EA005313B1 - Способ получения антигенных структур, усиливающих специфическую перекрестную реактивность - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к способу получения антигенных структур с высокой перекрестной реактивностью, способных усиливать иммунную реакцию на пептидные антигены, которые предназначены для системного введения и/или введения через слизистую оболочку, а также к химическим структурам, полученным данным способом, препаратам на основе указанных структур и их применению. Способ, описанный в настоящем изобретении, позволяет получить новые антигенные структуры, начиная с выбора и синтеза разветвленных структур, которые связывают с молекулами-носителями. Полученные структуры можно использовать вместе с приемлемыми адъювантами или в композиции различных антигенов. Может наблюдаться синергичное действие, усиливающее перекрестную реактивность и иммуногенность. Кроме того, указанные препараты могут содержать стабилизаторы и консерванты. Антигенные структуры по настоящему изобретению можно использовать в фармацевтической промышленности в виде вакцинных препаратов для профилактики или лечения заболеваний у человека и животного, а также для создания диагностических систем.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к одной из областей медицины, в частности к препаратам для вакцинации на основе новых антигенных структур, усиливающих перекрестную реактивность.

Предпосылки изобретения

Пептиды характеризуются плохой иммуногенностью, поэтому их необходимо связывать с белками-носителями, которые обеспечивают необходимую помощь Т-клеток для образования специфических антител (НсгппдЮп. И. А. е! а1., 1987, Ыа1иге 328:257-259). В процессе конъюгирования пептида с белком-носителем могут быть утрачены антигенные свойства вследствие неспецифического конъюгирования. Пептиды можно связывать с белком-носителем в главной части представляющего интерес эпитопа. Во избежание проблем, связанных с конъюгированием пептида, предложен другой способ представления пептида в иммунной системе. Например, мультиантигенный пептид (МАР) создан путем введения В- и Т-клеточного эпитопа в разветвленное ядро лизина (Тат, РР. е! а1., 1988, Ргос. ЫаЙ. Асаб. δοΐ. 86:5409-54132-5) (Тат, ЕР.,

1989, Ме!йобк ЕпхутоГ 168:7-15) (Тат, ЕР.,

1990, №0 90/11778) (Тат, ЕР., 1993, №0 93/03766). Главным преимуществом данной системы является ее структура и точно определенный состав, а также высокое соотношение представляющего интерес эпитопа в молекуле. Некоторые исследования по иммунологии подтверждают, что применение МАР является более эффективным, чем конъюгирование пептида (№апд, С.У. е! а1., 1991, Зстепсе 254:285-288). Указанный вывод не всегда является верным, так как в других исследованиях получен противоположный результат (К41еу, Е.М. е! а1., 1996, Уе!еттату 1ттипо1оду апб 1ттипора1йо1оду 55:243-253), причем такое противоречие может быть связано с белком-носителем.

Перекрестная реактивность и нейтрализация ранее были описаны для синтетического пептида (№апд, С.У. е! а1., 1991, 8с1епсе 254:285-288). Некоторые исследователи также отмечают, что антипептидные антитела против области У3 ВИЧ-1 вызывают перекрестную нейтрализацию разных полевых изолятов (№апд, С.У. е! а1., 1991, Заепсе, 254:285-288). Коротко говоря, перекрестная нейтрализация и реактивность связаны со структурой пептида. В качестве примера можно привести пептиды петли У3 ВИЧ-1.

Метод на основе МАР служит для стимуляции нейтрализующей реакции против У3 у человека (ОеоГГтеу, 1. е! а!., 1996, 1оитпа1 о! 1пГес!юик И1кеакек, 173:330-3398). Недостатком указанного метода является то, что для достижения эффекта нейтрализации необходимо инокулировать очень большое количество (500 мкг) МАР (Кайп, 1. е! а1., 1994, Теп111 1п!етпа!юпа1 СопГегепсе оп А1И8 Уокойата, 1арап 7-12

Аидик!, Уо1. 1) (Ь1, И. е! а1., 1997, 8е1/еб Рас 1 А11егду 1ттипо1. 15:105-13). Установлено, что при использовании смеси нескольких МАР на основании выбора другой области У3 для достижения широкого спектра нейтрализации клинических штаммов, необходимое общее количество МАР будет несовместимо с общепринятой практикой иммунизации.

Перекрестная реактивность определяется как способность иммуногена взаимодействовать с родственными лигандами (Раи1, Еипбатеп!а1 №. 1ттипо1од^, 4!й ебйюп). Несмотря на то, что явление перекрестной реактивности было известно уже в начале развития иммунологии, лишь некоторые вакцинные препараты получают на основе перекрестной реактивности. Это, по-видимому, объясняет, почему большинство вакцин, используемых в соответствии с программами иммунизации, не защищает от патогенных микроорганизмов с высокой вариабельностью в нескольких клинических изолятах.

Перекрестная реактивность гомологичных пептидов является свойством каждой последовательности. Данное свойство можно усилить в зависимости от форм представления пептида иммунной системе. Неочевидно, что усиление перекрестной реактивности происходит вместе с увеличением иммуногенности. Исследование Ти В-клеточного пептида показывает, что индукция антител с перекрестной реактивностью и/или нейтрализацией не находится в прямой зависимости от иммуногенности пептида (Какт1, К. С. е! а1., 1998, Мо1еси1аг 1ттипо1оду 35: 905-918).

Разработаны разные методы достижения иммунной реакции, способной распознавать большое число антигенных вариантов патогенного микроорганизма. Одним из таких методов является создание рекомбинантного многоэпитопного полипептида (МЕРг) для наиболее важных вариантов. Представление В-клеточного эпитопа в системе МЕРг не всегда дает хорошие результаты (Е1уии, ΕΝ. е! а1., 1997, 1. У1то1, 71:7586-92). С одной стороны, создание химерного полипептида продуцирует молекулу с непредсказуемой трехмерной структурой, которая не выявляет должным образом все эпитопы. Такая структура стимулирует реакцию на определенный эпитоп или полностью подавляет реакцию на другие эпитопы. С другой стороны, возникает непредсказуемое доминирование разных эпитопов. Другой метод предполагает создание пептидных библиотек в качестве иммуногена. Обычно создают пептидную библиотеку высоко вариабельных областей. Данная библиотека включает большое число пептидных последовательностей. Однако недостатком такой библиотеки является плохое представление каждого эпитопа. Он теряется среди большого количества разных последовательностей, что делает непредсказуемой иммунную реакцию на требуемом уровне (А11еп, И. е!. а1., 1998, 1. оГ

У1го1. 27:651-659) Цетоте, Ε. е! а1., 1994, Еиг. 1. 1ттипо1. 24:2789-2795).

Еще одним методом является создание консенсусного пептида, охватывающего широкий спектр последовательностей У3 в случае ВИЧ. Данный метод основан на исследовании вариабельности эпитопов в полевых или клинических изолятах с целью выявления каждого положения более консервативной аминокислоты во всех изолятах (Но11еу, Ь.И. е! а1., 1991, Ргос. Ν;·ι11. Асаб. 8с1. 88:6800-6804).

Описание изобретения

Целью данного изобретения является создание способа получения антигенных структур с высокой перекрестной реактивностью, способных усиливать иммуногенность пептидных антигенов, которые предназначены для системного введения и/или введения через слизистую оболочку. Данный способ предполагает создание разветвленных структур, конъюгированных с белками-носителями в требуемых соотношениях. Добавление аналогичных структур, несущих другой В-клеточный эпитоп, позволяет увеличить перекрестную реактивность. Это также способствует увеличению иммуногенности совместно вводимых антигенов. Указанный препарат может содержать другие антигены и адъюванты.

Поэтому одним из объектов настоящего изобретения является способ синтеза антигенных структур, усиливающих специфическую перекрестную реактивность.

