JP2581425B2 - ペプチド合成用支持体及びそれを用いて製造されたペプチド - Google Patents
ペプチド合成用支持体及びそれを用いて製造されたペプチドInfo
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- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
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- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ペプチド合成用支持体
及びそれを用いて製造されたペプチド合成用支持体とペ
プチドの結合物に関する。更に詳しくは、生分解性高分
子を含み、生体適合性が高く、低毒性のポリマーからな
るペプチド合成用支持体、及びそれを用いて製造される
生物活性ペプチドおよび／またはタンパク質のフラグメ
ントペプチドとペプチド合成用支持体との結合物に関す
る。
及びそれを用いて製造されたペプチド合成用支持体とペ
プチドの結合物に関する。更に詳しくは、生分解性高分
子を含み、生体適合性が高く、低毒性のポリマーからな
るペプチド合成用支持体、及びそれを用いて製造される
生物活性ペプチドおよび／またはタンパク質のフラグメ
ントペプチドとペプチド合成用支持体との結合物に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】従来、病原因子に対する特異的な免疫力
を高めておくことにより病原微生物の感染や、感染した
後の発症の予防を行なう医薬として、従来から多くのワ
クチンが実用化されている。例えば、天然痘ワクチン、
麻疹ワクチン、ポリオワクチン、ムンプスワクチン等が
よく知られている。しかし、その副作用も無視し得ない
ものがある。従って、副作用の少ないワクチンの開発が
全世界的に渇望されている。遺伝子組み換え技術の進展
により、抗原活性を有するポリペプチド等をワクチンと
して利用する試みが数多くなされている。例えば、Ｂ型
肝炎ワクチンの開発には世界中が鎬をけずっており、Ｂ
型肝炎ウイルスＤＮＡからＨＢｓ抗原のみをコードして
いるＤＮＡ（Ｓ ｇｅｎｅ）を切り出し、大腸菌または
酵母等のプラスミドに組み込んで発現させようと努力し
ている。そして酵母由来のＨＢｓ抗原については、現在
臨床段階にあると言われる。
を高めておくことにより病原微生物の感染や、感染した
後の発症の予防を行なう医薬として、従来から多くのワ
クチンが実用化されている。例えば、天然痘ワクチン、
麻疹ワクチン、ポリオワクチン、ムンプスワクチン等が
よく知られている。しかし、その副作用も無視し得ない
ものがある。従って、副作用の少ないワクチンの開発が
全世界的に渇望されている。遺伝子組み換え技術の進展
により、抗原活性を有するポリペプチド等をワクチンと
して利用する試みが数多くなされている。例えば、Ｂ型
肝炎ワクチンの開発には世界中が鎬をけずっており、Ｂ
型肝炎ウイルスＤＮＡからＨＢｓ抗原のみをコードして
いるＤＮＡ（Ｓ ｇｅｎｅ）を切り出し、大腸菌または
酵母等のプラスミドに組み込んで発現させようと努力し
ている。そして酵母由来のＨＢｓ抗原については、現在
臨床段階にあると言われる。
【０００３】一方、ワクチン用の抗原として、タンパク
質そのものを用いるのではなく、免疫原性に必要な最小
のペプチドフラグメントを合成して利用しようとする試
みもなされつつある。その根拠は、一般に次のように考
えられている。低分子の化合物や低分子のペプチドは一
般に抗原活性を有しない。しかるに、抗体と結合できる
がそれ自身は免疫反応を誘起し得ない低分子化合物のハ
プテンは、蛋白質と結合させて抗原として用いると、抗
体を産生する。この場合、抗体はハプテンと蛋白質に対
してそれぞれ産生されることが知られている。すなわ
ち、抗体は、存在する抗原決定基のそれぞれに対して産
生される。そこで、副作用の少ないワクチンを開発する
に当たり、高分子量の蛋白質をそのまま使用するより
も、低分子量の所望の抗原決定基を含むペプチドフラグ
メント、即ちエピトープ部分のフラグメントの単体また
は組み合わせ（ヘテロエピトープまたはマルチエピトー
プ）をワクチンとして使用すれば不要な抗体の産生が抑
