HU206377B - Process for producing cytotoxic vinc-dimer conjugates and pharmaceutical compositions comprising same - Google Patents

Process for producing cytotoxic vinc-dimer conjugates and pharmaceutical compositions comprising same Download PDF

Info

Publication number
HU206377B
HU206377B HU893992A HU399289A HU206377B HU 206377 B HU206377 B HU 206377B HU 893992 A HU893992 A HU 893992A HU 399289 A HU399289 A HU 399289A HU 206377 B HU206377 B HU 206377B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
antibody
conjugate
group
vinca
solution
Prior art date
Application number
HU893992A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT50488A (en
Inventor
George Joseph Cullinan
Bennett Coleman Laguzza
William Leonard Scott
Original Assignee
Lilly Co Eli
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lilly Co Eli filed Critical Lilly Co Eli
Publication of HUT50488A publication Critical patent/HUT50488A/hu
Publication of HU206377B publication Critical patent/HU206377B/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/44—Antibodies bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6883—Polymer-drug antibody conjugates, e.g. mitomycin-dextran-Ab; DNA-polylysine-antibody complex or conjugate used for therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás citotoxikus hatóanyagok előállítására, melyek vinka-dimerek és fiziológiai szempontból alkalmazható antitest vagy antigént felismerő része konjugátumai.
A szerves kémia, immunológia és gyógyszerkémia területéhez tartozó találmány olyan citotoxikus gyógyszer-konjugátumokkal foglalkozik, melyek alkalmasak citotoxikus hatóanyagok célzott bevitelére a kezelendő szervezetbe. A gyógyszer-konjugátum célzott bevilletősége abból ered, hogy olyan antitestet tartalmaz, amely felismeri a citotoxikus hatóanyag által kezelni kívánt sejtekhez kötődött antigént, és ezáltal a konjugátum a sejthez viszi a citotoxikus hatóanyagot. Ugyancsak foglalkozik a találmány a konjugátum előállításának köztitermékeivel is.
A rák gyógyszeres kezelése az orvostudomány alapvető részét képezi. A használatban lévő gyógyszerek azonban aktív citotoxikus hatásúak, ezáltal veszélyt jelentenek a betegre. A toxicitás korlátozása céljából a dózist és az adagolás gyakoriságát szigorú keretek között kell tartani. A találmány csökkenti a toxicitási problémát, minthogy egy olyan antitestet alkalmaz, ami, a vinka-hatóanyagot a ráksejthez vezeti, ezáltal csökken a citotoxikus hatóanyag érintkezési lehetősége a beteg egészséges szöveteivel. A hatóanyagot az antitesttel összekötő, találmány szerinti kapcsoló (linker) labilis és célként szolgáló ráksejtnél a hatóanyag felszabadul.
A találmányban egy sor olyan vinka konjugátum szerepei, ahol az antitestet olyan kapcsolórendszer köti a hatóanyaghoz, hogy az könnyen képes fiziológiailag aktív formában felszabadulni.
A találmány tárgya eljárás az (I) általános képletű ahol
Ab jelentése egy fiziológiai szempontból alkalmazható antitest vagy annak az antigént felismerő része, m jelentése 1-10;
Z jelentése hidrogénatom vagy 1-3 szénatomos, nem elágazó alkil-csoport;
X jelentése vegyértékkötés, 1-4 szénatomos alkiléncsoport vagy amino-csoporítal szubsztituált 1-4 szénatomos alkilén-csoport;
Y jelentése vegyértékkötés, karbonil-csoport vagy oxigénatom, feltéve, hogy Y jelentése karbonil-csoport, ha X jelentése amino-alkilén-csoport és Y jelentése vegyértékkötés vagy karbonil-csoport, ha X jelentése vegyértékkötés;
Ar jelentése pirrolil-csoport vagy p-fenil-csoport,
V jelentése (II) általános képletű vinka-dimer, melyen belül
R jelentése metil-csoport vagy formil-csoport;
R3 jelentése hidrogénatom;
R1 és R2 egyikének jelentése etil-csoport, a másik jelentése hidrogénatom vagy hidroxil-csoport;
RJ jelentése acetil-csoport citotoxikus gyógyszer-konjugátum előállítására, amely abból áll, hogy az alábbiakban ismertetésre kerülő köztiterméket antitesttel vagy annak fragmensével reagáltatjuk. Alternatív előállítási eljárás, mely során a
H2N-HN-V általános képletű vinka-hidrazidot az Ab/CO-X-Y-Ar-C(-Z) = 0/ általános képletű köztitermékkel reagáltatjuk.
A találmány szerinti konjugátum-szintézisben R5-CO-X-Y-Ar-C(-Z) = N-HN-V általános képletű - ahol
R5 jelentése hidroxil-csoport, savaktiváló csoport, sóképző csoport vagy karboxil-csoportot védő csoport;
a többi csoport jelentése azonos a fentebb tett meghatározásokkal - közíitemiéket alkalmaznak.
A vinka-konjugátum egy antitestből, egy kapcsolóból és a hidrazid formában levő vinka-hatóanyagból áll. A konjugátumban a kapcsolónak elsődleges szerepe van, amit úgy kell megválasztani, hogy a vinka-hatóanyag úgy váljon el az antitesttől, hogy maximális toxicitását fejthesse ki a célsejttel szemben. Az alábbiakban külön-külön tárgyaljuk a konjugátum egyes komponenseit, foglalkozunk a konjugátum szintézisével, és példákkal szemléltetjük a konjugátum szintézisét és biológiai aktivitását.
Az antitest alapvető tulajdonsága kell legyen, hogy a nem kívánatos sejten megkötött antigént felismerje. Tudni kell, hogy a vinka-hatóanyagok erősen toxikus hatásúak a legkülönfélébb sejtekre. Az antitestet tehát aszerint választjuk meg, hogy felismeri-e és rákötődike arra a sejtre, amit a hatóanyaggal el akarunk ölni, vagy más módon hatással lenni rá.
Az antitest forrása a jelen találmány szempontjából nem döntő. Kiválaszthatjuk az immunoglobulinok bármelyik csoportjából vagy alcsoportjából, ideértve az IgG-t, IgA-t, IgM-et, IgE-t és az IgD-t. Hasonlóképpen nem döntő a faj, ahonnan származik, ha az antitest megcélozza azt a sejtet, ahol a vinka-hatóanyagnak ki kell fejtenie hatását.
A gyógyszer-konjugátumokhoz leginkább monoklonális antitesteket használnak, a jelen találmány szerinti konjugátumhoz is ezt előnyös alkalmazni, de a poliklonális antitestek alkalmazása sem kizárt. Újabb típusú antitest a kiméra-antitest, amit rekombináns technikával állítanak elő laboratóriumban. Ezek olyan DNS-ek expressziójával keletkeznek, melyek bármelyik kívánt antitest antigén-kötőhely régiójában vagy az antitest más aminosav-szekvenciájánál kódoltak. így olyan kiméra-antiteslek kaphatók, melyek egyik része egy adott fajból, a másik része egy másikból származik. Ezek is előnyösen felhasználhatók a találmány szerinti konjugátumhoz.
Az antitest eredete és természete mindaddig nem kritikus, amíg megcélozza a kezelendő sejtet, és nem teszi a konjugátumot elfogadhatatlanul toxikussá. A szakemberek számára az itt leírtak alapján a kiválasztott antitestből könnyen előállítható a konjugátum és könnyen minősíthető is. Az antitestek és a konjugátumok vizsgálatára megadunk néhány módszert.
Először is az antitestet egy olyan hibridómának kell termelnie, ami elég stabil ahhoz, hogy jelentős mennyiségű antitest termelődjön. Az antitestnek részt kell tudnia venni a konjugációs reakcióban és á tisztítási eljárásokban, és különösen lényeges a kellő vízoldékony1
HU 206 377 Β sága, hogy a kémiai átalakításokat elfogadható koncentrációkban lehessen végrehajtani.
A kiválasztott antitesttel képzett konjugátumot először az antigénkötő-képessége szempontjából vizsgáljuk. A szabad antitestkötő-képességéhez viszonyított enyhe csökkenés várható és elfogadható. Ezt követően megvizsgáljuk a konjugátum in vitro toxicitását az antigén-pozitív sejtekkel szemben. A hatékony konjugátumnak valamivel kevesebb citotoxicitása van, mint a szabad hatóanyagnak ugyanolyan körülmények között vizsgálva. Az első két vizsgálaton átjutó konjugátumot meztelen egerekbe átültetett humán tumoron értékeljük Johnson és Laguzza módszere szerint [Cancer Rés. 47, 3118-22 (1987)]. A kiválasztott konjugátumot meztelen egéren (nude mouse) teszteljük a szabad hatóanyaghoz, a szabad hatóanyag és a szabad antitest keverékéhez és egy olyan konjugátumhoz viszonyítva, melynek nincs jelen megcélozható immunoglobulinja. A konjugátumnak mindezekhez képest hatásosabbnak és biztonságosabbnak kell lennie. A dózis tartományra és az adagolás időrendjére modellvizsgálatokat végzünk.
A „xenograft” modellezésben hatásosnak bizonyuló konjugátumokat olyan állatokban vizsgáljuk tovább, amelyekről ismert, hogy az emberéhez hasonló módon fejeződik ki a kérdéses antigén. Amennyiben a konjugátum ezekben a tesztekben is jelentős kötődésről tanúskodik az antigénhez, és ha a xenograft-modellezés által meghatározott dózisoknak nincs toxicitásuk, a kiválasztott konjugátumot úgy tekinthetjük, hogy terápiás hatással rendelkezik.
Sok, jelenleg ismert antitest alkalmas a találmány szerinti alkalmazásra. Különösen sajátságos az L/1C2 antitest, amit az American Typre Culture Collection (Rockville, MD, USA) törzsgyűjteményben letétbe helyezett HB9682 hidridóma termel.
Az 5E9C11 antitest, amit az ATCC HB21 hibridóma termel, felismeri a transferrin receptort, amit sok tumor kifejez. A National Cancer Instítute-tól beszerezhető B72.3 jelzésű antitest felismeri a mell- és vastagbélrák által termelt antigéneket.
Érdekes két antitest az 0KT3 és OKT4, amelyek nem-tumoros antiténekkel szemben reaktívak és a perifériás T-4 sejtekhez, illetve a humán T-helper sejtekhez kötődnek. Ezeket az ATCC CRL801, illetve a GRL8002 letéti számú hibridómák termelik.
A különféle terápiás céllal felhasználható antitestek további forrásai a következők: az TCC HB2, HB22, HE44, HB78 és HB136 kultúrák által termelt emberi limfocitákkal és monocitákkal szembeni antitestek, melyek immunmódosításra és tumorterápiára alkalmasak. Tumorgyógyászatban használható antitranszferrinreceptor antitestet termel az ATCC-HB84 kultúra. Az ATCC HB8059 kultúra a vastagbélrák monosialogangliozid elleni antitestet, a HB8136 kultúra az érett humán T-sejtek felületi antigénjével szembeni antitestet termel, melyek alkalmasak az immunitás befolyásolására és a T-sejt leukémia gyógyítására.
