JPH07507794A

JPH07507794A - アラビノガラクタン誘導体及びその使用

Info

Publication number: JPH07507794A
Application number: JP6501422A
Authority: JP
Inventors: ジャン、チュー; エンリケ、フィリップ; パルマーシ、スチーブン; ジョセフソン、リー
Original assignee: アドバンスド・マグネティクス・インク
Priority date: 1992-06-17
Filing date: 1992-06-17
Publication date: 1995-08-31
Also published as: EP0646018A1; NO944838L; WO1993025239A1; NO944838D0; CA2135295A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】アラビノガラクタン誘導体及びその使用技術分野本発明は、細胞、特に肝細胞を標的にする治療剤の合成および使用方法に関する。

背景技術治療剤の安全性及び効率は、（１）その固有生物学活性及び（１１）その投与後に達成される生分布の相関関係である。多くの潜在的に有用な治療剤は、特定の病理状態を改善する生化学的活性を有するが、正常な非病理組織における治療剤の通常の存在は、その治療剤の使用を妨げる有害な効果を生じる。正常に機能する人造、骨髄、肝臓組織又は他の器官に対する損傷は、確立された抗ウィルス活性を有する治療剤又は確立された抗癌活性を有する治療剤の使用を制限する。ある病理状態の原因である特定の細胞に対する治療剤を目的し、影響を受けていない正常の組織において得られる濃度を低減する新規な化合物に対する必要がある。目標は、注射又は経口投与後に細胞の特定の細胞集団による取り込みが非修飾剤の取り込みに比し増大するような、治療剤の修飾である。確立されたそして有益な生物学的活性を有する化合物が特定の組織を標的とすることにより、副作用によりその使用が現在制限されている化合物は、安全で効果を生じる薬になり得る。

治療剤は、有利な様式で、ある生理機能を変える目的で投与される化合物である。

治療剤には、放射線防護剤、化学防護剤、坑ウィルス剤、抗体、酵素及びペプチドが含まれる。

治療剤が特定の細胞を標的にする１つの方法には、インターナリゼーションを達成する治療剤を、受容体により認識される担体分子に結合することが含まれる。

特別に興味を有することはアシアログリコプロティン受容体を媒介として標的となることである。この受容体は、正常な肝細胞において高レベルで存在するが、形質転換された肝細胞（肝癌）には低レベルしか又は全く存在しない。診断剤及び治療剤は、アシアログリコプロティン受容体により認識され、細胞を標的とするアシアログリコプロティン担体及びネオグリコプロティン担体に結合される［１１ｅｉｊｅｒ及びｖａｎ　ｄｅｒ　Ｓｕ目ｉｅｓによる、Ｐｈａｒｍ、　Ｒｅｓ、（１９８９年）、６巻、１０５乃至１１８頁のＴａｂｌｅ　ＩＩ及びＲａｎａｄｅにょるＪ、　Ｃ１１ｎ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、（１９８９年）、２９巻、６８５乃至６９４頁参照コ。アシアログリコプロティン受容体を認識する分子は最も多い場合、アシアログリコプロティン又はネオグリコプロティンである。

アシアログリコプロティンは、糖蛋白質のシアル酸を除去し、ガラクトース残基を暴露することによって生成される。ネオグリコプロティンは、多数のガラクトース残基をヒトアルブミンのような非糖蛋白質に結合させることによって生成される。

診断剤及び治療剤を受容体認識担体分子に結合する場合、標的とすることは、受容体のための担体の親和力が維持される場合のみに達成され得る。蛋白質アミン及び、例えばアシアロフ２チュインのような糖蛋白質担体の炭水化物水酸基の特異な反応性がこの目的を達成するのに通常用いられる。蛋白質リジン残基の高度に反応性のアミン基は、選択的に修飾され、一方、炭水化物の水酸基がそのまま残っており、その受容体を続けて認識する。この方法の例は、Ｖａｎ　ｄｅｒＳｌｕｊ　ｊｓらによる上記文献及び＋Ｌｉｖｅｒ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ、　Ｔａｒｇｑｔｅｄ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ａｎｄＴｈｅｒａｐｙ　Ｕｓｉｎｇ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｌｉｇａｎｄｓ　”　（１９９１年）　、Ｇ、Ｙ、　ＷｕyびＣ，［ｌ、　Ｗｕ編、１ｌａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ　Ｉｎｃ、２３５−２６４頁に記載されている。それと対照的に、アラビノガラクタンのような多糖類は、アシアログリコプロティン受容体結合活性を保持する目的で修飾され得る受容体結合部位から遠位のポリペプチドアミノ基を与えない。受容体結合活性の保持を有する多糖類の修飾に関する明らかな方法にもかかわらず、目的とする非経口の医薬の使用は、幾つかの問題にあう。

（１）多糖類は、動物細胞から生成され、ヒト感染ウィルス病原体での非汚染を保証することが主な課題である。

（１１）多糖類は、有機溶媒は、しばしば生物学的活性の損失及び変性をもたらすので一般的に結合合成中に有機溶媒に耐えることができない。

（ｉｉｉ）多糖類は、毒性がある及び／または抗原性があり得る。

（ｉｖ）天然型である多糖類、例えばフェチュインは、ガラクトース残基を有することができず、脱ンアル酸化して受容体と相互作用する担体を生成する。

アラビノガラクタンは、多くの種の木及び他の植物の細胞壁から得られる多糖類の１つの種類である。通常の市販されているアラビノガラクタン源は、アメリカン・ウェスタン・カラマツ［＾ｍｅｒｉｃａｎ　ｆｅｓｔｅｒｎ　１ａｒｃｈ（Ｌａｒｉｘ　ｏｃｃｉｄｅｎｔｌｉｓ　）である。この供給源からのアラビノガラクタンは、食品における結合剤、乳化剤又は安定剤として用いられる。それは、実際には主鎖上のすべての残基においてＬ−アラビノース及びＤ−ガラクトースの１−６結合分技鎖を有する大部分の１−３結合Ｄ−ガラクトース主鎖から成る。カラマツアラビノガラクタンにおいて、ガラクトース対アラビノースの割合は、５対１乃至１０対１であり、一方、植物源からのアラビノガラクタンは、一般に約１対４乃至約１０対１である［Ｃ１ａｒｋｅ、　Ａ、Ｅ、、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｒ，Ｌ、、５ｔｏｎｅ、　Ｂ、＾、によるＰｈｙｔｏｃｈｅｓ＋１ｓｔｒｙ（１９７９N）、Ｉｎ、５２１乃至５４０頁］。多くの多糖類のように、アラビノガラクタンは約１、０００．０００乃至２．０００．０００から約１０．０００ダルトンの値を有する異なる分子量を有することが報告されている［Ｂｌａｋｅ、　Ｊ、Ｄ、、Ｃ１ａｒｋｅ、　１１ル１、Ｊａｎａｇｏｎ、　Ｐ、Ｅ、によるＣａｒｂｏｈｙｄｒ　Ｒｅ５（１９８３年）　、１１５巻、２６５−２７２頁］。Ｌ−アラビノース及びＤ−ガラクトースは、アシアログリコプロティン受容体と相互作用し、一方、グルコース又はマンノースのような通常の単糖類は相互作用をしない［Ｌｅｅ、　Ｈａｅｋｙｕｎｇ　。

Ｋｅｌｍ、　Ｓｏｒｇｅ　、ＩＴｅｒｕｏ　、　Ｙｏｓｈｉｎｏ　５ＳｃｈａｕｅｒによるＲｏｌａｎｄ　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｃｃ、、［Ｉｏ垂垂■| ３ｅｙｌｅｒ　（１９８８年）　、３６９巻、７０５−７１４頁］。

アラビノガラクタンのいくつかの誘導体は以前に製造されている。グラフトコポリマーが製紙［５Ｕ１２８５０９４　］及び土壌処理０Ｐ１０５１１９８　］に用いられてきた。

アラビノガラクタン硫酸塩は、薬剤の吸収及び薬剤延長作用［ＵＳ４６０９６４０　］に影響を与えるために薬剤で塩を生成するのに用いられてきた。アラビノガラクタンの酸性形態は、ウラン酸を含む組成物を自然に有するようになり［Ｃ１ａｒｋｅ。

