CN101583629A - 修饰的糖类 - Google Patents

Abstract

在相应天然荚膜糖至少一个单糖单元的羟基位置包含封端基团的修饰的荚膜糖，其中所述封端基团具有式(Ia)或(Ib)：－O－X－Y(Ia)或－O－R¹(Ib)，其中X是C(O)、S(O)或SO₂；Y是NR¹R²或R³；R¹是被1、2或3个独立选自羟基、巯基或胺的基团取代的C_1－6烷基；R²是H或C_1－6烷基；R³是C_1－6烷基；用封端基团修饰荚膜糖的方法；包含所述修饰的荚膜糖的糖－蛋白质偶联物；制造所述糖－蛋白质偶联物的方法，包含所述修饰的荚膜糖和/或糖－蛋白质偶联物的药物组合物；以及其方法和用途。

Description

修饰的糖类

本文引用的所有文献通过引用全文纳入本文。

技术领域

本发明属于多糖化学领域，并涉及修饰的糖、其制备方法以及偶联的衍生物。具体地说，本发明涉及具有改善的水中稳定性的修饰的糖。

背景技术

多糖是重要的生物分子，它们已经广泛应用在制药工业中，用于疾病的预防和治疗。例如，多年来荚膜多糖已经应用在对抗荚膜细菌，如脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和Hib(B型流感嗜血杆菌)(Haemophilus influenzae type B)的疫苗中。

为了提高这些多糖的免疫原性，尤其是提高这些多糖在儿童中的免疫原性，已开发了偶联疫苗。它们包含偶联在载体蛋白质上的荚膜多糖[如，参考文献1、2、3]。偶联作用能使得T-非依赖性的抗原转变为T-依赖性的抗原。

许多类型的多糖的问题是其在水中的稳定性差。多糖在水中的稳定性取决于连接糖单元的O-糖苷键的性质。水中的稳定性差是由于O-糖苷键在酸或糖苷酶存在下容易发生水解。血清组A脑膜炎球菌的荚膜多糖是水中稳定性差的多糖的一个例子。

多糖的稳定性是生产偶联疫苗中的一个具体问题。为了制备多糖-蛋白质偶联物，需要对多糖的官能团进行化学操作，使得多糖能被连接到蛋白质上。将多糖暴露于化学试剂，特别是酸，可能导致不希望的糖苷键断裂，接着发生多糖的片段化。这样的片段化是极不希望发生的，它降低了多糖-蛋白质偶联物合成的产率。

在这种情况下不稳定的多糖一般需要小心选择试剂和反应条件以克服上述的问题。然而，这限制了可用于操作多糖的试剂，因而限制了多糖和载体蛋白质之间的可能形成的键联的范围。此外，这些多糖的不稳定性意味着难以开发出有效的可用于工业规模制备疫苗的操作程序。

参考文献4披露了一种修饰的荚膜糖，其在相应的天然荚膜糖至少一个单糖单元的羟基位置包含封端基团。据说修饰的荚膜糖具有改善的水解稳定性。本发明的一个目的是提供另一种或改进的具有改善的水解稳定性的修饰的荚膜糖。

发明内容

本发明基于以下的发现：荚膜糖的单糖单元上的羟基的修饰可提高其稳定性。用本发明方法得到的修饰的糖较其相应的未修饰的糖对水解更稳定。

因此，本发明提供了一种修饰的荚膜糖，其在相应的天然荚膜糖至少一个单糖单元的羟基位置包含封端基团(blocking group)。封端基团的定义如下。本发明的修饰的荚膜糖较其天然的糖对应物对水解更稳定。优选地，本发明的修饰的荚膜糖保留与其天然糖对应物的免疫交叉反应性。

本发明还提供了用封端基团修饰荚膜糖的方法；包含所述修饰的荚膜糖的糖-蛋白质偶联物；制造所述糖-蛋白质偶联物的方法，包含所述修饰的荚膜糖和/或糖-蛋白质偶联物的药物组合物；以及其方法和用途。

本发明的修饰的糖

本发明提供了一种修饰的荚膜糖，其在相应的天然荚膜糖至少一个单糖单元的羟基位置包含封端基团。封端基团具有式(Ia)或(Ib)：

-O-X-Y    (Ia)    -O-R¹    (Ib)

