KR100887591B1 - 특정의 교차 반응성을 증가시키는 항원성 구조들의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 높은 교차 반응성을 갖는 항원성 구조들을 수득하는 방법에 관한 것으로서, 이는 이 방법으로부터 수득된 화학적 구조들 및 수득된 조성물들 및 그들의 용도들과 마찬가지로 계통적으로 및/또는 점액상으로 적용된 펩티드성 항원들에 대한 면역 응답들을 향상시킬 수 있다.
본 발명에서 설명된 방법은 덴드리머들의 선택 및 합성들로부터 시작되는 새로운 항원성 구조들을 수득할 수 있으며, 이는 운송 단백질들에 결합된다. 그 결과의 구조들은 통상적으로 부형화되거나 또는 여러 항원들의 조성내에서 사용될 수 있으며 교차 반응성 및 면역성들에서 상승적 효과가 발견될 수 있다. 더욱이, 조성물들은 안정제들 및 보존제들을 포함할 수 있다.
본 발명의 항원성 구조들은 인간들 및 동물들에서 질병들의 예방 또는 치료를 위한 백신 조성물로서 제약산업에서 사용될 수 있으며, 마찬가지로 진단시스템들에서의 개발분야에서 사용될 수 있다.

Description

특정의 교차 반응성을 증가시키는 항원성 구조들의 제조방법{Method For Obtaining Antigenic Structures Enhancing Specific Cross Reactivity}
본 발명은 의약분야, 특히 교차 반응성(cross reactivity)을 가능하게 하는 신규의 항원성 구조에 기초한 백신화된 조성물들에 관한 것이다.
펩티드들은 면역성(immunogenicity)이 불량하며, 그에 따라 이들은 특정 항체들을 유도하는데 도움이 되는 요구 티-세포(T-cell)를 제공하는 운송단백질(carrier protein)들에 반드시 결합되어야 한다(Herrington, D.A. et. al., 1987, Nature, 328:257-259). 운송단백질에의 펩티드 결합 공정 동안에, 비특이성 결합으로 인하여 항원성(antigenicity) 특성이 손실될 수 있다.
상기 펩티드들은 대상의 항원결정기(epitope)의 주요부 상에서 운송단백질에 결합되게 된다. 상기 펩티드들의 결합에 관련된 상기 문제들을 피하기 위하여, 펩티드를 면역체계(immune system)에 부여하는 다른 방법들이 기술되어 있다.
예를 들면, 다중-항원 펩티드(MAP ; multi-antigen peptide)는 라이신의 분지된 핵(core) 내부의 B- 및 T-세포 항원결정기의 합체에 기초하고 있다(Tam, J. P. et. al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 86:5409-54132-5)(Tam, J. P., 1989, Methods Enzymol, 168:7-15)(Tam, J. P. 1990, WO 90/11778)(Tam, J. P., 1993 WO 93/03766). 이 시스템의 주요 잇점들은 전체 분자에 대한 대상의 항원결정기의 높은 비율 뿐만 아니라 그들의 구조 및 정의된 조성들이다. 면역학의 몇 몇 연구들에서, 상기 MAP는 상기 펩티드의 결합 보다 더 나은 것으로 밝혀졌다(Wang, C. Y. et. al. 1991 Science 254:285-288).
다른 연구들에서 반대현상이 일어났기 때문에 이것이 항상 일관적이지 않기는 하나(Riley, E. M. et. al. 1996 Veterinary Immunology and Immunopathology 55:243-253), 이는 운송단백질에 관련된 형상이 될 수 있다.
교차 반응성 및 중화는 앞서 펩티드 합성에 대해 기술되었다(Wang, C. Y. et. al., 1991, Science 254 : 285-288). 몇 몇 연구자들 또한 HIV-1의 V3 영역(region)에 대한 항-펩티드 항체들이 장(field)의 다른 단리물(isolation)로의 교차화된 중화(crossed neutralization)를 부여한다는 것을 보고하고 있다(Wang, C. Y. et. al., 1991, Science 254 : 285-288).
요약하면, 상기 교차화된 중화 및 반응성은 상기 펩티드의 구조에 관련되어 있다. HIV-1의 V3 루프(loop)의 펩티드들이 그 예이다.
상기 MAP 용법은 인간에서 항 V3 대응 중화를 생성하는데 사용되어 왔다(Geoffrey, J. et. al., 1996, Journal of Infectious Diseases, 173:330-3398). 이 방법론의 단점은 효과를 얻기 위해서는 과다하게 많은 양, 500㎍의 MAP를 접종하여야 한다는 것이다(Kahn, J. et. al., 1994, Tenth International Conference on AIDS, Yokohama, Japan, 7-12 August, Vol. 1)(Li, D. et. al., 1997, seized Pac J Allergy Immunol. 15:105-13).
임상의 단리물들의 중화의 광범위한 대역(spectrum)을 찾기 위하여, 다른 V3의 선택에 기초한 MAP들의 혼합, MAP의 전체 ㎍의 필요량 등은 면역의 습관적인 실행들과는 맞지 않을 수 있다.
상기 교차화된 반응성은 관련된 리간드(ligand)들과 반응하는 면역원(immunogen)을 보유하는 능력으로 정의된다(Paul, Fundamental W. Immunology. 4th edition). 비록 교차 반응성의 현상이 면역학의 초기부터 지금까지 알려져 있기는 하나, 어떠한 백신 제제도 교차 반응성에 기초하고 있지는 않았다. 이는 아마도 면역화의 프로그램들에서 사용된 백신들의 거의 대다수가 그들의 여러 임상의 단리물들 중의 높은 다양성과 관련된 병원균(pathogen)들에 대해 보호하지 못하는가 하는 것으로 설명된다.
동종의 펩티드들 중의 교차화된 반응성은 각 서열(sequence)의 속성(property)이다. 이는 면역체계에 대한 펩티드의 존재의 형태에 따라 증가될 수 있다. 상기 교차화된 반응의 증가가 면역성의 증가에 의해 주어진다는 것은 명확하지 않다. 교차화된 반응성 및/또는 중화에 대한 항체의 유도는 펩티드 면역성과 관련이 있는 것은 아니라는 것이 티-비 펩티드에 대한 연구에서 입증되었다(Kasmi, K. C. et. al., 1998, molecular Immunology, 35;905-918).
병원균의 대다수의 항원성 변종(antigenic variant)을 인식할 수 있는 면역 응답(immune response)을 얻기 위하여 다른 전략들이 생겨났다. 이들 중의 하나가 보다 중요한 변종들에 대한 다중-항원결정기 폴리펩티드 재조합(MEPr ; Multi-Epitope Polypeptide recombinant)의 설계로 구성된다.
상기 MEPr 시스템의 비-항원결정기의 발현은 항상 선택할 수 있는 것은 아니다(Flynn, J. N. et. al., 1997, J. Virol, 71 ; 7586-92). 초기에는, 혼성의 폴리펩티드의 발생은 모든 항원결정기들을 적절하게 노출시켜야 하는 것은 아닌, 예측할 수 없는 3차원 구조의 분자의 생산을 촉진시킨다.
이러한 설계는 일부 항원결정기에 대한 응답을 선호하거나, 또는 전체적으로 다른 것들에 대한 응답을 지체시킨다. 반면에, 이는 또한 상기 다른 항원결정기들 중에 부여될 수 있는 우성(dominance)을 예측할 수 없다.
다른 전략은 면역원으로서의 펩티드들의 라이브러리(library)의 생성이었다. 상기 펩티드들의 라이브러리는 높은 가변영역들에서 얻어졌다. 이는 매우 큰 수의 펩티드 서열을 나타낸다.
그러나, 이는 각 항원결정기의 매우 작은 예로는 곤란하다. 이는 매우 많은, 다른 서열들 내에서 희석되고, 이는 요구되는 수준에서의 면역 응답을 예측 불가능하게 만든다(Allen, D. et. al., 1998, J. of Virol., 27;651-659)(Jerome, E. et. al., 1994, Eur. J. Immunol., 24;2789-2795).
다른 전략은 서열들, HIV의 경우 V3의 폭 넓은 스펙트럼을 커버하는 대상물과 일치하는 펩티드를 생성하는 것이다. 이는 현장 단리물들 또는 임상분야에서 모든 상기 단리물들 중 보다 보존된 아미노산에 대한 각 위치에서 침강되는, 항원결정기 다양성(epitope variability)의 연구에 기초한다(Holley, L. H. et. al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci., 88;6800-6804).
본 발명의 기술적인 목적은 계통적 및/또는 점액성의 경로(mucosal route)에 의해 투여된, 펩티드성의 항원들의 면역성을 향상시킬 수 있는 고도로 교차화된 반응성의 항원구조를 얻기 위한 방법을 개발하기 위한 것이다. 이 방법은 적절한 비율로 운송단백질에 결합된 덴드리머(dendrimer) 구조들을 생산하는 것이다.
다른 비-항원결정기(B-epitope)를 운송하는 유사한 구조들의 부가가 교차화된 반응성을 증가시키는 것을 가능하게 한다. 게다가, 공동-투여된 항원들의 면역성의 증가도 얻어진다. 다른 항원들 및 부형제(adjuvants)들도 이 제제에 첨가될 수 있다.
따라서, 본 발명의 하나의 목적은 특정의 교차 반응성을 향상시키는 항원성 구조를 합성하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 언급한 방법은
A) 대상의 항원결정기들을 선택하는 단계;
B) 라이신 또는 아스파르트산 코어들 상에서의 합성; 유기분자코어들 상에서의 합성; 덴드리머성의 코어상에 결합된 펩티드들 또는 B-세포 항원결정기들, T-세포 항원결정기들 또는 이들 모두의 단일 코어 상에서의 혼합물들의 합성 방법을 사용하여 A)의 단계에서 선택된 항원결정기들을 갖는 덴드리머성 구조들을 수득하는 단계;
C) 결합방법을 사용하여 B)의 단계에서 수득된 하나 또는 여러 덴드리머성 구조들을 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 숙신산 무수물(succinic anhydride), 베타-말레이미도프로피온산-N-히드록시 숙신산의 에스테르(MPS ; ester of the β- maleimidopropionic-N-hydroxy succininc acid) 등의 하나 또는 여러 운송분자들과, 또는 방향족 측쇄들이 없는 격리제(spacer agent)들과의 결합, 이는 이러한 그룹들이 결합된 덴드리머성의 구조들의 인식을 회피하는 것을 보여주기 때문임,
D) 상기 항원결정기를 갖는 CD4 결합 펩티드 또는 결합물을 첨가하므로써 조성을 얻기 위하여 상기 C)의 단계에서 수득된 결합물들을 혼합하는 단계, 이는 그 결과의 항원성 구조의 교차 반응성 및 면역성을 향상시킴 ; 및
E) 명반(alum) 또는 다른 적절한 부형제들에 부형시키는 단계;
들을 포함하여 이루어진다.