Ａ、　Ｅｏ、＾ｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｒ，Ｌ、、５ｔｏｎｅ、　Ｂ、＾、によるＰｈｙｔｏｃｈｅ＋ｏｉｓｔｒｙ　（１９７９年）、１８巻、５２１乃至５４０頁コ、アラビノガラクタンからも生成されてきた［ＪＰ６０２１９２０２］。アラビノガラクタンのアルキル、アリルシアノ、ハロ又はアミノ基置換基での誘導体及び有機酸及び酵素蛋白質での結合体が開示され、炭水化物を担体、吸着剤又は樹脂として用いている０Ｐ６０２１９２０１］。幾つかの場合には、アラビノガラクタンは、アシアログリコプロティン受容体との相互作用を壊す可能性があるように高度に誘導化された。例えば、幾つかの場合ではアラビノガラクタンの５０％ものヒドロキシル基が修飾された０Ｐ６０２１９２０１．］が、アシアログリコプロティン受容体に対するアラビノガラクタン誘導体の親和力、又はその欠乏が研究されている。

発明の概略本発明は、アシアログリコプロティン受容体を有する細胞に治療剤を宛てるのに用いることができるアラビノガラクタンの誘導体を提供する。

本発明の特徴である、アシアログリコプロティン受容体により細胞に治療剤を宛てるための多糖類アラビノガラクタンの使用は、この目的に糖蛋白質が用いられる場合に遭遇する問題にうち勝つことができる。

（ｉ）多糖類様の、植物源由来のアラビノガラクタンは、ヒトウィルス病原体で汚染されることがないようである。

（ｉｉ＞アラビノガラクタンは、多糖類であるので、通常、結合合成中に蛋白質を変性する有機溶媒への暴露に耐えられる。多糖類は、圧倒的に糖から成り、反応部位が狭いスペクトルを示し、これは種々の反応部位が望ましくない合成副生物を生じる蛋白質に比べての利点である。この利点については、下記の実施例で明らかにされる。

（市）アラビノガラクタンは、低毒性であり、低抗原性である。

（ｉｖ）アラビノガラクタンは、その天然形態において、アシアログリコプロティン受容体と反応する。このことは、糖蛋白質の終りから二番目のガラクトースを暴露するのに通常用いられる脱アシアリル化反応を回避するので、製造コストを低減することができる。

本願発明者らは、アラビノガラクタンがいくつかの方法で修飾され、アシアログリコプロティン受容体に対する有用な親和力を保持する分子を生成することを見出だした。アラビノガラクタンは、受容体結合部位がら遠位の選択的修飾のための蛋白質又はアミノ基を供給しないので、このことは予期しないことである。

アラビノガラクタンを修飾する能力により、その生物学的活性を維持しながら種々の標的方法を有する広範囲の治療剤のための担体としてその使用が可能になる。

いくつかの場合に、標的方法は、治療剤を病理組織ではなく正常の組織に作用させるのに用いられる。その方法は、正常の組織を他の一般的な毒性の薬剤から保護することが望ましい場合に用いられる。幾つかの場合には、公知のしかし制御された毒性の薬剤が治療に用いられる。通常毒性である放射線と組み合わせて用いられる保護剤の標的方法は、本発明の１つの態様であり、標的方法のこのタイプの例である。癌の治療において化学療法剤とともに用いられる保護剤の標的方法は、本発明の他の態様である。本明細書及び請求の範囲における「治療剤」という用語には、毒性の化学物質又は放射線から保護するための薬剤が含まれる。

本発明のアラビノガラクタン誘導体は、アシアログリコプロティン受容体と協力に相互作用しなければならなく、そうすることによって、前記受容体により標的細胞へ治療剤を直接送るのに用いられる。本発明のアラビノガラクタン誘導体の前記受容体との相互作用の強度を測定するための分析が提供される。

１つの態様において、抗ウイルス治療剤、アデノシンアラビノシドモノー５′− ホスフェート（ＡＲＡ−ＡＭＰ）を、アラビノガラクタンと結合させる。

その他には、ＡＲＡ−Ａ又はアシクロバール（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ　）　、両者は抗ウイルス治療剤であるが、もアラビノガラクタンに別々に結合する。その他の態様では、放射線防護剤、５−２−　（３−アミノプロピルアミノ）エチルチオ燐酸（ＷＲ２７２１として知られている）をアラビノガラクタンに結合する。

本発明は、アラビノガラクタンへの種々の治療剤の結合及び、アシアログリコプロティン受容体のエンドサイト−シス活性によって細胞の細胞質への治療剤のデリバリ−を可能にする方法及び組成物を提供する。

特定の態様の詳細な記載好ましい態様において用いられるアラビノガラクタンは、高度に精製され、実質的にエンドトキシンがな（、そしてウェスタン・ラーチ（ｆｅｓｔｅｒｎ　Ｌａｒｃｈ　）から誘導され、約２．０００ダルトンのサイズ排除クロマトグラフィーによる単一ピークを有する。アラビノガラクタンは、その天然の２０．０００ダルトン形態で用いることができる。他の形態では、アラビノガラクタンのポリマー（２０，０００ダルトン形態より多い分子量）又は分解生成物（２０，０００ダルトン形態より小さい分子量）が用いられ得る。精製されたアラビノガラクタンは、ゲル濾過によって２０．０００ダルトンの単一ピークを有し、アルジトールアセテート法による測定で５対１のガラクトース対アラビノースの割合を有する。アラビノガラクタンは、肝細胞におけるアシアログリコプロティン受容体に結合する［Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ　Ｇｒｏｍａｎらによる、１１ａｇ、　Ｒｅｓ、　Ｉｍａｇ、（１９９０年）、８巻、６３７−６４６頁］。例えば、グルコース又はマンノースのような通常の単糖類はアシアログリコプロティン受容体と相互作用しないが、Ｌ−アラビノース及びＤ−ガラクトースは、アシアログリコプロティン受容体と相互作用することが示されている［Ｌｅｅ　、　［ｌａｅｋｙｕｎｇＳＫｅｌｍらにょるＢｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌ、　、［１ｏｐｐｅ−３ｅｙｌｅｒ　（１９８８年）　、３６９巻、７０５−７１４頁］。アラビノガラクタンのように高度に分岐した多糖類によって示されるようにガラクトースにおける非誘導化４−ヒドロキシル基及び適する糖のクラスターは、アシアログリコプロティン受容体に結合するのに重要な要素である。これらの要件を与え、上記組成及び構造に基づいて、アラビノガラクタンは、デキストラン類、澱粉類、セルロース類、イヌリン類、１−４結合ガラクタン及びアラビアゴムを含む他の多糖類とは区別される。アラビノガラクタンとは化学的には区別されるが、アラビアコムは、アシアログリフプロティン受容体と相互作用するアラビノガラクタンに似ている他の多糖類である。

本発明は、アラビノガラクタンと、ＡＲＡ−ＡＭＰ又はＷＲ２７２１のような治療剤との結合物質を提供する。本発明は、アシアログリコプロティン受容体と相互作用するアラビノガラクタンの誘導体も提供する。アラビノガラクタン誘導体がアンアログリコプロティン受容体によって認識されると、治療剤は、前記受容体を有する細胞、主に肝細胞を標的にして送られ得る。アシアログリフプロティン受容体は、原発性（ｐｒｉｍａｒｙ　）肝細胞癌において劇的に低減され、肝臓に対する第二次癌（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　ｃａｎｃｅｒｓ）では全くなくなるが、正常な肝細胞では高濃度で見出だされる［Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ　、　ＧｒｏｉａｎらによるＭａｇ、　Ｒｅｓ、　Ｉｍａｇ、（１９９０年）、８巻、６３７ −６４６頁］。肝細胞は、前記受容体を有する主な細胞であり、注入された放射性同位元素を用いて識別されるアシアログリコプロティンの多くの割合のエンドサイト−シスを行う［Ｈｕｂｂａｒｄ、　ｆｉｌｓｏｎらによるＪ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　（１９７９年）、８３巻、４７−６４頁コ。しかし、アシアログリコプロティン受容体は、クツパー細胞［Ｌｅｅ　、　ＢａｅｋｙｕｎｇらによるＢｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ　（１９８８年）　、３６９巻、７０５−７１４頁］、骨髄細胞［Ｓａｍｏｌｏｓｋｉ及びＤａｙｎｅｓによるＰｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

（１９８５年）、８２巻、２５０８−２５１２頁］及びラット精巣（ｒａｔ　ｔｅｓｔｉｓ）　［＾ｂｕｌｌａｈ及びＫｉｅｒｓｚｅｒｂａｕｍによるＪ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　（１９８９年）、１０８巻、３６７−３７５頁］において検知される。治療剤の有用な量がアシアログリコプロティン受容体を有する細胞を標的にして送られる。同様に、幹細胞を含むいずれかの受容体を有する細胞は、アラビノガラクタンに基づく、受容体を標的にした放射線防護剤で保護される。