A szakember további megfelelő antitesteket is kiválaszthat. A könnyen hozzáférhető antitestekről különösen hasznos információkat nyújt a „Linscott’s Directory of Immunology and Biological Reagensts” kiadvány (kiadta Linscott’s Directory, 40 Glen Drive, Mill Valley, Califomia 94941, USA). Az 1984-es kiadás több mint 60 tumorral kapcsolatos monoklonális antitestet sorol fel, megjelölve mindegyiknél legalább egy kereskedelmi forrást is.
A találmány szerinti konjugátumokkal a nem kívánt sejtek számos változata kezelhető. A vinka-hatóanyagokról jól ismert, hogy hatásosak a különféle típusú rákokkal szemben, és ezért a ráksejtek azok között a célsejtek között vannak, melyekkel szemben a találmány szerinti konjugátumok a legelőnyösebben használhatók.
A rosszindulatúság folyamatos kialakulását elősegítő sejtek és az immunrendszernek azok a sejtjei, melyek az antitumor immunitás kialakulását szabályozzák ugyancsak figyelembe jöhetnek. Ilyen, a rákkal kapcsolatos megcélzandó sejttípusok a pikkelyes karcinóma sejtjei, adenokarcinóma-sejtek, a kis sejtes karcinómasejtek, a gliómasejtek, melanómasejtek, vese-karcinómasejtek, az átmeneti karcinóma sejtjei, a szarkómasejtek, a tumorérrendszeri sejtek, az olyan limfoid tumorok, mint a leukémia és a limfóma sejtjei.
A vinka-hatóanyagok azonban citotoxikusak más típusú sejtekkel szemben is. így a konjugátumokat fel tudjuk használni az antitest megfelelő kiválasztásával olyan nem kívánatos sejtek elpusztítására, vagy drasztikus befolyásolására, mint például a vírusokkal fertőzött sejtek, különféle ártalmas anyagokkal fertőzött Tsejtek, valamint azok a sejtek, melyek az autoimmun betegségek kialakulását elősegítik vagy ellenőrzik.
Nyilvánvaló, hogy az antitest megfelelően megválasztott fragmense ugyanolyan hatású, mint az intakt antitest. Ezek szerint a találmány gyakorlati kivitelezése szempontjából az antitest fragmensek, mindenek előtt az F(ab’)2 fragmensek, melyek a kezelendő sejthez kapcsolódott antigént felismerik, ugyanúgy felhasználhatók, mint az érintetlen antitestek.
A pontos mechanizmus, mellyel a kapcsoló csoport reagál az antitesttel és ahhoz kapcsolódik, nem teljesen ismert és az (I) általános képletben nem részletezett. Amint az alábbiakban'kimutatjuk, a reakció egy acilezést jelent, és az antitestmolekulán több olyan hely van, amelyik acileződik. Legáltalánosabb az a feltételezés, hogy a reakció a lizin szabad amino-csoportján történik, de acileződhet a hidroxil-csoport, fenol-csoport, imidazol-gyűrű és talán más csoport is.
Az (I) általános képlet mutatja, hogy antitest molekulánként 1-10 kapcsoló-hatóanyag egység kapcsolódik hozzá. Amennyiben a kapcsoló-hatóanyag egység ennél nagyobb számban szerepel, az kedvezőtlen hatással van az antitest antigénfelismerő képességére és az antigénhez való kötődésére, valamint a vízoldékonyságra, így egy optimális m számot kell találnunk. Általában előnyös, ha az m értéke 4-10 vagy 3-8.
A vinka-hatóanyagok:
Kutatásuk néhány éve a gyógyszerészet és az orvostudomány tárgya. Sokan tanulmányozták, nagy az irodalmuk, és több szabadalom foglalkozik velük. Néhányan
HU 206 377 Β már javasolták a humán rákos megbetegedés kezelésére. A találmány szerinti konjugátumokban szereplő vinka-hatóanyagok ismertek a gyógyszerészetben és a szakemberek előtt, és könnyen hozzáférhetők. Az olvasó tájékoztatására az alábbiakban röviden ismertetjük a hatóanyagokat.
A (II) általános képletű hatóanyagok: vinblasztin (VLB) - R jelentése metil-csoport, R1 jelentése hidroxil-csoport, R2 etil-csoport, R3 hidrogénatom és R4 acetil-csoport; vinkrisztin (VCR) - R jelentése formilcsoport, R1 hidroxil-csoport, R2 etil-csoport, R3 hidrogénatom és R4 acetil-csoport; leurozidin R jelentése metil-csoport, R1 etil-csoport, R2 hidroxil-csoport, R3 hidrogénatom és R4 acetil-csoport; deoxi-VLB „B” (4’-dezoxileurozidin vagy 4’-epideoxi-VLB) - R jelentése metil-csoport, R1 jelentése etil-csoport, R2 és R3 hidrogénatom, R4 acetil-csoport; deoxi-VLB „A” vagy 4’-deoxi-VLB - R jelentése metil-csoport, R2 etilcsoport R1 és R3 hidrogénatom és R4 acetil-csoport; 4’-epideoxi-vinkrisztin (1 -forrni 1-1 -dezmetil-4’ -deoxi leurozidin) - R jelentése CHO-csoport, R1 etil-csoport, R2 és R3 hidrogénatom, R4 acetil-csoport.
A vinka-hatóanyagokat a konjugátumhoz használt hidrazidokká a 4 203 898 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (12. hasáb, 65. sor és 3. példa 18, hasáb) eljárása szerint állítjuk elő. Az eljárás szerint vízmentes hidrazint reagáltatunk a megfelelő vinka-alkaloiddal etanolban, leforrasztott csőben 60 °C hőmérsékleten. A reakciótermék egy 4-dezacetil-3-karboxi-hidrazid, minthogy a C-4 helyen lévő acetoxi-csoport lúgos körülmények között lehidrolizál. Ha azt akarjuk, hogy a C-4 helyen észter-csoport legyen [a (II) általános képletű vegyület R4 jelentése 1-3 szénatomszámú alkil-CO csoport vagy ennek klóratommal szubsztituált származéka) a fenti dezacetil-3-karboxhidrazidot előzőleg acetonnal reagáltatva védjük, egy N2-propilidén-származékot képezve. A hidrazid acilezhető NH2 csoportja ezzel hatásosan védett az acilezéssel szemben, ezt a védett származékot a szokásos módon acilezhetjük savhalogeniddé! (például klór-acetilkloriddal) vagy savanhidriddel (például propionsav-anhidriddel). A védőcsoportot ezt követően savas kezeléssel eltávolíthatjuk. Ha az acileződés- amint az rendszerint történni szokott - a C-3 helyű hidroxil-csoporton is bekövetkezik, az acil-csoport előnyösen eltávolítható nedves szilikagél alkalmazásával, amint azt Hargrove leírja (3 392 173 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás).
A kapcsoló: olyan -X-Y-Ar-C(Z)» általános képletű szenes csoport, mely egyik végén a karboxil-csoporthoz, másik végén a hidrazidhoz kötődik. A vinkahidrazidhoz való kötés egy alkilidén-hidrazid kötés. Nyilvánvaló azonban, hogy oldatban, különösen fiziológiás oldatban ez a kötés más formában is lehet. A kettős kötés felnyílhat, lehetőséget adva arra, hogy a funkcionális csoportok vagy protonok kapcsolódjanak a nitrogénatomhoz és a szénatomhoz. Ennek eredményeként hidroxil-csoport vagy más, oxigénen keresztül kötődő csoport kapcsolódhat az előbbi kettős kötés egyik oldalán, és ugyanez történhet egy amino-csoporton keresztül kötődő csoporttal is. Az atomok egyikéhez gyenge kötéssel víz kötődhet. Az antitest egy csoportja ugyancsak kötődhet gyengén valamelyik atomhoz és egynél több ilyen reakció is végbemehet, keveréket eredményezve. Ezek a termékek átmenetiek, de a találmányban az általános és stabil alkilidén-hidrazid formát írjuk le.
Az X jelentése lehet csak egy vegyértékkötés, vagy jelenthet 1-4 szénatomszámú alkilén-csoportot, például metilén-, etilén-, butilén-, 2,2-propilén-, izo-butilénvagy 1,2-dimetil-etilén-csoportot; amino-(l-4 szénatomszámú alkilén)-csoportot, például amino-metilén-, amino-etilén-, amino-3-metil-propilén-, amino-l,l-dimetil-etilidén-csoportot és hasonlókat. Amennyiben X jelentése amino-alkilén-csoport, az amino-csoport szomszédos az Y csoporttal. Előnyös, ha X jelentése vegyértékkötés, 1-2 szénatomszámú alkilén-csoport vagy 1-3 szénatomszámú amino-alkilén-csoport, például metilén-, etilén-, amino-metilén- és amino-propilén-csoport.
Az egymással kapcsolatban levő X és Y csoportot illetően bizonyos megkötöttségek vannak, nem minden Y csoport kapcsolódhat minden X csoporttal. Ha X jelentése amino-alkilén-csoport, Y jelentése csak karbonil-csoport lehet; ha X jelentése vegyértékkötés, Y jelentése csak vegyértékkötés vagy karbonil-csoport lehet.
A leágazó Z csoport jelentése lehet hidrogénatom, vagy 1-3 szénatomszámú egyenes alkil-csoport, így metil-, etil- vagy propil-csoport. Előnyös, ha a Z csoportjelentése hidrogénatom vagy metil-csoport.
Az alábbiakban néhány példát sorolunk fel az -X-Y-Ar-C(Z)= általános képletű kötőcsoportra, hogy ezzel részletesebben jellemezzük a találmány szerinti konjugátumokat. Minden esetben az elnevezésnél a csoport C(Z) végétől indulunk ki, és haladunk a karbonilvég felé, tekintet nélkül az elnevezési szabályokra. így kívánjuk e csoportok elnevezését következetessé tenni. Ilyen csoport tehát a:
2-metilidén-pirrol-5-il,
-(3-metil idén i l-pirrol-4-il)-acetil, l-(2-metilidenil-pirrol-4-il-oxi)-etilénil, l-[2-(l,l-etilidenil)-pirrol-5-il-tio]-2-metil-etilénil, l-(3-metil idén i I-fenil)-2-meti 1-propiléni 1.
A találmány szerinti konjugátumok szempontjából előnyös kötőcsoport a 4-benzilidenil-, l-(4-metilideniIbenzamido)-etilenil-, l-(4-metilidenil-fenil)-etenil-, 4metilidenil-fenoxi-metilenil-, l-(2-metilidenil-pirrol-5il)-etilenil- és az 1 -[4-( 1,1 -etilidenil)-fenoxi]-acetilcsoport.
Az előzőekben már foglalkoztunk a köztitermékeket felépítő csoportokkal, kivéve az R5 terminális csoportot. R5 jelentése lehet a savat kialakító hidroxil-csoport vagy olyan, a karbonsavat aktiváló csoport, melyeket alább, a szintézisek tárgyalásánál említünk. Lehet továbbá sóképző csoport, például alkálifém-ion, alkáliföldfém-ion, amino-csoport, mint amilyen adietil-amino-csoport, dietanol-amino-csoport stb. Lehet ezenkívül savvédő csoport, melyeket például Green sorol fel (Protective groups in organic synthesis, Wiley, New
HU 206 377 Β
York, 1981, 152-92. old.). A védőcsoport képezhet észtert, amidot és hidrazidot; külön megemlítjük az R5 csoportoknál a fenacil-oxi-, triklór-etoxi-, terc-butoxi-, trifenil-metoxi-, trimetil-szilil-oxi-, sztannil-észtereket, a dimetil-amino-csoportot stb.
