WO2002036160A2 - Método de obtención de estructuras antigénicas que potencian la reactividad cruzada específica - Google Patents

Método de obtención de estructuras antigénicas que potencian la reactividad cruzada específica Download PDF

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Enrique Iglesias Perez
Osvaldo Reyes Acosta
Hilda Elisa GARAY PÉREZ
Verena Lucila MUZIO GONZÁLEZ
Gerardo Enrique GUILLÉN NIETO
Carlos Duarte Cano
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention is related to the branch of medicine, particularly with vaccine formulations based on new antigenic structures that enhance cross-reactivity.
  • Prior Art Peptides alone have very low immunogenicity, so they are generally conjugated to carrier proteins that provide epitopes for helper T cells (carrier effect) (Herrington, DA et al. 1987 Nature 328: 257-259).
  • carrier proteins that provide epitopes for helper T cells (carrier effect)
  • carrier effect carrier effect
  • the peptides can lose the desired antigenic properties due to, among other things, that the conjugation methods, being relatively non-specific, can bind the peptide by the sequence relevant to the recognition of the immune system.
  • MAPs multiantigenic peptide systems
  • Multi-epitope polypeptides generated from sequences for B epitopes have not always been a viable option (Flynn, JN, et. al. 1997 J Viral 71: 7586-92).
  • the generation of a chimeric polypeptide implies the production of a molecule of unpredictable three-dimensional structure that does not have to adequately expose all the epitopes represented, which favors the response to some and totally prevents the response against others.
  • the dominance relationship that will be imposed between the different epitopes is also unpredictable, which can silence even those that are adequately exposed.
  • the technical objective pursued with the proposed invention is the development of a method of obtaining antigenic structures of high cross-reactivity and capable of enhancing the immune response to peptide antigens administered systemically and / or mucosally.
  • This method generates conjugated dendrimeric structures that have a synthetic part coupled to carrier proteins in suitable proportions.
  • the addition of similar structures bearing other B epitopes has allowed to increase cross-reactivity, which also results in an increase in the general immunogenicity of co-administered antigens.
  • Other antigens and adjuvants may be added to this preparation. Therefore, one of the objects of the present invention is a method of obtaining antigenic structures that enhance specific cross-reactivity.
  • Said method comprises the following steps: A) Selection of the epitope of interest; B) Obtaining dendrimeric structures with the epitopes selected in step (A) by means of a synthesis method, which may be synthesis on a nucleus of plants or aspartic acid; or synthesis on nuclei of organic molecules; the synthesis on a dendrimeric nucleus; the coupling of peptides on a dendrimeric core; or mixtures on the same nucleus of B cell epitopes, T cells or both;
  • a synthesis method which may be synthesis on a nucleus of plants or aspartic acid; or synthesis on nuclei of organic molecules; the synthesis on a dendrimeric nucleus; the coupling of peptides on a dendrimeric core; or mixtures on the same nucleus of B cell epitopes, T cells or both;
  • step (C) Conjugation of one or more of the dendrimeric structures obtained in step (B), to one or more carrier molecules by means of a conjugation method that can be conjugation using glutaraldehyde, succinic anhydride, ⁇ -maleimidopropionic acid-N ester -hydroxysuccinimide (MPS) or using a spacer without aromatic side chains, since it was evidenced that the presence of these chains eliminates the reactivity towards the coupled dendrimeric structure.
  • a conjugation method that can be conjugation using glutaraldehyde, succinic anhydride, ⁇ -maleimidopropionic acid-N ester -hydroxysuccinimide (MPS) or using a spacer without aromatic side chains, since it was evidenced that the presence of these chains eliminates the reactivity towards the coupled dendrimeric structure.
  • step (C) Mixture of the conjugates obtained in step (C) to obtain the formulations by adding the peptide of the binding domain to the CD4 or a conjugate containing this epitope, which enhances cross-reactivity and immunogenicity of the resulting antigenic structure; and finally E.) Adjuvant in alumina or other appropriate adjuvant.
  • the peptides that are part of the structures obtained in step (B) may be regions of Human Immunodeficiency Virus 1 or 2, specifically variable regions such as the V3 region.
  • regions of viruses that have a certain level of variability and diversity including the Hepatitis C virus, B virus and Dengue viruses, can be used.
  • antigens corresponding to polysaccharide regions of Neisseria meningitidis may be used, as well as peptides that mimic polysaccharide antigenic regions, or any region of a microorganism or a pathogen.
  • the method of the invention can use regions of its own antigens or relevant antigens in obtaining vaccines against cancer, such as gonadotropin-releasing hormone regions.
  • Carrier molecules that can be employed in the method of the invention include hepatitis B virus surface antigen, HbsAg, Neisseria meningitidis p64K protein, HIV nucleocapsid antigen, virus nucleocapsid antigen Hepatitis B.
  • Polysaccharide molecules such as dextran particles can also be used for this purpose.
  • the method of the invention also comprises the conjugation of one or more of the dendrimeric structures obtained in step (B), to one or more carrier molecules by covalent conjugation or electrostatic association or by hydrophobicity.
  • Another object of the invention is the antigenic structure obtained by the above method, which enhances the specific cross-reactivity of preparations containing it, and which comprises the antigenic epitopes previously described in dendrimeric form and coupled to carrier molecules in a proportion between 1 and 30% of the resulting structure.
  • the selected epitopes can be oligosaccharide or peptide in nature and within the latter peptide consensus of variable regions selected by subtypes, subgroups, serotypes or other form of association can be used, as well as are libraries of peptide sequences of the selected microorganism, or mimetic peptides.
  • the peptides that are part of the dendrimeric region can correspond to variable regions of Human Immunodeficiency Virus 1 or 2, and within these the V3 region, and regions of other viruses that possess a certain level of variability and diversity, including the virus Hepatitis C, B and Dengue viruses.
  • These structures comprise antigens that correspond to polysaccharide regions of Neisseria meningitidis, as well as peptides that mimic polysaccharide antigenic regions, or any region of a microorganism or a pathogen.
  • the particles may contain regions of their own antigens or relevant antigens in obtaining vaccines against cancer, such as gonadotropin-releasing hormone regions.
  • the carrier molecules that make up these particles can be selected the hepatitis B virus surface antigen, HbsAg, the Neisseria meningitidis p64K protein, the HIV nucleocapsid antigen, the antigen of the Hepatitis B virus nucleocapsid. They can also include polysaccharide molecules such as dextran particles.
  • the invention also relates to the use of the antigenic structures previously described for diagnostic purposes or for inclusion in prophylactic and therapeutic vaccine preparations in infectious, autoimmune diseases, cancer, as well as with the vaccine formulations obtained therefrom. , which can be applied systemically and mucosally.
  • the V3 loop it is shown that it is possible to further increase cross-reactivity and neutralization with the addition of conjugates bearing the CD4 binding peptide, following the same type of structure that was developed to enhance cross-reactivity. of the peptides of variable regions.
  • the addition of these structures increases the anti-V3 cross-reactivity and the immunogenicity of co-administered antigens. The fact that this method favors cross-reactivity in vaccine strategies that require it does not exclude that it be applied in other vaccine strategies that may be favored by the increase in immunogenicity.
  • the invention provides the methodology for obtaining new chemical structures, based on a different presentation to the immune system of epitopes B of variable regions of microorganisms in which the variability is related to its pathogenicity, also of B epitopes of little variability but that induce a neutralizing or protective response, as well as epitopes B of own antigens, all arranged with a dendrimeric structure on carrier proteins capable of enhancing their cross-reactivity and immunogenicity.
  • the proposed method of obtaining allows obtaining vaccine antigens presented to the immune system differently from conventional ones and with greater epitope density, which increases the immunogenicity and the anti-peptide cross-reactivity that is generated when the multiantigenic peptide is conjugated to the carrier protein.
  • the general method described also allows reducing the amounts of dendrimeric structures to be used to obtain better levels of antibodies as well as new properties resulting from this different form of presentation.
  • the new structure may contain a dendrimeric part consisting only of epitopes B since the aid T comes from the carrier element, that is the concept of MAP used as a completely synthetic vaccine subunit avoiding the use of the carrier element, it becomes more flexible with the obtaining of macromolecules half natural or recombinant (carrier of epitope T) and half synthetic and dendrimeric nature.
  • This strategy allows greater accessibility and exposure of the B epitopes of interest and gives the immune system a variety of distances between the presented peptides.
  • Antigenic structures can be obtained from the binding of dendrimeric structures to carrier proteins. Binding of these was carried out using succinic anhydride (AS) as a spacing agent. This spacer covalently binds both antigens through its amino groups. For this, the carrier proteins were first reacted in buffer buffer pH 8.5 with the AS for approximately 30 minutes. The AS is activated under basic conditions forming the corresponding acyl that will react with the amino groups of the protein. Subsequently, the AS residues are removed by the dialysis process to avoid cross-linking of the unwanted dendrimeric molecules (MAP) and peptide-peptide.
  • AS succinic anhydride
  • the conjugation of the synthetic antigens to the carrier proteins is carried out by previously activating the carboxy groups with ECDI (a soluble carbodiimide) for 5 minutes and then adding the synthetic macromolecule (MAPs).
  • ECDI a soluble carbodiimide
  • MAPs synthetic macromolecule
  • the conjugate separation was performed by gel filtration chromatography. Finally, these were characterized by ELISA and Western Blotting using monoclonal antibodies (AcM) and sera from mice.
  • AcM monoclonal antibodies
  • Antigenic structures were obtained using different spacing agents.
  • a desirable requirement for obtaining a conjugate of good immunological quality is that the protein binding is carried out as far as possible from the residues that are part of the relevant epitope or epitopes.
  • different spacing agents were used: glutaraldehyde, M-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS), ⁇ -maleimidopropionic acid-N-hydroxysuccinimide (MPS) ester and succinic anhydride (AS).
  • MBS M-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester
  • MPS ⁇ -maleimidopropionic acid-N-hydroxysuccinimide
  • AS succinic anhydride
  • Example 3 Design, synthesis and conjugation of new dendrimeric structures to HBsAg. Taking into account that antigenic structures (MAP-protein conjugates) generated high titers against peptides of interest. Individual synthesis of new dendrimeric structures was carried out, but this time without the need to include in its sequence auxiliary T peptides product of the presence of the T epitopes of the carrier protein This fact facilitates the synthesis of this type of structures, enables the incorporation of larger B epitopes and prevents the formation of foreign structures that are generated by the linear sequence TB. Once the dendrimers were synthesized, they were individually conjugated to HBsAg as described in example 1. The synthesis of these MAPs was performed as described by J. Tam et.
  • Example 4 Study of potentiation of cross immunogenicity and reactivity.
  • 2 groups of 10 female Balb / c mice were immunized subcutaneously in ACF / AIF between 6-8 weeks each.
  • the groups were: 1, MAP8 (TT-JY1) and 2, HBsAg-MAP8 (TT-JY1).
  • the doses were 50 and 10 ⁇ g respectively.
  • the immunization schedule was 0-14-28-40 days and the mice were bled on days 36 and 51.
  • MAP8 The HBsAg-MAP8 conjugate (TT-JY1) was obtained using the succinic anhydride spacer as described in Example 1.
  • MAP8 contains 8 copies of the T cell epitope, which belongs to the 830-844 region of the tetanus toxoid (TT) and contains 8 copies for B cells, which comprises the central region of the V3 loop of gp120 of HIV-1 JY1 isolation (Cruz, LJ et al. 2000 Journal of Peptide Science 6: 217-224).