ＡＲＡ−ＡＭＰは、その使用が重篤な神経の副作用に関与するが、Ｂ型肝炎の治療において評価されている治療剤である［Ｌｏｋ、　Ａ、Ｓ、　、ｆｉｌｓｏｎ、　Ｌ、＾、らによる、Ｊ、　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ、　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、　（１９８４年）、１４巻、９３−９９及びｔｌｏｆｆｎａｇｅｌ、　Ｊ、ＨｌらによるＪ、　Ｈｅｐａｔｏｌ、（１９８６年）、３巻、３７３−８０］、アラビノガラクタンに結合し、ウィルス復製が進行する（肝細胞）細胞を有するアシアログリコプロティン受容体を標的に【７て送られるＡＲＡ−ＡＭＰは、中枢神経系における薬剤の濃度を低減し、ウィルス複製器官における薬剤の濃度を増大することによって、望ましくない副作用を低減することが期待される。ＡＲＡ− ＡＭＰは、アシアログリコプロティン受容体により認識される糖蛋白質に結合される［ＵＳ４７９１４７０　］。この目的に用いられ得る他の抗ウイルス治療剤にはアシクロバール（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ　）及びアラ−Ａ（＾ｒａ−＾）が含まれる。

本発明の教示により、標的に送られる第二のタイプの抗ウィルス剤は、抗体である。本明細書における抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又は抗体フラグメントが含まれる。血清における抗体の自然生成は、ウィルスへの過去の暴露を反映するが、ウィルスの複製は、細胞の細胞質内に生じるので保護活性はほとんどないかまったくない［１，１１，Ｒｏｉｔｔ、　Ｅｓ５ｅｎｔｉａｌ　Ｉｃｍｕｎｏｌｏｇｙ。

Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ロンドン（１９９１年）、２８頁］。特に、Ｂ型肝炎複製が肝臓の肝細胞内に生じ、ウィルス抗原に対する抗体がこの複製中にウィルスに直接結合することができない。Ｂ型肝炎ウィルス蛋白質に対する抗体をアラビノガラクタンに結合させる場合、アシアログリコプロティン受容体により肝細胞の細胞質を標的として直接送る。細胞質内で抗ウイルス抗体はＢ型肝炎複製ウィルスに結合し、有効な治療剤になる。

記載したアラビノガラクタン誘導体のいくつかは、受容体に結合する能力以外の公知の薬学的効果を有するが、治療剤を結合するための例えば、誘導体のアミノ、カルボキシル、スルフヒドリル、ホスフェート又は他の官能基への結合のための基質を提供する。得られる結合体は、アシアログリコプロティン受容体を有する細胞を標的として治療剤を直接送る。スクシニル−アラビノガラクタン、グルタリル−アラビノガラクタン及びＤＴＰＡ−アラビノガラクタン結合体により提供されるカルボキシル基（実施例１Ｏ−１２）は、カルボニイミド（ｃａｒｂｏｎｉｉｍｉａｅｓ）又は他の薬剤の使用によって分子を結合するのに用いられ得る。アラビノガラクタンヒドラジド（実施例３）又はポリーＬ−リジンアラビノガラクタン（実施例６．８）によって提供されるアミノ基も、種々の反応によって治療剤を結合するのに用いられる。ポリーＬ−リジンの強い陽電荷は、イオン交換力により陰電荷に荷電された核酸のような幾つかの物質を付着させる［１１ｕ、　Ｇ、Ｙ、及びｌｕ、　Ｃ，ｔｌによるＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　（１９８７年）　、２６２巻、４４２９−２２３２１　、本発明の好ましい態様は、アラビノガラクタンとポリーＬ−リジンを含む組成物であり、意図するその使用は、遺伝子又は非経口投与において用いられるアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　）オリゴヌクレオチドのための担体としてである［Ｄｅｇｏｌｓ、　Ｇ、、Ｌｅｏｎｅｔｔｉ。

Ｊ、Ｐ、、Ｇａｇｎｏｒ、　Ｃ，、Ｌｅｍａｉｔｒｅ、　１１．．１．ｅｂｌｅｕ、　Ｂ、によるＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５（１９８９年）、１７巻、９３４１−５０コ。ポリーＬ−リジンの他に、デキストリン、デキストラン又はアルブミンのような他の重合分子がアラビノガラクタンに結合し得る。

その他の態様では、アラビノガラクタンのガラクトースオキシダーゼ治療がアルデヒド基を生成させるのに用いられる。このアルデヒド基は、ジアミノ化合物（例えばエチレンジアミン）と反応し、シッフ塩基を生成し、その後に水素化ホウ素ナトリウムによって還元される。アラビノガラクタンの得られるアミノ誘導体は、その後に治療剤の結合に用いられる。

同様にＷＲ２７２１は、放射線療法中［Ｋｌｉｇｅｒｍａｎ、　Ｍ、Ｍ、　、Ｌｉｕ、　Ｔ、　、Ｌｉｕ。

Ｙ、　、Ｈｅ、　Ｓ、、Ｚｈａｎｇ、　Ｚ、　、７ｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｌｏｄｉｆｉｅｒｓ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　（１９９１年）　、Ｃｌｅａｒｗａｔｅｒ、　ＦＡ３３ｇ−３４０］又■■ 学療法中［５ｃｈｅｉｎ、　Ｐ、Ｓ、　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ麗ｏｄｉｆｉｅｒｓｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　（１９９１年）　、（１ｅＢｒｖａｔｅｒ、　Ｆ＾３４１−３４２　］の癌患者の正常細胞の保護するのに用いられ得るか否か確認するための最近の医療研究の主題であった。化学保護剤としてのＷＲ２７２１の有用性については、正常細胞を選択的に保護する確証がないことに基づいて、すなわち放射線から正常細胞及び癌細胞を保護し得ることに基づいて異議が唱えられていた［Ｔｈｅ　Ｐｉｎｋ　５ｈｅｅｔ、　２月３日（１９９２年）、５４巻、＃５コ。ＷＲ２７２１のアラビノガラクタンへの結合はこの欠点に打ち勝ち、その薬剤をアシアログリコプロティン受容体を有する細胞に向ける。アシアログリコプロティン受容体が主に非癌性肝細胞に見出だされるのでＷＲ２７２１の放射線保護活性は、正常細胞を標的とする（上記参照）。

ＷＲ２７２１以外の遊離基スカベンジャーをアラビノガラクタンに結合させ、受容体所有細胞を標的にすることができる。それらのスカベンジャーにはメラニン類［Ｈｉｌｌ、　Ｈ，Ｚ、、Ｈｕｓｅｌｔｏｎ、　Ｃ，、Ｐｉｌａａ、　Ｂ、　、Ｈｉｌｌ、　Ｇ、Ｊ、、Ｐｉｇ＋ｍｅｎｔ　Ｃｅ１ｌＲｅｓ、（１９８７年）、１巻、８１−６］　、トｏ　ロツクス（Ｔｒｏｌｏｘ）　［ｆｕ、　Ｔ、ｆ、、１（ａｓｈｉｍｏｔｏ、　Ｎ、　、Ａｕ、　Ｊ、Ｘ、、ｆｕ、　Ｊ、、Ｍｉｃｋｌｅ、　Ｄ、＾９、Ｃａｒｅｙ、　Ｄ、　、ｌｌｅｐａｔｏ撃盾■凵i １９９１年）、１３巻、５７５−８０頁］、システアミン誘導体［５ｃｈｏｒ、　Ｎ、Ｆ、　、５ｉｕｄａ。

Ｊ、Ｆ、　、Ｌｏｍｉｓ、　Ｔ、Ｊ、、Ｃｈｅｎｇ、　Ｂ、　、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、（１９９０年）、２６７巻、２９１−６頁］カチオンアミノチオール類、一般的にはグルタチオール類及びビタミンＥ誘導体が含まれる。

合成後、アラビノガラクタン誘導体とアシアログリコプロティン受容体との相互作用が生体内で測定され得る。誘導体のアシアログリコプロティン受容体とが相互作用する能力を先行技術に基づくアシアログリコプロティン受容体と相互作用すると認められる物質のクリアランスを阻止する能力により評価する。アラビノガラクタンを被覆した超常磁性酸化鉄コロイドがこの受容体と相互作用し、そのクリアランスの定量分析は下記に記載した。阻止剤がない場合、アラビノガラクタン被覆超常磁性酸化鉄は、２．８分の血中半減期を有するアシアログリコプロティン受容体により迅速に除去される。アシアログリコプロティン受容体と遊離アラビノガラクタンとの相互作用より、この物質の血中半減期の増加がもたらされ、アラビノガラクタン誘導体の阻止能力を評価する基礎が提供される。