Előnyösek azok a köztitermékek, melyek a fentebb előnyösként megnevezett X, Y és Ar csoportokat tartalmazzák. A reakció szempontjából előnyösek azok a köztitermékek, melyeknél R5 jelentése egy savaktiváló csoport, vagy olyan csoport, mely az aktivált savszármazékká való átalakítást lehetővé teszi.
A köztitermékek önmagukban is használhatók rákellenes szerként, és ilyen céllal hasonló módon és dozírozásban adagolhatok, mint a vinka-hatóanyagok, melyeket tartalmaznak.
A találmány szerinti konjugátumok önmagukban ismert módon állíthatók elő. Az elsődleges szempont ezeknél az eljárásoknál természetesen az, hogy az antitest szerkezetét és funkcióját amennyire csak lehetséges, megtartsuk és a köztitermék és a végtermék tisztítását megoldjuk. Az eljárások során a reakciólépések követhetik egymást a szokásos sorrendben, vagyis hozzákötjük a linkért az antitesthez, majd a vinka-hidrazidot reagáltatjuk a kapcsolóval, de reagáltathatjuk a kapcsolót a vinka-hidraziddal, és az így keletkezett köztiterméket kapcsoljuk második lépésben az antitesthez.
A kiindulási vegyületek előállítása, melyekből a kapcsolók származnak, a szerves kémiában alkalmazott rutineljárásokkal történik. Több közülük kereskedelmi forgalomból beszerezhető, mások ismert módon előállíthatók.
A találmány szerinti köztitermékek és konjugátumok előállítását vázlatosan az 1. és a 2. reakciófolyamatban mutatjuk be:
1. reakciófolyamat
R6-CO-X-Y-Ar-C(Z) = 0 + H2N-NH-V —>R6-CO-X-Y-Ar-C(Z) = N-HN-V ahol R6 jelentése savvédő csoport, hidroxil-csoport vagy sóképző csoport; és a keton vagy aldehid dimetilvagy dietil-acetál formájában lehet;
R6-CO-X-Y-Ar-C(Z) = N-HN-V: + R7-H —»R7-CO-X-Y-Ar-C(Z) = N-HN-V ahol R7 jelentése az alábbiakban ismertetett savaktiváló csoport;
Ab + m [R7-CO-X-Y-Ar(Z)-C ·= NHN-V] —»(I).
2. reakciófolyamat
Ab + m (R7-CO-X-Y-Ar-C(Z) = O]->
Ab (CO-X-Y-Ar(Z)-C = O]m ahol a keton vagy az aldehid dimetil- vagy dietil-acetál formában lehet;
Ab [CO-X-Y-Ar-C(Z) = O]m + m (H2N-NHV)-4(I).
A V-NH-NH2 általános képlettel jelölt vinka-hidrazidot alkalmazhatjuk szabad bázisként vagy savaddíciós sóként. Különösen előnyös szulfátsóként felhasználni, de más szokásos savaddíciós sókat is készíthetünk, és ezek is megfelelnek a további szintézislépésekhez. Ilyen sók például a hidroklorid, hidrobromid, toluol-szulfonát, metán-szulfonát, benzoát, maleát, nitrát, foszfát és hasonlók, melyeket sajátságos reakciókörülmények között alkalmazhatunk.
Az R7 jelentése karbonsavat aktiváló csoport, melyet az e célból általánosan használt, jól ismert csoportok közül választhatunk ki. Különösen alkalmasak a peptidkémiában alkalmazott aktiváló csoportok, mint amilyen a szukcinimid-οχϊ-, ftálimid-oxi-, metán-szulfonil-oxi-, toluol-szulfonil-oxi-, benzol-szulfonil-oxi-, benzo-triazolil-oxi-, klór-, bróm-, azido-csoport stb. Előnyös karbonsavaktiváló csoport a szukcinimid-oxi-, ftálimid-oxi- és a benzo-triazolil-oxi-csoport.
A karbonsavaktiváló csoport könnyen kapcsolható az R6-CO-X-Y-Ar(Z)-C = 0 általános képletű kiindulási vegyületekhez vagy a köztitermékekhez általánosan használt észterezőreagens, mint például a diciklohexil-karbodiimid stb. felhasználásával. A reakciót olyan 0-50 °C közötti hőmérsékleten és közömbös oldószerben hajtjuk végre, mint amilyen a dioxán, tetrahidrofurán, klórozott szénhidrogének stb. Az aktivált linker-köztitermékek előállítását a példákban részletezzük.
A találmány szerinti konjugátumok szintézisének egyes lépéseit úgy hajtjuk végre, hogy a berendezések kihasználtságát és a termékhozadékot maximalizáljuk.
A legtöbb, ha nem az összes esetben az eljárás legköltségesebb tényezője az antitest, ezért a folyamat optimalizálása megkívánja, hogy az antitestre viszonyítva minél tökéletesebb legyen a termékhozadék. Az optimális körülmények megválasztása ezért attól függ, hogy tudunk-e olyan feltételeket biztosítani, melyek közt az éppen alkalmazott antitest a legstabilabb. A termelés antitest szempontjából való maximalizálása rendszerint megköveteli, hogy az utolsó lépésben reagáltassuk az antitestet a köztitermékkel. Valószínű, hogy a legoptimálisabb körülmény megkívánja, hogy lényeges feleslegben alkalmazzuk a kapcsoló köztiterméket, hogy ezzel maximalizáljuk az antitest és - valamivel kisebb mértékben - a drága vinka-hatóanyag felhasználtságát.
A körülmények megválasztásánál elsődleges szempont, hogy a köztiterméket vagy az aktivált kapcsoló köztiterméket úgy reagáltassuk az antitesttel, hogy biztosítsuk az antitest stabilitását. A reakciót olyan összetételű vizes közegben játszatjuk le, mely károsan nem befolyásolja az antitestet. Különösen alkalmas vizes közeg a borát-puffer, melyben a borát ion koncentrációja 0,1-0,5 M között van. A reakciókeverék kémhatását semleges és enyhén bázikus tartományban, pH = 7-9 értéken kell tartani. Noha a reakcióközeg vizes, kis mennyiségű szerves oldószer jelenléte nem káros, sőt kedvező lehet. így például előnyös lehet, ha a köztiterniéket vagy a kapcsoló köztiterméket kevés szerves oldószerben oldjuk, és ezt a szerves oldatot adjuk az antitest vizes oldatához. Ilyen szerves oldószer lehet például a dimetil-formamid, tetrahidrofurán, dioxán vagy a glikol-éter.
Általában alacsony koncentrációkkal kell dolgoznunk, minthogy az antitestek oldékonysága rendszerint nem nagy. A vizes oldatban az antitest-koncentráció általában 5-25 mg/ml.
HU 206 377 Β
Ο
Mint már említettük, egy molekula antitesthez 1-10 molekula kapcsoló és hatóanyag kapcsolódik. Hogy ezt a konjugációs arányt elérhessük, a kapcsoló köztiterméket vagy a köztiterméket rendszerint feleslegben kell alkalmazni. Az acilezési körülmények között az antitestek reakcióképessége valamelyest változó, de általában egy mólnyi antitestre 5-30 mól kapcsoló köztiterméket vagy köztiterméket használunk.
Az antitest acilezése 0-40 °C hőmérsékleten néhány percestől néhány órás reakcióidőt igényel. A reakció meglehetősen gyors, ezért általában viszonylag alacsony hőmérsékleten is elfogadható termelést érünk el, mely hőmérsékleten az antitest kellően stabil. A találmány szerinti konjugátumokat és az antitestet tartalmazó különféle köztitermékeket kedvezően tisztíthatjuk a szokásos módon végzett kromatográfiás eljárásokkal. A példák között részletezzük ezeket az eljárásokat. Az antitestek reakciójának előrehaladtát a két hullámhosszú ultraibolya analízissel követhetjük nyomon, az antitestet tartalmazó gyógyszer-konjugátumoknál használt analitikai eljárások szerint.
A kromatográfiás tisztításnál eluensként azt a híg vizes puffért használhatjuk, mely a következő reakciólépés vizes közegéül is szolgál.
Ha a 2. reakciófolyamatot alkalmazzuk, a második lépésként szereplő vinka-hidrazid (V-NH~NH2)/kapcsoló köztitermék közötti reakció gyorsan és könnyen lejátszódik szobahőmérsékleten és a fentebb ismertetett vizes közegben. Különösen alkalmas vizes közeg a híg acetát-puffer, melyben a nátrium-acetát koncentrációja 0,1 m és a kémhatás gyengén savas, pH = 5-7. Más gyengén savas puffereket is használhatunk, például borátpuffert, gyengén savas foszfát-puffért, fiziológiásán pufferolt sóoldatot stb. Ha a reakciót az 1. reakciófolyamat szerint az első lépésben hajtjuk végre, azt végezhetjük megfelelő szerves oldószerben - például tetrahidrofuránban, dioxánban, dimetil-formamidban stb. - is. A vinka-hatóanyagokkal való reakciót sötétben kell végezni.
A találmány szerinti konjugátumok alkalmasak a nemkívánatos sejtek növekedésének gátlására. A találmány foglalkozik azokkal a gyógyszerkészítményekkel is, melyek alkalmasak mindenek előtt parenterális, injektálható bevitelre. Ezeket a készítményeket a gyógyszerkémiában szokásos, ismert módon készítjük el. A találmány szerinti konjugátumok kellően oldódnak fiziológiailag elfogadható oldószerekben, például fiziológiás sóoldatban és más vizes oldatokban, melyek biztonságosan bevihetők parenterálisan a szervezetbe.
A parenterális bevitelre alkalmas termékek gyakran szilárd alakban, például fagyasztva, szárítva kerülnek forgalomba, és a beviendő készítményt közvetlenül a felhasználás előtt készítjük el. Ezek elkészítése jól ismert a gyógyszerkémikusok előtt, a keverék általában az izotóniát biztosító szervetlen sókat és a gyors beoldódást elősegítő diszpergálószereket, például laktózt tartalmaznak a hatóanyag mellett. A végső készítményt nagy tisztaságú vízben készítjük el ismert koncentrációban.
A konjugátumok és a fenti gyógyszerkészítmények gátolják a nemkívánatos sejtek szaporodását, kihasználva a konjugátum alkotórészeként szereplő vinka-hatóanyagok citotoxikus tulajdonságát. A konjugátumok alkalmazási tartományát a vinka-hatóanyag citotoxikus tulajdonsága határozza meg. A találmány az előzőekben már felsorolt néhány olyan nemkívánatos sejttípust, mely ellen a találmány szerinti konjugátumok előnyösen felhasználhatók, olyan antitestet alkalmazva, mely az illető sejtnek célsejtje. A találmány szerinti konjugátumok és készítményeik előnyösen alkalmazhatók ráksejtek szaporodásának gátlására. A konjugátum optimális dózisát és a bevitel módját a kezelőorvosnak kell megállapítania a beteg állapotának figyelembevételével. Szokásos természetesen a citotoxikus gyógyszereket osztott dózisban adagolni a kezelési sorozatok között több napos vagy több hetes szüneteket tartva. A találmány szerinti konjugátumok széles dózishatárokon belül hatásosak, a heti dózis általában 0,ΙΙΟ mg/kg, előnyösen 0,25-4 mg/kg.