본 발명의 방법에서, B)의 단계에서 수득된 구조 내의 펩티드들은 HIV1 또는 HIV2로부터의 영역들, 특히 V3 루프와 같은 가변영역들이 될 수 있다.
또한, HCV, HBV 및 뎅기열 바이러스(Dengue virus)들 중 다른 바이러스들로부터의 일부 가변성을 갖는 영역들이 사용될 수 있다.
그리고, 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)로부터의 다당류성의 영역(polysaccharidic regions), 또는 다당류성의 항원(polysaccharidic antigens)로부터의 의사 펩티드(mimetic peptide), 또는 미생물이나 병원균들로부터의 어떠한 다른 영역들도 사용될 수 있다.
더욱이, 본 발명의 방법은 암 백신에 대한 자가항원(self antigens) 또는 관련 항원들로부터의 영역들, 예를 들면 고나도트로핀 방출 호르몬(Gonadotropine Releasing Hormone)으로부터의 영역들을 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 운송단백질들 중에는 B형 간염 바이러스(hepatitis B virus)로부터의 표면항원(HBsAg), 나이세리아 메닝기티디스로부터의 p64k 단백질, HIV의 코어 항원, B형 간염으로부터의 코어 항원들이 있다. 또한, 덱스트란(dextran)과 같은 다당류성의 분자들도 동일한 목적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 공유결합에 의해 또는 정전기적 상호작용 또는 소수성 상호작용에 의한 "B)"의 단계에서 얻어진 하나 또는 다수의 덴드리머성 구조들의 하나 또는 다수의 운송분자들에의 결합을 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 방법들에 의해 얻은 항원성 구조를 제공하는 것이며, 이는 포함된 항원결정기의 특정의 교차 반응성을 향상시킨다. 이는 수득되는 구조의 1 내지 30%로 운송단백질들에 결합된 덴드리머성 항원들로서 전술한 항원결정기들을 포함한다.
선택된 항원결정기들은 다당류성 또는 펩티드성의 속성이 될 수 있다. 펩티드들은 아류(subtype), 아족(subgroup), 혈청형들 또는 어떠한 임의의 분류에 의해서 선택된, 가변될 수 있는 영역들로부터의 동일 펩티드들이 될 수 있다. 게다가, 이들은 미생물로부터의 펩티드 라이브러리 또는 의사 펩티드들이 될 수 있다.
특히, 덴드리머들 내의 펩티드들은 HIV 1 또는 HIV 2들, 그들 중 V3 루프로부터의 가변영역(variable regions); 및 B형 간염, C형 간염 및 뎅기열 바이러스 등의 다른 바이러스들로부터의 영역들이 될 수 있다.
이들 구조들은 나이세리아 메닝기티디스로부터의 다당류성 영역들의 항원들, 다당류성 항원들에 대한 의사 펩티드들 또는 미생물이나 병원균으로부터의 어떠한 임의의 영역들도 포함한다.
그리고, 본 발명의 항원성 구조는 백신에 대한 자가항원(self antigens) 또는 관련 항원들로부터의 영역들, 예를 들면 고나도트로핀 방출 호르몬으로부터의 영역들을 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 운송단백질들 중에는 B형 간염 바이러스(hepatitis B virus)로부터의 표면항원(HBsAg), 나이세리아 메닝기티디스로부터의 p64k 단백질, HIV의 코어 항원, B형 간염으로부터의 코어 항원들이 있다. 또한, 덱스트란(dextran)과 같은 다당류성의 분자들도 동일한 목적으로 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 앞서 설명한 항원성 구조를 감염성의, 자가면역(autoimmune) 또는 악성의 질병들에 대한 진단용 또는 예방용 또는 치료용 백신 조성물용으로 사용하는 것에 관련된 것이며, 이는 계통적인 경로에 의해 예방접종될 수 있다.
특히, V3 루프에 대하여는 가변영역들로부터의 펩티들에 대한 교차반응 항체들을 향상시키도록 개발된 동일한 구조에 대한 CD4 결합 펩티드를 갖는 결합물(conjugates)의 첨가에 의해 교차반응 및 교차중화를 더욱 크게 증가시킬 수 있음이 입증되었다.
이러한 구조들의 부가는 항-V3 교차반응 및 공동-투여된 항원들의 면역성을 증가시킨다. 실제로, 이 방법은 이들에 기초한 백신전략에서 교차반응하는 항체들의 발현을 용이하게 하나, 백신전략에서 동종 펩티드에 대한 면역성만을 증가시키기 위해서 이의 사용을 배척하는 것은 아니다.
본 발명은 면역체계에 대해 가변할 수 있는 미생물들로부터의 B-세포 항원결정기들의 차등 존재에 기초하는 새로운 화학구조들을 얻기 위한 방법론을 제공한다. 이러한 가변성은 병원성에 관계될 수 있다.
또한, 세포항원들로부터의 B-세포 항원결정기들과 같이 보호 면역 응답을 이끌어낼 수 있는, 가변되지 아니하는 B-세포 항원결정기들 또한 사용될 수 있다. 운송단백질들 상의 이들 모든 덴드리머성 구조들은 그들의 교차반응 및 면역성을 향상시킬 수 있다.
상기 제안된 방법은 보다 높은 항원결정성 밀도를 갖는 통상적이지 않은 방법에서 백신상의 항원(vaccinal antigen)들을 생산할 수 있게 하며, 이는 면역성과 항-펩티드 교차반응을 증가시킨다.
또한, 상기 방법은 그 차등 존재로 인하여 앞서 기술한 새로운 장점들 이외에 보다 높은 항체 역가를 이끌어내는 덴드리머성 구조들의 양을 감소시킬 수 있게 한다.
가변 영역들로부터의 펩티드들이 실시예들에서 기술된 바와 같이 그들의 면역성에 어떠한 영향도 주지 않고 교차 반응성을 향상시킬 수 있음을 지적하여야 한다.
반면에, 이 방법은 서로 다른 덴드리머성 구조들을 동일한 운송체(carrier)에 결합시킬 수 있게 한다. 또한, CD4 결합 펩티드를 갖는 유사한 구조와 본 발명의 구조들의 혼합물은 항 V3 면역성과 교차 반응성을 증가시킨다.
운송체가 T-세포 항원결정기들을 제공하기 때문에 본 신규한 구조는 단지 B- 세포 항원결정기들 만을 갖는 덴드리머성 부분을 포함할 수 있다. 백신 요소들로 사용된 MAP 구조들은 운송체의 사용을 피할 수 있고, 본 구조의 T-세포 항원결정기들은 선택적으로 합성부분 또는 운송체 중에 포함될 수 있다.
이러한 전략은 이들이 밀집한 클러스터(cluster) 내에 존재하지 않기 때문에 B-세포 항원결정기들에 대한 보다 나은 발현을 가져온다. 또한, 운송단백질들에 결합된 덴드리머들을 사용하여, 덴드리머들(예를 들면, MAP들)과 비교하여 보다 적은 양의 면역원을 사용하여 교차반응 및/또는 면역성을 향상시킬 수가 있다.
마지막으로, 이들 결합물들의 혼합물에서 면역성과 교차반응에 대해 상승작용 효과가 나타난다.
본 발명의 조성은 본 기술이 최근 매우 중요한 점액상의 경로에 의해 그 목적에 도달할 수 있도록 하는 점액상의 경로를 통해 접종되도록 할 수 있다.
도 1은,
A) 3회 및 4회 투여 후의 면역성 연구.
1그룹 : MAP8(TT-JY1), 2그룹 : HBsAg-MAP8(TT-JY1). 투여량은 각각 50 및 10㎍ 이었다.
B) 3회 및 4회 투여 후 Abs 교차-반응의 연구.
두 그룹들로부터 모아진 혈청들은 고정된 100-1 희석율에서 시험되었다. V3-BSA 결합물로 코팅된 간접 ELISA 방법이 수행되었다.
C) 표 1.
시험된 HIV-1으로부터의 V3펩티드들의 아미노산 서열.
도 2는,
4회 투여 후 모여진 혈청들의 여러 V3 펩티드들의 인식 연구.
1그룹 : MAP8(TT-JY1), 2그룹 : TAB9. 투여량은 각각 16.4 및 100㎍ 이었다.
도 3은,
A) 표 2.
면역화 스케쥴의 요약.
B) JY1 항원결정기의 면역 시스템에의 발현의 여러 방법들 간의 면역성의 비교연구.
도 4는,
A) 표 3. 면역화 스케쥴의 요약.
B) 면역 시스템에 JY1 항원결정기를 서로 다른 방법으로 발현하는 Ags의 접종 후, 유도된 혈청들의 V3 펩티드들에 대한 인식 연구.
도 5a는,
표 4.
면역화 스케쥴의 요약.
표 5.
gp120으로부터의 CD4 결합 펩티드, V3로부터의 동형 펩티드 및 HIV-1으로부 터의 V3 서열들의 펩티드 라이브러리의 아미노산 서열들.
표 6. 4회 및 5회 투여 후 면역성 결과들.
도 5b는,
그래픽 1.
표 3으로부터의 2그룹, 3그룹 및 5그룹들로부터의 혈청들의 5회 투여 후의 Abs 교차-반응의 연구.
그래픽 2.
표 3으로부터의 4그룹, 5그룹 및 6그룹들로부터의 혈청들의 5회 투여 후의 Abs 교차-반응의 연구.
도 5c는,
표 7. 셀룰로스 막 상에서 합성된 V3 펩티드들의 패널에 대한 인식 연구. 퀄리티 프로파일은 4회 및 5회 투여 후 모여진 혈청들의 인식의 상대 강도들을 나타낸다.