血中半減期を決めるために、スブラーグ・ドウリイ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラット（２００−３００ｇ）に麻酔をし［インアクチン（Ｉｎａｃｔｉｎ　）　１００　ｒａｇ／ｋｇコ、そして阻止剤の所定量注射し、アラビノガラクタン被覆超常磁性酸化鉄を４０マイクロモル（ｕｍｏｌｅｓ）　Ｆ　ｅ　／　ｋｇ注射した。血液を採取し、１／Ｔ１、スピン−スピン緩和速度を決定した。１／Ｔ１の増大は超常磁性酸化鉄の濃度に直接比例し、１／Ｔ１における差から、血中半減期を記載のように測定する［ジョセフソン（Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ　）らによるＭａｇ　Ｒｅｓ、　Ｉｍａｇ、　（１９９０年）、８巻、６３７−６４６頁］。

表１は、アラビノガラクタンが、阻止剤としてのその活性を失うことなく　（受容体結合活性）、多くの異なるタイプの反応により生成する実質程度の修飾を許容する。抗体及び酵素を用いて共有結合修飾、特に高度の共有結合修飾は生物学的機能を一般的に低減するか又は破壊することを示した。従って、アラビノガラクタンは、受容体認識生物学的活性の優れた保有を有するランダムの修飾を許容することは驚くべきことである。事実、試験した２つの誘導体、ホスホリルアラビノガラクタン及びスクシニルアラビノガラクタンは、その元であるアラビノガラクタンよりも阻止剤としてより強力である。この非常に驚くへべき改良された反応性についての根拠は不明である。一方、ラクトース、三糖類含有ガラクトースは、アラビノガラクタンよりも実質的に活性が小さい阻止剤である。アシアログリコプロティン受容体に対するアラビノガラクタンの結合親和力を損なう誘導化方法の能力を実施例１８で示す。その酢酸誘導体は、アラビノガラクタン酢酸塩のｇ当り５ミリ当量の酢酸塩より大きい能力を有しており、実質的に低減した阻止活性を示す。

アラビノガラクタン結合剤が阻止分析において不活性である場合、すなわち、血中半減期を延長しない場合、低い程度の修飾をするように結合合成において用いる条件を調整し得る。その代わりとして、用いる修飾戦略を全くやめて異なる方法を用い得る。

表１アラビノガラクタン誘導体とアシアログリコプロティン受容体との相互作用実施例はアラビノガラクタンがホスフォリル、スルフヒドリル、アミノ、カルボキシル、ハロまたはアシルイミダゾール基の付加により修飾され得て、受容体結合活性は影響を受けないことを下記に示す。最初の修飾は、アラビノガラクタンのヒドロキシル基においてなされる。誘導体は、例えばアラビノガラクタン−Ｗ　Ｒ２７２１またはアラビノガラクタン−ＡＭＰのように、治療剤との結合物質を生成するのに用いられ得る（表１）。いくつかの場合には、知られている治療活性のないアミノ又はカルポキンアラビノガラククン誘導体の製造を記載する。それらの誘導体は、一般的に公知の架橋及び結合化学を用いて１．誘導化したアラビノガラクタンのアミノ基又はカルボキシ基に広範囲の薬剤又は配位子を結合するのに用いられ得る。それらの誘導体はまた、遺伝子、蛋白質、抗体及び酵素のような巨大分子をアラビノガラクタンに結合するのにも用いられ得る。適用できる反応の最近の概論は、Ｓ、ｆ、　ｌｏｎｇによる、”Ｃｈｅｇ＋ｉｇｔｒｙ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎａｎｄ　Ｃｒｏｓｓ−１ｉｎｋｉｎｇ″ＣＲＣＰｒｅｓｓ　Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ　（１９９１年）である。蛋白質を固体相アミノ又はカルボキシル基に結合するのに用いられる作用剤は、又、わずかな修飾の後にも用いられ得るＣ１．　Ｃｈｉｂａｔａ、“Ｉｔｎａｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｅｎｚｙｍｅｓ”、Ｈａｌｓｔｅａｄ　Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９７８年）を参照コ。有用な薬理学的作用物質を供姶するためにアラビノガラクタンに結合され得る治療剤の幾つかの実施例を表２に挙げる。

アラビノガラクタン又はアラビノガラクタン誘導体に結合された又はされ得る治療剤実施例実施例１：アラビノガラクタンの臭素化用いられるアラビノガラクタン（ＡＧ）は、ウエスタンラーチ（ｆｅｓｔｅｒｎＬａｒｃｈ　）からのもので、クロマトグラフでは、サイズ排除クロマトグラフィーにより、約２０．０００ダルトンの単一ピークを示す。

１０ｇのアラビノガラクタンをＺ　ｎ　（Ｂ　Ｆ　４）　２の７．１％（ｗ／ｖ）溶液３５ｍ１に溶解した。エビブロモヒドリン５０ｍ１を添加し、溶液を１００℃で９０分間攪拌した。

プロモーアラビノガラクタンを１５０ｍ１の冷（４℃）アセトン中に沈殿させ、水に再溶解し、１５０ｍ１の冷エタノール中に沈殿させた。生成物の臭素に関する分析は生成物ｇ当り０．７ミリ当量の臭化物を示した。

実施例２：水素化ホウ素ナトリウムでのアラビノガラクタンの処理水素化ホウ素ナトリウム１０ｇをアラビノガラクタンの２８．６％（Ｗ／Ｗ）溶液３．５００　ｇに添加した。その混合物を一晩攪拌し、その後に３．５００ダルトンの遮断（ｃｕｔ−ｏｆｆ）透析管を用いて水３５１（水は毎日取り替えた）で６日間透析し、未反アラビノガラクタンと比較するのにアルデヒドについて３−メチル− ２−ベンゾチアゾロンヒドラゾン試験を用いた。アラビノガラクタンはアルドヒトの青い染色形成特徴を示し、生成した還元アラビノガラクタンは染色を示さず、本質的に完全な還元を意味した。

実施例３：ヒドラジノ−アラビノガラクタン還元アラビノガラクタン（実施例２）１０ｇをｚｎ（ＢＦ４）２の７．１％（Ｗ／Ｖ）水溶液３５ｍ１に溶解した。

エビブロモヒドリン５０ｍ１を添加し、溶液を１００℃で９０分間攪拌した。臭素化アラビノガラクタンを１５０　ｍｌの冷（４℃）アセトン中に沈殿させ、水に再溶解し、１５０　ｍｌの冷エタノール中に沈殿させた。この臭素化アラビノガラクタン生成物５ｇをｐＨ８の０．３Ｍの水性ホウ酸塩１５ｍ１中に溶解した。ヒドラジン１０ｇを添加し、そして混合物を室温で２４時間攪拌した。ヒドラジドアラビノガラクタンを１５０ｍ１の冷（４℃）アセトン中に沈殿させ、水に再溶解し、１５０ｍ１の冷エタノール中に沈殿させた。生成物のヒドラジド含量を酸−塩基滴定により分析し、生成物ｇ当り０６２５ミリ当量のヒドラジドを示した。

実施例４：アデノシン−５′−モノホスフェート（ＡＭＰ）に結合させたアラビ酸水素ナトリウム粉末の添加をさせた２０ｍ１の水に溶解させた。アラビノガラクタンヒドラジド（０，６ｇ、実施例２）を添加し、ｐＨを水酸化ナトリウムで７．５に調整した。Ｉｇ（５，２ミリモル）の１−エチル−３，４−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを添加し、その反応を室温で６４時間維持した。

アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）　ＹＭ３限外濾過器を用いて限外濾過によって生成物を精製し、さらにエタトルでの沈殿によって精製した。３２３■の生成物の収量を得た。０．１ｍＭ５ｐＨ７，０燐酸緩衝液、流量０．５ｍｌ／分を用いてカチオン交換クロマトグラフィー　（Ｒａｉｎｉｎ　５ｙｎｃｈｒｏｐａｋ　、強力チオン交換Ｓ　ｏ　３００Ａ１２５Ｘ０．５　ａ１１カラム）により、生成物を分析した。誘導化されていないＡＭＰ　（保持時間６．３分）に対する証拠を有しない５．７分で単一の広いピークが観察された。２６０ｎｍでカーブモニタリング下でＨＰＬＣ領域の比較に基づいてＡＧ−ＡＭＰ生成物のｇ当りＡＭＰ分子の数は０．２４であり、これは利用できるヒドラジド基のおよそ９５％の変換を示した。ＡＧ−ＡＭＰ生成物のＵＶ／ＶＩ　Ｓスペクトルは事実上、誘導化されていないＡＭＰと同一であった。サイズ排除（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃ１１ｌｕｆｉｎｅ　ＧＣ２００１１）クロマトグラフィーは、誘導化されていないアラビノガラクタンとおよそ等しい分子量、約２０．０００ダルトンを示した。