Az elmondottak szemléltetésére az alábbiakban példákat adunk meg. A példák kizárólag szemléltető célzatúak, és a találmány oltalmi körét nem korlátozzák.
1. példa
4-Dezacetil-23-dezmetoxi-vinblasztin-3-benzilidén-karbox-hidrazid előállítása
1,3 g 4-dezacetil-23-dezmetoxi-vinblasztin-hidrazidot feloldunk 50 ml tetrahidrofuránban, és az oldathoz hozzáadunk 5 g vízmentes nátrium-szulfátot és 2 g 4karboxi-benzaldehidet. A reakciókeveréket szobahőmérsékleten, nitrogéngáz alatt keverjük két napon át, majd leszűrjük, és csökkentett nyomáson szárazra bepároljuk. A bepárlási maradékot 50 ml diklór-metánban oldjuk, és vízzel kétszer mossuk. A szerves fázist vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk, HPLC eljárással tisztítjuk szilikagéloszlopon, a lineáris grádiens-elúcióhoz 8 liter oldószerelegyet felhasználva, melynél a kezdeti összetétel: etil-acetát/metanol 95 : 5 és a befejező: etil-acetát/metanol 1 : 1. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, csökkentett nyomáson szárazra párolva 490 mg kívánt terméket nyerünk, amit tömegspektroszkópiával azonosítunk; a molekulasúly: 900.
2. példa
4-Dezacetil-23-dezmetoxi-vinblasztin-3-[4-(Nszukcinimid-oxi)-karbonil-benzilidén]-karbox-hidrazid előállítása
247 mg, az 1. példában leírtak szerint előállított köztitermékből, 63 mg N-hidroxi-szukcinimidbőI és 8 ml diklór-metánból álló reakciókeveréket 5 percen át keverünk, majd hozzáadunk 113 mg diciklohexil-karbodiimidet, és végül 52 mg p-toiuol-szulfonsavat. A reakciókeveréket összesen egy órán át keverjük, majd jeges fürdőben lehűtjük, készer 3 ml 0,05 M kálium-dihidrogén-foszfát pufferrel. pH = 7 extraháljuk. A szerves fázist vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk, szilikagélen kromatografáljuk, eluensként kloroform/metanol 95 : 5 elegyet használva. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, csökkentett nyomáson bepárolva 227 ing kívánt terméket kapunk.
HU 206 377 Β
3. példa
007B antitest konjugátuma 4-dezacetil-23-dezmetoxi-vinblasztin-3-(4-karbonil-benzilidén)-karboxhidraziddal
A 007B antitestet egy olyan hibridómával állítjuk elő, ami KS1/4 antitestet termelő hibridóma [Varki és munkatársai, Cancer Research 44,681—686 (1984)].
A 007B antitestet 0,34 M borátpufferben, pfl = 0,6 dializáljuk, az antitestoldat koncentrációja 10,3 mg/ml.
19,4 ml antitestoldathoz cseppenként hozzáadunk
1,6 ml dimetil-formamidban feloldott 13 mg, a 2. példa szerint előállított köztiterméket. A reakciókeveréket szobahőmérsékleten keverjük sötétben 2 órán át, majd centrifugáljuk. A felülúszót Sephadex G25 gyantán gélszűrjük (Pharmacia, Piscatoway. N. J.) eluensként fiziológiás sóoldatot használva, pH = 7,4. Az eluátumot 0,2 pm pórusú membránon szűrjük át, és ultraibolya-analízissel analizáljuk. 35 ml terméket tartalmazó oldatot kapunk, melyben a konjugátum-koncentráció 3,36 mg/ml és a konjugátum összetétele: 4,1 mól vinka-hatóanyag jutegy mól antitestre.
A konjugátumokat in vivő vizsgáljuk nőstény Charles River meztelen egérbe beültetett UCLA/P3 adeno-karcinómával szemben. Minden egérbe 107 UCLA/P3 tumorsejtet ültetünk be. A beültetést követő 2., 5. és 8. napon mindegyik állatba beinjektáljuk a konjugátum vagy a 2. példa szerint előállított köztitermék fiziológiás, puffereit sóoldatban készült oldatát. A kontroli-állatokba csak a sóoldatot injektáljuk. A konjugátum vagy a vinka-köztitermék (vinca-hidrazidra megadva) dózisait a táblázatban tüntetjük fel. A beültetéssel kiváltott daganat méretét a beültetést követő 14., 21. és 28. napon mérjük. Minden kezelési csoportban 5 egér van, kivéve a kontrollcsoportot, mert az 10 állatból áll. A táblázatban összefoglaljuk a 28. nap eredményeit.
I. táblázat
kezelés dózis, mg/kg százalékos gátlás
3. példa terméke 1,5 100
0,75 100
0,38 100
0,19 71
0,10 55
2. példa terméke 1,5 28
0,75 11
0,38 0
0,19 19
0,10 31
tóanyag-kapcsoló antitesthez viszonyított kiindulási anyaga eltérő.
Az antitest mindegyik esetben a 007B, melyet
12.3 mg/ml koncentrációban 0,8 ml borátpufferben, pH = 8,6 oldunk fel.
A 2. példában leírtak szerint előállított köztiterméket dimetil-formamidban oldjuk, 30 mg/ml koncentrációban. Mindegyik esetben a szerves oldószeres oldatot adjuk az antitest oldathoz, és a reakciókeveréket 2 órán át keverjük sötétben. A termék tisztítása a 3. példában leírtak szerint történik az alábbi eredményekkel:
A) ahol 0,65 mg vinka-kapcsoló köztiterméket alkalmazunk 0,02 ml oldatban, és további 0,045 ml dimetilformamidot adunk a reakciókeverékhez, 5,7 mg konjugátumot kapunk termékként 6,5 ml oldatban; a konjugátumban 1 mól antitestre 5,7 mól vinka-hatóanyag jut;
B) ahol 1,3 mg vinka-kapcsoló köztiterméket alkalmazunk 0,04 ml oldatban, és további 0,025 ml dimetilformamidot adunk a reakciókeverékhez, 5,4 ml oldatban 0,7 mg konjugátumot kapunk termékként, melyben 1 mól antitestre 7,2 mól vinka-hatóanyag jut;
C) ahol 1,95 mg köztiterméket alkalmazunk 0,065 ml oldatban, nem kapunk terméket.
Az A) eljárás szerint nyert terméket UCLA/P3 adeno-karcinóma szövettenyészettel szemben vizsgáljuk, a citotoxicitás meghatározására a 3H-leucin sejtekbe való beépülésének gátlását mérve. A konjugátum 50%-os gátlási koncentrációja (IC50): 0,08 pg/ml; az 1. példa szerint előállított köztitermék IC50-értéke: 0,07 pg/ml; a 4-dezacetil-23-dezmetoxi-vinblasztin-hidrazid IC5oértéke: 0,001 pg/ml.
5. példa
0,07B antitest konjugátuma 4-dezacetil-23-dezmetoxi-vinblasztin-3-(4-karbonil-benzilidén)-karboxhidraziddal
A konjugációt a 3. példában leírtak szerint hajtjuk végre, de lényegesen nagyobb mennyiségekből kiindulva. 40 ml antitestoldathoz, mely milliliterenként 10 mg 007B antitestet tartalmaz, hozzáadunk 63,8 mg, a 2. példában leírtak szerint előállított köztiterméket,
3.3 ml dimetil-formamidban oldva. 4,8 ml további dimetil-formamidot adunk a reakciókeverékhez, majd másfél órán át keverjük sötétben. A tisztítást a 3. példában leírtak szerint elvégezve, 278 mg konjugátumot kapunk 120 ml fiziológiás pufferolt sóoldatban. A konjugációs arány: 4,8. Az oldatot fiziológiás, pufferolt sóoldatban, pH = 7,4; vákuum-dialízissel betöményítjük 18 ml térfogatra, mely milliliterenként 7,2 mg konjugátumot tartalmaz, a konjugációs arány ez esetben:
4,4.
A konjugátumot in vivő vizsgáljuk: UCLA/P3 indukálta tumorral szemben nőstény meztelen egerekben, lényegében a 3. példában leírtak szerint. A hatóanyag bevitele a beültetést követő 15., 17., 20. és 23. napon történik; a tumor mérésére és a tömegének meghatározására Geran és munkatársai módszerét (Cancer Chemother. Reports, 3 : 1 (1972)] alkalmazzuk a 27., 34., 41. és a 48. napon.
4. példa
007B antitest konjugátuma 4-dezacetil-23-dezmetoxi-vinblasztin-3-(4-karbonil-benzilidén)-karboxhidraziddal
Három konjugációs reakciót hajtunk végre azonos körülmények között, azzal a különbséggel, hogy a haHU 206 377 Β
A konjugátum adagolásának kezdetekor, a 15. napon a daganat általágos súlya 1 g. A kezeletlen kontrollállatokban a daganat növekedése tovább folytatódott, a 48. napra 6 g átlagos súlyt elérve. 0,5, 1, illetve 2 mg/kg vinka-hatóanyagot konjugátumként bejuttatva, a tumor visszafejlődését figyelhettük meg. A 27. napon valamennyi kezelt csoportnál a tumor átlagos súlya 250 mg volt. A 48. napon az 1 mg/kg, illetve 2 mg/kg dózissal kezelt állatoknál a tumor súlya 200 mg vagy ennél kevesebb volt, a 0,5 mg/kg dózist kapott állatoknál a daganat súlya a kezdeti 1 g-ot érte el.
Egy következő kísérletben egy másik alkalommal előállított, azonos konjugátumot vittünk be az egerekbe, melyekbe UCLA/P3 tumorsejteket ültettünk. A kezelés a beültetést követő 16., 18., 22. és 25. napon történt. A tumor átlagos súlya 1300 mg volt. 0,35 mg/kg dózisnál (vinka-hidrazidra megadva) a tumomövekedés lelassult, de visszafejlődés nem történt meg. 0,5,1 és 2 mg/kg dózisoknál a tumor visszafejlődött olyannyira, hogy a 37. napon mindhárom esetben a daganat átlagos súlya csak 300 mg volt. 2 mg/kg dózis alkalmazásánál a daganat átlagos súlyát ezen a szinten lehetett tartani 51 napon át, míg a 0,5 és 1 mg/kg dózist kapott állatoknál az átlagsúly az 51. napon 700 mg volt,
6. példa
L4KS antitest konjugátuma 4-dezacetil-23-dezmetoxí-vinblasztin-3-(4-karboníl-benzilidén)-karboxhidraziddal
A Starling és munkatársa [J. Cell. Biochem. Supp., 11Β, 1982 (1987)] által leírt L4KS antitest 0,34 M borátpufferben készült oldatát, pH = 8,6 dializáljuk,
11,3 mg/ml koncentrációjú oldatot kapva. 10 mg antitestet tartalmazó oldathoz 0,072 ml dimetil-formamidban hozzáadunk 0,78 mg, a 2. példában leírtak szerint előállított köztiterméket. A reakciókeveréket szobahőmérsékleten és sötétben keverjük 2 órán át, majd centrifugáljuk. A felülúszót Biogel PG (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA 94 804 USA) oszlopon kromatografáljuk, eluensként fiziológiás, pufferolt sóoldatot használva. A tennéket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, csökkentett nyomáson bepároljuk, a terméket ultraibolya-analízissel analizáljuk, a 279 és a 293 nm-nél mért elnyelés alapján megállapítva, hogy az 1,5 ml oldatban 8,7 mg konjugátumot kapunk, melyben a konjugációs arány: 3,2. A konjugátum citotoxicitását UCLA/P3 szövettenyészettel szemben állapítjuk meg. Az IC50-érték: 0,024 pg/ml; összehasonlításként a 4-dezacetil-23-dezmetoxi-vinbIasztin-hidrazid IC50-értéke: 0,001 pg/ml.