  • TT-JY1 contains 8 copies of the T cell epitope, which belongs to the 830-844 region of the tetanus toxoid (TT) and contains 8 copies for B cells, which comprises the central region of the V3 loop of gp120 of HIV-1 JY1 isolation (Cruz, LJ et al. 2000 Journal of Peptide Science 6: 217-224).
  • the antibody response was quantified by immuno-enzymatic assay (ELISA) for the determination of serum JY1 anti-peptide IgG.
  • ELISA immuno-enzymatic assay
  • the cross-reactivity study was done by indirect ELISA by coating with the different V3 peptides conjugated to BSA (Gómez, CE. Et al. 1998 J. Viral. Methods. 71: 7-1618). Serum mixtures were tested at a 1/100 dilution.
  • mice Two groups of 10 female Balb / c mice between 6-8 weeks each with 100 ⁇ g of TAB9 protein and 16.4 ⁇ g of MAP8 (TT-JY1) were immunized subcutaneously in ACF / AIF (the mass of both immunogens is equivalent at the same molarity of epitopes JY1).
  • the immunization schedule was 0, 14, 28, 56 days and the mice were bled on day 67.
  • the antibody response was quantified by immuno-enzymatic assay (ELISA) for the determination of serum JY1 anti-peptide IgG.
  • mice immunized with MAP8 are able to recognize 4 (LR150, RF, MN, BRVA) of the 5 peptides analyzed for cross-reactivity (Fig. 2A).
  • RF, MN, BRVA optical density values greater than 1.25 OD which implies a strong reactivity.
  • the cross reactivity was very high (OD> 2.5). The above evidences the great cross reactivity that is generated by this way of presenting the epitope to the immune system.
  • the result obtained for the TAB9 protein shows that the technical solution of including a set of sequences within a construct to generate response against all these is not always viable. In fact, in this sense the MAP8 (TT-JY1) showed a much superior behavior.
  • an epitope mapping and alanine scanning of the mixtures of the sera of both groups were carried out. to determine their differences. In the case of maped was found that both groups recognize the same area of the peptide, LGQALY. However, a small difference was observed in the sweeping with alanine.
  • the amino acids involved in the recognition were LXQXXY. While for the TAB9 group, LXQXLY were important. This slight difference generates different patterns of recognition towards V3 peptides. Although it is possible to speculate that the three-dimensional structure adopted by the peptide within the MAP structure is responsible for the cross-reactivity found. In the case of TAB9 protein, the way in which V3 peptides, present in their sequence, are exposed to the immune system is different with respect to MAPs. This experiment demonstrates that this exposure is responsible for the cross-reactivity observed.
  • Example 6 Comparison of the immunogenicity of different forms of presentation of synthetic peptides to the immune system.
  • 9 groups of 8 female Balb / c mice were inoculated. The immunization schedule was 0-14-28 days and the mice were bled 10 days after the last dose. Immunized groups, doses and adjuvants used are presented in Table 2.
  • MAP4 TT-JY1 contains 4 repeated B-cell epitopes (JY1), and 4 epitopes for T-cells (TT).
  • the peptide (TT-JY1) contains two epitopes B (JY1) and T (TT) located consecutively.
  • the polymer was obtained by polymerization of the cysteines placed at the C and N terminal ends of the aforementioned peptide (Cruz, L.J. et al. 2000 Applied Biotechnology 17: 35-38).
  • the peptide was also synthesized on dextran microparticles.
  • the variants HBsAg-peptide (TT-JY1), HBsAg-MAP4 (TT-JY1) and HBsAg-MAP8 (TT-JY1) were obtained by conjugation through the succinic anhydride spacer as described in Example 1.
  • the immunized group with HBsAg (group 9) it was taken as placebo.
  • the antibody response was quantified by immuno-enzymatic assay (ELISA) for the determination of serum JY1 anti-peptide IgG.
  • ELISA immuno-enzymatic assay
  • the statistical analysis of the results was performed by the Student test: p ⁇ 0.05 was considered significant difference and p ⁇ 0.01 highly significant. It was shown that with the use of MAPs conjugated to HBsAg (group 7 and 8) it was possible to significantly increase the immune response to the JY1 peptide with respect to MAPs unconjugated and the polymer (groups 1, 2 and 3), no significant differences were observed between the MAPs and the polymer and these were statistically superior to the peptide (group 4).
  • the doses were 10 ⁇ g for groups 1, 2 and 4; Groups 3 and 5 were immunized with 5 ⁇ g of each conjugate in the mixture.
  • the immunization schedule was: 0, 14, 28, 56, 84 days, the mice being bled 10 days after the last dose.
  • a summary of the immunization schedule is presented in Table 4.
  • Cross-reactivity was evaluated against a panel of 50 V3 peptides synthesized on cellulose membrane corresponding to different isolates of HIV-1.
  • cross-reactivity by ELISA against the 5 V3 peptides mentioned in the example of Figure 1 was evaluated. Serum mixtures of each group diluted 1/100 were always used.
  • the antibody response was quantified by immuno-enzymatic assay (ELISA) for the determination of IgG anti-consensus peptides of V3, CD4 and serum V3 library.
  • ELISA immuno-enzymatic assay
  • the statistical analysis of the results was performed by the Student test: p ⁇ 0.05 was considered significant difference and p ⁇ 0.01 highly significant.
  • p ⁇ 0.05 was considered significant difference and p ⁇ 0.01 highly significant.
  • HBsAg-MAP4 (library) and HBsAg-MAP4 (consensus) groups a very weak antibody response against homologous peptides is observed even after five doses (Table 6).
  • conjugates were prepared independently and then mixed in the formulation to avoid the difficulty of the proportions of one with respect to the other. This was reflected in the three mixtures used where similar anti-peptide response levels were obtained for each peptide.
  • the anti consensus peptide and anti library response was significantly higher when both were immunized in the mixture with the CD4 peptide with respect to the response against themselves immunized as individual conjugates.
  • the anti-consensus response was increased and the anti-library response appeared at a high level as shown in Figure 5b (graphs 1 and 2). However, half of the dose administered with the individual conjugates was inoculated in the mixture.
  • Example 9 Comparison of the immunological response of peptide V3 (JY1) in linear and MAP form, coupled to different carrier proteins.
  • the JY1 peptide in linear form and of MAP dendrimeric structure was coupled to different carrier proteins ( HBsAg, KLH and P64k).
  • the conjugation of the peptide and the MAP to the different carriers was carried out by the succinic anhydride method in groups 5 to 9.
  • Group 10 was a control of HBsAg-MAP conjugate using MPS as a spacing agent.
  • 9 groups of 8 female Balb / c mice were inoculated subcutaneously. The immunization schedule was 0-14-28-56 days and the mice were bled 10 days after the last dose. Immunized groups, doses and adjuvants used are presented in Table 8.
  • the antibody response was quantified by immuno-enzymatic assay (ELISA) for the determination of serum JY1 anti-peptide IgG.
  • ELISA immuno-enzymatic assay
  • Cross-reactivity was also evaluated by ELISA using a panel of peptides described in example 5, in addition an unrelated peptide was used as a control.
  • the statistical analysis of the results was performed by the Student test: p ⁇ 0.05 was considered significant difference and p ⁇ 0.01 highly significant.
  • the antibody response of the protein-MAP conjugates was in all cases superior to the immunological response of the peptide-protein conjugates (Fig. 6B).
  • the response of the HBsAg-MAP8 conjugate (TT-JY1) was similar to the response of the KLH-MAP8 (TT-JY1) and these were at the same time statistically superior to that obtained with the P64k-MAP8 (TT-JY1) conjugate.
  • the immunization scheme was performed in female Balb / c mice from 8 to 10 weeks of age and had inoculations on days 0, 14 and 28, extractions were performed preimmune and after third dose.
  • the inoculated antigens were MAP8 (TT-RF), obtained as described by James Tam et al. 1988 and the dendrimeric structure obtained when this MAP was conjugated to HBsAg using the succinic anhydride method as previously described in example 1.
  • the doses used were 40 and 10 ⁇ g respectively.
  • Example 11 Immunological analysis of different MAPs conjugated to carrier proteins.
  • MAP4- (NM) and peptide- (NM) contain an epitope derived from loop 4 of the outer membrane protein P1.15 of strain B385 of Neisseria meningitidis (HYTRQNNADVFVPAVVG).
  • MAP4- (D) and D-peptide contain an epitope derived from the pre-M / M protein of Dengue-2 virus (LTTRNGEPHMIVSRQEKGKSLLFKTGDGVG). These were synthesized as described by James Tam et al. 1988.
  • MAP4- (NM) and peptide-NM were conjugated to the KLH and P64k carrier proteins using the specific method of the ⁇ -maleimidopropionic acid-N-hydroxysuccinimide (MPS) ester.
  • the conjugation reaction was carried out by derivatizing each of the proteins with excess of this spacer in 50 mmol / L phosphate buffer in DMF at pH 6 for 30 min. Subsequently, derivatized proteins were dialyzed in order to eliminate excess MPS.
  • To the MAP4- (NM) and the peptide-NM was added during the synthesis at its C-terminal end a cysteine containing the group -SH.
  • MAP4- (D) and the D-peptide were conjugated to the KLH and P64k proteins using the direct method of soluble carbodiimide.
  • MAP4- (D) and the D-peptide contain a carboxyl group at the C-terminal end of their sequence, which allows direct binding to the amino groups of the carrier proteins (KLH and P64k).
  • the antibody response was quantified by immuno-enzymatic assay (ELISA) for the determination of serum anti-peptide IgG.
  • ELISA immuno-enzymatic assay
  • mice from 10 to 12 weeks were inoculated with 10 g of HBsAg coupled to MAP8 (TT-JY1), as control was used a group of 8 mice that were given 40 g of MAP8 (TT-JY), the antibody response against both immunogens was evaluated by ELISA for the determination of anti JY1 IgG and cross-reactivity analysis against a panel of 5 V3 peptides.
  • the control group did not generate a detectable anti-JY1 response, however, the group immunized with the HBsAg-MAP8 conjugate (TT-JY1), generated strong responses against the homologous peptide and in 100% of cases, cross-reactivity against heterologous peptides. This result evidenced the critical role of conjugation in obtaining responses against the dendrimer, in addition to demonstrating the generation of a strong cross-reactivity against different V3 peptides mucosally.
  • dendrimers that had the same result were those prepared according to example 2, using the nucleocapsid antigens of Hepatitis B, Hepatitis C and Dengue Virus viruses as carriers.
  • Example 13 Analysis of cross-neutralization to different isolates of HIV-1 from sera with cross-reactivity.
  • an in vitro assay was performed using different laboratory isolates of HIV-1 (MN, RF, IIIB and a similar isolation to JY1). To this end, poles were taken from the sera of those groups whose immunogens had the highest cross-reactivity: HBsAg-MAP8 (TT-JY1) (example 4), HBsAg-MAP8 (TT-RF) (example 10) and the HBsAg mixture MAP4 (CD4) with HBsAg-MAP4 (consensus) (example 8).
  • the synthesis of the dendrimeric nucleus was carried out by reacting the amino groups of the 1,6-diaminohexane with the carboxylic groups of the amino acid Boc-Lys (Boc) -OH using dicyclohexylcabodiimide (DCC) as activator. Then, 37% trifluoroacetic (TFA) deprotection in dichloromethane (DCM) was performed, obtaining a core with 4 reactive ends to produce a tetravalent dendrimeric structure, then there is a second and third level of Boc-Lys coupling (Boc ) -OH, using the same reaction cycle to obtain a nucleus containing 16 reactive amino groups.