1 및 2 : HBsAg-MAP4(V3 서열들의 펩티드 라이브러리) 및 HBsAg-MAP4(gp120으로부터의 CD4 결합 펩티드) 결합물들의 혼합물, 3 및 4 : HBsAg-MAP4(V3로부터의 동형 펩티드) 및 HBsAg-MAP4(gp120으로부터의 CD4 결합 펩티드) 결합물들의 혼합물, 5 : 5회 투여 후의 HBsAg, 6 : 5회 투여 후의 HBsAg-MAP4(gp120으로부터의 CD4 결합 펩티드). 4가지 서로 다른 색상의 강도들은 펩티드들에 대한 항체 상호작용의 품질을 나타낸다. 흰색 : 인식 없음, 연녹색 : 약한 양성, 진녹색 : 양성, 검은색 : 강한 양성.
도 5d는,
표 5에 나타난 결과들에 대한 사진들. 사진 1 및 사진 2 : HBsAg-MAP4(V3 서열들의 펩티드 라이브러리) 및 (gp120으로부터의 CD4 결합 펩티드)의 결합물들의 혼합물, 사진 3 및 사진 4 : HBsAg-MAP4(V3로부터의 동형 펩티드) 및 HBsAg-MAP4(gp120으로부터의 CD4 결합 펩티드 ; 각각 4회 및 5회 투여 후) 결합물들의 혼합물, 5 : 5회 투여 후의 HBsAg, 6 : 5회 투여 후의 HBsAg-MAP4(gp120으로부터의 CD4 결합 펩티드). 모든 그룹들로부터 모여진 혈청들은 고정된 100-1 희석율에서 시험되었다.
도 6은,
A) 표 8. 면역화 스케쥴로부터의 요약.
B) 3회 투여 후의 서로 다른 그룹들의 면역성의 결정.
C) 그래픽 1 : 표 3에서 기술된 4그룹 내지 10그룹들로부터의 혈청들로 3회 투여한 후의 교차 반응성의 연구.
그래픽 2 : 표 3에서 기술된 4그룹으로부터의 혈청들로 4회 투여한 후의 교차 반응성의 연구. 모여진 혈청들은 고정된 1/100 희석율에서 분석되었다. BSA에 결합된 서로 다른 펩티드들로 덮여진 플레이트들에 대해 간접 ELISA 방법이 수행되었다.
도 7은,
A) 3회 투여한 후 모여진 혈청들의 V3 펩티들에 대한 인식의 연구. 1그룹 : MAP8(TT-RF), 2그룹 :HBsAg-MAP8(TT-RF). 투여량은 각각 40 및 10㎍이었다.
도 8은,
A) 표 8. 면역화 스케쥴의 요약.
B) 3회 투여 후, ELISA 방법에 의한 면역성 평가.
도 9는, 덴드리머성 펩티드들 및 항원성 구조들의 수득.
이상에서 본 발명은 기재된 구체예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.
실시예 1 : 항원성 구조를 제조하는 방법
일반적으로, 펩티드들, MAP들 및 덴드리머들의 합성은 앞서 기술된 바 있다(Tam, J. P. et. al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 86:5409-5413)(Shao J. et. al., 1995, J. Am. Chem. Soc., 117:3893-3899).
항원성 구조는 운송단백질에의 덴드리머 구조들의 교차결합에 의해 제조된다. 이는 격리제로서 숙신산 무수물(SA ; succinic anhydride)을 사용하여 수행된다.
이는 양 항원들이 그의 아미노기들을 통해 서로 공유결합하는 것을 허용한다. 이를 위해서, 상기 운송단백질들은 pH 8.5의 완충 면구(tampon) 내에서 30분 동안 숙신산 무수물은 활성화된다.
계속해서, 잔류하는 반응성은 희석에 의해 제거되어 덴드리머 분자(MAP)와 펩티드 간의 원치않는 교차결합을 회피하도록 한다. 결합은 상기 단백질의 카르복실기의 ECDI(용해가능한 카르보디이미드(carbodiimide))로의 활성화에 의해 수행된다.
계속해서, 합성 항원이 가해진다. 결합된 이들의 분리는 겔(gel)에서의 여과에 의해 수행되었다. 마지막으로, 이들은 AcM과 생쥐들(Mice)의 혈청들을 사용하여 ELISA 분석법 및 웨스턴 블럿팅(Western Blotting) 분석법으로 특정되었다.
실시예 2 : 서로 다른 격리제들을 사용하여 항원성 구조들을 제조하는 방법
서로 다른 격리제들을 사용하여 항원성 구조들의 제조를 수행하였다. 양호한 면역학적 품질(immunologic quality)의 결합을 얻기 위한 바람직한 요건은 상기 단백질에의 결합이 항원결정기의 중요한 잔기로부터 먼 곳에서 일어나는 것이다.
이러한 현상을 피하기 위해서는, 글루타르알데히드(glutaraldehyde), m-말레이미도벤질-N-히드록시숙신이미드 에스터(m-maleimidobenzyl-N-hydroxysuccinimide ester(MBS)), 카르보디이미드(carbodiimides), β-말레이미도프로피온산 N-히드록시숙신이미드 에스터(β-maleimidopropionic acid N-hydroxysuccinimide ester(MPS)), 숙신산 무수물(succinic anhydride) 등 서로 다른 격리제들이 사용되었다.
면역화 동안, 운송단백질들 및/또는 커플링제(결합제)들에 대한 항체들이 이끌어내어질 수 있다. 이상적으로, 우수한 커플링제는 그 자체에 대해 어떠한 항체반응도 일으키지 않아야 한다.
m-말레이미도벤질-N-히드록시숙신이미드 에스터 또는 β-말레이미도프로피온산 N-히드록시숙신이미드 에스터 또는 숙신산 무수물을 사용하는 서로 다른 운송단백질들에 결합된, HIV-1, JY-1 단리물로부터 유도된 V3-기초 합성 다중 항원 펩티드(MAP)에 대한 항체 반응은 서로 다른 행동을 보여준다.
숙신산 무수물의 경우에서 결합제(coupling agent)에 대한 강한 응답 없이, 우수한 항 JY-1 응답이 관찰되었다. 대조적으로, MBS는 결합제에 대한 높은 응답과 함께 전체적인 항체 응답의 방해가 일어났다.
이러한 결과는 문헌에서 보고된 격리제들 모두가 동일한 행동을 하는 것은 아님을 증명하였으며, 이는 이러한 형태의 항체구조들의 제조가 당해 기술분야에서 앞서 기술된 격리제들의 사용이 자명한 것은 아니다.
실시예 3 : HBsAg에 대한 신규한 덴드리머성 구조들의 설계, 합성 및 결합
이전의 항원구조들(즉, MAP-단백질 결합물들)이 대상이 되는 펩티드들에 대한 높은 역가를 이끌어내는 것을 고려하여 신규한 덴드리머성 구조들이 합성되었다.
운송단백질이 이들을 제공하기 때문에 이번에는 Th 항원결정기 없이 실행되었다. 이러한 구조들의 합성이 보다 쉬어지기 때문에, 보다 긴 B-세포 항원결정기들이 포함될 수 있으며, B-세포와 Th 항원결정기들 간의 공동-선형으로 인하여 원치않는 3차원 구조들은 회피된다.
덴드리머들은 실시예 1에서 기술된 바와 같이 HBsAg에 개별적으로 결합되었 다. MAP들은 J. Tam, et. al.,(1988)에서 언급된 바와 같이 합성되었다. 그 후에, 덴드리머성 구조들 및 결합물들이 겔 여과 크로마토그래피에 의해 분리되었으며, 그 농도는 코마시(Comassie) 방법에 의해 결정되었다.
실시예 4 : 면역-강화(immune-potentiation) 및 교차 반응성의 향상의 연구
면역성과 교차-반응에 있어서 운송단백질에의 MAP 결합의 효과를 연구하기 위하여, 2 그룹의 암컷 생쥐 10마리(Balb/c 6 내지 8주령)들을 FCA/FIA의 피하 경로(subcutaneous route)를 사용하여 면역화시켰다. 1그룹은 MAP8(TT-JY1)이고, 2그룹은 HBsAg-MAP8(TT-JY-1)이었다. 50 및 10㎍의 투여량이 각각 접종되었다.
생쥐들은 0-14-28-40일에 면역화되었고, 36일과 51일째에 채혈되었다. 실시예 1에서 기술된 바와 같이 격리제로서 숙신산 무수물을 사용하여 HBsAg-MAP8(TT-JY1)이 수득되었다.
MAP8(TT-JY1)은 8개 카피의 B-세포 항원결정기, 파상풍균 독소(TT ; tetanus toxin)로부터의 아미노산 830-844 및 HIV-1 JY1 isolate의 gp120의 V3 영역으로부터의 중심의 15 아미노산들을 포함하는 8개 카피의 B-세포 항원결정기들을 포함한다(Cruz, L. J. et. al., 2000, Journal of Peptide Science, 6 ; 217-224).
3회 및 4회 투여 후에, JY1 항원결정기 및 다른 V3 펩티드들에 대한 항체 응답들을 조사하였다. 간접 ELISA 방법에 의하여 BSA에 결합된 펩티드들을 사용하여 혈청들 내의 IgG 응답을 정량하였다(Gomez, C. E. et. al., 1998, J. Virol. Methods, 71 ; 7-1618). 100-1로 희석된 혈청들이 사용되었다.
스튜던트 시험(Student's test)에 의해 통계학적 분석들이 수행되었다. 0.05 이하의 확률값이 통계학적으로 분명한 것으로 고려되었으며, 0.01 이하가 고도로 분명한 것으로 고려되었다.
3회 투여 후, 동형 펩티드에 대한 면역성에 관하여 아무런 차이도 발견되지 않았으며, 이는 결합물의 5배 적은 양으로 여겨진다. 따라서, 결합물을 이용하여 매우 중요한 잇점인 항원의 큰 경제성이 가능하게 된다(도 1A).
교차반응이 없는 MAP8(TT-JY1)으로 접종된 생쥐들에 비해 HBsAg-MAP8(JY1-TT)로 면역화된 그룹에서 다른 V3 펩티드에의 교차반응이 나타났으며, 이는 유사한 수준의 항체 응답이 달성된 것으로 고려되었다.
