SU822551A1

SU822551A1 - Стабилизированна стрептокиназа,обладающа тромболитической активностью

Info

Publication number: SU822551A1
Application number: SU792806452A
Authority: SU
Inventors: Е.И. Чазов; В.Н. Смирнов; В.П. Торчилин; И.М. Терешин; Б.В. Москвичев
Original assignee: Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР; Всесоюзный Научно-Исследовательский Институт Антибиотиков И Ферментов Медицинского Назначения
Priority date: 1979-08-30
Filing date: 1979-08-30
Publication date: 1986-07-30
Also published as: DE3032606A1; DE3032606C2; SE8005990L; SE449621B

Abstract

Стабилизированна стрептокинаэаобщей формулы-"^^^0..,ан но'НгСcHa->&iH-cii;)U^'CHjOH -сн^рн /^^CHjOHгде - Щ - Стр - нативна стрепто~ киназа, обладающа тромболитической активностью. , .

Description

(Л

с

00 ю

O1

СП

Изобретение относитс к химикофармацевтической промышленности, а именно к синтезу биологически-активных химических соединений, про вл ющих т.ромболитическую активность. Описываемые соединени ьредставл ют собой полисахаридные производные стрептокиназы .

Стрептокиназу достаточно широко примен ют в медицине в качестве тромболитического препарата при терапии таких заболеваний, как инфаркта миокарда , тромбозы, тромбоэмболии легочных артерий. Препарат ввод т внутривенно в течение нескольких дней. Однако терапи стрептокиназой осложн етс двум обсто тельствами.Во-первых , как и все ферментные препараты, стрептокиназа быстро инактивируетс физиологических услови х под действием рН, тe шepaтypы, эндогенных протеаз и природных ингибиторов и быстро выводитс из кровотока, что приводит к необходимости введени больших доз фермента в течение продолжительного времени. Во-вторых, стрептокиназа представл ет собой чужеродный белок, который вызывает сильную иммунологическую реакцию организма . Кроме того, частое или повторное применение стрептокиназы может вызывать нежелательные реакции вплоть до анафилактического шока даже при первом ее применении.

В насто щее врем известно, что во многих случа х св зывание ферментов с растворимыми биосовместимыми полимерами позвол ет получать препараты, обладающие по сравнению с нативными ферментами значительно повышенной

стабильностью по отношению к различным инактивирующим воздействи м, замедленным выведением из организма и пониженной антигенностью. Наиболее удобными и хорошо зарекомендовавшими себ с точки зрени биосовместимостн носител ми ферментов вл ютс полисахариды , например декстраны.

Известны полисахаридные производные стрептокиназы, в частности иммобилизованна стрептокиназа, представл юща собой Стрептокиназу, св занную с активированным бромцианом растворимым декстраном. Эти соединени представл ют, преимущественно, теоретический интерес, поскольку способ их получени включает активацию декстр.ана высокотоксичным соединением - бромцианом.

Биосовместимость такого носител проблематична, поскольку содержащиес в нем активные группы циклических иминокарбонатов отличаютс высокой

реакционноспособностью и могут вступать в непредсказуемые реакции с другими белками организма.

Цель изобретени состоит в получении нового препарата, обладающего

ценными свойствами, обуславливающими его применение в медицине, в расширении ассортимента иммобилизованных и стабилизированных ферментов медицинского назначени и в получении

полисахаридных производных стрептокиназы , обладающих тромболитической активностью, повышенной стабильностью, пониженной антигенностью и увеличенным временем циркул ции в кровотоке с использованием носител , отвечающего медицинским требовани м, полученного без использовани токсичных реагентов и не содержащего после иммобилизации свободных реакционноспособных групп.

Цель изобретени достигаетс свойствами стабилизированной стрептокиназы , получаемой св зыванием

стрептокиназы при iS-SO C и рН 6,010 ,5 с предварительно окисленным водораствори 1М декстраном общей формулы (, где х - 100-1000, и восстановлением полученного продукта боргидридом натри .