えられるものと期待されるのである。
質そのものを用いるのではなく、免疫原性に必要な最小
のペプチドフラグメントを合成して利用しようとする試
みもなされつつある。その根拠は、一般に次のように考
えられている。低分子の化合物や低分子のペプチドは一
般に抗原活性を有しない。しかるに、抗体と結合できる
がそれ自身は免疫反応を誘起し得ない低分子化合物のハ
プテンは、蛋白質と結合させて抗原として用いると、抗
体を産生する。この場合、抗体はハプテンと蛋白質に対
してそれぞれ産生されることが知られている。すなわ
ち、抗体は、存在する抗原決定基のそれぞれに対して産
生される。そこで、副作用の少ないワクチンを開発する
に当たり、高分子量の蛋白質をそのまま使用するより
も、低分子量の所望の抗原決定基を含むペプチドフラグ
メント、即ちエピトープ部分のフラグメントの単体また
は組み合わせ（ヘテロエピトープまたはマルチエピトー
プ）をワクチンとして使用すれば不要な抗体の産生が抑
えられるものと期待されるのである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、エピト
ープ部分のペプチドフラグメントを抗原として使用する
場合にも、ワクチンとして使用するにはキャリアー蛋白
質などの高分子化合物と結合させて投与する必要があ
る。従って、この高分子化合物に対する抗体の産生を避
けることはできないのが実情である。本発明の目的は、
エピトープ部分のペプチドフラグメントを抗原として使
用する場合に結合させる高分子化合物として、それ自身
に対する抗体産生が少なく、かつエピトープを結合させ
てワクチンとして使用した場合に副作用の少ない化合物
からなるペプチド合成用支持体、並びにこの化合物と結
合したワクチン用に適した生物活性ペプチドおよび／ま
たはタンパク質のフラグメントペプチドを提供すること
にある。
ープ部分のペプチドフラグメントを抗原として使用する
場合にも、ワクチンとして使用するにはキャリアー蛋白
質などの高分子化合物と結合させて投与する必要があ
る。従って、この高分子化合物に対する抗体の産生を避
けることはできないのが実情である。本発明の目的は、
エピトープ部分のペプチドフラグメントを抗原として使
用する場合に結合させる高分子化合物として、それ自身
に対する抗体産生が少なく、かつエピトープを結合させ
てワクチンとして使用した場合に副作用の少ない化合物
からなるペプチド合成用支持体、並びにこの化合物と結
合したワクチン用に適した生物活性ペプチドおよび／ま
たはタンパク質のフラグメントペプチドを提供すること
にある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者は、この問題を
解決すべく、鋭意検討を進め、エピトープ部分のペプチ
ドフラグメント（ヘテロエピトープまたはマルチエピト
ープ）を化学合成する際に、固相法で合成するときは、
アミノ酸を高分子量の支持体に共有結合させた後にペプ
チド鎖伸長反応を行わせる点に着目し、ペプチド合成反
応終了後も支持体からペプチドの脱離を行わず、支持体
に結合した生物活性ペプチドないしタンパク質のフラグ
メントペプチドをそのままワクチンとして使用できる事
実を発見した。この場合、支持体として生分解性高分子
を使用すれば、不要な抗体産生の少ない優れたワクチン
を製造し得ること、並びに生分解性高分子は、優れたペ
プチド合成用支持体でもあること等を発見し、これらの
事実に基づいて研究を進め本発明を完成するに至った。
解決すべく、鋭意検討を進め、エピトープ部分のペプチ
ドフラグメント（ヘテロエピトープまたはマルチエピト
ープ）を化学合成する際に、固相法で合成するときは、
アミノ酸を高分子量の支持体に共有結合させた後にペプ
チド鎖伸長反応を行わせる点に着目し、ペプチド合成反
応終了後も支持体からペプチドの脱離を行わず、支持体
に結合した生物活性ペプチドないしタンパク質のフラグ
メントペプチドをそのままワクチンとして使用できる事
実を発見した。この場合、支持体として生分解性高分子
を使用すれば、不要な抗体産生の少ない優れたワクチン
を製造し得ること、並びに生分解性高分子は、優れたペ
プチド合成用支持体でもあること等を発見し、これらの
事実に基づいて研究を進め本発明を完成するに至った。
