PT92213B - Processo para a preparacao de conjugados de anticorpo-droga - Google Patents

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

Resumo

O presente invento diz respeito a um processo para a preparação de conjugados de drogas e anticorpos, ou seus fragrentos que conhecem antigénios, que são preparados com um ligante, constituído por um malonato, em que o anticorpo, ou um seu fragmento é ligado, através de um carbonilo, a um grupo éster ou amida em um dos carboxiELI LILLY AND COMPANY

PROCESSO PARA A PREPARAÇAO DE CONJUGADOS DE ANTICORPO-DROGA los de malonato, e a droga é ligada, através de um metileno, ao carbono da posição 2 do malonato.

Estes conjugados apresentam a fórmu la (I):

/'R-Q-CH-C-C0-Y-(CH)_n-C07_mAb I

I

COR¹ em que Ab é um anticorpo ou um seu fragmento; Q é -NH-, -0ou -S-; R-Q é um resíduo de droga; R¹ é um grupo protector de ácido carboxilico; Y é -0-, -NH-, -NCH^- ou -NC₂H₅-; n é um inteiro de 1 a 8; e m é um inteiro de 1 a 10.

A droga pode, por exemplo, apresentar a fórmula (V):

em que R é hidrogénio ou hidroxi, referido processo consiste, por exemplo, na reacção de um anticorpo modificado da fórmula (III) :

-3/R⁴-CH=C-CO-Y-(CH₂)_n-C07_mAb III

COR¹ em que R¹, Y, n, m e Ab são como foi definido anteriormente, 4 e R é alcoxi Cj-C₄, com uma droga da fórmula R-QH, em que Q e R-Q são como foi definido anteriormente.

-40 invento em consideração pertence aos campos de acção da química orgânica, da química farmacêutica e da imunologia, e estabelece conjugados de anticorpos-droga. Os conjugados são proveitosos para a administração dirigida de drogas, em que o anticorpo dirige a droga para o tecido, ou para a célula, onde a droga ê necessária.

A conjugação do anticorpo e da droga é atingida, por meio de um ligador bivalente, que liga ao anticorpo, num ponto de ligação, e à droga no outro. Os intermediários, para a preparação dos conjugados, são também estabelecidos.

A ciência da química farmacêutica tem, progressivamente, estabelecido mais e mais drogas especificas e vigorosas, para o tratamento e para a prevenção da doença. Não obstante, até quase recentemente, não tem havido meios, para dirigir uma droga, para a parte especifica do corpo, onde ela é necessária. Deste modo, conquanto seja, muitas vezes, possível tratar um paciente com uma droga,que tem o efeito especifico que é necessário, e nenhum outro efeito no corpo, é ainda necessário administrar-se uma dose para o corpo inteiro. Por outro lado, se fosse possível dirigir-se um medicamento para o orgão, tecido ou mesmo célula, com necessidade do tratamento, seria, muitas vezes, possível administrar-se uma dose total extremamente pequena, uma vez que a droga concentrar-se-ia, ela própria onde ele se tornasse necessária. A vantagem, na segurança ao paciente e a economia da droga,saiam óbvias.

Durante os últimos anos, a ciência da imunologia tem tentado proporcionar tais tratamentos dirigidos, conjugando as drogas com os anticorpos, que são dirigidos aos antigénios específicos, associados aos locais,onde a droga se torna necessária. Patentes e artigos científicos, respeitantes a tais conjugados de anticorpos com as drogas são, no presente, numerosos. Não obstante, até o momento presente, nenhum conjugado de anticorpos-droga está aprovado,

-5para o emprego terapêutico.

invento em consideração proporciona um conjugado de droga, fisio 1ogicamente aceitável, da f órrnu 1 a [R-Q-CH=C-CO-Y-(CH₂) -CO] Ab I n

COR¹ em que

Ab é um anticorpo, ou um seu fragmento que reconhece antigénios, o qual reconhece um antigénio, associado com uma célula, para a qual a libertação da droga é desejável;

Q é -NH-, -0- ou -S-;

R-Q ê o resíduo de uma droga, que tem uma função amino, hidroxi ou tiol, reactivamente utilizável ;

R¹ é um grupo de protecção do ácido carboxilico;

Y é -0-, -NH-, -KU₃- ou -NC₂H₅;

n é um número inteiro de 1 a cerca de 8; m é um número inteiro de 1 a cerca de 10.

invento estabelece, também, composições farmacêuticas, que compreendem um conjugado do invento e um meio parenteralmente administráve1, e os processos de tratamento, que compreendem a administração parenteral de um conjugado do invento, a um paciente, com necessidade de trai

tamento com a droga.

Também se estabelecem malonatos intermediários da fórmula

R⁴-CH=C-CO-Y-(CH₂) -cor³

I ⁿ II

COR² em que

R é hidroxi, um grupo de protecção do ácido carboxilico, ou uma porção que completa um sal do ácido carboxilico;

R é hidroxi, urn grupo de protecção do acido carboxilico, um grupo de activação do ácido carboxilico, ou uma porção que completa um sal do ácido carboxilico;

R⁴ é alcoxi de C j-C₄.

invento estabelece, ainda, um anticorpo modificado, ou um fragmento de anticorpo, modificado, da fórmula [R⁴-CH=C-CO-Y-(CH₂) -co] Ab ^L | n. m

COR¹

III invento estabelece,também, um medicamento derivatizado da fórmula

R-Q-CH=C-CO-Y-(CH₂) -COR³ i n

COR¹ .

IV

Ainda mais, o invento estabelece um processo para a preparação de um conjugado de droga da fórmula I, como foi definido no procedente compreendendo;

(A) a reacçao de um anticorpo modificado de Fórmula III, como foi definido no precedente, com uma droga da fórmula R-QH, em que Q e R-Q- são o que ficou estabelecido no precedente ; ou (B) a reacçao de uma droga que foi sujeita a derivação da Fórmula IV, como ficou definido no precedente, com um anticorpo, ou um fragmento de anticorpo da fórmula Ab, como ficou estabelecido no precedente.

Através do documento em consideração, todas as temperaturas são expressas em graus Cel sius.Todas as expressões de percentagem, de concentração e outras afins são expressas em unidades de peso, salvo indicação em contrário. Todas as referencias a concentrações e âs dosagens de conjugados de drogas são expressas em termos da quantidade ou da concentração da droga contida no conjugado.

Nas fórmulas gerais precedentes, o termo alcoxi Cj-C₄ refere-se a metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi e aos diversos grupos de butoxi isomêricos,inc1uindo n-butoxi e t-butoxi.

Através do documento em consideração, os compostos são designados, de um modo geral, como malonatos Compreender-se-á, contudo, que os compostos, em que Y ê uma função amino, são designados, propriamente como malonamatos, e um tal termo será empregado, quando tais compostos são des_i. gnados especificamente.

termo grupo de protecçâo do ácido carboxílico refere-se a grupos orgânicos, que são proveitosos para a protecçâo dos ácidos carboxi 1 icos , enquanto outras reacções se produzem em outros locais. Tais grupos são empregados em campos extremamente amplos, na quimica sintética, particularmente na quimica dos pêptidos, e os grupos de protecção são bem conhecidos dos químicos orgânicos. Um compêndio, particularmente conveniente, sobre o assunto, é a Greene Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, New York, 1981. Os grupos de protecçâo de ácidos são debatidos por Greene, no Capítulo 5. Os grupos de protecçâo, os mais preferidos, no contexto do invento em consideração, são os grupos alcoxi inferior, particularmerte etoxi. Outros grupos preferidos e convenientes, de protecçâo de ácidos incluem, como preconiza Greene, por exemplo, metoximetoxi,tetrahidropiraniloxi, tetrahidrofuraniloxi.benzlloximetoxi, fenaciloxi e fenaciloxi substituído, 2,2,2-tric1oroetoxi e outros haloetoxis, trimeti1ssi1i1etoxi, meti11ioetoxi,to 1uenossu1foniletoxi, t-butoxi, cic 1 opentoxi , benzi1oxi,difeni1 e trifeniImetoxi e outrso afins, bem como os grupos de formação de amidas, tais como amino, eti 1 amino , dimeti 1 amino,pirrolidino, morfolino, piperidino, dieti1aminoeti1amino, morfolinoetilamino, benziImeti1aminoeti1amino e outros afins.

termo, um grupo de activação do ácido carboxilico, inclui grupos empregados na química orgânica sintética, para aumentar a reactividade de um ácido carboxilico. Tais grupos são, frequentemente, empregados por químicos sintéticos, e incluem grupos tais como benzenossulfoniloxi, metanossulfoniloxi, toluenossulfoni loxi, ftalimi diloxi, succinimidiloxi, cloro, benzotriazoliloxi, bromo,azido e outros afins. Os grupos preferidos de activação, no invento em consideração, são N-succinimidi1oxi,fta 1imidiloxi e benzotr i azo 1i 1 ox i.

termo, uma porção que completa um sal do ácido carboxilico, designa as porções químicas, vulgar^ mente aceites, que, ligadas através de um átomo de oxigénio, formam sais de ácidos carboxi1icos. Por exemplo, tais porções de formação de sais, como metais alcalinos, grupos de amino e grupos de amónio quaternário, são desejáveis.Mais especificamente, os grupos de sódio, de potássio, de litio, de alquilamino de Cj-C₄, e dia 1qui1amino e de tria 1qui 1 amino , e os grupos de amónio quaternários, em que o átomo de azoto é substituido por porções de quatro hidrogénios, a 1 qui1 o Cj-C₄, fenilo ou benzilo, são os mais preferidos. Para um outro exemplo, os grupos de amónio quaternário, tais como o amónio, o tetrameti1amónio, o dieti1-dimeti 1 amónio , o dietil-dibuti1amónio, o benzi1 -trimeti1amónio , o t-buti1-trimeti1amónio, o feni 1-trietilamónio, o dieti1-dipropi1amónio, o £-buti1trimeti1amónio, o isobuti1 -trieti1amónio, e outros afins, são proveitosos e podem ser escolhidos por conveniência, nas circunstâncias. Além disso, aminas tais como a metilamina, a butilamina, a trieti1amina , a dipropi1amina , a dietanolamina e outras idênticas, são convenientes para a formação do sal.

-10Os conjugados de drogas do invento em consideração são compostos de anticorpos de drogas de determinadas classes químicas e de grupos químicos orgânicos, que ligam os anticorpos às drogas.0 invento estaoe1ece , também , malonatos intermediSrios , empregados para a preparação dos conjugados, e anticorpos modificados preparados por reacção de anticorpos, ou fragmentos de anticorpos, com os intermediários de malonatos em forma activada. Os anticorpos e as drogas serão primeiro debatidos individualmente, em seguida os intermediários de maonatos e as sínteses serão justificados,e, finalmente, serão apresentados exemplos da síntese e realização biológica dos conjugados.

anticorpo

Deve ser aceite que a função dos conjugados das drogas em consideração são determinadas pela eficiência biológica da droga e pela selectividade antigénica do anticorpo. Um anticorpo ê escolhido por reconhecer um antigénio associado a uma célula, à qual a droga especifica é libertada beneficamente. Por exemplo, se a droga é um a n t i neo p 1 á s t i co , então será bern escolhido um anticorpo, que reconhece um antigénio associado a células tumorosas. Se a droga é um antibacteriano, por exemplo uma cefa 1 osporina, deverá ser escolhido um anticorpo, que reconhece um antigénio bacteriano. Dependendo das características da droga a ser empregada, pode ser preferível, num dado caso, escolher-se um anticorpo que é interiorizado pela célula, ou pode ser preferível empregar-se um anticorpo que permaneça na superfície da célula, pelo reconhecimento de um antigénio de superfície.

A origem do anticorpo não é critica no invento em consideração. Pode ser escolhida de qualquer classe, ou subclasse de imunoglobu1ina, incluindo IgG, IgA,

IgM, IgE e IgD. De um modo semelhante, a especie da origem não é critica, na medida em que o anticorpo tenha como alvo uma célula, na qual o efeito da droga seja proveitosa.

No estado actual da técnica, os anticorpos monoclonais são os mais empregados nos conjugados das drogas, e o seu emprego é o preferido no invento em consideração. Não obstante, não se excluem os anticorpos policlonais. Um tipo mais recente de anticorpo é o anticorpo quimérico, que é prqsrado no laboratório, pela tecnologia de recombinantes, que permite a expressão de um DNA modificado, que codifique a região de ligação do antigénio, de qualquer anticorpo desejado, e, também, codifique quaisquer outras séries de aminoácidos desejados. Deste modo, os anticorpos quiméricos, dos quais uma parcela é derivada de uma espécie, e uma outra parcela é derivada de uma outra espécie, podem ser obtidos e empregados no invento em consideração.

A origem e a natureza do anticorpo não são sob outros aspectos, críticos, na medida em que elas tem como alvo a célula a ser tratada, e não são, elas próprias, tóxicas ao paciente. Os técnicos da arte podem preparar,fácilmente, os conjugados, com um anticorpo candidato, e avaliá-los. Algum debate do processo de avaliação de anticorpos e dos conjugados será estabelecido, por conveniência. Primeiro, o anticorpo deve ser produzido por um hibridoma,que seja suficientemente estável, para permitir a preparação de quantidades razoáveis do anticorpo. 0 anticorpo, ele próprio, deve ser submisso à purificação,e, em particular, deve ser suficientemente solúvel em água, para permitir as manipulações químicas, a uma concentração razoável.

Os conjugados, preparados com o anticorpo candidato, são avaliados, primeiramente, pela sua capacidade de ligação ao antigénio. Uma redução modesta da capacidade de ligação do anticorpo livre deve ser aguardada e é

-12aceitável. Em seguida, o conjugado é experimentado, para se determinar a sua potência in vitro, tal como a sua citotoxicidade, no caso de drogas anticancerosas, contra as células positivas de antigénios. Um conjugado eficiente pode ter uma potência, algum tanto inferior à da droga livre, na mesma análise, devido à sua capacidade para originar uma concentração elevada da droga à célula. Um conjugado, que é aosite nas duas primeiras experiências, é, em seguida, avaliado num modelo de xenoenxerto de tumores humanos em rato pelado,como preconiza Johnson e Laguzza, Câncer Res,47, 3118-22(1987).

conjugado candidato deve ser experimentado em ratos pelados contra a droga livre, contra uma mistura de droga livre e de anticorpo livre, e contra um conjugado com uma imunoglobulina não dirigida, e deve exibir uma potência aperfeiçoada ou uma seguraçça aperfeiçoada, acima de todas. Os estudos de escalonamento de doses devem ser levados a efeito, no modelo de xenoenxerto.