  • DCC dicyclohexylcabodiimide
  • the core is purified by RP-HPLC using a C8 column.
  • the JY1 peptide was previously synthesized containing a cysteine at the C-terminal end which is reacted in appropriate proportions with the core obtained.
  • Thioether formation due to the interaction between the heteroatom group of the nucleus and the thiol group of the peptide cysteine was carried out under basic conditions (pH, 8-9) (Fig. 9).
  • the degree of incorporation was determined by SDS-PAGE and gel filtration. Dendrimeric molecules between 40 and 50 kD were obtained. This dendrimeric structure was coupled to different carrier proteins using the spacers described above in Example 2. The antigenic structures obtained were used in different immunization schemes where their immunological superiority was demonstrated.
  • Figure 2 A) Study of the recognition towards several V3 peptides of the mixtures of sera after four doses. Groups: 1, MAP8 (TT-JY1); 2, TAB9. The doses were 16.4 and 100 ⁇ g respectively.
  • MAP4 (library), HBsAg-MAP4 (CD4)); 3 and 4, mixture (HBsAg-MAP4 (consensus), HBsAg-MAP4 (CD4)); 5, HBsAg fifth dose; 6, HBsAg-MAP4 (CD4) (fifth dose).

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Abstract

La presente invención se relaciona con un método para la obtención de estructuras antigénicas de alta reactividad cruzada, capaces de potenciar la respuesta inmune a antígenos peptídicos administrados por vía sistémica y/o mucosal, así como con las estructuras químicas obtenidas a partir este método, y con las formulaciones obtenidas a partir de dichas estructuras y su uso.El método describe la obtención de nuevas estructuras dendriméricas, partiendo de la selección y síntesis de dendrímeros, que posteriormente son acoplados a moléculas portadoras. Las estructuras resultantes pueden utilizarse convenientemente adyuvadas o en una formulación donde pueden introducirse varios antígenos de este tipo, encontrándose un efecto sinérgico entre estos componentes con respecto a la reactividad cruzada y la inmunogenicidad de la respuesta obtenida. Además la preparación puede contener, estabilizadores y preservos. Las estructuras antigénicas resultantes son aplicables en la industria farmacéutica como formulaciones vacunales tanto para uso humano como veterinario y como parte de sistemas de diagnóstico.

Description

MÉTODO DE OBTENCIÓN DE ESTRUCTURAS ANTIGENICAS QUE POTENCIAN LA REACTIVIDAD CRUZADA ESPECÍFICA.
Sector Técnico La presente invención está relacionada con la rama de la medicina, particularmente con formulaciones vacunales basadas en nuevas estructuras antigénicas que potencian la reactividad cruzada. Técnica Anterior Los péptidos tienen por si solos muy baja inmunogenicidad por lo que generalmente son conjugados a proteínas portadoras que aportan epítopos para células T auxiliadoras (efecto portador) (Herrington, D.A. et al. 1987 Nature 328:257-259). En el proceso de conjugación los péptidos pueden perder las propiedades antigénicas deseadas debido entre otras cosas a que los métodos de conjugación, al resultar relativamente inespecíficos, pueden enlazar al péptido por parte de la secuencia relevante para el reconocimiento del sistema inmune. Para evitar los problemas asociados a la conjugación de péptidos a proteínas portadoras se generó otra forma de presentar secuencias peptídicas al sistema inmune llamada sistemas peptídicos multiantigénicos (MAPs) los cuales se basan en la inclusión de epítopos para células B y T dentro de un núcleo ramificado de usinas (Tam, J. P.et al. 1988 Proc. Nati. Acad. Sci. 86:5409-54132-5)(Tam, J. P. 1989 Methods Enzymol. 168:7-15) (Tam, J. P. 1990 WO 90/11778) (Tam, J. P. 1993 WO 93/03766). Entre las ventajas de este sistema portador de antígenos sobre los conjugados de péptidos a proteínas se encuentran su estructura y composición definidas así como la alta proporción del epítopo de interés respecto del total de la molécula. En algunos estudios se ha mostrado la superioridad en cuanto a inmunogenicidad del sistema portador MAPs sobre los conjugados (Wang, C. Y. et al. 1991 Science 254: 285-288); aunque esto no ha sido siempre consistente pues en otros estudios ha sucedido lo contrario (Riley, E.M. et al. 1996 Veterinary Immunology and Immunopathology 55: 243-253), lo cual podría ser un fenómeno asociado a la proteína portadora. La reactividad cruzada es una propiedad que, al igual que la neutralización cruzada, ha sido descrita previamente para péptidos sintéticos (Wang, O Y. et al. 1991. Science 254: 285-288). Varios investigadores han reportado además que anticuerpos para péptidos del lazo V3 del HIV-1 presentan neutralización cruzada frente a diferentes aislamientos de campo de HIV-1 (Wang, C. Y. et al. 1991 Science 254: 285-288). En resumen, la neutralización cruzada y por tanto la reactividad cruzada están asociadas a la estructura de péptidos, como por ejemplo péptidos del lazo V3 de VIH-1. La estrategia de MAPs ha sido usada para generar una respuesta anti V3 neutralizante en humanos (Geoffrey, J. et al. 1996 Journal of Infectious Diseases, 173: 330-3398). La desventaja de esta estrategia vacunal consistió en que para obtener una inmunogenicidad y efecto neutralizantes mayores fue necesario inocular una cantidad excesivamente alta, 500 μg, de MAP (Kahn, J. et al. 1994 Tenth International Conference on AIDS Yokohama, Japan 7-12 August., Vol. 1)(Li, D. et al. 1997 Asian Pac J Allergy Immunol. 15:105-13). Si se pensara en preparar una mezcla de MAPs basados en la selección de diferentes V3 buscando el más amplio espectro de neutralización de aislamientos clínicos la cantidad necesaria de microgramos totales de MAPs sería incompatible con las prácticas habituales de inmunización. La reactividad cruzada se define como la habilidad que posee un inmunógeno para reaccionar con ligandos relacionados (Paul, W. Fundamental Immunology. 4th edition). Aunque el fenómeno de la reactividad cruzada se conoce desde los mismos inicios de la inmunología, hasta la fecha ninguna preparación vacunal con probada eficacia se ha basado a priori en la reactividad cruzada. Esto quizás explique en parte por qué la inmensa mayoría de las vacunas en uso actualmente en los programas de inmunización de diferentes países protegen contra patógenos que no presentan una alta variabilidad entre sus diferentes aislamientos clínicos.
La reactividad cruzada entre péptidos con secuencias presentando homología es una propiedad particular de cada péptido y ésta puede ser potenciada de acuerdo a diferentes formas de presentación del mismo al sistema inmune. Pudiera considerarse obvio que el aumento de la inmunogenicidad trae consigo una potenciación de la reactividad cruzada, sin embargo, no resulta así. En un estudio con péptidos T-B se demostró que la inducción de anticuerpos con reactividad y/o neutralización cruzadas no correlaciona con la inmunogenicidad de los péptidos (Kasmi, K.C, et. al. 1998 Molecular Immunology 35:905-918). Para poder generar una respuesta inmunológica capaz de reconocer un gran número de variantes antigénicas de un patógeno se han generado una serie de ¡deas. Una de éstas consiste en la inclusión dentro de un polipéptido multiepitópico de todas las variantes de un epítopo o aquellas más importantes. Los polipéptidos multiepitópicos generados a partir de secuencias para epítopos B no han sido siempre una opción viable (Flynn, J.N, et. al. 1997 J Viral 71: 7586-92). En primer término la generación de un polipéptido quimérico implica la producción de una molécula de estructura tridimensional impredecible que no tiene por qué exponer adecuadamente todos los epítopos representados lo cual favorece la respuesta hacia algunos e impide totalmente la respuesta contra otros. Por otro lado, resulta también impredecible la relación de dominancia que se impondrá entre los diferentes epítopos, lo cual puede silenciar incluso aquellos que se encuentran expuestos adecuadamente. Otra estrategia ha sido la generación de bibliotecas peptídicas que representan en si mismas toda o parte de la variabilidad posible. Las bibliotecas peptídicas obtenidas de regiones altamente variables han tenido un éxito relativo dado por la alta representatividad del número de epítopos que se pretende introducir en la formulación vacunal, sin embargo cada epítopo particular queda "diluido" dentro de un cúmulo muy grande de secuencias diferentes lo cual hace impredecible si se obtendrá una respuesta inmune al nivel requerido (Alien, D. et al. 1998 J. of Viral. 27: 651-659)(Jerome, E. et al. 1994 Eur. J. Immunol. 24: 2789-2795).
Otra estrategia es la diseñada en el caso del VIH con el objetivo de cubrir un amplio espectro de secuencias V3, es la generación de péptidos consenso. Esta se basa en el estudio de la variabilidad de los epítopos en los aislamientos de campo o clínicos, estableciendo para cada posición al aminoácido más conservado entre todos los aislamientos (Holley, L.H. et al. 1991 Proc. Nati. Acad. Sci. 88:6800-6804). Divulgación de la invención
El objetivo técnico que se persigue con la invención propuesta es el desarrollo de un método de obtención de estructuras antigénicas de alta reactividad cruzada y capaces de potenciar la respuesta inmune a antígenos peptídicos administrados por vía sistémica y/o mucosal. Este método genera estructuras dendriméricas conjugadas que cuentan con una parte sintética acoplada a proteínas portadoras en proporciones adecuadas. La adición de estructuras semejantes portando otros epítopos B ha permitido incrementar la reactividad cruzada, con lo que se consigue además un incremento de la inmunogenicidad general de los antígenos coadministrados. Otros antígenos y adyuvantes pueden ser adicionados a esta preparación. Por lo tanto, uno de los objetos de la presente invención es un método de obtención de estructuras antigénicas que potencian la reactividad cruzada específica. Dicho método comprende los siguientes pasos: A) Selección del epítopo de interés; B) Obtención de estructuras dendriméricas con los epítopos seleccionados en el paso (A) mediante un método de síntesis, el cual puede ser la síntesis sobre un núcleo de usinas o ácido aspártico; ó la síntesis sobre núcleos de moléculas orgánicas; la síntesis sobre un núcleo dendrimérico; el acoplamiento de péptidos sobre un núcleo dendrlmérico; o mezclas sobre un mismo núcleo de epítopos de células B, de células T o de ambas;
(C) Conjugación de una o varias de las estructuras dendriméricas obtenidas en el paso (B), a una o varias moléculas portadoras mediante un método de conjugación que puede ser la conjugación utilizando glutaraldehído, anhídrido succínico, éster de ácido β-maleimidopropionico-N -hidroxisuccinimida (MPS) o empleando un espaciador sin cadenas laterales aromáticas, ya que se evidenció que la presencia de estas cadenas elimina la reactividad hacia la estructura dendrimérica acoplada. D) Mezcla de los conjugados obtenidos en el paso (C) para la obtención de las formulaciones mediante la adición del péptido del dominio de unión al CD4 o un conjugado que contenga este epítope, lo cual potencia la reactividad cruzada y la ¡nmunogenicidad de la estructura antigénica resultante; y finalmente E.) Adyuvar en alúmina u otro adyuvante apropiado.