ＡＧ−ＡＭＰの活性を上記のように動物モデルで評価した。この物質１５０■／ｋｇは、超常磁性鉄−酸化物コロイドの有効な遮断剤であり、そのコロイドの半減期を１００分間より長い半減期に延長させた（表１）。

実施例５：アデノシンーアラビノシドー５′−モノホスフェート（ＡＲＡ−ＡＭＰ）に結合させたアラビノガラクタンアデノシンーアラビノシド−５゛−モノホスフェート（ＡＲＡ−ＡＭＰ）１　ｇ（２，９ミリモル）を、炭酸水素ナトリウム粉末の添加をさせた２０ｍ１の水に溶解させた。次にアラビノガラクタンヒドラジド、０．６ｇ（実施例２）を添加し、ｐＨを水酸化ナトリウムの添加で７．５に調整した。１−エチル−３，４−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを添加し、その反応を室温で６４時間維持した。アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）　ＹＭ３限外濾過器を用いて限外濾過によって生成物を精製し、次にエタノールによる沈殿によりさらに精製した。ＡＧ−ＡＭＰ　（実施例３）におけるように強（ｓｔｒｏｎｇ）カチオン交換クロマトグラフィーは、５．７分間で単一の広いピーク中心を示し、残存する未反応のＡＲＡ−ＡＭＰは測定されなかった。ＡＧ −ＡＲＡ−ＡＭＰ（７）ＵＶ／ＶＩ　Ｓ７．７ベクトルは事実上、ＡＲＡ−ＡＭＰ標準と同一であった。２６０ｎｍの光学濃度でのカーブ下での領域に基づいて、そして、ＡＲＡ−ＡＭＰと同じ係数を有すると仮定されるＡＭＰ標準との比較で生成物は、ｇ当りＡＲＡ−ＡＭＰの０．１２４　ミリ当量を有した。

実施例６：ポリ（Ｌ）リジルアラビノガラクタン（還元アミノ化により製造された）ポリ（Ｌ）リジン塩化水素（１０００−４，０００ダルトン、０．５ｇ）をホウ酸塩緩衝液（０，２Ｍ）　２ｍｌ中に溶解させ、ｐＨを水酸化ナトリウムで９．０に調整した。アラビノガラクタン１００■及びシアノボロヒドリドナトリウム５０■を添加し、５０℃で２４時間反応を進めた。その生成物混合物をアミコン（八ｍ１ｃｏｎ）　ＹＭ３限外濾過器を用いて精製した。ポリリジンアラビノガラクタン結合体を含む保持物質はアミンに対して陽性のニンヒドリン試験を示し、多糖類に対して陽性のアントロン試験を示した。３０■の生成物の収量を得た。サイズ排除高性能液体クロマトグラフィー　（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｅ１ｌｕｆｉｎｅ　ＧＣ２００Ｍ　）は、アラビノガラクタンとポリ（Ｌ）リジンの分子量の合計におよそ等しい分子量、すなわち約２５．０００ダルトンを有する生成物を示した。

実施例７：アクリルイミゾールーアラビノガラクタン無水アラビノガラクタン３ｇを無水過酸化物がないジオキサン５ｍｌ中に懸濁させた。攪拌しながら、１０ｍ１のジオキサンに溶解させた１、６２ｇ　（１０ミリモル）のＮ、Ｎ−一カルボニルジシミダゾールを一部に添加した。２０分間攪拌後、アシルイミダゾール −アラビノガラクタンを濾過［中間フリット（ｍｅｄｉｕｍ　ｆｒｉｔ　）　］により回収した。生成物を２５ｍ１のジオキサンで洗浄し、再濾過した。第二のジオキサン滴定を行った。次に生成物を２５ｍ１のａｐｆ−ジエチルエーテルで滴定し、その後、真空乾燥した。収量は、２．９ｇであった。

実施例ｉ（・ポリ（Ｌ、　）リジン−アラビノガラクタン（Ｔシルイミグゾールーアラビノガラククンから製造した）アシルイミグゾ・−ルーアラビノガラクタン（実施ｔｙ４７）Ｉｇとポリ（Ｌ）リン；　（１，０００−４，００００グルトン）０．２ｇをホウ酸塩緩衝液（０，２Ｍ）　５１１Ｉ中に溶解さ（恢ｐｌ（を水酸化ナトリウムで８．６に調整した。反応を５℃で２４時間進めた。生成物を最初にエタノール中の沈殿により単離し、次にアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）　ＹＭＩＯ限外濾過器を用いて精製した。

保持物質は、ニンヒドリン試験とアントロン試験を用いてそれぞれアミン及びカルボヒトレートに陽性試験を示Ｉ７、一方、最終濾過物は、アミンには陰性であった。収量は３１０■であった。

２５ｍＭ、ｐＨ５，５の燐酸緩衝液を流量１ｍ１Ｚ分で用いてカチオン交換クロマトグラフィー　ＨＰ　Ｌ　Ｃ（Ｒａｉｎｉｎ　５ｙｎｃｈｒｏｐａｋ　、強カチオン交換桐脂、Ｓ。

３０ＯＡ、　２５Ｘ０．５　ａｎ）により、生成物、ポリ（Ｌ）リンルーアラビノガラクタンを分析した。生成物、アラビノガラクタン−ポリリジンは、３．９分間の保持時間で溶離し、非結合ポリリジンは９．３分間の保持時間で溶離した。アラビノガラクタンに結合したポリ（Ｌ）リジンはそのＵ■スペクトルによって証明された。

実施例９．ホスフォリルーアラビノガラクタンアラビノガラクタン２ｇをホルムアミド２０ｍ１及びトリエチルアミン４ｍｌ中に溶解させた。ポリホスフォン酸１０ｇを添加し、その反応を１６時間攪拌させた。その生成物を４５％のＮａＯＨでｐ　Ｈ９にし、３．０００分子量の遮断（ｃｕｔｏｆｆ）膜（アミコ／）を有する攪拌細胞５０ｍ１において、容積を５０ｍ１から１０ｍ１にし、２回限外濾過した。限外濾過生成物を５００ｍ１の冷アセトン（４℃）で沈殿させ、再溶解させそし、て５００ｍ１の冷エタノール中に再沈殿させた。酸塩基滴定によりそして無機リン酸塩の比色定量（無機燐キット、シグマケミカル、ミズーリー州、セントルイス）により、そしてその後にトリフルオロ酢酸加水分解（２Ｍの酸で１２０℃で１時間）により、生成物は、生成物ｇ当り０．２１ｍ１当量のリン酸塩を示した。

ホスフォリル化アラビノガラククンの活性を上記のように動物モデルで評価した。この物質１５０■／ｋｇは、超常磁性鉄−酸化物コロイドの有効な遮断剤であり、そのコロイドの半減期を５１分間より長い半減期に延長させた（表１）。

実施例１０．ガラクトースオキシダーゼ（Ｇｏ）でのアラビノガラクタンの処理アラビノガラクタン１０ｇを０．ＩＭのｐｌＩＧ、ｏリニ・酸カリウム緩衝液ｐＨ６，０に溶解させ、約５０ｍ１の総量に１．た。得られた溶液１ご、約２ｍｌの同緩衝液中に溶解させたガラクトースオキシダーゼ２２５ユニツトを添加した。室温で２４時間、酸化を進めた。過酸化物試験ストリップで測定し、Ｈ２Ｏ２含量が約３■／ｍｌであることがわかった。反応混合物にＧｏの２２５ユニツトの第二の添加を行った。さらに２４時間の反応時間の後に、過酸化物含量は、約３■／ｍｌでの最初のＧｏ処理の結果と違わないことがわかった。カタラーゼ（乾燥固体）２０■を添加して過酸化物を分解させた。室温で一晩放置後、フラスコの内容物には過酸化物がないことが見出だされた。

生成物濾過：１０ｇの混合した層樹脂（ｂ′ｅｄ　ｒｅｓｉｎ）　、Ｍ　Ｂ　− １をフラスコに添加した。３０分間攪拌後、溶液をデカンタし、付加的ＭＢ−１樹脂５ｇを含有する類カラムに通過させた。そのｐＨ中性溶液は、ニンヒドリンとの反応により、蛋白質アミンがないことがわかった。生成物を５℃に冷却した無水エタノールからの沈殿により単離させた。その沈殿物を濾過により回収した。その生成物のアルデヒド含量は、本来のアラビノガラクタンのアルデヒド含量より３乃至５倍多いことがわかった。収量は１０ｇであった。