Os conjugados, que são potentes no modelo de xenoenxerto,são submetidos a experiências nos animais, que são conhecidos em expressar o antigénio de interesse, num modelo semelhante ao dos vistos nos entes humanos. Se o conjugado produz ligação significativa ao antigénio, em tais experiências,e, se ele é razoávelmente livre de toxicidade, em doses preditas pelo modelo de xenoenxerto para ser terapêutico, o conjugado candidato pode ser considerado como tendo um potencial terapêutico.

Deve ser compreendido que os fragmentos escolhidos adequadamente de anticorpos têm o mesmo efeito que o anticorpo intacto. Deste modo, na prática deste invento, os fragmentos de anticorpos, pa rt. i cu 1 amente os fragmentos F(a'>2» que aceitam um antigénio, associado a uma célula a ser tratada, podem ser proveitosos, como o são os anticorpos impolutos.

-130 mecanismo preciso, pelo qual o grupo do ligador reage com, e se liga com, o anticorpo, não é revelado na Fórmula I, e não se conhece com perfeição. A reacção é, pressumivelmente, uma acilação, como se demonstra a seguir, sendo uma diversidade de locais nas moléculas do anticorpo submetidas à acilação. Mais vulgarmente, pensa-se que as acilações dos anticorpos se desenvolvem, nos grupos amino livre das porções de lisina. Não obstante, a acilação pode, também, atacar os grupos hidroxi, grupos fenóis,anéis imidazoles e, talvez, outras porções.

A fórmula I indica que de 1 a cerca de 10 porções de drogas ligadores estão ligados a cada molécula do anticorpo. Como ê evidente, o número de tais porções, por molécula do anticorpo, ê um número médio, devido a que um dado lote de conjugados necessariamente conterá moléculas que têm um grau diverso de proporções de drogaligado ao anticorpo. 0 emprego o mais eficaz do anticorpo dispendioso ê obtido, como é evidente, quando um número de moléculas da droga está ligado a cada molécula do anticorpo. Não obstante, a ligação de um número excessivo de moléculas da droga ligador da porção tem, habitualmente, um efeito contrário na capacidade do anticorpo em reconhecer e ligar-se ao seu antigénio, e, por isso, um valor de compromisso para m deve ser encontrado. De um modo geral, o valor preferido para m é de cerca de 4 a cerca de 10; um outro valor preferido é de cerca de 3 a cerca de 8.

Um grande número de anticorpos são utilizáveis pelos imuno 1 ogistas,para emprego no invento em consideração, e mais outros anticorpos proveitosos estão a ser divulgados em cada edição das revistas pa^t i nentes. E irpossível e totalmente desnecessário proporcionar uma lista exaustiva de anticorpos, que podem ser aplicados,na prática deste invento. Os imunologistas e os químicos da arte estão

-14comp1etamente aptos a escolherem os anticorpos de origens tais como o catálogo da American Type Culture Col lection ,Rocj< vi 1 le ,i4ary land , U.S.A., e Linscotfs Directory of

Immuno1ogica 1 end Biological Reagents publicado pelo

Linscotfs Directory, 40 Glen Drive.Mill Va 11 ey , Ca 1 i f órn i a , Estados Unidos da América, 94941. Deste modo, é um assunto simples, para o técnico no campo, escolher um anticorpo, contra virtualmente qualquer determinante, tal como os antigénios de tumores, bacterianos, fungais,virais,parasíticos,micoplasmais, ou de histocompatibi1idade , bem como os antigénios de superfície de patogénios, as toxinas, as enzimas, os alergénios e outros tipos de antigénios, relacionados com as células fisio 1ogicamente importantes.

emprego mais preferido, do invento em consideração, é o desprendimento das drogas citotóxicas às células cancerosas, inc1uindo,particu 1armente, as células de carcinomas escamosas, as células de adenocarcinomas, as células de carcinomas de pequenas células, as células de gliomas, as células de melanomas, as células de carcinomas de células renais, as células de carcinomas de células transicionais, as células de sarcomas, as células de suporte de vasculaturas de tumores e as células de tumores linfóidos, tais como as leucemias e os linfomas. Os anticorpos adequadbs que têm como alvo todas estas células, são adquiríveis, e as origens podem ser lccalizadas em Linscott. Alternativamente, os hibridomas necessários para a produção de tais anticorpos, pelos processos convencionais, estão disponíveis em AVCC e de outras colecções de linhas celulares.

Um diversidade de anticorpos,conhecidos actualmente, são de particular interesse,para o emprego com objectivos anticancerosos,do invento em consideração. Um anticorpo especifico preferido, por exemplo, ê L/lC2,produzido por ATCC hibridoma HB9Ô82.

-15Um outro anticorpo de interesse é KS1/4, divulgado primeiramente por Varki et al,Câncer Research 44, 681-86, (1984).Uma diversidade de plasmídeo, que compreende as séries de codificação das diversas regiões do anticorpo monoclonal KSl/4,está agora em depósito e pode ser obtida do Northern Regional Research Laboratory.Peoria,

111inois,Estados UNidos da América.Os plasmídeos podem ser empregados por técnicos de arte,para produzir os anticorpos quiméricos,por meios de recombinantes,anticorpos esses que ligam a um antigénio de superfície de célu1 as, descoberto em densidade elevada nas células de adenocarcinomas. A produção de tais anticorpos é debatida, em pormenor.no Pedido de Patente Europeia,89303814.1, solicitado em 18 de Abril de 1989. Os plasmídeos que se seguem,dizem respeito a KS1/4.

Plasmídeos pGKC2310, a sequência codificadora da cadeia leve, o péptido-sina 1 associado com a cadeia leve, e as regiões não transladadas de 5' e de 3';isoladas de E. coli K12 MM294/pGKC2310, NRRL B-18356.

Plasmídeo pG2A52, a sequencia codificadora da cadeia pesada, a sequencia codificadora do pêptido-sinal associado com a cadeia pesada, e as regiões não transladadas de 5' e de 3' ; isoladas de E,co I i K12 MM294/pG2A52, NRRL B-18357.

Plasmídeo CHKC2-6, a sequencia codificadora da região variável de cadeia leve, a sequencia codificadora do pêptido-sina 1 associado com a cadeia leve, e uma sequencia codificadora da região constante da cadeia leve de um ente humano IgG;isolado de E,co 1 i K12 DH5/CHKC2-6,

NRRL B-18358.

-16Plasmídeo CHKC2-18, a sequencla codificadora de uma regipao variável de cadeia leve deriva, a sequência codificadora do péptido-sinal associado com a cadeialeve, e uma sequencia codificadora da região constante da cadeia leve de um ente humano IgG;isolado de E.co1i K12 DH5/CHKC2-18,

NRRL B-18359.

Plasmídeo CH2A5, a sequencia codificadora da região variável de cadeia pesada, a sequencia codificadora do péptido-sinal associado com a cadeia pesada, e uma sequencia codificadora da região constante da cadeia pesada de um ente humano IgGl;isolado de E.co 1 i K12 MM294/CH2A5,NRRL B-18360.

Plasmídeo CH2A5IG2, a sequencia codificadora da região variável de cadeia pesada, a sequencia codificadora do péptido-sinal associado com a cadeia pesada, e uma sequencia que codifica a região constante da cadeia pesada de um ente humano;iso1ado de E.co1i K12 0H5/CH2A5 IG2,

NRRL B-18361.

Plasmídeo CH2A5IG3, a sequencia codificaora da região variável de cadeia pesada, a sequencia codificadora do péptido-sinal associado com a cadeia pesada,e uma sequencia que codifica a região constante da cadeia pesada de um ente humano IgG3;isolado de E, co 1 i K12 DH5/CH2A5IG3 NRRL B-18362.

Plasmídeo CH2A5IG4, a sequencia codificadora da região variável de cadeia pesada, a sequencia codificadora do péptido-sinal associado com a cadeia pesada, e uma sequencia que codifica a região constante da cadeia pesada de um ente humano IgG4;isolado de E.co1i K12 DH5/CH2AIG4,

NRRL B-18363.

-170 anticorpo 5E9C11, produzido por um hibridoma HB21, de ATCC, aceita o receptor de transferrina, que se manifesta por muitos tumores. Um anticorpo designado por B72.3,disponível no National Câncer Institute,aceita os antigénios manifestados pelo carcinoma, tanto do seio,como do colon.

Dois anticorpos de interesse,com reactividade contra os antigénios não tumorosos, são 0KT3 e 0KT4, que se ligam às células T periferais e às células T auxiliares humanas, respectivamente. Eles são produzidos por hibridomas, em depósito no ATCC, como CRL8001 e CRL8002, respect i vamente.

Origens complementares de anticorpos,proveitosos para diversas finalidades terapêuticas, são as que se seguem. Os linfócitos anti-humanos e os anticorpos de monocitos, proveitosos para a modulação imune e para a terapia de tumores, são produzidos pelas culturas de ATCC HB2,

HB22, HB44, HB78 e HB136. Um anticorpo de receptor de transferrina, proveitoso para a terapia de tumores, é produzido pela cultura HB84, de ATCC. A cultura HB8059,cfe ATCC,produz um anticorpo contra a monosia 1ogang1ios ida do carcinoma colorectal, e a cultura HB8 136 produz um anticorpo contra o antigénio de superfície da célula T, humana, maduro, proveitoso para a modulação imune e para a terapia de leucemia da célula T.

Mais ainda, o hibridoma HB9620, de ATCC produz um antigénio anti-carcinoembirónico vantajoso,designado por CEM231.6.7.

-18Um imunologista, ou um técnico bem informado, da direcção dos medicamentos, com a assistência das publicações vulgarmente conhecidas no campo, e com os exemplos guias precedentes, pode, fácilmente, escolher um anticorpo para a direcção de qualquer droga adequado, para qualquer célula desejada, para ser tratada com uma tal droga.

A Droga

Compreender-se-á que a essência do invento em consideração é o processo de ligação da droga ao anticorpo, por meio dos agentes de ligação de ma 1onatos ,descritos anteriormente, e que nem a droga, nem o anticorpo, constitui uma limitação ao invento em consideração. Os agentes de ligação de malonatos, do invento em consideração, em conformidade,podem ser, e são, empregados beneficamente, quando aplicados a drogas com qualquer finalidade terapêutica ou profiláctica, limitada, epenas, pela necessidade,para a droga, de possuir uma função química, com a qual o malonato se possa ligar, e pela necessidade,para o anticorpo, de se dirigir a uma célula, para a qual ele seja benéfico. 0 mecanismo de ligação do metileno, estabelecido pelo invento em consideração, exige que a droga tenha uma função amino, hidroxi ou tiol, utilizável reactivamente.Além disso, como é evidente, a droga tem de ser de uma natureza,tal que a reacção, daquela função utilizável reactivamente com o agente de ligação, não destrua a actividade da droga.

Em conformidade, o invento do agente de ligação em consideração pode ser empregado em conecção com drogas,substanciaImente, de todas as c1 asses,inc1uindo , por exemplo, drogas antibacterianas, antivirais ,antifungais e anticancerosas, e antimicoplasmais, e outros afins. Os conjugados de drogas, deste modo constituídos, são eficien-

-19tes, para os fins habituais, para os quais as drogas correspondentes são eficientes, e têm uma eficiência superior, devido à sua capacidade,inerente no anticorpo, de transportar a droga para a célula, na qual ele seja de beneficio particular.

A Patente No. 4.671.958, dos Estados Unidos da América, presta informação sobre as drogas e outros compostos, que podem ser submetidos à conjugação de drogas, e a Memória Descritiva, referente a drogas daquela Patente, é aqui incorporada, a título de referencia.

Como ficou estabelecido, a droga é feita reagir por uma função sua amino, hidroxi ou tiol.

Estes termos são empregados num sentido extenso;isto é,o termo grupo amino inclui os grupos amino, que fazem parte das carboxamidas, das hidrazidas, dos carbamatos e de outros afins, bem como os grupos amino ligados simplesmente à estrutura de carbono-hidrogénio. Um grupo amino pode ter nele um terceiro pequeno substituinte, uma vez que o grupo não crie um impedimento estérico, que impeça a reacção com a estrutura doralonato. Tais grupos podem ser, por exemplo, grupos alquilo de cadeia linear e outros idênticos.

De um modo semelhante, um grupo hidroxi ou tiol pode constituir uma parte de um ácido carboxilico ou de um ácido tióico.

Conquanto o emprego de drogas,de qualquer tipo e de qualquer eficiência terapêutica ou profiláctica, esteja incluído no invento em consideração, é preferível empregarem-se drogas que tenham uma função amino, utilizável para a reacção. E mais preferível empregarem-se drogas, em que o grupo amino faça parte de uma porção hidrazina ou de uma porção hidrazida.

-20A classe de eficiência, a mais preferida, de drogas, para emprego, no invento em consideração, é a classe de drogas citotóxicos,particu 1 armente aquelas que são empregadas na terapia do cancro. Tais drogas incluem,de um modo geral, agentes de a 1 qui 1 ação,agentes antipro1iferativos, agentes de ligação de tubulina e outros idênticos. As (ff classes preferidas de agentes citotóxicos incluem, por exemplo, a família de daunomicina de drogas, as drogas vinca, as mitomicinas, as bleomicinas, as nucleosidas citotóxicas, a família de pteridinas de drogas, e as podofi11otoxinas.