4회 투여 후, MAP8(TT-JY1)에 비해 HBsAg MAP8(TT-JY1)이 JY1에 대한 보다 높은 응답을 유발시켰다. 몇 몇 교차-반응 항체들이 MAP8(TT-JY1)에서 이끌어내어 졌으며, 이는 HBsAg-MAP8(JY1-TT)와 비교하여 제한적이었다.
여러 항원결정기들에 대한 항체들을 유발시키기 위한 MAP 칵테일들의 사용이 보고된 이래 면역성의 증가는 매우 중요하다. 그러나, 원하는 효과(즉, 중화 등등)를 얻기 위해 요구되는 전체 양은 몇몇 경우에서는 부작용들 때문에 인간에게 접종하는 것이 허용되지 않을 수 있다.
결과적으로, 제한된 양의 항원으로 높은 항체반응을 유발시키는 것이 매우 중요하다. 따라서, 본 방법론에서 기술된 이러한 구조들(즉, MAP-운송단백질 결합 물)의 잇점이 명백하다.
보다 적은 양의 항원을 사용하여 보다 넓은 교차-반응 응답이 유발될 수 있음을 고려하면, 칵테일로 접종하기 위한 가변 항원결정기의 양은 감소될 수 있다. 마지막으로, 상기 운송체가 그 자체로 HBsAg와 같은 보호성 면역원인 경우, 이러한 결합물들의 사용은 2가의 백신의 제조에 접근될 수 있다.
실시예 5 : MAP들(TT-JY1) 및 TAB9으로 면역화된 생쥐들의 체액성 응답의 연구
면역체계(I. S)에 대한 JY1 항원결정기의 발현에 관련된 차이들에 대한 연구에 대하여, 재조합 단백질 TAB9(Duarte, C. A. et. al., 1994, AIDS Res. Hum.. Retroviruses, 10;235-243)은 즉, 차례로 LR150, JY1, RF, MN, BRVA 및 ⅢB 들의, HIV-1 isolate들로부터의 V3 펩티드들을 포함한다. 이들은 하나의 실험에서 비교된 V3 루프의 중앙부 및 MAP8(TT-JY1)들을 포함하는 15 아미노산 길이이다. 이는 TAB9에 포함된 V3 펩티드들에 대한 인식에 대한 연구였으며, JY-1 서열 전체에 걸쳐 Ala 치환된 펩티드들을 사용하여 항원결정기 맵핑(mapping)에 의해 차이점들이 평가되었다.
2그룹의 암컷 생쥐 10마리(Balb/c 6 내지 8주령)들을 FCA/FIA의 피하 경로를 사용하여 TAB9 단백질 100㎍ 및 MAP8(TT-JY1) 16.4㎍으로 면역화시켰다. 두 면역원들의 양은 JY1 항원결정기의 등량으로 정하였다.
생쥐들은 0, 14, 28, 56일에 면역화되었고, 67일째에 채혈되었다. 혈청들 내 의 항-JY1 IgG 응답이 ELISA 방법에 의해 측정되었다.
스튜던트 시험에 의해 통계학적 분석들이 수행되었다. 0.05 이하의 확률값이 통계학적으로 분명한 것으로 고려되었으며, 0.01 이하가 고도로 분명한 것으로 고려되었다.
V3펩티드들에 대한 교차-반응을 연구하기 위하여, 간접 ELISA방법에 의하여 혈청들 내의 IgG 응답을 정량하였다(Gomez, C. E. et. al., 1998, J. Virol. Methods, 71;7-1618). 100-1로 희석된 혈청들이 사용되었다.
셀룰로스 막(cellulose membrane) 상에서의 항원결정기 맵핑은 앞서 기술한 로날드 프랭크(Ronald Frank)에 의해 앞서 기술된 바 있다(Frank, R., 1992, Tetrahedron, 48 ; 9217-9232).
4회 투여 후, 희석된 그룹들로부터의 혈청들이 여러 V3 펩티드들에 대하여 시험되었다. MAP8(TT-JY1)으로 면역화된 생쥐들이 V3 시험들에서 다섯개 중 4개(LR150, RF, MN, BRVA)들이 검출됨이 밝혀졌다. 이들 중 3개(RF, MN, BRVA)들이 강한 반응성인 1.25보다 높은 흡수값(A492㎚)을 나타냈다.
특히, FR 펩티드에 대하여는, A492㎚는 2.5 보다 더 높았다. 앞의 결과들은 면역체계에 대한 B-세포 항원결정기들의 발현들에 대한 MAP들의 잇점들을 나타낸다. 전체 펩티드들을 포함하는 TAB9 단백질의 경우, 시험된 두 펩티드들(RF 및 BRVA)들은 인식되지 않았다.
MN 및 ⅢB 펩티드들은 0.75 이하의 매우 낮은 A492㎚에서 검출되었다. 단지 JY1 및 LR150 펩티드들 만이 매우 높은 A492㎚값들에서 검출되었다. MAP에 의한 면역시스템에 대한 발현이 발현될 면역원들에 포함되지 않은 다른 V3 펩티드들에 대한 교차-반응을 실현하게 된다. 이러한 이유로, 동형의 서열들의 전체를 다룰 수 있는 전략에서 포함될 수 있는 항원들의 양을 최적화시킬 수 있다.
TAB9 단백질에 대한 결과는 재조합 단백질 내의 여러 서열들이 항상 실현될 수 있는 기술적 해결책이 된다는 결론은 아니라는 것을 입증하였다. 실제로, MAP8(TT-JY1)은 보다 양호한 응답을 나타내었다.
면역체계에 대한 항원결정기들의 발현 중에서의 차이들을 찾아내기 위하여, 오버랩핑(overlapping)과 JY-1 서열로부터의 Ala 치환된 펩티드들을 사용하여 항원결정기 맵핑(mapping)이 수행되었다. 2 그룹들로부터의 희석된 혈청들이 동일한 아미노산 서열, LGQALY를 인식한다는 것이 밝혀졌다.
MAP8(TT-JY1)들에 대하여는, 그룹 아미노산 L-Q--Y들이 Abs들과의 상호작용에 직접적으로 포함되었다. 대조적으로, TAB9에 대하여는, 아미노산 L-Q-LY들이 주로 포함되었다. 단지 하나의 아미노산의 미약한 차이가 V3 시험된 펩티드들에 대한 차별 인식의 원인이 되는 것으로 보여진다.
항원결정기들이 두 면역원들에서 서로 다른 3차원 구조들로 나타난다는 것을 추측할 수가 있다. 결론적으로, TAB9 단백질 중의 펩티드들은 MAP에 대한 것과 비교하여 면역 시스템에 대하여 차등적으로 나타났다. 이 실험은 이러한 차등 현시(exposition)은 두 면역원들에서의 교차-반응 프로파일(profile)의 결과를 입 증하였다.
실시예 6 : 면역 시스템에 대한 펩티드 발현의 서로 다른 방법들 중의 면역성 비교
면역 시스템에 대한 펩티드 발현의 서로 다른 방법들의 면역성을 평가하기 위하여, 9그룹의 암컷 생쥐 8마리(Balb/c 6 내지 8주령)들을 접종시켰다. 0-14-28일에 면역화되었고, 최종 면역화 후, 10일째에 채혈되었다. 모든 결과들은 표 2에 요약하였다.
MAP4(TT-JY1)는 4개의 B-세포 항원결정기들(JY1 모두) 및 4개의 T-세포 항원결정기들(TT830-844 모두)을 갖는다. 펩티드(TT-JY1)는 직렬의 B(JY1) 및 T(TT)세포 항원결정기들을 갖는다. 상기의 펩티드의 양쪽 측면들에서 Cys가 첨가된 것으로부터의 중합에 의해 선형 중합체가 합성되었다(Cruz, L. J., et. al., 2000, biotecnologia Aplicada, 17:35-38).
또한, 상기 펩티드는 덱스트란 비드(dextran bead)들의 표면 상에서 합성되었다. HBsAg-펩티드(TT-JY1), HBsAg-MAP4(TT-JY1) 및 HBsAg-MAP8(TT-JY1)들이 앞서 기술된 실시예 1에서의 격리제로서의 숙신산 무수물(AS)을 사용하는 결합에 의해 수득되었으며 HBsAg(9그룹)을 위약효과(placebo)로 첨가하였다. 혈청들 중의 항-JY1 IgG 응답을 ELISA 방법으로 측정하였다.
스튜던트 시험에 의해 통계학적 분석들이 수행되었다. 0.05 이하의 확률값이 통계학적으로 분명한 것으로 고려되었으며, 0.01 이하가 고도로 분명한 것으로 고려되었다.
MAP-HBsAg 결합물들(7그룹 및 8그룹)이 MAP들 및 중합체들과 비교하여 JY1 항원결정기에 대한 분명히 보다 높은 항체 반응을 유도해 내었음이 증명되었다. 앞서의 그룹들은 상기 펩티드(그룹 4)보다 명백하게 우월하였다. 덱스트란-펩티드(그룹 5)(도 3B)는 HBsAg-MAP 결합물과 다르지 않았다. 그러나, 4배 적은 양의 결합물들이 접종되었음이 고려되어야 한다.
이 실험에서 HBsAg에의 MAP들의 결합이 MAP들과 비교하여 JY1 항원결정기에 대한 항체 응답을 명백하게 증가시킴이 증명되었다. MAP들이 운송단백질들에의 펩티드 결합을 피하기 위해 개발되었으며, 결합 후, 면역 응답이 단독으로 접종된 것의 4배 보다 많은 양에 의해 유도된 항체 반응에 대해 향상되었음을 나타내었다. MAP-운송단백질(즉, HBsAg) 결합물들이 시험된 면역원들 중 최고인 것으로 결론되었다.
실시예 7 : 면역 시스템에 대한 합성 펩티드들의 서로 다른 발현 방법들에 의하여 유도되는 교차-반응성의 연구
JY1 펩티드의 서로 다른 발현 방법들에 의해 유도된 교차-반응의 수준을 평가하기 위하여, 서로 다른 면역 스케쥴에 따른 희석된 혈청들을 대략 10-5 항-JY1 역가로 설정하였고, 서로 다른 HIV-1 단리물들로부터의 5가지의 V3 펩티드들의 패 널(panel)로 교차-반응하는 능력을 고려하여 비교하였다.