【０００６】即ち、本発明の要旨は、（１）生分解性高
分子からなるペプチド合成用支持体、並びに（２）生分
解性高分子からなるペプチド合成用支持体に結合した生
物活性ペプチドおよび／またはタンパク質のフラグメン
トペプチド、に関する。
分子からなるペプチド合成用支持体、並びに（２）生分
解性高分子からなるペプチド合成用支持体に結合した生
物活性ペプチドおよび／またはタンパク質のフラグメン
トペプチド、に関する。
【０００７】本発明のペプチド合成用支持体とは、生分
解性高分子である。生分解性高分子とは、生体内の酵素
により分解される高分子をいう。例えば、ポリβヒドロ
キシブチレートやポリ乳酸などの微生物の生産物等が挙
げられる。これらの生分解性高分子は、生体内で分解さ
れるために、一般に生体適合性が高く、毒性の低いポリ
マーである。
解性高分子である。生分解性高分子とは、生体内の酵素
により分解される高分子をいう。例えば、ポリβヒドロ
キシブチレートやポリ乳酸などの微生物の生産物等が挙
げられる。これらの生分解性高分子は、生体内で分解さ
れるために、一般に生体適合性が高く、毒性の低いポリ
マーである。
【０００８】本発明のペプチド合成用支持体を用いて、
ペプチド固相合成法によるペプチド合成を行うことがで
きる。具体的には、Ａｌｋａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒ
ｏｐｈｕｓが産生するポリβヒドロキシブチレート、ヒ
ドロキシブチレートとヒドロキシバリレートとの共重合
物、あるいはポリ乳酸、乳酸とエチレングリコールとの
共重合物等が適している。ペプチド合成用の支持体は各
種の試薬や溶媒に安定で溶媒に不溶であることが要求さ
れるが、本発明のペプチド合成用支持体もこの要件を具
備する必要がある。上記の共重合体の場合は、末端残基
が乳酸またはβヒドロキシブチレートまたはヒドロキシ
バリレートであれば、水酸基またはカルボキシル基が遊
離となるので、そのままペプチド合成に使用可能であ
る。
ペプチド固相合成法によるペプチド合成を行うことがで
きる。具体的には、Ａｌｋａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒ
ｏｐｈｕｓが産生するポリβヒドロキシブチレート、ヒ
ドロキシブチレートとヒドロキシバリレートとの共重合
物、あるいはポリ乳酸、乳酸とエチレングリコールとの
共重合物等が適している。ペプチド合成用の支持体は各
種の試薬や溶媒に安定で溶媒に不溶であることが要求さ
れるが、本発明のペプチド合成用支持体もこの要件を具
備する必要がある。上記の共重合体の場合は、末端残基
が乳酸またはβヒドロキシブチレートまたはヒドロキシ
バリレートであれば、水酸基またはカルボキシル基が遊
離となるので、そのままペプチド合成に使用可能であ
る。
【０００９】本発明のペプチド合成用支持体に結合した
生物活性ペプチドは、前記支持体を用い、固相ペプチド
合成法により、目的のエピトープ部分のペプチドフラグ
メントを有する生物活性ペプチドの合成を行なうことに
より得ることができるものである。尚、本発明において
目的のエピトープ部分のペプチドフラグメントを有する
生物活性ペプチドとは、エピトープ部分のフラグメント
の単体または組み合わせ（ヘテロエピトープまたはマル
チエピトープ）のいずれであってもよい。従来の固相ペ
プチド合成法と異なり、本発明の支持体を用いた場合
は、リンカーを介すことなく、直接前記支持体に対して
目的の生物活性ペプチドの合成を行うことができ、リン
カーに対する抗体の産生を避けることが可能であると同
時に、コストを下げることが可能である。
生物活性ペプチドは、前記支持体を用い、固相ペプチド
合成法により、目的のエピトープ部分のペプチドフラグ
メントを有する生物活性ペプチドの合成を行なうことに
より得ることができるものである。尚、本発明において
目的のエピトープ部分のペプチドフラグメントを有する
生物活性ペプチドとは、エピトープ部分のフラグメント
の単体または組み合わせ（ヘテロエピトープまたはマル
チエピトープ）のいずれであってもよい。従来の固相ペ
プチド合成法と異なり、本発明の支持体を用いた場合
は、リンカーを介すことなく、直接前記支持体に対して
目的の生物活性ペプチドの合成を行うことができ、リン
カーに対する抗体の産生を避けることが可能であると同