Os elementos, particularmente proveitosos.de tais classes, incluem, por exemplo, a doxorubicina, a aminopterina , o metotrexato, a metopterina, o dic1orometotrexato , a mitomicina C, a porfiromicina, o 5-fluoruracilo, a 6-mercaptopurina, a arabinosida de citosina, a podofi 1 lotoxina, a etoposida, o melfalano, a vinblastina, a vincristina, a leurosidina, a vindesina, a leurosina e outros afins. Deve compreender-se que alterações químicas, não importantes, podem ser feitas por químicos,vu 1 garmente peritos, para cs compostos preferidos e geralmente descritos, com a finalidade de tornarem as suas reacções o mais convenientes.

Deve,também, compreender-se que os conjugados preferidos são preparados a partir dos medicamentos preferidos.

Um grupo, mais altamente preferido, de agentes citotóxicos,para emprego como drogas no invento em consideração, inclui as drogas das fórmulas que se seguem.

VI

-22em que R⁶ é amino ou hidroxi;

R² é hidrogénio ou metilo;

g

R é hidrogénio, fluor, cloro, bromo ou iodo;

R é hidroxi ou uma porção que completa um sal do ácido carbox i1ico ;

em que R

hi drogén i o ou metilo;

em que é amino, alqui lamino d amino ou amino de polimetileno de

Cj-C₃ , di(alquilo de Cj-C₃ )

N(CH₂CH₂CI)₂

IX

0-R¹² 0-R¹²

2 em que uma das porções de R ê uma ligação e as outras são hidrogénio;

em que R

h i drogên i o ou metilo;

-26R¹⁴ é meti lo ou tien ilo;

em que R¹⁵ é H, CH ou CHO; quando R¹⁷ e R¹⁸ são considerados isoladamente, R¹⁸ é H, e um de R^⁶ e R¹⁷ é etilo e o outro 17 18 é H ou OH; quando R e R são considerados em conjunto,com os átomos de carbono aos quais eles estão ligados, eles formam um anel de oxirano, caso em que R^⁸ é etilo; R^⁹ é hidrogénio,(alquilo de C₁-C₃)-CO, ou (alquilo de C₁_c₃)-C0 clorossubstituido;

p é 0 ou 1;

? ο

R é uma ligação ou (alquilo de C₂-C₄)-X; X é -0-, -S- ou -NH-;

R²¹

CH₂OR¹²

O-R¹²

-28p I em que R é uma base de uma das fórmulas

-2922 em que R é hidrogénio, metilo, bromo, flúor,cloro ou iodo;

R²³ é -0R¹² ou -NHR¹²;

R é hidrogénio, bromo, cloro ou iodo.

Nas fórmulas preferidas precedentes, os compostos da fórmula V representam o grupo de daunomicina (ou adriamicina) de compostos; a Fórmula VI representa o grupo de metotrexatos de compostos; a Fórmula VII representa as mitomicinas; a Fórmula VIII representa as bleomicinas; a Fórmula IX representa o melfalano; a Fórmula X representa 6-mercaptopurina; a Fórmula XI representa a arabinosida de citosina; a Fórmula XII representa as podofi1lotoxinas; a Fórmula XIII representa os medicamentos de vinca; e a Fórmula XIV representa as dif1uornuc1eosidas.

Entre as drogas preferidas, os mais preferidos são as drogas vinca e a família de daunomicinas de drogas, uma outra classe preferida inclui as drogas vinca, a família de daunomicinas e a família de metotrexatos.

Uma outra classe de drogas preferidas inclui a wnercaptopurina, as dif1uornuc1eosidas e a aradinosida de citosina; ainda uma outra classe de drogas preferidas inclui as difluornucleosidas, as drogas vinca e as drogas de daunomi cinas.

Um outro grupo preferido das drogas preferidas é constituido por aqueles que estão ligados através de um grupo de amino.

As drogas vinca, empregadas no invento em consideração, são conhecidos na técnica, particularmente pelas diversas Patentes e publicações de Cullinan e outro, e Trouet e outro. A Patente No. 4.203.898, de Cullinan,

-30dos Estados Unidos da América, é particularmente instrutiva, sobre a síntese dos medicamentos de vinca, empregados no invento em consideração.

As drogas, as mais altanente preferidas, são os compostos vinca da Fórmula XIII precedente. Deve compreender-se que a Fórmula estrutural inclui os compostos que são, ou são derivados de drogas, que têm uma diversidade de nomes diferentes genéricos ou triviais. Em conformidade, com a finalidade de se simplificar a nonenclatura complexa das drogas vinca, eles serão designados, neste documento, como derivados de vinblastina. A vinblastina, deve compre1 5 ender-se, é o composto da fórmula precedente, em que R é metilo, r!6 é etilo, R^⁷ é hidroxi, R^³ é hidrogénio, R¹^ é acetilo, e o grupo de carbonilo em C₂₃ encontra-se na forma de um éster de metilo, de preferencia a uma carboxamida, como revelado no precedente.

A tabela,que se segue, representa uma diversidade de medicamentos de vinca, que revelam os empregados no invento em consideração.

TABELA I

Ris	Rie		Rif
H	H	C2Hs	H
ch3	c2h5	OH	H
CHO	c2h5	H	H
CHO	OH	C2H5	H
ch3	c2h5	Oxirane
H	c2h5	H	H
ch3	c2h5	Oxirane
H	C2H5	Oxirane
CHO	OH	c2h5	H
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ch3	c2h5	OH	H

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As dif1uornuc1eosidas, preconizadas pela Patente No.4.692.434, dos Estados Unidos da América, proporciona uma diversidade de situações, en que a reacçao, com o grupo de ligação, é possível, por meio de grupos amino ou hidroxi. Uma droga, particularmente preferida da Fórmula XIV, ê 2'-deoxi-2',2-difluorcitidina , que pode, também,ser designado por 1 -(2-oxo-4-amino-1H-pirimidiη- 1 -i 1 )-2-desoxi2,2-difluorribose. Deve compreender-se que pode fazer-se reagir o composto, para se formar o conjugado no grupo 5'-hidroxi, no grupo 3-hidroxi, ou num grupo amino, na base.

Uma vez que as difluornuc 1 eosidas são relativamente recentes na técnica, Um grupo deles serâ mencionado, para se assegurar a interpretação.

l-(5-metil-2,4-dioxo-lH,3H-pirimidin-1-il)-2-desoxi,2,2-difluororribose, l-(2,4-dioxo-lH,3H-pirimidinil-il)-2-desoxi-2,2,difluorribose, l-(5-bromo-2,4-dioxo-lH,3H-pirimidin-1 -i1)-2-desoxi-2,2-difluorribose, l-(5-cloro-2,4-dioxo-lH,3H-pirimidin-1 -i1)-2-desoxi-2,2-difluorribose, l-(5-iodo-2,4-dioxo-lH,3H-pirimidin- 1 -i1)-2-desoxi-2,2-difluorribose, l-(4-amino-5-cloro-2-oxo-lH-pirimidin-l-il)-2-desoxi-2,2-difluorribose, l-(4-amino-5-bromo-2-oxo-lH-pirimidin- 1 -i 1 )-2-desoxi-2,2-difluorribose,

1-(4-amino-2-oxo-lH-pirimidin-l-il)-2-desoxi,2,2-difluorribose, l-(4-amino-5-metil-2-oxo-lH-pirimidln-l-il)-2-desoxi-2,2-difluorribose, l-C5-(2-bromovinil)-4-hidroxi-2-oxo-lH-pirimidin-l-il_7-2-desoxi-2,2-difluorribose, l-C4-amino-5-(2-bromovinil)-2-oxo-lH-pirimidin-l-il}-2-desoxi-2,2-difluorribose, l-C4-amino-5-(2-iodovinil)-2-oxo-lH-pirimidin-l-il3-2-desoxi-2,2-difluorribose, l-C5-(2-clorovinil)-4-hidroxi-2-oxo-lH-pirimidin-l-il7-2-desoxi-2,2-difluorribose, l-C4-hidroxi-5-(2-iodovini1)-2-oxo-lH-pirimidin-l-ilJ-2-desoxi-2,2-difluorribose, l-Z4-amino-5-(2-clorovinil)-2-oxo-lH-pirimidin-l-il7-2-desoxi-2,2-difluorribose, l-(2-amino-6-oxo-lH,9H-purin-9-i1)-2-desoxi-2,2-difluorribose, l-(õ-arnino-9H-purin-9-il)-2-desoxi-2,2-d i f1 uorr1bose, l-(5-fluor-2,4-dioxo-lH,3H-pirimidin-l-il-2-desoxi-2,2-difluorribose, l-(2,4-dioxo-lH,3H-pirimidin-l-il)-2-desoxi-2,2-difluorribose,

-33l-(5-bromo-2,4-dioxo-lH,3H-pirimidin-lil)-2-desoxi-2,2-difluorxilose, l-(5-cloro-2,4-dioxo-lH,3H-pirimidin-lil )-2-desoxi-2,2-difluorxilose, l-(5-iodo-2,4-dioxo-lH,3H-pirimidin-lil)-2-desoxi-2,2-diflLDrxilose, l-(4-amino-5-fluor-2-oxo-lH-pirimidln-l-il)-2-desoxi-2,2-difluorribose, l-(4-amino-5-cloro-2-oxo-lH-irimidin-l-il)-2-desoxi-2,2-difluorxilose, l-(4-amino-2-oxo-lH-pirimidin-l-il)-2-desoxi-2,2-difluorxilose, l-(4-amino-5-fluor-2-oxo-lH-pirimidin-li1)-2-desoxi-2,2-difluorxilose, l-(4-amino-5-metil-2-oxo-lH-pirimidin-lil)-2-desoxi-2,2-difluorxilose, l-Z’5-(2-bromovinil)-4-hidroxi-2-oxo-lH-pirimidin-l-il3-2-desoxi-2,2-difluorxilose, l-Z4-amino-5-(2-bromovinll)-2-oxo-lH-pirímidin-l-i lJ’-2-desoxi-2,2-difluorxi lose, l-Z'4-amino-5-(2-iodovinil)-2-oxo-lH-pirimidin-l-il^-2-desoxi-2,2-difluorxilose, l-/'5-(2-clorovinil)-4-hidroxi-2-oxo-lH-pirimidiη-1 -i lJ-2-desoxi-2,2-d1f1uorxi1ose,

- Γ4 - h i d ro x i - 5 - ( 2 - i od o v i n i 1 ) - 2 - o x o -1H -pirimidin-l-il]-2-desoxi-2,2-difluorxilose, l-4-amino-5-(2-clorovinil)-2-oxo-lH-pirimidin-l-il-2-desoxi-2,2-difluorxilose, l-(2-amino-6-oxo-lH,9H-purin-9-il)-2-desoxi-2,2-difluorxilose, l-(6-amino-9H-purin-9-i1 )-2-desoxi-2,2-difluorxilose.

As drogas vinca, particularmente preferidas, são as descritas pelas restrições, que se seguem.Deve compreender-se que as diversas restrições individuais, que se seguem, podem ser combinadas, para se formarem,a 1ém de mais, mais classes preferidas limitadas.

A. R1⁸ é meti1 o;

B. R é hidrogénio ou formilo;

C. R¹⁶ é etilo;

D. r1® ê hidrogénio;

E. Um de e R^² é etilo e o outro é hidrogénio ou hidro-

	xi;
F.	R17	é hidroxi;
G.	R19	êhidrogênio;
H.	R19	é aceti1 o;
I.	R19	é alquilo de Cj-Cg-CO;
J.	P é	1 ;

K.	R20	é uma 1igação;
L .	R20	é (alquilo de C^-C^) -X;
M.	P é	0;
N.	X é	-NH;
0.	X é	-0- ou -S-;
P.	R2ú	é etoxi, etiltio ou etilamino
Q.	R20	é uma ligação;
P.	R20	ê (alquilode C^-C^) -NH.

Os Intermediários

Os malonatos intermediários, do invento em consideração, são os intermediários que são feitos reagir com o anticorpo e com a droga. Deste modo, os malonatos intermediários são os precursores do agente de ligação, que une o anticorpo â droga; em conformidade, os malonatos intermediários preferidos assentam as suas estruturas nos conjugados preferidos.

Os intermediários são derivados do ácido malónico, e são preparados de acordo com os processos conhecidos, ou fácilmente imaginados pelos peritos químicos orgânicos , vu1 gares. Um grupo dos compostos serão descritos, não obstante, a titulo de referencia aos grupos variáveis, com a finalidade de se assegurar a interpretação do leitor.

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Diversos subgrupos dos malonatos intermediários são os preferidos, como se seguem. Deve compreender-se que os subgrupos preferidos podem ser combinados,para se formarem outros grupos preferidos mais limitados.

A. R⁴ é alcoxi de C2~C₃;

B. R⁴ é etox i;

C. R é hidroxi ou uma porção de formação de sal;

D. R é um grupo de protecção;

E. R é um grupo de protecção, que é ligado através de um átomo de oxigénio;

F. R é um grupo de protecção, que é ligado através de um átomo de nitrogénio;

G.	Rc	é	um grupo de alcoxi;
H.	R2	é	um grupo de amino ou de alquilamino;
I .	R3	ê	um grupo de activação;
J .	R3	é	um grupo de protecção;
K.	R3	é	hidroxi ou uma porção de formação de sal;
L.	R3	é	N-succinimidi 1 oxi , N-fta 1imidi1oxi ou N-benzotriazo-

1i1oxi;

M.	n	é	de	1 a cerca de	3;
N.	n	é	de	1 a cerca de	6;
0.	n	é	de	cerca de 3 a	cerca	de	8;
P.	n	é	de	cerca de 5 a	cerca	de	8;
Q.	Y	é	-0-

-39R. Y é -NH-;

S. Y ê -NCH₃- ou -NC₂H₅-.

Os Anticorpos Modificados

Os anticorpos modificados são os intermediários para a preparação dos conjugados, os quais são constituídos pelo conjugado total, carecido da droga. Eles são preparados fazendo reagir o malonato intermediário com o anticorpo, de acordo com os processos, descritos a seguir na secção de síntese deste documento.