모든 경우의 그룹의 암컷 생쥐 10마리(Balb/c 6 내지 8주령)들을 100㎕의 용적으로 피하 경로를 사용하여 접종시켰다. 면역화의 전체 스케쥴은 0, 14, 28, 56 및 99일 이었다. 생쥐들은 최종 면역화 후 10일째에 채혈되었다. 모든 그룹들은 5회 접종되지 않았다. 결과들은 표 3에 요약하였다. 동일한 스케쥴 번호를 갖는 그룹들은 동일한 실험으로부터 추출되었다.
이 실험의 결과들은 시험된 면역 시스템들(2그룹, 3그룹, 8그룹 및 9그룹)에 대한 발현의 모든 방법들이 존재하기 때문에, 교차 반응이 JY1 V3 펩티드 그 자체의 특징임을 입증하였다.
게다가, 이러한 교차반응은 시험된 모든 펩티드들(그룹 1, 그룹 2, 그룹 3, 그룹 8 및 그룹 9)(도 4B)에 포함된 면역원에 의해 유도된 응답보다 더 높은 것이 될 것이다.
교차 반응을 고려하면, MAP4(TT-JY1), MAP8(TT-JY1), HBsAg-MAP4(TT-JY1) 및 HBsAg-MAP8(TT-JY1)들은 서로 다르지 않았다. 그러나, 결합물들로 면역화된 생쥐들은 MAP들로 접종된 그룹들과 같이 5회 접종된 대신 4회 접종으로 보다 적은 양의 단백질을 수용함을 주목해야 할 필요가 있다. 4회 투여 후의 MAP들(실시예 4)에 대한 교차반응 분석은 결합물들 보다 낮은 수준을 나타내었으며, 이는 결합 후에 효과가 증가되었음을 입증하는 것이다. 따라서, 이 실험은 실시예 4의 결과를 지지한다.
실시예 8 : 신규 덴드리머-HBsAg 결합물의 면역학적 평가. V3 펩티드들의 혈청 인식
백신 조성물 중의 서로 다른 결합물들 간의 가능한 상호작용을 평가하기 위하여, 그리고 결합물들의 혼합물들의 면역성 및 교차-반응성들에 대한 활성의 향상을 입증하기 위하여, 생쥐들에 대하여 실험이 실행되었다.
10 그룹의 암컷 생쥐 10마리(Balb/c 6 내지 8주령)들을 100㎕의 용적으로 피하 경로를 사용하여 접종시켰다. 면역화 그룹은 다음과 같다. 1그룹:HBsAg-MAP4(V3로부터의 교감 펩티드(consensus peptide), 2그룹:HBsAg-MAP4(gp120으로부터의 CD4 결합 펩티드), 3그룹 : HBsAg-MAP4(V3로부터의 교감 펩티드) 및 HBsAg-MAP4(gp120으로부터의 CD4 결합 펩티드) 결합물들의 혼합물, 4그룹 : HBsAg-MAP4(V3 서열들의 펩티드 라이브러리), 5그룹 : HBsAg-MAP4(V3 서열들의 펩티드 라이브러리) 및 HBsAg-MAP4(gp120으로부터의 CD4 결합 펩티드) 결합물들의 혼합물.
펩티드 서열들은 표 5에 요약시켰다. 10㎍의 투여량들이 1그룹, 2그룹 및 4그룹들에 접종되었으며, 3그룹과 5그룹들에는 매 결합물에 단지 5㎍이 접종되었다. 생쥐들은 0, 14, 28, 56 및 84일에 면역화 되었다. 이들은 최종 면역화 후 10일째에 채혈되었다. 결과들은 표 4에 요약되었다.
교차-반응 Abs들이 셀룰로오스 막(cellulose membrane) 상에서 합성된 서로 다른 HIV-1 isolates 들로부터의 50 V3 펩티드들의 패널에 대하여 연구되었다. 또한, 도 1의 실시예에서 이미 실험된 5개의 펩티드들에 대해 ELISA 방법에서 교차-반응 Abs들이 평가되었다. 매 그룹으로부터 1/100으로 희석된 혈청들이 사용되었 다.
동형 펩티드, gp120으로부터의 CD4 결합 펩티드 및 V3 서열들의 펩티드 라이브러리에 대한 항 IgG 응답을 결정하는 ELISA 방법에 의해 혈청들 내에서의 항체 응답들이 측정되었다.
스튜던트 시험에 의해 통계학적 분석들이 수행되었다. 0.05 이하의 확률값이 통계학적으로 분명한 것으로 고려되었으며, 0.01 이하가 고도로 분명한 것으로 고려되었다.
5회 투여 후, HBsAg-MAP4(V3 서열들의 펩티드 라이브러리) 및 HBsAg-MAP4(V3로부터의 동형 펩티드) 그룹들 중의 동형 펩티드들에 대한 항체 응답들은 매우 약하였다(표 6).
HBsAg-MAP4(V3 서열들의 펩티드 라이브러리)로 면역화된 생쥐들로부터 모아진 혈청들이 MAP(V3로부터의 동형 펩티드)나 BSA에 결합된 동형 펩티드들 뿐만 아니라 시험된 어떠한 V3 펩티드들과도 반응하지 않음을 주목하는 것은 흥미롭다. 그러나, HBsAg-MAP4(gp120으로부터의 CD4 결합 펩티드) 및 HBsAg-MAP4(V3 서열들의 펩티드 라이브러리)의 혼합물로 접종된 그룹에서 동형 펩티드 및 MAP4(V3 서열들의 펩티드 라이브러리)에 대한 높은 항체 반응이 나타났다.
HBsAg-MAP4(gp120으로부터의 CD4 결합 펩티드)로 면역화된 생쥐들로부터의 혈청들이 이들 펩티드들의 어느 것과도 반응하지 않기 때문에, 이러한 응답들은 항-CD4 결합 펩티드 Abs의 동형은 아니다. 따라서, 결합물들의 혼합물에서의 상승적 효과 때문에, 동형 펩티드 및 V3 라이브러리에 대한 항체 응답들이 향상되었다. 계속해서, 상기 MAP4(gp120으로부터의 CD4 결합 펩티드)는 단독으로 접종된 결합물들과 비교하여 혼합물에서 2배 적은 양의 면역원을 사용하여 보다 강한 항-V3 응답에 대한 면역 증강 효과를 갖는다. 동일한 상승적 효과는 HBsAg-MAP4(V3로부터의 동형 펩티드) 및 HBsAg-MAP4(gp120으로부터의 CD4 결합 펩티드) 그룹 중에서 존재한다.
이 실험은 결합물들(3그룹 및 5그룹)의 혼합물들로 면역화된 생쥐들이 조성 중에 포함된 B-세포 항원결정기들에 대해 Abs를 전개하였다는 것이 증명되었다(표 6). 이들 결합물들은 개별적으로 제조되었으며, 계속해서 개개 비율들에서의 차이들을 피하기 위하여 혼합되었다. 이러한 이유로 3개의 서로 다른 결합물들의 혼합물들이 항-펩티드 항체 응답들의 유사한 수준들로 개발되었다.
단독으로 면역화된 것에 비교하여 HBsAg-MAP4(V3로부터의 동형 펩티드) 및 HBsAg-MAP4(V3 서열들의 펩티드 라이브러리)들이 CD4 결합 펩티드와 함께 혼합되어 접종되었을 때, 항-동형 펩티드 및 항-펩티드 라이브러리 항체 응답들이 명백하게높아졌다.
도 5b(그래픽 1 및 그래픽 2)에서 나타난 바와 같이 항-동형 응답이 증가되었고, 항-펩티드 라이브러리가 매우 중요한 수준으로 나타났다. 게다가, 혼합물 중에서 개개 결합물들에 대한 투여량의 절반이 접종되었다.
이러한 결과는 MAP4(gp120으로부터의 CD4 결합 펩티드)를 갖는 조성물 중의 항-V3 응답을 향상시키는 것이 가능하다는 것을 입증하였다(도 5, 그래픽 1 및 그래픽 2).
교차-반응성의 증가가 항-V3 펩티드 ELISA들에 의해 증명되었다. 이 실험으로부터의 혈청들이 도 1에서 이미 기술된 TAB9 단백질 중의 V3 펩티드들의 패널에 대해 시험되었다. 동형 및 CD4 펩티드들 사이에서의 상호작용을 고려하면, CD4 펩티드에 의해 유발된 교차-반응 Abs 및 HBsAg-MAP4(gp120으로부터의 CD4 결합 펩티드)의 증강효과에 의해 증가된 동형 펩티드의 정규 반응성들로 인하여 상기 혼합물이 높은 역가들을 유발한다는 것이 입증되었다.
게다가, 50 V3 펩티드들의 패널에 대한 4회 및 5회 투여 후에 3그룹 및 5그룹들로부터 모여진 혈청들이 분석되었다. 5그룹(HBsAg-MAP4(V3 서열들의 펩티드 라이브러리) 및 HBsAg-MAP4(gp120으로부터의 CD4 결합 펩티드) 결합물들의 혼합물의 경우에서, 4회 투여 후, 시험된 펩티드의 26%(13/50)가 인식되었다.
5회 투여 후에는 그 백분율은 30%(15/50)으로 된다. 4회 투여 후 인식된 펩티드들의 53%(7/13)가 매우 강한 반응성을 가졌으며, 5회 투여 후, 그들 중46%(7/15)가 매우 강한 반응성을 가졌다.
3그룹(HBsAg-MAP4(V3로부터의 동형 펩티드) 및 HBsAg-MAP4(gp120으로부터의 CD4 결합 펩티드)의 혼합물은 4회 투여 후, 펩티드들의 72%(36/50)가 반응하였으며, 5회 투여 후에는 92%(46/50)가 반응하였다.
4회 투여 후, 인식된 펩티드들의 50%(18/36)가 매우 강한 반응성을 가졌으며, 5회 투여 후, 그들 중 48%(22/46)가 매우 강한 반응성을 가졌다.