Описанный выше способ включают нижеследующие стадии:

A) выбор представляющих интерес эпитопов;

B) получение разветвленных структур, содержащих эпитопы, выбранные на стадии (А), методом синтеза, который может представлять собой синтез на ядре лизина или аспарагиновой кислоты; синтез на ядре органических молекул; синтез на разветвленном ядре; связывание пептидов с разветвленным ядром;

или объединение на одном ядре Вклеточных эпитопов, Т-клеточных эпитопов или тех и других вместе;

C) конъюгирование одной или нескольких разветвленных структур, полученных на стадии (В), с одной или несколькими молекуламиносителями методом конъюгирования с использованием альдегида глутаровой кислоты, янтарного ангидрида, сложного эфира Ν-гидроксисукцинимида β-малеимидопропионовой кислоты (МР8) или спейсерного агента без ароматических боковых цепей, так как известно, что такие группы не распознают связанные разветвленные структуры;

И) объединение конъюгатов, полученных на стадии (С), для получения препарата с добавлением СИ4-связывающего пептида или конъюгата, имеющего эпитоп, усиливающий перекре стную реактивность и иммуногенность полученной антигенной структуры;

и наконец

Е) введение в квасцы или любой другой адъювант.

В способе по настоящему изобретению пептиды в структурах, полученных на стадии (В), могут представлять области ВИЧ-1 или ВИЧ-2, более предпочтительно вариабельные области подобные петле У3. Кроме того, можно использовать области с некоторой степенью вариабельностью из других вирусов, таких как вирус гепатита С, вирус гепатита В и вирус Денге.

Можно использовать другие антигены полисахаридных областей №155епа тешпдйтбЦ пептидомиметики полисахардных ангигенов или любую другую область микроорганизма или патогена.

Кроме того, при осуществлении способа по настоящему изобретению можно использовать области аутоантигенов или родственных антигенов для получения противораковой вакцины, например, области гонадотропинсекретирующего гормона.

К белкам-носителям, которые можно использовать в способе по настоящему изобретению, относятся поверхностный антиген вируса гепатита В (НВ 5Ад), белок р64К №155епа тептдйтбЦ ядерный антиген ВИЧ, ядерный антиген вируса гепатита В. Для аналогичных целей можно также использовать полисахаридные молекулы, подобные декстранам.

Способ по настоящему изобретению включает конъюгирование одной или нескольких разветвленных структур, полученных на стадии (В), с одной или несколькими молекулами-носителями путем ковалентного конъюгирования, электростатического или гидрофобного взаимодействия.

Другим объектом настоящего изобретения является антигенная структура, полученная описанным выше способом, которая усиливает специфическую перекрестную реактивность имеющихся эпитопов. Указанная структура содержит вышеописанные эпитопы в виде разветвленных антигенов, связанных к белкаминосителями, составляющими 1-30% конечной структуры.

Выбранные эпитопы могут иметь полисахаридную или пептидную природу. Пептиды могут быть консенсусными пептидами из вариабельных областей, выбираемых с учетом подтипов, подгрупп, серотипов или в соответствии с любой другой классификацией. Кроме того, указанные пептиды могут представлять пептидные библиотеки или миметические пептиды микроорганизма.

В частности, пептиды в разветвленных структурах могут представлять вариабельные области ВИЧ-1 или ВИЧ-2 в петле У3, а также области других вирусов, характеризующиеся некоторой вариабельностью и разнообразием, таких как вирусы гепатита В, гепатита С и вирус Денге.

Указанные структуры содержат антигены полисахаридных областей Йемена тепшдШбб. пептидомиметики для полисахаридных антигенов или любые области микроорганизма или патогена.

Кроме того, в антигенной структуре по настоящему изобретению могут быть использованы области аутоантигенов или родственных антигенов для создания противораковой вакцины, например, области гонадотропинсекретирующего гормона. К белкам-носителям, которые можно использовать в способе по настоящему изобретению, относятся поверхностный антиген вируса гепатита В (НВкАд), белок р64К Ыещкепа тешпдШбб. ядерный антиген ВИЧ, ядерный антиген вируса гепатита В. Для аналогичных целей можно также использовать полисахаридные молекулы, подобные декстранам.

Данное изобретение относится также к применению вышеописанных антигенных структур для создания диагностических систем, профилактических или лечебных вакцин против инфекционных, аутоиммунных или раковых заболеваний, предназначенных для системного введения.

В частности, для петли У3 продемонстрирована возможность значительного увеличения перекрестной реактивности и перекрестной нейтрализации в результате добавления конъюгатов, имеющих СИ4-связывающий пептид в той же структуре, созданной для повышения эффективности дающих перекрестную реакцию антител против пептидов вариабельных областей.

Добавление таких структур увеличивает перекрестную реактивность и иммуногенность совместно вводимых антигенов против У3. Данный способ действительно облегчает появление дающих перекрестную реакцию антител в методах вакцинации на их основе, при этом не исключена возможность его применения в других методах вакцинации просто для увеличения иммуногенности к гомологичному пептиду.

Данное изобретение относится к способу получения новых химических структур на основе дифференциального представления Вклеточных эпитопов из разных микроорганизмов в иммунной системе. Такая вариабельность может быть связана с патогенностью. Кроме того, можно использовать невариабельные Вклеточные эпитопы, способные вызывать защитную иммунную реакцию, подобные Вклеточным эпитопам из клеточных антигенов. Все они в разветвленных структурах на белкахносителях способны усиливать перекрестную реактивность и иммуногенность.

Предлагаемый способ позволяет нетрадиционным путем получить антигены, используемые для приготовления вакцины, с более высокой плотностью эпитопов, что увеличивает им муногенность и антипептидную перекрестную реактивность. Кроме того, данный способ позволяет уменьшить количество разветвленных структур, что увеличивает титры антител благодаря дифференциальному представлению помимо вышеописанных новых отличительных особенностей.

Важно отметить, что можно увеличить перекрестную реактивность пептидов из вариабельных областей, не влияя на их иммуногенность, как это показано в примерах.

С другой стороны, данный способ позволяет связывать разные разветвленные структуры с одним и тем же носителем. Аналогичным образом показано, что объединение структур по настоящему изобретению с подобными структурами, имеющими СИ4-связывающий пептид, увеличивают иммуногенность и перекрестную реактивность против У3.

Новая структура может включать разветвленную часть, имеющую только В-клеточные эпитопы, так как Т-клеточные эпитопы предоставляет носитель. Структуры МАР, используемые в качестве элементов вакцины, исключают применение носителя, поэтому Т-клеточные эпитопы структур по настоящему изобретению могут быть необязательно введены в синтетическую часть или в носитель. Подобная методика обеспечивает лучшее представление В-клеточных эпитопов, так как они не образуют компактных кластеров. Кроме того, используя разветвленные структуры, связанные с белкаминосителями, можно усилить перекрестную реактивность и/или иммуногенность при помощи меньшего количества иммуногена по сравнению с использованием только разветвленных структур (например, МАР).

И наконец, установлено, что комбинации указанных конъюгатов оказывают синергичное действие на иммуногенность и перекрестную реактивность.

Препарат по настоящему изобретению можно вводить через слизистую оболочку, что в настоящее время имеет очень важное значение для практического осуществления данного способа.

Примеры

Пример 1. Способ получения антигенных структур.

Способы синтеза пептидов, МАР и разветвленных структур описаны в научной литературе (Тат, 1.Р. е! а1., 1988, Ргос. №111. Асаб. 8с1. 86:5409-5413) (8 Као 1. е! а1. , 1995, 1. Ат. Сйет. 8ос. 117:3893-3899). Антигенные структуры получают, сшивая разветвленные структуры с белками-носителями. В качестве спейсерного агента используют янтарный ангидрид (8А). Это делает возможным ковалентное связывание двух антигенов при помощи аминогрупп. Белок-носитель активируют янтарным ангидридом на тампоне, пропитанном буфером с рН 8,5, в течение 30 мин. Оставшиеся реаген005313 ты удаляют диализом во избежание попадания перекрестносшивающего агента между молекулами разветвленной структуры (МАР) и пептидилирования. Конъюгирование выполняют, активируя карбоксильные группы белка реагентом Εί,ΌΙ (растворимый карбодиимид). Затем добавляют синтетический антиген. Конъюгированную структуру отделяют гель-фильтрацией. И наконец, полученные структуры исследуют методами ЕЙ18А и вестерн-блоттинга с использованием АсМ и сыворотки мышей.

Пример 2. Способ получения антигенных структур с использованием разных спейсерных агентов.