Os anticorpos modificados preferidos são produzidos pelos grupos variáveis preferidos dos intermediários dos malonatos, feitos reagir com os anticorpos preferidos. Um grupo de anticorpos modificados típicos serã aqui mencionado, para se assegurar a interpretação. Devido à dificuldade na nomenclatura destas moléculas complicadas, os compostos serão identificados pela identidade das suas variáveis dos componentes, de preferencia aos seus nomes químicos. Os anticorpos, aqui mencionados, são conhecidos da técnica imunológica.

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-40TABELA III ~ i CEj I

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-41As Drogas Derivatizadas

As drogas derivatizadas, do invento em consideração, são intermediários, produzidos pela reacção da droga com o malonato intermediário, os quais são empregais para se produzirem os conjugados, por reacção com o anticorpo. Na fórmula definicional precedente, as drogas derivatizadas, as definições amplas e os significados preferidos 1 3 dos grupos R, R , R , Y e n são os que foram estabelecidos no precedente, e deve compreender-se, distintamente, que qualquer droga derivatizada desejada ou preferida, ê preparada esco 1 hendo-se as designações desejadas dos diversos grupos variáveis, particularmente as designações preferidas dos grupos dos malonatos intermediários. As drogas derivatizadas são preparadas por processos debatidos na secção da sin tese, a seguir.

A Síntese

Deve ser compreendido, por quimicos orgânicos,que, em muitas fases da síntese em consideração, tornar-se-á necessário protegerem-se diversas funções reactivas nos compostos de partida e nos intermediários de partida, enquanto as reacções desejadas são levadas a efeito com outras funções reactivas. Depois de as reacções terem terminado, será necessário, em conformidade, removerem-se tais funções protectoras, de um modo geral, Tais fases de protecção e de desprotecção são inteiramente convencionais,na química orgânica, e não será necessário esclarecê-las, com todos os pormenores, nesta Memória Descritiva. Deve observar-se, não obstante, que o compêndio de Greene, sobre os grupos protectores, citado no precedente, esclarece, com todos os pormenores, os grupos protectores, para todas as funções reactivas, verificadas no habitual, incluindo os grupos hidroxi, os grupos tiol, os grupos amino e outros afins, e

-42delinea os processos, para a colocação e paraa remoção de tais grupos protectores.

A Síntese dos Malonatos Intermediários

Um quimico orgânico, vulgarmente especializado, pode preparar qualquer dos malonatos intermediários, a partir dos conhecimentos gerais e da bibliografia vulgar. 0 processo preferido, para os preparar, parte não obstante, de um derivado do ácido malónico, em que o grupo 2 protector do ácido carboxilico, R , é um dos grupos carboxi.

outro grupo carboxi pode ser substituído, do mesmo modo ou de modo diferente. Se for de modo diferente, o grupo não de

2 R deve ser removido mais fácilmente, do que o grupo R . 0 composto de partida é feito reagir com um ha loalcanoato ou com um aminoalcanoato, em que o comprimento da cadeia de alquilo estabelece n grupos de metileno. Um ha 1oa1canoato é empregado, para se fazerem intermediários, em que Y é oxigénio, para se criar a ligação de ésteres. Neste caso, o átomo de halogénio (ou outro bom grupo de partida) encontrase na extremidade da cadeia. Um aminoalcanoato, em que o amino se encontra na extremidade da cadeia, é empregado para produzir os intermediários, em que Y é amino. A parcela de 3 ésteres do alcanoato é um grupo de protecçâo de ácidos,R.

A reacção é levada a efeito, removen2 do-se o grupo não de R do composto de partida, e reagindo o radical do ácido carboxilico, formado, deste modo, com o alcanoato. A reacção é conduzida, com sucesso, por uma redução inicial, por exemplo, pelo emprego de um catalisador de hidrogenação , na presença de ciclohexadieno. Alternativamente, a hidrogenação pode ser empregada, na presença de um catalisador adequado, tal como um catalisador de metal nobre.

-43A reacção pode, também, ser levada a efeito pela decomposição do éstercé não R com uma base forte, especificamente o hidróxido de lítio, num solvente aquoso,tal como a acetona aquosa. Quando o radical do ácido carboxilico se tiver formado, adiciona-se o haloalcanoato, e o malonato intemediário forma-se muito rápicbmente, particularmente na presença de um neutra 1izador de ácidos. Não obstante,quando a reacção se processa com um am i noa lc anoato, o radical do ácido carboxilico deve ser activado, adicionando-se um dos grupos de activação descritos no precedente, antes da reacção, para se formar o malonato.

A reacção precedente produz o malonato intermediário, com um grupo de protecção de ácidos em R , mas carecendo da porção R -CH=. Um tal grupo, um grupo alcoximetileno, é inserido fazendo reagir o primeiro intermediário com um ortoformiato de alquilo adequado, na presença de um ácido de Lewis, tal como o cloreto de zinco. A reacção é levada a efeito a uma temperatura elevada, compreendida entre 100 e 200°, e termina num periodo de poucas horas.

Nas reacções precedentes, bem como nos outros processos descritos a seguir, não se tornam necessárias quantidades em excesso anormais de compostos de partida.Tal como é o caso normal, na quimica orgânica, é aconselhável empregar-se um excesso moderado de reagentes relatiavmente económicos, com afinalicbde de se evitar que outros mais dispendiosos se consumam totahente. Esta regra é especificamente verdadeira, no caso das reacções com os anticorpos eles próprios, as quais são, tipicamente, muito dispendiosas e difíceis de se prepararem e de se purificarem, De um modo geral, não obstante, quantidades de reagentes em excesso podem ser seleccionadas, com a finalidade de se tornar máxima a economia dos processos, tendo presente o custo dos ingredientes, bem como o rendimento do equipamento,e é desnecessário empregarem-se quantidades em excesso, unicamente para se forçar

-44que as reacções se produzam.

Reacções com as Drogas

Os malonatos intermediários são fe_i_ tos reagir com as drogas, sob condições que permitam que o 4 grupo de alcoxi R seja libertado, e que o grupo remanescente de metileno reaja com a função reactiva amino, hidroxi ou tiol. De um modo geral, as reacções são levadas a efeito sob condições suaves, de cerca de 0° a cerca de 50°, em solventes orgânicos, que não reagirão quer com qualquer dos reagentes, quer com as misturas aquosas de tais solventes orgânicos.e, habitualmente, na presença de bases moderadas, tais como os bicarbonatos, os carbonatos e os hidróxidos,de metais alcalinos. As reacções são quantitativas, de um modo geral, e não exigem quantidades em excesso anormais. 0 isolamento do produto pode, não obstante, exigir a cromatografia sob pressão elevada, ou outros procedimentos sofisticados porque é importante, habitualmente, purificar a droga derivatizada, com cuidado considerável. Uma vez que a droga derivatizada é feita reagir com o anticorpo, para se completar o conjugado, qualquer impureza reactiva, que acompanha a droga derivatizada, consome as moléculas reactivas no anticorpo, desperdiçando, por esse motivo, o anticorpo preparado com dispêndio.

Num caso em que a droga tenha múltiplas células reactivas, tais como as nucleosidas, que têm múltiplos grupos hidroxi, é, habitualmente, necessário bloquear os grupos reactivos da droga, dos quais não há o propósito de emprego. Um tal bloqueamento é feito com grupos de protecçâo, como foi debatido, e não apresenta qualquer dificuldade especifica ao químico orgânico.

grupo de protecçâo do ácido carboxi-45lico, R , pode ser removido, do malonato intermédio, quer antes, quer depois, de ele ter reagido com a droga. Se for necessário empregarem-se grupos de protecção na droga, pode bem ser possível, para aqueles grupos, serem amovíveis, sob 3 as mesmas condições que rarovem o grupo de protecção R , obtendo, por esse motivo, um emprego duplo, a partir da fase de desprotecção.

A Síntese dos Anticorpos Modificados

Os anticorpos são feitos reagir com os malonatos intermediários, na forma activada, em que 3 o grupo R do malonato intemediário é um grupo de activação de ácido carboxilico, tal como foi esclarecido no precedente.

Os grupos de activação são aplicados aos ácidos carboxílicos (em que R é hidrogénio), pelo emprego de reagentes de esterificação convencionais, tais como as carbodi imidas, especificamente a dicic1ohexi1carbodiimida. Tais reacções são 3 conduzidas depois de um grupo de protecção de ácidos R ter sido removido por processos adequados, dependentes do grupo de protecção em emprego. As reacções, com os grupos de activação, são levadas a efeito em solventes orgânicos iner tes, tais como o dioxano, o tetrahidrofurano, os hidrocarbonetos clorados e outros afins, e podem ser realizadas a temperaturas moderadas, compreendidas entre cerca de 0 e 50°C.

A preocupação principal, ao escolherem -se as condições, sob as quais se irão fazer reagir o malonatr intemediário com o anticorpo, é manter-se a estabilidade do anticorpo. A reacção deve ser levada a efeito num meio aquo so de uma composição, que não prejudique o anticorpo. Um meio aquoso, particularmente adequado, é uma solução tampão de borato, na qual a concentração do ião de borato esteja compreendida entre cerca de 0,1 e 0,5 molar. Um outro meio

-46aquoso adequado, no qual a reacção deve ser levada a efeito, é uma so 1 ução sa1ina protegida com um tampão fisiológico.0 pH do meio da reacção deve ser ligeiramente básico, compreendido entre 7 e 9. Conquanto o meio da reacção deva ser aquoso, a presença de quantidades pequenas de solventes orgânicos não é prejudicial, e pode ser até muito conveniente. Por exemplo, pode tornar-se muito vantajoso dissolver-se o malonato do intermediãrio numa quantidade pequena do solvente orgânico, por exemplo, a dimetilformamida, o acetonitrilo, o tetrahidrofurano, o dioxano, ou um éter de glicol, e adicionar-se a solução orgânica à solução do anticorpo, no meio aquoso.

De um modo geral, tornar-se-á necessário impulsionar a reacção a uma concentração relativamente baixa, visto que a solubilidade dos anticorpos não é, de um modo geral, grande. Por exemplo, a concentração do anticorpo, está habitualmente, compreendida entre 5 e 25 mg, por ml do meio aquoso.

Como foi descrito no precedente.de 1 a cerca de 10 moles do agente de ligação e do medicamento estão ligades a cada mole do anticorpo. Com a finalidade de se obter aquela proporção de conjugação, torna-se, habitualmente, necessário, empregar-se uma quantidade em excesso do intermediário do agente de ligação. A reactividade dos anticorpos e dos ésteres activos, sob as condições da acilação, é, de um certo modo, variável, mas, de um modo geral, cerca de 5 a cerca de 15 moles do intermediário do agente de ligação, por mole do anticorpo, são empregadas no processo.

Permite-se quea reacção da acilação se processe de alguns minutos a algumas horas, a temperaturas compreendidas entre 0° e cerca de 40°. Obviamente, as temperaturas elevadas podem ser prejudiciais ao anticorpo, e é mais aconselhável accionar-se a temperaturas baixas, visto que part i cu 1 armente , a reacção é, inerentemente, rápich.

Quando o anticorpo derivatizado, tendo os grupos do agente de ligação no seu lugar, estiver preparado, a mistura da reacção pode ser cromatografada pelos processos convencionais, como se revela nos exemplos a seguir, para separar o anticorpo derivatizado do intermediário do agente de ligação não reagido.

A Síntese dos Conjugados

Quando uma droga modificada tiver sido feito e tiver reagido com o anticorpo, como se tratasse da fase final da preparação do conjugado, as observações, respeitantes às precauções pertinentes às reacções com os anticorpos, são totalmente aplicáveis. Os mesmos princípios determinam a escolha da proporção entre a quantidade do anticorpo e a quantidade da droga derivatizada, De um modo gera, as condições da reacção devem ser escolhidas de acordo com a estabilidade do anticorpo, visto que se aceita que a droga tolere quaisquer condições, que o anticorpo tolere.

A droga derivatizada deve ser transO formada na forma activada, em que R é um grupo de activação de ácido carboxilico, como foi descrito no precedente, sob a síntese dos anticorpos modificados.

Por outro lado, quando um anticorpo modificado tiver sido feito, e quando a reacção com o medicamento for a fase final, as precauções, para se assegurar a estabilidade do anticorpo, devem ser observadas.

Em conformidade, o processo preferido

Em conformidade, o processo preferido é o de fazer uma droga derivatizada e fazê-la reagir, como a fase final, com o anticorpo. A reacção do anticorpo modificado, com a droga, deve ser levada a efeito a temperaturas relativamente baixas, tais como cerca de 0° a cerca de 40°, e num meio que o anticorpo possa tolerar. Por exemplo, um meio de reacção, particularmente proveitoso, é o tampão de borato, especialmente um tampão de borato de sódio de 0,1 a 0,5 molar, a um pH compreendido entre cerca de 7 e cerca de 9. A reacção pode, também, ser levada a efeito, não obstante, num tampão de borato, em tampões de fosfato ligeiramente ácidos, em salina protegida com um tampão fisiológico, e em outros idênticos. Quantidades pequenas de solventes orgânicos, no meio da reacção, não são prejudiciais, como foi debatido no precedente, uma vez que os solventes não tenham uma tendência para prejudicar o anticorpo.

Finalmente, o conjugado da droga é purificado e isolado, habitualmente por processos cromatográficos. Pode ser possível eluir-se um conjugado, a partir do meio da cromatografia, nima concentração que seja adequada à administração aos pacientes. Habitualmente, não obstante, o conjugado é purificado pela cromatografia, eluindo-se com qualquer solvente conveniente,mas, com a máxima preferência, com salina protegida com um tampão fisiológico, na concentração máxima, que a sua solubilidade permita. 0 eluente será, como é de costume, liofilizado, para dar origem ao conjugado, numa forma seca e estável, que poderá ser armazenada, com segurança, e embarcada, e, eventualmente,pode ser reconstituída com água estéril, para adni n i stração.

A síntese dos diversos intermediários e conjugados, do invento em consideração, ê esclarecida a seguir, pelas preparações e pelos exemplos, que se seguem.