7. példa
14.95.55 antitest konjugátuma 4-dezacetil-23-dezmetoxi-vinblasztin-3-(4-karbonil-benzilidén)-karbox-hidraziddal
A Corvalan és munkatársai [Protides of Bioi. Fluids,
31, 921-24 (1984)] által leírt 14.95.55 antitestet borátpufferben pH = 8,6 dializálva, 1 ml oldatot nyerünk, mely 8,32 mg antitestet tartalmaz. Az oldathoz hozzá8 adunk 0,08 ml dimetil-formamidban 0,66 mg, a 2. példában leírtak szerint előállított köztilemiéket. A reakciókeveréket szobahőmérsékleten, sötétben keverjük 45 percen keresztül, majd a reakciókeveréket a 3. példában leírtak szerint tisztítjuk 3,0 mg konjugátumot nyerve 3,7 ml fiziológiás, pufferolt sóoldatban; a konjugációs arány: 4,8.
A konjugátum kötődési kapacitását radioimmunvizsgálattal állapítottuk meg, összehasonlítást téve nem konjugált antitesttel. A konjugátum és a szabad antitest titrációs görbéje lényegében hasonló, jelezve, hogy a konjugáció következtében az antitest kötődési képessége lényegében változatlan marad.
8. példa
B72.3 antitest konjugátuma 4-dezacetil-23-dezmetoxi-vinblasztin-3-(4-karbonil-benzilidén)-karboxhidraziddal
A Colcher és munkatársai által leírt [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 199-203 (1981)] B72.3 antitest beszerezhető a National Cancer Institute-tól. Az antitestet pH = 8,6-os borátpufferben dializálva, 10 mg/ml koncentrációjú oldatot készítünk. 5 mg antitestet használunk mindegyik konjugátum elkészítéséhez. Minden esetben a 2. példában leírtak szerint előállított vinka köztianyagot alkalmazzuk 30 mg/ml koncentrációjú oldat alakjában. A reakciót szobahőmérsékleten, sötétben hajtjuk végre 2 óra alatt, és a termék tisztítását a 3. példában leírtak szerint végezzük.
A) 0,32 mg vinka-linker köztiterméket használunk 0,01 ml térfogatú oldatban, további 0,02 ml dimetilformamidot adva a reakciókeverékhez. 2 ml oldatban 2,8 mg konjugátumhoz jutunk; a konjugációs arány: 3,0.
B) 0,02 ml oldatban 0,65 mg köztitermékből indulunk ki, további 0,01 ml dimetil-formamidot adva a reakciókeverékhez. 2 ml oldatban 1,2 mg konjugátumot kapunk termékként; a konjugációs arány: 4,9.
C) 0,03 ml oldatban 0,97 mg köztiterméket használunk fel. 2,7 ml oldatban 0,5 mg konjugátumot nyerünk; a konjugációs arány: 6,6.
A C) eljárás termékét LS174T adenokarcinóma-sejtekkel szemben vizsgáljuk. A konjugátum citotoxicitásának IC50-értéke: 0,047 pg/ml; a 4-dezacetil-23-dezmetoxi-vinblasztin-hidrazid és az 1. példa szerint előállított köztitennék IC50-értéke egyaránt 0,0001 Rg/ml.
9. példa
KS 1/4 S2 antitest konjugátuma 4-dezacetil-23-dezmetoxi-vinblasztin-3-(4-karbonil-benzilidén)-karbox-hidraziddal
Egy adag KS 1/4 S2 antitest, ami a Varki és munkatársai, [Cancer Research 44, 681-86 (1984)] által leírt KS 1/4 antitest antigénkötő része, feloldunk 0,34 M borátpufferben pH = 4, 18 mg/ml koncentrációban. Három konjugációt végzünk, mindegyikhez 0,56 ml antitestoldatot használunk fel. Mindegyik esetben a 2. példa szerint előállított köztiterméket használjuk konjugálásra 43,5 mg/ml vinka-hatóanyagot tartalmazó dimetil-formamidos oldat alakjában. A reakciót másfél
HU 206 377 Β órán át végezzük szobahőmérsékleten és sötétben. A reakció végeztével a terméket a 3. példában leírtak szerint tisztítjuk.
A) 0,015 ml vinka-oldatot alkalmazunk, és további 0,03 ml dimetil-formamidot adunk a reakciókeverékhez. 4,8 ml fiziológiás, pufferolt sóoldatban 8,2 mg terméket kapunk; a konjugációs arány: 2,1.
B) 0,03 ml vinka-oldatot alkalmazunk, és további 0,015 ml dimetil-formamidot adunk a reakciókeverékhez. 5,2 ml oldatban 7,8 mg konjugátumot kapunk; a konjugációs arány: 3,6.
C) 0,045 ml vinka-oldatot alkalmazunk, és 5,4 ml oldatban 7,6 mg konjugátumot nyerünk; a konjugációs arány: 5,4.
A konjugátumok kötődési képességét radioimmunvizsgálattal meghatározva, az a szabad antitesthez képest az (Aj terméknél 54%-osnak, a (B) terméknél 48%-osnak, a (C) terméknél 37%-osnak adódott.
10. példa
L/1C2 antitest előállítása
A lefagyasztott L/1C2 hibridóma HB9682 szám alatt az American Type Culture Collectiontól szerezhető be. A cső tartalmát 37 °C hőmérsékletű vízfürdőben olvasztjuk fel, miközben a csövet forgatjuk. A sejtszuszpenziót 1: 2 arányban kiegyensúlyozott sóoldattal [balanced salt solution; Grand Island Biological Company (GIBCO), 3175 Staley Road, Grand Island, New York 14 072] hígítjuk fel, a sejtek alá kriogén közeget rétegzünk, és ezen keresztül fugáljuk a sejteket. Az üledékről leszívjuk a felülúszót, a sejteket T150 szövetkultúra-edényben 5% szén-dioxidot tartalmazó légtérben 37 °C hőmérsékleten szuszpendáljuk 10% borjúembrió-szérummal, 2 mH L-glutaminnal (GIBCO), 50pg/ml gentamicin-szulfáttal (GIBCO) kiegészített szövettenyészet közegben (Ventrex HL-1, Ventrex Laboratories, Portland, ME, USA).
A csaknem egybefolyó tenyészetről a felülúszót összegyűjtjük, a még benne lévő sejteket centrifugálással eltávolítjuk. A sejtmentes felülúszóból Protein A Sepharose oszlopon (Pharmacia, Uppsala, Sweden) megtisztítjuk az antitestet, Az antitest hozzákötődik az oszlophoz, a szövetfürdőt 0,01 M nátrium-foszfáttal, pH = 8, mossuk ki. Az oszlopról az antitestet ezt követően 0,1 M nátrium-foszfát pufferrel pH = 3,5 eluáljuk. A leoldott antitest oldatát azonnal semlegesítjük 1M Trizma pufferrel pH - 7,4 értéken (Sigma, St. Louis, MO, USA) dializáljuk, és vákuum-dializátorban (Bio-Molecular Dynamics, Beaverton, OR, USA), mely 0,01 M nátrium-foszfát puffért pH = 7,4 és 0,15 M nátrium-kloridot tartalmaz, betöményítjük. Az antitest-oldatot 0,2 pm pórusú membránon átszűrve sterilizáljuk, és 4 °C hőmérsékleten tároljuk a felhasználásig.
11. példa
L/1C2 antitest konjugátuma 4-dezacetil-23-dezmetoxi-vinblasztin-3-(4-karbonil-benzilidén)-karboxhidraziddal
0,56 ml 0,34 M borátpufferes oldatban, pH = 8, mg L/1C2 antitestet mérünk egy kémcsőbe, és 0,045 ml dimetil-formamidban hozzáadunk 0,65 mg, a
2. példában leírtak szerint elkészített köztiterméket.
A reakciókeveréket szobahőmérsékleten keverjük
1,5 órán át, majd centrifugáljuk. A felülúszót Sephadex G25 oszlopon kromatografáljuk, elüensként fiziológiás, pufferolt sóoldatot használva. Az ultraibolya-analízis szerint az 5,4 ml oldatban 1,3 mg konjugátumot kapunk, a konjugációs mólarány: 6,2.
A terméket T222 sejtekkel szemben vizsgáljuk szövettenyészetben. 0,032 mg/ml koncentrációnál 40%os, 0,32 mg/ml koncentrációnál 70%-os sejtszaporodás-gátlást okoz. Összehasonlításként a 4-dezacetil-23-dezmetoxi-vinblasztin-hidrazid gátlóhatása 0,01 mcg/ml koncentrációnál 45%-os, 0,1 mcg/ml koncentrációnál 82%-os.
12. példa
A 3-(4-formil-fenil-karbonil-amino)-propionsav-Nszukcinimido-észtemek előállításához 100 ml dioxánban 5-10 percig keverünk 3 g 4-karboxi-benzaldehidet és 2,3 g N-hidroxi-szukcinimidet, majd hozzáadunk
4,1 g diciklohexil-karbodiimidet. A reakciókeveréket szobahőmérsékleten keverjük egy órán át, majd leszűrjük. A szűrletet csökkentett nyomáson bepárolva, 9,4 g fehér, szilárd anyaghoz jutunk, amit 25 ml forró izopropanolban átkristályosítunk. A köztiterméket propanolban eldörzsölve megkapunk 2,1 g 4-karboxi-benzaldehid-N-szukcinimido-észtert.
g fenti N-szukcinimido-észtert hozzáadunk 3,6 g β-alanin 40 ml 1 n nátrium-hidroxid-oldat és 100 ml víz elegyében készült oldatához. A reakciókeveréket
1,5 órán át keverjük, miközben a kémhatását pH - 8 feletti értéken tartjuk. A keveréket leszűrjük, és a szűrlet kémhatását 2 n sósavval pH - 1,9 értékre állítjuk be. Háromszor 50 ml etil-acetáttal extrahálunk, az extraktumokat egyesítjük, sóoldattal mossuk. A szerves fázist vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk, csökkentett nyomáson bepároljuk, 4,6 g 3-(4-formíl-fenil-karbonil-amino)-propionsavat nyerve fehér, szilárd anyag alakjában.
Egy kis edénybe bemérünk 100 mg fenti köztiterméket, 103 mg diciklohexil-karbodiimidet, 57,5 g N-hidroxi-szukcinimidet és 10 ml dioxánt, a reakciókeveréket nitrogéngáz alatt keverjük szobahőmérsékleten. A reakció elóremenetelét vékonyréteg-kromatográfiával követjük nyomon, és 75 mg további cidiklohexil-karbodiimidet és 45 mg további N-hidroxi-szukcinimidet adunk a reakciókeverékhez. 4 óra elteltével a keveréket megszűrjük, a szűrletet csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. Kb. 200 mg szennyezett terméket kapunk, amit 30 g szilikagélen kromatografálunk, elüensként 5% izopropanolt tartalmazó diklór-metánt használva. A tennéket tartalmazó frakciókat egyesítjük, bepárolva 81 mg kívánt köztitennéket nyerünk valamennyire szennyezett alakban.
