PT91372A - Processo para a preparacao de conjugados de medicamentos citotoxidos, nomeadamente conjugados de medicamentos de vinca - Google Patents

Description

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0 invento presente diz respeito aos campos de acção da química orgânica, da imunologia, e da quimica farmacêutica, e estabelece conjugados de medicamentos citotóxicos, proveitosos na administração em vista de medicamentos citotôxicos a doentes, com necessidade de tal tratamento. 0 objectivo dos conjugados dos medicamentos é alcançado pelo emprego de anticorpos, que reconhecem um antigénio associado a uma célula a ser tratada com o medicamento cito-tôxico, e, por esse meio, transportam o medicamento citotó-xico à célula. Os intermediários, empregados na síntese dos conjugados, são, também, estabelecidos. 0 tratamento do cancro, com medicamentos, constitui, agora, uma parte demonstrada da ciência médica. Os medicamentos, em emprego, contudo, são agentes citotóxicos activos, que representam um perigo para o doente. As doses e a frequência da administração devem ser controladas, rigorosamente, para limitar a toxicidade. 0 invento presente reduz o problema da toxicidade, pelo emprego de um anticorpo, para dirigir o medicamento vinca à célula cancerosa, reduzindo, por esse meio, a quantidade do medicamento citotó-xico, em contacto com os tecidos normais do doente. Além disso, o agente de ligação, empregado aqui para ligar o medicamento ao anticorpo, ê instável e liberta o medicamento na célula cancerosa em vista, 0 invento presente estabelece uma série de conjugados de medicamentos vinca,1igados a anticorpos, por meio de um sistema de ligação, que proporciona uma libertação especificamente boa do medicamento, numa modalidade fisiologicamente activa. 0 invento presente estabelece um conjugado de medicamentos citotóxicos, da fórmula -5-

Ζ

I

Ab/CO-X-Y-Ar-C=N-HN-iflm I em que Ab é um anticorpo fisiologicamente aceitável» ou um seu fragmento que aceita um antigênio, o qual aceita um anti-gênio associado a uma célula indesejável; m ê um número inteiro de 1 a cerca de 10; 1 ê hidrogénio ou alquilo CpCg não ramificado; X ê um agente de ligação, um alquileno CpC^, um alquenileno C2“C4’ ou Uín ^no^duileno Cj-C^; Y ê um agente de ligação, carbonilo» -0-, -S-, ou sulfonilo, com a ressalva de que Y ê carbonilo ou sulfonilo, quando X ê aminoalquileno, e que Y é um agente de ligação ou carbonilo, quando X ê um agente de ligação;

Ar ê pirrolilo, m-fenilo, ou p-feniIo, grupos esses de fenilo que podem ser mono- ou dissubstituido por bromo, cloro, fluoro, metoxi,nitro ou alquilo de Cj-C3; V é um medicamento de vinca da fórmula -6-

9 3 em que R ê H, CH~ ou CHO; quando R e R são considerados 5 0 ] 9 isoladamente R ê H, e um de R e R é etilo e o outro é H 2 3 ou OH; quando R e R são considerados em conjunto com os átomos de carbono aos quais eles estão ligados, eles formam um anel oxirano, caso esse em que R1 é etilo; R4 ê H, (alquilo Cj-CgJ-CO ou (alquilo Cj-C3)-C0 clorosubstituido. 0 invento presente esatbelece, também, novos intermediários, para a preparação dos conjugados precedentes, intermediários esses que são da fórmula 1

5 I

R-CO-X-Y-Ar-G=N~HN-V 5 -7- t. em que R ê hidroxi, um grupo de activação de ácidos, uma metade que completa um sal, ou um grupo de protecção de ácidos, e os outros grupos de variáveis são o que ficou estabelecido no precedente. 0 invento estabelece, também, um processo para o controlo do desenvolvimento das células indesejáveis, pela administração parenteral de um conjugado do invento, ao doente. Um outro objectivo do invento é uma composição terapêutica farmacêutica, que compreende um conju gado do invento disperso num meio administrável parenteral-mente.

Ainda um outro objectivo do invento é um processo para a preparação dos conjugados precedentes, o qual compreende a reacção dos intermediários, como ficou descrito no precedente, com um seu anticorpo ou fragmento, como se encontra representado na fórmula precedente. Um processo de alternativa compreende a reacção de uma hidrazida de vinca da fórmula Hg-N-HN-V com um intermediário da fórmula

Ab/*C0-X-Y-Ar-C=0j i z

Os conjugados presentes dos medicamentos de vinca são compostos por um anticorpo, um agente de ligação e um medicamento de vinca, na modalidade de hidrazida. As propriedades terapêuticas notáveis dos conjugados são derivadas, principalmente, das propriedades do agente de ligação, que é designado, deste modo, para efeito de se libertar o medicamento de vinca do anticorpo de uma maneira que transmite a toxicidade máxima do medicamento à célula -8-

em vista. Os três componentes principais dos conjugados serão debatidos individualmente, a síntese dos conjugados, será explicada, e, finalmente, serão apresentados exemplos da síntese e da eficiência biológica dos conjugados. 0 Anticorpo A propriedade essencial da parcela do anticorpo dos conjugados ê a sua capacidade em reconhecer um antigénio associado a uma célula indesejável. Deve com-preender-se que os medicamentos de vinca são altamente cito-tóxicos para uma diversidade ampla de células. Deste modo, o anticorpo é seleccionado pela sua capacidade em aceitar e ligar-se à célula que deve ser morta, ou de outro modo controlada com o medicaiento. A origem do anticorpo não constitui pormenor para criar problemas ao invento presente. Pode ser seleccionada de qualquer classe, ou subclasse, de imunoglo-bulina, incluindo Ig6, IgA, IgM, IgE e IgD. De um modo idêntico, a espécie da origem não constitui pormenor para criar problemas, na medida em que o anticorpo tem por alvo uma célula, em que o efeito do medicamento de vinca ê proveitoso.

No estado actual da técnica, os anticorpos monoclonais são muito empregados nos conjugados dos medicamentos, e o seu emprego ê preferido no invento presente. Não obstante, os anticorpos policlonais não estão excluídos. Um tipo mais recente de anticorpo ê o anticorpo quimérico, que ê preparado no laboratório pela tecnologia recombinante que permite a expressão de um DNA modificado, que codifica a região de ligação do antigénio de qualquer anticorpo desejado, e também codifica qualquer outra série de aninoâcidos desejados. Deste modo, os anticorpos quiméricos,

dos quais uma parcela ê obtida de uma espécie, e a outra parcela é obtida de uma outra espécie, podem ser obtidos e empregados no invento presente. 0 emprego de anticorpos quiméricos ê, também, o preferido. A origem e a natureza do anticorpo não ê, de outro modo, pormenor para constituir problemas, na medida em que ele tem em vista a célula a ser tratada e não torna o conjugado inaceitâvelmente tóxico. Os peritos nesta técnica vulgares, empregando a Memória Descritiva presente, podem preparar, fácilmente, os conjugados, com um anticorpo candidato, e analisâ-los. Algum debate do processo de analisar os anticorpos e os conjugados será proporcionado, por conveniência. Primeiramente, o anticorpo deve ser produzido por um hibridoma, que seja suficientemente estável para permitir a preparação de quantidades razoáveis do anticorpo. 0 anticorpo, ele próprio, deve ser submissível às reacçóes da conjugação e â purificação, e, em particular, deve ser sufidentemente solúvel em água, para permitir as manipulações químicas, a uma concentração razoável.

Os conjugados, preparados com o anticorpo do candidato, são, primeiramente, analisados, pela sua capacidade para a ligação com o antigênio. Uma redução razoável da capacidade de ligação do anticorpo livre é esperada e aceitável. Em seguida, o conjugado ê experimentado, para se determinar a sua citotoxicidade j_n vitro, contra as células positivas do antigênio. Um conjugado efeiciente pode ter uma citotoxicidade algum tanto inferior â do medicca mento livre, na mesma análise. Um conjugado, que ê aceite, nos dois primeiros testes, ê, em seguida, analisado num modelo de xenoenxerto de tumor humano num rato nu, como preconiza Johnson and Laguzza, Câncer Res.47, 3118-22(1987). 0 conjugado candidato deve ser experimentado em ratos pelados, contra o medicamento livre, uma mistura de medicamento livre e do anticorpo livre, e um conjugado com uma imunoglobulina -lO-

que se não tem em vista, e deve ser mais;eficiente ou mais seguro do que todos. Os estudos da quantidade da dose e da periodicidade devem ser levados a efeito no modelo de xenoenxerto.

Os conjugados, que são eficientes no modelo de xenoenxerto, são submetidos a experiências nos animais que são conhecidos em se manifestar o antigénio de interesse, num exemplar semelhante ao do visto em entes humanos. Se o conjugado produz um grau digno de nota de ligação ao antigénio, em tais experiências, e se ele se encontra razoâvelmente livre de toxicidade, a doses preditas pelo modelo de xenoenxerto como sendo terapêutico, o conjugado do candidato pode ser considerado como tendo potencial terapêutico.

Muitos anticorpos, actualmente conhecidos, são acessíveis, para emprego, no invento presente. Um anticorpo especifico de interesse é o L/1C2, que ê produzido por um hibridoma em depósito na American Type Culture Collection, Rockville, MD, como HB9682. 0 anticorpo 5E9C11, produzido por um hibridoma, do ATCC HB21, aceita o receptor de transferri-na, que se manifesta por muitos tumores. Um anticorpo, designado por B72.3, adquirível no Instituto Nacional de Cancro, aceita os antigênios manifestados pelo carcinoma, tanto do seio, como do colon.

Dois anticorpos de interesse, com reactividade contra os antigênios não tumorosos, são 0KT3 e QKT4, que se ligam às células T periféricas e âs células T auxiliares humanas, respectivamente. Eles são produzidos por hibridomas em depósito no ATCC, como CRL8001 e CRL8002, respectivamente. -11-

Fontes complementares de anticorpos, proveitosos para diversos fins terapêuticos, são os que se seguem. Os anticorpos anti-humanos de linfôcitos e de mo-nôcitos, proveitosos para a modulação imune e para a terapia de tumores, são produzidos por culturas ATCC HB2,HB22, HB44, HB78 e HB136. Um anticorpo receptor de transferrina, proveitosos para a terapia de tumores, é produzido por cultura ATCC, HB84, A cultura ATCC HB8059 produz um anticorpo contra a monosialogangliosida de carcinoma colorectal, e a cultura HB8136 produz um anticorpo contra o antigênio de superfície de célula T humana madura, proveitoso para a terapia da modulação imune e da leucemia da célula T.