Preparação 1

Malonato de Etilo de Benziloxicarbonilmetilo

Num balão de fundo redondo, equipado com um agitador, derramaram-se 400 ml de acetona e 50 gramas de malonato de dietilo. Quando a solução se completou, adicionaram-se 200 ml de água, seguidos por 156 ml de uma solução de hidróxido de lítio a 2N. A mistura foi agitada, à temperatura ambiente, durante 30 minutos,e, em seguida,foi concentrada, sob o vácuo, dando origem a um sólido. A ela, adicionaram-se 350 ml de dimeti1su1fóxido , e a mistura foi agitada, enquanto se adicionavam 71,5 gramas de 2-bromoacetato debenzilo. A mistura foi, em seguida, agitada, durante 3 horas, à temperatura ambiente, e foi, em seguida, extraída com 1.000 ml de acetato de etilo com salmoura, e o extracto foi lavado, por duas vezes, com salmoura. 0 extracto foi seco, sobre o sulfato de sódio, foi filtrado e foi concentrado sob o vácuo, de um dia para o outro, dando origem a

76,4 gramas de um liquido viscoso, que foi destilado a 0,1 mm de mercúrio, dando origem a 18,8 gramas do intermediário desejado, na sua forma essencialmente pura.

Preparação 2

Malonato de Etilo de Benzi1oxicarbonilmetiIo

Uma quantidade de 5 gramas, de catalisador de hidrogenação de paládio sobre o carbono, foi suspensa em 60 ml de etanol absoluto, num balão equipado com um agitador, e adicionaram-se-1he 25 gramas de malonato de etilo de benzilo e 16 ml de 1,4-ciclohexadieoo. A mistura foi agitada, durante 1,5 horas, e ela foi, em seguida,filtrada, e o filtrado foi concentrado, sob o vácuo, dando origem a um xarope. Sessenta ml de dimetilformamida e 15,6 ml

-50de trieti1amina foram adicionados ao residuo, seguidos por 17,7 ml de 2-bromoacetato de benzilo, A mistura foi agitada, à temperatura ambiente, durante uma hora, e ela foi, em seguida, extraida com 600 ml de acetato de etilo com salmoura e o extracto foi lavado com uma solução saturada de bicarbonato de sódio, com salroura,com uma solução de ácido citrico a 10%, com salmoura,e, novamente, com o bicarbonato de sódio saturado e com salmoura. 0 extracto lavado foi seco sobre o sulfato de magnésio, foi filtrado e foi concentrado sob o vácuo, dando origem a 28,2 gramas do intermediário desejado puro, que era o material 1-ponto, pela cromatografia de camada fina, eluindo-se com o acetato de eti1 o : hexano, a 1:1, Rf = 0,55. A espectroscopia de massa deu um espectro de massa de 280.

Preparação 3

2-Etoximeti I enomaIonato de Etilo de Benzi 1 oxicarboniI metilo

Dez gramas do produto da Preparação 1 foram dissolvidos em 11,1 ml de anidrido acético, num balão equipado com um agitador, e adicionaram-se-lhes 7,8ml de trietilortoformiato. A mistura foi aquecida, durante 6,5 horas, a 140 a 150°, e os produtos voláteis foram,em seguida , retirados , sob o vácuo. 0 residuo foi dissolvido em 11,1 ml de anidrido acético e 7,8 ml de trietilorto/formiato, e adicionaram-se-1hes 50 mg de cloreto de zinco. A mistura foi, em seguida, aquecida sob o refluxo, a 140 a 150°, durante 16 horas,e, em seguida, foi arrefecida e extraida em 600 ml de acetato de etilo com salmoura.e foi lavada com dois lotes de salmoura. 0 extracto lavado foi seco sobre sulfato de magnésio, foi filtrado e foi concentrado, o residuo foi dissolvido numa quantidade minima de acetato

de etilo, e a solução tornou-se turva com o hexano. A solução foi coada através de um funil cheio de gel de silica, que foi eluida com 1 litro de acetato de etilo, a 10% em hexano,e, em seguida.com 1 litro de acetato de etilo a 20%.

produto desejado foi obtido em dois litros adicionais de acetato de etilo a 20% em hexano, que foi concentrado sob o vácuo, dando origem a 4,9 gramas de um xarope incolor,que era o produto desejado, essencialmente puro.

Análise calculada: C 60,71; H 5,99;

Verificada: C 60,98; H 6,03.

Preparação 4

2-Etoximeti lenomalonato de Etilo de Carboximetilo

Um grama de catalisador de hidrogenação de paládio sobre o carvão foi suspenso em 15 ml de etanol absoluto, num balão equipado com um agitador,e a ele se adicionou uma solução de 4,9 gramas do produto da Preparação 3, em 10 ml de etanol, seguida por 2,8 ml de 1,4-ciclohexadieno. A mistura foi agitada.durante 5 minutos,e foi, em seguida, aquecida até 45°, temperatura em que ela se tornou exotérmica. Reduziu-se,então, o calor, e a mistura foi agitada durante 45 minutos, instante em que ela atingiu a temperatura ambiente. A mistura foi, em seguida,fi1trada, e foi concentrada sob o vácuo, obtendo-se 3,6 gramas de um liquido amarelo, que foi identificado pela espectroscopia de massa, como o produto intermediário desejado, com o espectro de massa de 246.

2-Met i1enomalonato	Preparação 5 de etilo de carboximetilo de aduto de
doxorub i c i na.

produto desta preparação é o aduto, em que se junta a doxorubicina, através do grupo amino do anel de daunosamina, ao miileno do malonato intermediário.

Num balão de fundo redondo, derramaram-se 134 mg de cloreto de doxorubicina e 8,5 ml de dimeti1 formamida, e adicionou-se 1 ml de água, para se dissolver o medicamento. Um lote de 264 mg do produto da Preparação 4 foi adicionado, como uma solução em 0,5 ml de dimetilformamida, e a mistura foi agitada, durante 10 minutos. Em seguida,uma solução de 115 mg de bicarbonato de sódio, em 1,25 ml de água, se adicionou, e a mistura foi agitada, durante 2 horas, â temperatura ambiente. Em seguida, retiraram-se, sob o vácuo, os produtos voláteis, e o residuo foi dissolvido numa quantidade mínima de um tampão de acetato de sódio a O,1M, a pH 5,4. Aplicou-se a solução a uma coluna de cromatografia flash de C18(J.T. Baker, Phi11ipsburg ,

N.J), de 1,75x6 cm, e a coluna foi eluida com o tampão de acetato, contendo quantidades crescentes de metanol. 0 produto desejado foi obtido em parcelas, contendo 50% e mais de metanol, e as parcelas, que continham o produto, foram reunidas e concentradas sob ovácuo. 0 residuo foi dissolvido em alguns ml de água e foi aplicado â mesma coluna,que foi eluida com 40 ml de água, em seguida com 80 ml de metanol aquoso a 50%,e, em seguida,com 20 ml de metanol. 0 produto desejado foi, nas parcelas.eluido com metanol a 50%, e essas parcelas foram reunidas e concentradas sob o vácuo.

residuo foi dissolvido numa quantidade minima de metanol, ad i c i onou-se-1 he um volume de cinco vezes de benzeno, e a solução foi congelada e liofilizada, de um dia para o outro,

dando origem a 146 mg de um sólido alaranjado, com o espectro de massa de 744, pela espectroscopia de massa de bombardeamento atómico rápido. 0 produto revelou-se ser puro, pela análise de cromatografia liquida de elevada execução, empregando-se uma coluna de embalagem radial, de 5 ml por minuto, de metanol aquoso a 70%,contendo 3% de acetato de amónio.

Preparação 6

Aduto de doxorubicina de 2-Metilenomalonato de N-succinimidoxicarbonilmetilo de etilo.

Num balão de fundo redondo, equipado com um tubo de secagem e com um agitador, derramaram-se 17,6 mg do produto da Preparação 5, dissolvidos em 1,5 ml de dimetilformamida seca. A solução foi arrefecida até -5°, e adicionaram-se-1he 5,2 pl de N-metilmorfo 1ina ,em 0,1 ml de dimeti 1 formamida seca. A mistura foi agitada a -5°,durante 5 minutos, e, em seguida,adicionaram-se-1he 6,14 ml de c1oroformiato de isobutilo, em 0,1 ml de dimeti1 formamida seca, e a mistura foi agitada durante mais 30 minutos,à temperatura constante. Em seguida, adicionaram-se-1he 5,45 mg de N-hidroxisuccinimida , em 0,1 ml de dimetilformamida seca, e a mistura foi agitada, durante 20 horas, enquanto ela se aquecia até a temperatura ambiente. Ela foi, em seguida, concentrada, sob o vácuo, dando origem a um resíduo vermelho, que foi dissolvido num volume mínimo de dic1orometano, e foi aplicado a uma coluna de gel de silica, de 0,75 x 4 cm, equilibrada com dic1orometano. A coluna foi eluida com 50 ml de dic1orometano,e, em seguida.com isopropanol a 10%,em diclorometano. 0 segundo eluente foi concentrado sob o vácuo, e o resíduo foi dissolvido num volume mínimo de isopropanol, ao qual se adicionou uma quantidade pequena de benzeno. A solução foi congelada e 1 iofi1izada,dando origem a 15,9 mg do produto desejado, com o espectro de massa de 742. A idénti-54-

dade foi confirmada pela espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR), em CDCl^, num instrumento de 300 mHz, que revelou vestígios de N-hidroxisuccinimida, em 2,8 partes por milhão.

Exemplo 1

Conjugado do anticorpo 007B, com o aduto de doxorubicina,de

2-meti lenomalonato de etilo de carboniImeti1 o.

anticorpo 007B é produzido por um hibridoma, que é uma subclone, derivada do hibridoma, que produz o anticorpo KS1/4, que foi discutido no precedente, na secção de anticorpos, deste documento. Uma parcela de 508 /ul, de uma solução contendo 19,7 mg/ml daquele anticorpo, num tampão de borato de sódio a 0,34 M, a pH 8,6, foi derramada num frasco pequeno de 3ml, equipado com um agitador. Um lote de 0,56 mg do produto da Preparação 6, em 56,4 /jl de dimeti lformamida seca, foi adicionado à solução do anticorpo, à temperatura ambiente, e foi agitado, durante duas horas. A mistura foi, em seguida , centrifugada, à temperatura ambiente,para lançar uma pastilha vermelha, e o flutuante foi aplicado a uma coluna de Sephadex G-25M, de 1,75 x 25 cm, de (Pharmacia, Inc., Piscataway.N.J.) .equilibrada com salina protegida com um tampão de fosfato fisiológico. A coluna foi eluida com o mesmo tampão, e o primeiro pico da coluna foi coligido. Aquela parcela foi filtrada, através de um filtro de Millex-GV (Mi 11 i pore , Bedford , HA) de 0,22(U, e foi arrecadada, a 4°,durante três dias. Ela foi,em seguida, filtrada, novamente,da mesma maneira, e avaliada pela espectroscopia de ultravioletas (U.V.), que revelou uma concentração de anticorpo de 1,54 mg/ml, indicando uma recuperação de 7,6 mg do conjugado. A proporção da conjugação foi de 2,2 moles do medicamento, por mole do anticorpo.

-55Exemplo ΙΑ.

Conjugado do anticorpo 007B, com o aduto de doxorubicina,de

2-metilenomaIonato de etilo de carboni lmeti lo h-- 0 processo do Exemplo 1 foi seguido, partindo-se de 7,5 mg do anticorpo e 1,0 mg do produto da Preparação 6. 0 cmjugado recuperado totalizou 4,94 mg, com uma proporção de conjugação de 3,1 moles por mole,como ^! uma solução de concentração de 1,10 mg/ml.

Exemplo 2

Conjugado do anticorpo HB21, com o aduto de doxorubicina ,de 2-meti1enoma1onato de etilo de carboni lmeti 1 o anticorpo HB21 é produzido pelo hibridoma, identificado como ATCC HB21. Uma parcela de

17,5 mg do anticorpo HB21 , em 0,875 ml do tampão de borato, mencionado no Exemplo 1, foi derramada num frasco pequeno de 3 ml, equipado com um agitador, e a ela se adicionaram 1,3 mg do produto da Preparação 6, dissolvidos em 97,2 ul de dimeti 1 formamida seca. A mistura da reacção foi agitada, e o conjugado foi isolado, como foi descrito no Exemplo 1, obtendo-se 14,9 mg do conjugado, numa concentração de 2,57 mg/ml, tendo uma proporção de conjugação de 3,8.

Exemplo 2A.

Conjugado do anticorpo HB21, com o aduto de doxorubicina,de

2-meti 1 enoma1onato de etilo de carboni lmeti lo.

Seguiu-se o processo do Exemplo 2, partindo-se de 12 mg do anticorpo e de 1,30 mg do produto da Preparação 6. A solução do produto filtrado foi concentrada pela diálise de vácuo, obtendo-se 0,82 ml da solução, contendo 3,25 mg do conjugado, a uma proporção deconjugação de 4,5 moles por mole.

Exemplo 2B.

Conjugado do anticorpo HB21, com o aduto de doxorubicina,de 2-rnetilenomalonato de etilo de carbonilmetilo.

Seguiu-se o processo do Exemplo 2A, partindo-se de 12 mg do anticorpo e de 2,60 mg do produto da Preparação 6. 0 produto foi 0,72 ml da solução, contendo 1,37 mg do conjugado, a uma proporção de conjugação de 5,6 moles, por mole.

Exemplo 3

Conjugado do anticorpo L4KS, com o aduto de doxorubicina,de

2-metilenomalonato de etilo de carbonilmetilo.

anticorpo L4KS, tal como foi descrito por Starling et a 1., J. Cell. Biochem. Supp. 11B.1982 (1987) foi dialisado num tampão de borato de sódio de 0,34M a pH 8,6, estabelecendo 17,5 mg do anticorpo, em 0,875 ml do tampão. A ele se adicionaram 1,3 mg do produto da Preparação 6, em 97,2 μ 1 de dimeti1formamida seca. A reacção foi levada a efeito, e o produto foi isolado.como ficou descrito no Exemplo 1, dando origem a 11,6 mg do conjugado, a uma concentração de 2 mg por ml. A proporção da conjugação foi de 2,6 moles, por mole.