Схематическое строение целевого продукта может быть представлено ч виде

где NH - Стр - нативна стрептокиназа . Мол.м. полученного продукта 100000 ± 300000, содержание белка 10-20%, содержание декстрана 60-80%. Полисахаридное производное стрептокиназы обладает тромболитической активностью, повышенной стабильностью , пониженной антигенностью, увеличенным временем циркул ции в организме.

. -.г. ....

Продукт полностью сохран ет биологическую активность, согласно данным испытаний in vivo и in vitro, и обладает целым р дом преимуществ зировали однократно внутривенно пре паратом нативной стрептокиназы в до зе 0,77 мг/белка/кг. Через три неде ли этим животным вводили модифицированньш фермент в трех предполагае мых терапевтических дозах (см.табл, Как видно из представленных данных предварительна иммунизаци нативным ферментом не измен ла иммунный ответ к модифицированному ферменту . Титры антител в обеих группа практически не отличаютс .Более того, превышение титров антител над титрами антител нормальных животных практически отсутствует. Аналогичны результаты, показывающие, что предварительна иммунизаци не измен ет а главное не усиливает иммунньй от .вет к модифицированной форме были получены в опытах на мышах. Важно отметить, что у кроликов или мьш1ей мы не наблюдали минимальных признаков анафилактической реакции. В экспериментах на морских свинках вли ние предшествующей иммуниза ции оценивали методом активной системной анафилаксии. Установлено, чт введение разрешающих доз препарата модифицированной стрептокиназы животным , получавшим ранее препарат нативной стрептокиназы, не приводило к заметной шоковой реакции. Установлено, что предварительное введение нативного фермента у экспе риментальньпс животных не усиливает иммунной ответ к модифицированному ферменту. . . Отсутствие вьфаженного гуморального ответа к модифицированному ферменту, полное отсутствие или сла бое про вление анафилактогенной и кожносенсибилизируннцей активности в испытанных нами дозировках свидетельствуют , что аллергизирующий потенциал препарата не высок. Антигенные свойства стабилизированной стрептокиназы изучали в опытах по истощению плазмы. Дл этого в пробирки вносили такое количество препарата нативной стрептокиназы, которое полностью св зывает антистрептокиназные антитела и поэтому лизиса искусственного тромба не происходит. Далее добавл ютс различные количества модифицированного фермента и тромбин. Оказалось,что дл получени лизиса сгустка необхо димо такое же (а не меньшее) количе ство модифицированного препатата, как в пробах, где нативный фермент предварительно не добавл лс . Если же вначале добавл етс модифицированный Фермент, то дл про влени каталитической активности необходимо добавить такое же количество нативного фермента, как в опытах без истощени . Таким образом, полученные результаты показывают, что модифицированный фермент не взаимодействует с антителами человека. Исследование вли ни плазмы крови .кроликов на активность нативного и модифицированного фермента также не вы вило вьфаженного взаимодействи антител с энзимами. Образцы плазмы . в этих опытах получали от животных иммунизированных различными дозами препаратов нативной и модифицированной стрептокиназы. Результаты определений представлены в табл. 8. Изложенные выше результаты испытаний показывают, что: 1. Лечение экспериментального тромбоза методом однократной внутривенноструйной инфузии эффективно при минимальной дозе препарата 50000 ед/кг веса. Лизис тромба начинаетс в первые полтора часа после инфузии и спуст сутки проходимость кровеносных сосудов оказьшаетс полностью восстановленной. 2. Нормализаци изменений системы свертывани крови, вызванных введением иммобилизованной стрептокиназы, наступает у подопытных животных на вторые-третьи сутки, что свидетельствует о продлении фибринолитической активности препарата в 2-3 раза по сравнению с нативной стрептокиназой. Пролонгахщ эффекта фибринолиза у стабилизированной стрептокиназы увеличиваетс с увеличением дозы препа- , рата. 3.Стабилизированна стрептокиназа обладает малой токсичностью. Внутривенное введение препарата в дозах, превышакнцих максимальные терапевтические в 50-100 раз хорошо перенос тс животными. 4.Аллергизирующий потенциал стабилизированной стрептокиназы не высок, поскольку при испытании на морских свинках анафилактогенна и кожносенсибилизирующа активность практически отсутствовала.