Антигенные структуры получают, используя разные спейсерные агенты. При получении конъюгированной структуры хорошего иммунологического качества желательно, чтобы связывание с белком производилось на достаточно большом расстоянии от остатков, имеющих важное значение для эпитопа. Во избежание указанного явления используют разные спейсерные агенты:

альдегид глутаровой кислоты, сложный эфир м-малеимидо-бензоил-Ы-гидроксисукцинимида (МВ 8), карбодиимиды, сложный эфир Ν-гидроксисукцинимида β-малеимидопропионовой кислоты (МР8), янтарный ангидрид и тому подобные. Во время иммунизации могут образовываться антитела против белковносителей и/или связующего агента. Хороший связующий агент не должен вызывать образования антител против себя.

Установлено, что гуморальный ответ на синтетические мультиантигенные пептиды (МАР) на основе У3, выделенных из изолята 1Υ1 ВИЧ-1 и конъюгированных с двумя разными белками-носителями с использованием сложного эфира м-малеимидобензоил-Ы-гидроксисукцинимида (МВ8), сложного эфира Νгидроксисукцинимида β-малеимидопропионовой кислоты (МР8) или янтарного ангидрида, имеет разную природу. Великолепная реакция против 1Υ1 при отсутствии сильной реакции в отношении связующего агента наблюдается при использовании в качестве спейсера янтарного ангидрида. В отличие от этого МВ8 не вызывает образования антител при сильной реакции в отношении связующего агента. Полученные результаты показывают, что не все спейсерные агенты, описанные в научной литературе, действуют одинаково, поэтому при получении антигенных структур указанного типа нельзя использовать все спейсерные агенты, известные в данной области.

Пример 3. Конструирование, синтез и конъюгирование новых разветвленных структур с НВкАд.

Новые разветвленные структуры синтезируют с учетом того, что ранее известные антигенные структуры (то есть конъюгаты МАР белок) вызывают высокие титры антител против представляющих интерес пептидов. Причем в данном случае не использован Тй-клеточный эпитоп, так как он предоставляется белкомносителем. Таким образом облегчается синтез таких структур, появляется возможность ввести более длинные В-клеточные эпитопы и избежать образования нежелательных трехмерных структур благодаря колинейности между В- и Тй-клеточными эпитопами. Разветвленные структуры индивидуально связывают с НВ к Ад, как это описано в примере 1. МАР синтезируют способом, описанным Дж. Тэмом и др. (1. Тат ей а1., 1988). Затем разветвленные структуры и конъюгаты разделяют хроматографией с гельфильтрацией и определяют концентрацию методом с использованием кумассии.

Пример 4. Исследование потенциирования иммунной реакции и усиления перекрестной реактивности.

Для исследования влияния конъюгирования МАР с белком-носителем на иммуногенность и перекрестную реактивность производят иммунизацию самок мышей Ва1й/е в возрасте 68 недель, распределенных в две группы по 10 особей в каждой, которым подкожно вводят испытуемый препарат в адъюванте РСА/Р1А. Первой группе вводят МАР8 (ΤΤ-1Υ1) и второй группе вводят НВкАд-МАР8 (ΤΤ-1Υ1). Дозы соответственно равны 50 и 10 мкг. Мышей иммунизируют в 0-14-28-40 день и берут у них пробы крови на 36-й и 51-й день. НВкАд-МАР8 (ΤΤ-1Υ1) получают, используя в качестве спейсера янтарный ангидрид, как это описано в примере 1. МАР8 (ΤΤ-1Υ1) имеет восемь копий Тклеточного эпитопа, аминокислоты 830-844 из столбнячного токсина (ТТ), и восемь копий Вклеточного эпитопа, содержащего 15 центральных аминокислот из области У3 др 120 штамма 1Υ1 ВИЧ-1 (Сти/, Ь.1. е! а1., 2000, 1оитпа1 οί Рерйбе 8с1епсе 6:217-224). После введения третьей и четвертой дозы исследуют гуморальный ответ на эпитоп 1Υ1 и других пептидов У3. Производят количественное определение 1дС в сыворотке при помощи непрямого анализа ЕЫ8А, используя пептиды, связанные с бычьим сывороточным альбумином (В8А) (Соте/, С.Е. е! а1., 1998, 1. νίτοί. Ме1йобк 71: 7-1618). Собранную сыворотку разводят в отношении 100^-1.

Статистические анализы выполняют в соответствии с критерием Стьюдента. Значения вероятности менее 0,05 считаются статистически значимыми и менее 0,01 считаются в высшей степени значимыми.

После введения третьей дозы не обнаружено различия в иммуногенности к гомологичному пептиду, хотя масса инокулированного конъюгата была в пять раз меньше.

Поэтому при использовании конъюгатов возможна большая экономия антигена, что является важным преимуществом (фиг. 1А). В группе мышей, иммунизированной НВ к Ад9

МАР8 (1Υ1-ΤΤ), имеет место перекрестная реактивность в отношении других пептидов У3 в отличие от мышей, инокулированных МАР8 (ΤΤ-1Υ1), у которых отсутствует перекрестная реактивность, несмотря на одинаковые уровни гуморальных ответов. После введения четырех доз НВкАд-МАР8 (ΤΤ-1Υ1) достигается более сильная реакция на эпитоп 1Υ1 по сравнению с МАР8 (ΤΤ-1Υ1). Некоторое количество дающих перекрестную реакцию антител образуется в группе, получавшей МАР8 (ΤΤ-1Υ1), но их количество весьма ограничено по сравнению с введением НВкАд-МАР8 (1Υ1-ΤΤ). Увеличение иммуногенности имеет очень важное значение, поскольку в научной литературе появились сообщения об использовании смесей МАР для выработки антител против нескольких эпитопов. Однако в некоторых случаях невозможно инокулировать человеку весь объем, необходимый для достижения требуемого действия (то есть нейтрализации и т.д.), из-за возникновения побочных эффектов. В конечном счете очень важно индуцировать интенсивный гуморальный ответ при использовании ограниченной массы антигена. Поэтому совершенно очевидно преимущество таких структур (то есть конъюгата МАР и белка-носителя), рассмотренных в данном описании изобретения. Принимая во внимание, что при использовании меньшего количества антигена может быть достигнута более широкая перекрестная реактивность, можно уменьшить количество разных эпитопов, используемых в сыворотке. И наконец, использование таких конъюгатов представляет один из подходов к созданию бивалентных вакцин, в которых носитель сам по себе является защитным иммуногеном подобно НВкАд.

Пример 5. Исследование гуморального ответа у мышей, иммунизированных МАР8 (ΤΤ1Υ1) и ТАВ9.

Для исследования различий, связанных с представлением эпитопа 1Υ1 в иммунной системе (Ι.8.), используют рекомбинантный белок ТАВ9 (Оиайе, С.А. е1 а1., 1994, АГО8 Век Нит Вейоупикек, 10:235-243), содержащий пептиды У3 из нескольких изолятов ВИЧ-1; БВ150, 1Υ1, ВР, МЫ, ВВУА и ΙΙΙΒ в указанном порядке. В данном эксперименте сравнивают указанный белок, состоящий из 15 аминокислот, включая центральную часть петли МАР, и МАР8 (ΤΤ1Υ1). Целью исследования является распознавание пептидов У3, входящих в состав ТАВ9, и определение различий путем картирования эпитопов с использованием А1а-замещенных пептидов, охватывающих всю последовательность 1Υ1. При наличии в последовательности остатка А1а его заменяют остатком О1у. Самок мышей Ва1Ь/е в возрасте 6-8 недель, распределенных в две группы по 10 особей в каждой, иммунизируют подкожной инъекцией испытуемого препарата в адъюванте СРА/1РА, содержащем 100 мкг белка ТАВ9 и 16,4 мкг МАР8 (ΤΤ-1Υ1).

Масса обоих иммуногенов включает одинаковое количество эпитопа 1Υ1. Мышей иммунизируют в 0, 14, 28, 56 день и берут пробы крови на 67-й день. Реакцию ЦС против 1Υ1 в сыворотке измеряют методом ЕЫ8А.

Статистический анализ выполняют в соответствии с критерием Стьюдента. Значения вероятности менее 0,05 считаются статистически значимыми и менее 0,01 считаются в высшей степени значимыми.

Для исследования перекрестной реактивности в отношении пептидов У3 измеряют уровень 1дС-реакции в сыворотке при помощи непрямого анализа ЕЫ8А, используя пептиды, связанные с В8А (Соте/, С.Е. е1 а1., 1998, 1. νίτοί. МеШобк, 71:7-1618). Собранную сыворотку разводят в отношении 100^-1.

