formação de sal, podem ser preparados com qualquer base que forme um sal fisiologicamente aceitável

Os intermediários necessários, a partir dos quais se derivam os grupos da formula VI, encon-⁵tram-se na técnica da quimica farmacêutica, e os peritos vulgares daquela técnica podem obter qualquer deles.

Um artigo proveitoso de revista, na síntese de medicamentos de metotrexatos, é Rahman e

Chhabra, TheRevista Res. Medicinal 8 , No.1 ,95-155( 1988).

-200 Grupo de Ligação grupo de ligação X é um grupo org£ nico, que está ligado ao carbonilo. numa extremidade, e à hidrazida na outra.

grupo de ligação da formula II é um grupo de alquileno. em que a porção (CH₂) , é por exemplo, metileno, etileno, propileno. pentileno e outros afins.

grupo R é hidrogénio ou fenilo, que podem ser substituídos por um ou dois grupos de afasta mento electronico. Deste modo, o grupo R pode ser fenilo,

3- nitrofeni1 o, 2,4-diclorofenilo , 3-bromo-5-f1uorofenilo ,

4- cianofenilo , 3-trifluorometilfenilo . 2-c1oro-4-trif1uoro metilfenilo, 3-nitro-4-trifluorometilfenilo. e outros idênticos.

termo halogénio e empregado, neste documento, para se referir ao cloro, bromo e fluor.

hidrogénio é um grupo preferido R; o fenilo não substituido é um outro grupo preferido R. e um terceiro grupo preferido R é o fenilo mono-substituido.

grupo de formula III é uma porção de alquilarilo. em que o grupo de arilo de ponte Ar é fenilo ou pirrolilo. Um grupo Ar de fenilo está ligado na posição meta ou para de preferencia na posição para.

-21A metade (CH₂)_n. no grupo de formula III, é a mesma que o grupo corresponde na formula II; deste modo, quando n é 0 o grupo não é mais do que uma ligação, ou pode ser um grupo de alquileno, como foi descrito no precedente. E preferível para n ser 0; é também preferível para n ser 2 a 4.

grupo de formula IV é um grupo de ligação ligado â amida. que pode conter uma. ou duas, pontes de alquileno. Os grupos alquileno (CH₂)_n, no grupo de formula IV, são os mesmos que os debatidos no precedente, sob o grupo de formula II. No plano de grupos da formula IV. as duas pontes de alquileno facultativas podem ser consideradas independentemente — isto é. n pode ser 0 em ambas os casos, um pode ser 0 e o outro pode ser um nu mero inteiro de 1 a 5. ou ambos podem ser numeros inteiros de 1 a 5.

E preferivel que ambos os grupos (CH₂) ^seJ^am 9^ruP°^s de alquileno, em que n seja de 1 a 4 , ou, com mais preferencia, que seja 2 ou 3.

grupo de formula V é um grupo ligado â amida mais complexo, que, muitas vezes, incorpora uma metade de aminoácidos. 0 grupo (CH₂)_n é semelhante ao mesmo tempo e grupo que o debatido sob a formula II.

grupo pendente pode ser um grupo de alquilo de C^-C^, substituído por amino, hidroxi ou guanidino (NH-C(=NH)-NH₂ ) Deste modo, ele inclui grupos, tais como aminometilo, 2-aminoetilo, 4-aminobutilo, 2-hidroxietilo , 3-hidroxipropi lo, 4-hidroxibutilo. guanidinometi1 o, 2-guanidinoeti1 o e

4-guanidinobutilo. por exemplo R¹ pode, também, ser hidrogénio ou amino. Os grupos preferidos R¹ são amino. hidro-22ximetilo, aminoalquilo, especialmente 4-aminobutilo e guanidinoalquilo, especialmente 4-guanidinobutilo.

grupo R é uma ligação, quando n é 0, ou pode ser um grupo de alquileno de 1 a 5 átomos de carbono, fenilo ou pirrolilo. Um grupo R de fenilo está ligado na posição meta ou para. Um grupo (CH₂)_n é o mesmo que o correspondente grupo de alquileno, descrito sob o grupo de formula II, e pode ter os mesmos valores.

Os grupos de ligação, os mais preferidos, de formulas II,III, IV e V são o 4-benzi1ideno o 4-meti1benzi1ideno e o 2-eti1aminocarboni1-4-benzi1ideno.

Os Anticorpos Derivatizados

Os anticorpos derivatizados são intermediários para a sintese dos conjugados, consistindo no anticorpo modificado pela reacção com o agente de ligação intermediário. 0 grupo de agente de ligação termina com um carbonilo, ou com um seu acetal de di (metilo ou etilo),com o qual a hidrazida do medicamenti de metotrexato é feita reagir, numa fase final. Deste modo, o grupo de ligação X termina com =0, ou com (OCH.^^, ou com (OCF^CHg^, nos anticorpos derivatizados . A forma carbonilo é a preferida, mas os acetais são reagentes satisfatórios e podem ser empre gados, quando o for conveniente fazê-los.

-23As variáveis X e m têm o mesmo valor nos anticorpos derivatizantes , o qual foi debatido no prece dente. Os anticorpos derivatizados preferidos correspondem aos conjugados preferidos, no que eles são abrangidos pelos anticorpos preferidos, combinados com o número m preferido dos grupos de agentes de ligação, constituídos pelos grupos X preferidos.

Sintese

Os conjugados do invento em conside ração são preparados de acordo com os processos que são, de um modo geral, semelhantes aos empregados, actualmente, na técnica. E preferido fazer reagir o agente de ligação com o anticorpo, em primeiro lugar, em seguida, fazer reagir o agente de ligação com a hidrazida do medicamento metotrexato. como a fase final. Uma vantagem desse processo sintético é que a forma estereospecifica do medicamento de metotrexato é conservada mais facilmente.

Deste modo, a primeira fase, ou fdases, da sintese é preparar o grupo de ligação, numa forma adequada para ser reagida com o anticorpo numa extremidade, e com o medicamento de metotrexato na outra. Em seguida, o grupo de ligação é ligado ao anticorpo, para preparar o anticorpo derivatizado. e. finalmente, o medicamento de metotrexato é ligado às extremidades do carbonilo ou do acetal, do agente de ligação. Deve compreender-se que, sem pre que o anticorpo se encontre presente numa mistura da reacção, o processo deve ser levado a efeito sob condições adequadamente moderadas, para se impedir danos ao anticorpo.