En el método de la invención, los péptidos que forman parte de las estructuras obtenidas en el paso (B) pueden ser regiones del Virus de Inmunodeficiencia Humana 1 ó 2, específicamente regiones variables como la región V3. Igualmente pueden ser empleadas regiones de virus que poseen determinado nivel de variabilidad y diversidad, entre ellos el virus de la Hepatitis C, B y los virus del Dengue. Igualmente pueden ser empleados antígenos que se correspondan con regiones polisacarídicas de Neisseria meningitidis, así como péptidos que mimetizan regiones antigénicas polisacarídicas, o cualquier región de un microorganismo o un patógeno. De igual modo el método de la invención puede utilizar regiones de antígenos propios o antígenos relevantes en la obtención de vacunas contra el cáncer, como por ejemplo las regiones de la hormona liberadora de la gonadotropina. Entre las moléculas portadoras que pueden emplearse en el método de la invención se incluyen el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B, HbsAg, la proteína p64K de Neisseria meningitidis, el antígeno de la nucleocápsida del HIV, el antígeno de la nucleocápsida del virus de la Hepatitis B. También pueden ser empleadas para este fin moléculas de naturaleza polisacarídica como las partículas de dextrana.
El método de la invención también comprende la conjugación de una o varias de las estructuras dendriméricas obtenidas en el paso (B), a una o varias moléculas portadoras mediante conjugación covalente o asociación electrostática o por hidrofobicidad. Otro objeto de la invención es la estructura antigénica que se obtiene mediante el método anterior, la cual potencia la reactividad cruzada específica de preparados que la contienen, y que comprende los epítopos antigénicos descritos previamente en forma dendrimérica y acoplados a moléculas portadoras en una proporción entre 1 y 30% de la estructura resultante. Los epítopos seleccionados pueden ser de naturaleza oligosacarídica o peptídica y dentro de esta última pueden utilizarse consensos peptídicos de regiones variables seleccionados por subtipos, subgrupos, serotipos u otra forma de asociación, así como son bibliotecas de secuencias peptídicas del microorganismo seleccionado, o péptidos miméticos. Particularmente los péptidos que forman parte de la región dendrimérica pueden corresponderse con regiones variables del Virus de Inmunodeficiencia Humana 1 ó 2, y dentro de estas la región V3, y regiones de otros virus que poseen determinado nivel de variabilidad y diversidad, entre ellos el virus de la Hepatitis C, B y los virus del Dengue. Estas estructuras comprenden antígenos que se correspondan con regiones polisacarídicas de Neisseria meningitidis, así como péptidos que mimetizan regiones antigénicas polisacarídicas, o cualquier región de un microorganismo o un patógeno. De igual modo las partículas pueden contener regiones de antígenos propios o antígenos relevantes en la obtención de vacunas contra el cáncer, como por ejemplo las regiones de la hormona liberadora de la gonadotropina.
Entre las moléculas portadoras que conforman estas partículas pueden seleccionarse el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B, HbsAg, la proteína p64K de Neisseria meningitidis, el antígeno de la nucleocápsida del HIV, el antígeno de la nucleocápsida del virus de la Hepatitis B. También pueden incluir moléculas de naturaleza polisacarídica como las partículas de dextrana.
La invención también se relaciona con el uso de las estructuras antigénicas previamente descritas con fines de diagnóstico o para su inclusión en preparados vacunales profilácticos y terapéuticos en enfermedades infecciosas, autoinmunes, cáncer, así como con las formulaciones vacunales que se obtienen a partir de las mismas, las cuales pueden ser aplicadas por vía sistémica y mucosal. En el caso específico del lazo V3, se demuestra que es posible incrementar aun más la reactividad y la neutralización cruzadas con la adición de conjugados que porten al péptido de unión a CD4, siguiendo el mismo tipo de estructura que se desarrolló para potenciar la reactividad cruzada de los péptidos de regiones variables. La adición de estas estructuras incrementa la reactividad cruzada anti-V3 y la inmunogenicidad de antígenos coadministrados. El hecho de que este método favorezca la reactividad cruzada en estrategias vacunales que lo requieran no excluye que se aplique en otras estrategias vacunales que se puedan favorecer por el incremento de la inmunogenicidad.
La invención proporciona la metodología de obtención de nuevas estructuras químicas, basadas en una diferente presentación al sistema inmunológico de epítopos B de regiones variables de microorganismos en los que la variabilidad está relacionada a su patogenicidad, también de epítopos B de poca variabilidad pero que inducen una respuesta neutralizante o protectora, así como epítopos B de antígenos propios, todos ellos dispuestos con una estructura dendrimérica sobre proteínas portadoras capaces de potenciar su reactividad cruzada y su inmunogenicidad. El método de obtención propuesto permite obtener antígenos vacunales presentados al sistema inmunológico de manera diferente a los convencionales y con mayor densidad epitópica, lo que incrementa la inmunogenicidad y la reactividad cruzada anti-péptido que se genera al conjugar el péptido multiantigénico a la proteína portadora. El método general descrito permite, además, disminuir las cantidades de las estructuras dendriméricas a utilizar para obtener mejores niveles de anticuerpos así como nuevas propiedades resultantes de esta distinta forma de presentación.
Es fundamental destacar que en el caso de péptidos provenientes de regiones variables es posible aumentar la reactividad cruzada sin afectar la inmunogenicidad, como se describe en los ejemplos. Además de potenciarse la inmunogenicidad, se evidenció una potenciación de la reactividad cruzada, esto, además de posibilitar la obtención de mejores respuestas usando menores cantidades de péptidos, es una propiedad adicional que se potencia hasta niveles significativos. Por otra parte, este método permite acoplar diferentes estructuras dendriméricas a una misma molécula portadora. Igualmente se demostró que la combinación de mezclas de este tipo de estructuras, con estructuras semejantes portando el péptido de unión a CD4, permite incrementar la inmunogenicidad y reactividad cruzada de la respuesta anti péptido V3. La nueva estructura puede contener una parte dendrimérica constituida solamente por los epítopos B ya que la ayuda T proviene del elemento portador, o sea el concepto de MAP usado como subunidad vacunal completamente sintética evadiendo el uso del elemento portador, se flexibiliza con la obtención de macromoléculas mitad natural o recombinante (portador de epítopo T) y mitad sintética y de naturaleza dendrimérica. Esta estrategia permite una mayor accesibilidad y exposición de los epítopos B de interés y brinda al sistema inmune una variedad de distancias entre los péptidos presentados. Además, con el uso de los conjugados de estructuras dendriméricas a proteínas portadoras, se logra una potenciación de la reactividad cruzada y/o de la inmunogenicidad con dosis mucho más bajas respecto a las dosis de las estructuras dendriméricas (Ej. MAPs) en solución. Por otra parte, ha sido probado el efecto sinérgico que puede obtenerse sobre la inmunogenicidad y sobre la reactividad cruzada con mezclas de estos conjugados. La presente invención se puede aplicar por vía mucosal, y aún más, facilita por primera vez a la metodología de inmunización con MAPs alcanzar su uso por esta vía, una de las rutas de mayor interés en la actualidad. EJEMPLOS DE REALIZACIÓN
Ejemplo 1. Método de obtención de las estructuras antigénicas. Las estructuras antigénicas pueden ser obtenidas a partir de la unión de estructuras dendriméricas a proteínas portadoras. La unión de estas se llevó a cabo utilizando el anhídrido succínico (AS) como agente espaciador. Este espaciador enlaza covalentemente a ambos antígenos a través de sus grupos aminos. Para esto, primeramente se pusieron a reaccionar las proteínas portadoras en buffer tampón pH 8.5 con el AS durante 30 minutos aproximadamente. El AS se activa en condiciones básicas formando el acilo correspondiente que reaccionará con los grupos aminos de la proteína. Posteriormente, los restos de AS son eliminados mediante el proceso de diálisis para evitar los entrecruzamientos de las moléculas dendriméricas (MAP) y péptido-péptido no deseados. La conjugación de los antígenos sintéticos a las proteínas portadoras se lleva a cabo activando previamente los grupos carboxilos con ECDI (una carbodiimida soluble) durante 5 minutos y adicionando seguidamente la macromolécula sintética (MAPs). La separación de los conjugados se realizó mediante cromatografía de filtración en gel. Finalmente, estos fueron caracterizados por ELISA y Western Blotting empleando anticuerpos monoclonales (AcM) y sueros de ratones. Ejemplo 2. Método de obtención de las estructuras antigénicas empleando diferentes agentes espaciadores.
La obtención de las estructuras antigénicas se realizó utilizando diferentes agentes espaciadores. Un requisito deseable para obtener un conjugado de buena calidad inmunológica es que la unión a la proteína se realice lo más lejos posible de los residuos que forman parte del epítopo o epítopos relevantes. Para evitar este fenómeno, fueron empleados diferentes agentes espaciadores: glutaraldehído, éster de M-maleimidobenzoyl-N-hidroxisuccinimida (MBS), éster de ácido β- maleimidopropionico-N-hidroxisuccinimida (MPS) y anhídrido succínico (AS). Idealmente, un buen agente espaciador no debe generar respuesta de anticuerpos contra sí mismo. En los estudios realizados se encontró que los títulos generados contra el epítopo JY1 por los diferentes conjugados de HBsAg-MAP utilizando diferentes agentes espaciadores fueron altos, excepto para el conjugado de MBS en el cual la respuesta fue nula, siendo alta la respuesta anti espaciador cuando se inmunizaron los ratones con conjugados que difirieron en agente acoplante. Este hecho demuestra que todos los agentes espaciadores reportados en la literatura no se comportan de igual manera, lo cual indica que en la obtención de este tipo de estructuras no es obvio el uso de cualquier agente acoplante previamente descrito en el estado del arte.
Ejemplo 3. Diseño, síntesis y conjugación de nuevas estructuras dendriméricas al HBsAg. Teniendo en cuenta que las estructuras antigénicas (conjugados MAP-proteínas) generaron altos títulos contra péptidos de interés. Se realizó la síntesis individual de nuevas estructuras dendriméricas, pero esta vez sin necesidad de incluir en su secuencia péptidos T auxiliadores producto de la presencia de los epítopos T de la proteína portadora. Este hecho facilita la síntesis de este tipo de estructuras, posibilita la incorporación de epítopos B de mayor tamaño y evita la formación de estructuras extrañas que se generan por la secuencia lineal T-B. Una vez sintetizado los dendrímeros fueron conjugados individualmente al HBsAg como fue descrito en el ejemplo 1. La síntesis de estos MAPs se realizó como fue descrito por J. Tam et. al. (1988). Posteriormente, los conjugados son separados de las estructuras dendriméricas por cromatografía de filtración en gel y la concentración se determinó por Comassie. Ejemplo 4. Estudio de potenciación de la inmunogenicidad y la reactividad cruzadas. Con el objetivo de estudiar el efecto de la conjugación del MAP a una proteína portadora sobre la inmunogenicidad y la reactividad cruzada se inmunizaron por vía subcutánea en ACF/AIF, 2 grupos de 10 ratones Balb/c hembras entre 6-8 semanas cada uno. Los grupos fueron: 1, MAP8 (TT-JY1) y 2, HBsAg-MAP8 (TT-JY1). Las dosis fueron de 50 y 10 μg respectivamente. El esquema de inmunización fue de 0-14-28-40 días y se desangró a los ratones en los días 36 y 51. El conjugado HBsAg-MAP8 (TT- JY1) se obtuvo utilizando como agente espaciador al anhídrido succínico como fue descrito en el ejemplo 1. El MAP8 (TT-JY1 ) contiene 8 copias del epítopo para células T, que pertenece a la región 830-844 del toxoide tetánico (TT) y contiene 8 copias para células B, que comprende la región central del lazo V3 de la gp120 del aislamiento JY1 del HIV-1 (Cruz, L.J. et al. 2000 Journal of Peptide Science 6: 217-224). Después de la tercera y cuarta dosis se estudió la respuesta anti JY1 por ELISA y la reactividad cruzada. La respuesta de anticuerpos se cuantificó por ensayo inmuno-enzimático (ELISA) para la determinación de IgG anti-péptido JY1 en suero. El estudio de la reactividad cruzada se hizo por ELISA indirecto recubriendo con los diferentes péptidos V3 conjugados a BSA (Gómez, CE. et al. 1998 J. Viral. Methods. 71: 7-1618). Las mezclas de los sueros fueron ensayadas a una dilución 1/100.