時に、コストを下げることが可能である。
【００１０】ペプチド鎖伸長反応の終了後に該ペプチド
鎖の脱保護を行ない、次いで、酢酸エチル、メタノー
ル、エーテルなどの適当な溶媒で順次洗浄したのち、ト
リフルオロ酢酸や塩化水素等を用いて常法に従いペプチ
ド側鎖保護基を除去する。こうして、本発明のペプチド
合成用支持体に共有結合を介して結合した生物活性ペプ
チドを得ることができる。本発明において生物活性ペプ
チドとは、エピトープ部分のペプチドフラグメントの単
体または組み合わせ（ヘテロエピトープまたはマルチエ
ピトープ）のみからなるものや、エピトープ部分を含む
ペプチドであって、支持体との結合物をワクチンとして
投与された場合、該エピトープに対する抗体の産生が可
能なものをいう。
鎖の脱保護を行ない、次いで、酢酸エチル、メタノー
ル、エーテルなどの適当な溶媒で順次洗浄したのち、ト
リフルオロ酢酸や塩化水素等を用いて常法に従いペプチ
ド側鎖保護基を除去する。こうして、本発明のペプチド
合成用支持体に共有結合を介して結合した生物活性ペプ
チドを得ることができる。本発明において生物活性ペプ
チドとは、エピトープ部分のペプチドフラグメントの単
体または組み合わせ（ヘテロエピトープまたはマルチエ
ピトープ）のみからなるものや、エピトープ部分を含む
ペプチドであって、支持体との結合物をワクチンとして
投与された場合、該エピトープに対する抗体の産生が可
能なものをいう。
【００１１】以上のようにして得られた本発明のペプチ
ド合成用支持体に共有結合を介して結合した生物活性ペ
プチドは、生理食塩水およびアジュバントとともに低温
にてホモジナイザーでエマルジョン化して皮内または皮
下注射することにより、ワクチン又は治療薬として使用
することができる。
ド合成用支持体に共有結合を介して結合した生物活性ペ
プチドは、生理食塩水およびアジュバントとともに低温
にてホモジナイザーでエマルジョン化して皮内または皮
下注射することにより、ワクチン又は治療薬として使用
することができる。
【００１２】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定され
るものではない。 実施例１ ポリ乳酸に結合したペプチドの製造 本発明のペプチド合成用支持体としてはポリ乳酸を用い
た。エピトープの例として、エピトープＡをとりあげ
た。エピトープＡは、下記に示すアミノ酸配列（配列番
号：１）を有する自己ペプチド由来のペプチドフラグメ
ントである。 H-Leu-Pro-Phe-Asp-Phe-Thr-Pro-Gly-Tyr-OH（エピトー
プＡ）
明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定され
るものではない。 実施例１ ポリ乳酸に結合したペプチドの製造 本発明のペプチド合成用支持体としてはポリ乳酸を用い
た。エピトープの例として、エピトープＡをとりあげ
た。エピトープＡは、下記に示すアミノ酸配列（配列番
号：１）を有する自己ペプチド由来のペプチドフラグメ
ントである。 H-Leu-Pro-Phe-Asp-Phe-Thr-Pro-Gly-Tyr-OH（エピトー
プＡ）
【００１３】まず、ポリ乳酸粒子（９０〜１２０μｍ）
を支持体として、ペプチド合成装置ＰＳＳＭ−８（株式
会社島津製作所社製）内に入れた。尚、このポリマー支
持体には末端カルボキシル基に第一のアミノ酸（Fmoc-T
yr(tBu)-OH）を予め導入しておいた。方法は、以下の通
りである。
を支持体として、ペプチド合成装置ＰＳＳＭ−８（株式
会社島津製作所社製）内に入れた。尚、このポリマー支
持体には末端カルボキシル基に第一のアミノ酸（Fmoc-T
yr(tBu)-OH）を予め導入しておいた。方法は、以下の通
りである。
【００１４】（方法１）ポリ乳酸の末端のカルボキシル
基をリチウムアルミニウムハイドライドで還元して末端
をアルコールとしジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩ
ＣＤ）を用い、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を
触媒として第一のアミノ酸（Fmoc-Tyr(tBu)-OH）と反応
させ、ポリ乳酸支持体にＦｍｏｃ−アミノ酸を導入し