Exemplo 3A

Conjugado do anticorpo L4KS,com o aduto de doxorubicina ,de 2-meti1enoma1onato de etilo de carbonilmetilo.

Repetiu-se o processo do Exemplo 3, partindo-se de 10 mg do anticorpo e de 0,59 mg do produto da Preparação 6. A solução do produto foi concentrada pela diálise do vácuo, obtendo-se 1,16 ml de solução, contendo 4,03 mg do conjugado, a uma proporção de conjugação de 2,9.

-58Preparação 7

Produção de anticorpos L/1C2.

Frascos pequenos de hibridomas L/1C2 congelados adquirem-se na American Type Culture Collection, sob o número de aquisição de HB9682. As células viáveis são recuperadas por descongelação do conteúdo de um frasco pequeno, num banho de água a 37°C, enquanto se anda à roda com o frasco. A suspensão da célula é, em seguida,diluída, numa proporção de 1:2, com uma solução de sal equilibrada (Grand Island Biological Company (GIBCO), Staley Road 3175, Grand Island,Nova Iorque 14072) e a suspensão é centrifugada por meio de uma camada de soro, para separar as células do meio criogénico. 0 sobrenadante é aspirado, e as células, na pastilha das células, são suspensas no meio da cultura (Ventrex HL-1, Ventrex Laboratories,Port1 and,ME ), acrescido com o soro de vitela fetal, 2mM L-glutamina (GIBCO) e de 50 yug/ml de sulfato de gentamicina (GIBCO),em balões de cultura de tecidos T75, em dióxido de carbono a 5%, a 37¾. Os sobrenadantes de culturas muito de perto confliaites são reunidos, e as células residuais são removidas por centrifugação. 0 anticorpo é purificado do sobrenadante livre das células, passando-o sobre uma coluna de Sepharose de Proteínas A(Farmácia). 0 anticorpo liga-se à coluna, e o meio da cultura é lavado livremente, em fosfato de sódio a 0,01 M, a pH 8,0. 0 anticorpo é, em seguida,e1uido da coluna, com um tampão de fosfato de sódio a 0,lM, a pH 3,5. 0 anticorpo eluido é, imediatamente, neutralizado com um tampão de Trizma, a 1 M (Sigma, S. Luis,M0), a pH 7,4 e é dialisado e concentrado num dialisador de vácuo (Bio-Molecu1 ar Dynamics,Beaverton,0R), contendo fosfato de sódio a 0,01M, pH 7,4,e cloreto de sódio a 0,15M. As composições dos anticorpos são esterilizadas por filtração, através de poros de 0,2 yum, e são armazenadas, a 4°C, até o seu empreho.

Exemplo 4

Conjugado do anticorpo L/1C2, com o aduto de doxorubicina,de

2-metilenoma1onato de etilo de carboniImeti lo

Um lote de 10,1 mg do anticorpo L/1C2, em 0,94 ml de tampão de borato de sódio a 0,34M,foi combinado com 0,85 mg do produto da Preparação 6, em 54,7 μΐ de dimeti 1 formamida seca. A mistura da reacção foi agitaaa, à temperatura ambiente,durante 1,5 horas, e o produto foi, em seguida, isolado, como foi descrito no Exemplo 1, e a solução resultante foi dialisada no vãcuo, durante cerca de 16 horas, a 4°C, frente a 5 litros de salina protegida com fosfato tampão fisiológico, dando origem a 9,16 mg do conjugado, a uma concentração de 5,33 mg/ml. A proporção da conjugação era de 1,7 moles, por mole.

Exemplo 4A,

Conjugado do anticorpo L/1C2, com o aduto de doxorubicina,de

2-meti 1 enomaIonato de etilo de carboni Imetilo.

Repetiu-se o processo do Exemplo 4, omitindo-se a fase da diãlise, e partindo-se de 24 mg do anticorpo e de 1,75 mg do produto da Preparação 6.Um lote de 8,56 mg do conjugado foi recuperado, em 2,69 ml da solução a uma proporção da conjugação de 2,8.

Preparação 8

Malonato de etilo de benziloxicarbonilpentilo

Num balão de fundo redondo, equipa_ do com um agitador, derramaram-se 200 ml de acetona, 100 ml de água e 25,3 gramas de malonato de dietilo. Adicionaram-se, à solução,78,9 ml de uma solução de hidróxido de lítio a 2N, durante mais de 5 minutos. Depois de 75 minutos de agitação, à temperatura ambiente, os produtos voláteis foram rerovidos, e o residuo foi suspenso em 35 ml de dimetilformamida seca.

A ele se adicionaram 38,3 gramas de 6-bromohexanoato de benzilo, e a mistura foi agitada, a 55°, durante 20 horas. A mistura foi, em seguida , arrefecida até a temperatura ambiente, e foi extraída com 1.000 ml de acetato de etilo, com salmoura. 0 extracto foi lavado, por duas vezes, com salmoura,e foi, então, concentrado sob o vácuo. 0 residuo liquido foi derramado em gel de sílica, foi lavado com 500 ml de heptano e foi eluido com 1 litro de acetato de etilo a 10%,em heptano. Em seguida, a elução com 1 litro de acetato de etilo a 15%, em hexano, retirou o produto desejado,do qual 22 gramas foram obtidas por concentração sob o vácuo, com o espectro de massa de 336.

Prqaração 9

2-Metilenomalonato de etilo de benzi1oxicarboni1penti1 o.

Um lote de 15 gramas do produto da Preparação 8 derramou-se num balão equipado com um condensador e com um agitador, e der ramaram-se nele, 8,4 ml de trieti1ortoformiato e 8,6 ml de anidrido acético. Em seguida, adicionaram-se 48 mg de cloreto de zinco, e a mistura foi agitada, durante 16 horas, a 125°, θ, em seguida, durante

-613,5 horas, a 150 a 160°. Ela -foi, em seguida, arrefecida e foi extraida em 600 ml de acetato de etilo com salmoura. 0 extracto foi lavado, por duas vezes,com salmoura,e foi concentrado sob o vácuo. 0 residuo liquido foi lavado com 500ml de hepatno, com 1.500 ml de acetato de etilo a 15% em heptano, e com 500 ml de acetato de etilo a 20% em heptano. Em seguida, a elução,com 500 ml de acetato de etilo a 40% em heptano isolou o produto desejado,numa quantidade de 2,78 gramas,com o espectro de massa de 392.

Preparação 10

2-Meti1enoma1onato de etilo de 5-carboxipentilo.

Num frasco pequeno, equipado com um agitador, derramou-se 0,49 grama de um catalisador de paládio sobre carvão a 10%, em 2 ml de etanol absoluto, 1 grama do produto da Preparação 9 e 1 ml de 1,4-ciclohexadieno. 0 frasco pequeno foi encapsulado e foi agitado, durante 5 minutos, a 60°, e foi, em seguida, arrefecido até a temperatura ambiente, e foi agitado, durante 30 minutos ,mais. Ele foi, em seguida, filtrado, e a solução foi concentrada sob o vácuo. 0 residuo liquido foi dissolvido numa quantidade minima de acetato de etilo, e foi tornada turva com heptano, e foi, em seguida, purificado pela cromatografia sobre gel de silica, lavando-se, em primeiro lugar, com 250 ml de acetato de etilo a 10% em heptano,e, em seguida, com 250 ml de acetato de etilo a 30% em heptano. Um lote de 500 ml de acetato de etilo a 50% em heptano eluiu 0,56 grama do produto desejado, com o espectro de massa de 303.

Preparação 11

Aduto de doxorubicina de 2-metiIenoma1onato de etilo de 5-carboxipentilo malonato intermediário foi aqui liga do a uma molécula de doxorubicina, da mesma maneira que o produto da Preparação 5 precedente. A reacçao foi levada a efeito da mesma maneira que a da Preparação 5 precedente, partindo-se de 142 mg de hidrocloreto de doxorubicina, de 159 mg do produto da Preparação 10 e de 75,5 mg de bicarbonato de sódio. 0 produto foi isolado como foi descrito na mesma Preparação, eluindo-se o produto da coluna com 60 ml denetanol a 70% em tampão de acetato. Aquele produto foi, além disso, purificado, como foi descrito na Preparação 5, obtendo-se 95 mg de um produto sólido vermelho,com os espectros de massa de 403 e 398.

Preparação 12

Aduto de doxorubicina de 2-metilenomalonato de N-succinimidoxicarboni1penti1 o de etilo

Um lote de 12,5 mg do produto da Preparação 11 foi feito reagir com 3,6 mg de N-h i drox i ssuc i n_i mida, na presença de N-metilmorfo 1ina e de c1oroformiato de isobutilo, essencialmente como revelado na Preparação 6,para se obterem 9,7 mg do produto desejado, com o espectro de massa de 896.

Exemplo 5

Conjugado do anticorpo 007B, com o aduto de doxorubicina de 2-metilenomalonato de etilo de carboni1penti1 o

Duas reacções de conjugação foram levadas a efeito. Em cada caso, o anticorpo 007B foi fornecido como uma parcela db 0,862 pl de solução em tampão de bora^ to de sódio a 0,34M, a pH 8,6, contendo 17,4 mg/ml do anticorpo.

1. Adicionou-se um lote de 1,17 mg do produto da Preparação 12, dissolvido em 95,8 μ1 de dimeti1formamida seca.

2. Adicionou-se um lote de 1,79 do mesmo intermediário dissolvido em 95,8 p1 de dimeti1 formamida seca.

Ambas as misturas da reacçao foram agitadas, à temperatura ambiente,durante 1,5 horas, e foram, em seguida, cromatografadas sobre colunas de Sephadex G-25M, de 1,75 x 25 cm. As parcelas, que continham o produto, foram.em cada caso, reunidas, foram filtradas através de filtros de Millex-GV 0,22 μ, e foram armazenados, a 4°, durante 16 horas. Os produtos foram, em seguida, filtrados novamente, e foram avaliados pela espectrofotometria de ultravioletas.

1. A recuperação foi 11,1 mg do conjugado, a uma concentração de 1,75 mg/ml. A proporção da conjugação foi de

3,8 moles por mole.

2. A recuperação foi 6,7 mg, a uma concentração de 1,33 mg/ml, com uma proporção de conjugação de 4,5 moles por mole.

-64Preparação 13

2-(4-Desacetil-23-desmetoxivinblastina-23-hidrazo)metilenomalonato tfe etilo de carboxipentilo

Um lote de 60,2 mg de sulfato de 4-desaceti1-23-desmetoxivinblastina-23-hidrazina foi dissolvido em 1 ml de dimeti1 formamida seca,e a ele se adicionaram 48,6 mg do produto da Preparação 10, dissolvido em 0,5 ml de dimetilformamida seca. A mistura foi agitada,à temperatura ambiente, durante 16 horas, e os produtos voláteis foram, em seguida,removidos,sob o vácuo. 0 resíduo foi dissolvido numa quantidade minima de metanol, e a água foi adicionada para se obter uma solução em metanol aquoso a 15%. A solução foi aplicada a uma coluna de cromatografia flash de C18, de l,5x 6 cm, equilibrada com metanol a 10% em água. A coluna foi eluida com metanol aquoso concentrado cada vez mais, e notou-se que o produto eluia em parcelas, contendo metanol a 60% e metanol a 100%. As parcelas, que continham o produto, foram reunidas e foram concentradas sob o vácuo, e o resíduo foi dissolvido numa quantidade pequena de metanol. Adicionou-se uma grande quantidade de benzeno' (100 ml),e a solução foi congelada e 1iofi1izada,para se obterem 46 mg do intermediário desejado, com o espectro de massa de 952.

Preparação 14

2-(4-Desacetil-23-desmetoxivinblastina-23-hidrazo)metilenomalonato, de N-succinimidoxicarboni1penti1 o de etilo

Um lote de 36,9 mg do produto da Preparação 13 foi dissolvido em 2 ml de dimeti 1 formamida seca, e foi feito reagir com 7,56 mg de N-hidroxissuccinimida,na presença de 10,8 μ 1 de N-meti lmorfo 1ina e de 8,5 μ 1 de cloro-

formiato de isobutilo em dimetilformamida seca, a -20°,durante 5 minutos, e a mistura foi, em seguida, aquecida, gradualmente, até a temperatura ambiente e, em seguida, foi aquecida até 40°, durante 30 minutos. Ela foi, em seguida, arrefecida até a temperatura ambiente e foi agitada durante 16 horas,e os produtos voláteis foram removidos sob o vácuo. 0 residuo foi dissolvido em dic1orometano e foi aplicado a uma coluna de gel de silica de 0,75 x 6 cm. A coluna foi eluida com 20 ml de dic1orometano,e, em seguida, com 30 ml de acetato de eti1 o :dic1orometano, a 1:1, que eluiu o produto.0 eluente foi concentrado sob o vácuo, dando origem a 28,3 mg do produto desejado, que foi identificado pela ressonância magnética nuclear, revelando vestígios de N-hidroxissuccinimida, a 2,88 partes por milhão.

Exemplo 6

Conjugado do anticorpo L4KS, com 2-(4-desacetil-23-desmetoxivinb 1 astina-23-hidrazo)metilenoma1onato de etilo de carbonilpent i 1 o .

Duas conjugações foram levadas a efeito. Em cada caso, o anticorpo L4KS foi fornecido como 625 μ 1 de solução, contendo 16 mg/ml de tampão de borato de sódio a 0,34M a pH 0,6.

1. Um lote de 0,75 mg do produto da Preparação 14, dissolvido em 51 /j1 de d imet i 1 f ormam i d a seca, foi adicionado à solução do anticorpo.