El análisis estadístico de los resultados se realizó por el test de Student: p<0.05 se consideró diferencia significativa y p<0.01 altamente significativa. Después de la tercera dosis no hubo diferencias en cuanto a inmunogenicidad entre los grupos aunque se puso 5 veces menos cantidad en cuanto a masa del conjugado respecto del MAP lo cual evidencia la ventaja en cuanto a economía de antígeno de esta estrategia (Fig. 1A). En el grupo inmunizado con el conjugado se observa una reactividad cruzada hacia otros péptidos V3 que no aparecen en el grupo inmunizado con el MAP incluso con similares niveles de inmunogenicidad (Fig. 1B). Luego de cuatro dosis si existen diferencias significativas entre los grupos en cuanto a inmunogenicidad anti JY1, además se produjo un incremento de la reactividad cruzada en ambos inmunógenos siendo más intensa y amplia en el caso del conjugado (Fig. 1B). El resultado del aumento de la inmunogenicidad es muy interesante pues en la literatura se reportan experimentos donde se inoculan mezclas de MAPs para lograr un reconocimiento amplio de varios epítopos; pero la masa que se necesita poner de cada MAP para lograr el efecto deseado hace en ocasiones que la masa total que resulta de la suma de cada uno sea tan grande que no es posible inocularla a humanos por los efectos secundarios que provoca. De lo dicho resulta que es muy importante lograr alta inmunogenicidad con la menor masa a inocular posible. Lo que demuestra la superioridad de las estructuras resultantes de la metodología que se describe. Si tomamos en cuenta que esa menor masa tiene a la vez la propiedad de tener mayor reactividad cruzada esto implica que la cantidad de regiones variables correspondientes a un epítopo, necesarias para inocular un coctel, son menores. Además, el uso de conjugados da la posibilidad de generar vacunas bivalentes si la proteína portadora tiene per se capacidad protectora como es el caso del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B. Ejemplo 5. Estudio de la respuesta humoral de ratones inmunizados con MAP8 (TT- JY1) y TAB9.
Con el objetivo de estudiar las diferencias en cuanto a presentación del epítopo JY1 al sistema inmune entre los grupos inmunizados con la proteína recombinante TAB9 (Duarte, C.A. et al. 1994 AIDS Res Hum Retroviruses.10: 235-243), que incluye dentro de su secuencia 6 péptidos de 15 aminoácidos cada uno de la región V3 del VIH-1 de los aislamientos LR150, JY1 , RF, MN, BRVA, IIIB) y el MAP8 (TT-JY1), se realizó un experimento para estudiar el reconocimiento de los diferentes péptidos V3 presentes en TAB9 y establecer las diferencias en el reconocimiento del epítopo JY1 a través del mapeo en papel con péptidos sustituidos por el aminoácido alanina en cada posición de la secuencia del epítopo JY1. Se inmunizaron por vía subcutánea en ACF/AIF, 2 grupos de 10 ratones Balb/c hembras entre 6-8 semanas cada uno con 100 μg de la proteína TAB9 y 16.4 μg de MAP8 (TT-JY1) (la masa de ambos inmunógenos equivale a igual molaridad de epítopos JY1). El esquema de inmunización fue de 0, 14, 28, 56 días y se desangró a los ratones en el día 67. La respuesta de anticuerpos se cuantificó por ensayo inmuno-enzimático (ELISA) para la determinación de IgG anti-péptido JY1 en suero.
El análisis estadístico de los resultados se realizó por el test de Student: p<0.05 se consideró diferencia significativa y p<0.01 altamente significativa. El estudio de la reactividad cruzada se hizo por ELISA indirecto recubriendo con los diferentes péptidos V3 conjugados a BSA (Gómez, CE. et al. 1998 J. Viral. Methods. 71 : 7-16). Las mezclas de sueros fueron ensayadas a una dilución de 1/100. El mapeo epitópico sobre soporte de celulosa se realizó según fue descrito por Ronald Frank (Frank, R. 1992 Tetrahedron 48: 9217-9232). El análisis del reconocimiento de varios péptidos V3 de las mezclas de sueros después de cuatro dosis de los diferentes grupos, mostró que los ratones inmunizados con el MAP8 (TT- JY1 ) son capaces de reconocer 4 (LR150, RF, MN, BRVA) de los 5 péptidos analizados para la reactividad cruzada (Fig. 2A). Entre los péptidos que fueron reconocidos 3 de estos (RF, MN, BRVA) dieron valores de densidad óptica mayores de 1.25 D.O. lo que implica una fuerte reactividad. En el caso particular de RF la reactividad cruzada fue muy elevada (D.O.> 2.5). Lo anterior evidencia la gran reactividad cruzada que se genera por esta manera de presentación del epítopo al sistema inmune. En el caso de la proteína TAB9, que presenta los 6 epítopos en su secuencia, no se reconocieron dos de los péptidos V3 (RF y BRVA). Además fueron débilmente reconocidos (< 0.75 D.O.) los péptidos MN y IIIB. Solamente los péptidos JY1 y LR150 dieron valores de DO muy elevados. Este experimento permite concluir que la presentación del epítopo JY1 al sistema inmune por el MAP hace posible el reconocimiento por reactividad cruzada de otros péptidos V3 lo cual es, evidentemente, una cualidad que optimiza la cantidad de antígenos dentro de una estrategia encaminada a la búsqueda del mayor reconocimiento posible en un universo de secuencias peptídicas con homologías. El resultado obtenido para la proteína TAB9 evidencia que la solución técnica de incluir un conjunto de secuencias dentro de una construcción para generar respuesta contra todas estas no es siempre viable. De hecho, en este sentido el MAP8 (TT-JY1 ) mostró un comportamiento muy superior. Como es posible que las diferencias encontradas en cuanto al reconocimiento de péptidos V3 estén dadas por las diferentes formas de presentación de los epítopos al sistema inmune, se llevó a cabo un mapeo epitópico y un barrido con alanina de las mezclas de los sueros de ambos grupos para determinar sus diferencias. En el caso del maped se encontró que ambos grupos reconocen la misma zona del péptido, LGQALY. Sin embargo, en el barrido con alanina se observó una pequeña diferencia. Para el grupo del MAP8 (TT-JY1), los aminoácidos involucrados en el reconocimiento fueron LXQXXY. Mientras que para el grupo de TAB9 fueron importantes LXQXLY. Esta ligera diferencia genera diferentes patrones de reconocimientos hacia los péptidos V3. Aunque es posible especular que la estructura tridimensional que adopta el péptido dentro de la estructura MAP sea la responsable de la reactividad cruzada encontrada. En el caso de la proteína TAB9 la forma en que los péptidos V3, presentes en su secuencia, son expuestos al sistema inmune es diferente con respecto a los MAPs. Este experimento demuestra que esta exposición es responsable de la reactividad cruzada observada.
Ejemplo 6. Comparación de la inmunogenicidad de diferentes formas de presentación de péptidos sintéticos al sistema inmune. Con el objetivo de evaluar la inmunogenicidad de diferentes formas de presentación de péptidos sintéticos al sistema inmune, por vía subcutánea, se inocularon 9 grupos de 8 ratones Balb/c hembras. El esquema de inmunización fue de 0-14-28 días y se desangró a los ratones 10 días después de la última dosis. Los grupos inmunizados, las dosis y los adyuvantes utilizados se presentan en la tabla 2. El MAP4 (TT-JY1) contiene 4 epítopos de células B (JY1 ) repetidos, y 4 epítopos para células T (TT). El péptido (TT-JY1) contiene dos epítopos B (JY1) y T (TT) situados consecutivamente. El polímero se obtuvo por polimerización de las cisteínas colocadas en los extremos C y N terminal del péptido anteriormente señalado (Cruz, L.J. et al. 2000 Biotecnología Aplicada 17:35-38). El péptido también fue sintetizado sobre micropartículas de dextrana. Las variantes HBsAg-péptido (TT-JY1), HBsAg-MAP4 (TT-JY1) y HBsAg- MAP8 (TT-JY1 ) se obtuvieron por conjugación a través del agente espaciador anhídrido succínico como fue descrito en el ejemplo 1. El grupo inmunizado con HBsAg (grupo 9) se tomó como placebo.
La respuesta de anticuerpos se cuantificó por ensayo inmuno-enzimático (ELISA) para la determinación de IgG anti-péptido JY1 en suero. El análisis estadístico de los resultados se realizó por el test de Student: p<0.05 se consideró diferencia significativa y p<0.01 altamente significativa. Se demostró que con el uso de MAP conjugados al HBsAg (grupo 7 y 8) fue posible incrementar significativamente la respuesta inmune al péptido JY1 respecto a los MAPs sin conjugar y el polímero (grupos 1, 2 y 3), entre los MAPs y el polímero no se observó diferencias significativas y estos fueron superiores estadísticamente al péptido (grupo 4). La única variante que no difirió en cuanto a inmunogenicidad de los conjugados HBsAg-MAP fue la del péptido acoplado a dextrana (grupo 5) (Fig. 3B). Sin embargo, debe señalarse que la cantidad de proteína inoculada en el grupo del conjugado fue 4 veces menor. Este experimento demuestra que la potenciación de la respuesta inmune contra el epítopo JY1 después de la conjugación de los MAPs al HBsAg es altamente significativa respecto de los MAPs. Aunque los MAPs fueron creados para evitar la conjugación a proteínas portadoras, no obstante, luego de la conjugación de los mismos a estas últimas la respuesta inmune se potencia a niveles muy elevados con 4 veces menos cantidad de proteína total inoculada. Este experimento permite concluir que la mejor variante, dentro de las ensayadas, es la conjugación de los MAPs a una proteína portadora (en este caso HBsAg). Ejemplo 7. Estudio de reactividad cruzada para las diferentes formas de presentación de péptidos sintéticos al sistema inmune.
Con el objetivo de evaluar la reactividad cruzada de diferentes formas de presentación del epítopo JY1, se tomaron mezclas de sueros correspondientes a diferentes esquemas de inmunización, se igualaron en títulos anti-péptido JY1 (aproximadamente 1/105) y se evaluó su reactividad frente a un panel de 5 péptidos V3 correspondientes a diferentes aislamientos del VIH-1. En todos los esquemas de inmunización comparados se inocularon ratones Balb/c hembras por vía subcutánea en grupos de 10 en un volumen final de 100 μL. El esquema de inmunización fue de: 0, 14, 28, 56, 99 días desangrándose a los ratones 10 días después de la última dosis. En todos los esquemas no se completaron las cinco inoculaciones. Los datos correspondientes a cada grupo aparecen en la tabla 3. Los grupos que tienen igual número de esquema de inmunización pertenecen al mismo esquema.