Картирование эпитопов на целлюлозной мембране описано Рональдом Фрэнком (Етаик, В., 1992, 'ГеИ’аНебгоп 48:9217-9232).

Сыворотку, собранную у групп после введения четырех доз, тестируют в отношении нескольких пептидов ν3. Установлено, что мыши, иммунизированные МАР8 (ΤΤ-1Υ1), способны обнаружить четыре из пяти испытанных пептидов ν3 (ЕВ150, ВР, МЫ, ΒВVΑ). Из них три пептида (ВР, МЫ, ΒВVΑ) характеризуются величинами оптической плотности (А_{492 нм}) выше 1,25, что свидетельствует о сильной реактивности. В частности, для пептида ВР значение А492 нм выше 2,5. Полученные результаты подтверждают преимущество МАР для представления В-клеточных эпитопов иммунной системы. В случае белка ТАВ9, содержащего все пептиды, не опознаны два испытанных пептида (ВР и ΒВVΑ). Пептиды МЫ и III В обнаружены при очень низких значениях А492 нм менее 0,75. Только пептиды 1Υ1 и БВ150 опознаны при очень высоких значениях А_{492 нм}. Авторы данного изобретения пришли к выводу, что представление антигена иммунной системе при помощи МАР делает возможной перекрестную реактивность в отношении других пептидов ν3, не включенных в иммуноген. Благодаря этому можно оптимизировать количество антигенов, относящихся к совокупности гомологичных последовательностей. Результат, полученный для белка ТАВ9, показывает, что включение нескольких последовательностей в рекомбинантный белок не всегда является обоснованным техническим решением. На самом деле МАР8 (ΤΤ-1Υ1) вызывает лучшую реакцию.

Для выявления различий в представлении эпитопов иммунной системе выполняют картирование эпитопов, используя перекрывающиеся и А1а-замещенные пептиды из последовательности 1Υ1. Установлено, что сыворотка, собранная в обеих группах, распознает ту же аминокислотную последовательность БСОАБ-У. В группе, получавшей МАР8 (ΤΤ-1Υ1), во взаимодействии непосредственно участвует аминокислота Ь-Ρ-Υ. В отличие от этого в случае ТАВ9 взаи11 модействует в основном аминокислота ί-Ο-ίΥ. Незначительное отличие, включающее всего одну аминокислоту, по-видимому, является причиной разного распознавания испытанных пептидов У3. Можно предположить, что данный эпитоп находится в разных трехмерных структурах обоих иммуногенов.

В заключение следует отметить, что пептиды в белке ТАВ9 имеют другое представление в иммунной системе по сравнению с МАР. Данный эксперимент показывает, что такое разное представление определяет профили перекрестной реактивности в обоих иммуногенах.

Пример 6. Сравнение иммуногенности при разном представлении пептидов иммунной системе.

Для оценки иммуногенности нескольких вариантов представления пептидов в иммунной системе используют самок мышей Ва1Ь/с, распределенных в девять групп по 8 особей в каждой. Животных иммунизируют в 0-14-28 день и берут пробы крови через 10 дней после последней иммунизации. Все данные суммированы в таблице 2. МАР4 (ΤΤ-1Υ1) имеет четыре Вклеточных эпитопа (все 1Υ1) и четыре Тклеточных эпитопа (все ТТ_830-844). Пептид (ΤΤ1Υ1) имеет последовательно расположенные Вклеточные (1Υ1) и Т-клеточные (ТТ) эпитопы. Линейный полимер синтезируют полимеризацией от остатка Сук, добавленного с обеих сторон исходного пептида (Сгй/, ЬЛ. с1 а1., 2000, Вю1сс1шо1оща Арйсаба 17:35-38). Кроме того, пептид синтезируют на поверхности декстрановых гранул. НВкАд-пептид (ΤΤ-1Υ1), НВкАдМАР4 (ΤΤ-1Υ1) и НВкАд-МАР§ (ΤΤ-1Υ1) получают конъюгированием, используя янтарный ангидрид (А§) в качестве спейсера, как описано в примере 1. Группу мышей, которым вводят НВкАд (группа 9), используют в качестве контрольной группы. Реакцию 1дС против ΙΥ1 в сыворотке измеряют методом ЕЫ8А.

Статистические анализы выполняют в соответствии с критерием Стьюдента. Значения вероятности менее 0,05 считаются статистически значимыми и менее 0,01 считаются в высшей степени значимыми.

Установлено, что конъюгаты МАР-НВкАд (группы 7 и 8) вызывают значительно более сильный гуморальный ответ против эпитопа 1Υ1 по сравнению с МАР и полимером. Вышеуказанные группы характеризуются гораздо лучшими результатами по сравнению с группой, получавшей пептид (группа 4). Результаты, полученные для конъюгата декстран-пептид (группа 5) (фиг. 3В), не отличаются от результатов, полученных для конъюгатов НВкАд-МАР. Однако необходимо отметить, что масса инокулированных конъюгатов в четыре раза меньше. Данный эксперимент показывает, что конъюгирование МАР с НВкАд значительно увеличивает гуморальный ответ против эпитопа 1Υ1 по сравнению с МАР. Хотя МАР созданы, чтобы избежать конъюгирования пептидов с белкаминосителями, авторы данного изобретения показали, что в результате конъюгирования иммунный ответ превышает гуморальный ответ в четыре раза большей массы отдельно вводимого МАР. Можно сделать вывод о том, что конъюгаты МАР и белка-носителя (то есть НВ к Ад) являются наиболее эффективными из испытанных иммуногенов.

Пример 7. Исследование перекрестной реактивности, вызываемой разными способами представления синтетических пептидов иммунной системе.

Для определения уровня перекрестной реактивности, вызываемой разными способами представления пептида 1Υ1, собранную сыворотку, соответствующую разным схемам иммунизации, используют для получения примерно 10^-5 титра против 1Υ1 и сравнивают перекрестную реактивность полученных образцов с панелью из пяти пептидов У3 из разных изолятов ВИЧ-1. Во всех случаях самок мышей Ва1Ь/с, распределенных в группы по 10 особей в каждой, инокулируют при помощи подкожной инъекции объемом 100 мкл. Иммунизацию производят в 0, 14, 28, 56 и 99 день. У животных берут пробы крови через 10 дней после введения последней дозы. Не все группы инокулируют пять раз. Данные суммированы в табл. 3. Группы с одинаковой схемой введения исключают из одного эксперимента.

Результаты данного эксперимента показывают, что перекрестная реактивность является отличительной особенностью самого пептида У3 ΙΥ1, так как она имеет место в каждом испытанном варианте представления в иммунной системе (группы 2, 3, 8 и 9). Кроме того, такая перекрестная реактивность может быть выше, чем реакция, вызываемая иммуногеном, содержащим все испытанные пептиды (группы 1, 2, 3, 8 и 9) (фиг. 4В). Перекрестные реактивности МАР4 (ΤΤ-ΙΥ1), МАР8 (ΤΤ-1Υ1), НВкАд-МАР4 (ΤΤ-1Υ1) и НВкАд-МАР§ (ΤΤ-1Υ1) не являются различающимися. Однако важно отметить, что мыши, иммунизированные конъюгатами, получали меньшее количество белка; им были введены только четыре дозы вместо пяти доз, введенных мышам, инокулированным МАР. Анализ перекрестной реактивности для МАР после введения четырех доз (пример 4) свидетельствует о более низком уровне по сравнению с конъюгатами, действие которых усиливается после конъюгирования. Таким образом, данный эксперимент подтверждает результаты, полученные в примере 4.

Пример 8. Иммунологическая оценка новых конъюгатов разветвленная структураНВкАд. Распознавание в сыворотке с использованием панели пептидов У3.

Для оценки возможных взаимодействий между разными конъюгатами в вакцинном препарате и для демонстрации повышенной имму13 ногенности и перекрестной реактивности смесей конъюгатов выполняют эксперимент с использованием мышей.