Outros anticorpos candidatos são localizados fâcilmente pelos peritos na técnica. Uma fonte, particularmente proveitosa, de informação, acerca de anticorpos fácilmente acessíveis, ê a Linscotfs Directory of Immunological Biological Reagents, publicada por Linscotfs Directory, 40 Glen Drive, Mi 11 Valley,Califórnia 94941. A edição de 1984 regista mais do que 60 anticorpos monoclo-nais associados a tumores,e, pelo menos, uma fonte comercial, para cadb.

Deve compreender-se que uma diversidade de células indesejáveis pode ser tratada com os conjugados do invento presente. Os medicamentos de vinca são bem conhecidos como sendo eficientes contra os diversos tipos de cancro, e estabelece-se que as células do cancro estão entre as células preferidas a se terem em vista nos conjugados presentes.

Em particular, as células, que suportam o desenvolvimento continuado de uma malignidade, e as células do organismo imune, que controla o desenvolvimento da imunidade anti-tumorosa, são também as estabelecidas.Os -12-

tipos específicos das células a se terem etn vista incluem as células escamosas de carcinomas, as células do adenocar-cinomas, as células de carcinomas de célula pequena,as cê-lulas de glioma, as células de melanoma, as células de carcinomas de célula renal, as células de carcinomas de célula transcicional, as células de sarcomas, as células de vascu-latura mantendo o tumor, e as células de tumores 1infôides, tais como as leucemias e as linfomas. Não obstante, os medicamentos de vinca são, também, citotôxicos a muitos outros tipos de células. E assim,os conjugados podem ser empregados, pela selecção adequada do anticorpo, para matar, ou para modificar.drâsti-camente, tais células indesejáveis, como, por exemplo, células infectadas com partículas de virus, as células T infectadas com diversos agentes perniciosos, e as células do organismo imune, que promove, ou controla, o desenvolvimento das doenças autoimunes.

Deve compreender-se que os fragmentos seleccionados adequadamente dos anticorpos têm o mesmo efeito que o anticorpo intacto. Deste modo, na prática deste invento, os fragmentos do anticorpo, de preferencia os fragmentos F(ab1)2* que reconhecem um antigénio, associado a uma célula a ser tratada, são precisamente tão proveitosos como o são os anticorpos intactos, 0 mecanismo preciso, pelo qual o grupo de ligação reage com, e se liga ao, anticorpo, nlo está representado na fórmula I, e nlo ê ainda rigorosamente conhecido. A reacção ê uma acilação, como se demonstra a seguir, e uma diversidade de situações das moléculas do anticorpo são submetidas â acilação. Mais vulgarmente, pensa-se que as acilações dos anticorpos se prosseguem nos grupos livres de amino das porções lisina. Não obstante, a acilação 13-

pode, também* atacar os grupos de hidroxi, os grupos de fenol, os aneis de imidazol e, talvez, outras porções* A fórmula I indica que de 1 a cerca de 10 porções do medicamento do grupo de ligação estão ligados a cada molécula do anticorpo. Ccid ê evidente, o número de tais porções, por molécula do anticorpo, ê um número médio, visto que um dado conjunto de conjugados conterá, necessariamente, moléculas com uma diversidade de proporções do medicamento-agente de ligação ao anticorpo. 0 emprego, o mais eficiente do anticorpo dispendioso, ê obtido, como é evidente, quando um número de moléculas do medicaiento estão ligadas a cada molêcila do anticorpo. Não obstante, a ligação de um núiero excessivo de moléculas da porção medicamento--grupo de ligação tem, habítualmente, um efeito adverso na capacidade do anticorpo em aceitar e ligar ao seu antigênio, e na solubilidade na âgua, e assim um valor harmónico para m tem de se achar. De um modo geral, o valor preferido para m ê cerca de 4 a cerca de 10. Cerca de 3 a cerca de 8, ê um outro valor preferido. 0 Medicamento de Vinca

Os medicamentos de vinca têm sido o objecto da investigação farmacêutica e médica, durante alguns anos. Um grande número deles tem sido estudado, tem sido descrito na bibliografia, e tem sido patenteado, e alguns têm sido aprovados para o tratamento do cancro humano. Os medicamentos de vinca, empregados nos conjugados presentes, são eles próprios conhecidos da técnica farmacêutica, e podem ser obtidos fãcilmente e empregados pelo técnico. Algum debate sobre os medicamentos serâ proporcionado, para a conveniência do leitor. .·ν

Na fórmula II precedente, quando R ê metilo, R1 ê hidroxilo, R2 êetilo, R3 ê H, e R4 é acetilo, VLB (vinblastina) ê apresentada; quando R ê formilo, R1 ê ? 3 á hidroxilo, R é etilo, R ê H e R ê acetilo,vincristina (VCR) ê apresentada; quando R ê metilo, R1 ê etilo, R2 ê 3 4 hidroxilo, R ê H e R é acetilo, leurosidina é apresentada; 1 ? 3 quando R ê metilo ou formilo, R é etilo; R e R considerados em conjunto com os átomos de carbono aos quais eles estão ligados formam um anel de alfa-epóxido, e R4 ê acetilo, leurosina e leuroformina, respectivamente, são apresentadas; quando R ê metilo, R* ê etilo, R2 e R3 são H, e R4 ê acetilo, desoxi VLB “B" (4,-desoxileurosidina ou 4'-epidesoxi VLB) ê apresentado; quando R é metilo, R2 ê etilo, R1 e R3 são H, e R4 ê acetilo, desoxi VLB "A" ou 4'-desoxi VLB é apresentado; e, quando R ê CHO, R* ê etilo, R2 e R3 são H, e R4 é acetilo, 4'-epidesoxivincristina (1-formi1-1-desmeti1--4'-desoxileurosidina) ê apresentada.

Os medicamentos de vinca são transformados nas hidrazidas, empregadas nos conjugados deste invento pelo processo da Patente No. 4.203.898. dos Estados Unidos da América, coluna 12, linha 65 e seguintes e Exemplo 3, coluna 18. Neste processo, a hidrazina anidra ê feita reagir com o alcaloide de vinca adequado, em etanol, num tubo vedado, a cerca de 60°C. 0 produto desta reacção ê uma 4-desaceti1-3-carboxi-hidrazida, visto que o grupo ace-toxi em C-4 ê hidrolisado, sob condições básicas de reacção. Se for desejado preparar-se um éster de C-4 (R4 em II ê (alquilo Cj-C3)-C0 ou c1 oro-(a 1qui1 Cj-C3)-C0, a desacetil C-3-carboxi—hidrazida precedente ê, primeiramente, protegida por reacção com acetona, para se formar um derivado de 2 N -propilideno. Com o grupo de NHg acilável da hidrazida, eficientemente protegido contra a acilação, este derivado protegido pode, em seguida, ser acilado, de uma maneira rotineira, com um haleto de acilo (cloreto de cloroacetilo, por exemplo), ou um anidrido de acilo (anidrido propiônico, -15- X «

por exemplo). 0 grupo de protecção poderem seguida, ser removido por tratamento com um ácido. Se a acilação,também, surge no hidroxilo de C-3, como acontece, habitualmente, este grupo de acilo de C-3 pode, de preferencia, ser removido por tratamento com o gel de silica húmido-- veja Hargrae, Patente No. 3.392.173, dos Estados Unidos da América. A lista, que se segue, apresenta alguns dos medieansntos de vinca preferidos, de Fórmula II, que podem ser empregados nos conjugados, e os seus nomes vulgares, tais como os conhecidos na especialidade: 4-Desacetil-VLB-3-carboxi-hidrazida (R4 ê hidrogénio, R3 ê hidrogénio, R ê metilo, R* é hidroxi, R2 ê etilo). 4-Desacetil-VCR-3-carboxi-hidrazida (R4 ê hidrogénio, R3 ê hidrogénio, R é CHQ, R* é hidroxi, R2 é etilo). 4-Desaceti1-4'-epidesoxi-VLB-3-carboxi-hidrazida (R4 2 3 é hidrogénio, R ê hidrogénio, R ê hidrogénio, R ê metilo, R1 ê etilo). 4-Desacetil-VL8-4-propionil-3-carboxi-hidrazida(R4 ê COCHgCi·^, R ê metilo, R* ê hidroxi, R2 ê etilo, R3 é hidrogénio). 0 Srupo de Ligação 0 grupo de ligação, X-Y-Ar-C(Z), ê um grupo orgânico, que está ligado ao carbonilo numa extremidade, e à hidrazida na outra. A ligação à hidrazida da vinca ê uma ligação â hidrazida de alquilideno. Deve aceitar-se, não obstante, que a ligação pode existir em outras formas na solução, particularmente na solução fisiológica, A ligação dupla pode ser aberta, permitindo que os -16-

grupos funcionais ou protões se liguem aos átomos de nitrogénio e de carbono. Como um resultado, um grupo de hidroxi, ou uma outra espécie ligada ao oxigénio, pode ligar-se a um lado da primitiva ligação dupla, e as metades ligadas ao amino podem fazê-lo também de modo idêntico. A ãgua pode ligar-se suavemente a um dos átomos. Uma porção do anticorpo pode, também, formar uma ligação fraca a um dos átomos, e mais do que uma de tais reacções pode surgir, formando misturas. Tais produtos são transitórios, não obstante,e, através deste documento, o conjugado será descrito, como na forma alquileno-hidrazida, porque essa ê sua forma geral e estável. 0 grupo X pode ser apenas uma li gação, ou pode ser alquileno de Cj-C4, tal como metileno, etileno, butileno, 2,2-propileno, isobutileno, ou 1,2-dime-ti1 etileno; ele pode ser alquenileno de Cg-C^, tal como vi-nilo, alilo ou 2-metilalilo; ou ele pode ser alquileno de amino de C^-C^, tal como aminometileno, aminoetileno, ami-ηο-3-metiIpropileno, amino-1,1-dimetiletileno e outros idên ticos. Quando X ê aminoalquileno, o grupo de amino ê adjacente ao grupo Y. Os grupos preferidos X incluem uma ligação, alquileno Cj-C2, e amino-alquileno C|-C3, tal como metileno, etileno, aminometileno e aminopropileno. 0 grupo Y ê um grupo em ponte, que pode ser apenas uma ponte, ou pode ser carbonilo, sulfo nilo, oxigénio ou enxofre. Os grupos Y preferidos são uma ligação, oxigénio e carbonilo. . Os grupos X e Y estão inter-relacionados, mas nem todos os grupos Y podem ser associados a determinados grupos X. Quando X ê aminoalquileno, Y é apenas carbonilo ou sulfonilo; e, quando X ê uma ligação, Y é apenas uma ligação ou carbonilo. -17-

0 grupo Ar ê pirrolilo ou fenilo. Um grupo de fenilo está ligado na posição meta ou para, e os grupos de fenilo podern não ser substituídos, ou podem ser mono- ou di-substituidos pelos citados grupos. Os grupos Ar substituídos típicos incluem 2-bromo-m-fenilo, 3-cloro-p-feni-lo, 2,5-difluoro-p-fenilo, 3-metoxi-5-cloro-j>-fenilo, 2,6-di-nitro-m-fenilo, 3-propi1-p-fenilo, 2-metil-5-fluoro-m-fenilo e outros idênticos. Os grupos Ar preferidos incluem o fenilo não substituído, particularmente, p-fenilo, e o fenilo mo-nosubstituido, particularmente mono-substituido-£-fenilo, bem como o pirrolilo. 0 grupo Z pendente pode ser hidrogénio, ou um grupo de alquilo de Cj-Cg linear, incluindo meti-lo, etilo e propilo. Os grupos Z preferidos são o hidrogénio e o metilo.