De este experimento se evidenció que la reactividad cruzada está asociada a la estructura del péptido V3 ya que en mayor o menor grado existe para todas las formas en que se presenta el epítopo B (JY1 ), pero su intensidad depende de la forma en que es presentado el mismo al sistema inmune (grupos 2, 3, 8 y 9). Además, se demuestra que la reactividad cruzada inducida puede llegar a ser incluso superior a la respuesta generada con un inmunógeno que presenta todos los péptidos analizados en el estudio (grupos 1, 2, 3, 8 y 9) (Fig. 4B). Cuando se compara la reactividad cruzada entre los grupos inmunizados con MAP4 (TT-JY1) y MAP8 (TT-JY1) con los grupos HBsAg- MAP8 (TT-JY1) y HBsAg-MAP4 (TT-JY1), se encuentran niveles semejantes. Sin embargo, es importante notar que los grupos inmunizados con los conjugados recibieron una menor cantidad de proteína y a su vez tienen una inoculación menos que los grupos inmunizados con MAPs. El análisis de la reactividad cruzada de los MAPs con solo cuatro dosis (ejemplo 4) evidenció una reactividad cruzada mucho menor, evidenciándose la potenciación de la reactividad cruzada luego de la conjugación.. Por tanto, este experimento corrobora el resultado obtenido en el ejemplo 4. Ejemplo 8. Evaluación inmunológica de nuevos conjugados de dendrímeros con HBsAg. Análisis del reconocimiento de los sueros frente a un panel de péptidos V3. Con el objetivo de evaluar las interacciones entre diferentes conjugados previendo el uso de una multiplicidad de este tipo de estructura en las vacunas que describimos y con el objetivo de demostrar la actividad potenciadora sobre la inmunogenicidad y la reactividad cruzada de la mezcla de conjugados MAP-HBsAg por vía subcutánea, se ensayaron los siguientes grupos de inmunización: 1 , HBsAg-MAP4 (péptido consenso de V3); 2, HBsAg-MAP4 (CD4); 3, Mezcla de los conjugados HBsAg-MAP4 (péptido consenso) y HBsAg-MAP4 (CD4); 4, HBsAg-MAP4 (péptido librería de V3); 5, Mezcla de los conjugados HBsAg-MAP4 (péptido librería de V3) y HBsAg-MAP4 (CD4). La secuencia de los péptidos aparece resumido en la tabla 5. Se inmunizaron ratones Balb/c hembras por vía subcutánea en grupos de 10 en un volumen final de 100 μL. Las dosis fueron de 10 μg para los grupos 1 , 2 y 4; los grupos 3 y 5 se inmunizaron con 5 μg de cada conjugado en la mezcla. El esquema de inmunización fue: 0, 14, 28, 56, 84 días, desangrándose los ratones 10 días después de la última dosis. Un resumen del esquema de inmunización se presenta en la tabla 4.
Se evaluó la reactividad cruzada frente a un panel de 50 péptidos V3 sintetizados sobre membrana de celulosa correspondientes a diferentes aislamientos del VIH-1. Además, se evaluó la reactividad cruzada por ELISA frente a los 5 péptidos V3 mencionados en el ejemplo de la figura 1. Siempre se usaron las mezclas de sueros de cada grupo diluidas 1/100.
La respuesta de anticuerpos se cuantificó por ensayo inmuno-enzimático (ELISA) para la determinación de IgG anti-péptidos consenso de V3, CD4 y librería de V3 en suero. El análisis estadístico de los resultados se realizó por el test de Student: p<0.05 se consideró diferencia significativa y p<0.01 altamente significativa. En el caso de los grupos HBsAg-MAP4 (librería) y HBsAg-MAP4 (consenso) se observa una respuesta de anticuerpos muy débil contra péptidos homólogos aún después de cinco dosis (tabla 6). Es notable que la mezcla de los sueros de los animales inmunizados con MAP librería no reconoce ningún péptido V3 de los ensayados en el estudio de la reactividad cruzada, ni siquiera fue capaz de reconocer al MAP homólogo, ni al péptido consenso conjugado a BSA. Sin embargo, en el grupo inmunizado con la mezcla de conjugados conteniendo los MAPs para CD4 y librería aparecen altas reactividades para el péptido consenso así como para el MAP librería lo cual no puede atribuírsele al MAP CD4 puesto que en el grupo inmunizado con este no aparece ninguna reactividad contra alguno de estos antígenos. Del último resultado se puede concluir que existió un efecto sinérgico en la mezcla de los conjugados que resultó en una potenciación muy elevada de las respuestas humorales anti consenso y anti librería. O sea, el MAP CD4 tiene un efecto inmunopotenciador apreciable sobre la respuesta anti V3 que se manifiesta muy potente usando dosis de inmunógenos 2 veces menor en la mezcla respecto a los conjugados inoculados individualmente. El mismo efecto sinérgico se observa en el grupo de la mezcla CD4 y consenso. En este experimento se demostró que en los ratones inmunizados con las mezclas de los conjugados (grupos 3 y 5) se obtuvo una respuesta hacia ambos epítopos B incluidos en la formulación (tabla 6). Estos conjugados fueron preparados de forma independiente y luego mezclados en la formulación para evitar la dificultad de las proporciones de uno con respecto al otro. Esto se reflejó en las tres mezclas utilizadas donde se obtuvieron niveles de respuesta anti-péptido similares para cada péptido. La respuesta anti péptido consenso y anti librería fue significativamente superior cuando ambos se inmunizaron en la mezcla con el péptido CD4 con respecto a la respuesta contra ellos mismos inmunizados como conjugados individuales. La respuesta anti consenso se incrementó y la respuesta anti librería apareció a un alto nivel como se aprecia en la figura 5b (gráficos 1 y 2). No obstante que en la mezcla se inoculó la mitad de la dosis que se administra con los conjugados individuales. Este resultado evidencia que es posible potenciar la respuesta anti V3 con la formulación de mezclas conteniendo al péptido CD4 conjugado (Figura 5, Gráficos 1 y 2). El incremento en la reactividad cruzada se evidenció por ELISA anti péptidos del V3. Se tomaron los péptidos presentes en la proteína TAB9, previamente descritos en la figura 1 y se evaluaron los sueros de este esquema. Con respecto a la interacción entre los péptidos consenso y CD4 se observó que la mezcla generó altos títulos de respuesta por reactividad cruzada propia del CD4 y por la reactividad normal del consenso incrementada por el efecto potenciador de la adición del conjugado HBsAg- MAP4 (CD4). Además las mezclas de los sueros de los grupos 3 y 5 después de cuarta y quinta dosis fueron analizadas frente a un panel de 50 péptidos V3. En el caso del grupo 5 (mezcla CD4 y librería) se reconocen luego de cuatro dosis el 26% (13/50) de los péptidos ensayados, llegando hasta un 30% (15/50) después de 5 dosis. En cuarta dosis un 53% (7/13) de los péptidos reconocidos tuvieron una elevada reactividad y luego de 5 dosis un 46% (7/15) de estos.
Para el caso de la mezcla del grupo 3 (mezcla CD4 y consenso) cuando fue analizada frente al mismo panel de péptidos se obtuvo un reconocimiento del 72% (36/50) luego de cuatro dosis y un 92% (46/50) después de cinco dosis. El 50% (18/36) de los péptidos reconocidos luego de cuatro dosis tuvieron una alta reactividad y luego de 5 dosis fue del 48% (22/46).
De este experimento podemos concluir que con la mezcla HBsAg-MAP4 (consenso) y HBsAg-MAP4 (CD4) se obtuvo un mayor espectro de reconocimiento que en el caso de la librería. Como el péptido consenso se generó a partir de la selección de los aminoácidos más frecuentes para cada posición dentro del conjunto del panel de péptidos ensayados y la librería a su vez también fue generada a partir del mismo panel podemos concluir que la estrategia más aceptada para generar el mayor espectro de reconocimiento consiste en la inmunización de un MAP conteniendo el péptido consenso conjugado a una proteína y mezclado con otro conjugado que ejerce un efecto sinérgico.
Ejemplo 9. Comparación de la respuesta inmunológica del péptido V3 (JY1) en forma lineal y de MAP, acoplado a diferentes proteínas portadoras. Con el objetivo de estudiar el efecto de la conjugación de la estructura dendrimérica (en este caso MAP) a diferentes proteínas portadoras sobre la inmunogenicidad y la reactividad cruzada, el péptido JY1 en forma lineal y de estructura dendrimérica MAP se acopló a diferentes proteínas portadoras (HBsAg, KLH y P64k). La conjugación del péptido y el MAP a los diferentes portadores se efectuó por el método del anhídrido succínico en los grupos del 5 al 9. El grupo 10 fue un control de conjugado HBsAg-MAP utilizando MPS como agente espaciador. Se inocularon 9 grupos de 8 ratones Balb/c hembras por vía subcutánea. El esquema de inmunización fue de 0-14-28-56 días y se desangró a los ratones 10 días después de la última dosis. Los grupos inmunizados, las dosis y los adyuvantes utilizados se presentan en la tabla 8.
La respuesta de anticuerpos se cuantificó por ensayo inmuno-enzimático (ELISA) para la determinación de IgG anti-péptido JY1 en suero. La reactividad cruzada también fue evaluada por ELISA empleando un panel de péptidos descritos en el ejemplo 5, además se utilizó como control un péptido no relacionado.
El análisis estadístico de los resultados se realizó por el test de Student: p<0.05 se consideró diferencia significativa y p<0.01 altamente significativa. La respuesta de anticuerpos de los conjugados de proteínas-MAP fue en todos los casos superior a la respuesta inmunológica de los conjugados de péptido-proteína (Fig. 6B). La respuesta del conjugado HBsAg-MAP8 (TT-JY1 ) fue similar a la respuesta de la KLH-MAP8 (TT-JY1) y estas a la vez fueron superiores estadísticamente a la obtenida con el conjugado P64k-MAP8 (TT-JY1). Por otra parte, la respuesta de anticuerpos obtenida por los conjugados de MAPs a proteínas portadoras fue significativamente superior (p<0.05) a la del MAP8 JY1 per se excepto para el caso del conjugado de P64k-MAP8 (TT-JY1) aunque es importante señalar que se inoculó una masa total inferior. Estos resultados demuestran que el empleo de los conjugados de estructuras dendriméricas a proteínas portadoras optimiza la cantidad total de inmunógeno a utilizar. Se observó reactividad cruzada inmunizando con todos los conjugados contra más de dos péptidos V3 heterólogos como mínimo y fue en aumento de tercera a cuarta dosis (Fig. 6C). Además se pudo evidenciar que la reactividad cruzada fue significativamente superior en las variantes en que los dendrímeros (MAPs) se acoplan a los conjugados con respecto a los MAPs sin acoplar y a los conjugados de péptidos (Fig. 6C). Ejemplo 10. Determinación de la inmunogenicidad y reactividad cruzada de los sueros generados por estructuras dendriméricas del péptido del lazo V3 del aislamiento RF. Con el objetivo de demostrar que el efecto de potenciación de la inmunogenicidad y de la reactividad cruzada encontrada es independiente de la secuencia del péptido V3 usada, se determinaron ambas en los sueros generados por estructuras dendriméricas de otro péptido del lazo V3 -diferente al JY1-. Se tomó al péptido del aislamiento RF, cuya secuencia se corresponde con la descrita en la tabla 1 de la figura 1. El esquema de inmunización se realizó en ratones Balb/c hembras de 8 a 10 semanas de edad y tuvo inoculaciones los días 0, 14 y 28, las extracciones se realizaron preinmune y luego de tercera dosis. Los antígenos inoculados fueron el MAP8 (TT-RF), obtenido de acuerdo a lo descrito por James Tam et al. 1988 y la estructura dendrimérica obtenida cuando se conjugó este MAP al HBsAg empleando el método del anhídrido succínico como fue descrito previamente en el ejemplo 1. Las dosis empleadas fueron de 40 y 10 μg respectivamente.