-24A síntese pode ser representada, esquematicamente, como se segue:

Ab + m[R⁷-CO-X=R⁸ ] Ab[CO-X=R⁸Jm Ab[CO-X=R⁸] + m[H2NHN-M] Ab[CO-X=N-HN-M1

Ul ^Jm em que R⁷ é um grupo de activação do acido carboxílico; e

O

Ab, X, R e m são o que ficou estabelecido no precedente.

Na formula precedente, o grupo R⁷, é escolhido entre os grupos bem conhecidos, empregados habitua 1 mente para activar os ácidos carboxi1icos . para emprego como reagentes de acilação. Por exemplo, o succinimidoxi , o ftalimidoxi. o metanossulfoniloxi . o toluenossul foniloxi, o benzenossulfoniloxi . o benzotriazo 1i1oxi . o cloro, o bromo, o azido e outros análogos são empregados habitualmente, como tais grupos de activação. Os grupos de activação preferidos são o succinimidoxi . o ftalimidoxi e o benzotriazoliloxi .

Enquanto as reacções são levadas a efeito, os grupos de amino livre, que são parte sunstituir^ te R do pendente, são bloqueadas com os grupos de protecção, facilmente amovíveis convencionais. Tais grupos são debatidos, exaustivamente, por Green , Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Nova Iorque,1981.

-25Os grupos empregados aqui devem ser amovíveis sob condições absolutamente moderadas, para se evitarem prejuízos do/ao anticorpo. Tais grupos de protecção são conhecidos pelos químicos; particularmente proveitosos incluem o acetoacetato de etilo, o citraconato e o dimetiImaleato de etilo.

Os intermediários dos agentes de

8 ligação R -CO-X=R , são compostos comparativamente simples, e podem ser comprados, ou preparados facilmente pelos processos convencionais. Os intermediários dos agentes de ligação, que possuem uma ligação de carboxamido, são, preparados, o mais convenientemente, pela reacção de uma amina primária, que forma uma extremidade do intermediário do grupo de ligação, com um ácido carboxílico activado que forma a outra extremidade do intermediário. Tais reacções podem ser levadas a outra extremidade do intermediarip e a efeito numa base moderadamente aquosa, â temperatura ambiente, ou ligeiramente elevada, e dão origem a boas produções, num periodo de algumas poucas horas.

As diversas fases da síntese dos conjugados em consideração podem ser levadas a efeito, para se tornar máximo o comportamento do equipamento, o qual o processo é levado a efeito, ou para tornar máximo o renidmento.

Na maior parte dos casos, se não em todos, o anticorpo, ele proprio. representa o preço máximo no processo e, por isso, a optimização do processo implica o tornar máximo o rendimento baseado no anticorpo. As condições de operação óptimas e precisas, por isso, de-26pendem das condições da máxima estabilidade do anticorpo especifico empregado. Em conformidade, é provável que as condições de operação óptimas exijam o emprego de um excesso absolutamente grande do medicamento de metotrexato, com o fim de se utilizar o anticorpo no máximo enquanto se reduz ao minimo a duração de tempo, no qual o anticorpo é exposto â mistura da reacção.

Os grupos de activação do acido carboxilico são aplicados facilmente aos ácidos carboxilicos dos intermediários do grupo de ligação, pelo emprego a dicilohexiIcarbodiimida ou outros reagentes de esterificação. Tais reacções são levadas a efeito em solventes orgânicos inertes, tais como o dioxano. o tetrahidrofurano, os hídrocarbonetos clorados e outros afins, e podem ser realizadas a temperaturas moderadas, de ordem de 0 a 50°C.

A preparação dos intermediários do grupo de ligação é mais adiante explicada, nas Preparações.

A preocupação principal na escolha das condições, sob as quais se devem fazer reagir os inter mediarios do agente de ligação com o anticorpo, é manter a estabilidade do anticorpo. A reacção deve ser levada a efeito num meio aquoso de uma composição, que não prejudica o anticorpo. Um meio aquoso, particularmente adequado, é uma solução de um tampão de borato, na qual a concentração do ião de borato é da oedem de 0,1 a 0.5 molar. Um outro meio aquoso adequado, no qual se deva levar a efeito a reacção é uma solução salina protegida fisiologicamente com um tampão. 0 pH do meio da reacção deve ser ligeiramen te básico, da origem de 7 a 9. Não obstante po meio de reacção deve ser aquoso, a presença de quantidades pequenas de solventes orgânicos não é prejudicial, e pode tornar-se

-27absolutamente conveniente. Por exemplo, pode ser mais vantajoso dissolver-se o intermediário do grupo de ligação numa quantidade pequena de solvente orgânico por exemplo, a dimetilformamida, o acetonitrilo, o tetrahidrofurano, o dioxano, ou um éter de glicol. e adicionar-se a solução orgânica à solução do anticorpo, no meio aquoso.

De um modo geral . tornar-se-à necessário proceder-se à reacção, a uma concentração relativamente baixa, visto que a solubilidade dos anticorpos, não é de um modo geral, grande. Por exemplo, a concentração do anticorpo, é, habitualmente, da ordem de 5 a 25 mg, por milímetro do meio aquoso.

Como foi descrito no precedente, de 1 a cerca de 10 moles do grupo de ligação e do medicamento são ligados a cada mole do anticorpo. Com a finalidade de se obter proporção de conjugação, é, habitualmente, necessário empregar-se uma quantidade em excesso do intermediário do agente de ligação. A reactividade dos anticorpos e dos ésteres activos. sob a s condições de acilação , é algum tanto variável, mas, de umodo geral, cerca de 5 a cerca de 15 moles do intermediário do grupo de ligação, por mole do anticorpo, são empregados no processo.

Deixa-se que a reacção de acilação se processe de alguns minutos a algumas horas, a temperaturas da ordem de cerca de 0°C a cerca de 40°C. Obviamente, as temperaturas elevadas podem ser prejudiciais ao anticorpo e é mais aconselhável operar a temperaturas baixas, particularmente uma vez que a reacção é inerentemente rápida.

-28Quando o anticorpo derivatizado, tendo os grupos intermediários do agente de ligação depositados, tiver sido preparado, a mistura da reacção pode ser cromatográfada pelos processos convencionais, como se revela nos exemplos a seguir, para separar o anticorpo derivatizado do intermediário do agente de ligação que não tenha reagido.