其中

X是C(O)、S(O)或SO₂；

Y是NR¹R²或R³；

R¹是被1、2或3个独立选自羟基、巯基或胺的基团取代的C_1-6烷基；

R²是H或C_1-6烷基；和

R³是C_1-6烷基。

优选地，封端基团具有式(Ia)。在该实施方式中，优选X是C(O)。这种氨基甲酸酯和酯封端基团对糖苷键具有稳定效果并可在温和条件下制备。提供氨基甲酸酯和酯封端基团的糖的操作方法的例子在下文中描述。然而，本发明不限于通过本文列举方法制备的修饰的糖，本发明的修饰的糖的其他制备方法对技术人员而言是显而易见的。

优选地，R²是H。

R¹的C_1-6烷基被1、2或3个独立选自羟基、巯基或胺的基团取代。当C_1-6烷基被2或3个基团取代时，取代基可以是相同基团或不同基团，但通常是相同的基团。优选地，R¹的C_1-6烷基被1、2或3个羟基取代。

R¹可在C_1-6烷基链的任何位置被取代。优选地，至少一个取代基存在于C_1-6烷基链的远端。当C_1-6烷基链是直链烷基时，这意味着C_1-6烷基在C_x上被取代，其中x是C_1-6烷基链中碳原子的总数。类似地，当C_1-6烷基链是支链烷基时，这意味着C_1-6烷基在一个支链，通常是最长支链的远端被取代。

在优选实施方式中，R¹被单个基团取代，该取代位于C_1-6烷基链的远端，如上所述。这种基团对于提供改善的水解稳定性特别有效。优选地，所述单个基团是羟基。因此优选的基团包括羟甲基、2-羟基乙基、3-羟基丙基、4-羟基丁基、5-羟基戊基和6-羟基己基。特别优选的基团是2-羟基乙基。

在其他优选实施方式中，R¹被两个邻位基团(vicinal group)，即位于C_1-6烷基链相邻位置上的两个基团取代。这种基团对于提供改善的水解稳定性特别有效。优选地，两个邻位基团位于C_1-6烷基链的远端。当C_1-6烷基链是直链烷基时，这意味着两个邻位基团位于C_x和C_x-1上，其中x是C_1-6烷基链中碳原子的总数。类似地，当C_1-6烷基链是支链烷基时，这意味着两个邻位基团位于一个支链，通常是最长支链的远端。优选地，所述两个邻位基团是羟基。这种基团为与载体分子偶联提供柄(handle)，如下所述。因此，优选的基团包括1，2-二羟基乙基；1，2-二羟基丙基和2，3-二羟基丙基；1，2-二羟基丁基、2，3-二羟基丁基和3，4-二羟基丁基；1，2-二羟基戊基、2，3-二羟基戊基、3，4-二羟基戊基和4，5-二羟基戊基；以及1，2-二羟基己基、2，3-二羟基己基、3，4-二羟基己基、4，5-二羟基己基和5，6-二羟基己基。如上所述，优选所述两个邻位基团位于C_1-6烷基链的远端。因此，特别优选的基团包括1，2-二羟基乙基、2，3-二羟基丙基；3，4-二羟基丁基、4，5-二羟基戊基和5，6-二羟基己基。特别优选的基团4，5-二羟基戊基。

在一些实施方式中，修饰的荚膜糖包含至少两种封端基团(如上所述)。例如，优选所述糖包含：a)至少一个封端基团，其中R¹被单个基团取代，该取代发生在C_1-6烷基链的远端(如上所述)；和b)至少一个封端基团，其中R¹被两个邻位基团取代(如上所述)。这种混合的封端基团对于提供改善的水解稳定性特别有效。此外，通过包含至少一个其中R¹被两个邻位羟基取代的封端基团为与载体分子偶联提供柄，如下所述。

优选地，R³是C₁-C₃烷基。最优选地，R³是C₁烷基(CH₃)，尽管C₂烷基和C₃烷基也是优选的。

式-O-X-Y或-O-R¹的封端基团可通过标准衍生操作由羟基(如天然分子中发现的那样)制备，如将羟基与酰卤、烷基卤、磺酰卤等反应。因此，-O-X-Y中的氧原子优选是羟基的氧原子，而-O-X-Y中的-X-Y基团优选代替羟基的氢原子。或者，可通过取代反应如Mitsunobu型取代获得封端基团。这些以及其他从羟基制备封端基团的方法是熟知的。