た。
基をリチウムアルミニウムハイドライドで還元して末端
をアルコールとしジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩ
ＣＤ）を用い、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を
触媒として第一のアミノ酸（Fmoc-Tyr(tBu)-OH）と反応
させ、ポリ乳酸支持体にＦｍｏｃ−アミノ酸を導入し
た。
【００１５】
【化１】
【００１６】（方法２）ＤＩＣＤを用い、ＤＭＡＰを触
媒として、ポリ乳酸の末端のカルボキシル基とポリオキ
シエチレンを反応させ、得られたポリ乳酸−ポリオキシ
エチレン結合物の末端水素基をチオニルクロライドで処
理し、次いでメタノール中にてアンモニアで処理してア
ミノ基を導入し、ポリ乳酸−ポリオキシエチレン支持体
を得た。次に、該支持体と第一のアミノ酸（Fmoc-Tyr(t
Bu)-OH）とをＤＩＣＤ、ＤＭＡＰによりカップリングさ
せることによりポリ乳酸−ポリオキシエチレン支持体に
Ｆｍｏｃ−アミノ酸を導入した。
媒として、ポリ乳酸の末端のカルボキシル基とポリオキ
シエチレンを反応させ、得られたポリ乳酸−ポリオキシ
エチレン結合物の末端水素基をチオニルクロライドで処
理し、次いでメタノール中にてアンモニアで処理してア
ミノ基を導入し、ポリ乳酸−ポリオキシエチレン支持体
を得た。次に、該支持体と第一のアミノ酸（Fmoc-Tyr(t
Bu)-OH）とをＤＩＣＤ、ＤＭＡＰによりカップリングさ
せることによりポリ乳酸−ポリオキシエチレン支持体に
Ｆｍｏｃ−アミノ酸を導入した。
【００１７】
【化２】
【００１８】（方法３）ＤＩＣＤを用い、Ｎ−ヒドロキ
シベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を触媒として、ポリ
乳酸の末端のカルボキシル基と市販のバイファンクショ
ナルポリマー(Bifunctional polymers )であるバイファ
ンクショナルポリオキシエチレンの末端アミノ基とを反
応させ、さらにバイファンクショナルポリオキシエチレ
ンの他端のＢｒ基をメタノール中にてアンモニアで処理
してアミノ基に転換させて、ポリ乳酸−バイファンクシ
ョナルポリオキシエチレン支持体を得た。次に、該支持
体と第一のアミノ酸（Fmoc-Tyr(tBu)-OH）とをＤＩＣ
Ｄ、ＤＭＡＰによりカップリングさせることによりポリ
乳酸−バイファンクショナルポリオキシエチレン支持体
にＦｍｏｃ−アミノ酸を導入した。
シベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を触媒として、ポリ
乳酸の末端のカルボキシル基と市販のバイファンクショ
ナルポリマー(Bifunctional polymers )であるバイファ
ンクショナルポリオキシエチレンの末端アミノ基とを反
応させ、さらにバイファンクショナルポリオキシエチレ
ンの他端のＢｒ基をメタノール中にてアンモニアで処理
してアミノ基に転換させて、ポリ乳酸−バイファンクシ
ョナルポリオキシエチレン支持体を得た。次に、該支持
体と第一のアミノ酸（Fmoc-Tyr(tBu)-OH）とをＤＩＣ
Ｄ、ＤＭＡＰによりカップリングさせることによりポリ
乳酸−バイファンクショナルポリオキシエチレン支持体
にＦｍｏｃ−アミノ酸を導入した。
【００１９】
【化３】
【００２０】以上の方法により得られた、Ｆｍｏｃ−ア
ミノ酸を導入した支持体を出発物質とし、第２のアミノ
酸（Ｇｌｙ）を反応させた。ペプチド合成はＦｍｏｃ法
の常法に従って、ＮαＦｍｏｃ，側鎖保護アミノ酸をＨ
ＯＢｔ、（ベンゾトリアゾリル）−Ｎ−オキシトリピロ
リジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（Ｐｙ
ＢＯＰ）の存在下で活性エステルとし、支持体上のアミ
ノ基とカップリングした。次に導入されたアミノ酸残基
のＮαＦｍｏｃ基を３０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液中で
処理した。以下、ＰＳＳＭ−８の操作マニュアルに記載
のペプチド固相合成のプロトコールに従ってペプチド鎖
を伸長した。なお、側鎖保護基としては、Ｆｍｏｃ−ｔ