Os grupos, que se seguem, de grupos de ligação exemplares, X-Y-Ar-C(Z), são designados com a finalidade de apresentar, além do mais, os conjugados do invento, presente. Em cada caso, os grupos de agentes de ligação são designados começando pela extremidade C(Z) do agente de ligação, e prosseguindo até a extremidade de car-bonilo, sem se atender âs regras da nomenclatura, com a finalidade de designar, consistentemente, os grupos. 2-Meti1idenilpirrol-5-ilo, l-(3-Metilidenilpirro1-4-i1)acetilo, l-(2-Metilidenilpirrol-4-iloxiJetilenilo, 1-^2-(1,1-Etilideni1)pirrol-5-iltip7-2-metiletilenilo, 1-< 3-Meti1idenilfeni1)-2-metilpropileni lo, l-(2,6-Dicloro-4-metilidenilfeniltio)etenilenilo, -18-

1-#,4-Dimeti1-3-(1, 1-propílideni1)fenoxiJ-2-propeni-lenilo, l-/T3-Bromo-4-( 1,1-buti 1 ideni 1 )feni l/-3-pentenoi lo, 4-Metilidenil-2-nitro-4-benzamidometileni lo, (4-Met1lideniIfenilsuIfonamido)etileni lo, 1 - (3-Metox i-4-met i 1 icfen i lf en i 1 su lf onam i do)-3-met i 1 pro- pilenilo.

Os grupos de agentes de ligação prefe ridos, empregados nos conjugados presentes, são 4-benzilide-nilo, i-(4-metilidenilbenzamido)etileni lo, l-(4-metilidenil-feni1)etenilo, 4-metilidenilfenoximetilenilo, l-(2-metilide-ni lpirrol-5-il )eti leni lo, e l-/*4-(l,l-etilidenil)fenoxiJace-tilo.

Os Intermediários

Os intermediários presentes são os reagentes que reagem com o anticorpo, para preparar os conjugados. Eles são constituídos pela hidrazida de vinca e pela porção do grupo de ligação, e terminam por um ácido carboxilico ou por um ácido carboxilico modificado. Os diversos grupos, que constituem os intermediários, foram debatidos no precedente, excepto o grupo terminal, R5. R5 pode ser hidroxi, formando o ácido, ou pode ser um grupo de aeti-vação do ácido carboxilico, como será debatido a seguir, na secção de Síntese. Ele pode, também, ser uma rnetade de formação do sal, tal como um ião de metal alcalino, um ião de metal alcalino terroso, ou um grupo de amino, tal como dietilamino 9 dietanolamino, e outros idênticos.Ele pode, também,ser um grupo de protecção de ácidos, como preconiza, por exemplo, Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley,Nova -19-

lorque, 1981, páginas 152 a 192. Tais grupos de protecção incluem ésteres, amidas e hidrazidas, particularmente gru- c pos R , tais como fenaciloxi, tricloroetoxi, t-butoxi, trifenilmetoxi, trimetilssililoxi, ésteres de estanilo.di-metilamino e outros idênticos.

Os intermediários preferidos são os que compreendem os grupos preferidos X, Y e Ar, como os debatidos no precedente. Os intermediários preferidos para 5 reacção são aqueles em que R ê um grupo de activação de e ácidos; são aqueles em que R , em outras modalidades, é proveitoso como intermediário, para a preparação das formas activadas.

Os intermediários são, também, proveitosos como agentes anticancerosos eles próprios, e são administrados com essa finalidade, do mesmo modo e em dosagens idênticas como os medicamentos de vinca, que eles compreendem.

Sintese

Os conjugados do invento presente são preparados por processos, que são, individualmente, levados a efeito, de acordo com os princípios conhecidos actual-mente na especialidade. As considerações mais importantes, nos processos que envolvem os anticorpos, são, como é evidente, preservar a estrutura e a função do anticorpo, o mais que possível, e permitir a purificação dos produtos intermediários e do produto final, Dentro desses princípios, é possível levar a efeito as fases da reacção, por qualquer ordem principal: isto ê, pode ligar-se o agente de ligação ao anticorpo, e, em seguida, fazer reagir a hidrazida de vinca com o agente de ligação, ou pode fazer-se reagir o agente de ligação com a hidrazida de vinca, e, em seguida, ligar-se o intermediário resultante ao anticorpo, como uma segunda fase. A preparação dos compostos de partida, dos quais se derivam os grupos dos agentes de ligação,é efectuada de acordo com os processos químicos orgânicos de rotina. Muitos daqueles compostos são obteníveis no comércio, e os restantes podem ser preparados pelos químicos orgânicos de perícia vulgar. A síntese dos intermediários e conjugados do invento, presente ê representada, esquemâticamente, como se segue.

ESQUEMA A

Z

a I

R6-C0-X-Y-Ar-C=0 + H2N-HN-V z

I

R6 -CO-X-Y-Ar-C=N-HN-V em que R° é um grupo de protecção de ácido, hidroxi ou uma porção que completa um sal; e a cetona ou o aldeido podem en contrar-se na forma de um acetal dimetilico ou de um acetal de dietilico; -21-

Ζ

I

R6-CO-X-Y-Ar-C=N-HN-V + R7-H

Z

I

> R7-CO-X-Y-Ar-C=N-HN-V 7 em que R é um grupo de activação de ácidos, como se descreve a seguir: z

Ab + m [R7-CO-X-Y-Ar-C=NHN-V] ->

ESQUEMA B

Z Z

I I

Ab + m [R7 -C0-X-Y-Ar-C=0] -» Ab [C0-X-Y-Ar-C=0]m em que a cetona ou o aldeído podem encontrar-se na forma de um acetal dimetilico ou de um acetal de dietilico; -22-

Ζ

I

Ab[C0-X-Y-Ar-C=0]m + m(H2N-HN-V) -» I A hidrazida de vinca, V-NH-NH2, pode ser empregada como uma base, ou como um seu sal de adição de Scidos. Os sais de sulfatos são convenientes, particularmente. Não obstante, os sais vulgares de adição de ácidos podem ser constituídos e podem proporcionar formas convenientes da hidrazida de vinca, para sínteses ulteriores.Por exemplo,s*ais tais como os cloridratos, os bromidratos, os tolue-nossulfonatos, os metanossulfonatos, os benzoatos, os malea-tos, os nitratos, os fosfatos e outros idênticos,podem ser empregados, na medida em que foram convenientes,para as condições especificas da reacção. 7 0 grupo R ê um grupo de activação dos ácidos carboxi1icos, o qual ê escolhido entre os grupos bem conhecidos, empregados, frequentemente, para activar os ácidos carboxilicos, para emprego como reagentes de acilação. Os grupos de activação, empregadas na quimica dos pêptidos, são particularmente proveitosos aqui. Por exemplo, grupos tais como succinimidoxi, ftalimidoxi, metanossulfoniloxi, toluenossulfoniloxi, benzenossulfoniloxi, benzotriazoliloxi, cloro, bromo, azido e outros idênticos, são empregados,vulgarmente, como tais grupos de activação. Os grupos preferidos de activação dos ácidos carboxilicos são o succinimidoxi,o ftalimidoxi e o benzotriazoliloxi.

Os grupos de activação dos ácidos carboxilicos são, fâcilmente,colocados nos ácidos carboxilicos dos compostos de partida (R6-C0-X-Y-Ar-(Z)C=0)ou os -23-

intermediários, pelo emprego de, por exemplo, diciclo-hexi1-carbodi-imida, ou outros reagentes típicos de esterificação. Tais reacções são levadas a efeito em solventes orgânicos inertes, tais como o dioxano, o tetra-hidrofurano, os hidro-carbonetos clorados e outros idênticos, e podem ser efectua-das a temperaturas moderadas, na escala de 0 a 50°C. A preparação dos intermediários de agentes de ligação activados é esclarecida a seguir, nas Preparações.

As diversas fases da síntese dos conjugados presentes podem ser efectuadas para tornar máximo o comportaneito do equipamento, no qual o processo ê levado a efeito, ou para tornar máximo o rendimento. Na maior parte dos casos, se não em todos, o anticorpo, ele próprio, representa o custo máximo no processo,e, por isso, a optimi-zação do processo implica tornar máximo o rendimento baseado no anticorpo. As condições Óptimas de operação dependem,por isso, das condições da máxima estabilidade do anticorpo especifico em emprego. Por isso, a maximização do rendimento, baseada no anticorpo, implica, habitualmente, que a fase final do processo seja a reacção do anticorpo com o intermediário. E provável que as condições Óptimas de operação exijam o emprego de um excesso substancial do intermediário do agente de ligação, com a finalidade de tornar máxima a utilização do anticorpo, e tornar, de algum modo, menos extensa a utilização do medicamento de vinca dispendioso. A preocupação principal, na escolha das condições, sob as quais se deve levar a efeito a reacção entre o intermediário, ou o intermediário do agente de ligação activado, e o anticorpo ê manter a estabilidade do anticorpo.Em conformidade, a reacção é conduzida num meio aquoso de uma composição que não prejudica o anticorpo. Um meio aquoso, particularmente adequado, é um tampão de borato, no qual a concentração do ião de borato está compreendido entre 01, e 0,5 molar. 0 pH do meio da reacção deve ser neutro,ou -24-

ligeiramente básico, da ordem, por exemplo, de cerca de 7 a 9. Conquanto o meio da reacção seja aquoso, a presença de quantidades pequenas de solventes orgânicos não ê prejudicial, e pode atê ser mesmo conveniente. Por exemplo, pode ser vantajoso dissolver o intermediário, ou o intermediário do agente de ligação, numa quantidade pequena do solvente orgânico, e adicionar a solução orgânica à solução aquosa do anticorpo. Os solventes orgânicos adequados,para tal emprego, incluem, por exemplo, a dimetilformamida, o tetra-hidrofurano, o dioxano ou o éter de glicol.