アルデヒド基の数の決定、アルデヒドについての３−メチル−２−ベンゾチアゾロンヒドラゾン試験を行い、アラビノガラクタン出発物質をポリ−アルデヒドアラビノガラクタンと比較した。６７０ｎｍで測定した吸収に基づいて、このポリ −アルデヒドアラビノガラクタンは、アラビノガラクタンｇ当り０．３４ミリ当量のアルデヒドを有していた。

実施例１１．スクシニルアラビノガラクタン精製したアラビノガラクタン（１６，０ｇ　、　０．７０ミリモル）とスクシニル無水物（１０゜Ｏｇ、１００　ミリモル）を６０℃でＤＭＳＯ（２００ｍｌ）中に溶解させた。１．０時間後、透明な明るい黄色の溶液を周囲温度に冷却し、さらに４８時間攪拌した。

ＤＭＳＯ溶液をＨ２０（２００ｍｌ）に添加し、アミコンＹＭ３限外濾過膜で濾過し、１（ｃ＝ｏ）であった。００１Ｎの水酸化ナトｌＪ’７ムとの結合体の水溶液の滴定では、スクシニルアラビノガラクタンｇ当り１．９６ミリ当量のスクシネートの存在を示した。

スクシニルアラビノガラクタンの活性を上記の動物モデルにおいて評価した。

この物質の１５０■／ｋｇは、超常磁性鉄−酸化物コロイドの有効な遮断剤であり、そのコロイドの半減期を２１３分に延長させた（表１）。

実施例１２：ＤＴＰＡアラビノガラクタン精製したアラビノガラクタン（２０，０ｇ、　０．８７ミリモル）とジエチレントリアミンペンタ酢酸（Ｄ　Ｔ　Ｐ　Ａ）の二無水物（２，ｔ５ｇ、　６．０２ミリモル）を６０℃でジメチルスルフオキシド（ＤＭ　Ｓ　０．２００　ｍｌ）中に溶解させた。０．５時間後、透明な温源過膜［それぞれ５．０００及び１．０００ダルトン遮断（ｃｕｔｏｆｆ）　］でその溶液を濾過１（Ｃ＝Ｏ）でのバンドを示した。０．０１０　Ｎの水酸化ナトリウムとの結合体の水溶液の滴定では、ＤＴＰＡアラビノガラクタンｇ当り０．１１７　ミリ当量のＤＴＰＡの存在を示した。

実施例１３　グルタリルアラビノガラクタン精製したアラビノガラクタン（２０，０ｇ　、　０．８７ミリモル）と無水グルタル酸（５，ＯＯｇ、　４４ミリモル）を６０℃でジメチルスルフオキシド（ＤＭＳＯ１２００ａｌｌ）中に溶解させた。反応混合物を周囲温度に冷却し、１６時間反応させた。

ＩＲ（ＫＢｒ）は、１７２６ａｎ　’　（Ｃ＝Ｏ）でのバンドを示した。

実施例１４．チオホスフェートデキストランからの５−２−　（３−アミノプロピルアミノ）エチル−チオホスフェートデキストラン−アラビノガラクタンデキストランのポリチオホスフ中すル化、デキストランＬｏｇを６０ｍ１の無水ピリノン中に懸濁させた。その懸濁液を氷水浴中で冷却した。攪拌しながら、その冷却した懸濁液に１０ｍ１　（９８゜４ミリモル）のチオホスフオリルクロライドを１加した。

添加が完了したらすぐに反応混合物を定速的に攪拌しながら室温に暖めた。次にその反応フラスコを油浴に浸し、４℃で１６時間加熱した。

わずかに黄色の反応混合物を水浴で冷却した。冷却したらすぐに、反応懸濁液を激しく攪拌しながら、水をゆっくりと１加した。約１０ｍ１の水を反応混合物に添加した後に、ｐＨが９．５になるまで１ＮのＮａＯＨの溶液を添加した。その後、その溶液を室温で蒸発させて油にした。その残渣を水２０ｍ１と混合し、透明な均質の溶液を得た。この溶液を激しく攪拌している２００ｍ１の０℃のエタノールに１加した。得られた白色沈殿物を粗い濾過漏斗上に回収し、真空下で乾燥した。

０．５Ｍの塩酸との滴定により、チオホスフェートの１ミリモルが多糖類ｇ当りに組み込まれていることが示された。

２−（３−アミノプロピルアミノ）エチルプロミド、ンヒドロブロミドの合成：２３．６ｇ　（２００ミリモル）の氷で冷却した２−（ω−アミノプロピルアミノ）エタノールを２００ｍ１の、氷で冷却した４ｇ−５２％の臭化水素酸に少しずつ添加した。

１時間攪拌後、反応混合物を１６−２０時間加熱して還流した。反応混合物を真空乾燥し、赤みがかった色の油を得た。その油を３００ｍ１のアセトンで滴定し、４時間冷蔵した。アセトンの母液をデカントしてゴム状の残渣から除去した。

その残渣を７５ｍ１の水で溶解し、得られた溶液を６００ｍ１の冷アセトンに添加した。結晶沈殿物を回収し、次に沸騰メタノール中に再溶解させた。その得られたメタノール溶液をエチルエーテルとアセトンの５０％混合物（４００ｍｌ）に添加した。その混合物を一晩冷却後、純粋の白色結晶を回収し、真空乾燥させた。その生成物の融点（ま、報告されているように２０５−２０６℃であった［Ｐｉｐｅｒ、　Ｊ、Ｒ，らによる、Ｊ、　ｌｅｄ。

Ｃｈｅｍ、　、１．２巻、２３６−２４３頁（１９６９年）］。

ポリチオホスフオリル化デキストランの２−（ω−アミノプロピルアミノ）エチルプロミドとの反応による５−２−（３−アー肛ノニ６已ｅｔ＋ヨ二五）ｌ二五 ±に二二オホスフエートーデキストランの生成：ボリチオホスフオリル化デキストランのナトリウム塩５ミリモルを１０ｍ１の水に溶解させた。上記の溶液に、１０ｍ１の水蓚こ溶解させた５、５　ミリモルの２−（３−アミノプロピルアミノ）エチルプロミドジヒドロプロミドを添加した。その透明な溶液を室温で４時間攪拌した。得られた濁った溶液を迅速に攪拌した０℃のエタノールに１加した。得られた沈殿物を濾過により回収した。生成物を、２５ｍ１の暖かい（４０− ５０℃）のエタノールで２回洗浄し、真空乾燥した。チオアルキル化の程度をニンヒドリンの比色分析により測定した。

５−２−　（３−アミノプロピルアミノ）エチル−チオホスフェート−デキストランのアラビノガラクタンアシルイミダゾールとの反応：　５−２−　（３−アミノプロピルアミノ）エチル−チオホスフェート−デキストランをアラビノガラクタンアシルイミダゾール（実施例７）と４℃で１６時間反応させた。生成物を単離し、ＹＭＩＯ瀘過膜を用いて限外濾過により精製した。

実施例１５：　臭素化アラビノガラクタンからのアラビノガラクタン−ＷＲ２７２１還元されたアラビノガラクタンを実施例３に記載されたように臭素化した。

この臭素化アラビノガラクタン２ｇを１０ｍ１の０．２モル硼酸塩中の１ｇのＷ　Ｒ２７２１に添加しｐＨを８．０に調整した。その混合物を室温で１６時間攪拌した。アラビノガラクタン−ＷＲ２７２１をアミコンＹＭ３の限外濾過で精製し、その後にアセトン中で沈殿し、水中に再溶解させた。最終的に、エタノール中に沈殿させ、乾燥させた。最終生成物を０．ＩＮの塩酸で溶解させ、０．ＩＮのＮａＯＨで滴定した。

Ｗ　Ｒ２７２１を滴定の参考として用いて、アラビノガラクタン−Ｗ　Ｒ２７２１最終生成物は、その生成物ｇ当り０．６６ミリ当量のＷ　Ｒ２７２１を有することが示された。サイズ排除クロマトグラフィー（アミコン・セルファインＧＣ２００Ｍ）によって分析された生成物は、主な成分は約２５．０００ダルトンの分子量を有することを示した。

アラビノガラクタン−Ｗ　Ｒ２７２１の活性を上記のように動物モデルで評価した。

１５０■／ｋｇのこの物質の注入は、超常磁性鉄−酸化物コロイドクリアランスの有効な遮断剤であり、前記コロイドの半減期を８６分に延長させた（表１）。

実施例１６：ホスフオリル化アラビノガラクタンからのアラビノガラクタン−Ｗ　Ｒ２７２１アラビノガラクタンホスフェート（８ｇ１実施例９）　、１．２　ｇの１−エチル−３，４−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド及び１ｇのＷ　Ｒ２７２１を２０ｍ１の水中で一緒に混合した。水酸化ナトリウムを添加してｐＨを７．５に調整し、その混合物を暗所に室温で約６４時間放置した。アラビノガラクタンホスフェートにおけるホスフェートにエステル化されたその第一アミンによってその生成物、アラビノガラクタンに結合させたＷ　Ｒ２７２１をＹＭ３　（３０００ダルトン遮断）を用いて限外濾過（５回、１０ｍ１）によって精製し、その後、凍結乾燥した。収量は、白色結晶粉末の０．６３　ｇであった。