Como se puede observar en la figura 7, la estructura dendrimérica acoplada al HBsAg como el MAP, generaron reactividad cruzada, y luego del análisis estadístico se demostró que se incrementaron significativamente la inmunogenicidad y la reactividad cruzada de los sueros obtenidos inmunizando con el conjugado dendrimérico HBsAg- MAP8 (TT-RF).
Ejemplo 11. Análisis inmunológico de diferentes MAPs conjugados a proteínas portadoras.
Con el objetivo de estudiar el efecto de la potenciación de la inmunogenicidad de diferentes MAPs unidos covalentemente a proteínas portadoras, se realizó la síntesis de diferentes MAPs en forma tetramérica y el péptido correspondiente. El MAP4-(NM) y el péptido-(NM) contienen un epítopo derivado del lazo 4 de la proteína de membrana externa P1.15 de la cepa B385 de Neisseria meningitidis (HYTRQNNADVFVPAVVG). El MAP4-(D) y el péptido-D contienen un epítopo derivado de la proteína pre-M/M del virus Dengue-2 (LTTRNGEPHMIVSRQEKGKSLLFKTGDGVG). Estos fueron sintetizados según fue descrito por James Tam et al.1988. El MAP4-(NM) y el péptido- NM fueron conjugados a las proteínas portadoras KLH y P64k empleando el método específico del éster de ácido β-maleimidopropionico-N-hidroxisuccinimida (MPS). La reacción de conjugación se llevó a cabo derivatizando cada una de las proteínas con exceso de este espaciador en tampón fosfato 50 mmol/L en DMF a pH 6 durante 30 min. Posteriormente, las proteínas derivatizadas fueron dializadas con el fin de eliminar el exceso de MPS. Al MAP4-(NM) y el péptido-NM se le añadió durante la síntesis en su extremo C-terminal una cisteína que contiene el grupo -SH. Las proteínas derivatizadas con la función maleimida reaccionaron espontáneamente con los tioles libres de cada uno de estos MAPs respectivamente durante 3 h a TA. La purificación de estos conjugados se realizó de forma similar a los de los ejemplos anteriores. En el caso del MAP4-(D) y el péptido-D fueron conjugados a las proteínas KLH y P64k utilizando el método directo de la carbodiimida soluble. El MAP4-(D) y el péptido-D contienen en el extremo C-terminal de su secuencia un grupo carboxilo, que permite la unión directa a los grupos aminos de las proteínas portadoras (KLH y P64k). Para evaluar la inmunogenicidad de los diferentes MAPs conjugados a las proteínas KLH y P64k, por vía subcutánea, se inocularon 12 grupos de 8 ratones Balb/c hembras. El esquema de inmunización fue de 0-14-28 días y se desangró a los ratones 10 días después de la última dosis. Los grupos inmunizados, las dosis y los adyuvantes utilizados se presentan en la tabla 8.
La respuesta de anticuerpos se cuantificó por ensayo inmuno-enzimático (ELISA) para la determinación de IgG anti-péptido en suero. El análisis estadístico de los resultados se realizó por el test de Student: p<0.05 se consideró diferencia significativa y p<0.01 altamente significativa.
Como se puede observar en la figura 8B. Los mayores títulos correspondieron a los conjugados de KLH-MAP4-(D) y P64k-MAP4-(D). En todos los casos los títulos de los conjugados de proteínas-MAPs fueron significativamente superiores a los conjugados de proteínas-péptidos. Para estos últimos, se obtuvieron títulos similares a los correspondientes MAPs. De este experimento se puede concluir que la conjugación de moléculas dendriméricas conteniendo secuencias de patógenos diferentes a proteínas portadoras permite un incremento significativo de la inmunogenicidad. Ejemplo 12. Estudio de inmunización nasal utilizando dendrímeros conjugados. Con el objetivo de demostrar la generación de respuestas de anticuerpos con alta reactividad cruzada luego de inmunizaciones nasales, un grupos de 8 ratones de 10 a 12 semanas fue inoculado con 10 g de HBsAg acoplado al MAP8 (TT -JY1), como control se utilizó un grupo de 8 ratones a los que se le administraron 40 g del MAP8 (TT-JY ), la respuesta de anticuerpos contra ambos inmunógenos se evaluó por ELISA para la determinación de IgG anti JY1 y se realizó el análisis de la reactividad cruzada contra un panel de 5 péptidos V3. El grupo control no generó respuesta detectable anti JY1 , en cambio, el grupo inmunizado con el conjugado HBsAg-MAP8 (TT-JY1 ), generó fuertes respuestas contra el péptido homólogo y en el 100% de los casos, se pudo encontrar reactividad cruzada contra los péptidos heterólogos. Este resultado evidenció el papel crítico de la conjugación para la obtención de respuestas contra el dendrímero, además de que demostró la generación de una fuerte reactividad cruzada contra diferentes péptidos V3 por vía mucosal.
Otros dendrímeros que tuvieron idéntico resultado fueron los preparados de acuerdo al ejemplo 2, utilizando como elementos portadores a los antígenos de nucleocápsida de los virus de Hepatitis B, de Hepatitis C y de Dengue Virus.
Asimismo utilizando como la parte sintética de la estructura dendrimérica a péptidos de la hormona liberadora de la gonadotropina sobre los antígenos anteriormente mencionados, se pudo comprobar una reducción en el tamaño de las gónadas significativamente respecto al control de los péptidos solos y de los ratones sin inmunizar.
Ejemplo 13. Análisis de la neutralización cruzada a diferentes aislamientos del HIV-1 de sueros con reactividad cruzada. Con el objetivo de evaluar la neutralización cruzada de sueros que reconocen a diferentes péptidos del lazo V3 de la gp 120 del HIV-1 , se realizó un ensayo in vitro usando diferentes aislamientos de laboratorio del HIV-1 (MN, RF, IIIB y un asilamiento similar a JY1). Para esto se tomaron pooles de los sueros de aquellos grupos cuyos inmunógenos tuvieron mayor capacidad de reactividad cruzada: HBsAg-MAP8 (TT- JY1) (ejemplo 4), HBsAg-MAP8 (TT-RF) (ejemplo 10) y la mezcla HBsAg-MAP4 (CD4) con HBsAg-MAP4 (consenso) (ejemplo 8).
Estos estudios mostraron que dentro de la respuesta de anticuerpos inducida por cada inmunógeno hay capacidad para ejercer un efecto neutralizante sobre aislamientos heterólogos.
Se demostró que los sueros de ratones inmunizados con conjugados dendriméricos conteniendo un epítopo de un solo aislamiento fueron capaces de generar neutralización cruzada frente a diferentes aislamientos del HIV-1 mencionados más arriba. Se evidenció además que los sueros de ratones inmunizados con la mezcla HBsAg-MAP4 (CD4) con HBsAg-MAP4 (consenso) tuvieron un alto nivel de neutralización cruzada. Ejemplo 14. Síntesis de estructuras dendriméricas empleando diferentes núcleos.
Con el objetivo de incrementar la amplificación de los epítopos B por unidad molecular. Se realizó la síntesis indirecta la cual consiste en sintetizar el núcleo y los péptidos de forma separada. Este sistema evita los errores inherentes en la síntesis de secuencias largas y permite una mayor incorporación de epítopos B o T dentro de una misma matriz adecuadamente funcionalizada.
La síntesis del núcleo dendrimérico se llevo a cabo por reacción de los grupos aminos del 1, 6 diaminohexano con los grupos carboxilos del aminoácido Boc-Lys (Boc)-OH empleando diciclohexilcabodiimida (DCC) como activador. Luego, se realizó la desprotección con trifluoroácetico (TFA) al 37% en diclorometano (DCM), obteniéndose un núcleo con 4 extremos reactivos para producir una estructura dendrimérica tetravalente, después hay un segundo y un tercer nivel de acoplamiento de Boc-Lys (Boc)-OH, empleando el mismo ciclo de reacciones para obtener un núcleo que contiene 16 grupos amino reactivos. Posteriormente, se ponen a reaccionar estos grupos aminos con el grupo carboxilo del anhídrido del ácido bromo acético. El núcleo es purificado por RP-HPLC empleando una columna C8. El péptido JY1 fue sintetizado previamente conteniendo una cisteína en el extremo C-terminal el cual se pone a reaccionar en proporciones adecuadas con el núcleo obtenido. La formación del tioéter debido a la interacción entre el grupo heteroátomo del núcleo y el grupo tiol de la cisteína del péptido se llevo a cabo en condiciones básicas (pH, 8-9) (Fig.9). El grado de incorporación fue determinado por SDS-PAGE y filtración por gel. Se obtuvieron moléculas dendriméricas entre 40 y 50 kD. Esta estructura dendrimérica fue acoplada a diferentes proteínas portadoras utilizando los espaciadores anteriormente descritos en el ejemplo 2. Las estructuras antigénicas obtenidas fueron utilizadas en diferentes esquemas de inmunización donde fue demostrada la superioridad inmunológica de estas.
Este sistema ofrece diversas ventajas; varios péptidos antigénicos B o T preparados separadamente pueden ser incorporados dentro de una única matriz adecuadamente funcionalizada (4-6H), los péptidos antigénicos pueden ser conjugados por el C o N- terminal según las características del epítopo del interés. Además, permitiendo la purificación de los determinantes individuales, evitando errores inherentes en la síntesis de secuencias largas. Breve descripción de las figuras.
Figura 1 :
A) Estudio de la inmunogenicidad después de tres y cuatro dosis. Grupos: 1 , MAP8
(TT-JY1) y 2, HBsAg-MAP8 (TT-JY1). Las dosis fueron de 50 y 10 μg respectivamente. B) Estudio de la reactividad cruzada. Después de tres y cuatro dosis. Se ensayaron pooles de sueros de ambos grupos a una dilución fija de 1/100. Se realizó un ELISA indirecto recubriendo con los diferentes péptidos V3 conjugados a BSA.
C) Tabla 1. Secuencias de aminoácidos de los péptidos V3 del VIH-1 ensayados.
Figura 2: A) Estudio del reconocimiento hacia varios péptidos V3 de las mezclas de sueros después de cuatro dosis. Grupos: 1 , MAP8 (TT-JY1 ); 2, TAB9. Las dosis fueron de 16,4 y 100 μg respectivamente.
Figura 3:
A) Tabla 2. Grupos inmunizados. B) Estudio comparativo de la inmunogenicidad de las diferentes formas de presentación del péptido JY1 al sistema inmune.
Figura 4:
A) Tabla 3. Resumen del esquema de inmunización.
B) Estudio de reconocimiento de los diferentes péptidos V3 de sueros obtenidos a partir de diferentes formas de presentación del péptido JY1 al sistema inmune.
Figura 5:
A) Tabla 4. Resumen del esquema de inmunización.
Tabla 5. Secuencias de aminoácidos de los péptidos CD4, consenso y composición de la librería del VIH-1 ensayados. Tabla 6. Resultados de inmunogenicidad después de cuatro y cinco dosis.
Gráfico 1. Estudio de la reactividad cruzada después de cinco dosis con los sueros de los grupos 2, 3 y 6 descritos en la tabla 3.