De um modo geral, torna-se necessário levar a efeito a reacção numa concentração reduzida,visto que a solubilidade dos anticorpos não ê, de um modo geral, grande. Por exemplo, a concentração do anticorpo está, habitualmente compreendida entre cerca de 5 e 25 mg por ml do meio aquoso.

Como foi descrito no precedente,de 1 a cerca de 10 moles do agente de ligação e do medicamento são ligadas a cada mole do anticorpo. Com a finalidade de se obter aquela proporção de conjugação, torna-se, habitualmente, necessário, empregar-se uma quantidade em excesso do intermediário do agente de ligação ou do intermediário. A reactividade dos anticorpos, sob condições de acilação, ê algum tanto variável, mas, de um modo geral, cerca de 5 a cerca de 30 moles do intermediário do agente de ligação ou do intermediário, por mole do anticorpo, são empregados no processo. A acilação do anticorpo perraite-se prosseguir de alguns minutos a algumas horas, a temperaturas compreendidas entre 0o e cerca de 40°C. A reacção é inerente mente e relativamente rápida, e, assim, ê, habitualmente, possível obter-se um comportamento aceitável do processo, a temperaturas relativamente baixas, às quais o anticorpo ê -25-

estâvel de um modo aceitável. Os conjugados do invento presente e os diversos produtos intermediários contendo o anticorpo, são purificados, convenientemente, pela cromatografia, de acordo com os processos convencionais. As Preparações e os Exemplos, que se seguem, apresentam as purificações típicas. 0 progresso das reacções, envolvendo os anticorpos,pode ser seguido pela análise de ultravioletas de compriíento de onda duplo, como ê habitual na análise dos conjugados dos medicamentos ώ anticorpo. .

As purificações cromatográficas podem ser levadas a efeito eluindo-se com tampões aquosos diluídos, que podem ser bem os mesmos tampões aquosos, empregados como meios de reacção aquosos, nas fases subsequentes. A reacção da hidrazida de vinca, V-NH-NHg, com o intermediário do agente de ligação, é rápida e fácil, e prossegue bem, a cerca da temperatura ambiente, num meio aquoso, tal como o que foi descrito no precedente, quando a reacção se processa como a fase segunda, de acordo com o Esquema B. Um meio, particularmente proveitosos, ê o tampão de acetato diluido, especialmente o acetato de sõdio a 0,1 molar, a um pH ligeiramente ácido, tal como cerca de 5 a 7. Outros tampões, ligeiramente ácidos, podem, também, ser empregados, tais como os boratos, os tanpões de fosfatos ligeiramente acídicos, a salina fisiológica protegida com tampão, e outros idênticos. Quando a reacção ê levada a efeito como a primeira fase, de acordo com o Esquema A, ela pode ser levada a efeito mais eficfentemente, em solventes orgânicos, tais como o tetrahidrofurano, o dioxano, a dimetil-formamida, e outros idênticos. As reacções dos medicamentos de vinca devem ser levadas a efeito no escuro. A síntese dos conjugados presentes é explicada mais além, pelas Preparações e pelos Exemplos,que se seguem. ,Ν Λ*

Preparação 1 4-Carboxibenzilideno-hidrazida de 4-desaceti1-23-desmetoxi vinblastina

Uma parcela de 1,3 gramas de hidra-zida de 4-desaceti1-23-desmetoxivinblastina foi dissolvida em 50 ml de tetrahídrofurano, e a ela se adicionaram 5 gramas de sulfato de sódio anidro e 2 graneis de 4-carboxibenzal-deido. A mistura foi agitada, durante dois dias, sob nitrogénio, à temperatura ambiente, e foi, em seguida, filtrada e evaporada até â secura, sob o vácuo. 0 resíduo foi dissolvido em 50 ml de diciorometano, e foi lavado,por duas vezes, com água. A camada orgânica foi, em seguida, seca sobre o sulfato de sódio, e foi purificada pela cromatografia líquida de alta resolução, empregando-se uma coluna de gel de sílica, e eluindo-se com 8 litros de solvente, que variou de uma maneira linear de 95:5 de acetato de etiloimetanol, para 1:1 de acetato de etilo:metanol. As parcelas, que continham o produto, foram reunidas e foram evaporadas até a secura, sob o vácuo, dando origem a 490 mg do composto em epígrafe, que foi identificado pela espectroscopia, de massa, indicando um ião molecular de peso 900,

Preparação 2 4-(H-succÍnimidoxi)carbonilbenzilidenohidrazida de 4-desace ti1-23-desmetoxivinblastina

Uma parcela de 247 mg do intermediá rio da Preparação 1 adicionou-se a 63 mg de N-hidroxisuccini-mida, e 8 ml de diciorometano foram adicionados. A mistura foi agitada, durante cinco minutos,e, em seguida, adicionaram-se 113 mg de diciclohexilcarbodiimicb, seguidos de 52 mg do ácido jp-toluenossulfónico. A mistura foi agitada,durante -27-

\ uma hora ao todo,e, em seguida, ela foi arrefecida num banho de gelo, e foi extraída, por duas vezes, com parcelas de 3 ml de um tampão de fosfato de potássio monobâsico a 0,05M, a pH 7. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio, e foi, em seguida, cromatografada sobre gel de si 1 ica,eluin-do-se com 95:5 de clorofôrmiotmetanol. As parcelas,que continham o produto, foram reunidas e foram concentradas sob o vácuo, dando origem a 227 mg do intermediário desejado.

Exemplo 1

Conjugado do anticorpo 007B com carboni1-4-benzilideno -hidrazida de 4-desaceti1-23-desmetoxivinblastina. 0 anticorpo 007B ê produzido por um hibridoma, que ê uma subclona, derivada do hibrtloma.que produz o anticorpo Ksl/4, que foi descrito por Varki e outro, Investigação do Carcro 44, 681-86(1984). Uma parcela de 007B foi dialisada em tampão de borato a 0,34M, pH 8,6, a uma concentração de 10,3 mg/rnl. A uma parcela de 19,4 ml da solução do anticorpo, foram adicionados, gota a gota e lentamente, 13 mg do intermediário da Preparação 2, na forma de l,6ml de solução em dimetilformamida. A mistura foi agitada, â temperatura ambiente, no escuro, durante 2 horas,e, em seguida, foi centrifugada. 0 sobrenadante foi gel, filtrado sobre Sephadex 825 (Farmácia, Piscataway, NJ), eluindo-se com soro fisiológico tamponado, a pH 7,4. 0 eluente foi filtrado através de uma membrana porosa de 0,2 um, e foi analisado por análise de ultravioletas. Trinta e cinco ml da solução do produto se obtiveram, contendo 3,36 mg/ml do conjugado, a uma proporção da conjugação de 4,1 moles do medicamento de vinca, por mole do anticorpo. 0 conjugado foi experimentado in vivo, contra o xenoenxerto do adenocarcinoma do pulmão de UCLA/P3, -28-

em ratinhos pelados de Charles Ri ver. Iníciou-se a experiên- 7 cia implantando, ern cada rata, subcutâneamente, 10 células tumorosas de UCLA/P3. Em cada um dos dias 2,5 e 8, apôs a implantação, cada ratinho foi injectado com o conjugado,ou com o intermediário da Preparação 2, em soro fisiológico tamponado. Os ratinhos de controlo foram injectados com soro fisiologico Onicamente. As doses do conjugado, ou do intermediário de vinca (baseadas na parte essencial da hidra-zida de vinca), estão indicadas a seguir. A dimensão dos tumores, provocados pela implantação, foi medida nos dias 14, 21 e 28, após a implantação. Cada grupo de tratamento era constituído por cinco ratas, excepto para o grupo de controlo não tratado, que era constituído por dez ratas. Os resultados do dia 28 estão registados a seguir.

TABELA I

Tratamento

Dose mg/kg Inibição,em percen- __ tagem_______ 1,5 100 0,75 100 0,38 100 0,19 71 0,10 55 1.5 28 0,75 11 0,38 0 0 19 19 0,10 31

Exemplo 1

Preparação 2

Exemplo 2

Conjugado do anticorpo 0Q7B,eom carbonil-4-benzilidsnohidra-zida, de 4-desaceti1-23-desffletoxivinblastina

Três reacções de conjugação foram levadas a efeito, sob as mesmas condições, excepto a proporção da absorção do agente de ligação medicamento para o anticorpo. Em cada caso, o anticorpo foi 007B, fornecido na forma de 0,8 ml de solução em tampão de borato, a pH 8,6,com uma concentração de 12,3 mg do anticorpo/ml. 0 intermediário da Preparação 2 foi fornecido como uma solução em dimetilformamida.contendo 30 mg/ml do intermediário. A solução orgânica foi adicionada â solução do anticorpo, em cada caso, e as misturas da reac-ção foram deixadas a agitarem-se, no escuro,durante duas horas. Em seguida, elas foram purificadas, como se descreveu no Exemplo 1, com os resultados que se seguem. A. A quantidade do intermediário de vinca-medicamento foi de 0,65 ml, fornecida como 0,02 ml de solução; adicionou-se, também, 0,045 de dimetilformamida complementar. 0 produto foi de 5,7 mg de conjugado, a uma proporção de conjugação de 5,7, na modalidade de 6,5 ml de solução. B. Empregou-se uma parcela de 1,3 mg do intermediário de vinca-agente de ligação, como 0,04 ml de solução com 0,025ml de dimetilformamida suplementar. O produto foi de 0,5 mg de conjugado, com uma proporção de conjugação de 7,2 em 5,4 ml de solução. C. Empregou-se uma parcela de 1,95 mg do intermediário, como 0,065 mi de solução. Não se obteve qualquer produto. -30-

0 produto do Exemplo 2A foi experimentado em cultura de tecidos, contra a série de células de adeno-carcinoma UCLA/P3, num processo que determina a citotoxicí- dade contra as células do carcinoma, medindo-se a inibição de 3 incorporação de H-leucína das células. A concentração inibitória de 50¾ do conjugado foi de 0,03 jug/ral, o IC5Q do intermediário da Preparação 1 foi de 0,07 jug/ml, e o ICgg da hídrazida de 4-desaceti1-23-desmetoxívinblastina foi de 0,001 /jg/ml.