Самок мышей Ва1Ь/с, распределенных в 10 групп по 10 особей в каждой, инокулируют 100 мкл вакцины при помощи подкожной инъекции. В зависимости от иммунизации группы распределяют следующим образом: 1, НВ8Лд-МЛР4 (консенсусный пептид из У3); 2, НВ8Лд-МЛР4 (СО4-связывающий пептид из др 120); 3, смесь конъюгатов НВ8Лд-МЛР4 (консенсусный пептид из У3) и НВ8Лд-МЛР4 (СИ4-связывающий пептид из др120); 4, НВ8Лд-МЛР4 (пептидная библиотека последовательностей У3); 5, смесь конъюгатов НВ8Лд-МЛР4 (пептидная библиотека последовательностей У3) и НВ8Лд-МЛР4 (СО4-связывающий пептид из др120). Пептидные последовательности суммированы в табл. 5. Мышам в группах 1, 2 и 4 вводят конъюгат в дозе 10 мкг; мышам в группах 3 и 5 вводят только 5 мкг конъюгата. Мышей иммунизируют в 0, 14, 28, 56 и 84 день. У мышей берут пробы крови через 10 дней после последней иммунизации. Данные суммированы в табл. 4.

Перекрестно реагирующие антитела исследуют при помощи панели, включающей 50 пептидов У3 из разных изолятов ВИЧ-1, синтезированных на целлюлозной мембране. Помимо этого, перекрестно реагирующие антитела определяют методом ЕЫ8Л в отношении пяти пептидов, ранее испытанных в примере, показанном на фиг. 1. Сыворотку, собранную в каждой группе, разводят в отношении 1/100.

Гуморальный ответ в сыворотке измеряют методом ЕЫ8Л, определяя анти-Ю реакцию на консенсусный пептид, СО4-связывающий пептид из др120 и пептидную библиотеку последовательностей У3.

Статистические анализы выполняют в соответствии с критерием Стьюдента. Значения вероятности менее 0,05 считаются статистически значимыми и менее 0,01 считаются в высшей степени значимыми.

После введения пяти доз гуморальный ответ на консенсусный пептид в группах, получавших НВ8Лд-МЛР4 (пептидная библиотека последовательностей У3) и НВ8Лд-МЛР4 (консенсусный пептид из У3), является очень слабым (таблица 6). Интересно отметить, что сыворотка, полученная у животных, иммунизированных НВ8Лд-МЛР4 (пептидная библиотека последовательностей У3), не взаимодействует с испытанными пептидами У3, а также с МАР4 (консенсусный пептид из У3) и консенсусным пептидом, связанным с В8Л. Однако в группе, инокулированной смесью НВ8Лд-МЛР4 (СИ4связывающий пептид из др120) и НВ8Лд-МЛР4 (пептидная библиотека последовательностей У3), происходит интенсивный гуморальный ответ против консенсусного пептида и МАР4 (пептидная библиотека последовательностей У3). Такие реакции не являются следствием поглощения, относящегося к СО4-связывающему пептиду, так как сыворотка, полученная у мышей, иммунизированных НВ8Лд-МЛР4 (СО4-связывающий пептид из др120), не взаимодействует с указанными пептидами. Таким образом, можно сделать вывод о том, что гуморальный ответ против консенсусного пептида и библиотеки У3 усиливается благодаря синергичному действию смеси конъюгатов. Затем, МАР4 (СИ4-связывающий пептид из др120) вызывает иммуноусиливающий эффект против У3 при использовании в два раза меньшей массы иммуногена в смеси по сравнению с отдельно инокулируемыми конъюгатами. Аналогичное синергичное действие имеет место в группе мышей, которым вводили НВ8Лд-МЛР4 (консенсусный пептид из У3) и НВ8Лд-МЛР4 (СИ4связывающий пептид из др120).

Данный эксперимент показывает, что у мышей, иммунизированных смесями конъюгатов (группы 3 и 5), индуцируются антитела против В-клеточных эпитопов, входящих в состав препарата (табл. 6). Указанные конъюгаты получают отдельно и затем смешивают в требуемых соотношениях. Поэтому три разных смеси конъюгатов характеризуются одинаковыми уровнями антипептидного гуморального ответа.

Гуморальный ответ против консенсусного пептида и пептидной библиотеки значительно выше при инокуляции НВ8Лд-МЛР4 (консенсусный пептид из У3) и НВ8Лд-МЛР4 (пептидная библиотека последовательностей У3) в смеси с СО4-связывающим пептидом из др120 по сравнению с иммунизацией отдельными препаратами. Анти-консенсусный ответ усиливает ответ против пептидной библиотеки достигает высокого уровня, показанного на фиг 5Ь (графики 1 и 2). Тем не менее, в смеси инокулирована половина дозы, необходимой для отдельных конъюгатов. Полученный результат свидетельствует о том, что можно усилить ответ против У3 в препаратах, содержащих МАР4 (СЭ4связывающий пептид из др120) (фиг. 5, графики 1 и 2).

На увеличение перекрестной реактивности указывают данные ЕЫ8Л для пептида У3. Сыворотку, полученную в данном эксперименте, испытывают при помощи панели пептидов У3 в белке ТАВ9, ранее показанной на фиг. 1. Что касается взаимодействия между консенсусным и СО4-связывающим пептидами, то установлено, что данная смесь образует высокие титры благодаря перекрестно реактивным антителам, индуцированными СО4-связывающим пептидом, и нормальной реактивности консенсусного пептида, увеличивающейся вследствие усиливающего действия НВ8Лд-МЛР4 (СИ4связывающий пептид из др120). Помимо этого, сыворотку, полученную в группах 3 и 5, анализируют после введения четвертой и пятой доз при помощи панели, включающей 50 пептидов У3. В группе 5 (смесь конъюгатов НВ8Лд-МЛР4 (пептидная библиотека последовательностей У3) и НВ§Ад-МАР4 (СИ4-связывающий пептид из др120)) после введения четырех доз опознано 26% (13/50) испытуемого пептида. Указанное значение увеличивается до 30% (15/50) после введения пяти доз. После введения четырех доз 53% (7/13) распознаваемых пептидов обладают очень высокой реактивностью, и после введения пяти доз указанный показатель снижается до 46% (7/15).

Смесь, вводимая группе 3, НВ§Ад-МАР4 (консенсусный пептид из У3) и НВ§Ад-МАР4 (СВ4-связывающий пептид из др120) после введения четырех доз взаимодействует с 72% (36/50) пептидов и после введения пяти доз взаимодействует с 92% (46/50) пептидов. После введения четырех доз 50% (18/36) распознаваемых пептидов характеризуются очень высокой реактивностью, и после введения пяти доз указанный показатель составляет 48% (22/46).

Можно сделать вывод о том, что смесь НВ§Ад-МАР4 (консенсусный пептид из У3) и НВ§Ад-МАР4 (СИ4-связывающий пептид из др120) вызывает более сильную перекрестную реактивность, чем аналогичная смесь с пептидной библиотекой. Поскольку консенсусный пептид создан в результате выбора часто встречающихся аминокислот в каждом положении на панели, включающей 50 пептидов, и библиотека получена на основании той же панели, авторы изобретения пришли к выводу, что лучшим способом вызвать образование дающих перекрестную реакцию антител является создание препарата, включающего смесь МАР консенсусного пептида, связанного с белком-носителем, и другой конъюгат, обладающий синергичным действием.

Пример 9. Сравнение иммунной реакции, вызываемой линейным пептидом У3 (1Υ1) и МАР, связанным с другими белкаминосителями.

Для исследования влияния конъюгирования разветвленных структур (в данном случае МАР) с другими белками-носителями на иммуногенность и перекрестную реактивность линейный пептид 1Υ1 и его структуру МАР связывают с другими белками-носителями (НВкАд, КЬН, Р64к).

Пептид и МАР связывают с другими белками-носителями, используемыми в группах 59, при помощи янтарного ангидрида. МАР, вводимый животным в группе 10, связывают с НВкАд, используя МР8 в качестве связующего агента.

Самок мышей Ва1Ь/с, распределенных в девять групп по 8 особей в каждой, инокулируют в 0-14-28-56 день и через 10 дней после последней инокуляции производят экстракцию. Группы иммунизированных животных, дозы и адъюванты приведены в табл. 8.

Гуморальный ответ измеряют методом ЕЫ8А. измеряя количество !дС против пептида

1Υ1 в сыворотке. Перекрестную реактивность также оценивают методом ЕЫ8А, используя панель пептидов аналогично примеру 5, и в качестве контрольного образца используют неродственный пептид.

При помощи Г-теста анализируют отклонения от однородности, используя ΐ-критерий Стьюдента. Значения р<0,05 считаются статистически значимыми и р<0,01 считаются в высшей степени значимыми.