通常，本发明的修饰的糖是寡糖。寡糖可通过本文所述的任何解聚和分级(sizing)方法从多糖获得。

本发明的修饰的荚膜糖可从天然荚膜糖获得。然而，本发明不限于从天然荚膜糖获得的修饰的糖。本发明的修饰的荚膜糖可通过其他方法获得，如全合成或部分合成(参见，例如，参考文献5)。

在本发明的修饰的荚膜糖中，具有封端基团的单糖单元的数目是可变的。优选地，修饰的荚膜糖中所有的或几乎所有的单糖单元可具有封端基团。或者，修饰的荚膜糖中至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的单糖单元可具有封端基团。修饰的荚膜糖中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个单糖单元可具有封端基团。

当修饰的荚膜糖包含至少两种类型的封端基团时，具有每种类型的封端基团的单糖单元的数目也是可变的。例如，相对其他类型封端基团由一种类型的封端基团构成的封端基团总数的比例是可变的。具体地说，当存在两种类型的封端基团时，一种类型封端基团与另一类型封端基团的比例可选自1∶20、1∶19、1∶18、1∶17、1∶16、1∶15、1∶14、1∶13、1∶12、1∶11、1∶10、1∶9、1∶8、1∶7、1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2和1∶1。具体地说，在上述实施方式中，当所述糖包含以下封端基团时：a)至少一个其中R¹被单个基团取代且该取代位于C_1-6烷基链远端的封端基团；和b)至少一个其中R¹被两个邻位基团取代的封端基团，优选前一种类型的封端基团与后一种类型的封端基团的比例选自99∶1、98∶2、97∶3、96∶4、95∶5、94∶6、93∶7、92∶8、91∶9、90∶10、89∶11、88∶12、87∶13、86∶14、85∶15、84∶16、83∶17、82∶18、81∶19和80∶20。在这些比例中，95∶5、94∶6、93∶7、92∶8、91∶9、90∶10、89∶11、88∶12、87∶13、86∶14和85∶15是特别优选的。在这些比例中优选90∶10。

同样，单糖单元上封端基团的数目是可变的。例如，单糖单元上封端基团的数目可以是1、2、3、4、5或6，优选1-4，更优选1或2，最优选1。

在一个实施方式中，所述至少一个具有封端基团的单糖单元包括非末端单糖单元。术语“非末端单糖单元”是指不是寡糖/多糖链中末端单糖单元之一的单糖单元。

本发明包括修饰的荚膜糖，其中末端和非末端单糖单元的全部羟基位置都有封端基团。然而，在一些优选实施方式中，本发明的修饰的荚膜糖中至少有一个游离的羟基或氨基。有一个游离的羟基或氨基是有利的，因为它为修饰的荚膜糖提供了进一步反应(如偶联到载体分子上)的柄。当修饰的糖含有游离羟基时，它可以是异头羟基，具体是末端异头羟基。当修饰的糖含有氨基时，它可以是由异头羟基衍生的。通过还原性胺化反应(例如用NaBH₃CN/NH₄Cl)容易从异头羟基得到氨基。类似地，在其他优选实施方式中，所述修饰的荚膜糖的至少一个单糖单元中相应天然荚膜糖的两个邻位羟基不包含封端基团。优选地，1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％的单糖单元具有两个这种方式的邻位羟基。例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个单糖单元具有两个这种方式的邻位羟基。优选地，5-15％，最优选10％的单糖单元具有两个这种方式的邻位羟基。单糖单元中的两个邻位羟基是有利的，因为它们为与载体分子偶联提供柄，如下所述。

或者，在一些优选实施方式中，修饰的荚膜糖中至少一个或至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％单糖单元可具有封端基团，其中R¹被两个邻位羟基取代，如上所述。例如，修饰的荚膜糖中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个单糖单元可具有这种封端基团。优选地，修饰的荚膜糖中5-15％，最优选10％单糖单元具有其中R¹被两个邻位羟基取代的封端基团。再者，单糖单元中的两个邻位羟基是有利的，因为它们为与载体分子偶联提供柄，如下所述。