特徴１０分子量：サイズ排除クロマトグラフィー（アミコン拳セルファインＧＣ２００Ｍ）は、アラビノガラクタンホスフェート出発物質について観察されるのと同様に２２分において中心の単一ピークを示した。低分子量の不純物の証拠は見られなかった。

ｉｉ、スルフヒドリル含量の分析：アラビノガラクタン−Ｗ　Ｒ２７２１に結合した生成物ホスフェートを最初に２Ｍのトリフルオロ酢酸において１２０℃で１時間加水分解した。中和後、スルフヒドリル濃度を５．５′ビスジチオ−２−二トロ安息香酸を用いて比色試験によって測定した。アラビノガラクタン上のＷ　Ｒ２７２１の量を測定すると、生成物ｇ当り０．０６３．ミリ当量であった。

ｉｉｉ、酵素触媒加水分解：ｐＨ８，０においてアルカリ性ホスファターゼ［バイオザイム（Ｂｉｏｚｙｍｅ）　、：Ｉ−ドＡ　Ｌ　Ｐ　ｌ−１２Ｇ］及びｐＨ４，８において酸ホスフェート（Ｅ　Ｃ３，１，３，２、ジャガイモから）の両方がホスフォチオエートエステルを迅速に加水分解し、従って、チオールを遮断しない（ｕｎｂｌｏｃｋ　）。酸ホスファターゼによる加水分解速度は、２７℃ で０．１ミクロ当量ホスフ工−ト／分であり、ｐ−ニトロフェノールホスフェートの加水分解から期待されるものに近い速度である。

実施例１７：アラビノガラクタン−ペプスタチンペプスタチンは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを通してアミノアラビノガラクタン（多糖類の重量に基づいて２％アミン）に結合され得る［Ｆｕｒｕｎｏ、　Ｋ、らによるＪ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９３巻、２４９頁（１９８３年）］。第一アミンを有するアラビノガラクタンを実施例２（アラビノガラクタン−ヒドラジド）または実施例５又は７（ポリリジン−アラビノガラクタン）によって生成した。ペプスタチンＡ　（２５０■）を１ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した。その後に、５０■の１−エチル−３（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド及び３０■のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙ　ｓｕｃｃｉｍｉｄｅ）を添加した。室温で２時間、反応を進めた後に、混合物を、１００■のアミノ−アラビノガラクタンを含有する０、ＩＭの炭酸水素ナトリウム３０ｍ１に滴加した。得られた混合物を室温で２時間反応させ、その後、１０．０００ダルトン遮断を用いて限外濾過によりそして次にカチオン交換クロマトグラフィーにより生成物を精製した。

実施例１８・ブロモ酢酸とアラビノガラクタンとの反応からのカルボキシメチル −アラビノガラクタンアラビノガラクタン５ｇを４Ｎの水酸化ナトリウム５０ｍ１に溶解した。これに、１０ｇのブロモ酢酸を添加し、その混合物を８０℃で３時間加熱した。室温に冷却することによってその反応を停止させ、その後、濃塩酸を用いてｐＨを７．５乃至９に調整した。生成物を単離し、Ｇ−２５カラムクロマトグラフイー及び、アミコンＹＭ３膜を用いる限外濾過により精製した。１４Ｃラベルのブロモ酢酸を用いて反応を行わせ、液体シンチレーションカウンティングによって生成物の特定の活性を測定することによって、誘導化の程度は、生成物ｇ当り約５．２ミリ当量のカルボキシメチル基であることを確認した。

このアラビノガラクタン酢酸塩の活性を上記のように動物モデルで評価した。

＋５０　ｒａｇ／ｋｇの用量は、超常磁性鉄−酸化物コロイドの有効な遮断剤ではな（、非誘導化アラビノガラクタンでは、３３．２分であったのに対して前記コロイドの半減期を７．３分までだけ延ばした（表１）。

実施例１９：２−ブロモプロピオン酸とアラビノガラクタンとの反応からのカルボキシエチル−アラビノガラクタンアラビノガラクタン５ｇを４ＮのＮ　ａ　ＯＨ３Ｏｍ１に溶解させた。これに、１１ｇの２−ブロモプロピオン酸を添加し、その混合物を８０℃で３時間加熱した。室温に冷却することによってその反応を停止させ、その後に濃塩酸を用いてｐＨを７．５乃至９に調整した。生成物を単離し、Ｇ−２５カラムクロマトグラフイー及び、アミコンＹＭ３膜を用いる限外濾過により精製した。酸／塩基滴定により決定した誘導化の程度は、生成物ｇ当り約１．３ミリ当量のプロピオン酸塩である。

このアラビノガラクタンプロピオン酸塩の活性を上記のように動物モデルで評価した。この物質を１５０■／ｋｇの使用は、超常磁性鉄−酸化物コロイドクリアランスアッセイにおいて有効な遮断剤ではなく、半減期を４０．８分まで延ばした（表■）。

実施例２０．チオホスフォリル化アラビノガラクタンからのアラビノガラクタン −Ｒ２７２１１ラビノガラクタンのチオホスフォリル化：無水アラビノガラクタン１０ｇをトリエチルホスフェート５０ｍ１に懸濁した。１０．５＋ｏｌ　（７５ミリモル）の無水トリエチルアミンを添加した後に、懸濁液を氷−水浴内で冷却した。冷却した懸濁液に塩化チオホスフェート２．５５ａ＋ｌ　（２５ミリモル）を攪拌しながら滴加した。添加を終了したらすぐに、反応混合物を室温に暖め、７２時間攪拌した。その後、アラビノガラクタニルチオホスフォロジクロリデート生成物を５０ｍ１の脱イオン化氷−水を添加ることによって加水分解し、２時間攪拌した。溶媒、トリエチルホスフェートをクロロホルム２５ｍ１で２回抽出することによって反応混合物から除去した。水性相のｐＨをＩＮの水酸化ナトリウムを添加することによって９乃至９．５に調整した。

生成物アミコンＹＭ３　（３０００ダルトン遮断）限外濾過膜を用いて限外濾過（５０ｍｌから１０ｍ１．４サイクル）によって精製した。最終保持物質を凍結乾燥し、乾燥させた。

２−（３−アミノプロピルアミノ）エチルプロミド、ジヒドロプロミドの合成二２−（３−アミノプロピルアミノ）エチルプロミド、ジヒドロプロミドの合成は実施例１４で記載した通りである。

５ミリモルのポリチオホスフォリル化アラビノガラクタンナトリウム塩を１０ｍ１の水に溶解させた。上記溶液に、１０ｍ１の水に溶解させた５、５ミリモルの２−（３−アミノプロピルアミノ）エチルプロミド、ジヒドロプロミドを添加した。

その透明な溶液を室温で４時間攪拌した。得られた濁った溶液を迅速に攪拌した０℃のエタノールに滴加した。得られた沈殿物を濾過により回収した。その生成物を２５ｍ１の温（４０−５０℃）エタノールで２回洗浄し、真空乾燥した。

チオアルキル化をニンヒドリンの比色分析により確認した。

フロントページの続き（７２）発明者　パルマージ、スチーブンアメリカ合衆国、マサチューセッツ州０２０８１、ウォルポール、グラニット・ストリート１１０（７２）発明者　ジョセフソン、り一アメリカ合衆国、マサチューセッツ州０２１７４、アーリントン、チャーチル・アベニュー　１４