5. Антигенна активность модифицированного препарата снижена. В опытах по истощению плазмы модифицированна стрептокиназа не взаимодействовала с антителами человека.

Создание иммобилизованньпс препаратов-фибринолитиков , обладанмдих пролонгированным действием, позволит заменить многодневный внутривенно-капельный способ введени препарата одноразовым внутривенно-струйным, сократить курсовую дозу и тем самым снизить число осложнений и повысить а.Исследование на модели тр Контроль Опыт 1 Стрептокиназа нативна 3 Опыт II Стрептокиназа стабилизированна из примеров 1 и 2 10 б.Исследовани , на модели тр Контроль Опыт 1 Стрептокиназа ативна 1 Опыт II Стрептокиназа стабилизированна из . примеров 1 и 2 2 в.Исследование на модели тр Контроль Опыт 1 Стрептокиназа нативна Опыт II Стрептокиназа стабилизированна из примеров 1 и 2

эффективность тромболитической терапии .

4,

Стабилизированна стрептокиназа

5может примен тьс дл лечени острых тромбозмболий и тромбозов легочных артерий, мозговых сосудов, периферических артерий (до того, как развилась гангрена), при тромбофлебите, тромбозе периферических вен, остром инфаркте миокардаj тромбозе центральной вены или артерии сетчат ки глаз.

Таблица 1 5 2 2 ой вены кролика 2-31-3 4-15 :4-6 i 4-152-6 нной вены собаки 2-3 -1-3 151-6 151-6 нной артерии собаки 2-31-3 по сравнению с нативной стрептокина зой. Получаемый целевой продукт представл ет собой стрептокиназу, св занную с окисленным декстраном. Сте пень окислени декстрана 5-35%. Св зывание фермента с окисленным декст раном идет по механизму образовани Шиффовых оснований между альдегидны ми группами декстрана и аминогруппами фермента. Реакци св зывани протекает в растворе 30-120 мин. После св зывани с ферментом непрореагировавшие альдегидные группы но сител легко перевод тс в инертные оксигруппы под действием м гкого восстановител - боргидрида натри . Целевой продукт вьздел ют лиофильной сушкой после восстановлени боргидри ;дом натри и после диализа против воды в течение 18-40 ч при дл дополнительной очистки препарата. Пример 1. 2г декстрана полиглюкина раствор ют в 40 мл дистиллированной воды и добавл ют 1,226 периодата кали . Окисление провод т при температуре 22 i 3 С и посто нном перемешивании в течение 1 ч. Полученный раствор окисленного полиглюкина пропускают через хромато графическую колонку, заполненную 10 анионита АРА в ацетатной форме, отбрасьшают объем элюата, равный мертвому объему колонки - 6 мл, и собирают оставшиес 40 мл в мерный цилиндр . : 40 мл .очищенного и окисленного полиглюкина смешивают с 10 мл 0,5М содового буферного раствора рН 9,25 (до концентрации ДАПГ 40 мг/мл) и добавл ют при легком перемешивании 10QO мг стрептокиназы фирмы Берингверк , Реакционную смесь в объеме 50 мл выдерживают при рН 9,9 при комнатной температуре 1 ч, затем ее охлаждают до 4 Си добавл ют мелкими порци ми 450 мг боргидрида натри . Реакци восстановлени проходит в течение 1 ч при рН 9,25. Раствор стабилизированной стрептокиназы разбавл ют апирогенной во дои до. 400 МП и заливают в чейку установки дл диафильтрации ТСГ-10 фирмы АМИКОН . Собирают диафильтрат (1000 мл) и отбрасывают, а раствор в чейке концентрируют до 25 мл., Концентрированный раствор стабилизированной стрептокиназы пропускают через стерильный фильтр Миллипор ;(диаметр пор 0,45 мк) и высушивают ЛИОФИЛЬНО. Выход препарата составл ет 1500мг с удельной фибринолитической активностью 4300 ед/мг препарата и общей активностью 6500000 ФЕ, что составл ет 50% от исходного. Полученный продукт имеет мол.м. 100000. Представл ет собой пористую массу белого цвета, без запаха, без вкуса. Гигроскопичен, легко растворим в воде, в изотоническом 0,9% растворе натри хлорида, практически не растворим в 95% спирте, эфире и хлороформе. Пример2. 1г декстрана-по лиглюкина раствор ют в 20 мл дистиллированной воды и добавл ют 613 Мг. периодата кали . Окисление провод т при температуре 22 t 2 С и посто нном перемешивании в течение 1ч. Полученный раствор окисленного полиглюкина со степенью окислени . 22 + 2% пропускают через стекл нную колонку, заполненную 5 г анионита АРА в ацетатной форме дл полного отделени ДАПГ от анионов НСОО 10, Юз . На выходе из колонки отбрасывают объем элюата, равный мертвому объему колонки -4 мл, а 20 кл содержащие ДАПГ в концентрации 50 мг/мл, собирают в мерный цилиндр. 20 мл очищенного полиглюкина смешивают с 5 мл 0,5М содового буферного раствора рН 9,35 (до концентрации ДАПГ.40 мг/мл) и добавл ют при легком перемешивании 500 мг стрептокиназы фирмы Берингверк. Реакционную смесь в объеме 25 мл вьщерживают при рН 9,1 пр1И температуре 20 ± 2 С 40 мин, охлаждают на бане со льдом до 4°С и добавл ют небольшими порци ми 224 мг боргидрида натри . Реакци восстановлени проходит за 30 мин. Затем раствор стабилизированной стрептокиназы став т на диализ против дистиллированной воды на 18 ч при 4-7 С и высушивают лиофильно. Выход препарата составл ет 1100мг с удельной активностью 1700 ед/мг препарата и общей активностью 1875000 ФЕ, что составл ет 30% от исходного.