参考文献4中建议有效的封端基团是吸电子基团。不希望被理论束缚，但相信糖苷键对水解不稳定是由于受到糖羟基对糖苷键的分子内亲核进攻(即形成环状中间体)引起的。羟基的亲核性越大，分子内亲核进攻的倾向就越大。吸电子的封端基团具有使氧孤对电子离域化的作用，因此降低氧的亲核性，并降低分子内亲核进攻的倾向。我们吃惊地发现，包含被1、2或3个独立选自羟基、巯基或胺的基团取代的C_1-6烷基的基团可以是有效的封端基团，尽管封端基团中存在亲核的羟基、巯基或胺。此外，这些羟基-、巯基-或胺-取代的基团是有利的，因为它们能够将修饰的荚膜糖与载体分子更加有效地偶联。不希望被理论束缚，但相信这种效果源自包含被1、2或3个独立选自羟基、巯基或胺的基团取代的C_1-6烷基的基团的相对亲水性。此外，当封端基团包含被两个邻位羟基取代的C_1-6烷基时，该封端基团本身为与载体分子偶联提供柄。

在上述所有实施方式中，修饰的荚膜糖优选为具有磷酸二酯键的修饰的荚膜糖。更优选地，所述修饰的荚膜糖是修饰的脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)血清组A糖类。脑膜炎奈瑟球菌血清组A糖类对水解特别不稳定。

当所述修饰的荚膜糖是修饰的脑膜炎奈瑟球菌血清组A糖类时，所述封端基团优选位于相应的脑膜炎奈瑟球菌血清组A糖类的4-和/或3-位，更优选位于4-位。位于脑膜炎奈瑟球菌血清组A糖类4-和/或3-位的封端基团已显示出对于提高水解稳定性特别有效。

在具有酯封端基团的实施方式中(即当封端基团具有式(Ia)，X是C(O)且Y是R³时)，发明人发现，修饰的脑膜炎奈瑟球菌血清组A糖类的稳定性受到具有封端基团的4-和/或3-位的比例影响。例如，具有封端基团的4-位的比例可以是约0％，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或约100％，优选为至少30％和约100％。类似地，具有封端基团的3-位的比例可以是约0％，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或约100％，优选为至少95％和约100％。通常，具有封端基团的4-和3-位的比例是在各位置上大致相同。换句话说，具有封端基团的4-位与具有封端基团的3-位的比例约为1∶1。然而，在一些实施方式中，具有封端基团的4-位与具有封端基团的3-位的比例是可变的。例如，具有封端基团的4-位与具有封端基团的3-位的比例可以是1∶20、1∶19、1∶18、1∶17、1∶16、1∶15、1∶14、1∶13、1∶12、1∶11、1∶10、1∶9、1∶8、1∶7、1∶6、1∶5、1∶4、1∶3或1∶2。类似地，具有封端基团的3-位与具有封端基团的4-位的比例可以是1∶20、1∶19、1∶18、1∶17、1∶16、1∶15、1∶14、1∶13、1∶12、1∶11、1∶10、1∶9、1∶8、1∶7、1∶6、1∶5、1∶4、1∶3或1∶2。

本发明还提供一种下式所示糖：

其中

T具有式(A)或(B)：

n是1-100的整数；

各Z基团独立选自OH、OAc或如上文所定义的封端基团；和

各Q基团独立选自OH、OAc或如上文所定义的封端基团；

V选自-NH₂、-NHE、-NE¹E²、W²或-O-D，其中：E、E¹和E²是氮保护基，所述保护基可以是相同或不同的，且D是氧保护基；

W选自OH或如上文所定义的封端基团；

W¹选自-OH或如上文所定义的封端基团；

W²选自-OH或如上文所定义的封端基团；

其中至少1(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40)个Z基团和至少1(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40)个Q基团是如上文定义的封端基团。

优选地，n是15-20的整数。

n+2个Z基团各自可以是相同或不同的。同样，n+2个Q基团各自可以是相同或不同的。

V优选是-NH₂或-NHE。

合适的氮保护基是甲硅烷基(如TMS、TES、TBS、TIPS)、酰基衍生物(如三氟乙酰胺、甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基(Boc)、苄氧基羰基(Z或Cbz)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、烯丙氧基羰基(Alloc)、2，2，2-三氯乙氧基羰基(Troc))、磺酰衍生物(如β-三甲基甲硅烷基乙磺酰(SES))、亚磺酰衍生物、C_1-12烷基、苄基、二苯甲基、三苯甲基、烯丙基、9-苯基芴基，等等。优选的氮保护基是Fmoc。