13. példa
Az L/1C2 antitest F(ab')? fragmensét úgy állítjuk elő, hogy 2.4 ml, milliliterenként 12,6 mg pepszint
HU 206 377 Β tartalmazó oldatot hozzáadunk 270 ml fiziológiás, pufferolt sóoldatban oldott 1.5 g L/1C2 antitesthez. A reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten tartjuk 2 óra és 20 percen át, majd trietanol-amin hozzáadásával leállítjuk a reakciót. A terméket Fást Flow Sepharose (Pharmacia) oszlopon kromatografáljuk, eluensként 0,15 M nátrium-acetát oldatot használva. Az F(ab’)2-t tartalmazó frakciókat egyesítjük, és dialízissel betöményítjük 100 ml oldatban 992 mg L/1C2 F(ab’)2 fragmenst kapva.
14. példa
Az L/1C2 F(ab’)2 fragmens 3-(4-formil-fenil-karbonil-amino)-propionil származékának előállítása A 13. példában leírtak szerint előállított L/1C2
F(ab’)2 fragmenst 0,34 M borátpufferben, pH = 8,6 dializáljuk, 23 mg F(ab’)2 fragmenst kapva 3,8 ml oldatban. Ehhez hozzáadjuk 0,44 mg 3-(4-formil-fenilkarbonil-amino)-propionsav-N-szukcinimido-észter 102 pl aceto-nitrilben készült oldatát. A reakciókeveréket egy órán át keverjük szobahőmérsékleten, majd az oldatot 11 g Sephadex G25 gyantából készült oszlopon kromatografáljuk, 0,1 M nátrium-acetát oldattal pH =
5,6 eluálva. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, 19 mg antitestfragmens-származékot kapva 9,6 ml oldatban; a konjugációs mólarány: 2,8.
15. példa
L/1C2 (Fab’)2 fragmens konjugátuma 4-dezacetil23-dezmetoxi-vinblasztin-3-[4-(3-amino-propionil3-karbonil)-benzilidén]-karbox-hidraziddal mg, a 14. példában leírtak szerint előállított köztiterméket hozzáadunk 6,9 mg szilárd 4-dezacetil-23dezmetoxi-vinblasztin-hidrazidhoz. A kémhatást híg sósavval pH - 5,6 értékre állítjuk be, és a reakciókeveréket szobahőmérsékleten 21 órán át kevertetjük. A keveréket centrifugáljuk, és a felülúszót 11 g-os Sephadex G25 oszlopon kromatografáljuk fiziológiás, pufferolt sóoldattal eluálva. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, szűrjük. A 4,8 ml oldatot ultraibolya-fényelnyeléssel analizáljuk, a 280 és 325 nm-en mért elnyelés alapján az oldat 3,5 mg konjugátumot tartalmaz; a konjugációs mólarány: 3,5 mól vinka-hatóanyag antitestfragmens mólonként.
A konjugátum T222 sejtekkel szembeni citoxicitását az előzőekben ismertetett módon határozzuk meg. 0,1 pl/ml vinka-hidrazidra vonatkoztatott koncentrációnál nem volt hatása, 1 pg/ml koncentrációnál a növekedésgátlás 85%-os.
16. példa
A 14.95.55 antitest 3-(4-formil-fenil-karbonil-amino)-propionil-származékának előállítása
0,34 M borátpufferben pH = 8,6 dializálva a
15.95.55 antitestoldat koncentrációja 11,6 mg/ml. 3,9 ml-t ebből az oldatból - mely 45,2 mg antitestet tartalmaz - egy 10 ml-es edénybe mérünk, és 0,57 mg, a 12. példában leírtak szerint előállított köztiterméket adunk hozzá 132 pl aceto-nitrilben oldva. A réakciókeveréket egy órán át kevertetjük szobahőmérsékleten.
majd 10 g-os Sephadex G25 oszlopon kromatografáljuk, 0,1 M nátrium-acetát pH = 5,6 oldattal eluálva. A terméket tartalmazó frakciókat leszűrjük, UV elnyelés alapján, 258 és 280 nm-en mérve analizáljuk. 40 mg származékot kapunk 2,6 mg/ml koncentrációjú oldatban. A konjugációs arány: 4,1 mól kapcsoló antitest mólonként.
/ 7. példa
14.95.55 antitest konjugátuma 4-dezacetil-23-dezmetoxi-vinbIasztin-3-[4-3-amino-propíoniI-3-karbonil)-4-benzilidén]-karbox-hidraziddal
14,75 ml, a 16. példában leírtak szerint előállított köztitermék oldatot, mely 38,3 mg módosított antitestet tartalmaz, bemérünk egy edénybe, és 2,6 ml 1 M foszfátpuffert, majd 22,2 mg 4-dezacetil-23-dezmetoxi-vinblasztin-liidrazid-szulfátot adunk hozzá. A reakciókeveréket egy éjszakán át kevertetjük szobahőmérsékleten, majd 15 percen át centrifugáljuk, és 45 g Sephadex G25-ön kromatografáljuk fiziológiás, pufferolt sóoldattal eluálva. UV spektrum alapján analizálva, a 280 és 325 nm-en mért elnyelés szerint a terméket tartalmazó frakciókban 21,8 mg konjugátum van, a hatóanyag antitesthez viszonyított mólaránya 3,8.
A konjugátumot szövetkultúrában UCLA/P3 sejtekkel szemben vizsgáljuk. 0,035 pg/ml vinka-hidrazidra megadott koncentrációnál a gátlás 50%-os.
Egy másik alkalommal előállított, de azonos konjugátumot LS174T karcinómasejtekkel Charles River meztelen egerekben indukált daganattal szemben vizsgáltunk. A konjugátumot intravénásán visszük be a beültetést követő 9., 11., 14. és 17. napon. A kezelés kezdetekor a tumor átlagos tömege 1000 mg. A 0,25 mg/kg dózis (vinka-hidrazidra megadva) a nagyon gyors növekedésű tumor fejlődését csak kis mértékben lassítja. A kontrollállatokban a tumor súlya 2, 28. napon 10 g. A 0,5 mg/kg dózissal kezelt állatokban a tumor átlagos súlya 4,5 g, az 1 mg/kg dózist kapott állatoknál lényegében a kezdeti állapothoz képest változatlan, azaz a daganat átlagos súlya 1 g.
18. példa
A 4-dezacetil-23-dezmetoxi-vinblasztin-3-[4-(karbonil-metoxi)-ct-metil-benzilidén]-karbox-hidrazid előállítása g 4-dezacctil-23-dezmetoxi-vinblasztin-hidrazidot feloldunk 75 ml tetrahidrofuránban, és hozzáadunk 1.52 g 4-acetil-fenoxi-ecetsavat. 10 ml dimetil-fonnamidot és 5 g nátrium-szulfátot adunk a reakciókeverékhez, és vízmentes körülmények között keverjük szobahőmérsékleten egy éjszakán át. A reakciőkeveréket leszűrjük, a szőrieteket csökkentett nyomáson bepárolva szilárd maradékot kapunk, amit szilikagélen HPLC el járással tisztítunk. Az eluáláshoz lineáris grádienseiúciót alkalmazva, etil-acetátban a kezdeti. 5% metanoltartalmat 50%-ig emelve. .
A. terméket tartalmazó frakciókat betöményítye 490 mg kívánt köztitermékhez jutunk, amit tömeg10
HU 206 377 Β spektroszkópiával azonosítunk, ami 900, 944, 957 és 973 tömegű molekulaionokról tanúskodik.
19. példa
A 4-dezacetil-23-dezmetoxi-vinblasztin-3-[4-(szukcinimid-oxi-karbonil-metoxi)-a-metil-benzilidén]karbox-hidrazid előállítása
300 mg, a 18. példában leírtak szerint előállított köztiterméket feloldunk 25 ml dimetil-formamidban, és az oldatot jeges fürdőben, nitrogéngáz alatt lehűtjük. 86 μΐ N-metil-morfolint adunk hozzá, és a reakciókeveréket 20 percen át keverjük, majd 81 μΐ izobutilklór-formiátot adunk hozzá, és további 20 percen át keverjük. 108 mg N-hidroxi-szukcinimidet adunk a reakciókeverékhez, egy éjszakán át keverjük a hőmérsékleten fokozatosan szobahőmérsékletre emelve. Az illékony komponenseket csökkentett nyomáson eltávolítjuk, a maradékot diklór-metánban vesszük fel, és sóoldattal szárítjuk. A szerves fázist nátrium-szulfát felett szárítjuk, csökkentett nyomáson bepárolva 110 mg kívánt aktív észtert nyerünk,
20. példa
007B antitest konjugátuma 4-dezacetil-23-dezmetoxi-vinblasztin-3-[4-(karbonil-metoxi)-a-metil-benzilidénj-karbox-hidraziddal
007B antitestet 0,34 M borátpufferben, pH = 8,6 dializálva 4,05 mg/ml antitest-koncentrációjú oldatot készítünk. Két konjugátumot állítunk elő a 19. példában leírtak szerint előállított köztitermékből, különböző mennyiségeket felhasználva. Mindegyik esetben 12, 15 mg antitestből indulunk ki, ami 3 ml oldatban van. A reakciót szobahőmérsékleten, egy óra alatt hajtjuk végre, ami után a reakciókeveréket centrifugáljuk, és a felülúszót Sephadex G25 oszlopon tisztítjuk, eluensként fiziológiás, pufferolt sóoldatot tartalmazva. A terméket tartalmazó frakciókat UV analízissel minősítjük 279 és 285 nm-nél.
A) 4,2 mg a 19. példában leírtak szerint előállított köztiterméket 240 μΐ dimetil-formamidban oldunk.
7,5 ml oldatban 6 mg konjugátumot nyerünk, a konjugációs mólarány: 5,2.
B) 6,3 mg köztiterméket 240 μΐ dimetil-formamidban oldva használunk fel. 6 ml oldatban 1,56 mg konjugátumot kapunk, melynek a konjugációs aránya:
11,4.
Az Aj konjugátumot UCLA/P3 adenokarcinóma-sejtekkel szemben vizsgáljuk szövettenyészetben az előzőekben már ismertetett módon. A konjugátum 50 ng/ml koncentrációnál 29%-ban, 100 ng/ml koncentrációnál 93%-ban gátolta a sejtek növekedését. A 18. példa szerinti nem konjugált köztitermék aktivitása a citotoxikus vizsgálatok szerint lényegében ezzel azonos.
27. példa
A 4-dezacetil-23-dezmetoxi-vinblasztin-3-[4-(karbonil-metoxi)-benzilidén]-karbox-hidrazid előállítása
Lényegében a 18. példában leírtak szerint történik,
940 mg 4-fonnil-fenoxi-ecetsavat felhasználva. 170 mg kívánt köztitennéket nyerünk termékként, mely tömegspektrumát 886, 944 és 958 tömegű molekuláris ionok jellemzik.