Полученный продукт имеет мол.м

100000. Представл ет собой пористую ассу белого цвета, без запаха, без куса. Гигроскопичен, легко раствоим в воде, в изотоническом 0,9%-ном астворе натри хлорида, практически е растворим в 95%-ном спирте, эфие и хлороформе.

Полученный продукт ковалентного

в зывани стрептокиназы с окисленными декстранами удовлетвор ет как клиническим, так и технологическим

требовани м получени лекарственных препаратов: матрица не содержит токсичных групп, избыточные реакционноспособные альдегидные группы во избежание их св зывани с белками , содержащимис в организме, вое- . становлены до гидрокс.ильных, при реакции не используютс высокотоксичные вещества.

Диальдегиддекстран не оказывает, нежелательного побочного воздействи на организм, поскольку токсичность ферментов иммобилизованных на нем не вьппе, а подчас ниже, чем у нативных , а иммуногенность и антигенность ферментов в результате их модификации окисленными декстранами существенно снижаетс .

Биологическа активность полученных препаратов была проверена на экспериментальных животных. Исследование проведено на кроликах-самцах породы шиншилла, весом 2,2-2,5 кг и на беспородных собаках весом 1213 кг.

Исход из предполагаемого пролонгированного фибринолитического эффекта действи стабилизированной стрептокиназы, изучаемую дозу препа7 рата - 30000 - 240000 ед/кг веса раствор ли в физиологическом растворе дл кроликов в 20-30 мл, а дл собак в 50- 100 мл и вводили шприцом на прот жении 20 мин внутривенно струйно, а не по инструкции к стрептазе (внутривенно-капельным методом на прот жении 16-18 ч).

Введение испытуемого (и контрольного ) препарата начинали через 1 ч после образовани тромба. Препарат вводили кроликам в вену на стороне образовани тромба в ремной вене, собаке - в вену задней лапы.

Анализ крови проводили перед началом эксперимента, через 2,3 ч 1, 2, 3 суток после образовани тромба . Дл каждой серии анализов крови животного брали 10-12 мл крови из неповрежденных вен. Кровопотерю восполн ли введением равного коли5 честна стерильного физиологического раствора; Динамику образовани и лизиса тромба наблюдали визуально и мунуально на прот жении первых шести часов опыта, через одни, двое и

0 трое суток. Ангиографию и флюометрию проводили до начала опыта, через одни, двое и трое суток. По завершении эксперимента животных забивали, после чего дл гистологического исследовани брали кусочки кровеносных сосудов в местах фиксации тромбов.