Exemplo 3

Conjugado do anticorpo 0073 com carboni1-4-benzi1idenohidra-zida, de 4-desaceti1-23-desmetoxivinblastina

Uma conjugação, semelhante â do Exemplo 1, foi levada a efeito, numa escala, considerávelmente superior, partindo de 40 ml da solução do anticorpo,contendo 10 mg do anticorpo GQ7B, por ml. A solução do άπΐχοοτ-* po, adicionou-se uma solução do intermediário da Preparação 2, contendo 63,3 mg do intermediário, em 3,3 ml de diietilfor-mamida. Adicionou-se, também, uma parcela de 4,3 ml da dime-tilformamida complementar. A mistura da reacção foi agitada, no escuro, durante 1,5 horas, e foi, em seguida, purificada, como foi descrito no Exemplo 1, para se obter 278 mg do conjugado, a uma proporção de conjugação de 4,8, na forma de 120 ml de solução, em salina protegida com um tampão fisiológico. 0 produto foi concentrado por diSlise de vácuo, em salina protegida com urn tampão fisiológico, a pH 7,4, para se obter 18 ml de solução, contendo 7,2 mg/ml do conjugado,com uma proporção de conjugação de 4,4. 0 conjugado foi experimentado i£ vivo contra tumores provocados por UCLA/P3, em ratinhos essencialmente pelados,como foi descrito no Exemplo 1. A administração -31-

do medicamento foi efectuada nos dias 15,17,20 e 23, apôs a implantação, e os tumores foram nedidos e as massas foram calculadas pela fórmula de Geran e outro, "Câncer Chemother, Reports"3, (1972), nos dias 27,34,41 e 48.

Quando a administração do conjugado se iniciou aos 15 dias, o peso médio dos tumores foi de 1 grama. Os tumores, nos animais de controlo não tratados, continuaram a crescer com regularidade, a um peso médio de cerca de 6 gramas,por 48 dias. A administração de doses de 0,5, 1 e 2 mg/kg do medicamento de vinca, na modalidade do conjugado precedente, retrogradou os tumores. Na observação do dia 27, o peso médio dos tumores, em todos os grupos tratados, foi cerca de 250 mg. Apôs 48 dias, os tumores dos grupos de tratamento de 1 e 2 mg/kg mantinham-se ainda em 200 mg, cu menos. Apôs 48 dias, os tumores do grupo de tratamento de 0,5 mg/kg tinham crescido para o peso de 1 grama, que eles tinham no começo do tratamento.

Numa outra experiência, um lote semelhante, mas diferente, do mesmo conjugado, foi administrado a ratos que tinham sido implantados com xenoenxertos UCLA/P3, nos dias 16,19,22 e 25, apôs a implantação. A massa média dos tumores foi, então, de cerca de 1.300 mg. As doses de 0,25 mg/kg (baseadas na parte essencial da hidra-zida de vinca) tornaram mais lento o desenvolvimento dos tumores, mas não o retrogradaram. As doses de 0,5, 1 e 2 mg/kg retrogradaram os tumores, de tal modo que, aos 37 dias, a massa média dos tumores de todos os três tratamentos foi sómente cerca de 300 mg. 0 tratamento de 2 mg/kg manteve a massa média dos tumores constante àquele nível, durante 51 dias; os tumores de ratos, que receberam 0,5 e 1 mg/kg, tinham uma massa média de cerca de 700 mg, aos 51 dias. -32-

Exemplo 4

Conjugado do anticorpo L4KS, com carbonn-4-benzilidenohidra-zida de 4-desacetil-23-desmetoxivinblastina 0 anticorpo L4KS,como descreve Starling et aj_., J. Cel 1. Biochem.Supp., 11B, 1982(1987), foi dialisado em tampão de borato a 0,34 M, a pH 8,6, para se obter uma concentração de 11,3 mg/ml. Uma parcela de 10 mg do anticorpo, naquela solução,foi empregada, e a ela se adicionou 0,78 mg do intermediário da Preparação 2,como uma solução em 0,072 ml de dimetilformamida. A mistura foi agitada, à temperatura ambiente, durante duas horas,no escuro, e foi, em seguida, centrifugada. 0 flutuante foi cromato-grafado sobre uma coluna de Biogel P6 (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA 94804),eluindo-se com soro fisiológico, tampona-do. As parcelas, que continham o produto, foram recolhidas e foram concentradas sob vácuo, e o produto foi analisado pela análise de ultravioletas, observando-se a curva a 279 e a 293, para se verificar que 8,7 mg do conjugado tinha sido obtido, a uma proporção de conjugação de 3,2, na modalidade de uma solução contendo 1,5 mg/ml. 0 conjugado foi avaliado, determinando-se a sua toxicidade contra as células de UCLA/P3, na cultura dos tecidos. 0 IC5Q do conjugado foi de 0,024 jug/ml, comparado com o IC50 de 0,001 jug/ml da hidrazida de 4-desaceti1-3-desmetoxivinblastina. -33-

Exemplo 5

Conjugado do anticorpo 14.95.55 com carbonil-4-benzilidenohi-drazida de 4-desacetil-23-desmetoxivinbIastina

Uma parcela do anticorpo 14.95.55, como descreve Corvalan et^ aK, Protides of Biol. Fluids 31, 921-24 (1984), foi dialisada em tampão de borato, a pH 8,6, para se obter 1 ml de solução, contendo 8,32ng do anticorpo. A solução, adicionou-se 0,66 mg do intermediário da Preparação 2, como uma solução em 0,08 ml de dimetilformamida. A mistura da reacção foi agitada, no escuro, à temperatura ambiente, durante 45 minutos, e a mistura foi, em seguida, purificada, como se descreve no Exemplo 1 precedente,para se obterem 3,0 mg do conjugado, a uma proporção de conjugação de 4,8, na modalidade de 3,7 ml de solução em soro fisiológico tampónado. A capacidade de ligação do conjugado foi determinada pela rádioimunoanSlise, comparando-a com o anticorpo não conjugado. As curvas de titulação, do conjugado e do anticorpo foram essencialmente semelhantes,indicando que a capacidade de ligação do anticorpo não se tinha alterado, essencialmente, pela conjugação.

Exemplo 6

Conjugado do anticorpo B72.3, com carboniΙ-4-benzilidenohi-drazida, de 4-desaceti1-23-desmetoxivinblastina 0 anticorpo B72.3 foi descrito por Colcher e£ aJL, Proc. Natl. Aced. Sei. USA, 78, 199-203 (1981), e ê adquirível no National Câncer Institute.Uma parcela sua foi dialisada num tampão de borato de pH 8,6, a uma concentração de 10 mg/ml. Uma parcela de 5 mg do anticorpo foi empregada em cada uma das três conjugações* Em cada caso, o intermediário de vinca foi o da Preparação 2, fornecido como uma solução, contendo 30 mg/ml. As reacções decorreram à temperatura ambiente, no escuro,durante duas horas, e as misturas foram purificadas, como foi descrito no Exemplo 1 precedente. A. Uma parcela de 0,32 mg do intermediário do vinca-agente de ligação foi empregada, na modalidade de 0,01 ml de solução, e adicionou-se 0,02 ml de dimetilformamida complementar. 0 produto foi 2,8 mg do conjugado, a uma proporção de conjugação de 3,0, na modalidade de 2 ml de solução. B. Uma parcela de 0,65 mg do intermediário foi empregada, como 0,02 ml de solução, e adicionou-se-lhe 0,01 ml de dimetilformamida complementar. 0 produto foi 1,2 mg de conjugado, a uma proporção de conjugação de 4.9, na modalidade de 2 ml de solução. C. Uma parcela de 0,97 mg do intermediário foi empregada, como 0,03 ml de solução, e o produto foi 0,5 mg de conjugado, a uma proporção de conjugação de 6.6, na forma de 2,7 ml de solução. -35-

0 produto do Exemplo 6C foi experimentado em cultura de tecidos, contra as células de adenocarcino-ma LS174T. Verificou-se que o citotóxico IC^q do conjugado era 0,047 /jg/ml, comparado com 0,0001 para cada uma das hidra-zidas de 4-desaceti1-23-desmetoxivinblastina e o intermediário da Preparação 1.

Exemplo 7

Conjugado do anticorpo KS1/4 S2 com carboni1-4-benzi1ideno-hidrazida de 4-desacetil-23-desmetoxivinblastina

Uma parcela do anticorpo KS1/4 S2,e uma parcela de ligação do antigénio do anticorpo, descrito como KS1/4, por Varki e outro, Investigação do Cancro 44, 681-66(1984), foram dissolvidas num tampão de borato a 0,34tô, a pH 8, numa concentração de 18 mg/ml. Levaram-se a efeito três conjugações, empregando-se, em cada,parcelas de 0,56ml da solução do anticorpo. Em cada caso, o anticorpo foi conjugado com o intermediário da Preparação 2, que foi fornecido como uma solução de dimetilformamida, contendo 43,5 mg/ml do medicamento de vinca. Em cada caso, o tempo da reacção foi de 1,5 horas, no escuro, à temperatura ambiente. Depois da reacção, as misturas da reacção foram purificadas,como foi descrito no Exemplo 1. A. Uma parcela de 0,015 ml da solução de vinca foi empregada, em conjunto com 0,03 ml de dimetilformamida complementar. 0 produto totalizou 8,2 mg, a uma proporção de conjugação de 2,1, na modalidade de 4,8 ml de uma solução de soro fisiológico tamponado. 8. Uma parcela de 0,GBml de solução de vinca foi empregada, com 0,015 ml de dimetilformamida complementar. 0 produto foi 7,8 mg de conjugado, com uma proporção de conjugação de 3,6, -36-

na modalidade de 5,2 ml de solução. C. Uma parcela de 0,045 ml da solução de vinca foi empregada, para se obterem 7,6 mg de conjugado, a uma proporção de conjugação de 5,4, na modalidade de 5,4 ml de solução. A capacidade de ligação dos conjugados foi determinada pela radioimunoanálise, que revelou que a capacidade de ligação relativa do produto A era de 54%, do produto B 48% e do produto C 37%, da capacidade do anticorpo próprio.

Preparação 3.