二价的氮保护基可表示为E¹E²，包括环酰亚胺衍生物(如N-邻苯二甲酰亚胺、N-二硫杂琥珀酰亚胺、N-2，3-二苯基马来酰亚胺)、亚胺衍生物(如N-1，1-二甲基硫代亚甲基胺、N-亚苄基胺、N-对甲氧基亚苄基胺、N-二苯基亚甲基胺)、烯胺衍生物(如N-(5，5-二甲基-3-氧代-1-环己烯基)胺)等。优选的二价氮保护基是N-邻苯二甲酰亚胺基。

合适的氧保护基包括酯、醚(如甲硅烷基醚或烷基醚)和缩醛。具体例子包括烯丙基、乙酰基、Aloc、苄基、苄氧基甲基(BOM)、叔丁基、三苯甲基、叔丁基二甲基硅烷基(TBS)、叔丁基二苯基硅烷基(TBDPS)、三乙基硅烷基(TES)、三甲基硅烷基(TMD)、三异丙基硅烷基(TIPS)、对甲氧基苄基(PMB)、MEM、甲氧基甲基(MOM)、MTM和四氢吡喃基(THP)。

所有的Z基团可以是OH(前提是至少一个Z基团和/或至少一个Q基团是封端基团)。或者，所有Z基团中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％可以是OAc。优选约60-90％的Z是OAc，其它的Z基团是OH或上面定义的封端基团。优选地，至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％的Z基团是封端基团，60-90％是OAc，其余为OH。优选地，约10-40％的Z基团是封端基团，60-90％是OAc，而其余为OH。或者，约0％、至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或约100％的Z基团是封端基团，优选至少95％和约100％。

所有的Q基团可以是OH(前提是至少一个Z基团和/或Q基团是封端基团)。或者，至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％或20％的Q基团可以是OAc。优选约1-20％的Q基团是OAc，其余的Q基团是OH或上面定义的封端基团。优选地，至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的Q基团是封端基团，1-20％是OAc，其余为OH。优选地，约80-99％的Q基团是封端基团，1-20％是OAc，而其余为OH。或者，约0％、至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或约100％的Q基团是封端基团，优选至少30％和约100％。

本发明还提供了一种包含下式所示糖部分的分子：

其中

T具有式(A)或(B)：

n、Z、Q和W如上文所定义；至少1(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40)个Z基团和/或至少1(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40)个Q基团是封端基团；并且L是O、NH、NE、S或Se。

L的游离共价键可与任何合适的部分，如与-H、-E、接头、蛋白质载体等连接。L也可能是N，连接到二价接头、二价保护基或二价蛋白质载体上。

优选的n、Z、Q和W基团在上文中描述。

本发明还提供了一种包含下式所示糖的分子：

其中

T具有式(A)或(B)：

n、Z、Q、W、W1和V如上文所定义，和至少1(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40)个Z基团和/或至少1(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40)个Q基团具有式(IIa)或(IIb)：

-O-X-Y’    (IIa)    -O-R⁴    (IIb)

其中

X如上文所定义；

Y’是NR²R⁴；

R²如上文所定义；和

R⁴是-C_1-4亚烷基-CH(O)或-C_1-5亚烷基-NH-，其中-NH-基团是蛋白质载体的一部分。

优选地，Z和/或Q基团中至少有一个具有式(IIa)。在该实施方式中，优选X是C(O)。

优选的R²基团在上文的式(Ia)中描述。

优选的R⁴基团包括-C₁亚烷基-CH(O)、-C₂亚烷基-CH(O)、-C₃亚烷基-CH(O)和-C₄亚烷基-CH(O)。特别优选的R⁴基团是-C₃亚烷基-CH(O)。

其他优选的R⁴基团包括-C₁亚烷基-NH-、-C₂亚烷基-NH-；-C₃亚烷基-NH-、-C₄亚烷基-NH-和-C₅亚烷基-NH-。特别优选的R⁴基团是-C₄亚烷基-NH。