22. példa
007B antitest konjugátuma 4-dezacetil-23-dezmetoxi-vinblasztin-3-[4-karbúnil-metoxi)-benzilidén]karbox-hidraziddal
A raekciót a 15. példában leírtak szerint hajtjuk végre 500 mg, a 21. példa szerint előállított köztitermékből, 145 μΐ N-metil-morfolinból, 137 μΐ izobutilklór-formiátból és 182 mg N-hidroxi-szukcinimidből kiindulva. 160 g kívánt konjugátumot kapunk.
23. példa
007B antitest konjugátuma 4-dezacetiI-23-dezmetoxi-vinblasztin-3-[4-(karbonil-metoxi)-benzilidén]karbox-hidraziddal
Két konjugátumot állítunk elő lényegében a 20. példában leírtak alapján a 22. példában leírtak szerint előállított köztitermékből. Az A) konjugáció eredményeként 5,8 ml oldatban 6,6 mg konjugátumot kapunk, amelynek konjugációs mólaránya: 3,5. A B) eljárással 6,0 mg konjugátumhoz jutunk 7,2 ml oldatban, a konjugációs arány: 4,8.
Az A) konjugátumot UCLA/P3 sejtekkel szemben vizsgáljuk szövettenyészetben. A növekedésgátlás 100 ng/ml koncentrációnál 33%-os, 250 ng/ml koncentrációnál 100%-os. A 21. példa szerint előállított köztitermék citotoxikus aktivitása lényegében azonos.
24. példa
3-(5-formil-pirrol-2-il-karbonil-amino)-propionsavN-szukcinimido-észter előállítása
139 ng 5-fomnil-pirrol-2-il-karbonsavból, 247 mg diciklohexil-karbodiimidből, 138 mg N-hidroxi-szukcinimidből és 10 ml dimetil-formamidból álló reakciókeveréket 2 órán át keverjük szobahőmérsékleten, nitrogéngáz alatt. Az oldószert elpárolva 394 mg nyers aktív észtert kapunk.
A bepárlási maradékot 1 ml aceto-nitrilben felvesszük. Nem oldódik fel a teljes maradék. Ezt a keveréket lassan hozzáadjuk 89 mg β-alanin 2 ml 0,5 n nátrium-hidroxid oldatban. Egyidejűleg 1 n nátrium-hidroxi-oldattal a kémhatást pH = 7,5-8,0 értéken tartjuk. A reakciókeveréket egy órán át kevertetjük szobahőmérsékleten, majd leszűrjük. A szűrletet híg sósavval megsavanyítjuk, nátrium-kloriddal telítjük, és etil-acetáttal extraháljuk. A megszárított extraktumot bepárolva narancssárga olajat kapunk, amit szilikagéloszlopon kromatografálunk, eluensként 10% metanolt tartalmazó diklór-metánt használva. A terméket tartalmazó frakciókat csökkentett nyomáson bepárolva, 49 mg 3-(5-formil-pirrol-2-il-karboniIamino)-propionsavat kapunk. 31 mg fenti köztiterméket 3 inl dioxánban veszünk fel, és hozzáadunk 35 mg diciklohexil-karbodiimidet és 19 mg N-hidroxi-szukcinimidet. A reakciókeveréket nitrogéngáz alatt, szobahőmérsékleten keverjük 2 órán át, majd
HU 206 377 Β szűrjük, és csökkentett nyomáson bepároljuk. A maradékot szilikagélen kromatografáljuk, 5% metanolt tartalmazó diklór-metánnal eluálva. 6 mg kívánt aktív észtert kapunk.
25. példa
A 007B antitest 3-(5-formil-pirrol-2-il-karbonilaminoj-propionil-származékának előállítása 105 mg 007B antitest 0,34 M borátpufferes oldatát, melynek koncentrációja 15 mg/ml, egyesítjük 1,29 mg, a 24. példa szerint előállított köztitermék 300 pl acetonitriles oldatával. A reakciókeveréket egy órán át keverjük szobahőmérsékleten, majd 10 g Sephadex G25 gyantán kromatografáljuk, eluensként 0,1 M nátriumacetát oldatot, pH = 5,6 használva. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, UV spektroszkópiával analizáljuk, 280 és 300 nm-en mérve a fényelnyelést.
14,6 ml, 5,7 mg/ml koncentrációjú oldatot, azaz 83,2 mg kívánt köztiterméket kapunk, a konjugációs arány: 3,6.
26. példa
A 007B antitest konjugátuma 4-dezacetil-23-dezmetoxi-vinblasztin-3-[2-(3-amino-propionil-3-karbonil)-pirrol]-5-metilidén-karbox-hidraziddal 60 mg, a 25. példa szerint előállított köztitermék
12,4 ml pH - 5,6 kémhatású pufferben készült oldatához - mely puffer 0,1 M nátrium-acetátból és 0,15 M foszfáíionból áll - hozzáadunk 36 mg 4-dezacetil-23dezmetoxi-vinblasztin-hidrazid-szulfátot. A reakciókeveréket sötétben keverjük 24 órán át, majd centrifugáljuk. A felülúszót 17 g Sephadex G25 gyantán kromatografáljuk, a terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, a fényelnyelést 340 és 280 nm-en mérve UV spektroszkópiával analizáljuk. 15,8 ml oldatban
43,8 mg konjugátumot kapunk, melyben a vinka-hatóanyag antitesthez viszonyított mólaránya: 5,4.
Radioimmunvizsgálattal összehasonlítjuk a konjugátum és a szabad antitest antigénhez való kötődési képességét. A konjugátumban az antitest kötődési képessége csökken. A konjugátumot in vitro UCLA/P3 sejtekkel szemben vizsgáljuk; 0,0001 μΐ/ml koncentrációban (a vinka-hidrazidra megadva) a gátlás 50%-os.
27. példa
A007B antitest 3-(4-formil-fenil-karboníl-amino)propionil-származékának előállítása A 007B antitest 15 mg/ml koncentrációjú 0,34 M borátpufferes oldatából pH = 8,6, 7,0 ml-t egyesítünk 1,33 mg, a 12. példában leírtak szerint előállított köztitennék 0,31 ml aceto-nitrilben készített oldatával. A reakciókeveréket egy órán át keverjük szobahőmérsékleten, majd 10 g Sephadex G25 gyantán kromatografáljuk, 0,1 M nátrium-acetát pufferrel, pH = 5,6 eluálva. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, és 258 és 280 nm-en UV spektroszkópiával analizáljuk. Az oldat koncentrációja
5,1 mg/ml, a konjugációs arány: 4.3. A nyert össztermék: 91 mg.
28. példa
A 0073 antitest konjugátuma 4-dezacetil-23-dezmetoxi-vinblasztin-3-[4-(3-amino-propionil-3-karbonil)-benzilidén]-karbox-hidraziddal mg 4-dezacetil-23-dezmetoxi-vinblasztin-hidrazid-szulfátot hozzáadunk 60 mg, a 27. példa szerint előállított köztitermék 0,1 M nátrium-acetát pufferben készült oldatához. A reakciókeveréket szobahőmérsékleten keverjük 24 órán át, majd centrifugáljuk, és 17 g Sephadex G25 gyantán kromatografáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, 0,22 pm pórusú membránon átszűrjük, 21,9 ml terméket kapunk, ami az UV spektroszkópiai adatok - 280 és 293 nm-en mérve - szerint 2,0 ing konjugátumot tartalmaz milliliterenként. A vinka-hatóanyag antitesthez viszonyított konjugációs mólaránya: 4,1.
A konjugátumot nude meztelen egérben UCLA/P3 adenokarcinóma-sejtekkel kiváltott daganattal szemben vizsgáltuk. A beültetést követő 16., 19., 22. és 25. napon 0,5 mg/kg konjugátumot (vinka-hatóanyagra megadva) injektáltuk az állatokba. A 16. napon a kezelt állatoknál a tumor átlagos tömege 500 mg. A kezelés hatására a tumor visszafejlődött, és az 51. napon az átlagos tömege csak 50 mg. A nem kezelt állatoknál a tumor folyamatosan növekedett nagyon nagy méretre, ami eme a daganatra jellemző.
Az alábbi példákban parenterálisan bevihető készítményeket ismertetünk.
29. példa
3. példa szerinti konjugátum 100 mg fiziológiás sóoldat 10 ml
Alacsony hőmérsékleten tároljuk, és intravénásán juttatjuk a szervezetbe.
30. példa
3. példa szerinti konjugátum 100 mg diszpergálószer 5 mg fiziológiás sóoldat 10 ml
Fagyasztva szárítjuk, a száraz terméket szobahőmérsékleten vagy az alatt tároljuk. Bevitelkor tisztított vízben oldjuk, és intravénásán adagoljuk.
31. példa
6. példa szerinti konjugátum 1 g laktóz 10 mg fiziológiás sóoldat 100 ml
Fagyasztva szárítjuk, a száraz terméket szobahőmérsékleten vagy az alatt tartjuk. Bevitelkor tisztított vízben oldjuk, és intravénásán adagoljuk.
32. példa
15. példa szerinti konjugátum 100 mg fiziológiás sóoldat 20 ml
Alacsony hőmérsékleten tároljuk, intravénásán juttatjuk a szervezetbe.
33. példa
26. példa szerinti konjugátum lg
HU 206 377 Β diszpergálószer 12,5 mg fiziológiás sóoldat 100 ml
Fagyasztva szárítjuk, és a száraz terméket szobahőmérsékleten vagy az alatt tároljuk. Bevitelkor tisztított vízben oldjuk, és intravénásán juttatjuk a szervezetbe.

Claims (6)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás az (I) általános képletű - ahol
    Ab jelentése egy fiziológiai szempontból alkalmazható antitest vagy annak az antigént felismerő része, m jelentése 1-10;
    Z jelentése hidrogénatom vagy 1-3 szénatomos, nem elágazó alkil-csoport;
    X jelentése vegyértékkötés, 1-4 szénatomos alkiléncsoport vagy amino-csoporttal szubsztituált 1-4 szénatomos alkilén-csoport;
    Y jelentése vegyértékkötés, karbonil-csoport vagy oxigénatom, feltéve, hogy Y jelentése karbonil-csoport, ha X jelentése amino-alkilén-csoport és Y jelentése vegyértékkötés vagy karbonil-csoport, ha X jelentése vegyértékkötés;
    Ar jelentése pirrolil-csoport vagy p-fenil-csoport,
    V jelentése (II) általános képletű vinka-dimer, melyen belül
    R jelentése metil-csoport vagy formil-csoport;
    R3 jelentése hidrogénatom;
    R1 és R2 egyikének jelentése etil-csoport, a másik jelentése hidrogénatom vagy hidroxil-csoport;
    R4 jelentése acetil-csoportkonjugátum előállítására, azzal jellemezve, hogy a) az Ab általános képletű, fentiekben meghatározott antitestet vagy fragmensét Rs-CO-X-Y-Ar-C(Z) ~ N-HN-V általános képletű - ahol R5 jelentése hidroxil-csoport, savaktiváló csoport, sóképző csoport, vagy a savas csoportot védő csoport; X, Y, Ar, Z és V jelentése azonos a fentebb tett meghatározásokkal köztitermékkel reagáltatjuk; vagy
    b) az Ab[CO-X-Y-Ar-C(Z) = O]m általános képletű konjugátumot ekvivalens mennyiségű H2N-NH-V általános képletű hidraziddal reagáltatjuk, ahol Ab, X, Y, Ar, Z, V és m jelentése azonos a fentebb tett meghatározásokkal.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakciót pH = 7-9 kémhatású vizes pufferban hajtjuk végre.