Produção dos anticorpos L/1C2,

Obtêm-se frascos pequenos de hibri-doma L/1C2 congelado, da American Type Culture Collection,sob o número de aquisição HB9682. Células viáveis são recuperadas, descongelando a parte essencial de um frasco,num banho de água a 37°C, enquanto se turbilhona o frasco. A suspensão da célula é, em seguida, diluída 1:2, com uma solução equilibrada de sal (Grand Island Biological Company (GIBCO), 3175 Staley Road, Grand Island, Nova Iorque 14072) e a suspensão é centrifugada através de uma camada de soro, para partilhar as células do meio criogênico. 0 flutuante ê aspirado, e as células, na pastilha das células, são suspensas no meio da cultura (Ventrex HL-1, Ventrex Laboratories,Portland,ME), acrescido com o soro de vitela fetal a 10%, L-glutamina a 2 mM (GIBCO) e 50/ug/ml de sulfato de gentamicina (GIBCO), em frascos de cultura de tecidos T150, em dióxido de carbono a 5%, a 37°C. Os flutuantes, das culturas aproximadamente confluentes, sbo reunidos, e as células residuais são removidas por centrifugação. 0 anticorpo ê purificado do flutuante livre das células, passando-o através de uma coluna de Sepharose de PRoteina A (Pharmacia,Uppsala,Suécia), As li-

gações do anticorpo â coluna e ao meio da cultura são lavadas livremente, em fosfato de sódio a 0,01M, a pH 8,0. 0 anticorpo ê, em seguicfa, eluido da coluna, com um tampão de fosfato de sódio a 0,1M, a pH 3,5. 0 anticorpo eluido ê neutralizado, imediatamente, com um tampão de Trizma a 1M (Sigma, S. Luis, MO), a pH 7,4, é dialisado e ê concentrado num diaH sador de vácuo (BioMolecular Dynamics Beaverton, 0R), contende fosfato de sódio a 0,01M, a pH 7,4, acrescido de cloreto de sódio a 0,15M. As preparações do anticorpo são esterilizadas por filtração, através de uma membrana porosa de 0,2 /um, e são armazenadas a 4°C, até o seu emprego.

Exemplo 8

Conjugado do anticorpo L/1C2 com carbonil-4-benzilidenohidra-zida de 4-desaceti1-23-desmetoxivinblastina.

Uma parcela de 10 mg do anticorpo L/1C2, como 0,56 ml de solução em tampão de borato a 0,34 M, a pH 8, foi introduzida num frasco pequeno. A ela, se adicionou 0,65 mg do intermediário da Preparação 2, em 0,045 ml de dimetilformaraida. A mistura foi agitada, durante 1,5 horas, â temperatura ambiente, e foi, em seguida, cen-trifugada. 0 flutuante foi purificado pela cromatografia sobre Sephadex G24, eluindo-se soro fisiológico tampinado. As parcelas, que continham o produto, foram reunidas, para se obterem 1,3 mg do conjugado, que tinha uma proporção de conjugação de 6,2 moles por mole, em 5,4 ml da solução, como foi revelado pela análise de ultravioletas. 0 produto foi avaliado contra as células T222, em cultura de tecidos. Ele inibiu o desenvolvimento das células em 40¾ a 0,032 mcg/ml, e em 70¾ a 0,32 mcg/ml. Em comparação, a hidrazida de 4-desaceti1-23-desmetoxivinblastina inibiu o desenvolvimento das células em 45/ a 0,01 mcg/ml, e em 82¾ a 0,1 mcg/ml.

Preparação 4 N-succinimido-éster do ácido 3-(4-formilfenilcarbonilamino) propiônico A um balão de 250 ml, adicionaram-se 3 gramas de 4-carboxibenzaldeido e 2,3 gramas de N-hidroxis-succinimida em 100 ml de dioxano. A mistura foi agitada,duran te 5 a 10 minutos,e, em seguida,adicionaram-se-lhe 4,1 gramas de diciclo-hexilcarbodi-imida. A mistura foi agitada, durante uma hora, à temperatura ambiente, e foi, em seguida, filtrada. 0 filtrado foi evaporado sob vácuo, dando origem a 9,4 gramas de um sólido branco, que foi cristalizado novamente em 25 ml de isopropanol quente. 0 produto intermediário foi titulado com propanol, dando origem a 2,1 gramas do desejado N-succinimido-éster de 4-carboxibenzaldeido.

Produziram-se lotes complementares do intermediário, e adicionaram-se o total de 10 gramas do éster de N-succimido precedente, a uma solução de 3,6 gramas de B-alanina em 40 ml de hidróxido de sódio a IN e cerca de 100 ml de água. 0 pH foi’ mantido acima de 8, enquanto a mistura era agitada durante 1,5 horas. A mistura foi, em seguida, filtrada, e o filtrado foi tornado ácido a pH 1,9,com o ácido clorídrico a 2N. Ele foi extraído, por três vezes, com o total de 150 ml de acetato de etilo, e os estratos orgânicos foram reunidos e foram lavados com salmoura. 0 estrato orgânico foi, em seguida, seco sobre o sulfato de sódio e foi evaporado sob vácuo, dando origem a 4,6 gramas de um sólido branco, o ácido 3-(4-formilfenilcarbonilamino)propiÔ-nico.

Cem miligramas do intermediário precedente, 103 mg da diciclohexilcarbodiimida, 57,5 gramas de N-hidroxissuccinimida e 10 ml de dioxano, foram introduzidos num balão pequeno, e a mistura foi agitada,â temperatura am- -39- c

biente, sob o nitrogénio. 0 desenvolvimento'da reacção foi observado pela cromatografia de camada fina, e adicionaram--se-lhe 75mg de diciclo-hexilcarbodi-imida complementar e 45 mg de N-hidroxissuccinimida complementar. Depois de quatro horas, a mistura da reacção foi filtrada, e o filtrado foi evaporado, dando um sólido sob o vácuo. Obtiveram-se cerca de 200 mg de produto iipuro, que foi cromatografado sobre 30 gramas de gel de silica, eluindo-se com isopropanol a 5¾. em diclorometano. As parcelas, que continham o produto, foram reunidas e foram evaporadas, dando origem a 81mg do intermediário desejado, em protótipo de certo modo impuro.

Preparação 5

Fragmento F(ab')2 do anticorpo L/1C2. 0 fragmento F(ab*)2 do anticorpo L/1C2 foi preparado, adicionando-se 2,4 ml da solução de pepsina, contendo 12,6 mg de pepsina/ml, a 1,5 gramas do anticorpo L/1C2 em 270 ml de soro fisiológico tamponado. A mistura foi mantida a 37°€, durante 2 horas e 20 minutos,e, em seguida, a reacção foi interrompida pela adição de trie-tanolamina. 0 produto foi, em seguida, concentrado pela cro-matografia sobre uma coluna de Sepharose de Fluxo Rápido (Farmácia), eluindo-se com o acetato de sódio a 0,15 M. As parcelas, que continham o F(ab1)2» foram reunidas e foram concentradas pela diálise, dando origem a 100 ml da solução do produto, contendo 992 mg do fragmento F(ab')2 do anticorpo L/1C2. -40-

Preparação 6

Derivado 3-(4-formilfenilcarbonilaroino)propionno do fragmento F(ab')2 do anticorpo L/1C2 0 fragmento Fíab'^ do anticorpo L/1C2, preparado na Preparação 5, foi dialisado num tampão de borato a 0,34 M, a pH 8,6, dando origem a 23 mg do fragmento F(ab')2, na forma de 3,8 ml de uma solução. Essa solução foi reunida a 0,44 mg do éster de N-succinimido, do ácido 3-(4-formilfenilcarbonilamino)propiónico, em 102 ul de acetonitrilo. A mistura foi agitada, durante uma hora,â temperatura ambiente, e a solução foi, em seguida, cromato-grafada,sobre uma coluna de 11 gramas de Sephadex G25, eluin-do-se com o acetato de sódio a 0,1M, a pH 5,6. As parcelas, que continham o produto, foram reunidas, dando origem a 19mg do fragmento do anticorpo derivatizado, a uma proporção de conjugação de 2,8 moles por mole, em 9,6 ml de solução.

Exemplo 9

Conjugado do fragmento F(ab')2 do anticorpo L/1C2 com propionil-3-aminocarbonil-4-benzilideno-hidrazida de 4-desaceti1-23-desmetoxivinblastina

Uma parcela de 8 mg do intermediário, preparado na Preparação 6, foi adicionada a 6,9 mg de hidra-zida de 4-desaceti1-23-desmetoxivinblastina, sólida. 0 pH foi ajustado a 5,6, adicionando-se o ácido clorídrico diluído, e a mistura foi agitada, â temperatura ambiente,durante 21 horas. A mistura foi, em seguida, centrifugada, e o flutuante foi cromatografado sobre uma coluna de 11 gramas de Sephadex G25, eluindo-se com salina protegida com um tampão fisiológico. As parcelas, que continham, o produto, foram reunidas e filtradas, dando origem a 4,8 ml da solução do produto, a qual se verificou, pela análise de ultravioletas, verificando-se que a curva a 280 e a 325 nm continha 3,5mg do conjugado, a uma proporção de conjugação de 3,5 moles do medicamento de vinca, por mole do fragmento do anticorpo. A citotoxicidade do conjugado, contra as cêiulas T222, em cultura de tecidos, foi verificada,como ficou descrito no precedente. Não tinha qualquer efeito a 0,1 /ug/ml.baseado na parte essencial da hidrazida da vinca, e inibiu o desenvolvimento em 85¾. a 1 ^jg/ml.

Preparação 7

Derivado de 3-(4-formilfenilcarbonilamino)propionilo do anticorpo 14.95.55.

Uma parcela do anticorpo 14.95.55 foi dialisada num tampão de borato a 0,34M, a pH 8,6 dando origem a uma solução, que continha 11,6 mg/ml do anticorpo. Uma parcela de 3,9 ml da solução, que continha 45,2 mg do anticorpo, 1oi introduzida num balão de 10 ml, e a ela se adicionaram 132 íu 1 de uma solução, contendo 0,57 mg do intermediário da Preparação 4, dissolvidos em acetonitrilo. A mistura foi agitada, durante uma hora, à temperatura ambiente,e foi, em seguida, cromatografada sobre uma coluna de 10 gramas de Sephadex G25, eluindo-se com o acetato de sódio a 0,1M, a pH 56. As parcelas, que continham o produto, foram filtradas e foram analisadas por ultravioletas, observando-se picos a 258 e a 280 nm. Obteve-se uma produção de 40 mg do derivado, como uma solução contendo 2,6 mg/ml. A proporção da conjugação era de 4,1 moles do agente de ligação,por mole do anticorpo. -42-

,Ν V

Exemplo 10

Conjugado do anticorpo 14.95.55, com a propioni1-3-aminocar-bonil-4-benzilldeno-hidra2ida de 4-desaceti1-23-desmetoxivin-blastina

Uma parcela de 14,75 ml da solução intermediária da Preparação 7, que continha 38,3 mg do anticorpo modificado, foi introduzida num balão, e a ela se adicionaram 2,6 ml de tampão de fosfato a 1M, seguido de 22,2mg de sulfato de hidrazida de 4-desaceti1-23-desmetoxivinblasti-na. A mistura foi agitada, de um dia para o outro, â temperatura ambiente, e ela foi centrifugada, durante 15 minutos, e foi cromatografada sobre uma coluna de 45 gramas de Sephadex G24, eluindo com soro fisiológico tampcnado. A análise das parcelas, que continham o produto, por ultravioletas,observando-se a curva a 280 e a 325 nm, revelou que se obtinham 21,8 mg do conjugado, numa proporção de conjugação de 3,8 moles do medicamento, por mole do anticorpo. 0 conjugado foi experimentado, em cultura de tecidos, contra as células UCLA/P3. A sua concentração inibitória de 50¾ foi 0,035 jug/ml, baseada ba parte essencial da hidrazida de vinca.