Se a purificação se não tiver efectuado, neste momento, então o medicamento do metotrexato deverá ser gasto fazendo-o reagir com o intermediário do grupo de ligação em excesso, na primeira mistura da reacção.

Finalmente, o conjugado do medicamento é concluído, fazendo reagir a -hidrazida do medicamento de metotrexato com o anticorpo derivatizado. A reacção é uma reacção simples de cetona ou do aldeído, ou do seu acetal. que é o grupo teFminal do intermediário do grupo de ligação, com a hidrazida do medicamento. E uma reacção rapida. que se processa bem. à cerca da temperatura ambiente. em meio aquoso.

No ideal, o anticorpo acilado é purificado pela cromatografia. eluindo-se com uma solução, que forma um meio de reacção satisfatório para a reacção do medicamento de metotrexato. bem como que proporciona uma boa separação na cromatografia. Os tampões aquosos diluídos são adequados para ambas as finalidades.

-29Por exemplo, um meio de reacção particularmente proveitoso é o tampão de acetato diluído, mais especificamente acetato de sodio a 0.1 molar, a um pH ligeiramente acido, da ordem de cerca de 5 a cerca de

7. A reacção pode, também, ser levada a efeito, contudo, em tampão de borato, em tampões de fosfatos ligeiramente ácidos, em salina protegida com tampão fisiologico e em outros idênticos, uma vez que o pH seja ligeiramente ácido. Quantidades pequenas de solventes orgânicos no meio da reacção não são prejudiciais, como foi debatido no precedente uma vez que os solventes não tenham uma tendencia para prejudicar o anticorpo.

A reacçao com a hidrazida de metotrexato, é levada a efeito durante períodos de reacção da ordem de cerca de uma hora a cerca de um dia. As temperaturas, da reacção. da ordem de cerca de 0 a 40°C, são as empregadas, devendo escolher-se a temperatura para tornar máximo o rendimento baseado na quantidade do anticorpo na mistura da reacção.

Finalmente, o conjugado do medicamento do invento em consideração é purificado e isolado pela cromatografia. por meios convencionais. E particularmeq te conveniente eluir o conjugado do medicamento com salina protegida com tampão fisiologico. Pode ser possível eluir-se o conjugado do medicamento a uma concentração que seja adequada para a administração ao paciente, mas é. habitualmente, necessário concentrar-se o conjugado, como pela diálise pelo vacuo.

-30A síntese dos conjugados do medicamento do invento em consideração é expplicada mais adiante, pelas Preparações e pelos Exemplos, específicos, que se seguem.

Preparação 1.

Metotrexato - tf -hidrazida

A um balão de 100 ml. adicionaramse 1,61 gramas (10 mmoles) de éster de 5-metilo. do acido L-glutâmico. A isto se adicionaram 60 ml de acetato de t-butilo, e a mistura foi agitada durante muito pouco tempo. A isto se adicionaram, em seguida, gota a gota e lentamente 1,58 gramas (11 mmmoles) de acido perclórico a 70%, com boa agitação. Deixou-se a mistura a agitar-se, sob o nitrogénio, durante dois dias, e ela foi, em seguida, extraída com 100 ml de acido clorídrico a 0,5N. em tres parcelas.

As camadas aquosas foram reunidas e foram neutralizadas com 30 gramas de bicarbonato de sodio.

A solução neutra foi extraída com tres parcelas de éter dietílico. 150 ml no total, e as camadas organicas foram reunidas e foram lavadas com salmoura. A solução organica lavada foi. em seguida, seca com o sulfato de sodio. e foi evaporada à tempertaura ambiente, sob o vacuo, para se obterem 1,18 gramas (5.4 mmoles)

-31de um óleo límpido, que foi identificado como o diéster de

5-meti1 -1-t-butilo, do acido L-glutâmico.

A um balão de 100 ml. seco no forno, adicionaram-se 0,92 ml (6.6 mmoles) de trietilamina, ml (6,6 mmoles) de cianofosfonato de dietilo e 49 ml de dimetilformamida, destilados recentemente, sob o vacuo, do oxido de bário. A solução em agitação, adicionaram-se 506 mg (1,3 mmoles) de trihidrato de 2.4-diamino-6-/~N-meti1-N-(4-carboxifeniI )amino7-pteridina. Assim que o inter mediário se tivesse dissolvido, com agitação, a mistura foi aquecida a 80°C, e, em seguida, adicionaram-se 0,20 ml (1,4 mmoles) de trietilamina e 342 mg de diéster do acido L-glutâmico preparado no precedente . a 1 ml de dimetilformamida .

A mistura foi agitada, durante duas horas, a 80°C. efoi. em seguida, arrefecida, e o solvente foi retirado sob o vacuo. 0 residuo foi recolhido em 300 ml de cloroformio e foi lavado com uma solução de bicarbonato de sodio a 5%. A camada aquosa, foi extraída com o cloroformio, e as camadas organicas, foram reunidas, foram secos, sobre o sulfato de sodio e foram concentradas sob vacuo, para se obterem 1.35 gramas de um óleo alaranjado, que foi cromatografado sobre 150 gramas de gel de silica, eluindo-se com metanol a 10%, em cloroformio. As parcelas, que continham o produto, foram reunidos e foram concentrados, dando origem a 645 mg de diester de metotrexato, em que o tf-carboxi se encontrava na forma de ester de metilo, e o °t-carboxi se encontrava na forma de éster de t-butilo.

-320 intermediário precedente foi reu nido com um outro lote do mesmo, perfazendo 697 mg(1,3 mmoles) ao todo, e foi dissolvido em 12 ml de metanol. A ele adicionaram-se 170 mg (5,3 mmoles) de hidrazina anidra, e a mistura foi agitada à temperatura ambiente, sob azoto, durante seis dias.

Em seguida, o solvente foi removido, sob vacuo e o redisuo foi cromatografao sobre 150 gramas de gel de silica, eluindo-se com metanol a 15% em cloroformio, dando origem a 470 mg (0,9 mmoles) de metotrexato- «S-t-buti léster- <<-hidrazida.

intermediário precedente foi dis^ solvido em 120 ml de acido clorídrico a 1N, e foi aquecida a 55°C, durante 50 minutos. Foi, em seguida, concentrado sob o vacuo atê se solidificar, e o residuo foi recolhido em 80 ml de acetato de amonio a 0,01M a pH8.