H BsAg-MAP4(V3로부터의 동형 펩티드) 및 HBsAg-MAP4(gp120으로부터의 CD4 결합 펩티드) 혼합물은 펩티드 라이브러리와의 유사한 혼합물보다 더 넓은 교차-반응 응답을 유발하였다는 결론을 얻었다. 동형 펩티드가 50 펩티드들의 패널 중의 모든 위치에서 보다 빈번한 아미노산들의 선택으로부터 창조되었고, 라이브러리가 동일한 패널로부터 생성되었기 때문에, 본 발명자들은 교차-반응 항체들을 유발하는 가장 좋은 전략은 상승적 효과를 갖는 다른 결합물에 더해 운송단백질에 결합된 동형 펩티드의 MAP의 혼합물을 포함하는 조성이라는 결론을 내렸다.
실시예 9 : 선형 V3(JY1) 펩티드와 서로 다른 운송단백질들에 결합된 MAP에 의해 생성된 면역 응답의 비교
면역성 및 교차 반응성에 대한 서로 다른 운송단백질에의 덴드리머성 구조(MAP들의 경우에서)의 결합의 효과를 연구하기 위하여, 선형 JY1 펩티드 및 그의 MAP 구조를 서로 다른 운송단백질들(HBsAg, KLH, P64k)에 결합시켰다.
펩티드와 MAP를 서로 다른 운송단백질들에 결합시키기 위하여 5그룹과 9그룹들에서 사용되었던 숙신산 무수물의 방법이 사용되었다. 10그룹의 MAP는 결합제로서 MPS를 사용하여 HBsAg에 결합시켰다.
9 그룹의 암컷 생쥐 8마리(Balb/c)들을 0-14-28-56일에 면역화 되었으며, 채혈은 최종 면역화 후 10일째에 수행되었다. 면역화 그룹들, 투여량 및 부형제들을 표 8에 나타내었다.
혈청 중 JY1 펩티드에 대한 IgG에 대해 ELISA 방법에 의해 항체 응답이 정량화되었다. 교차 반응성은 또한 실시예 5에서 기술된 바와 같이 펩티드들의 패널을 사용하여 ELISA 방법에 의해 평가되었으며, 더욱이 대조군으로서 연관되지 않은 펩 티드가 사용되었다.
스튜던트 티 시험(Student t test)에 따른 변화 동질성을 분석하기 위한 시험 F(test F)가 상기 결과들을 분석하는데 사용되었다. p<0.05의 값들이 통계학적으로 서로 다른 것으로 고려되었으며, p<0.01의 값들이 고도로 분명한 것으로 고려되었다.
단백질-MAP들에 대한 항체 응답이 펩티드-단백질들의 결합물(도 6B)에 의해 생성된 응답에 비해 모든 경우에서 우월하였다. HBsAg-MAP8(TT-JY1)에 대한 응답은 KLH-MAP8(TT-JY1)의 응답과 유사하였으며, 두가지 모두는 P64k-MAP8(TT-JY1) 결합물로 얻어진 응답에 비해 우월하였다. 반면에, MAP들의 결합물들에 대한 항체 응답들 또한 MAP들 단독에 의해 생성된 것에 비해 명백하게 우월하였다(p<0.05).
P64k-MAP8(TT-JY1)의 경우를 제외하고는, 이 결합물 중의 항원의 전체 양이 낮다는 것을 지적하는 것은 매우 중요하다. 이들 결과들은 면역 응답을 충분히 향상시키는 것을 제외하고, 운송단백질들에 결합된 덴드리머성 구조들의 사용이 사용할 면역원의 전체 양을 최적화하고, 가능하게 하는 것을 입증한다.
적어도 2가지 이상의 이형 V3 펩티드들(heterologous V3 peptides)에 대한 모든 결합물들을 면역화 하는 교차 반응성이 관측되었고, 3회 및 4회 투여 후 교차 반응성이 증가하였다(도 6C). 더욱이, 결합되지 않은 것들과 비교하여 MAP들에 결합된 것에 대해 교차 반응성이 명백하게 우월함을 입증할 수 있었다(도 6C).
실시예 10 : 덴드리머성 구조들에 대한 서로 다른 V3 단리물을 사용하는 면 역화 후 혈청들내의 면역성 및 교차 반응성의 결정
면역성 및 교차 반응에서 발견된 효과의 증가가 선택된 V3 서열들에 따르지 않는 다는 것을 증명하기 위하여, V3 단리물에 따른 서로 다른 V3 펩티드의 덴드리머성 구조들로의 면역화 후에 측정되었다. RF 펩티드의 서열이 표 1, 도 1에 기술되었다.
8 내지 10주령의 암컷 생쥐(Balb/C)들을 0, 14 및 28일에 면역화 되었으며, 채혈은 면역전 및 3회 투여 후에 수행되었다. 접종된 항원들은 MAP8(TT-RF)이었고, 덴드리머성 구조는 앞서 실시예 1에서 기술된 바와 같이 숙신산 무수물 결합제로 사용하여 RF-기초 MAP를 HBsAg에 결합시켜 수득하였다. 사용된 투여량은 각각 40㎍ 및 10㎍ 이었다.
도 7에서 명백하게 관찰된 바와 같이, MAP와 마찬가지로 HBsAg에 결합된 덴드리머성 구조 두가지 모두 명백한 교차 반응 수준들이 나타났으며, 통계학적 분석 후에 HBsAg-MAP8(TT-RF)의 덴드리머성 결합물로 면역화된 그룹으로부터의 혈청들에 대해 면역성 및 교차 반응성에서 명백한 증가가 입증되었다.
실시예 11 : 운송단백질들에 결합된 서로 다른 MAP들의 면역학적 분석
운송단백질들에 공유결합된 서로 다른 MAP들의 면역성에 대한 강화 효과를 연구하기 위하여, 테트라머성(tetrameric) MAP들과 그에 대응하는 선형의 펩티드들이 합성되었다.
MAP4(MN)와 MN 펩티드는 OMP P1.15로 부터 유도된 루프4, 나이세리아 메닝기티디스의 스트레인(strain) B385로부터의 유도된 항원결정기를 포함한다(HYTRQNNADVFVPAVVG).
MAP4-(D) 및 D 펩티드는 뎅기열 2 바이러스 preM/M 단백질로부터 유도된 항원결정기를 포함한다(LTTRNGEPHMIVSRQEKGKSLL FKTGDGVG).
MAP4-(NM) 및 MN 펩티드들이 커플링제로서 베타-말레이미도프로피온산-N-히드록시 숙신산의 에스테르를 사용하여 운송단백질들 KLH 및 P64k에 결합되었다. 결합의 반응은 pH 6에서 30분 동안 DMF 내의 인산염 완충제 50mmol/ℓ중의 과량의 격리제로의 유도에 의해 수행되었다. MPS의 초과분은 투석에 의해 제거되었다. MAP4-(NM) 및 MN 펩티드의 합성 동안에, -SH기를 발생시키는 시스테인(cystein)이 가해졌다. 말레이미드(maleimide)로 유도된 단백질들은 동시적으로 실온에서 3시간 동안 대응 펩티드들 및 MAP들에 유리 티올기들에 반응시켰다. 이들 결합물들의 정제는 겔 여과 크로마토그래피에 의해 수행되었다.
MAP4-(D)의 경우에, 가용성 카르보디이미드의 직접 방법을 사용하여 D 펩티드들을 KLH 및 P64k 단백질들에 결합시켰다. MAP4-(D)와 D 펩티드는 C-말단에 운송단백질들(KLH 및 P64k)로부터의 아민기들에의 직접적인 결합을 가능하게 하는 카르복실기를 포함한다.
서로 다르게 결합된 MAP들의 면역성을 평가하기 위하여, 12 그룹의 암컷 생쥐 8마리(Balb/c)들을 피하 경로를 사용하여 면역화시켰다. 접종은 0-14-28일에 이루어졌다. 생쥐들은 최종 접종 후 10일째에 채혈되었다. 면역화 그룹들, 투여량 및 부형제들을 표 8에 나타내었다.
혈청들 내에서 대응하는 펩티드에 대한 전체 IgG를 결정하기 위하여 ELISA 방법에 의해 항체 응답을 정량화하였다.
스튜던트 티 시험에 따른 변화 동질성을 분석하기 위한 시험 F(test F)가 상기 결과들을 분석하는데 사용되었다. p<0.05의 값들이 통계학적으로 서로 다른 것으로 고려되었으며, p<0.01의 값들이 고도로 분명한 것으로 고려되었다.
도 8B에서와 같이, KLH-MAP4-(D) 및 P64k-MAP4-(D) 결합물들에 대응하는 보다 높은 역가들이 관측되었다. 모든 경우들에서, 단백질-MAP들 결합물들의 역가들은 명백하게 단백질-펩티드들의 결합물들 보다 더 높았으며, 이는 MAP들 단독으로 면역화된 그룹들의 유사한 세기의 응답들이 달성되었다.
이 실험으로부터, 서로 다른 병원균들의 서열들을 포함하는 덴드리머성 구조들의 운송단백질들에의 결합이 선택된 펩티드들에 대한 그 결과의 면역성에 대한 명백한 증가가 가능하다는 것으로 결론되었다.
실시예 12 : 덴드리머성 결합물을 사용하는 비강 면역화 후의 교차 반응성의 연구
비강 면역화 후 높은 교차 반응성과 함께 항체 응답들의 형성을 입증하기 위하여, 수 그룹의 암컷 생쥐 8마리(Balb/c, 10 내지 12주령)들을 (TT-JY1) MAP8에 결합된 HBsAg 10㎍으로 접종시켰다.
대조군으로서, (TT-JY1) MAP8 40㎍이 적용된 8마리의 생쥐들의 그룹들을 사용하였으며, 두 면역원들에 대한 항체 응답이 JY1 펩티드에 대한 전체 IgG에 대하 여 ELISA 방법에 의해 평가되었으며, 또한 5개의 V3 펩티드들에 대한 교차 반응성을 분석하였다.
대조군이 감지할 수 있는 항 JY1 응답을 생성하지 못한 것과는 달리 HBsAg-MAP8(TT-JY1) 결합물로 면역화된 그룹은 모든 경우들에서 100%로 동형 펩티드에 대한 강한 응답들을 생성하였으며, 또한 상기 패널로부터 2 펩티드들 이상에 대하여 교차 반응성 응답이 발견되었으며, 이는 접종수에 따라 증가한다.