Ｂｕストラテジーに常用されるものを用いた。即ち、Ｔ
ｈｒ、ＴｙｒにはｔＢｕ（ｔｅｒｔ−ブチル）基，Ａｓ
ｐにはＯｔＢｕ（ｔｅｒｔ−ブチルエステル）基を用い
た。
ミノ酸を導入した支持体を出発物質とし、第２のアミノ
酸（Ｇｌｙ）を反応させた。ペプチド合成はＦｍｏｃ法
の常法に従って、ＮαＦｍｏｃ，側鎖保護アミノ酸をＨ
ＯＢｔ、（ベンゾトリアゾリル）−Ｎ−オキシトリピロ
リジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（Ｐｙ
ＢＯＰ）の存在下で活性エステルとし、支持体上のアミ
ノ基とカップリングした。次に導入されたアミノ酸残基
のＮαＦｍｏｃ基を３０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液中で
処理した。以下、ＰＳＳＭ−８の操作マニュアルに記載
のペプチド固相合成のプロトコールに従ってペプチド鎖
を伸長した。なお、側鎖保護基としては、Ｆｍｏｃ−ｔ
Ｂｕストラテジーに常用されるものを用いた。即ち、Ｔ
ｈｒ、ＴｙｒにはｔＢｕ（ｔｅｒｔ−ブチル）基，Ａｓ
ｐにはＯｔＢｕ（ｔｅｒｔ−ブチルエステル）基を用い
た。
【００２１】Ｎ末Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨの導入終了
後、ＮαＦｍｏｃ基もペプチド合成装置ＰＳＳＭ−８の
標準プロトコールに従って除去し、ＤＭＦ、メタノー
ル、ｔ−ブチルメチルエーテルにてレジンを十分洗浄し
た。側鎖保護ペプチドレジンの入った反応容器をＰＳＳ
Ｍ−８より取り出し減圧下に乾燥した。レジンを反応容
器より取り出し、密栓可能なガラスチューブに移し、こ
こへ９４％ＴＦＡ、５％アニソール、および１％エタン
ジチオールの混合溶液を加え、６０分放置した（液量は
レジンより３ｍｍ位、液面が高くなるようにした）。混
合物に３０〜５０倍量の乾燥ジエチルエーテルを加え３
５００ｒｐｍにて遠心分離した。沈澱物を２回ジエチル
エーテルにて洗い（遠心を繰り返し）２００ｍｌの０．
０１Ｎ−ＨＣｌを加えてよく攪拌し、凍結乾燥してポリ
マー付ペプチドを得た。なお、得られたペプチドを塩酸
で加水分解し、アミノ酸組成分析を行った。得られた結
果を表１に示す。
後、ＮαＦｍｏｃ基もペプチド合成装置ＰＳＳＭ−８の
標準プロトコールに従って除去し、ＤＭＦ、メタノー
ル、ｔ−ブチルメチルエーテルにてレジンを十分洗浄し
た。側鎖保護ペプチドレジンの入った反応容器をＰＳＳ
Ｍ−８より取り出し減圧下に乾燥した。レジンを反応容
器より取り出し、密栓可能なガラスチューブに移し、こ
こへ９４％ＴＦＡ、５％アニソール、および１％エタン
ジチオールの混合溶液を加え、６０分放置した（液量は
レジンより３ｍｍ位、液面が高くなるようにした）。混
合物に３０〜５０倍量の乾燥ジエチルエーテルを加え３
５００ｒｐｍにて遠心分離した。沈澱物を２回ジエチル
エーテルにて洗い（遠心を繰り返し）２００ｍｌの０．
０１Ｎ−ＨＣｌを加えてよく攪拌し、凍結乾燥してポリ
マー付ペプチドを得た。なお、得られたペプチドを塩酸
で加水分解し、アミノ酸組成分析を行った。得られた結
果を表１に示す。
【００２２】
【表１】
【００２３】更にペプチドはポリマーを気相によるエド
マン分解に付し、目的とするアミノ酸配列を確認した。
マン分解に付し、目的とするアミノ酸配列を確認した。
【００２４】実施例２ 抗原の作成 実施例１により得られたペプチド合成用支持体またはそ
の一部に結合したままのペプチドおよびアジュバントを
生理食塩水に懸濁し、ミキサーまたは連結注射筒でエマ
ルジョンとし抗原を調製した。この抗原をウサギに皮内
または皮下注射することにより、ペプチドに対する抗体
を産生させることができた。抗体の産生は酵素を用いる
イムノアッセイ法により確認された。また、得られた本
発明のポリマーに結合したペプチドをＨＬＡ−Ｂ３５を
導入したトランスジェニックマウスに投与することによ
りＣＴＬ（サイトトキシックリンホサイト）の誘導が認
められた。
の一部に結合したままのペプチドおよびアジュバントを
生理食塩水に懸濁し、ミキサーまたは連結注射筒でエマ
ルジョンとし抗原を調製した。この抗原をウサギに皮内
または皮下注射することにより、ペプチドに対する抗体
を産生させることができた。抗体の産生は酵素を用いる