A solução foi armazenada, durante tres dias, a 4°C. e foi. em seguida, cromatografada sobre 300 ml de Sepharose Fast Flow Q, (Pharmacia Inc.. Piscataway, NJ) eluindo-se, de uma maneira de gradiente, com o mesmo tampão empregado imediatamente antes (Tampão A) e com o acetato de amonio a 1, 0M, a pH 8 (Tampão B). As parcelas, que continham o produto, eluindo-se no tampão B a 100%, foram reunidas e foram 1iofi1izadas, repetidamente para se removerem os vestígios de acetato de amonio. A produção foi de 326 mg (0.7 mmmoles) de metotrexato- Y-hidr£ zida .

-33Preparação 2

Produção de Anticorpos L/1C2

Obtêm-se frascos pequenos de hibridomas L/1C2, da American Type Culture Collection, sob o numero de acesso HB9682. As células viáveis são recuperadas. descongelando o conteúdo de um frasco, num banho de agua a 37°C, enquanto se anda à roda com o frasco. A suspensão das células é. em seguida, diluida 1:2 com uma solução de sal equilibrada (Grand Island Biological Company (GIBCO) 3175 Staley Road, Grand Island. Nova Iorque 14072) e a suspensão é centrifugada através de uma camada de soro, para partição das células a partir do meio criogénico. 0 sobrenadante aspirado, e as células nas pastilha de células são suspensas no meio da cultura (Ventrex, HL-1 Ventrex Laboratories, Portland, ME) acrescido com o soro de vitela fetal, 2 mM L-glutamina (GIBCO) e 50 )jg/ml de sulfato de gentamicina (GIBCO), em frascos de cultura de tecidos T75, em dioxido de carbono a 5% a 37°C. Os sobrenadante de culturas aproximadamente confluentes são recuperados e as células residuais são removidas por centrifugação.

anticorpo é purificado a partir do sobrenadante livre das células, passando-o sobre uma coluna de Sepharose de Proteina A (Pharmacia). 0 anticorpo liga-se â coluna e o meio de cultura é lavado livremente em fosfato de sodio a 0,01M a pH 8,0. 0 anticorpo é, em seguida, eluido da coluna, com um tampão de fosfato de sodio a 0,1M, a pH 3,5. 0 anticorpo eluído é neutralizado, imediatamente, com um tampão de Trizma a 1M (Sigma, St. Louis, MO) a pH 7,4 e é dialisado e é concentrado num dialisador de vacuo (Bio-Molecular Dynamics, beaverton, OR) contendo fosfato de sodio a 0,01m pH 7.4 e cloreto de sodio a 0,15M. As preparações do anticorpo são esterilizadas por filtração, atra-34vés de orifícios a 0,2 um e são armazenadas a 4°C, até serem empregadas.

Preparação 3

Ester de N-succinimido do acido 3-(4-formilfenilcarboni1 amino )propiónico

Num balão de 250 ml, deitaram-se 3 gramas (20 mmoles) de 4-carboxibenzeldeido e 2,3 gramas (20 mmmoles) de N-hidroxissuccinimida em 100 ml de dioxano. A mistura foi agitada durante 5 a 10 minutos, e em seguida, adicionaram-se 4,1 gramas (20 mmoles) de diciclohexilcarbodiimida. A mistura foi agitada, durante uma hora, â temperatura ambiente, e foi, em seguida, filtrada. 0 filtrado foi evaporado sob o vacuo, dando origem a 9,4 gramas de um solido branco, que foi cristalizado novamente em 25 ml de isopropanol quente. 0 produto intermediário foi triturado com isopropanol, dando origem a 2,1 gramas (8,5 mmoles) do éster de N-succiinimido de 4-carboxibenzaldeido desejado.

Fizeram-se lotes adicionais do intermediário, e adicionou-se um total de 10 gramas (40 mmoles) do éster de N-succinimido a uma solução de 3,6 gramas (40 mmoles) de B-alanina em 40 ml de hidroxido de sodio a 1N e cerca de 100 ml de água. Manteve-se o pH acima de 8, e a mistura foi agitada durante 1,5 horas. Em seguida, a mistura foi filtrada, e o filtrado foi tornado ací

-35do a pH 1,9, com o acido clorídrico a 2N. Ele foi extraido por tres vezes, com um total de 150 ml de acetato de etilo, e os extractos orgânicos foram reunidos e foram lavados com salmoura. 0 estracto orgânico foi, em seguida, seco sobre o sulfato de sodio, e foi evaporado sob o vacuo, dando origem a 4,6 gramas (21 mmoles) de um solido branco, o ácido 3-(4-formilfeni1carbon i1ami no)propi ón i co.

Cem mg (0,45 mmole) do intermediário precedente, 103 mg (0,5 mmoles) da diciclo-hexilcarbodi-imida 57,5 mg (0,5 mmole) de N-hidroxissucinimida, e 10 ml de dioxano foram derramados num balão pequeno, e a mistura foi agitada â temperatura ambiente, sob o nitrogénio. 0 curso da reacção foi observado pela cromatografia de camada fina, e adicionado 75 mg (0,36 mmoles) de diciclohexilcarbodi-imida adicional e 45 mg (0,4 mmoles) de N-hidroxisuccinimida adicional. Depois de quatro horas, a mistura de reacção foi filtrada, e o filtrado foi evaporado até se obter um solido, sob o vácuo. Obtiveram-se cerca de 200 mg de um produto impuro, o qual foi cromatografado sobre 30 gramas de gel de silica, eluindo-se com isopropanol a 5% em diclorometano. As parcelas, que continham o produto, foram reunidas e foram evaporadas, dando origem a 81 mg (0,25 mmole) do intermediário desejado, numa forma algum tanto impura.

-36Preparação 4

Anticorpo L/1C2 propioni1-3-aminocarboni1-4-benza1 deido

Num balão de 100 ml, à temperatura ambiente, derramou-se uma solução de 1.026 mg (6,8 umoles) de anticorpo L/1C2 em 76,1 ml de tampão de borato a 0,34M, a pH 8,6 em seguida, por 14,1 mg (44 umoles) do éster activo de Preparação 3, em 3,3 ml de acetonitrilo.

A mistura foi agitada, durante uma hora, â temperatura ambiente. Foi, em seguida, cromatografada , sobre 90 gramas de Sepharex G25 (Pharmacia), eluindo-se com acetato de sodio e a 0.1M a pH 5,6.