Изучение тромболитической активности стабилизированной стрептокиназы проводили на модел х тромбов

0 бедренных артерий и вен собак и ремной вены кролика (см.табл. 1).

Результаты, полученные на собаках , подтвердили закономерности тром5 болитической терапии, установленные на кроликах.

Дл испытани тромболитической активности нативной и стабилизированной стрептокиназы препараты вводили

0 методом однократной внутривенно-струйной инфузии в течение 20 мин. Результаты приведены в табл. 2.

Таким o6pa30ft}, из полученных данных следует, что минимальна терапевтическа доза стабилизированной

стрептокиназы составл ет 50000ФЕ/кг, оптимальна - свЬше 100000 ФЕ/кг, а тромболитическа активность нативной и стабилизированной стрептокиназы

равнозначны.

Изучение изменений свертывающей и фибрииолитической систем крови.

Проводили измерение времени рекальцификации плазмы после введени подопытньм животным стабилизированной или нативной стрептокиназы (в сек.).

Установлено, что при введении стабилизированной стрептокиназы врем рекальцификации плазмы значительно удлинилось.

Кроме того, проводили определение концентрации фибриногена у подопытных животных в мг% по Г.А.Рутберг .у взвешиванием роздушно-сухого сгустка-фибрина , образованного при рекальцификации цитратной плазмы.

Установлено, что концентраци фибриногена в плазме крови кроликов .

резко снижаетс в первые часы после введени препаратов- стрептокиназы. Через сутки концентраци фибриногена возвращаетс к исходной или возрастает по сравнению с ней. У тех животных , у которых тромбы лизкровалиеь после введени иммобилизованной стрептокиназы, концентраци фибриногена возрастала через сутки в меньшей степени, чем у животных, у которых тромбы не лизировались. У собак . концентраци фибриногена резко падала через 2 ч после введени испытуемых препаратов и нормализовалась через сутки, после чего нарастала. Нар ду с удлинением времени рекальцификации плазмы и снижением концентрации фибриногена через 2-3 ч после введени препаратов наблюдалос также укорочение времени лизиса эугло-20 булиновой фракции плазмы, определ емое по Коваржику. Результаты приведены в табл.3. Полученные результаты свидетельствуют об усилении фибринолитической активности крови. Изменение лизиса эуглобулиновой «(фракции плазмы у кроликов после вве дени опытного и контрольного образ . цов стрептокиназы было столь выраженным , что сгусток из эуглрбулиновой фракции плазмы лизировалс мгновенно. Восстановление тромболитической активности крови до исход- ного уровн происходило через сутки после введени препарата. До опыта лизис тромба эуглобулинового сгустка происходил более, чем за 4ч. Иногда лизиса не бьшо даже через 24 ч. Одна ко, в плазме крови, .вз той через 2 ч после введени препарата, лизис происходил очень быстро, причем у кроликов наблюдалась четка закономерность - если лизис сгустка не ускор лс , то лизиса тромба, как прави ло, не происходило. Изменение лизиса эуглобулииовой фракции крови у собак не столь значительно, как у кроликов и нормализуетс за одни сутки. Дл вьщвлени изменений свертываю щей и фибринвлитической систем крови у кроликов в зависимости от введени нативной стабилизированной стрепто киназы были проведены тромбоэластографические исследовани (ТЭГ) на тромбоэластографе Тромб-2. Результаты приведены в табл. 4.

Приведенные данные показывают, что у тех кроликов, у которых произошел лизис тромбов после введени стабилизированной стрептокиназы, существенные изменени показателей ТЭГ наблюдались лишь черед одни сутки (удлинение 1 , соответствующие невидимой свертываемости и удлинение k,, характеризующее начало образовани , сгустка фибрина). Удлинение времени этих двух величин свидетельствует о гипокоагул ции. Уменьшена и амплитуда та, свидетельствующа об уменьшении в зкости свернувшейс крови. Коагул ционный индекс (с.т) также снижаетс значительно лишь через сутки (на 70% от исходного ) .