Гуморальный ответ на конъюгат белокМАР во всех случаях превосходит результат, полученный при использовании конъюгата пептид-белки (фиг. 6В). Ответ против НВкАдМАР8 (ΤΤ-1Υ1) аналогичен ответу КЬН-МАР8 (ΤΤ-1Υ1), и в обоих случаях полученный результат превосходит ответ, полученный при использовании конъюгата Р64к-МАР8 (ΤΤ-1Υ1). С другой стороны, гуморальный ответ против конъюгатов МАР также является значительно более высоким (р<0,05) по сравнению с результатом, полученным при использовании одного МАР. Исключение представляет Р64к-МАР8 (ΤΤ-1Υ1), хотя очень важно отметить, что общее количество антигена в данном конъюгате является более низким. Полученные результаты показывают, что использование разветвленных структур, связанных с белками-носителями, оптимизирует общее количество используемого иммуногена и является вполне приемлемым для значительного усиления иммунной реакции.

Перекрестная реактивность наблюдается при иммунизации всеми конъюгатами по крайней мере против более чем двух гетерологичных пептидов У3 и возрастает после введения третьей и четвертой доз (фиг. 6С). Кроме того, результаты показывают, что перекрестная реактивность является более высокой для связанных МАР по сравнению с несвязанными пептидами (фиг. 6С).

Пример 10. Определение иммуногенности и перекрестной реактивности в сыворотке после иммунизации с использованием другого изолята У3 в разветвленных структурах.

Чтобы показать, что усиливающее действие, оказываемое на иммуногенность и перекрестную реактивность, не зависит от выбранной последовательности У3, иммуногенность и перекрестную реактивность измеряют после иммунизации разветвленными структурами другого пептида У3, соответствующего изоляту У3. Последовательность пептида КГ показана в таблице 1 на фиг. 1.

Самок мышей Ва1Ь/с в возрасте восьмидесяти недель инокулируют в 0, 14 и 28 день и производят экстракцию до иммунизации и после введения третьей дозы. Инокулируемыми антигенами являются МАР8 (ΤΤ-КГ) и разветвленная структура, полученная в результате связывания МАР на основе КГ с НВкАд, при использовании в качестве связующего агента янтарного ангидрида, описанного выше в примере

1. Используемые дозы соответственно равны 40 и 10 мкг.

Как хорошо показано на фиг. 7, разветвленная структура, связанная с НВкЛд, и МАР значительно увеличивают уровни перекрестной реактивности, и результаты статистического анализа свидетельствуют о существенном увеличении иммуногенности и перекрестной реактивности в сыворотке группы мышей, иммунизированных разветвленным конъюгатом НВкАдМАР8 (ТТ-КЕ).

Пример 11. Иммунологический анализ разных МАР, конъюгированных с белкаминосителями.

Для исследования эффекта потенциирования иммуногенности разных МАР, ковалентно связанных с белками-носителями, синтезируют четырехмерные МАР и соответствующий линейный пептид. МАР4-(ИМ) и пептид ΜΝ содержат эпитоп из петли 4, полученный из ОМР Р1.15, штамм В385 №188епа тешидШбщ (НУТКОЧМАИУЕУРАУУС). МАР4-(И) и пептид И содержат эпитоп, полученный из раннего/ позднего белка вируса Денге 2 (ИТТ^СЕРН М1У8КОЕКСК8ЕЕ ЕКТСИСУС).

ΜАР4-(NΜ) и пептид ΜN конъюгируют с белками-носителями КЕН и Р64к, используя в качестве связующего агента сложный эфир Νгидроксисукцинимида β-малеимидопропионовой кислоты (МР8). Реакцию конъюгирования осуществляют дериватизацией белков, с избытком спейсерного агента в фосфатном буфере объемом 50 ммоль/л ДМФ при рН 6 в течение 30 мин. Избыток МР8 удаляют диализом. В процессе синтеза МАР4-^М) и пептида ΜN к С-концу добавляют цистеин с образованием группы -8Н. Производные белки, полученные при взаимодействии с имидом малеиновой кислоты, произвольно взаимодействуют со свободными тиоловыми группами в соответствующих пептидах и МАР в течение 3 ч при комнатной температуре. Полученные конъюгаты очищают хроматографией с гель-фильтрацией.

МАР4-(И) и пептид И конъюгируют с белками КЕН и Р64к прямым способом с использованием растворимого карбодиимида. МАР4-(И) и пептид И содержат карбоксильную группу в С-конце, позволяющую осуществлять прямое связывание с аминогруппами белков-носителей (КЕН и Р64к).

Для оценки иммуногенности разных конъюгированных МАР самок мышей Ва1Ь/е, распределенных в двенадцать групп по 8 особей в каждой, иммунизируют при помощи подкожной инъекции. Инокуляцию производят в 0-1428 день. У мышей берут пробы крови через 10 дней после последней инокуляции. Группы иммунизированных животных, дозы и адъюванты указаны в табл. 8.

Гуморальный ответ измеряют методом ЕЬ18А, измеряя общее количество 1дС против соответствующего пептида в сыворотке.

При помощи Е-теста анализируют отклонения от однородности, используя 1-критерий Стьюдента. Значения р<0,05 считаются статистически значимыми и р<0,01 считаются в высшей степени значимыми.

Как показано на фиг. 8В, более высокие титры соответствуют конъюгатам КЕН-МАР4(Ό) и Р64к-МАР4-(И). Во всех случаях титры конъюгатов белок-МАР значительно выше, чем у конъюгатов белок-пептиды, которые вызывают реакцию такой же интенсивности, как в группах мышей, иммунизированных только МАР. На основании результатов данного эксперимента можно сделать вывод о том, что конъюгирование разветвленных структур, содержащих последовательности других патогенов, с белками-носителями позволяет существенно увеличить иммуногенность для выбранного пептида.

Пример 12. Исследование перекрестной реактивности после назальной иммунизации разветвленными конъюгатами.

Для демонстрации вызывания гуморального ответа с высокой перекрестной реактивностью после назальной иммунизации используют самок мышей Ва1Ь/с в возрасте 10-12 недель, распределенных в группы по 8 особей в каждой, которых инокулируют 10 мкг НВкАд, связанного с (ТТ-1У1) МАР8. В качестве контрольных групп используют мышей, распределенных в группы по 8 особей в каждой, которым вводят 40 мкг (ТТ-1У1) МАР8. Гуморальный ответ против обоих иммуногенов измеряют методом ЕЫ8А, измеряя общее количество 1дС против пептида 1У1, при этом также анализируют перекрестную реактивность, используя панель, включающую 5 пептидов У3. В контрольной группе не обнаружена реакция против 1У1, в отличие от этого в группе мышей, иммунизированных конъюгатом НВ§Ад-МАР8 (ТТ-1У1), возникла сильная реакция против гомологичного пептида в 100% случаев; кроме того, перекрестная реактивность обнаружена для более чем 2 пептидов из панели, которая усиливается с увеличением числа инокуляций. Полученные результаты свидетельствуют о важной роли конъюгирования для получения ответа; использование антигена улучшает иммунную реакцию против связанного МАР. Кроме того, впервые стала возможна сильная иммунная реакция после иммунизации через слизистую оболочку в сыворотке и на поверхности слизистой оболочки.

Другие разветвленные структуры получены с аналогичными результатами способами по примерам 2 и 3 с использованием в качестве молекул-носителей ядерного антигена из вирусов гепатита В и С и из вируса Денге.

Кроме того, при использовании пептида из гонадотропинсекретирующего гормона в качестве синтетической части разветвленной структуры, связанной с вышеуказанными антигенами, наблюдается значительное уменьшение размера гонад по сравнению с контрольными животными, иммунизированными только пептидами, и неиммунизированными мышами.

Пример 13. Анализ перекрестной нейтрализации разных изолятов ВИЧ-1, полученных при использовании сыворотки с высокими уровнями перекрестной реактивности.

Для оценки перекрестной нейтрализации сыворотки с высокой перекрестной реактивностью для петли У3 выполняют анализ ίη νίίτο, используя разные лабораторные изоляты ВИЧ1. Для указанных анализов отбирают пулы сыворотки с учетом уровня перекрестной реактивности. При выполнении данного анализа используют НВкАд-МАР8 (ΤΤ-1Υ1) (пример 4), НВкАд-МАР8 (ΤΤ-ΒΡ) (пример 10) и смесь НВкАд-МАР4 (СБ4) с НВкАд-МАР4 (консенсусный пептид) (пример 8).