As parcelas foram avaliadas pela analise de ultravioletas, a 258 e a 280 nm, e as parcelas contendo o produto foram reunidas, dando oirgem a 948 mg (6,3 umoles) do produto desejado, na forma de 111,5 ml de uma solução com uma concentração de 8,5 mG/Ml.

A proporção da conjugação do antj_ corpo derivatizado foi de 4,8 mmoles do grupo da ligação, por mole do anticorpo.

-37Exemplo 1 conjugado do anticorpo L/1C2 propioni1-3-awinocarboni1 -4-benzaldeído com a metotrexato- á-hidrazida

Uma parcela de 55,6 ml do produto da Preparação 4, contendo 472 mg (3,1jjmmoles) do anticorpo derivatizado, foi diluída com 87 ml de acetato de sodio a 0,1M a pH 5,6.

Uma parcela de 101 mg (216 ^immoles) de metotrexato-í -hidrazida foi recolhida em 7,2 ml de acetonitrilo e 21,6 mlde tampão de fosfato de potássio monobásico a 1M. Adicionou-se um pouco de hidroxido de sodio 5N. â solução e a solução foi. então, adicionada â solução do anticorpo. A mistura da reacção foi tornada ácida a pH

5,8 com o ácido acético cristalizado, e foi agitada durante 16 horas, à temperatura ambiente. Ela foi. em seguida, centrifugada e o sobrenadante foi cromatografado sobre duas colunas de cromatografia de Sephadex G25 de 90 gramas, eluidno com soro fisiologico tamponado.

Um total de 202,8 mlde solução foi recolhido de cromatografia, o qual foi analisado pela espectroscopia de ultravioleta, observando-se o espectro a 280 a 370 nm. A analise revelou que a solução continha 0,018 mg/ml de metotrexato e 1,87 mg/ml do anticorpo.

A proporção da conjugada foi, deste modo, de 3,0 em termos molares.

A solução do produto foi concentra da pela diálise de vacuo, contra a salina protegida com um tampão fisiologico, no frio, combinando a solução do produto deste exemplo com 212 ml da solução do produto de uma serie de semelhante. 0 volume foi reduzido pela diálise a 108 ml .

produto foi avaliado contra o tumor humano T222 (Masui et al , Câncer 44, 1002.07 (1984 ))., instaurado em ratas nuas, como xenoenxerto. 0 conjugado foi administrado aos ratos em doses (baseadas no conteúdo da hidrazida de metotrexato), representadas na tabela a seguir, como injecções intraveçosas, nos dias 3, 6 e 9, após os tumores terem sido implantados nos ratos. Os tumores foram medidos duas, tres e quatro semanas após a implantação dos tumores, e os resulatdos estão registados a seguir,como uma percentagem da inibicção do desenvolvimento dos tumores, nos ratos tratados, em comparação com o desenvolvimento dos animias de controlo não tratados.

Os animais de controlo positivos foram tratados com metotrexato- <-hidrazida, na forma de não combinada, para proprocionar uma comparação com os animias tratados com o conjugado. A toxicidade dos tratamentos encontra-se registada como o numero de animais, em cada grupo de tratamento de 5 ratos, que exibiam sinais de toxicidade. Os resultados são os que se seguem.

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-40Exemplo 2

Conjugado do anticorpo L/1C2 propioni1-3-aminocarboni1-4-ben zaldeido com a metotrexato- íf-hidrazida processo do Exemplo 1 foi repetido por quatro vezes sobcondições diferentes, como se segue .

A. Um lote de 0,67 mg de metotrexato- tf-hidrazida dissolvi do com 67 ul de acetato de sodio a 0,1M, a pH 5,6 e 3,3 ul de acetonitrilo, foi reunido a 1 ml de uma solução contendo

2,2 mg do intermediário da Preparação 4, em acetato de sodio a 0,1M e a mistura foi deixada a assentar-se, durante 11 horas. Ela foi, em seguida, cromatográfada sobre 5,9 gramas de Biogel P6 (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA 94804), dando origem a 5 ml de solução do conjugado, que se verificou conter 0,6 mg do conjugado desejado, a uma proporção de conjugação de 3,2 moles do metotrexato por mole do anti corpo.

Β. A mesma quantidade da solução de metotrexato- ^-hidrazida, empregada em A, foi reunida a 0,95 ml da solução do intermediário da Preparação 4, contendo 0,42mg do intermediário, e deixou-se a mistura a assentar-se durante 11 horas. Ela foi cromatográfada como em A, dando origem a

4,75 ml da solução do conjugado, contendo 0,11 mg do conjugado, a uma proporção da conjugação de 5,4 mmoles por mole.

-41C. Um lote de 0,7 mg de metotrexato-< -hidrazida, dissolvido em 50 ul de acetonitrilo e 100 ^il de um tampão de fosfato de 1M, a pH 5,8 foi reunido a 2,2 mg do intermediário da Preparação 4, dissolvido em 1 ml de acetato de sodio a 0, 1M a pH 5,6. Depois da mistura se ter assentado durante 11 horas, ela foi cromatográfada como em A, dando origem a 5,3 ml da solução do conjugado contendo 1,3 mg do conjugado a uma proporção da conjugação de 3J moles por mole.

D. Um lote de 0,7 mg de metotrexato - ti -hidrazida, dissolvido em 50 ul de acetonitrilo e 150 |jl de um tampão de fosfato a 1M, a pH 5,8 foi reunido a 2,2 mg do intermediário do Exemplo 4, em 1 ml de acetato de sodio a 0,1M. Deixou-se a mistura a assentar-se durante 14 horas, e, em seguida, ela foi cromatográfada como em A, dando origem a 5,3 ml de solução do conjugado, contendo 1,7 mg do conjugado a uma proporção de conjugação de 3.3.

Os produtos dos processos C e D precedentes foram avaliados, pela sua capacidade em inibir o desenvolvimento das células do tumor T222 , em cultura de tecidos, adicionando concentrações controladas dos conjugados ao meio da cultura. 0 anticorpo livre L/1C2, empregado como um controlo inibiu o desenvolvimento das células em 37% a 16 mcg/ml , e em 98% a 160 mcg/ml . 0 conjugado do Exemplo C precedente inibiu o desenvolvimento em 13% a 0,0013 mcg/ml e em 87% a 0,013 mcg/ml, baseado no conteúdo da metotrexato-ti -hidrazida.

conjugado do Exemplo D precedente inibiu o desenvolvimento das células em 21% a

0,0016 mcg/ml, e em 92% a 0,016 mcg/ml, baseado no conteúdo

-42do metotrexato--hidrazida .