При введении нативной стрептоки- назы наибольшие изменени показателей ТЭГ наблюдались уже через 2 ч после введени препарата. Индекс коагул ции снижалс на 75% и через 2 суток показатели ТЭГ полностью нормализовались. В случае же введени стабилизированной стрептокиназы показатели ТЭГ были резко изменены до п ти суток .после введени препарата , т.е. наблюдалась пролонгаци действи иммобилизованной стрептокиназы по сравнению с нативной. У животных, у которых лизис тромба после введени стабилизированной стрептокиназы не произошёл, показатели ТЭГ, измененные через 2 ч пос ле введени препарата, через сутки {практически нормализовались. По данным записи на коагулографе Н-33 обнаружено резкое замедление времени свертывани через 2 ч и 1 сутки после введени стабилизированной стрептокиназы. Через двое суток врем свертывани возвращаетс к норме. В случае введени подопытным животным той же дозы нативной стрептокиназы врем свертывани ускор етс до исходного уже к концу первых суток. В тех опытах, где кроликам была введена больша доза стабилизированной стрептокиназы (свьш1е 100000 ед/кг веса) почти всеми тестами отмечалась пролонгаци действи препарата до трех суток. При этом на тромбозластограмме определ ли резкое удлинение времени свертывани , уменьшение площади ветвей ТЭГ, снижение индекса свертывани . Пролангаци действи фибринолизина на прот жении двух-тре суток подтверждалась и данными коагу лограммы - удлинение времени рекальцификации плазмы, снижение активност ФСФ (фибриносвертывакмцего фактора), толерантности плазмы к гепарину. При проведении подобных испытаний на собаках тромботест также нормализовалс через сутки (изменение показателей ТЭГ, удлинение г и уменьшение амплитуды та, снижение на 70% коагул ционного индекса с от исходного). Токсичность стабилизированной строптокиназы в острых опытах изучена на белых мьпиах и кроликах. В опытах на мышах CWP массой 18-20 г нативную, стабилизированную стрептокиназу и окисленный декстран, вл ющийс матрицей иммобилизованного препарата , вводили внутривенно в виде водных растворов в объеме 0,5 мл. За животными наблюдали в течёние 7 дней. Установлено, что однократное введение нативной стрептокиназы в дозах до 1 г/кг и стабилизированной стрептокиназы и модифицированного де.кстра на в дозах до 2 г/кг не вызывает гибели мьшей и не отражаетс на их поведении и внешней виде (см.табл.5) Полученные результаты позвол ют утверждать, что оба препарата при однократном внутривенном введении мышам в ,дозах, превьш1аннцих макси-. мальные терапевтические дозы в 50100 раз, хорошо перенос тс животными и что стабилизированна стрепто киназа не обладает большей токсичностью , чем нативна . Хорошо переносили стабилизированную стрёптокиназу и кролики. .Внутривенное введение им препарата в дозах .t/iiO и 100 тыс. ЕД/кг не сопровождаось никакими про влени ми токсического действи за.- исключением незначительного увеличени фибринолитичес кой активности крови. После введени модифицированной стрептокиназы в дозе 200 тыс. ЕД/кг имел место несколько более выраженный фибринолиз, однако, и эта. доза препарата никак не сказывалась на состо нии животных Аллергенные свойства стабилизированной стрептокиназы изучали на морских свинках.: Дл определени анафилактогенной активности стабилизированной стрептокиназ .ы морских свинок иммунизировали однократно дозами 1,0, 0,5, 0,13 и 0,05 и 0,005 мг белка/мг, что в пересчете на активность составл ет 31000, 15500, 4200, 1700 и 155 МЕ/кг. Результаты этих исследований, а также сравнение их с данными по нативной стрептокиназе и другим ферментам , обладающим тромболитической активностью, приведены в табл. 6. Как показали испытани , стрептокиназа в стабилизированной форме практически не обладает анафилактоген- ной активностью, особенно при сравнении с такими ферментами, как террилитин и гигролитин. Кожносенсибилизирующую активность стабилизированной стрептокиназы изучали на морских свинках и кроликах. 20|Каждый опыт включал три группы животных по 5-6 штук, которые получали препараты однократно в дозах 31000, 4200 и 1700 МЕ/кг. Кожные реакции учитывали через 3 и 24 ч. Во всех опытах были получены отрицательные результаты. Полученные результаты свидетельствуют , что в испытанном диапазоне дозировок модифицированна стрептокиназа практически лишена кожносенсибиЛизирующей активности, что согла- суетс с данными системой анафилаксии t (АА) и результатами проведени пассивной кожной анафилаксии (ПКА). Таким образом, на основании изучени анафилактогенных и кожносенсибилизирующих свойств иммобилизованной стрептокиназы, можно сделать вывод, что фермент обладает незначительным аллергизирующим потенциалом дл лабораторных животных. Моделирование условий применени модифицированной стрептокиназы в сенсибилизированном организме. Хорошо известно, что на прот жении жизни человек неоднократно стал- ; киваетс в возбудителем стрептококковых инфекций. В результате такого контакта у многих людей наблюдаетс повьш1енное содержание антистрептокиназных антител. В св зи с этим представл лось необходимьв вы снить вли :-. ние предшествующей сенсибилизации к нативному ферменту на иммунный от вет к модифицированной форме. Опыты проводили на мьшгах, морских свинках и кроликах. Дл создани антистрептокиназного -фона животных иммуниЯремна вена