Um lote semelhante, mas diferente, do mesmo conjugado foi experimentado contra os tumores,provocados pelos xenoenxertos das células de carcinoma do colon LS174T, nas ratas nuas de Charles River. 0 conjugado foi administrado intravenosamente, nos dias 9,11,14 e 17,depois da implantação, quado a massa média dos tumores era cerca de 1.000 mg. Doses de 0,25 mg/kg (baseadas na parte essencial da hidrazida de vinca) revelaram o desenvolvimento apenas ligeiro, dos tumores de crescimento muito rápido;aos 28 dias, os tumores dos ratos de controlo pesavam 10 gramas. A massa média dos tumores, em ratos a que se administrou 0,5 mg/kg, -43-

foi cerca de 4,5 gramas, e a massa média dos tumores em ratos a que se administrou 1 mg/kg foi cerca de 1 grama,essencialmente inalterados a partir do inicio do tratamento.

Preparação 8 4-Carboximetoxi- PÍ-metilbenzilideno-hidrazida de 4-desacetil--23-desmetoxivinblastina

Um gra'ma de hidrazida de 4-desacetil--23-desmetoxivinblastina foi dissolvido em 75 ml de tetra-hi-drofurano, e adicionaram-se-lhe 1,52 gramas de Scido 4-ace-tilfenoxiacêtico. Adicionaram-se, em seguida, dez ml de di-metilformamida e 5 gramas de sulfato de sódio, e a mistura da reacção foi agitada, de um dia para o outro, à temperatura ambiente, sob condições anidras. A mistura da reacção foi filtrada, e o filtrado foi evaporado, sob o vácuo, dando origem a um residuo sólido, que foi purificado pela cromatogra-fia liquida de alta resolução, sobre gel de silica, eluindo--se com um gradiente linear, alterando-se de 5% a 50¾ de metanol em acetato de etilo. A concentração das parcelas, que continham o produto, deu origem a 490 mg do intermediário desejado, que foi identificado, pela espectroscopia de massa, a qual revelou iões moleculares de peso 900, 944, 957 e 973.

Preparação 9 4-Sticcinimidoxicarbonilmetoxi- C^~metiIbenzi 1 ideno-hidrazida de 4-desaceti1-23-desmetoxivinblastina

Uma parcela de 300 mg do intermediário da Preparação 8 foi dissolvida em 25 ml de dimetilformamida, e a solução foi arrefecida num banho de gelo, sob o nitrogénio. A ela, adicionaram-se 86 jul de N-metilmorfolina, e a mistura foi agitada, durante 20 minutos. Em seguida, adi-cionaram-se 81 μΐ de cloroformiato de isobutilo, e a mistura foi agitada, durante mais 20 minutos. Em seguida, adicionaram-se 108 mg de N-hidroxisuccinimida, e a mistura foi agitada, de um dia para o outro, ao mesmo tempo que ela se aquecia, gradualmente, à temperatura ambiente. Os produtos voláteis foram, em seguida, removidos sob o vácuo, e 0 residuo foi recolhido em diclorometano, e foi lavado com salmoura. 0 estrato orgânico foi seco com o sulfato de sódio, e foi evaporado sob o vácuo, dando origem a 110 mg do éster activo desejado.

Exemplo 11

Conjugado do anticorpo 007B com carbonilmetoxi-^-metil-4--benzi1ideno-hidrazida de 4-desacetil-23-desmetoxivinblas-tina 0 anticorpo 007B foi dialisado num tampão de borato a 0,34M, a pH 8,6, a uma concentração de 4,05 mg do anticorpo/ml. Efectuaram-se duas conjugações,em-pregando-se quantidades diferentes do intermediário da Preparação 9. Em cada caso, a quantidade do anticorpo foi de 12,15 mg, fornecida como 3 ml de uma solução do anticorpo.

As reacçSes com o anticorpo foram levadas a efeito durante uma hora, â temperatura ambiente, apôs o que as misturas da reacção foram centrifugadas, e o flutuante foi purificado -45-

pela cromatografia sobre urna coluna de Sephadex G25,eluindo com soro fisiológico tamponado. As parcelas, que continham o produto, foram analisadas por uma análise de ultravioletas, observando-se as curvas 279 e 285 nm. A. Uma parcela de 4,2 mg do intemediário da Preparação 9 foi empregada, dissolvida em 240 /ul de dimetilformamida. 0 produto foi 6 mg do conjugado, a uma proporção de conjugação de 5,2 moles por mole, na modalidade de 7,5 ml de uma solução. B. A quantidade do intermediário foi de 6,3 mg, dissolvidos em 240 jul de dimetilformamida, e obtiveram-se 1,56 mg do produto conjugado, com uma proporção de conjugação de 11,4, na modalidade de 6 ml de uma solução. 0 produto da conjugação A foi analisado contras as células de adenocarcinoma UCLA/P3, em cultura de tecidos, na análise da citotoxicidade, que foi descrita no precedente. Verificou-se que o conjugado inibiu o desenvolvimento das células em 29%, a uma concentração de 50 ng/ml, e em 93%, a uma concentração de 100 ng/ml. A actividade, do intermediário não conjugado da Preparação 8, foi, essencialmente, a mesma, na análise da citotoxici-adde.

Preparação 10

Um processo, essencialnente idêntico ao da Preparação 8, foi levado a efeito, empregando-se 940 mg de ácido 4-formilfenoxiacático. 0 produto foi de 170mg do intermediário desejado, que revelou i6es moleculares,na espectroscopia da massa, de peso 886, 944 e 958. -46-

Preparação 11 4-Succimidoxicarbonilmetoxibenzilideno-hidrazida, de 4-desa-cetil-23-desmetoxivinblastina

Um processo, idêntico ao da Preparação 9, foi levado a efeito, partindo-se de 500 mg do intermediário da Preparação 10, de 145 /j1 de N-metili»íorfolina,de 137 μΐ de cloroformiato de isobutilo e de 182 mg de N-hidro-xissucinimida. 0 produto foi 160 gramas do éster activo desejado.

Exemplo 12

Conjugado do anticorpo 007B, com carbonilmetoxi-4-benzilideno--hidrazida de 4-desacetil-23-desmetoxivinblastina

Duas conjugações foram levadas a efeito, empregando-se o intermediário da Preparação 11,sob condições idênticas âs do Exemplo 11. 0 produto da conjugação A foi 6,6 mg do conjugado, que tinha uma proporção de conjugação de 3,5 moles por mole, na modalidade de 5,8 ml da solução. 0 produto da conjugação B foi 6,0 mg do conjugado, que tinha uma proporção de conjugação de 4,8 moles por mole, na modalidade de 7,2 ml da solução. 0 produto da conjugação A foi analisado contra células UCLA/P3, em cultura de tecidos, e verificou-se que inibiu o desenvolvimento em 33%, a 100 ng/ml, e em 100% a 250 ng/ml. A actividade citotôxica do intermediário da Preparação 10 foi essencialmente a mesma.

Preparação 12 N-Succinimido-éster do ácido 3-(5-formilpirrol-2-ilcarbonila-mino)propiónico

Num balão, deitaram-se 139 mg de ácido 5-formilpirrol-2-ilcarboxilico, 247 mg de diciclohexi 1-carbodi-imida, 138 mg de N-hidroxissuccinimida e 10 ml de dimetilformamida. A mistura foi agitada, durante duas horas, à temperatura ambiente, sob azoto, e o solvente foi removido sob o vácuo, dando origem a 394 mg do éster activo bruto. 0 resíduo precedente foi recolhido em 1 ml de acetonitrilo. Nem todo o residuo foi recolhido na solução. A mistura heterogénea foi adicionada,lentamente,a uma solução de 89 mg de β-alanina em 2 ml de hidróxido de sódio a 0,5N. Concorrentemente, adicionou-se o hidróxido de sódio a IN, para se manter o pH entre 7,5 e 8,0. A mistura foi, em seguida, agitada, â temperatura ambiente,durante 1 hora, e foi filtrada. 0 filtrado foi tornado ácido com o ácido clorídrico diluido, foi saturado com o cloreto de sódio, e foi extraído com o acetato de etilo. Ele foi, em seguida, seco e concentrado dando origem a um óleo alaranjado, que foi cromatografado sobre uma coluna de gel de silica, eluindo-se com metanol a 10¾ em diclorometano. As parcelas, que continham o produto, foram concentradas sob vácuo,dando origem a 49 mg de ácido 3-(5-formilpirrol-2-ilcarbonilamino) propiónico.

Uma parcela de 31 mg do intermediário precedente foi recolhido em 3 ml de dioxano, e a ela se adicionaram 35 mg de diciclohexilcarbodiimida e 19 mg de N-hidroxissuccinimida. A mistura foi agitada, durante duas horas, â temperatura ambiente, sob o nitrogénio, e foi, em seguida filtrada e concentrada sob o vácuo. 0 residuo foi cromatografado sobre gel de silica, eluindo-se com metanol a -48-

5¾ em diclorometano, dando origem a cerca de- 6 mg do éster activo do intermediário desejado.

Preparação 13

Derivado de 3-(5-forrnilpirrol-2-ilcarbonilaroino)propionilo do anticorpo 007B

Uma parcela de 105 mg do anticorpo 007B, na forma de uma solução* que continha 15 mg/ml em tampão de borato a Q,34M, foi reunida a 300 μ 1 de uma solução do intermediário da Preparação 12* que continha l,29mg do éster activo do intermediário em acetonitrilo. A mistura foi agitada, durante 1 hora, à temperatura ambiente, e foi, em seguida, cromatografada sobre uma coluna de 10 gramas de Sephadex G25, eluindo-se com o acetato de sódio a Q,1M, a pH 5,6. As panelas, que continham o produto, foram reunidas e foram analisadas pela espectroscopia de ultravioletas, observando-se a curva a 280 e a 300 nm. 0 produto compreendia 14,6 ml de solução, a uma concentração de 5,7 mg/ml, um total de 83,2 mg do intermediário designado no precedente. A proporção da conjugação foi de 3,6.