Preparação 5

Anticorpo L/1C2 carboni1-4-benza1 deído

Um lote de 0,31 mg do éster de N-succinimido de 4-carboxibenzaldeido foi preparado como foi descrito na Preparação 3 precedente. Ele foi dissolvido em 100 jjI de dimetilformamida e foi adicionado a 18,9 mg do anticorpo L/1C2 em 2,1 ml de tampão de borato a 0,34M a pH 8,6. A mistura foi agitada durante 1,5 horas à temperatura ambiente e ela foi, em seguida, cromatografada sobre 6 gramas de Biogel P6. eluindo-se com o acetato de sodio a 0,1M a pH 5,6. Um lote de 6,2 ml da solução foi obtido e foi analisado com ultravioletas, observando-se os espectros a 256 e 280 nm.

A analise revelou que se obtiveram 16,1 mg do anticorpo derivatizado, a uma concentração de 2,6 mg/ml com uma proporção de conjugado de 5.2 mmoles do agente de ligação, por mole do anticorpo.

-43Exemplo 3

Conjugado do anticorpo L/1C2 carboni1-4-benza1 deido , com a metotrexato-y -hidrazida ml da solução da Preparação 5, contendo 10,4 mg (0,069 umoles) do anticorpo derivatizado foram reunidos a 3,2 mg (6,8 ummoles) de metotrexato-7 -hidrazida em 250 pl de dimetilformamida. Deixou-se a mistura a asentar-se durante 6 horas, à temperatura ambiente, e, em seguida, colocou-se-a no frigorifico. Depois de dois dias, a mistura foi centrifugada , e o flutuante foi cromatografado sobre Bio-Gel P6, eluindo-se comsalina protegida com tampão fisiologico, dando origem a 8.5 ml de solução, que foi analisada com raios ultravioletas, observando-se o espectro a 280 e 370 nm. A analise revelou que o produto tinha uma proporção de conjugados de 6.4 moles do medicamento por mole do anticorpo, e que a solução continha 0,64 mg/ ml do conjugado.

produto foi avaliado pela sua capacidade para inibir o desenvolvimento das células do tumor T222, em cultura de tecidos. Verificou-se que o conjugado produzia 70% da inibição do desenvolvimento das células, a uma concentração de 0,035 mcg/ml , baseada no conteúdo de metotrexato.

-44Preparação 6 fragmento F(ab ’ do anticorpo L/1C2.

fragmento F(ab'do anticorpo L/1C2 foi preparado, adicionando-se 2, 4 ml da solução de pepsina, contendo 12,6 mg de pepsina/ml, a 1,5 gramas do anticorpo L/1C2 em 270 ml de salina protegida com um tampão fisiologico. Manteve-se a mistura a 37°C, durante 2 horas e 20 minutos e, em seguida, interrompeu-se a reacção pela adição de trietanolamina. Em seguida, o produto foi concentrado pela cromatografia sobre uma coluna de Fluxo Rápido de Sepharose, eluindo-se com o acetato de sodio e a 0,15M. Os lores, que continham os fragmentos F(ab')₂, foram reunidos e foram concentrados pela diálise, dando origem a 100 ml de solução do produto, contendo 992 mg do fragmento F(ab')₂ do anticorpo L/1C2.

-45Preparação 7

Propioni1-3-amino-carboni1-4-benzaldeido do fragmento F(ab*) do anticorpo L/1C2.

fragmento F(ab')₂ do anticorpo L/1C2 preparado na Preparação 6, foi dialisado nun· tampão de borato de 0,34 M, a pH 8,6 dando origem a 23 mg (0,23 umoles) de fragmento Fíab¹^. na forma ce 3,8 ml de solução.

Aquela solução foi reunida com 0,44 mg (1,4 ummoles) de acido 3-(4-formi1feni1carbonilamino ) prop i ón i co , éster de acido de N-succinimidos, em 102 pi de acetonitri1c. A mistura foi agitada, durante uma hora, a temperatura ambiente, e a solução foi, em seguida, cromatografada sobre uma coluna de 11 grama: ce Sephadex G2b, eluindo-se com o acexato de sodio a 0,1M a pH 5,6. Os lotes, que continham o produto, foram reunidos dando origem a 19 mg (0,19 umoles) do fragmento do anticor po derivatizado, a uma proporção de conjugado de 2,8 moles por mole, em 9,6 ml de solução.

-46Exemplo 4

Conjugado de propioni1-3-amino-carboni1-4-benzaIde ido do fragmento F(ab')₂ do anticorpo L/1C2, com metotrexato-Y h i draz ida

A 2,7 ml da solução do fragmento do anticorpo derivatizado, da Preparação 7, contendo 8 mg (0,08 /jmoles) do fragmento do anticorpo derivatizado, adicionou-se 0,47 ml do tampão de fosfato a 1M, a pH 5,6.

Aquela solução, adicionaram-se 3,7 mg (7,9 ^jrnoles) da metotrexato- Y-hidrazida, dissolvidos na quantidade minima de acetato de sodio a 0,1M.

pHda mistura foi rectificado para 5,6 com o acido clorídrico diluido e a mistura foi agitada, durante 17 horas, à temperatura ambiente. Ela foi em seguida, centrifugada, e o flutuante foi cromatografado numa coluna de 11 gramas de Sephadex G25, eluindo-se com salina protegida com tampão fisiologico. A analise de ultravioletas revelou que 5,8 mg do conjugado se obtiveram na modalidade de uma solução contendo 0,95 mg/ml, a uma proporção de 2,1 moles por mole.

conjugado foi experimentado numa cultura de tecidos, contra células de tumores T222, e veri ficou-se que inibiam o desenvolvimento das células numa e,x tensão de 22% a uma concentração de 0,0046 mcg/ml , e que i_ nibem o desenvolvimento em 83% a uma concentração de 0,046 mcg/ml baseado no conteúdo da metotrexato- X -hidrazida .

-47Preparação 8

Ester de N-succinimido, do ácido 3-(5-formilpirrol-2-iIcar bonilamino)propiónico.