Контроль кролика

То же

Вена собаки Артери собаки

1

Стрептокиназа

Яремна вена кролика нативна

То же

Вена собаки Артери собаки

2

Стрептокиназа

Яремна вена стабилизирокролика ванна из примеров 1 и 2 То же

«

11

Нет То же

Нет

Лизис полный

То же 11

Лизис полный

То же

Лизис полный Лиз.ис полный

Нет

Лизис полный

Нет

Лизис полный

Нет

Лизис полный

То же

Стабилизированна стрептокиназа из примеров 1 и 2 (тромболизис )

4 ч

4ч 4ч

Без эффекта

Стабилизированна стреп- 50,55; токиназа35-40

(тромболиз) 47,65 мин мин

Стрептокиназа нативна

(эффект

тромболиза) 4ч 27 мин

Без эффекта 4ч 4ч

84 мин 64 мин

240000

55000

Лизиса нет 70000 Лизис полный

55000 Лизиса нет 70000

Лизис полный

Таблица 3

13 мин

4 ч4 ч

85,60

120 мин мин

4ч 4 ч 90 мин

2182255122

Число погибших (числитель) и выживших (знаменатель) мышей при внутривенном введении исследованных препаратов

Анафилактогенные свойства стрептокиназы и микробных тромболитических протеиназ Примечание:

Таблица 5

Таблица 6 - - не определ ли; О - анафилактическа реакци отсутствует . Подчеркнуты дозы соответствующие: максимальной, терапевтической (суммарно) 1,85 млн ME 250 тыс. ME и минимальна йсходнал..терапевтическа по рекомендаци м фирмы-изготовител нативной стрептокиназы .

Иммунный ответ к модифицированной стрептокиназе у кроликов, иммунизированных нативным ферментом

А. Без предварительной иммунизации препаратом СКн 1700 0,053,2-3,2

4200 0,133,02,2 33000 1,02,6 Б, После предварительной иммунизации

Резистентность плазмы крови кролика и нативной и модифицированной стрептокиназы

Т а б л и ц а 8 3,0 нативной стрептокиназой

25 Примечание: 26

822551 Продолжение табл.8 отношение количеств СКм и СКн, св зываемых 1 мл плазмы. Титры антител определ ли в РИГА. Соответствуют максимальным разведени м сывороток крови реагирующим с гомоголичным тестантителом.

Claims

Стабилизированная стрептокиназа общей формулы

-о

. СН₂ОН

где - ΝΗ - Стр - нативная стрептокиназа , обладающая тромболитической активностью.

822551

1