イムノアッセイ法により確認された。また、得られた本
発明のポリマーに結合したペプチドをＨＬＡ−Ｂ３５を
導入したトランスジェニックマウスに投与することによ
りＣＴＬ（サイトトキシックリンホサイト）の誘導が認
められた。
【００２５】
【発明の効果】本発明のペプチド合成用支持体が提供さ
れることにより、該支持体に共有結合を介して結合した
生物活性ペプチドを作製することが可能となった。ペプ
チド合成用支持体に結合した該ペプチドは低毒性のワク
チン又は治療薬として、そのまま体内に投与することが
可能である。
れることにより、該支持体に共有結合を介して結合した
生物活性ペプチドを作製することが可能となった。ペプ
チド合成用支持体に結合した該ペプチドは低毒性のワク
チン又は治療薬として、そのまま体内に投与することが
可能である。
【００２６】
配列番号：１ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Leu Pro Phe Asp Phe Thr Pro Gly Tyr 1 5
Claims (2)
- 【請求項１】 ポリβヒドロキシブチレート、ヒドロキ
シブチレートの共重合物、ポリ乳酸、および乳酸の共重
合物からなる群より選ばれる生分解性高分子からなるペ
プチド合成用支持体。 - 【請求項２】 ポリβヒドロキシブチレート、ヒドロキ
シブチレートの共重合物、ポリ乳酸、および乳酸の共重
合物からなる群より選ばれる生分解性高分子からなるペ
プチド合成用支持体に結合した生物活性ペプチドおよび
／またはタンパク質のフラグメントペプチド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5307377A JP2581425B2 (ja) | 1993-11-12 | 1993-11-12 | ペプチド合成用支持体及びそれを用いて製造されたペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5307377A JP2581425B2 (ja) | 1993-11-12 | 1993-11-12 | ペプチド合成用支持体及びそれを用いて製造されたペプチド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07138283A JPH07138283A (ja) | 1995-05-30 |
| JP2581425B2 true JP2581425B2 (ja) | 1997-02-12 |
Family
ID=17968329
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5307377A Expired - Lifetime JP2581425B2 (ja) | 1993-11-12 | 1993-11-12 | ペプチド合成用支持体及びそれを用いて製造されたペプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2581425B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1194704C (zh) * | 2001-11-12 | 2005-03-30 | 华东理工大学 | 含有活性药物、主链中具有氨基酸的聚酯及其制备方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE111746T1 (de) * | 1989-11-15 | 1994-10-15 | Sandoz Ag | Polymyxinkonjugate. |
| JPH0680694A (ja) * | 1991-08-30 | 1994-03-22 | La Jolla Cancer Res Found | 創傷治癒に活性のあるポリペプチド・ポリマーイオン複合体 |
-
1993
- 1993-11-12 JP JP5307377A patent/JP2581425B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07138283A (ja) | 1995-05-30 |
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