优选的n，Z、Q、W、W¹和V基团在上文中描述。

制造修饰的糖的方法

本发明提供了一种修饰荚膜糖的方法，该方法包括以下步骤：

(a)提供在单糖单元上具有至少一个羟基的荚膜糖；和

(b)将所述至少一个羟基转化成封端基团。

所述封端基团是上文中定义的任何一种封端基团。

荚膜糖可以是天然的荚膜糖(寡糖或多糖)。或者，荚膜糖可以是例如脱-O-乙酰基的荚膜糖和/或具有末端氨基的荚膜糖(如通过还原性胺化得到的)。

在修饰封端基团是-OC(O)NR¹R²的糖的优选方法中，步骤(b)包括以下步骤：

(b1)在有机溶剂中使荚膜糖与双功能试剂反应；和

(b2)将步骤(b1)的产物与式(III)的氨基化合物反应：

HNR¹R²    (III)

其中R¹和R²如上文定义。

术语“双功能试剂”指能够发挥以下双重功能的任何试剂：(i)在步骤(b1)提供第一亲电子碳原子，用于与糖的羟基偶联；(ii)提供第二亲电子碳原子，用于与步骤(b2)所用的氨基偶联。一般，第二亲电子碳原子在步骤(b)中从第一亲电子碳原子再生。双功能试剂在多糖和氨基化合物之间提供-C(O)-连接。

本发明使用的双功能试剂包括但不限于1，1’-羰基二咪唑(CDI)、羰基二-1，2，4-三唑(CDT)、羰基二-1，2，3-苯并三唑(CDB)、碳酸二苯酯、溴化氰、光气或三光气。熟练人员应知道能够起相同作用的其它双功能试剂。

优选的双功能试剂是CDI。CDI的优点是比例如光气或溴化氰温和。特别是，使用CDI的偶联反应不会产生氢卤酸气体如HCl或HBr。HCl或HBr气体的产生是不利的，因为这些气体要求在反应室出口洗气以避免它们逃逸入大气中。而且，HCl或HBr的产生可能影响糖的敏感官能团，发生糖的分解或片段化，引起产率下降。

用于步骤(b1)的有机溶剂优选是非质子溶剂。非质子溶剂是本领域技术人员熟知的，不包含任何可离解的氢原子。这些溶剂是有利的，因为它们通过增强羟基的亲核性而促进糖羟基与双功能试剂的反应。合适的非质子溶剂包括但不限于：二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、甲酰胺、六甲基磷三酰胺(HMPT)、1，3-二甲基-3，4，5，6-四氢-2(1H)-嘧啶酮(DMPU)、二甲基乙酰胺(DMAC)或六甲基磷酰胺(HMPA)。DMSO是优选的。

在本发明方法的步骤(b2)中，步骤(b1)的产物与氨基化合物反应，形成修饰的多糖。用于本发明方法的氨基化合物是式(III)化合物，如上定义。

可用于本发明的合适的氨基化合物取决于R¹和R²。如上所述，在优选实施方式中，R¹被单个羟基取代，该取代位于C_1-6烷基链的远端，且R²是H。因此，可用于本发明的优选的氨基化合物包括氨基甲醇、2-氨基乙醇、3-氨基丙-1-醇、4-氨基丁-1-醇、5-氨基戊-1-醇和6-氨基己-1-醇。特别优选的氨基化合物是2-氨基乙醇。在其他优选实施方式中，R¹被两个邻位羟基取代，且R²是H。因此，优选的可用于本发明的氨基化合物包括1-氨基乙-1，2-二醇；1-氨基丙-1，2-二醇和3-氨基丙-1，2-二醇；1-氨基丁-1，2-二醇、1-氨基丁-2，3-二醇和4-氨基丁-1，2-二醇；1-氨基戊-1，2-二醇、1-氨基戊-2，3-二醇、5-氨基戊-2，3-二醇和5-氨基戊-1，2-二醇；和1-氨基己-1，2-二醇、1-氨基己-2，3-二醇、5-氨基己-3，4-二醇、6-氨基己-2，3-二醇和6-氨基己-1，2-二醇。在特别优选的实施方式中，R¹被两个邻位羟基在C_1-6烷基链远端取代。因此，可用于本发明的优选的氨基化合物包括3-氨基丙-1，2-二醇、4-氨基丁-1，2-二醇、5-氨基戊-1，2-二醇和6-氨基己-1，2-二醇。特别优选的氨基化合物是5-氨基戊-1，2-二醇。它们可以盐形式(如盐酸盐)用于本发明。