이들 결과들은 수득되는 결과들에 대한 결합의 결정적인 역할인 결합된 MAP에 대한 면역 응답을 증가시킨 항원 입자화의 특성을 입증하였다. 더욱이, 혈청들 및 점액상의 표면들에서의 점액상의 면역화 후 처음으로 강한 면역 응답을 입증할 수 있었다.
운송단백질들로서 B형 간염 및 C형 간염 바이러스들로부터 및 뎅기열 바이러스로부터의 코어 항원들을 사용하여 실시예 2 및 실시예 3들에 따라 동일한 결과들의 다른 덴드리머들이 준비되었다.
더욱이, 이미 언급된 항원들에 결합된 덴드리머성 구조의 합성부분으로서 고나도트로핀 방출 호르몬으로부터의 펩티드를 사용하는 경우, 펩티드들 단독으로 면역화된 대조군 및 면역화되지 않은 생쥐들에 비해 생식선(gonad)들의 크기가 명백하게 감소함을 주목하였다.
실시예 13 : 높은 수준의 교차 반응성을 갖는 혈청들을 사용하여 얻어진 서로 다른 HIV-1 isolate들의 교차 중화에 대한 분석
V3 루프에 대한 높은 교차 반응성을 갖는 혈청들의 교차 중화를 평가하기 위하여, HIV-1으로부터의 서로 다른 실험 isolate들을 사용하여 시험관내 분석이 수행되었다.
이들 분석들에 대하여는, 모여진 혈청들 즉, HBsAg-MAP8(TT-JY1)(실시예 4), HBsAg-MAP8(TT-RF)(실시예 10) 및 HBsAg-MAP4(CD4)와 HBsAg-MAP4(동형)의 혼합물(실시예 8)이 그들의 교차 반응성의 수준을 고려하여 선택되었다.
이들 연구들은 각 항원에 의하여 유발된 항체 응답이 이형 단리물들의 중화 효과를 유발하는 능력을 가짐을 보여주고 있다.
이는 또한 CD4와의 혼합물이 교차 중화의 수준 향상을 입증하고 있다. 단일의 펩티드 또는 그들의 결합물들은 감지할 만한 교차 중화를 발생시키지 않는다.
실시예 14 : 서로 다른 핵(nucleus)을 사용하는 덴드리머성 구조들의 합성
분자 단위 당 B 항원결정기의 수를 증가시키기 위하여, 간접 합성은 핵과 펩티드들의 개별적인 합성들로 이루어진다. 이 시스템은 큰 서열들의 합성에 따른 실수들을 피하고, 적절하게 기능화된 핵에의 B 및 T 항원결정기들의 보다 높은 결합을 가능하게 한다.
덴드리머성핵의 합성은 활성화제(activator)로서 diciclohexilcaribodiimide(DCC)를 사용하는 1,6-디아미노헥산(1,6-diaminohexano)의 아미노기의 Boc-Lys(Boc)-OH 아미노산의 카르복실, 카르복실기와의 반응에 의해 수행되었다.
그 후, 디클로로메탄(DCM) 내의 트리플루오로아세트산(trifluoacetic acid ; TFA) 37%로 탈보호(desprotection)가 이루어져, 4 반응성 말단들을 갖는 핵을 수득하고, 16 아미노 반응 말단들을 갖는 핵을 얻기 위한 반응들의 동일한 반복을 사용하는 덴드리머화와 Boc-Lys (Boc)-OH에 대한 2차 및 3차 수준의 커플링의 4의 가능성(tetravalent possibility)들을 수득하였다.
그 후, 이들 그룹들과 브로모아세트산(bromoacetic acid)의 카르복실기와의 사이에서 반응을 시켰다. 핵은 C8 컬럼을 사용하여 RP-HPLC에 의해 정제되었다. C-말단에 시스테인을 포함하는 JY1 펩티드가 앞서 합성되었으며, 이는 수득된 핵과 적절한 비율로 반응한다.
핵으로부터의 헤테로원자 그룹과 시스테인으로부터의 티올그룹 사이에서의 상호작용에 의해 형성된 티오에테르(tioether)는 염기성 조건들(pH 8 내지 9)에서 수행되었다(도 9). 결합의 정도는 SDS-PAGE 및 겔 여과 크로마토그래피에 의해 결정되었으며, 40 내지 50kD 사이에서 덴드리머성 펩티드들이 얻어졌다.
전술한 실시예 2에서의 커플링제를 사용하여 덴드리머성 구조가 서로 다른 운송단백질들에 결합되었다. 그 결과의 단백질과 MAP들에 의해 구성된 덴드리머성 구조들은 계속해서 서로 다른 면역화 스케쥴에서 사용되어, 면역성 및 교차 반응성에서 그들의 우월성이 입증되었다.
이 시스템은 예를 들면 개별적으로 제조된 여러 B-펩티드 및 T-펩티드들이 적절히 관능화된(4-6H) 하나의 독특한 매트릭스(matrix) 내에서 결합될 수 있는 것과 같은 서로 다른 잇점들을 제공한다.
항원성 펩티드들은 합성될 수 있고, 또한 필요에 따라 개별적인 결정자들의 정제를 가능하게 하고, 또한 길이가 긴 서열들의 합성에 따른 실수들을 회피할 수 있도록 C- 및 N-말단들을 통해 결합될 수 있다.
따라서, 본 발명은 의약분야, 특히 교차 반응성(cross reactivity)을 가능하게 하는 신규의 항원성 구조에 기초한 백신화된 조성물들을 제공하는 효과가 있다.
SEQUENCE LISTING <110> CENTRO DE INGENIERIA GENETICA Y BIOTECNOLOGIA <120> Method for obtaining ANTIGENic structures of high cross REACTIVITY AND their use in formulations <130> crossreactividad <140> PCT/CU01/00007 <141> 2001-11-01 <150> CU 2000-0242 <151> 2000-11-03 <160> 59 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <223> V3 peptide <300> <400> 1 Arg Gln Ser Thr Pro Ile Gly Leu Gly Gln Ala Leu Tyr Thr Thr 1 5 10 15 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> v3 peptide <400> 2 Arg Gln Ser Thr Pro Ile Gly Leu Gly Gln Ala Leu Tyr Thr Thr 1 5 10 15 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> v3 peptide <400> 3 Ser Ile Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile 1 5 10 15 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> v3 peptide <400> 4 Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr 1 5 10 15 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> v3 peptide <400> 5 Ser Arg Gly Ile Arg Ile Gly Pro Gly Arg Ala Ile Leu Ala Thr 1 5 10 15 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> v3 peptide <400> 6 Arg Lys Ser Ile Thr Lys Gly Pro Gly Arg Val Ile Tyr Ala Thr 1 5 10 15 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> v3 peptide <400> 7 Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala 1 5 10 15 <210> 8 <211> 24 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(24) <223> v3 peptide <400> 8 Lys Ser Val Arg Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Asp 1 5 10 15 Ile Ile Gly Asp Ile Arg Gln Ala 20 <210> 9 <211> 24 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(24) <223> v3 peptide <400> 9 Lys Xaa Xaa Xaa Ile Gly Pro Gly Gln Xaa Phe Tyr Ala Thr Gly Xaa 1 5 10 15 Ile Ile Gly Xaa Ile Arg Gln Ala 20 <210> 10 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 10 Ser Val His Met Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asp Ile Arg Gln 20 <210> 11 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 11 Ser Val His Met Gly Pro Gly Lys Thr Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asp Ile Arg Gln 20 <210> 12 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 12 Ser Met Arg Ile Gly Pro Gly Gln Thr Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asp Ile Arg Gln 20 <210> 13 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 13 Ser Ile Arg Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asp Ile Arg Gln 20 <210> 14 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 14 Ser Ile His Ile Ala Pro Arg Gln Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Ala Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asp Ile Arg Gln 20 <210> 15 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 15 Ser Val Arg Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asp Ile Arg Gln 20 <210> 16 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 16 Ser Val Asn Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asp Ile Arg Gln 20 <210> 17 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 17 Gly Val His Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Arg Gly Asp Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asp Ile Arg Gln 20 <210> 18 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 18 Ser Leu Arg Ile Gly Pro Gly Gln Thr Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asp Ile Arg Gln 20 <210> 19 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 19 Ser Val His Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asp Ile Arg Gln 20 <210> 20 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 20 Ser Val Arg Ile Gly Pro Gly Gln Thr Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asp Ile Arg Gln 20 <210> 21 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 21 Gly Ile His Ile Gly Pro Gly Ser Ala Ile Tyr Ala Thr Gly Asp Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asp Ile Arg Gln 20 <210> 22 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 22 Gly Ile His Ile Gly Pro Gly Gln Thr Phe Tyr Ala Thr Gly Glu Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asn Ile Arg Gln 20 <210> 23 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 23 Ser Val Arg Ile Gly Pro Gly Gln Thr Phe Tyr Ala Thr Gly Ala Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asp Ile Arg Gln 20 <210> 24 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 24 Ser Val Arg Ile Gly Pro Gly Gln Thr Phe Tyr Ala Ala Gly Asp Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asp Ile Arg Gln 20 <210> 25 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 25 Ser Val Arg Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asp Thr Arg Gln 20 <210> 26 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 26 Ser Ile His Phe Gly Pro Gly Gln Thr Leu Tyr Ala Thr Gly Asn Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asp Ile Arg Gln 20 <210> 27 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 27 Ser Ile Arg Ile Gly Ser Gly Gln Thr Ser Tyr Ala Thr Gly Asp Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asn Ile Arg Glu 20 <210> 28 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 28 Gly Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Gln Ile 1 5 10 15 Thr Gly Asp Ile Arg Gln 20 <210> 29 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 29 Ser Ile Arg Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asn Ile Arg Gln 20 <210> 30 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 30 Ser Ile His Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asn Ile Arg Gln 20 <210> 31 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 31 Ser Ile Arg Ile Gly Pro Gly Gln Thr Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asn Ile Arg Gln 20 <210> 32 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 32 Ser Ile Arg Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile 1 5 10 15 Thr Gly Asp Ile Arg Gln 20 <210> 33 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 33 Ser Ile His Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Thr Ser Asp Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asp Ile Arg Gln 20 <210> 34 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 34 Ser Ile