Num balão deitaram-se 139 mg de ácido 5-formi1pirrol-2-i1carboxi1ico, 247 mg de diciclohexi1carbodiimida , 138 mg de N-hidroxissuccinimida e 10 ml de dimetilformamida. A mistura foi agitada, durante duas horas, à tempertaura ambiente, sob o nitrogénio, e o solveq te foi retirado sob o vacuo, dando origem a 394 mg do éster activo bruto.

residuo precedente foi recolhido em 1 ml de acetonitrilo. Nem todo o residuo se dissolveu.

A mistura heterogénea foi adicionada, lentamente, a uma solução de 89 mg de B-alanina em 2 ml de hidroxido de sodio a 0,5N. Concorrentemente, o hidroxido de sodio a 1N foi adicionado, para se manter o pH entre 7,5 e 8,0.

A mistura foi, em seguida, agitada, à temperatura ambiente, durante 1 hora, e foi filtrada. 0 filtrado foi tornado acido com o acido clorídrico diluído, foi saturado com o cloreto de sodio, e foi extraído com o acetato de etilo. Foi, em seguida, seco e concentra do, dando origem a um óleo alaranjado, que foi cromatografia sobre uma coluna de gel de silica, eluindo-se com metanol a 10% em diclorometano.

-48Os lotes, que continham o produto foram concentrados sob o vacuo, dando origem a 49 mg de acido 3-(5-formilpirrol-2-ilcarbonilamino)propiónico.

Um lote de 31 mg do intermediário precedente foi recolhido em 3ml de dioxano, e a ele se adi cionaram 35 mg de diciclohexilcarbodiimida e 19 mg de N-hidroxissuccinimida. A mistura foi agitada, durante 2 horas, a temperatura ambiente, sob o nitrogénio, e foi, em seguida, filtrada e concentrada sob o vacuo. 0 residuo foi cromatografado sobre gel de silica, eluindo-se com metanol a 5%, em diclorometano, dando origem a cerca de 6 mg do éster activo do intermediário desejado.

Preparação 9

Propioni1-3-aminocarboni1-2-pirrol-5-carboxa1 deído do ant/ corpo Q07B anticorpo 007B é produzido por um hibridoma, que é uma subcloma derivada da hibridoma, que produz o anticorpo KS1/4, que foi descrito por Varki et a 1 , Câncer Research 44, 681-86( 1984 ). Um lote de 105 mg do anticorpo 007B, na modalidade de uma solução, con tendo 15 mg/ml num tampão de borato a 0,34M, foi reunido a 300 ul de uma solução do intermediário da Preparação 8, contendo 1,29 mg do éster activo do intermediário em aceto nitrilo. A mistura foi agitada, durante 1 hora, à tempera tura ambiente e, foi em seguida, cromatografada sobre uma coluna de 10 gramas de Sephadex G25, eluindo-se com o ace-49tato de sodio a 0,1M, a pH 5,6. Os lotes, que continham o produto, foram reunidos e foram analisados pela espectro^ copia de ultravioletas, observando-se a curva a 280 e a 300 nm. 0 produto compreendeu 14,6 ml de solução, a uma concentração de 5,7 mg/ml, num total de 83,2 mg do intermediário designado no precedente. A proporção da conjugação era de 3.6.

Exemplo 5

Conjugado do propioni1-3-aminocarboni1-2-pirrol-5-carboxal deido do anticorpo 007B, com a metotrexato--h i dr az i da

Um lote de 15 mg do intermediário da Preparação 9, na modalidade de 3, 1ml de uma solução, que continha 4,8 mg/ml de um tampão a pH 5,6 que continha acetato de sodio a 0,1M e um ião de fosfato de 0,15M, foi reunido a 4,7 mg de metotrexato -# -hidrazida , em 0,2 ml de um tampão de acetato de sodio. 0 pH foi ajustado a 5,6 depois da adição, e a mistura foi agitada, à temperatura ambiente, durante cerca de 24 horas.

Ela foi, em seguida, centrifugada , e o flutuante foi cromatografado sobre uma coluna de 10 gramas de Sephadex G25, eluindo-se com salina protegida com um tampãi fisiologico. Os lotes, que continham o produ to foram reunidos e foram filtrados através de um filtro de 0,22 mícron, dando origem a 6,05 ml da solução do produto , que continha 9,9 mg do conjugado desejado, a uma proporção de 2.3, como foi determinado pela espectroscopia

-50de ultravioletas, observando-se a curva a 250 e a 280 nm.

A capacidade de ligação do conjugado foi estabelecida pela radioimunoanálise, comparando-a com o anticorpo 007B não conjugado. As curvas de titulação do conjugado e do anticorpo eram essencialmente semelhantes, indicando que a capa cidade de ligação do anticorpo se mantinha essencialmente sem modificação pela conjugação com o agente de ligação e com o medicamento.

Preparação 10

Dietilacetal de propioni1-3-aminocarbonilbutanal do anticor po KS1/4 anticorpo KS1/4 foi dialisado, no tampão de borato a 0,34M, a uma concentração de 20 mg/ml Lotes de um ml da solução do anticorpo foram feitos reagir com o éster de succinimido do acido 3-(4,4-dietoxibuti1aminocarboni1)propionico, que foi adicionado como uma solução de 20 mg/ml em dimetilformamida. Num caso, a quantidade do éster activo foi de 0,24 mg, e no outro caso a quantidade foi de 0,48 mg. Ambas as misturas de reacção foram agitadas durante 2 horas, e foram, em seguida, cromatografadas sobre Biogel P6, eluindo-se com salina protegida com um tampão fisiologico.

-510 produto da primeira reacção foi de 17,8 mg do intermediário desejado, e o produto da segunda reacção foi de 15,6 mg do intermediário desejado.

Exemplo 6

Conjugado de dietilacetal de propionil-3-aminocarbonilbutanaldo anticorpo KS1/4, com metotrexato- Y-hidrazida

Lotes de um ml do anticorpo derivatizado, produzidos na Preparação 10 precedentes, foram feitos reagir com metotrexato-<-hidrazida, em tampão de borato a 0,34 M, a pH 8,6. No caso do primeiro produto da Preparação 10, 3,5 mg do produto precedente foram feitos reagir com 2,3 mg de metotrexato- <f-hidrazida, como uma solução de dimetilformamida.

No caso do segundo produto, a sua quantidade era de 2,9 mg e a quantidade da metotrexato-k hidrazida era de 2,0 mg. Em cada caso, a mistura da reacção foi, em seguida, ajustada a pH 4,9.