  3. 3. Az 1, vagy 2, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antitestként egy monoklonális antitestet vagy ezek antigént felismerő fragmenség alkalmazunk.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű konjugátum előállítására, ahol X jelentése vegyértékkötés vagy 1-3 szénatomos amino-alkilén-csoport és Ab a 3., Y, Ar, Z, V és m az 1. igénypontban megadott, azzal jellemezve, hogy a megfelelően szubsztituált kiindulási vegyületeket és konjugátumokat alkalmazzuk.
  5. 5. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás L/1C2 antitest és 4-dezacetil-23-dezmetoxi-vinblasztin-karbonil-4-benzilidén-hidrazid konjugátumának előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelően szubsztituált kiindulási vegyületeket vagy konjugátumokat alkalmazzuk.
  6. 6. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. vagy 3-5. igénypontok bármelyike szerint előállított (I) általános képletű konjugátumot - ahol Ab, X, Y, Ar, Z, V és m az 1. igénypontban megadott - egy vagy több, gyógyászati szempontból alkalmazható vivőanyaggal vagy hígítóközeggel összekeverve szokásos dózisformává alakítunk.
HU893992A 1988-08-08 1989-08-07 Process for producing cytotoxic vinc-dimer conjugates and pharmaceutical compositions comprising same HU206377B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/230,084 US5006652A (en) 1988-08-08 1988-08-08 Intermediates for antibody-vinca drug conjugates

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT50488A HUT50488A (en) 1990-02-28
HU206377B true HU206377B (en) 1992-10-28

Family

ID=22863896

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU893992A HU206377B (en) 1988-08-08 1989-08-07 Process for producing cytotoxic vinc-dimer conjugates and pharmaceutical compositions comprising same

Country Status (15)

Country Link
US (1) US5006652A (hu)
EP (1) EP0354728A3 (hu)
JP (1) JPH02131499A (hu)
KR (1) KR900002804A (hu)
CN (1) CN1040205A (hu)
AR (1) AR245368A1 (hu)
AU (1) AU619329B2 (hu)
DK (1) DK382989A (hu)
HU (1) HU206377B (hu)
IL (1) IL91182A0 (hu)
MX (1) MX164971B (hu)
NZ (1) NZ230200A (hu)
PH (1) PH27351A (hu)
PT (1) PT91372A (hu)
ZA (1) ZA895908B (hu)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5776093A (en) 1985-07-05 1998-07-07 Immunomedics, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
AU633867B2 (en) * 1989-02-02 1993-02-11 Eli Lilly And Company Delivery of cytotoxic agents
US5272253A (en) * 1991-07-01 1993-12-21 Eli Lilly And Company Cluster conjugates of drugs with antibodies
GR1001459B (el) * 1992-10-08 1993-12-30 Lilly Co Eli Σύμπλεγμα συζυγών φαρμάκων με αντισώματα.
ES2049656B1 (es) * 1992-10-08 1994-11-16 Lilly Co Eli Grupos de conjugados de farmacos con anticuerpos.
US5773001A (en) * 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US20030119724A1 (en) * 1995-11-22 2003-06-26 Ts`O Paul O.P. Ligands to enhance cellular uptake of biomolecules
JP2004536027A (ja) 2000-12-01 2004-12-02 ジョーンズ・ホプキンス・ユニーバーシティー グリコシル化／ガラクトシル化ペプチドの接合体、二官能性リンカー、およびヌクレオチドのモノマー／ポリマー、および関連する組成物および使用方法
ATE427948T1 (de) 2001-04-24 2009-04-15 Purdue Research Foundation Folat-mimetika und deren folatrezeptorbindende konjugate
AU2003243226A1 (en) * 2002-05-15 2003-12-02 Endocyte, Inc. Vitamin-mitomycin conjugates
DK1592457T3 (da) 2003-01-27 2012-10-22 Endocyte Inc Folat-vinblastin-konjugat som lægemiddel
WO2006012527A1 (en) 2004-07-23 2006-02-02 Endocyte, Inc. Bivalent linkers and conjugates thereof
EP1863816B1 (en) * 2005-03-16 2014-06-25 Endocyte, Inc. Synthesis and purification of pteroic acid and conjugates thereof
EP2382995A3 (en) * 2005-08-19 2013-09-25 Endocyte, Inc. Ligand conjugates of Vinca alkaloids, analogs and derivatives
CN103893778A (zh) * 2005-08-19 2014-07-02 恩多塞特公司 多药物配体缀合物
WO2008101231A2 (en) * 2007-02-16 2008-08-21 Endocyte, Inc. Methods and compositions for treating and diagnosing kidney disease
NZ599239A (en) * 2007-03-14 2013-10-25 Endocyte Inc Binding ligand linked drug delivery conjugates of tubulysins
AU2008268432B2 (en) * 2007-06-25 2015-01-15 Endocyte, Inc. Conjugates containing hydrophilic spacer linkers
US9877965B2 (en) 2007-06-25 2018-01-30 Endocyte, Inc. Vitamin receptor drug delivery conjugates for treating inflammation
JP2011500835A (ja) * 2007-10-25 2011-01-06 エンドサイト，インコーポレイテッド チューブリシン類および調製プロセス
US10080805B2 (en) 2012-02-24 2018-09-25 Purdue Research Foundation Cholecystokinin B receptor targeting for imaging and therapy
US20140080175A1 (en) 2012-03-29 2014-03-20 Endocyte, Inc. Processes for preparing tubulysin derivatives and conjugates thereof
CA2887727A1 (en) 2012-10-16 2014-04-24 Endocyte, Inc. Drug delivery conjugates containing unnatural amino acids and methods for using
EP3590922A1 (en) 2013-03-15 2020-01-08 Zymeworks Inc. Cytotoxic and anti-mitotic compounds, and methods of using the same
ES2916722T3 (es) 2013-12-27 2022-07-05 Zymeworks Inc Sistemas de enlace que contienen sulfonamida para conjugados de fármacos
CN113416229A (zh) 2014-09-17 2021-09-21 酵活有限公司 细胞毒性和抗有丝分裂化合物、及其使用方法

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4203898A (en) * 1977-08-29 1980-05-20 Eli Lilly And Company Amide derivatives of VLB, leurosidine, leurocristine and related dimeric alkaloids
FI820020L (fi) * 1981-01-12 1982-07-13 Lilly Industries Ltd Immunoglobulinkonjugater
US4631190A (en) * 1981-06-26 1986-12-23 Shen Wei C Acidity-sensitive spacer molecule to control the release of pharmaceuticals from molecular carriers
US4671958A (en) * 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
CA1203164A (en) * 1982-03-09 1986-04-15 Thomas J. Mckearn Antibody conjugates
EP0121388B1 (en) * 1983-03-30 1990-06-13 Lilly Industries Limited Immunoglobulin conjugates
EP0124502B1 (fr) * 1983-04-29 1991-06-12 OMNICHEM Société anonyme Nouveaux conjugués de la vinblastine et de ses dérivés, procédé pour leur préparation et compositions pharmaceutiques contenant ces conjugués
LU86157A1 (fr) * 1985-11-12 1987-06-26 Omnichem Sa Nouveau procede de fabrication de conjugues de la vinblastine et de ses derives
US4675400A (en) * 1985-06-17 1987-06-23 Eli Lilly And Company Bifunctional derivatives of 4-desacetyl indole-dihydroindole alkaloids
EP0232693A3 (fr) * 1985-12-16 1988-04-06 La Region Wallonne Conjugués de la vinblastine et de ses dérivés, procédé pour leur préparation et compositions pharmaceutiques les contenant
GB8610551D0 (en) * 1986-04-30 1986-06-04 Hoffmann La Roche Polypeptide & protein derivatives
ZA873600B (en) * 1986-05-27 1988-12-28 Lilly Co Eli Immunoglobulin conjugates
US4997913A (en) * 1986-06-30 1991-03-05 Oncogen pH-sensitive immunoconjugates and methods for their use in tumor therapy
FR2610198B1 (fr) * 1987-02-03 1990-06-15 Ire Celltarg Sa Conjugues d'hydrazide d'alcaloide de vinca lie a une immunoglobuline, procede de preparation et compositions pharmaceutiques en comprenant
IL89043A0 (en) * 1988-01-27 1989-08-15 Lilly Co Eli Antibody conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
NZ230200A (en) 1991-11-26
IL91182A0 (en) 1990-03-19
PH27351A (en) 1993-06-21
JPH02131499A (ja) 1990-05-21
KR900002804A (ko) 1990-03-23
AU3933989A (en) 1990-02-08
ZA895908B (en) 1991-04-24
HUT50488A (en) 1990-02-28
AU619329B2 (en) 1992-01-23
DK382989A (da) 1990-02-09
MX164971B (es) 1992-10-09
AR245368A1 (es) 1994-01-31
CN1040205A (zh) 1990-03-07
EP0354728A2 (en) 1990-02-14
EP0354728A3 (en) 1991-04-10
US5006652A (en) 1991-04-09
PT91372A (pt) 1990-03-08
DK382989D0 (da) 1989-08-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU206377B (en) Process for producing cytotoxic vinc-dimer conjugates and pharmaceutical compositions comprising same
US5094849A (en) Cytotoxic antibody conjugates of hydrazide derivatized vinca analogs via simple organic linkers
US5028697A (en) Cytotoxic antibody conjugates of hydrazide derivatized methotrexate analogs via simple organic linkers
US5643573A (en) Antibody-drug conjugates
US20210024646A1 (en) Targeted cd73 antibody and antibody-drug conjugate, and preparation method therefor and uses thereof
JP2930965B2 (ja) Ｃ―３位に脂肪鎖を有するビンカ誘導体の複合体
US5141736A (en) Bispecific monoclonal antibody, its production and use
FI102517B (fi) Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen immunokonjugaatin valmistami seksi
HU193737B (en) Process for preparing transferrin-indole-dihydroindole alkaloid derivatives
KR900006908B1 (ko) 면역글로불린 결합체
BG63492B1 (bg) Методи за получаване на мономерни конюгати калихеамициново производно/носител
JPH0625012A (ja) チオエーテルコンジュゲート
KR20140035393A (ko) 단백질-활성제 접합체 및 이의 제조 방법
AU619614B2 (en) Antibody-drug conjugates
HU205135B (en) Process for producing monoclonal antibody nucleoside conjugates
EP0056322B1 (en) Immunoglobulin conjugates
JP2820256B2 (ja) メチルトリチオ抗腫瘍剤のターゲテッド形態
US5144012A (en) Cytotoxic drug conjugates
US4814438A (en) Immunoglobulin conjugates of 2',2'-difluronucleosides
JP2022500454A (ja) 抗葉酸受容体抗体コンジュゲートによる併用療法
Dosio et al. Antibody-targeted leucinostatin A
CA2121990A1 (en) Antibody-drug conjugates
Ikegaki et al. Characterization and in vitro cytotoxic effect of adriamycin conjugated monoclonal antibody prepared against breast cancer cell line

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee