JPH10504347A - 水溶性ポリエン複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ポリエン抗生物質の実質的に安定な水溶性の多糖複合体を製造する方法が記載される。本方法は、以下の工程：ａ）多糖を過ヨウ素酸酸化によってジアルデヒドに活性化し、ｂ）ジアルデヒドを妨害アニオンおよび副生成物から精製し、ｃ）ポリエンをシッフ塩基形成によって精製ジアルデヒドに結合して複合体を生成させ、そしてｄ）複合体を精製することを含んでなる。好適な態様では、工程（ｃ）の複合体は、精製前に、還元剤によってアミン複合体に還元される。また、ポリエン・ナイスタチンのイミンおよびアミン多糖複合体が記載される。

Description

【発明の詳細な説明】 水溶性ポリエン複合体 発明の技術分野 本発明は、ポリエン抗生物質の水溶性多糖複合体の製造方法、さらに詳しくは 、抗真菌性ポリエン・ナイスタチン（ｎｙｓｔａｔｉｎ）およびアンホテリシン Ｂ（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ）の複合体に関する。本発明はまた、本方法 によって製造された複合体およびそれらを含んでなる製薬学的組成物に関する。 発明の背景 真菌感染症の治療は、ポリエンのような効果的な抗真菌薬が使用できるにも拘 わらず、重要な問題として残されている。これらの市販の薬物を臨床的に使用す ることが、生命を脅かす真菌感染症、特に癌患者、移植後の患者およびＡＩＤＳ 患者のような免疫無防衛宿主中での発生が増加している結果として連続的に増加 している。しかし、利用できるポリエン抗生物質の大多数は毒性があり、そして それらの応用を制限する副作用を引き起こす。最も広範に使用されるポリエン抗 生物質は、アンホテリシンＢ（Ａｍｐｈ Ｂ）およびナイスタチン（Ｎｙｓ）− 広範囲の真菌によって引き起こされる真菌感染症の治療のための良好な薬物−で ある。最初のものは、可溶化形態の非経口薬剤、Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（商標）と して、そしてさらに最近に開発された毒性の低いリポソーム形態の薬剤、Ａｍｂ ｉｓｏｍｅ（商標）として存在する。しかし、抗真菌剤のリポソーム状の製剤的 静脈内注射形態をさらに実際的に開発するため には、リポソームの物理的安定性およびリポソームのバッチ間の再現性に関連す る重要な技術的難点をなを克服する必要がある^(1、2)。Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（商 標）はリポソームを含有していないが、その治療用量はその最大耐量（ＭＴＤ） に極めて近く、それ故通常は生命を脅かす症状の場合にのみ処方される。Ｎｙｓ に関しては、新規で効果的な非経口的抗真菌剤形態の開発の問題がまだ残されて いる。Ｎｙｓのリポソーム形態は文献に記載されているが⁽³⁾、これらは、Ａｍ ｐｈ Ｂに関連して上記された問題点の外に、リポソームからの薬物の漏洩およ び薬物の化学的保全性の維持の問題に悩まされている。それ故、Ｎｙｓの使用は 、現在は経口または局所形態に限定され、そして非経口製剤は未だこの強力な薬 物について開発されていない⁽⁴⁾。 例えば、デキストランのような水溶性の酸 化多糖は、最も興味をそそる薬物担体の候補の一つであると考えられる⁽⁵⁾。ジ アルデヒドデキストラン（ＤＡＤ）、デキストランと過ヨウ素酸塩との酸化反応 の主要生成物は、酵素（例えば、米国特許第４，４４６，３１６号明細書）およ び抗生物質^(6-10)を含む薬物のための安定剤として提案された。しかし、非経口 投与に適用できるポリエン抗生物質の複合体は全く報告されていない。 英国特許第９７８，１７０号明細書には、多糖をポリジアルデヒドに酸化させ た後、ポリエンと反応させるポリエン抗生物質の水溶性イミン誘導体の製造法が 記載されている。上記の特許に記載の複合体の中には、ピマリシン−デキストラ ンおよびＮｙｓ−トウモロコシ澱粉がある。この英国特許には、アミン複合体の 記載はない。本出願の出願人によって行われそして実施例８に記載された実験で は、上記の特許に記載の方法に従って製造されたＮｙｓ−デキストラン複合体は 水溶性であるが、そ れは安定性および活性が極めて低くそしてポリマーの劇的な分解および複合され た薬物の不活性化に感受性であることが見出された。このことは、酸化ポリマー が複合前に過剰の還元剤から精製されないので、ポリエンが酸化を受けるためで あると考えられる。この精製は、以下にさらに記載するように、複合薬物の安定 性、効能および毒性の欠如のために必須である。 要するに、上記の研究は、全身性真菌感染症に対する、水溶性形態でのＮｙｓ 投与の有利な効果を記録するのに成功したものは全くなかった。それ故、一般的 にはポリエンおよび特定的にはＮｙｓのための、ＩＶ注射可能で無毒性のシステ ムを形成することは、重篤な真菌性疾患の全身的治療のためにそれらを使用する ことを制限する問題点として残されている。 発明の要旨 静脈内投与に適する水溶性ポリエン抗生物質の製造方法を提供することが本発 明の目的である。 遊離ポリエンよりも高い溶解度、大きい効能および低い毒性を有するポリエン 抗生物質の水溶性複合体を提供することが本発明のさらなる目的である。 追加的には、静脈内投与並びに局所適用に適する水溶性ポリエン抗生物質を含 んでなる医薬組成物を提供することが本発明の目的である。 本発明の一つの態様によれば、 （１）前記多糖を過ヨウ素酸酸化によってジアルデヒドに活性化し、 （２）前記ジアルデヒドを妨害アニオンおよび副生成物から精製し、 （３）前記ポリエンをシッフ塩基形成によって前記精製ジアルデヒドに 結合させて前記複合体を生成させ、そして （４）前記複合体を精製すること、 を含んでなる、ポリエン抗生物質の実質的に安定な水溶性多糖複合体を製造する 方法が提供される。 本発明の第二の態様によれば、 （１）前記多糖を過ヨウ素酸酸化によってジアルデヒドに活性化し、 （２）前記ジアルデヒドを妨害アニオンおよび副生成物から精製し、 （３）前記ポリエンをシッフ塩基形成によって前記精製ジアルデヒドに結合させ て前記複合体を生成させ、そして （４）前記複合体を還元剤によってアミン複合体に還元し、そして （５）前記複合体を精製すること、 を含んでなる、ポリエン抗生物質の実質的に安定な水溶性多糖複合体を製造する 方法が提供される。 本発明の好適な態様では、ポリエンはＮｙｓおよびＡｍｐｈ Ｂであり、そし て多糖はデキストランまたはアラビノガラクタンである。 本発明のもう一つの態様によれば、多糖とポリエン抗生物質との実質的に安定 な水溶性複合体を製造する方法が提供される。 好適な態様では、ポリエンはアミン結合を介して多糖に複合される。 本発明のさらにもう一つの態様によれば、本発明の複合体を含んでなる、真菌 性感染症の治療で使用するための医薬組成物が提供される。 多糖に過ヨウ素酸塩を反応させて（構造式Ａ、図１）酸化多糖（ＯＰ−構造式 Ｂ）を生成させることは良く研究され、そして反応混合物の妨害アニオン（過ヨ ウ素酸塩、ヨウ素酸塩およびギ酸塩）から活性化ポリマーを高度に効果的に分離 する技術的条件が提案される。このことは、 酢酸塩型の強塩基性アニオン交換樹脂を充填したカラムに反応混合物を通塔する ことによって達成される。この精製方法は、迅速であり、そして初期濃度で高い 収率の精製ＯＰを提供し、その後アニオン交換樹脂は容易に再生される。同様の 方法が多くのタンパク質のＤＡＤへの結合に成功裡に使用されたが^(13-15)、抗 生物質または他の低分子量の薬物の複合のためのかかる担体を製造する試みは行 われなかった。 次いで、ＯＰをポリエン抗生物質のアミノ基と反応させて、シュッフ塩基（構 造式Ｃ）を生成させる。好適には、次いで、シュッフ塩基結合を、還元剤、好適 には水素化ホウ素ナトリウムまたはカリウムによって安定なアミン結合（構造式 Ｄ）に転化する。かかる結合は体内で容易には加水分解されそうにない。ＮａＨ ＳＯ₃またはＨＯ−ＮＨ₂：ＨＣｌのような他の還元剤も使用することができるこ とが理解されるべきである。 次いで、複合体を、塩、低分子量ポリマーフラクションおよび微量の未結合水 溶性薬物から、透析によって分離し、次いで遠心分離および凍結乾燥を行う。 複合体は、予想されるように、浸透圧の増加に顕著には貢献しない。 それ故、静脈用液剤の製造の場合、凍結乾燥された複合体を単に食塩水に溶解さ せ、濾過またはオートクレーブによって滅菌する。 点眼剤または点耳剤を製造することが望まれる場合、パラヒドロキシ安息香酸 エステル誘導体（メチル、プロピル、ブチル）のような適切な保存剤を食塩液に 添加するべきである。 図面の簡単な説明 本発明は、以下の図面と合同して、好適な態様の以下の詳細な説明か ら、一層よく理解される。図面中、 図１は、本発明の方法の好適な態様の反応スキームを示し； 図２は、本発明の方法の好適な態様の複合体生成物のＨＰＬＣ分析を示し； 図３は、時間の関数として測定された安定性実験の結果を示し； 図４は、温度および時間の関数として測定された安定性実験の結果を示し； 図５は、ｐＨの関数として測定された安定性実験の結果を示し； 図６ａおよび図６ｂは、生体内検定法で真菌接種後２４時間（図６ａ）および ４８時間（図６ｂ）に測定した、本発明の複合体の効能を示し； 図７は、本発明の複合体の生体外毒性研究を示し； 図８は、生体内検定法で低濃度のマウスのカンジジアシス（ｃａｎｄｉｄｉａ ｓｉｓ）細胞の接種後に測定した、本発明の複合体の効能を示し； 図９は、生体内検定法で高濃度のマウスのカンジジアシス細胞の接種後に測定 した、本発明の複合体の効能を示し；そして 図１０ａおよび図１０ｂは、生体内検定法で低濃度のマウスのクリプトコッコ シス（ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ）細胞の単回接種（図１０ａ）または多回 接種（図１０ｂ）後に測定した、本発明の複合体の効能を示す。 好適な態様の詳細な説明 方法 １．クロマトグラフィー法 ＨＰＬＣ−ＧＰＣは、Ｂｉｏ−Ｓｉｌ Ｒ ＳＥＣ−１２５ ＨＰＬ Ｃゲル濾過カラム３００×７．５ｍｍ（日本）上で、移動相としてＤＤＷを使用 して、行った。 ＧＰＣは、全量５５ｍｌのＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５および１９ｍｌの空隙 容量を含有するカラム上で、溶離液としてＤＤＷを使用して行った。 ２．分光分析法 ＵＶスペクトルは、ＵＶＩＫＯＮ分光光度計（Ｋｏｎｔｒｏｎ Ｉｎｓｔｒｕ ｍｅｎｔｓ）を使用して記録した。 ＩＲスペクトルは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ２００ＦＴ−Ｉ Ｒを使用して記録した。 ３．複合体の滅菌法および凍結乾燥法 動物研究のための無菌抗真菌性複合体は、無菌の発熱物質を含まないフィルタ ー（０．２ミクロン、２０ｍｍ、４５ｍｍ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈ ｕｅｌｌ，Ｄａｓｓｅｌ Ｇｅｒｍａｎｙ）を通す濾過によって製造した。凍結 乾燥は、Ｃｈｒｉｓｔ Ａｌｐｈａ−ＩｓＬｙｏｐｈｉｌｉｚｅｒ，Ｇｅｒｍａ ｎｙ中で行った。無菌性は、Ｂａｃｔｅｃ４６装置（Ｊｏｈｓｏｎ Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ，Ｔｏｗｓｏｎ，Ｍｄ，ＵＳＡ）を使用する無菌試験法によって 確認した。この機器は、試験試料を接種したＢａｃｔｅｃ培養バイアル中の放射 性二酸化炭素を定量的に測定するように設計されている。好気性または嫌気性バ イアルを培養して一定の基線水準以上の¹⁴ＣＯ₂が検出されると、原接種中に生 存可能な微生物が存在することを示す。 ４．毒性研究 ａ．生体内研究 ヒト赤血球に対する毒性の検定は、７０時間までの期間に亙って、所定の時間 間隔で、（１，３）に記載の溶血反応の過程中の５５０ｎｍでのヘモグロビンの 放出を追跡することによって行った。 ｂ．生体内研究 体重２０ｇの健康な雄性の白のＢＡＬＢ／ｃマウスに、尾部静脈を通して、Ｎ ｙｓ形態の各用量（０．５および１．０ｍｇ／ｋｇ）を注射した。各剤形を、滅 菌水を使用して製造した０．１０または０．２０ｍｌの液剤の単回大量注射によ って、１０匹のマウスの群に静脈内投与した。生残率を４５日までの間追跡した 。多回用量処理の場合、Ｎｙｓ複合体液剤の５日連続用量（０．１ｍｌ）を、マ ウス（１０匹の群）の尾部静脈中に注射した。 ５．効能研究 ａ．カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）に対する生物活性の生体外研究 酵母感受性試験（ＭＩＣ決定法）を使用した⁽¹²⁾。ＮｙｓおよびそのＤＡＤと の複合体のＭＩＣ（最小阻止濃度）値は、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉ ｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）ＣＢＳ５６２（基準代表菌株）に対して、酵母窒素塩 基培地（Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｄｉｆｃ ｏ）および４段階系統希釈を使用する寒天希釈法に従って決定した。 ｂ．カンジダ属およびクリプトコッコシス属に対する生物活性の生体内研究 すべての実験において、Ｃ．アルビカンスＣＢＳ５６２を、０．１ｍｌの液剤 の単回大量によって、雄性の白のＢＡＬＢ／ｃマウス（２０±３ｇ）の尾部静脈 中に注射した。接種量は、サブロー・デキストロース寒 天上で３７℃の２４時間培養物からのマウス当たり５×１０⁴〜１０⁵酵母細胞の 範囲内であった。これらの接種量を用いて、１０−１５日以内に全数死滅をもた らす全身性感染症をマウス中に定期的に作成した。各実験に適切な接種量は実験 的に決定した。酵母の濃度は血球計の計数によって決定した。生菌数は、接種の ２日後３７℃のサブロー・デキストロース寒天上のコロニー形成単位（ＣＦＵ） として測定した。幾つかの実験では、死亡率の外に、腎臓中での増殖を、均質化 された器官のＣＦＵによって測定して、監視した。 上記のように感染させたマウスを、無傷のマウスについての最大耐量−２％Ｄ ＭＳＯ中の１ｍｇ／ｋｇ（かかる濃度の溶媒は無毒であることが分っていた）の Ｎｙｓ液剤またはＮｙｓ−複合体で処理した。１０匹のマウスを各処理で使用し 、そして個別のケージ中に保持した。処理は、感染開始の２４時間後、多回処理 実験では、２５ｍｇ Ｎｙｓ／ｋｇに等しい用量で、ＮｙｓまたはＮｙｓ複合体 の５日連続用量の注射によってか、或いは単回処理実験では、８０ｍｇ／ｋｇ（ ０．１ｍｌ）に等しい濃度で、複合体の単回大量の注射によって始めた。比較の ために、複合体の延長効果を考慮して、他の群のマウスが、上記の用量のＮｙｓ または複合体で、多回週２回ＩＶ処理（注射の間に２−３日の間隔をおいて５回 注射）を受けた。複合体の代わりに食塩水で処理された１０匹の感染マウスの対 照群が含まれた。各群中の生残動物数を４５日までの期間に亙って毎日記録した 。 効能研究は、クリプトコッカス標準型について、同様の実験条件下で行った。 実施例 実施例１−シッフ塩基複合体の形成 １．０ｇのＤｅｘｔｒａｎ−４０（平均Ｍ．Ｗ．４０．０００、Ｓｉｇｍａ） を、２０．０ｍｌの蒸留水中に、室温で５分間撹拌した後溶解させた。１．２７ ５ｇの過ヨウ素酸カリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．）を添加し、そ して混合物を、塩が完全に溶解するまで、同一温度で２時間効果的に撹拌した。 生成したジアルデヒドデキストラン（ＤＡＤ）を、市販のアニオン交換樹脂（Ｓ ｉｇｍａ）を１Ｍ酢酸溶液で前処理して得た酢酸塩型のＤｏｗｅｘ−１を充填し たカラム（６ｍｍ×８０ｍｍ、Ｖｏ＝２．０ｍｌ）に通塔することによって、反 応混合物の妨害アニオンおよび副生成物から分離した。精製されたＤＡＤは５０ ．０ｍｇ／ｍｌの初期濃度であり、ヨウ素還元滴定法によって測定して５０％酸 化された⁽¹²⁾。 ２０．０ｍｌの精製ＤＡＤ溶液を等量の０．２Ｍホウ酸緩衝液ｐＨ９．１と混 合し、４００．０ｍｇのＮｙｓをこのポリマー溶液（ポリマーおよび薬物の初期 濃度はそれぞれ２５ｍｇ／ｍｌおよび２０ｍｇ／ｍｌであった）に添加した。混 合物のｐＨ値を３７℃で８．９±０．１に１６時間維持した。その時間の終期に 、すべてのＮｙｓは溶解した。この事実は、反応混合物のＨＰＬＣ分析（図２） での単一ピークの存在と一緒になって、水溶性複合体が９５％以上の収率で生成 することを示した。 複合体を、１２−１４ＫｄのＭ．Ｗ．カットオフを持つＳＰＥＣＴＲＡ／ＰＯ Ｒ分子多孔性膜チュービングを使用して、ＤＤＷに対して４℃で３０時間透析し 、次いで２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、凍結乾燥した。 アンスロン法によって決定して６５％のポリマーおよび４１９−４２ ０ｎｍでのＵＶ吸収によって評価して３５％のＮｙｓを含んでなる、９２５ｍｇ の凍結乾燥した最終生成物を得た。複合体中のＮｙｓの収率は８７％であり、ポ リマーの計算収率は６７％であった。 凍結乾燥した複合体は、水中に１００ｍｇ／ｍｌもの濃度に容易に溶解し、一 方遊離Ｎｙｓは、ＤＭＳＯ中にのみ３０ｍｇ／ｍｌまたはそれ以上の濃度に容易 に溶解し、メタノール中にはより少なく（１ｍｇ／ｍｌ）、水中には極少量で（ ０．２−０．４ｍｇ／ｍｌ）溶解する。反対に、Ｎｙｓ−デキストラン複合体は ＤＭＳＯまたはメタノール中に不溶である。 複合体のＵＶスペクトルは遊離Ｎｙｓと同様であるが、ＤＡＤと結合すると、 以下のようにピーク波長がある一定の移動を示す(波長(ｎｍ))：ＤＭＳＯ中のＮｙｓ ：４１５−１４６、３９１−３９６、３２０−３２４、３０ ５−３０９、２９２、２９５；ＤＭＳＯ−水混合物中のＮｙｓの溶液 ：４１６−４１８、３９２−３９５、３２ １−３２３、３０６−３０８、２８９−２９１；水溶液中の複合体 ： 未還元型：４１７−４１９、３９２−３９３、３２１、３０６−３０７、２８ ９−２９３、２７０−２７３、２３１； 還元型：１４９−４２０、３９４、３２２、３０７、２８５−２８９、２７１ −２７５、２３２−２３３。 結合方法を、デキストランの分子量および酸化度、薬物−ポリマー比、ｐＨ、 温度および反応時間の関数として研究した。９，３００−７４，０００の範囲内 の分子量および５−５０％の酸化度を持つデキストランを、Ｎｙｓと、７．５− １０の範囲内のｐＨの水性緩衝液中で４−３７ ℃で２−２０時間反応させた。反応混合物中の薬物およびポリマー濃度は、それ ぞれ５−１５ｍｇ／ｍｌおよび５−５０ｍｇ／ｍｌの範囲内であった。結果を表 １に示す。 反応混合物のｐＨを低下させると、生成物の収率が低下し、他方ｐＨ値を９． ０以上にすると、劇的にポリマーが分解しそしてＮｙｓが不活性化する。さらに 、ポリマー酸化の程度が減少すると、ポリマーの分解能が低下するが、同時にＮ ｙｓ結合が低下する。 水溶液中の複合体の安定性を、遊離ＮｙｓおよびＮｙｓとデキストランとの混 合物の安定性と３７℃で比較した。図３に示すように、複合体は、急速に分解し た他の調製物とは反対に、１００時間を超える間ＵＶ吸光度を殆ど完全に保持し た。 図５は、ＤＭＳＯ中の遊離Ｎｙｓとは反対に、水溶液中の未還元複合体のｐＨ 安定性が増加することを示している。調製物を、室温で、各種ｐＨのリン酸緩衝 液中で、２０時間インキュベートした。 上記の結果は、本発明の方法によるポリエン抗生物質の多糖への結合が、ポリ エン薬物の水溶性および安定性を顕著に向上させるという結論を支持する。 未還元複合体（＃３）の抗真菌性能を、ＭＩＣ試験で、各種真菌に関して、遊 離Ｎｙｓ（＃１）と比較して試験した。複合体は、遊離薬物の２倍を超える効果 （ＭＩＣ値は低くなる）を示すことが分かった。同様の結果が、ＮｙｓとＡｍｐ ｈ Ｂ（示されていない）とのアラビノガラクタン複合体について得られた。 無菌未還元（イミン）複合体調製物は、生体外検定法で測定して、遊離薬物よ りずっと毒性が低かった（図７）。生体内毒性試験法でＮｙｓおよび未還元複合 体についての急性毒性値を比較評価した結果は、薬物の単回独注射の場合の最大 耐量（ＭＴＤ）は、Ｎｙｓについては３−４ｍｇ／ｋｇであり、複合体について は７００ｍｇ／ｋｇ以上であること を示した。 実施例２−アミン複合体の形成 Ｎｙｓ−デキストラン複合体は実施例１に記載の通りに得た。しかし、複合の 後、反応混合物を、二倍モル過剰の水素化ホウ素ナトリウムで、４℃で３０分間 処理した。次いで、その後のすべての操作は上記の実施例１に記載の通りに行っ た。得られた複合体（９４５ｍｇ）は、アンスロン法によって決定して６６％ポ リマーおよび４１９−４２０ｎｍでのＵＶ吸収法によって評価して３４％結合Ｎ ｙｓを含んでなった。複合体中のＮｙｓの収率は８６％であり、そしてポリマー の計算収率は６９％であった。 還元複合体は未還元対応品より色が淡く、水溶解度が高かった（２００ｍｇ／ ｍｌまで）。還元（アミン）複合体の１ｍｇ／ｍｌ水溶液は、４℃、３７℃およ び５０℃で５００時間を超える期間に亙って測定して、未還元（イミン）型の等 量溶液より有意的に安定であることが見出だされた（図４）。還元複合体のｐＨ 安定性もまた、未還元複合体より少し優れていることが見出された（図５）。 還元調製物（＃２）は、ＭＩＣ試験で、未還元複合体（＃３）と同様の活性を 有した（図６ａおよび図６ｂ）。生体外毒性研究（図７）は、アミン誘導体が遊 離薬物より毒性がずっと低く、そしてイミン誘導体より有意的に毒性が低いこと を示した。実施例１に記載の生体内毒性研究では、還元複合体についてのＭＴＤ は８８０ｍｇ／ｍｌであった。マウスに５日連日注射した第二実験では、複合体 についてのＭＴＤは、遊離Ｎｙｓについての１ｍｇＮｙｓ／ｋｇ／日と比較して 、１５０ｍｇＮｙｓ／ｋｇ／日であった。 図８−１０に示されるように、還元複合体と遊離Ｎｙｓとを比較するために、 生体内効能試験も行った。 図８は、図に示されるように、薬物または薬物複合体で処理する前に、マウス 中に３×１０³Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）細胞／０．２ｍｌを 注射した実験の結果を示す。図１０ａおよび図１０ｂは、マウスのクリプト・ネ オホルマンス（Ｃｒｙｐｔｏ． ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）の２×１０³細胞を用 いた同様の実験を示す。図９は、１０⁵Ｃ．アルビカンス細胞／０．２ｍｌをマ ウスに注射した実験の結果を示す。すべての生体内実験は、遊離薬物と比較して 、複合体の抗真菌効能が増強したことを明らかに示す。 実施例３ 複合体を、９，３００ＭＷデキストランを使用したことを除いて、実施例２に 記載の通りに製造し、そして反応混合物中の最終デキストラン濃度は２０ｍｇ／ ｍｌであった。複合体が透析チュービングを通過するのを防止するために、６， ０００のＭ．Ｗ．カットオフを持つＳＰＥＣＴＲＡ／ＰＯＲ分子多孔性膜チュー ビングを使用した。得られた９４０ｍｇの複合体は３６％の結合Ｎｙｓを含有し 、最終収率はＮｙｓについては９１％であり、ポリマーについては６７％であっ た。複合体のＭＩＣおよび毒性結果は、実施例２の複合体と同様であった（示さ れていない）。 実施例４ 複合体を、７４，０００ＭＷデキストランを使用したことを除いて、実施例２ に記載の通りに製造し、そしてＮｙｓの最終濃度は５ｍｇ／ｍｌであった。生成 物をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５カラムに通塔した場 合、各分子量を有する複合体に対応する２つのピークが観察された。 実施例５ 複合体を、可溶性多糖アラビノガラクタン（Ｌａｒｅｘ ＵＦ）−アラビノー スとガラクトースとのポリマー（１：６）−をデキストランの代わりに使用した ことを除いて、実施例２に記載の通りに製造した。酸化ポリマーおよびＮｙｓの 初期濃度はそれぞれ２５ｍｇ／ｍｌおよび３ｍｇ／ｍｌであった。ポリマー複合 体中の薬物の収率は８０％であった。 実施例６ Ａｍｐｈ Ｂおよびアラビノガラクタンとの複合体を、実施例２に記載の条件 下で製造した。酸化ポリマーおよび薬物の初期濃度はそれぞれ２０ｍｇ／ｍｌお よび５ｍｇ／ｍｌであった。ポリマー複合体中の薬物の収率は７５％であった。 実施例７ フンギゾン（Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）（可溶性Ａｍｐｈ Ｂ）を、アラビノガラ クタンに、実施例２の条件下で複合させた。酸化ポリマーおよびＡｍｐｈ Ｂの 初期濃度はそれぞれ２０ｍｇ／ｍｌおよび１０ｍｇ／ｍｌであった。ポリマー複 合体中の薬物の収率は９５％であった。 実施例８ 本発明の複合方法を英国特許第９７８，１７０号明細書の方法と比較するため に、３種のＮｙｓ−デキストラン複合体を製造した。即ち、（１）Ｎｙｓ（１０ ｍｇ／ｍｌ）を、未精製ＤＡＤ（２０ｍｇ／ｍｌ）に、１Ｍ ＮａＯＨの強アル カリ性媒体中で、５０℃で、２０分間複合させ（反応混合物のｐＨは反応の過程 に亙って１３．５から１２．５に低下した）；（２）Ｎｙｓを未精製ＤＡＤに、 ０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐ Ｈ８．８−９．０）中で、３７℃で、１０時間複合させ；（３）注意深く精製し たＤＡＤ（酸化アニオン含量２．５％以下）を本発明の方法に従って使用した以 外は、（２）と同じ。 複合体＃１および＃２は水中に急速に溶解したが、溶液並びにそれらの極めて 吸湿性の凍結乾燥物は、ＧＰＣ−ポリマー複合体に対応する副ピークおよびクロ マトグラフカラムの全容量で溶出する低分子量の生成物に対応する主ピーク−に よって測定される２つの主要フラクションの混合物を含有した。両フラクション において、４１９ｎｍおよび３９３ｎｍでのＵＶピークの完全な消失によって証 明されるように、Ｎｙｓは有意的に不活性化され、そして残余の抗真菌活性は８ ％を超えないことが見出された。このことは、上記の２つのＵＶピークが遊離薬 物中と同一の大きさであり、そしてＨＰＬＣ溶出液中には高分子量フラクション のみが存在する複合体＃３とは著しく対照的である。 上記の結果は、安定で活性なＮｙｓ−複合体調製物を得るためには、ＤＡＤの 予備精製並びに反応混合物のｐＨの９．０以下への維持の両方が必要であること を明らかに示す。 本発明を数項の好適な態様の見地から記載したが、この開示を考察したとき、 当業者の頭に種々の改変および改良が浮かぶことが予想される。 本発明の範囲は、本明細書で説明された説明的態様によって限定されるものと 解釈されるべきではなく、添付の請求の範囲に従って決定されるべきである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年８月１５日 【補正内容】 請求の範囲 ９．前記多糖がデキストランである請求の範囲５に記載の方法。 １０．前記デキストランが９０００〜７５，０００ドルトン（ｄａｌｔｏｎ） の間の分子量を有する請求の範囲９に記載の方法。 １１．前記多糖がアラビノガラクタンである請求の範囲５に記載の方法。 １２．前記還元剤がＮａＢＨ₄、ＮａＨＳＯ₃、およびＨＯ−ＮＨ₂：ＨＣｌよ りなる群から選択される請求の範囲５に記載の方法。 １３．前記還元剤がＮａＢＨ₄である請求の範囲１２に記載の方法。 １４．前記ジアルデヒドが、強塩基性アニオン交換樹脂に通塔することによっ て、精製される請求の範囲５に記載の方法。 １５．請求の範囲５に記載の方法に従って製造された、ポリエン抗生物質の実 質的に安定な水溶性の多糖イミン複合体。 １６．請求の範囲６に記載の方法に従って製造された、ポリエン抗生物質の実 質的に安定な水溶性の多糖アミン複合体。 １７．ナイスタチン−デキストランである請求の範囲１５に記載の複合体。 １８．ナイスタチン−デキストランである請求の範囲１６に記載の複合体。 １９．請求の範囲１５に記載の複合体を含んでなる、真菌感染症の治療に使用 するための医薬組成物。 ２０．静脈内投与に適した請求の範囲１９に記載の医薬組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 リンデン， ガリナ イスラエル・リシヨンレジオン75323・ベ イトレヘムストリート２／７ (72)発明者 ドンブ， アブラハム・ジエイ イスラエル・エフラト・ミグダルエダース トリート16 (72)発明者 ポラチエク， イツハク イスラエル・エルサレム93892・イズハー ストリート23 (72)発明者 ベニタ， シモン イスラエル・メバセレトジオン・ハーラジ ムストリート33／３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．抗生物質がイミン結合を介して多糖に結合している、多糖と未酸化の生物 学的活性なポリエン抗生物質との実質的に安定な水溶性複合体。 ２．前記抗生物質がナイスタチン（ｎｙｓｔａｔｉｎ）である請求の範囲１に 記載の複合体。 ３．抗生物質がアミン結合を介して多糖に結合している、多糖と未酸化の生物 学的活性なポリエン抗生物質との実質的に安定な水溶性複合体。 ４．前記抗生物質がナイスタチンである請求の範囲３に記載の複合体。 ５．ａ）前記多糖を過ヨウ素酸酸化によってジアルデヒドに活性化し、 ｂ）前記ジアルデヒドを妨害アニオンおよび副生成物から精製し、 ｃ）前記抗生物質をシッフ塩基形成によって前記精製ジアルデヒドに結合して前 記複合体を生成させ、そして ｄ）前記複合体を精製すること、 を含んでなるポリエン抗生物質の実質的に安定な水溶性の多糖複合体の製造方法 。 ６．工程（ｃ）に続いて、前記複合体を還元剤によってアミン複合体に還元す る工程をさらに含んでなる請求の範囲５に記載の方法。 ７．前記抗生物質がナイスタチンである請求の範囲５に記載の複合体。 ８．前記抗生物質がアンホテリシンＢ（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ）であ る請求の範囲５に記載の複合体。 ９．前記多糖がデキストランである請求の範囲５に記載の方法。 １０．前記デキストランが９０００〜７５，０００ドルトン（ｄａｌｔｏｎ） の間の分子量を有する請求の範囲９に記載の方法。 １１．前記多糖がアラビノガラクタンである請求の範囲５に記載の方法。 １２．前記還元剤がＮａＢＨ₄、ＮａＨＳＯ₃、およびＨＯ−ＮＨ₂：ＨＣｌを 含んでなる群から選ばれる請求の範囲５に記載の方法。 １３．前記還元剤がＮａＢＨ₄である請求の範囲１２に記載の方法。 １４．前記ジアルデヒドが、強塩基性アニオン交換樹脂に通塔することによっ て、精製される請求の範囲５に記載の方法。 １５．請求の範囲５に記載の方法に従って製造された、ポリエン抗生物質の実 質的に安定な水溶性の多糖イミン複合体。 １６．請求の範囲６に記載の方法に従って製造された、ポリエン抗生物質の実 質的に安定な水溶性の多糖アミン複合体。 １７．ナイスタチン−デキストランである請求の範囲１５に記載の複合体。 １８．ナイスタチン−デキストランである請求の範囲１６に記載の複合体。 １９．請求の範囲１５に記載の複合体を含んでなる、真菌感染症の治療に使用 するための医薬組成物。 ２０．静脈内投与に適した請求の範囲１９に記載の医薬組成物。