Claims

【特許請求の範囲】

１．細胞受容体に対する誘導体の有用な親和力を保持するように誘導体を生成するための官能残基による部位で修飾されたアラピノガラクタンを含む、治療剤の標的組織の表面に位置する細胞受容体ヘのデリバリーのための、治療剤との複合体を生成するための担体。
２．修飾部位が、アラビノガラクタン上のヒドロキシル基である、請求項１に記載の担体。
３．アラビノガラクタンが複数の部位で修飾される、請求項１に記載のキャリヤー。
４．アラビノガラクタンが複数の部位で修飾され、官能残基の数がアラビノガラクタンのモル当り１当量以上であり、アラビノガラクタンのモル当りアラビノガラクタン上のヒドロキシル基の数以下である、請求項２に記載の担体。
５．官能残基が、ホスフォリル、スルフヒドリル、アミノ、ハロ、アシルイミダゾール及びカルボキシル基から成る群から選ばれる、請求項１に記載の担体。
６．官能残基が、ホスフォリル、スルフヒドリル、アミノ、ハロ、アシルイミダゾール及びカルボキシル基から成る群から選ばれる、請求項２に記載の担体。
７．官能残基が重合体分子である、請求項１に記載の担体。
８．官能残基が重合体分子である、請求項２に記載の担体。
９．官能残基が、デキストラン、デキストリン、アルブミン及びポリ−Ｌ−リジンから成る群から選ばれる重合体分子である、請求項７に記載の担体。
１０．官能残基が、デキストラン、デキストリン、アルブミン及びポリ−Ｌ−リジンから成る群から選ばれる重合体分子である、請求項８に記載の担体。
１１．細胞受容体に対する誘導体の有用な親和力を保持するように誘導体を生成するための官能残基により修飾されたアラビノガラクタン及び複合体を生成するために誘導体と結合した治療剤を含む、標的組織の表面に位置する細胞受容体ヘの治療剤のデリバリー用複合体。
１２．治療剤が抗ウイルス剤である、請求項１１に記載の複合体。
１３．抗ウイルス剤が、アシクロバール（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）、ＡＲＡ−ＡＭＰ及びＡＲＡ−Ａから成る群から選ばれる、請求項１２に記載の複合体。
１４．治療剤が放射線保護剤である、請求項１１に記載の複合体。
１５．放射線保護剤が、Ｓ−２−（３−アミノプロピルアミノ）エチルリン酸である、請求項１４に記載の複合体。
１６．治療剤が化学保護剤である、請求項１１に記載の複合体。
１７．化学保護剤が、Ｓ−２−（３−アミノプロピルアミノ）エチルリン酸である、請求項１６に記載の複合体。
１８．治療剤が遊離基スキャベンジャ−である、請求項１６に記載の複合体。
１９．遊離基スキャベンジャーが、メラニン、トロロックス（Ｔｒｏｌｏｘ）、システアミン誘導体、カチオンアミノチオール及びビタミンＥ誘導体から成る群から選ばれる、請求項１８に記載の複合体。
２０．治療剤がポリペプチドである、請求項１１に記載の複合体。
２１．ポリペプチドがペプスタチンである、請求項２０に記載の複合体。
２２．ポリペプドが酵素である、請求項２０に記載の複合体。
２３．酸素がスーパーオキシドジムスターゼである、請求項２２に記載の複合体。
２４．治療剤が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及び抗体フラグメントから成る群から選ばれる、請求項１１に記載の複合体。
２５．治療剤がＤＮＡ分子である、請求項１１に記載の複合体。
２６．ＤＮＡ分子がアンチセンス分子である、請求項２５に記載の複合体。
２７．治療剤がステロイドである、請求項１１に記載の複合体。
２８．細胞受容体に対する誘導体の有用な親和力を保持するように誘導体を生成するための官能残基により１つの部位においてアラビノガラクタンを修飾する工程及び、複合体を生成するために治療剤を誘導体と結合させる工程を含む、細胞受容体に治療剤をデリバリーする方法。
２９．部位が、アラビノガラクタン上のヒドロキシル基である、請求項２８に記載の方法。
３０．アラビノガラクタンは、複数部位においてアラビノガクタンは修飾することを含む、請求項２５に記載の方法。
３１．アラビノガラクタンを修飾する工程に、官能残基の数がアラビノガラクタンモル当り１当量以上であり、アラビノガラクタンモル当りアラビノガラクタン上のヒドロキル基の数以下である、複数部位でアラビノガラクタンを修飾すること含む、請求項２８に記載の方法。
３２．官能残基を修飾する工程には、ホスフォリル、スルフヒドリル、アミノ、ハロ、アシルイミダゾール及びカルボキシル基から成る群から官能残基を選ぶことが含まれる、請求項２８に記載の方法。
３３．官能残基を修飾する工程には、ホスフォリル、スルフヒドリル、アミノ、ハロ、アシルイミダゾール及びカルボキシル基から成る群から官能残基を選ぶことが含まれる、請求項２９に記載の方法。
３４．官能残基が重合体分子である、請求項２８に記載の方法。
３５．治療剤がポリペプチドである、請求項２８に記載の方法。
３６．ポリペプチドが酵素である、請求項３５に記載の方法。
３７．ポリペプチドがスーパーオキシドジムスターゼである、請求項３５に記載の方法。
３８．ポリペプチドがペプスタチンである、請求項３５に記載の方法。
３９．ポリペプチドが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体及び抗体フラグメントから成る群から選ばれる、請求項３５に記載の方法。
４０．治療剤がＤＮＡ分子である、請求項２８に記載の方法。
４１．ＤＮＡ分子がアンチセンス分子である、請求項４０に記載の方法。
４２．治療剤がステロイドである、請求項２８に記載の方法。
４３．治療剤が、抗ウイルス剤、放射線保護剤及び化学保護剤から成る群から選ばれる、請求項２８に記載の方法。
４４．放射線保護剤がＳ−２−（３−アミノプロピルアミノ）エチルチオ燐酸である、請求項４３に記載の方法。
４５．化学保護剤がＳ−２−（３−アミノプロピルアミノ）エチルチオ燐酸である、請求項４３に記載の方法。
４６．化学保護剤が、遊離基スキャベンジャーである、請求項４３に記載の方法。
４７．遊離基スキャベンジャーが、メラニン、トロロックス（Ｔｒｏｌｐｘ）、システアミン誘導体、カチオンアミノチオール及びビタミンＥ誘導体から成る群から選ばれる、請求項４６に記載の方法。
４８．抗ウイルス剤が、アシクロバール（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）、ＡＲＡ−ＡＭＰ及びＡＲＡ−Ａから成る群から選ばれる、請求項４３に記載の方法。
４９．有効量の複合体を細胞受容体を有する生物に投与する工程をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
５０．有効量の複合体を細胞受容体を有する生物に投与する工程をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
５１．有効量の複合体を細胞受容体を有する生物に投与する工程をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
５２．有効量の複合体を細胞受容体を有する生物に投与する工程をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
５３．有効量の複合体を細胞受容体を有する生物に投与する工程をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
５４．有効量の複合体を細胞受容体を有する生物に投与する工程をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
５５．有効量の複合体を細胞受容体を有する生物に投与する工程をさらに含む、請求項３５に記載の方法。
５６．有効量の複合体を細胞受容体を有する生物に投与する工程をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
５７．有効量の複合体を細胞受容体を有する生物に投与する工程をさらに含む、請求項４２に記載の方法。
５８．有効量の複合体を細胞受容体を有する生物に投与する工程をさらに含む、請求項４３に記載の方法。
５９．有効量の複合体を細胞受容体を有する生物に投与する工程をさらに含む、請求項４６に記載の方法。
６０．アラビノガラクタンを用意する工程及びその誘導体と細胞受容体との有用な親和力を保持する誘導体を製造するためにアラビノガラクタンをそのアルデヒド含量を変えるのに適する作用剤で処理する工程を含む、細胞受容体に複合体をデリバリーするための、治療剤との複合体を生成するのに適する担体を生成する方法。
６１．作用剤がアラビノガラクタンのアルデヒド含量を増大するのに適する、請求項６０に記載の方法。
６２．作用剤がガラクトースオキシダーゼである、請求項６１に記載の方法。
６３．アラビノガラクタンを処理する工程が、少なくとも１つの付加的アルデヒド及び多糖類のグラム当りアルデヒドの約１．２ミリ当量未満を含むようにガラクトースオキシダーゼによりアラビノガラクタンを酸化する工程を含む、請求項６２に記載の方法。
６４．作用剤が、アラビノガラクタンのアルデヒド含量を低減するのに適する、請求項６３に記載の方法。
６５．作用剤が水素化ホウ素を含む還元剤である、請求項６０に記載の方法。
６６．水素化ホウ素が、水素化ホウ素ナトリウム及び水素化シアノホウ素ナトリウムから成る群から選ばれる、請求項６５に記載の方法。
６７．アラビノガラクタンを処理する工程が、アラビノガラクタンをエンド−β −ガラクトシダーゼ酸素により加水分解する工程を含む、請求項６０に記載の方法。
６８．アラビノガラクタンを処理する工程が、アラビノガラクタンをコハク酸塩、グルタル酸塩及びジエチレンペンタ酢酸から成る群から選ばれる無水物と反応させる工程を含む、請求項６０に記載の方法。
６９．アラビノガラクタンを処理する工程が、アラビノガラクタンに第一アミンと反応させて、シッフ塩基を製造し、その生成物を還元剤で処理する工程を含む、請求項６０に記載の方法。