Gráfico 2. Estudio de la reactividad cruzada después de cinco dosis con los sueros de los grupos 4, 5 y 6 descritos en la tabla 3. C) Tabla 7. Estudio del reconocimiento frente a un panel de péptidos V3 sintetizados sobre soporte de celulosa. El patrón cualitativo refleja las intensidades relativas de las respuestas de los pooles de sueros de cuarta y quinta dosis. 1 y 2, mezcla (HBsAg-
MAP4 (librería), HBsAg-MAP4 (CD4)); 3 y 4, mezcla (HBsAg-MAP4 (consenso), HBsAg-MAP4 (CD4)); 5, HBsAg quinta dosis; 6, HBsAg-MAP4 (CD4) (quinta dosis). Cuatro intensidades de color representan la respuesta contra los péptidos. Blanco: respuesta negativa, gris claro: respuesta ligeramente positiva, gris oscuro: respuesta positiva, negro: respuesta muy positiva. D) Fotos correspondientes a los resultados presentados en la tabla 5. Fotos: 1 y 2, mezcla (HBsAg-MAP4 (librería), HBsAg-MAP4 (CD4)); 3 y 4, mezcla (HBsAg-MAP4 (consenso), HBsAg-MAP4 (CD4)); de cuarta y quinta dosis respectivamente. 5, HBsAg quinta dosis; 6, HBsAg-MAP4 (CD4) quinta dosis. Todos los sueros fueron ensayados a una dilución 1 : 100. Figura 6:
Tabla 8. Resumen del esquema de inmunización.
Determinación de la inmunogenicidad de los diferentes grupos luego de tres dosis. Gráfico 1. Estudio de la reactividad cruzada después de tres dosis con los sueros de los grupos 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 descritos en la tabla 3. Se ensayaron pooles de sueros de cada grupo a una dilución fija de 1/100. Se realizó un ELISA indirecto recubriendo con los diferentes péptidos V3 conjugados a BSA.
Gráfico 2. Estudio de la reactividad cruzada después de cuatro dosis con los sueros de los grupos 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 descritos en la tabla 3. Se ensayaron pooles de sueros de cada grupo a una dilución fija de 1/100. Se realizó un ELISA indirecto recubriendo con los diferentes péptidos V3 conjugados a BSA. Figura 7:
Estudio del reconocimiento hacia varios péptidos V3 de las mezclas de sueros después de tres dosis. Grupos: 1, MAP8 (TT-RF); 2, HBsAg-MAP8 (TT-RF). Las dosis fueron de 40 y 10 μg respectivamente. Figura 8:
A) Tabla 8. Resumen del esquema de inmunización.
B) Evaluación por ELISA de la inmunogenicidad después de tres dosis Figura 9:
Esquema de reacción para la obtención de péptidos dendriméricos y estructuras antigénicas

Claims

REIVINDICACIONES
1. Método de obtención de estructuras antigénicas que potencian la reactividad cruzada específica caracterizado por que comprende los siguientes pasos:
A) Selección del epítopo de interés;
B) Obtención de estructuras dendriméricas con los epítopos seleccionados en el paso (A) mediante un método de síntesis seleccionado dentro del grupo consistente en síntesis sobre un núcleo de usinas o ácido aspártico; síntesis sobre núcleos de moléculas orgánicas; síntesis sobre un núcleo dendrimérico; acoplamiento de péptidos sobre un núcleo dendrimérico; y mezclas sobre un mismo núcleo de epitopos de células B, de células T o de ambas;
C) Conjugación de una o varias de las estructuras dendriméricas obtenidas en el paso (B), a una o varias moléculas portadoras mediante un método de conjugación seleccionado dentro del grupo consistente en: conjugación utilizando glutaraldehído, anhídrido succínico, éster de ácido β-maleimidopropionico-N -hidroxisuccinimida (MPS) y un espaciador sin cadenas laterales aromáticas;
D) Mezcla de los conjugados obtenidos en el paso (C) para la obtención de las formulaciones mediante la adición del péptido del dominio de unión al CD4 o un conjugado que lo contenga; y
E) Adyuvar en alúmina u otro adyuvante apropiado.
2. Método de obtención de estructuras antigénicas según la reivindicación 1 , caracterizado porque los péptidos que forman parte de las estructuras obtenidas en el paso (B) se corresponden con regiones del Virus de Inmunodeficiencia Humana 1 ó 2.
3. Método de obtención de estructuras antigénicas según la reivindicación 2, caracterizado porque los péptidos que forman parte de las estructuras obtenidas en el paso (B) se corresponden con regiones variables del Virus de la Inmunodeficiencia Humana 1 ó 2.
4. Método de obtención de estructuras antigénicas según la reivindicación 3, caracterizado porque los péptidos que forman parte de las estructuras obtenidas en el paso (B) se corresponden con región variable V3 del Virus de la Inmunodeficiencia Humana 1 ó 2.
5. Método de obtención de estructuras antigénicas según la reivindicación 1 , caracterizado porque los péptidos que forman parte de las estructuras obtenidas en el paso (B) se corresponden con regiones del virus de la Hepatitis B.
6. Método de obtención de estructuras antigénicas según la reivindicación 1 , caracterizado porque los péptidos que forman parte de las estructuras obtenidas en el paso (B) se corresponden con regiones del virus de la Hepatitis C.
7. Método de obtención de estructuras antigénicas según la reivindicación 1 , caracterizado porque los péptidos que forman parte de las estructuras obtenidas en el paso (B) se corresponden con regiones de los Virus del Dengue.
8. Método de obtención de estructuras antigénicas según la reivindicación 1 , caracterizado porque los antígenos que forman parte de las estructuras obtenidas en el paso (B) se corresponden con regiones polisacarídicas de Neisseria meningitidis.
9. Método de obtención de estructuras antigénicas según la reivindicación 1 , caracterizado porque los péptidos que forman parte de las estructuras obtenidas en el paso (B) mimetizan regiones antigénicas polisacarídicas.
10. Método de obtención de estructuras antigénicas según la reivindicación 1, caracterizado porque los péptidos que forman parte de las estructuras obtenidas en el paso (B) se corresponden con regiones de un microorganismo o un patógeno.
11. Método de obtención de estructuras antigénicas según la reivindicación 1 , caracterizado porque los péptidos que forman parte de las estructuras obtenidas en el paso (B) se corresponden con regiones de antígenos propios o auto-antígenos.
12. Método de obtención de estructuras antigénicas según la reivindicación 11 , caracterizado porque los péptidos que forman parte de las estructuras obtenidas en el paso (B) se corresponden con regiones de la hormona liberadora de la gonadotropina.
13. Método de obtención de estructuras antigénicas según la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula portadora del paso (C) es el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B, HBsAg.
14. Método de obtención de estructuras antigénicas según la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula portadora del paso (C) es la proteína p64K de Neisseria meningitidis.
15. Método de obtención de estructuras antigénicas según la reivindicación 1 , caracterizado porque la molécula portadora del paso (C) es el antígeno de la nucleocápsida del HIV.
16. Método de obtención de estructuras antigénicas según la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula portadora del paso (C) es el antígeno de la nucleocápsida del virus de la Hepatitis B o O
17. Método de obtención de estructuras antigénicas según la reivindicación 1 , caracterizado porque la molécula portadora del paso (C) es de naturaleza polisacarídica.
18. Método de obtención de estructuras antigénicas según la reivindicación 1 , caracterizado porque la molécula portadora del paso (C) es una dextrana.
19. Método de obtención de estructuras antigénicas según la reivindicación 1 , caracterizado porque los componentes del paso (C) se conjugan covalentemente, se asocian por hidrofobicidad o electrostáticamente.
20. Estructura antigénica que potencia la reactividad cruzada específica caracterizada porque comprende epítopos antigénicos dendriméricos acoplados a moléculas portadoras.
21. Estructura antigénica según la reivindicación 20 caracterizada porque los epítopos de la región dendrimérica es de naturaleza peptídica u oligosacarídica.
22. Estructura antigénica según la reivindicación 20 caracterizada porque los epítopos de naturaleza peptídica son consensos peptídicos de regiones variables seleccionados por subtipos, subgrupos, serotipos u otra forma de asociación.
23. Estructura antigénica según la reivindicación 20 caracterizada porque los epítopos de naturaleza peptídica son bibliotecas de secuencias peptídicas del microorganismo seleccionado, o péptidos miméticos.
24. Estructura antigénica según la reivindicación 21 caracterizada porque los péptidos que forman parte de la región dendrimérica se corresponden con regiones del Virus de Inmunodeficiencia Humana 1 ó 2.
25. Estructura antigénica según la reivindicación 21 caracterizada porque los péptidos que forman parte de la región dendrimérica se corresponden con regiones variables del Virus de la Inmunodeficiencia Humana 1 ó 2.
26. Estructura antigénica según la reivindicación 21 caracterizada porque los péptidos que forman parte de la región dendrimérica se corresponden con la región variable V3 del Virus de la Inmunodeficiencia Humana 1 ó 2.
27. Estructura antigénica según la reivindicación 21 caracterizada porque los péptidos que forman parte de la región dendrimérica se corresponden con regiones del virus de la Hepatitis B.
28. Estructura antigénica según la reivindicación 21 caracterizada porque los péptidos que forman parte de la región dendrimérica se corresponden con regiones del virus de la Hepatitis O
29. Estructura antigénica según la reivindicación 21 caracterizada porque los péptidos que forman parte de la región dendrimérica se corresponden con regiones de los Virus del Dengue.
30. Estructura antigénica según la reivindicación 21 caracterizada porque los péptidos que forman parte de la región dendrimérica se corresponden con regiones polisacarídicas de Neisseria meningitidis.
31. Estructura antigénica según la reivindicación 21 caracterizada porque los péptidos que forman parte de la región dendrimérica mimetizan regiones antigénicas polisacarídicas o proteicas.
32. Estructura antigénica según la reivindicación 21 caracterizada porque los péptidos que forman parte de la región dendrimérica se corresponden con regiones de un microorganismo o un patógeno.
33. Estructura antigénica según la reivindicación 21 caracterizada porque los péptidos que forman parte de la región dendrimérica se corresponden con regiones de antígenos propios o auto-antígenos.
34. Estructura antigénica según la reivindicación 21 caracterizada porque los péptidos que forman parte de la región dendrimérica se corresponden con regiones de la hormona liberadora de la gonadotropina.
35. Estructura antigénica según la reivindicación 20 caracterizada porque la molécula portadora es el antígeno de superficie del virus de la Hepatitis B, HBsAg.
36. Estructura antigénica según la reivindicación 20 caracterizada porque la molécula portadora es la proteína p64K de Neisseria meningitidis.
37. Estructura antigénica según la reivindicación 20 caracterizada porque la molécula portadora es el antígeno de la nucleocápsida del HIV.
38. Estructura antigénica según la reivindicación 20 caracterizada porque la molécula portadora es el antígeno de la nucleocápsida del virus de la Hepatitis B.
39. Estructura antigénica según la reivindicación 20 caracterizada porque la molécula portadora es de naturaleza polisacarídica.
40. Estructura antigénica según la reivindicación 20 caracterizada porque la molécula portadora es una dextrana.
41. Uso de la estructura antigénica de las reivindicaciones 20 a 40 en un sistema de diagnóstico,
42. Uso de la estructura antigénica de las reivindicaciones 20 a 40 en vacunas profilácticas y terapéuticas.
43. Formulación vacunal que comprende la estructura antigénica de cualquiera de las reivindicaciones de la 20 a la 40, así como un adyuvante apropiado.
44. Formulación vacunal según la reivindicación 43 de aplicación sistémica o mucosal
45. Uso de las formulaciones vacunales de las reivindicaciones 43 y 44 para la prevención de enfermedades infecciosas, autoinmunes y cáncer.
46. Uso de las formulaciones vacunales de las reivindicaciones 43 y 44 para la terapia de enfermedades infecciosas, autoinmunes y cáncer.
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