Arg Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Thr Thr Gly Asp Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asp Ile Arg Gln 20 <210> 35 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 35 Ser Val His Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asn Ile Arg Gln 20 <210> 36 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 36 Ser Ala Asn Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Glu Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asp Ile Arg Gln 20 <210> 37 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 37 Gly Ile His Ile Gly Pro Gly Gln Ser Phe Tyr Ala Thr Gly Ser Ile 1 5 10 15 Val Gly Asn Ile Arg Gln 20 <210> 38 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 38 Ser Ile Arg Ile Gly Pro Gly Gln Thr Phe Tyr Ala Thr Gly Glu Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asn Ile Arg Gln 20 <210> 39 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 39 Gly Val His Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asp Ile Arg Gln 20 <210> 40 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 40 Ser Ile Arg Ile Gly Pro Gly Gln Ser Phe His Ala Thr Gly Asp Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asp Ile Arg Gln 20 <210> 41 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 41 Ser Val His Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Val 1 5 10 15 Ile Gly Asp Ile Arg Gln 20 <210> 42 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 42 Gly Val Arg Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Gly Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asp Ile Arg Gln 20 <210> 43 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 43 Ser Val His Ile Gly Pro Gly Gln Thr Ser Tyr Ala Thr Gly Asp Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asp Ile Arg Gln 20 <210> 44 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 44 Ser Ile His Leu Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asp Ile Arg Gln 20 <210> 45 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 45 Ser Val Arg Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asn Ile Arg Gln 20 <210> 46 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 46 Ser Val His Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Arg Gly Asp Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asp Ile Arg Gln 20 <210> 47 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 47 Ser Ile His Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Arg Gly Asp Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asn Ile Arg Gln 20 <210> 48 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 48 Ser Val His Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Glu Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asp Ile Arg Gln 20 <210> 49 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 49 Ser Val Arg Ile Gly Pro Gly Gln Thr Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asn Ile Arg Gln 20 <210> 50 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 50 Ser Val His Ile Gly Pro Gly Lys Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Gly Ile 1 5 10 15 Val Gly Asp Ile Arg Gln 20 <210> 51 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 51 Ser Val His Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Ala Ile 1 5 10 15 Ile Gly Ser Ile Arg Gln 20 <210> 52 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 52 Ser Ile Gly Ile Gly Pro Gly Gln Thr Phe Tyr Ala Ala Asp Asn Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asp Ile Arg Gln 20 <210> 53 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 53 Ser Val Arg Ile Gly Pro Gly Gln Ser Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asp Ile Lys Gln 20 <210> 54 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 54 Ser Ile Ser Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Phe Ala Thr Gly Asp Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asp Ile Arg Gln 20 <210> 55 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 55 Gly Ile His Met Gly Pro Gly Gln Ile Leu Tyr Ala Thr Gly Ser Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asp Ile Arg Gln 20 <210> 56 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 56 Ser Ile Arg Ile Gly Pro Gly Gln Val Phe Tyr Thr Asn Gly Asp Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asp Ile Arg Gln 20 <210> 57 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 57 Ser Ile His Ile Ala Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Ala Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asp Ile Arg Gln 20 <210> 58 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 58 Gly Ile His Leu Gly Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Thr Asn Ala Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asp Ile Arg Gln 20 <210> 59 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> v3 peptide <400> 59 Ser Ile His Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asp Ile Arg Gln 20

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  47. 다음 단계를 포함하는 항원을 수득하는 방법:
    A) 인간 면역결핍 바이러스 1 또는 2, 고나도트로핀 방출 호르몬, 뎅기열 바이러스 또는 나이세리아 메닝기티디스의 세번째 가변영역(V3)으로부터 유래된 항원결정기 중에서 선택한 하나 또는 그 이상의 항원결정기를 선택하는 단계;
    B) 선택된 항원결정기를 아스파르트산 또는 라이신의 덴드리머성 핵에 결합시켜 덴드리머성 구조를 갖는 항원결정기를 포함하는 다중-항원 펩티드를 수득하는 단계;
    C) 숙신산 무수물 또는 베타-말레이미도프로피온산-N-히드록시 숙신산(MPS)을 사용하여 B형 간염 표면 항원, HBV 뉴클레오캡사이드 항원(HBcAg), KLH 및 나이세리아 메닝기티디스로부터의 p64K 단백질 중에서 선택한 하나 또는 그 이상의 운송분자에 수득한 다중-항원 펩티드를 결합시키는 단계.
  48. 다음 단계를 포함하는 항원을 수득하는 방법:
    A) 인간 면역결핍 바이러스 1 또는 2, 고나도트로핀 방출 호르몬, 뎅기열 바이러스 또는 나이세리아 메닝기티디스의 세번째 가변영역(V3)으로부터 유래된 항원결정기 중에서 선택한 하나 또는 그 이상의 항원결정기를 선택하는 단계;
    B) 선택된 항원결정기를 아스파르트산 또는 라이신의 덴드리머성 핵에 결합시켜 덴드리머성 구조를 갖는 항원결정기를 포함하는 다중-항원 펩티드를 수득하는 단계;
    C) 숙신산 무수물 또는 베타-말레이미도프로피온산-N-히드록시 숙신산(MPS)을 사용하여 B형 간염 표면 항원, HBV 뉴클레오캡사이드 항원(HBcAg), KLH 및 나이세리아 메닝기티디스로부터의 p64K 단백질 중에서 선택한 하나 또는 그 이상의 운송분자에 수득한 다중-항원 펩티드를 결합시키는 단계 ; 및
    D) 서열 KQIINMWQEVGKAMYA를 갖는 CD4 결합 펩티드를 아스파르트산 또는 라이신의 덴드리머성 핵에 결합시켜 덴드리머성 구조를 갖는 펩티드를 포함하는 결합물을 수득한 후 이 결합물을 C)의 단계에서 수득된 다중 항원 펩티드에 첨가하는 단계.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 다음의 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법:
    E) D)의 단계에서 결과적으로 생성된 제형을 부형시키는 단계.
  50. 제47항 또는 제48항에 있어서, 뎅기열 바이러스로부터 유래된 항원결정기는 LTTRNGEPHMIVSRQEKGKSLLFKTGDGVG로 구성된 항원결정기임을 특징으로 하는 방법.
  51. 제47항 또는 제48항에 있어서, 나이세리아 메닝기티디스로부터 유래된 항원결정기는 HYTRQNNADVFVPAVVG로 구성된 항원결정기임을 특징으로 하는 방법.
  52. 제47항 또는 제48항에 있어서, 운송분자는 Th 항원결정기를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  53. 제47항 또는 제48항에 있어서, 활성화제로서 디클로헥실칼보디이미드(DCC)를 사용하여 아미노산 Boc-Lys(Boc)-OH의 카르복실기와 1,6 디아미노핵산을 반응시키는 단계를 포함하는 합성방법에 의해 덴드리머성 핵을 제조함을 특징으로 하는 방법.
  54. 다음을 포함하는 항원:
    a) 인간 면역결핍 바이러스 1 또는 2, 고나도트로핀 방출 호르몬, 뎅기열 바이러스 또는 나이세리아 메닝기티디스의 세번째 가변영역(V3)으로부터 유래된 항원결정기를 포함하는 하나 또는 그 이상의 항원결정기 및 아스파르트산 또는 라이신의 덴드리머성 핵을 포함하는 덴드리머성 구조를 갖는 다중-항원 펩티드, 여기에서 에피토프는 아스파르트산 또는 라이신의 덴드리머성 핵과 결합한 것임 ;
    b) B형 간염 표면 항원, KLH 및 나이세리아 메닝기티디스로부터의 p64K 단백질 중에서 선택한 하나 또는 그 이상의 운송분자 ; 및
    c) 다중-항원 펩티드를 운송분자에 결합시키는 숙신산 무수물 또는 베타-말레이미도프로피온산-N-히드록시 숙신산(MPS) 중에서 선택한 하나 또는 그 이상의 스페이서.
  55. 다음 A) 및 B)를 포함하는 백신 제형:
    A) 다음을 포함하는 항원:
    a) 인간 면역결핍 바이러스 1 또는 2, 고나도트로핀 방출 호르몬, 뎅기열 바이러스 또는 나이세리아 메닝기티디스의 세번째 가변영역(V3)으로부터 유래된 항원결정기를 포함하는 하나 또는 그 이상의 항원결정기 및 아스파르트산 또는 라이신의 덴드리머성 핵을 포함하는 덴드리머성 구조를 갖는 다중-항원 펩티드, 여기에서 에피토프는 아스파르트산 또는 라이신의 덴드리머성 핵과 결합한 것임 ;
    b) B형 간염 표면 항원, KLH 및 나이세리아 메닝기티디스로부터의 p64K 단백질 중에서 선택한 하나 또는 그 이상의 운송분자 ; 및
    c) 다중-항원 펩티드를 운송분자에 결합시키는 숙신산 무수물 또는 베타-말레이미도프로피온산-N-히드록시 숙신산(MPS) 중에서 선택한 하나 또는 그 이상의 스페이서 ; 및
    B) 아스파르트산 또는 라이신의 덴드리머성 핵과 서열 KQIINMWQEVGKAMYA를 갖는 CD4 결합 펩티드가 결합한 덴드리머성 구조를 갖는 결합물.
  56. 제55항에 있어서, 아쥬반트 백신 제형임을 특징으로 하는 백신 제형.
  57. 제54항에 있어서, 운송분자는 Th 항원결정기를 포함함을 특징으로 하는 항원.
  58. 제55항에 있어서, 운송분자는 Th 항원결정기를 포함함을 특징으로 하는 백신 제형.
  59. 제54항 또는 제57항의 항원을 포함하는 HIV 1, HIV 2, HCV, HBV, 뎅기열 바이러스(Dengue virus) 또는 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)에 의해 발생하는 감염성 질병들, 자가면역 또는 암 진단용 조성물.
  60. 제55항, 제56항 및 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 전신 또는 점막 투여를 위한 백신 제형.
  61. 제55항, 제56항 및 제58항 중 어느 한 항에 있어서, HIV 1, HIV 2, HCV, HBV, 뎅기열 바이러스(Dengue virus) 또는 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)에 의해 발생하는 감염성 질병들, 자가면역 또는 암을 예방하기 위한 백신 제형.
  62. 제55항, 제56항 및 제58항 중 어느 한 항에 있어서, HIV 1, HIV 2, HCV, HBV, 뎅기열 바이러스(Dengue virus) 또는 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)에 의해 발생하는 감염성 질병들, 자가면역 또는 암을 치료하기 위한 백신 제형.
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