2. Um lote de 1,2 mg do mesmo intermediário, dissolvido em 51 ^jl de dimetilformamida seca, foi adicionado.

Ambas as misturas da reacção foram agitadas, à temperatura ambiente.durante 1,5 horas, e foram, em seguida, centrifugadas,para se separar uma pastilha branca. Os sobrenadantes foram cada um cromatografados sobre colunas de Sephadex G-25M, de 1,75 x 25 cm, equilibradas com salina protegida com tampão de fosfato fisiológico , e foram eluidas com o mesmo tampão. Os lotes, que continham o produto, de cada coluna, foram filtrados através de filtros de Millex-GV 0,22 /j , e foram armazenados a 4°, durante 17 dias. Eles foram, em seguida, filtrados, novamente,da mesma maneira, e foram avaliados pela espectrofotometria de ultravioletas .

1. A recuperação foi de 6,3 mg de conjugado, a uma concentração de 1,26 mg/ml, com uma proporção de conjugação de

2,5 moles por mole.

2. 0 produto foi 4,5 mg de conjugado, a uma concentração de 0,68 mg/ml, com uma proporção de conjugação de 3,6 moles por mole.

Exemplo 6A.

Conjugado do anticorpo L4KS, com 2-(4-desaceti1-23-desmetoxivinblastina-23-hidrazo)metilenomalonato de etilo de carbonilpent i lo

Repetiu-se o processo do Exemplo 6, partindo-se de 595 mg do anticorpo e de 57,9 mg do produto da Preparação 14. A solução do produto foi concentrada pela diálise do vácuo, e o produto concentrado foi novamente filtrado com esteri 1 ização,obtendo-se 17,8 ml da solução contendo 125 mg do conjugado, a uma proporção de conjugação de 2,8 moles por mole.

Exemplo 7

Conjugado do anticorpo 007B, com 2-(4-desaceti1-23-desmetoxivinbIastina-23-hidrazo)metilenomalonato de etilo de carbonilpent ilo

Três reacções de conjugação foram levadas a efeito. Em cada caso, 10 mg do anticorpo 007B foram

fornecidos	cuno	0,5 ml	de solução em tampão de borato	de	sódio
a 0,34M , a	PH	8,6.
1. Um lote 14 foi adicionado,	de em	0,89 mg do intermediário da Preparação 41 ul de dimeti1 formamida seca.
2.	Um	1 ote	de	1,20 mg do mesmo intermediário	foi	ad i -

cionado em 41 /j 1 de d imeti lformamida seca.

3. Um lote de 1,49 mg do mesmo intermediário foi adicionado em 41 μ 1 de dimeti1 formamida seca.

Todas as três misturas de reacçao foram agitadas, à temperatura ambiente, durante 1,5 horas, e foram, em seguida, centrifugadas, e o flutuante foi cromatograf ado , como foi descrito no Exemplo 5. Os lotes, que continham o produto, foram reunidos e foram avaliados pela espectrofotometria de ultravioletas.

1. A recuperação foi de 5,95 mg do conjugado, a uma concentração de 1,35 mg/ml, com uma proporção de conjugação de 3,0 moles por mole.

2. A recuperação foi de 3,76 mg do conjugado, a uma concentração de 0,76 mg/ml, com uma proporção de conjugação de 3,6 moles por mole.

3. A recuperação foi de 1,54 mg, do conjugado, auma concentração de 0,34 mg/ml, com uma proporção de conjugação de 6,1 moles por mole.

Exemplo 7A.

Conjugado do anticorpo 007B, com 2-(4-desaceti1—23-desmetoxivinblastina-23-hidrazo)metilenomalonato de etilo de carbonilpmt i lo

Repetiu-se o processo do Exemplo 7, partindo-se de 396 mg do anticorpo e de 35,6 mg do produto da Preparação 14. 0 produto foi dialisado no vácuo e foi filtrado com esterilização, obtendo-se 39,4 ml da solução contendo 307 mg do conjugado, a uma proporção de concentração de 2,6 moles por mole.

Exemplo 8

Conjugado do anticorpo 92.27, com 2-(4-desacetil-23-desmetoxivinb 1 astina-23-hidarzo )metiIenoma1onato de etilo de carbonilpent i1 o.

anticorpo 9.2.27 foi preconizado por Bumol e Reisfeld, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 79, 1245 (1982). Três reacções de conjugação, com aquele anticorpo, foram levadas a efeito, partindo-se, em cada caso, de 10 mg do anticorpo, na modalidade de 0,36 ml de solução em tampão de borato de sódio a 0,34M, a pH 8,6.

1. Um lote de 0,6 mg do intermediário da Preparação 14, em 41 μ 1 de dimeti1 formamida seca, foi adicionado.

2. Um lote de 0,89 mg do mesmo intermediário foi adici£ nado, em 41 /j1 de dimeti lformamida seca.

3. Um lote de 1,2 mg do mesmo intermediário foi adicionado em 41 /jl de dimetilformamida seca.

As misturas da reacçao foram agitadas, foram centrifugadas e foram cromatografadas, como ficou descrito no precedente, no Exemplo 7, e os produtos foram avaliados pela espectrofotometria de ultravioletas.

1. A recuperação foi de 5,2 mg do conjugado, a uma concentração de 0,95 mg/ml, com uma proporção de conjugação de 3,4 moles por mole.

2. A recuperação foi centração de 0,32 mg/ml, de 6,1 moles por mole.

de 1,5 mg do conjugado, a uma concom uma proporção de conjugação

3. A centração 7,3 moles recuperação foi de 0,16 mg/ml, por mole.

de 0,6 mg do conjugado, a uma concom uma proporção de conjugação de

Exemplo 9

Conjugado do anticorpo L/1C2, com 2-(4-desaceti 1-23-desmetox£ vinb I a stina-23-hidrazo)meti1enoma1onato de etilo de carbon i1pent i 1 o

Um lote de 2,9 ml de solução, contendo 43 mg do anticorpo L/1C2, em tampão de borato de sódio a 0,34M, a pH 8,6, foi combinado com 238 de solução,contendo 10,7 mg/ml do intermediário da Preparação 14, em dimetilformamida seca. A reacçao foi levada a efeito, e o pro-70-

duto foi isolado e avaliado, como ficou descrito no Exemplo 7 precedente. A recuperação foi de 9,35 do conjugado,a uma concentração de 0,69 mg/ml, com uma proporção de conjugação de 2,6 moles por mole.

Preparação 15

N-(2-Benziloxicarbonilmeti1)malonato de etilo

Num balão de 100 ml, derramaram-se 2 gramas de catalisador de hidrogenação de paládio sobre o carvão a 5%, 10 gramas de malonato de etilo de benzilo, e

8,6 ml de 1,4-cic 1 ohexadieno. A mistura foi agitada, à temperatura ambiente, e a reacção tornou-se exotérmica,depois de 40 minutos. Continuou-se a agitação, até que a mistura da reacção se tivesse arrefecido novamente até à temperatura ambiente, e a mistura foi, em seguida, filtrada e o solvente foi removido, sob o vácuo, do filtrado.

residuo xaroposo resultante foi dissolvido numa quantidade mínima de acetato de etilo, e foi coado através de um funil de 150 ml de gel de silica.

gel de silica, foi, em seguida, lavado com 400 ml de acetato de etilo a 20% em hexano,e, em seguida, o intermediário cfesejado foi eluido com 400 ml de acetato de etilo. Oeluente foi concentrado sob o vácuo, dando origem a 5,48 gramas do intermediário, como um liquido viscoso.

intermediário precedente foi dissolvido em 100 ml de dimeti1 formamida seca, e 4,77 gramas de N-hidroxissuccinimida foram adicionados e dissolvidos. Em seguida, adicionaram-se, lentamente e parcela por parcela, 8,56 gramas de dicic1ohexi1carbodiimida , e a mistura da reacção tornou-se exotérmica. Ela foi, em seguida, agitada, à temperatura ambiente e de um dia para o outro,e

-71fõi filtrada. Um lote de 8,95 gramas de cloridrato do ácido

3-aminopropiónico de benzilo foi adicionado e foi dissolvido no filtrado, e, em seguida, adicionaram-se 4,56 ml de N-metiImorfo 1ina. A mistura foi agitada, à temperatura ambiente, durante 1,5 horas, e a mistura foi, em seguida, extraída em acetato de etilo, com salmoura. 0 estrato orgânico foi, em seguida, lavado com o ácido cítrico aquoso a 10%, com salmoura, com o carbonato de sódio aquoso saturado, e novamente com salmoura, e foi seco, foi filtrado e foi concentrado sob o vácuo. 0 residuo xaroposo foi dissolvido em acetato de etilo, e adicionou-se o hexano, até que a solução se tornasse turva. Ela foi, em seguida, coada através de gel de sílica, e o gel de silica foi lavado com 200 ml cada de acetato de etilo a 10%, a 20% e a 30%, em hexano. Em seguida, o produto desejado foi eluido com 600 ml de acetato de etilo a 40% em hexano. A solução do produto foi concentrado sob o vácuo, dando origem a 5,05 do produto desejado,como um liquido viscoso amarelo pálido. Ele foi identificado, pela espectroscopia de massa, relevando um ião molecular de peso 293. A sua análise elementar foi o que se segue.

Teórica: C 61,42 H 6,57 N 4,78;

Verificada:C 61 ,21 H 6,31 N 4,76

-72Preparação 16

N-(2-Benziloxicarboniletil)-2-etoximetilenomalonamato de etilo

Um lote de 5,05 gramas do produto da Preparação 15 foi dissolvido em 10,7 ml de anidrido acético, e adicionaram-se-lhe 7,45 ml de trieti1ortoformiato. A mistura, adicionaram-se, a seguir, 80 mg de cloreto de zinco, e a mistura foi agitada sob o refluxo, a 140 a 150°, durante 16 horas. Ela foi, em seguida, arrefecida, até a temper^ tura ambiente, e os produtos voláteis foram removidos sob o vácuo. 0 resíduo foi extraído com o acetato de etilo e salmoura, e o estrato orgânico foi lavado com salmoura,foi seco, foi filtrado e foi concentrado sob o vácuo. 0 resíduo foi dissolvido numa quantidade mínima de acetato de etilo, e a solução tornou-se turva, pela adição de hexano. Ela foi, em seguida, coada através de gel de silica, e o gel de silica foi eluido com hexano, contendo quantidades crescentes de acetato de etilo. Os lotes, que continham o produto, obtidos com 30% e 50% de acetato de etilo, foram reunidos e foram concentrados sob o vácuo, dando origem a 3,4 gramas do produto desejado, tendo um ião molecular, na espectroscopia de massa, de peso 349.

Preparação 17

N-(2-Carboxieti1)-2-etoximeti1enoma1onamato de etilo

Um lote de 1,64 gramas, do produto da Preparação 16, foi adicionado a 10 ml de etanol e a 0,5 grama de catalisador de hidrogenaçao de paládio sobre carvão a 5%. Adicionou-se-1he um lote de 0,89 ml de 1,4-ciclohexadieno, e a mistura foi aquecida ao refluxo, foi

-73arrefecida e foi agitada, durante 1 hora, à temperatura ambiente. Ela foi, então, aquecida novamente, foi arrefecida e foi agitada, durante mais uma hora, e, em seguida, a mistura foi filtrada e o filtrado foi concentrado sob o vácuo.

residuo foi triturado com o acetato de etilo, e os sólidos foram reunidos por filtração, e foram lavados com éter de dietilo, dando origem a 0,61 grama do produto desejado, exibindo iões moleculares de espectroscopia de massa de 260, 244, 214 e 171.

Preparação 18

N-(2-Carboxietil)-2-(4-desacetil-23-desmetoxivinblastina-23-hidrazo)meti1enoma1onamato de etilo

Um lote de 67 mg do produto da

Preparação 17 foi adicionado a uma solução de 196 mg de sulfato de 4-desaceti1-23-desmetoxivinb1 a stina-23-hidrazina , em 1 ml de dimeti1 formamida seca. A mistura foi agitada, à temperatura ambiente, de um dia para o outro, e o solvente foi, em seguida,removido sob o vácuo. 0 residuo foi dissolvido em metanol a 20%, num tampão de KH₂P0₄ a 0,5M, a pH 7, e foi aplicado a uma coluna de gel de silica de fase inversa Cjq. A coluna foi eluida, com o mesmo tampão, contendo quantidades crescentes de metanol, e os lotes, que continham o produto, foram reunidos e foram concentrados sob o vácuo.

residuo foi, em seguida, dissolvido em alguns ml de água, e a solução foi aplicada a uma coluna do mesmo tipo e foi eluida com água, contendo quantidades crescentes de metanol.

Os lotes, que continham o produto, foram reunidos e foram concentrados sob o vácuo, dando origem a 197 mg do intermediário desejado.

Preparação 19

N-(2-Succinimidoxicarboniletil)-2-(4-desacetiI-23-desmetoxivinblastina-23-hidrazo)metilenomalonamato de etilo

Um lote de 159 mg do produto da Preparação 18 foi dissolvido em 2 ml de dimeti1 formam ida seca, e adicionaram-se-lhe 20,5 mg de N-hidroxissuccinimida , 33,4mg de diciclohexi lcarbodiimida e 30,8 mg de hidrato de ácido p-tolueno-sulfónico. A mistura foi agitada, à temperatura ambiente, durante 24 horas, e o solvente foi, em seguida,removido sob o vácuo. 0 resíduo foi recolhido em diclorometano e foi aplicado a uma coluna de gel de silica, equilibrada com dic1orometano. A coluna foi eluida com isopropano1:diclorometano, na proporção de 1:1, e os lotes, que continham o produto, foram reunidos e foram concentrados sob o vácuo, dando origem a 45,2 mg do intermediário desejado.

Exemplo 10

Conjugado do anticorpo 007B, com N-(2-carbonileti1)-2-(4-desacetil-23-desmetoxivinblastina-23-hidrazo)meti1 enemalonamato de etilo

Três reacções de conjugação foram levadas a efeito, essencialmente de acordo com o processo do Exemplo 6, iniciando-se, em cada caso, com 15 mg do anticorpo em 1,03 ml de tampão de borato. As quantidades, que se seguem, do produto da Preparação 19, foram empregadas, nas três reacções.