As reacções foram, em seguida, levadas a efeito durante 18 horas, a 37°C, e os produtos foram cromatografados sobre Biogel P6, eluidndo-se com soro fisiologico tamponado.

-52Os lotes que continham o produto de cada reacção, foram reunidos, e foram analisados pela espectroscopia de ultravioletas, observando-se as curvas a 279 e a 370 nm. 0 produto da primeira reacção foi de 2,7 mg do conjugado desejado, a uma proporção de conjugação de 2.0. 0 produto da segunda reacção foi de 2,6 mg, a uma proporção de conjugação de 3.9.

Os conjugados do invento em consideração, são proveitosos no processo da inibição do desenvolvimento de células indesejáveis, o qual constitui parte impor tante do invento em consideração. Em conformidade, o inven to inclui, também, uma composição farmacêutica, com mais preferencia uma composição parentérica adequada à injecção no corpo do paciente. Tais composições são formuladas por processos, que são vulgarmente empregados na quimica farmacêutica. Os conjugados em consideração são solúveis aceitavelmente nos fluidos fisiologicamente aceitáveis, tais como as soluções de salina fisiológicas, e outras soluções aquosas, que podem ser administradas parenteralmente , com segurança.

Os produtos para a administração parenteral, são, muitas vezes, formulados e distribuídos no estado de solidos, de preferencia na modalidade de secos por congelação, para a sua reconstituição imediatamente antes do seu emprego. Tais composições são composições proveitosas do invento em consideração.

A sua preparação é bem aceite pelos farmacêuticos; de um modo geral, elas compreendem misturas de sais inorgânicos , para conferir a isotonicidade, e agentes de dispersão, tais como a lactose, para permitir que a

-53perparação seca se dissolva, rapidamente, mediante a sua reconstituição. Tais composições são reconstituídas com água elevadamente purificada para uma concentração conhecida baseada no medicamento de metotrexato.

A dosagem óptima e o programa da administração dos conjugados do inevnto em consideração devem ser determinados pelo médico que se trata, em face do estado de saude do paciente.

E habitual, como é evidente, administrarem-se medicamentos citotóxicos, na modalidade de doses divididas, com intervalos de dias, ou de semanas entre cada serie de doses. Os conjugados em consideração são eficientes numa quantidade ampla de dosagem, e as dosagens por semana estarão, habitualmente, compreendidas num escalão de cerca de 50 a cerca de 1.000 mg/m do medicamento de metotrexato, e com, mais preferencia, no escalão de cerca de 200 a cerca de 400 mG/m .

As composições, que se seguem, são tipicas das empregadas na administração dos conjugados em consideração, e são mencionadas para a orientação do leitor .

-54Exemplo 1

Conjugado do Exemplo 100 mg

Soro fisiologico 10 ml

Armazenar a uma temperatura baixa e administrar intravenosamente,.

Composição 2

Conjugado do Exemplo 3 1 grama

Lactose 10 mg

Soro fisiologico 100 mg

Liofilizar a uma temperatura baixa, armazenar à temperatura ambiente, ou inferior, e reconstituir para administração, com água purificada.

-55Composição 3

Conjugado do Exemplo 4	1	grama
Agente de dispersão	25	mg
Soro fisiologico	100	ml

Composição 4

Conjugado do Exemplo 5 100 mg

Soro fisiológica 10 ml

Armazenar à temperatura baixa e administrar a intravenosamente.

-56Composição 5

Conjugado do Exemplo 6 gramas

Agente de dispersão

Soro fisiologico mg

500 ml

Liofilizar â temperatura baixa, armazenar â temperatura ambiente, ou inferior, e reconstituir para administração com água purificada.

Claims

REIVINDICAÇOES

1-.- Processo para de um conjugado de medicamentos citotóxicos a preparação da formula

Ab[CO-X=N-HN-M] I m

em que m é um numero inteiro de 1 até cerca de 10;

Ab é um anticorpo fisiologicamente aceitável, ou um seu fragmento que reconhece antigénios. que reconhece um antigénio associado a uma célula indesejável;

X é um grupo de ligação de formula

R (CH₂)_n-C= (CH₂ >_n-Ar-CHII

III

- 58(CH₂)_n-CO-NH-(CH₂)_n-CH-, ou

R¹

I

CH-(CH₂)_n-NH-CO-R²-CH=;

R é hidrogénio, fenilo, ou fenilo substituído por um ou dois grupos nitro, halogénio, ciano ou trifluorometilo;

H

R¹ é hidrogénio, amino, aminoalquilo hidroxialquilo

CpC^ ou guanidinoalqui lo CpC^;

-59R² é (CH₂)_n'

H n é um numero inteiro de 0 a 5;

M é um medicamento de metotrexato de fórmula

5 5

FC R

1 I

R³ é N, CH, S ou 0;

R⁴ é CO, S0₂, C0-(CH₂)_s ou CO-NH; c

R é hidrogénio ou alquilo C-C3 ; s é um ou dois;

-60COR⁶
2 é (CO-(CH₂)₂-CH-NH)_t

VII

COR⁶

I

SO₂-(CH₂)_s-CH-NH

COR⁶

I

CO-(CH₂)_u-CH-NH

VIII

IX t é um número inteiro de 1 a 6; u é um número inteiro de 1 a 22;

r6 é hidroxi ou uma porção que completa um sal fisiologicamente aceitável; caracterizado por compreender a reacção de um anticorpo que foi sujeito a derivação da formula

Ab[CO-X=R⁸]

-61em que R® é 0, (0CH₃)₂ ou (OCH₂CH₃)₂; com uma hidrazida de medicamento da formula

H₂NHN-M

2⁵.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o anticorpo ser um anticorpo monoclonal ou quimérico, ou um seu fragmento que aceita antigénios.
3^?.- Processo de acordo com a reivindicação 1, ou com a reivindicação 2, caracterizado por X ser (CH₂)_n-Ar-CH= ou

R¹

CH-(CH₂)_n-NH-CO-R²-CH=.
4^?.- Processo de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado por:

-62COR⁶

Z é (CO-(CH₂)₂-CH-NH)_t e t é 1.
5⁵.- Processo de acordo com a 3 5 4 reivindicação 4, caracterizado por R ser N(R ) e R ser CO.
6-.- Processo de acordo com qual quer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por m ser de cerca de 3 a cerca de 8.

Lisboa, 3 de

Agosto de 1989