Данное исследование показывает, что гуморальный ответ, вызванный каждым иммуногеном, обладает способностью оказывать нейтрализующее действие на гетерологические изоляты.

Очевидно, что смесь с СБ4 увеличивает уровень перекрестной нейтрализации. Отдельные пептиды или их конъюгат не вызывают обнаруживаемой перекрестной нейтрализации.

Пример 14. Синтез разветвленных структур с использованием разных ядер.

Для увеличения количества В-клеточных эпитопов в одном молекулярном звене выполняют непрямой синтез, включающий раздельный синтез ядра и пептидов. Такая система позволяет избежать ошибок, присущих синтезу больших последовательностей, и обеспечивает более высокое введение В- и Т-клеточных эпитопов в ядро, имеющее требуемые функциональные группы.

Разветвленное ядро синтезируют, осуществляя взаимодействие аминогруппы 1,6диаминогексана с карбоксильными группами, карбоксилом аминокислоты Вос-Ьук (Вос)-ОН, используя дициклогексилкарбодиимид (ОСС) в качестве активатора. Затем удаляют защитные группы при помощи 37% трифторуксусной кислоты (ΤΡΑ) в дихлорметане (БСМ) и получают ядро с 4 реакционноспособными концами, что делает возможным создание тетравалентной разветвленной структуры и достижение второго и третьего уровней связывания для Вос-Ьук (Вос)-ОН при выполнении аналогичного цикла реакций для получения ядра с 16 аминокислотными реакционноспособными концами. Затем указанные группы подвергают взаимодействию с карбоксильной группой бромуксусной кислоты. Ядро очищают ВЭЖХ с обращенной фазой на колонке С8. Предварительно синтезируют пептид ΤΥ1, имеющий цистеин в С-конце, который взаимодействует в требуемых отношениях с полученным ядром. Тиоэфир получают в результате взаимодействия между гетероатомной группой ядра и тиоловой группой цистеина в основных условиях (рН 8-9) (фиг. 9). Степень введения определяют методом БОЗ-РАСЕ и хроматографией с гель-фильтрацией. Получают разветвленные пептиды с длиной цепи 40-50 кДа.

Разветвленную структуру связывают с разными белками-носителями, используя связующие агенты, указанные в примере 2. Полученные разветвленные структуры, содержащие белок и МАР, затем используют в разных схемах иммунизации, где очевидно их превосходство в отношении иммуногенности и перекрестной реактивности.

Описанная система обладает разными преимуществами, например, полученные отдельно В- или Т-клеточные пептиды можно вводить в уникальную матрицу, имеющую требуемые функциональные группы (4-6Н). Антигенные пептиды можно синтезировать и конъюгировать с С- и Ν-концами, при этом можно произвести очистку отдельных детерминант и избежать ошибок, присущих синтезу длинных последовательностей.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1

A) Исследование иммуногенности после введения трех и четырех доз. Группы: 1. МАР8 (ΤΤ-1Υ1) и 2. НВкАд-МАР8 (ΤΤ-1Υ1). Дозы соответственно равны 50 и 10 мкг.

B) Исследование перекрестие реактивных антител после введения трех и четырех доз. Сыворотку, полученную в обеих группах, испытывают при постоянном разведении, равном 100^-1. Выполняют непрямой анализ ЕЬ13А с сенсибилизацией конъюгатами У3-В8А.

C) Таблица 1. Аминокислотные последовательности пептидов У3 испытанного ВИЧ-1.

Фиг. 2

Исследование распознавания нескольких пептидов У3 в сыворотке, полученной после введения четырех доз. Группы: 1. МАР8 (ΤΤ1Υ1); 2. ТАВ9. Дозы соответственно равны 16,4 и 100 мкг.

Фиг. 3

A) Таблица 2. Краткое описание схемы иммунизации.

B) Сравнительное исследование иммуногенности при разных способах представления эпитопа 1Υ1 в иммунной системе.

Фиг. 4

A) Таблица 3. Краткое описание схемы иммунизации.

B) Исследование распознавания пептидов У3 в сыворотке после инокуляции Адк, представляющего эпитоп НΥ1 разными способами иммунной системе.

Фиг. 5а

Таблица 4. Краткое описание схемы иммунизации.

Таблица 5. Аминокислотные последовательности СО4-связывающего пептида из др120, консенсусного пептида из У3 и пептидной библиотеки последовательностей У3 из ВИЧ-1.

Таблица 6. Результаты иммуногенности после введения четырех и пяти доз.

Фиг. 5Ь

График 1. Исследование перекрестно реактивных антител после введения пяти доз в сыворотке, полученной в группах 2, 3 и 6, указанных в табл. 3.

График 2. Исследование перекрестно реактивных антител после введения пяти доз в сыворотке, полученной в группах 4, 5 и 6, указанных в табл. 3.

Фиг. 5с

Таблица 7. Исследование распознавания при помощи панели пептидов У3, синтезированных на целлюлозной мембране. Профиль качественного изменения показывает относительную интенсивность распознавания в полученной сыворотке после введения четырех и пяти доз: 1 и 2, смесь конъюгатов НВ§Ад-МАР4 (пептидная библиотека последовательностей У3) и НВ§Ад-МАР4 (СИ4-связывающий пептид из др120); 3 и 4, смесь конъюгатов НВкАдМАР4 (консенсусный пептид из У3) и НВкАдМАР4 (СИ4-связывающий пептид из др120); 5, НВкАд после введения пяти доз; 6, НВкАдМАР4 (СИ4-связывающий пептид из др120) после введения пяти доз. Четыре цвета разной насыщенности показывают степень взаимодействия антитела с пептидами. Белый: отсутствие распознавания, светло-серый: слабо положительное, темно-серый: положительное; черный: сильно положительное.

Фиг. 5б

Рисунки, соответствующие результатам, приведенным в табл. 5. Рисунки: 1 и 2, смесь конъюгатов НВ§Ад-МАР4 (пептидная библиотека последовательностей У3) и НВ§Ад-МАР4 (СИ4-связывающий пептид из др120); 3 и 4, смесь конъюгатов НВ§Ад-МАР4 (консенсусный пептид из У3) и НВ§Ад-МАР4 (СИ4связывающий пептид из др120) после введения соответственно четырех и пяти доз; 5, НВкАд после введения пяти доз; 6, НВ§Ад-МАР4 (СИ4связывающий пептид из др120) после введения пяти доз. Сыворотку, полученную во всех группах, испытывают при постоянном разведении, равном 100^-1.

Фиг. 6

A) Таблица 8. Краткое описание схемы иммунизации.

B) Определение иммуногенности в разных группах после введения трех доз.

C) График 1. Исследование перекрестной реактивности после введения трех доз в сыворотке, полученной в группах 4-10, указанных в табл. 3. Пулы сыворотки анализируют при постоянном разведении, равном 1/100. Непрямой анализ ЕЫ8А выполняют, покрывая планшеты разными пептидами, связанными с В8А.

График 2. Исследование перекрестной реактивности после введения четырех доз в сыворотке, полученной в группах 4-10, указанных в таблице 3. Пулы сыворотки анализируют при постоянном разведении, равном 1/100. Непрямой анализ ЕЫ8А выполняют, покрывая планшеты разными пептидами, связанными с В8А.

Фиг. 7

А) Исследование распознавания разных пептидов У3 в сыворотке, полученной после введения трех доз. Группа 1, МАР8 (ТТ-ЯГ); 2, НВ§Ад-МАР8 (ТТ-ЯГ). Дозы соответственно равны 40 и 10 мкг.

Фиг. 8

A) Таблица 8. Краткое описание схемы иммунизации.

B) Оценка иммуногенности методом ЕЫ8А после введения трех доз.

Фиг. 9

Получение разветвленных пептидов и антигенных структур.