1. 0,86 mg

2. 1,08 mg

3. 1,30 mg

As três misturas da reacção foram agitadas, à temperatura ambiente,durante 1 hora, foram centri fugadas e foram cromatografadas, e as soluções do produto foram filtradas com esteri1ização,dando origem aos produtos, que se seguem.

2 3

Conjugado	14,9 mg	14,9 mg	13,6	mg
Vo 1 ume	6,2 ml	6,5 ml	7,2	m 1
Proporção da
Conjugação	3,3	4,1	4,9

Exemp1 o 11

Conjugado do anticorpo 007B, com N-(2-carbonileti1)-2-(4-desacetil-23-desmetoxivinblastina-23-hidrazo)metilenomalonamato de etilo

Uma conjugação, essencialmente de acordo com o Exemplo 6, foi levada a efeito,partindo-se de 200 mg do anticorpo 007B, como uma solução de 14,6 mg/ml, e de 18 mg do produto da Preparação 19. 0 produto foi filtra do com esterilização e foi dialisado no vácuo,dando origem a 163 mg do conjugado, com uma proporção de conjugação de 4,3, como uma solução de 12,0 mg/jul.

-76Exemplo 12

Conjugado do fragmento de F(ab')₂ do anticorpo 007B, com

N-(2-carboniletil)-2-(4-desacetil-23-desmetoxivinblastina)-23-hidrazo)metilenoma1onamato de etilo

Seiscentos mg do fragmento de F(ab')₂ do anticorpo 007B foram dissolvidos em 30 ml de tampão de borato de 0,34M, pH 8,6. A eles se adicionaram, gota a gota e lentamente, 3,75 ml de dimeti1 formamida seca, contendo 51 mg do intermediário da Preparação 19, e a mistura foi agitada, durante 30 minutos, à temperatura ambiente. Ela foi, em seguida,centrifugada, e o sobrenadante foi cromatografado sobre uma coluna de Sepharose CL-4B de Fenilo (Farmácia), eluindo-se com um tampão de fosfato de O,1M, pH 6,2, e, em seguida, com acetonitrilo aquoso a 40%. Os lotes, que continham o produto, foram concentrados por diálise em salina protegida com um tampão fisiológico, dando origem a 214 mg do conjugado desejado, com uma proporção de conjugação de 2,9 moles por mole.

Exper iência I. Experimentação In Vitro

Conjugados representantes do invento em consideração foram experimentados em sistemas in vitro, para se demonstrar a actividade dos conjugados. Nestas experiências, o vigor dos conjugados dos medicamentos citotóxicos foi determinado, medindo-se a citotoxicidade dos conjugados, contra as culturas de tecidos das células de origem carnerosa humana. As células empregadas foram da família de células UCLA/P3, um adenocarcinoma do pulmão humano, e da família das células T222, um carcinoma escamoso humano. A tabela 1, que se segue, apresenta a actividade dos conju-77gados,como a concentração inibitória de 50%, baseada na quantidade do medicamento no conjugado.

: emplo	UCLA/P3	T222
2A	0.1 pg/ml	>10 pg/ml
2B	>10	>10
3A	>10	>10
4	>10
4A	>10	3.3
6A	<0.0001
11	0.26

Experiênc ia II

UCLA/P3 em Ratos conjugado do Exemplo 6A foi experimentado in vivo, contra xenoenxertos do adenocarcinoma do pulmão de UCLA/P3, em ratos pelados Charles River. Iniciou-se a experiência, implantando cada rato, subcutâneamente, com 10⁷ células de tumores UCLA/P3. Em cada um dos dias 2, e 8, após a implantação, cada rato foi injectado com o conjugado, ou com a salina protegida com um tampão fisiológico, como um controlo não tratado. As doses do conjugado oscilaram entre 0,09 mg/kg e 3 mg/kg, baseadas na quantidade do medicamento. A dimensão dos tumores, originados pela implantação, foi medida nos dias 15,21 e 28, após a implantação. Cada grupo de tratarento era constituído por cinco ratos,

excepto do grupo de controlo não tratado, que era constituido por 10 ratos.

No dia 28, a supressão dos tumores foi produzida por todos os tratamentos de 0,38 mg/kg ou dê mais. 0 tratamento de 0,19 mg/kg originou uma supressão de cerca de 60%, e o tratamento de 0,09 mg/kg originou cerca de 25% da supressão do desenvolvimento dos tumores.

Experiência III

Tumores de UCLA/P3, em Ratos conjugado do Exemplo 7A foi experimentado contra os tumores originados pela implantação de células de UCLA/P3 em ratos, essencialmente, como foi descrito na Experiência II.Nesfecaso, o conjugado foi administrado em doses de 0,25, 0,5, 1 e 2 mg/kg, baseadas na quantidade do medicamento, e as doses foram administradas nos dias 16,19,22 e 25, depois da implantação. Os tumores foram medidos, nos mesmos dias.

Verificou-se que a dose de 0,25mg/kg deu um controlo ligeiro dos tumores, e que, cerca de 50 dias após a implantação, os ratos,daque1 a dose, tinham tumores compactos, pesando em média cerca de 7,500 mg. Os ratos de controlo tinham tumores pesando em média cerca de 8.000 mg, naquela data.As outras doses, contudo, originaram uma supressão substancial dos tumores.

Aos 70 dias, após a imp1antação , os ratos, que tinham recebido 0,5 mg/kg, tinham tumores,que pesavam em média cerca de 4.000 mg; os ratos, que tinham recebido 1 mg/kg, tinham tumores, pesando em média cerca de

2.000 mg; e os ratos, que tinham recebido 2 mg/kg, tinham tumores, pesando em média unicamente cerca de 500 mg.

Composições e Processos de Emprego

Os conjugados, do invento em consideração,são proveitosos nos processos de tratamento, que constj. tuem partes importantes do invento em consideração. Em conformidade, o invento inclui, também, composições farmacêuticas, para a administração parenteral, que são empregadas nos processos de tratamento. Tais composições são formuladas por processos, vulgarmente empregados na quimica farmacêutica. Os conjugados em consideração são solúveis, de modo aceitável, nos fluidos fisio 1ogicamente aceitáveis, tais como soluções de salina fisiológica e outras soluções aquosas,que podem ser administradas, com segurança, parenteralmente.

Os produtos, para a administração parenteral, são, muitas vezes, formulados e distribuídos na modalidade seca, e, de preferencia, na modalidade de seca congelada, para reconstituição imediatamente antes do seu emprego. Tais composições são composições proveitosas, do invento em consideração. A sua preparação ê bem aceite por químicos farmacêuticos; de um modo geral, elas compreendem misturas de sais inorgânicos, para conferirem a isotonicidade, e agentes de dispersão, tais como a lactose, para permitir a sua preparação a seco, para se disso1 ver,rapidamente, após a sua reconstituição. Tais composições são reconstituídas para emprego, com água purificada em grau elevado, para uma concentração conhecida.

Os conjugados e as composições,que compreendem os conjugados, são empregados no tratamento de doentes, que necessitam do tratamento com o medicamento compreendido pelo conjugado. A finalidade especifica do tratamento e

o grau da dose a ser administrada dependem da identidade dos medicamentos e da doença, da qual o paciente vai ser tratado. A orientação, para as potências do medicamento e para os graus de dosagem adequados, deve ser obtida da bibliografia médica norma 1i zada.

Claims (12)

1. REIVINDICAÇOES

   Η. - Processo para a preparação de um conjugado de droga que apresenta a fórmula
2. 2'R-Q-CH = C-CO-Y-(CH)_n-CO/_rnAb I

   I

   COR¹ em que:

   Ab é um anticorpo, ou um seu fragmento que reconhece um antigénio, o qual reconhece um antigénio associado com uma célula para a qual a libertação da droga é desejável

   Q é -NH-, -0-, ou -S-;

   R-Q ê o resíduo de uma droga, que tem uma função amino, hidroxi, ou tiol, utilizável reactivamente;

   R¹ é um grupo de protecção de ácido carboxilico;

   Y é -0-, -NH-, -NCH₃- ou -NC₂H₅- ; n é um número i nte i ro de 1 até cerca de 8; m é um número i nte i ro de 1 até cerca de 10.

   caracterizado por compreender:

   (A) a reacção de um anticorpo modificado da fórmula fR⁴-CH=C-C0-Y-(CH_o) -CO/Ab

   I ,

   COR¹ em que R , Y, n, m e Ab são como foi definido anteriormente, 4 e R é alcoxi com uma droga da fórmula R-QH, em que Q e R-Q-são como foi definido anteriormente; ou (B) a reacção de uma droga que foi sujeita a derivação da fórmula

   R-Q-CH=C-CO-Y-(CH₂) -COR³ IV em que Q,R-Q, R , Y e N são como foi definido anteriormente, e 3

   R é hidroxi, um grupo de activação de ácido carboxi1ico,ou uma porção que complete um sal do ácido carboxílico, com um anticorpo, ou com um fragmento de anticorpo, de fórmula Ab, como foi descrito anteriormente.

   2^?. - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a droga ser a droga citotó xica de uma das fórmulas que se seguem:

   C=O I ₅ ch₂r erii que R é hidrogénio ou hidroxi;

   g em que R é amino ou hidroxi;

   R⁷ ê hidrogénio ou metilo;

   Q

   R é hidrogénio, fluoro, cloro, bromo ou iodo;

   R é hidroxi ou uma porção que completa um sal do ácido carboxi1ico em que r’° é hidrogénio ou metilo;

   em que r’’ é amino no ou polimetileno alquil Cj-C^-amino, di(alqui 1 C|-C₃)amiCgam i no

   R¹²-OH₂C em que uma das porções R é uma ligação e as outras são hidrogénio;

   ί:,%·.

   ch₃o

   XII

   1 3 em que R é hidrogénio ou metilo;

   R é meti lo ou tienilo;

   em que R^⁵ é H, CHL ou CHO; quando R¹⁷ e R¹⁸ são considerados

   1 O 1 £ 17 isoiadamente, R ê H, e um de R e R é etilo e o outro é H ou OH; quando R e R são considerados em conjunto com os átomos de carbono aos quais eles estão ligados.eles formam um anel oxirano, caso em que R¹⁶ é etilo; R¹⁹ é hidrogénio, (alquil Cj-C₃)-C0, ou (alquil Cj-C₃)-C0 clorossubstituido;

   p é 0 ou 1 ;

   R é uma ligação ou (alqjil (^-C^-X;

   X é -0-, -S- ou -NH-;

   em que R é uma base de uma das fórmulas em que R²^ § hidrogénio, metilo, iodo;

   R²³ é -0R¹² ou -NHR¹²;

   bromo, fluoro, cloro ou

   FT⁴ hidrogénio, bromo, cloro ou iodo.
3. 3®. -Processo, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por o anticorpo ser um anticorpo monoclonal.

   f>r<
4. 4®. - Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por m ser de cerca de 3 até cerca de 8.
5. 5®. - Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por n ser de 1 até cerca de 6.
6. 6®. - Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por n ser de 1 até cerca de 3.
7. 7®. - Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por a droga ser da fórmula V, da fórmula VI ou da fórmula XIII.
8. 8®. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se incluir, num meio administráve1 parentericamente um conjugado, preparado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
9. 9®. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, na preparação das drogas ou anticorpos modificados, se utilizar um malonato da fórmula:

   r⁴-ch=c-C0-Y-(CH₂) - COR³ COR²

   II em que n e Y são o que foi definido na reivindicação 1;

   R é hidroxi, um grupo de protecção de ácido carboxilico ou uma porção que completa um sal do ácido carooxi1 i co;

   R é hidroxi, um grupo de protecção de ácido carboxilico, um grupo de activação de ácido carboxílico, ou uma porção que completa um sal do ácido carboxílico;

   R⁴ é alcoxi Cj-C₄«
10. 10⁵. - Processo, de acordo com a 2 reivindicação 11, caracterizado por R ser um grupo de pro3 tecção de ácido carboxílico, R ser um grupo de protecção de ácido carboxílico, ou um grupo de activação de ácido carboxilico, e n ser de 1 até cerca de 6.
11. 11-, - Processo para a preparação de um anticorpo modificado, ou de um fragmento de anticorpo modificado, que apresenta a fórmula /'R⁴-C H = C-C 0-Y-( C H₂ ) _n-C 0J_m Ab III í 1

    COR¹ em que R¹, Y, n, m e Ab são o que ficou definido na reivindicação I, e R⁴ é alcoxi Cj-C^, caracterizado por compreender a reacção de um malonato da fórmula ^-CH=C-CO-Y-(CH₂)_n-COR³ II ' 2

    COR^Z em ψ5 Y e n são o que foi definido na reivindicação 1;

    R ê um grupo de protecção de ácido carboxilico;

    O

    R é hidroxi, um grupo de activação de ácido carboxilico, ou uma porção que completa um sal do ácido carboxilico;

    R⁴ é a 1cox i , C|-C^;

    com um anticprpo, ou com um fragmento de anticorpo, de fórmula Ab, como foi definido na reivindicação 1.
12. 12-. - Processo para a preparação de uma droga, que foi sujeita a derivação, que apresenta a fórmu1 a

    R-Q-CH = C-CO-Y-(CH₂ ) -COR³ COR¹

    IV

    -93em que Q, R-Q, r’, Yen são o que foi definido na reivindicação 1, e R³ é hidroxi, um grupo de protecção de ácido carboxilico, um grupo de activação de ácido carboxi1ico,ou uma porção que completa um sal do ácido carboxi1ico,caracter£ zado por compreender a reacçao de umrelonato da fórmula

    R⁴-CH=C-C0-Y-(CH₂)_n-C0R³ II

    COR² em que R é um grupo de protecção de ácido carboxilico; e 4 3

    R , Y, n e R. são o que foi estabelecido na reivindicação 12, com uma droga da fórmula R-QH, em que Q e R-Q- são como foi definido na reivindicação 1.

    Lisboa, 7 de Novembro de 1989

    J. PEREIRA DA CRUZ Aflsnt; Oficial ca Propriedade Industrial RUA VICTOR CORC8-N. 10-A. 1.· 1200 lisboa