Exemplo 13

Conjugado do anticorpo Q07B, com propioni1-3-aminocarboni1-2-pirrol-5-meti1ideno-hidrazida de 4-desacetil-23-desmetoxivin-blastina

Uma parcela de 36 mg de sulfato de hidrazida de 4-desaceti1-23-desmetoxivinblastina foi adicionada a 60 mg do intermediário da Preparação 13, em 12,4 ml de um tampão de pH 5,6, que continha o acetato de sódio a 0,1M e um ião de fosfato a 0,15M. A mistura foi agitada, no escuro, durante 24 horas, e foi centrifugada. 0 * ι

sobrenadante foi cromatografado sobre 17 gramas de Sephadex G25, e as parcelas, que continham o produto, foram reunidas e foram analisadas pela espectrsocopia de ultravioletas pedindo-se a absorvência a 340 e a 280 nm. Verificou-se que se obtinham 43,8 mg do conjugado, com uma proporção de conjugação de 5,4 moles do medicamento de vinca, por mole do anticorpo, como 15,8 ml da solução. 0 conjugado foi subietido à radioi-munoanâlise, para se comparar a sua capacidade de ligação ao antigênio, com a ligação do anticorpo livre. Verificou--se que a conjugação tinha reduzido, apenas 1igeiramente,a capacidade de ligação do anticorpo. Ela foi analisada "in vitro", contra as células UCLA/P3, em que a sua concentração inibitória de 50%, foi de 0,0001 yug/ml (baseada na parte essencial da hidrazida de vinca).

Preparação 14

Derivado de 3-(4-formilfenilcarbonilamino)propionilo do anticorpo 0Q7B

Uma parcela de 7,0 ml da solução do anticorpo 0Q7B, que continha 15 mg/ml do anticorpo,num tampão de borato a 0,34M, a pH 8,6 foi reunida com l,33mg do intermediário da Preparação 4, como uma solução em 0,31ml de acetonitrilo. A mistura da reacção foi agitada,durante 1 hora, à temperatura ambiente,e, foi, em seguida,cromatogra-fada sobre 10 gramas de Sephadex G25, eluindo-se com um tampão de acetato de sódio a 0,1M, a pH 5,6. As parcelas,que continham o produto, foram recolhidas e foram analisadas por ultravioletas, medindo-se a absorvência a 258 e a 280 nm.Ve-rificou-se que a concentração era de 5,1 mg/ml do conjugado, com uma proporção de conjugação de 4,3. A produção total do conjugado foi de 91 mg. > 1 '

Exemplo 14

Conjugado do anticorpo 0Q7B com a propionil-3-aminocarbonil--4-benzilideno-hidrazída de 4-desacetil-23-desmetoxivinblas-tina

Uma parcela de 36 mg de hidrazida de 4-desaceti1-23-desmetoxivinblastina foi adicionada a 13,8ml de uma solução, que continha 60 mg do intermediário da Preparação 14, num tampão de acetato de sódio a Q,1M. A mistura foi agitada, à temperatura ambiente, durante 24 horas, e foi, em seguida, centrifugada e foi cromatografada sobre 17 gramas de Sephadex 625. Âs parcelas, que continham o produto, foram reunidas e filtradas, através de uma membrana porosa de 0,22 um, dando origem a 21,9 ml da solução do produto, que continha 2,0 mg do conjugado, por ml do conjugado,pela espectroscopia por ultravioletas, medindo-se a absorvência a 280 e a 293 nm. A proporção da conjugação era de 4,1 moles de medicamento de vinca, por mole do anticorpo. 0 conjugado foi analisado contra os tumores provocados nas ratas nuas, pelosjenoenxertos do ade-nocarcinoma UCLA/P3. 0 conjugado foi injectado a 0,5 mg/kg, baseado na parte essencial do medicamento de vinca, nos dias 16,19, 22 e 25, apôs a implantação. Mo dia 16, a massa média dos tumores dos animais tratados era cerca de 500 mg. Os tumores foram retrogradados pelo tratamento, e, ao fim dos 51 dias, a massa média dos tumores era sômente cerca de 50mg. Os tumores, nos animais de controlo não tratados,cresceram, com regularidade, a uma dimensão muito grande,como se processa, consistentemente, nestes tumores. -51- 1

Cornposições e Processos dè Emprego

Os conjugados do invento em consideração são proveitosos, no processo da inibição do crescimento das células não desejadas, o que constitui uma parte importante do invento em consideração. Em conformidade,o invento também inclui uma composição farmacêutica, com a máxima preferencia uma composição parentêrica, adequada para injecção no corpo do paciente. Tais composições são formuladas por processos, que são utilizados, vulgarmente, na química farmacêutica. Os conjugados em consideração são solúveis, aceitávelmente, nos fluidos fisiologicamente aceitáveis, tais como as soluções salinas fisiológicas e outras soluções aquosas, que podem ser administradas parenteralmente, com segurança.

Os produtos, para a administração parenteral, são, muitas vezes, formulados e distribuídos na modalidade de sólidos, de preferencia secos por congelação, para reconstituição, imediatamente antes do seu emprego.Tais formulações são composições proveitosas do invento em consideração. A sua preparação ê bem compreendida pelos farmacêuticos; de um modo geral, elas abrangem misturas de sais inorgânicos, para conferir a isotonicidade, e agentes de dispersão, tais como a lactose, para permitir que a preparação seca se dissolva, rápidamente, apôs a sua reconstituição.

Tais composições são reconstituídas, com água altamente purificada, a uma concentração conhecida.

Os conjugados e as composições farmacêuticas precedentes são empregadas na inibição do desenvolvimento das células não desejadas, aproveitando-se das propriedades citotóxicas dos medicamentos de vinca, abrangidos pelos conjugados. Em conformidade, o campo de acção dos empregos dos conjugados ê determinado pelas propriedades citotóxi- -52- !< 1

cas dos medicamentos de vinca. A secção anticorpo desta Memória Descritiva, discute alguns dos tipos, das células não desejadas, contra as quais os conjugados em consideração podem ser empregados, com vantagem, pelo emprego de um anticorpo, que tenha por objectivo a célula. De preferencia,os conjugados em consideração e as composições em consideração são empregados na inibição do crescimento das células cancerosas. A dosagem óptima e o programa óptimo da administração dos conjugados do invento em consideração devem ser determinados pelo médico que trata, tendo em vista a doença do paciente. E costume, como ê evidente, administrar os medicamentos citotóxicos, na modalidade de doses divididas, com intervalos de dias, ou de semanas, entre cada série de doses. Os conjugados em consideração são eficientes num amplo campo de acção de dosagens, e as dosagens,por semana, estão compreendidas, habitualmente, no escalão de cerca de 0,1 a cerca de 10 mg/kg do conjugado, com a maior preferencia no escalão de cerca de 0,25 a cerca de 4 mg/kg.

As composições típicas parenterais,que se seguem, são mencionadas para a conveniência do leitor.

Composição 1

Conjugado do Exemplo 1 100 mg

Soro fisiológico 10 ml

Armazenar a uma temperatura baixa e administrar intravenosamente. “53“ À u \

Composição 2 Conjugado do Exemplo 1 100 mg Agente de dispersão 5 mg Soro fisiológico 10 ml

Liofilizar a uma temperatura baixa e armazenar o produto seco â temperatura ambiente» ou inferior. Reconstituir» para administração, com Sgua purificada, e administrar intravenosamente.

Composição 3

Conjugado do Exemplo 4 1 grama

Lactose 10 mg

Soro fisiológico 100 ml

Liofilizar a uma temperatura baixa, e armazenar o produto seco â temperatura ambiente,ou inferior. Reconstituir, para administração, com água purificada,e administrar intravenosamente.

Composição 4 Conjugado do Exemplo 9 100 mg Soro fisiológico 20 ml Armazenar a uma temperatura baixa, e administrar intravenosamente. -54 Λ \

Composição 5

Conjugado do Exemplo 13 1 grama Agente de dispersão 12,5 mg Soro fisiológico 100 ml

Liofilizar a uma temperatura baixa, e armazenar o produto seco â temperatura ambiente,ou inferior. Reconstituir, para administração, com Sgua purifi cada, e administrar intravenosamente.

Claims (1)

1. -55-

   REIVINDICAQOES Ia. - Processo para a preparação de um conjugado de medicamentos citotóticos da fórmula Z AbrCO-X-Y-Ar-C=N-HN-VJm I \ em que Ab ê um anticorpo fisiologicamente aceitável, ou um seu fragmento que reconhece antigênios, que reconhece um antigénio associado a uma célula indesejável: m ê um número inteiro de 1 a cerca de 10; Z é hidrogénio ou alquilo Cj-Cg, não ramificado; X ê uma ligação, alquileno Cj-C^, alquenileno C2-C4 ou aminoalquileno Cj-C4; Y é uma ligação, carbonilo, -0-, -S-, ou sulfonilo.com a ressalva de que Y ê carbonilo ou sulfonilo quando X ê aminoalquileno, e de que Y é uma ligação ou um carbonilo, quando X ê uma ligação; Ar ê pirrolilo, m-fenilo,ou p-fenilo, cujos grupos fe-nilo podem ser mono- ou dissubstituidos por bromo, cloro, fluoro,metoxi, nitro ou alquilo C^-C^; V ê um medicamento de vinca da fórmula II

   em que R é H, CHg ou CHO; quando R2 e R3 são considerados isoladamente, R3 ê H, e um de R* e R2 ê etilo e o outro é H ou OH; quando R2 e R3 são considerados em conjunto com os carbonos aos quais eles estão ligados, eles constituem um anel oxirano, caso em que R1 é etilo; R4 é H, (alquil Cj-C-jl-CO ou (alquil Cj-C3)-C0 cloro-substituido;caracteri-zado por compreender; (A) a reacção de um anticorpo, ou de um seu fragmento, de fórmula Ab, tal como foi estabelecido no precedente.com um intermediário da fórmula

   ζ I R5-C0-X-Y-Ar-C=N-NH-V 5 em que R ê hidroxi, um grupo activador de ácido,uma porção que completa um sal, ou um grupo de protector de ácido; e os outros grupos de variáveis são o que ficou estabelecido no precedente; ou B) a reacção de um anticorpo modificado da fórmula Z Ab/CO-X-Y-Ar-C*Q/ com uma quantidade equivalente de uma hidrazida da fórmula h2n-nh-v em que Ab, X, Ar, Z, v e m são o que ficou estabelecido no precedente. -58-

   -N 2a.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o processo ser levado a efeito num tampão aquoso, a um pH cerca de 7 a cerca de 9. 3a. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o anticorpo ser um anticorpo monoclonal ou quimérico, ou um seu fragmento que reconhece antigénios. 4a. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por X ser uma ligação ou um ami-noalquileno Cj-C3. 5a. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por Y ser uma ligação carabo-nilo ou oxigénio. 6a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por Ar ser fenilo, fenilo mono-substituido ou pirrolilo. 7a. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por se preparar o conjugado de L/1C2 com carboni1-4-benzi1ideno-hidrazida de 4-desa-ceti1-23-desmetoxivinblastina, Lisboa, 3 de Agosto de 1989

   1200 LISSOA