Claims (46)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ получения антигенных структур, способных усиливать специфическую перекрестную реактивность, включающий стадии:

   A) отбор представляющего интерес эпитопа;

   B) получение разветвленных структур с эпитопами, отобранными на стадии (А), с помощью способа синтеза, выбранного из следующей группы: 1) синтеза на ядре аспарагиновой кислоты или лизина; 2) синтеза на ядре органических молекул и 3) прямого связывания пептидов с разветвленным ядром; причем В- и Т-клеточные эпитопы могут быть объединены на одном ядре;

   C) конъюгирование одной или различных разветвленных структур, полученных на стадии (В), с одной или различными молекуламиносителями с помощью способа связывания, выбранного из группы, состоящей из 1) конъюгирования с использованием альдегида глутаровой кислоты, 2) с использованием янтарного ангидрида, 3) с использованием сложного эфира Ν-гидроксисукцинимида β-малеимидопропионовой кислоты (МР8) и 4) любого способа, не требующего использования спейсерных агентов с ароматическими боковыми цепями;

   Ό) объединение конъюгатов, полученных на стадии (С), включая добавление СИ4связывающего пептида или содержащего его конъюгата; и

   Е) введение полученного препарата в квасцы или любой другой приемлемый адъювант.
2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что пептиды, содержащиеся в структурах, полученных на стадии (В), относятся к областям вируса иммунодефицита человека типа 1 или 2.
3. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что пептиды, содержащиеся в структурах, полученных на стадии (В), относятся к вариабельным областям вируса иммунодефицита человека типа 1 или 2.
4. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что пептиды, содержащиеся в структурах, полученных на стадии (В), относятся к третьей вариабельной области (У3) вируса иммунодефицита человека типа 1 или 2.
5. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что пептиды, содержащиеся в структурах, полученных на стадии (В), относятся к вирусу гепатита

   B.
6. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что пептиды, содержащиеся в структурах, полученных на стадии (В), относятся к вирусу гепатита

   C.
7. 7. Способ по п.1, отличающийся тем, что пептиды, содержащиеся в структурах, полученных на стадии (В), относятся к вирусу Денге.
8. 8. Способ по п.1, отличающийся тем, что олигомеры, содержащиеся в структурах, полученных на стадии (В), относятся к полисахаридным областям Нелепа тешпдЮбб.
9. 9. Способ по п.1, отличающийся тем, что пептиды, содержащиеся в структурах, полученных на стадии (В), являются пептидомиметиками антигенных полисахаридов.
10. 10. Способ по п.1, отличающийся тем, что пептиды, содержащиеся в структурах, полученных на стадии (В), относятся к антигенным областям микроорганизма или патогена.
11. 11. Способ по п.1, отличающийся тем, что пептиды, содержащиеся в структурах, полученных на стадии (В), относятся к аутоантигенам.
12. 12. Способ по п.11, отличающийся тем, что пептиды, содержащиеся в структурах, полученных на стадии (В), относятся к гонадотропинсекретирующему гормону.
13. 13. Способ по п.1, отличающийся тем, что молекула-носитель, используемая на стадии (С), является поверхностным антигеном гепатита В, НВкАд.
14. 14. Способ по п.1, отличающийся тем, что молекула-носитель, используемая на стадии (С), является белком р64К Нелепа тешпдШбщ.
15. 15. Способ по п.1, отличающийся тем, что молекула-носитель, используемая на стадии (С), является ядерным белком вируса иммунодефицита человека.
16. 16. Способ по п.1, отличающийся тем, что молекула-носитель, используемая на стадии (С), является ядерным антигеном гепатита В или ядерным антигеном гепатита С.
17. 17. Способ по п.1, отличающийся тем, что молекула-носитель, используемая на стадии (С), является полисахаридом.
18. 18. Способ по п.17, отличающийся тем, что молекула-носитель, используемая на стадии (С), является декстраном.
19. 19. Способ по п.1, отличающийся тем, что молекулу-носитель и разветвленную структуру, используемые на стадии (С), связывают ковалентно, электростатически или на основе гидрофобности.
20. 20. Антигенная структура, способная усиливать специфическую перекрестную реактивность, включающая разветвленные антигенные эпитопы, связанные с белками-носителями.
21. 21. Антигенная структура по п.20, отличающаяся тем, что эпитопы разветвленной области имеют пептидную или олигосахаридную природу.
22. 22. Антигенная структура по п.21, отличающаяся тем, что эпитопы пептидной природы представляют собой пептидную консенсусную последовательность вариабельных областей, выбираемых из подтипов, подгрупп, серотипов или ассоциаций другого типа.
23. 23. Антигенная структура по п.21, отличающаяся тем, что эпитопы пептидной природы представляют собой пептидные библиотеки пептидных последовательностей, выбираемых из микроорганизмов или пептидомиметиков.
24. 24. Антигенная структура по любому из пп.21-23, отличающаяся тем, что эпитопы разветвленных пептидных областей относятся к вирусу иммунодефицита человека типа 1 или 2.
25. 25. Антигенная структура по п.24, отличающаяся тем, что эпитопы разветвленных пептидных областей относятся к вариабельным областям вируса иммунодефицита человека типа 1 или 2.
26. 26. Антигенная структура по п.25, отличающаяся тем, что эпитопы разветвленных пептидных областей относятся к вариабельной области У3 вируса иммунодефицита человека типа 1 или 2.
27. 27. Антигенная структура по любому из пп.21-23, отличающаяся тем, что эпитопы разветвленных пептидных областей относятся к областям вируса гепатита В.
28. 28. Антигенная структура по любому из пп.21-23, отличающаяся тем, что эпитопы разветвленных пептидных областей относятся к областям вируса гепатита С.
29. 29. Антигенная структура по любому из пп.21-23, отличающаяся тем, что эпитопы разветвленных пептидных областей относятся к областям вируса Денге.
30. 30. Антигенная структура по п.21, отличающаяся тем, что эпитопы разветвленных пептидных областей относятся к полисахаридным антигенам Ыещкепа тешпдюбб.
31. 31. Антигенная структура по любому из пп.21-23, отличающаяся тем, что эпитопы разветвленных пептидных областей являются пептидомиметиками полисахаридных или белковых антигенов.
32. 32. Антигенная структура по любому из пп.21-23, отличающаяся тем, что эпитопы раз ветвленных пептидных областей относятся к микроорганизмам или патогенам.
33. 33. Антигенная структура по любому из пп.21-23, отличающаяся тем, что эпитопы из разветвленных пептидных областей относятся к аутоантигенам.
34. 34. Антигенная структура по любому из пп.21-23, отличающаяся тем, что эпитопы разветвленных пептидных областей относятся к гонадотропинсекретирующему гормону.
35. 35. Антигенная структура по п.20, отличающаяся тем, что молекула-носитель является поверхностным антигеном вируса гепатита В, НВкАд.
36. 36. Антигенная структура по п.20, отличающаяся тем, что молекула-носитель является белком р64К Νοίδδοπα тешпДцбЬ.
37. 37. Антигенная структура по п.20, отличающаяся тем, что молекула-носитель является нуклеокапсидным антигеном ВИЧ.
38. 38. Антигенная структура по п.20, отличающаяся тем, что молекула-носитель является нуклеокапсидным антигеном НВУ (НВеАд).
39. 39. Антигенная структура по п.20, отличающаяся тем, что молекула-носитель является полисахаридом.
40. 40. Антигенная структура по п.39, отличающаяся тем, что молекула-носитель является декстраном.
41. 41. Применение антигенной структуры по любому из пп.20-40 в диагностической системе на антигены вируса иммунодефицита человека типа 1 и 2, вируса гепатита С, вируса гепатита В, вируса Денге, №155епа тешидШбщ, гонадотропинсекретирующего гормона.
42. 42. Применение антигенной структуры по любому из пп.20-40 в профилактических и терапевтических вакцинах, направленных на вирус иммунодефицита человека типа 1 и 2, вирус гепатита С, вирус гепатита В, вирус Денге, №185епа теишдШбк, гонадотропинсекретирующий гормон.
43. 43. Вакцинная композиция, включающая антигенную структуру по любому из пп.20-40 в сочетании с приемлемым адсорбирующим веществом или адъювантом.
44. 44. Вакцинная композиция по п.43, для системного введения или введения через слизистую оболочку.
45. 45. Применение вакцинной композиции по п.43 или 44 для профилактики инфекционных заболеваний, аутоиммунной реакции или рака.
46. 46. Применение вакцинной композиции по п.43 или 44 для лечения инфекционных заболеваний, аутоиммунной реакции или рака.