优选的本发明方法列举在下面的方案1中：

方案1

在该方案中，首先用CDI在DMSO溶剂中通过单糖单元上的至少一个羟基使糖(如MenA多糖或寡糖)活化。生成的咪唑氨基甲酸酯中间体用胺R¹R²NH(如2-氨基乙醇)捕获，产生修饰的糖。

或者，可以通过使荚膜糖的一个或多个羟基与式XC(O)NR¹R²的试剂反应用一步方法制备修饰的糖，其中X是离去基团，R¹和R²如上定义。合适的离去基团包括但不限于-Cl、-Br、-CF₃、-OC₆F₅或-CCl₃。

在修饰封端基团是-OC(O)NR³的糖的优选方法中，步骤(b)包括以下步骤：

(b1)在存在咪唑催化剂时使荚膜糖与[(R³C(O)]₂O反应。

该方法特别适合修饰其中的封端基团是-OC(O)CH₃的糖。在该实施方式中，步骤(b)包括以下步骤：

(b1)在存在咪唑催化剂时使荚膜糖与[(CH₃C(O)]₂O(乙酸酐)反应。

或者，本发明的修饰的荚膜糖可以通过合成方法，例如，从合适的单糖单元制备。通常，修饰的荚膜糖的全合成包括在合适的单糖单元之间形成糖苷键连接(如磷酸二酯键连接)，然后用上述的任何方法修饰得到的糖。或者，可在形成糖苷键连接之前修饰单糖单元，得到相同的修饰的荚膜糖。

本发明的修饰的荚膜糖优选是寡糖。从天然的荚膜多糖开始，可通过以下两种方法之一得到修饰的荚膜寡糖：(1)修饰荚膜多糖，接着对修饰的多糖进行解聚和分级，形成修饰的寡糖；(2)对荚膜多糖进行解聚和分级，接着修饰得到的寡糖，形成修饰的寡糖。两种方法都包括在本发明范围内。但是，在某些实施方式中第一种方法是优选的，因为该方法确保得到末端羟基，以便用于随后修饰寡糖与载体分子如蛋白质的偶联。

本发明还提供了一种修饰脑膜炎奈瑟球菌血清组A多糖的方法，该方法包括以下步骤：

(a)提供脑膜炎奈瑟球菌血清组A多糖；

(b)将所述多糖解聚和分级以提供寡糖；和

(c)将所述寡糖的至少一个羟基转化成封端基团，如上所述。

该方法的步骤(b)之后可任选进行已知的衍生化步骤，然后进行步骤(c)。已知的衍生化步骤包括，例如，还原性胺化，接着保护生成的-NH₂和/或脱-O-乙酰化。

本发明还提供了一种修饰脑膜炎奈瑟球菌血清组A多糖的方法，该方法包括以下步骤：

(a)提供脑膜炎奈瑟球菌血清组A多糖；

(b)将所述多糖的至少一个羟基转化成封端基团，如上所述；和

(c)将所得多糖解聚和分级以提供寡糖。

该方法的步骤(c)之后可任选进行已知的衍生化步骤。已知的衍生化步骤包括，例如，还原性胺化，接着保护生成的-NH₂和/或脱-O-乙酰化。

任何上述方法可后接除去污染物(如低分子量污染物)的步骤。

荚膜糖原料

本发明的修饰的荚膜糖可从天然荚膜糖获得。术语“天然的荚膜糖”指含糖的聚合物(如糖、糖酸、氨基糖、多元醇、糖醇和磷酸糖等的聚合物)，它们可从细菌的荚膜中发现。细菌包括革兰阳性菌和革兰阴性菌，如脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)和流感嗜血杆菌(H.influenzea)。而且，“天然的荚膜糖”既包括多糖也包括寡糖。天然的荚膜寡糖可通过将天然多糖解聚和分级得到。

天然荚膜糖的“羟基位置”是天然荚膜糖上具有羟基的位置。然而，它不包括糖苷键或其残基中具有羟基的位置(如作为磷酸酯键一部分的羟基不占据羟基位置)。天然荚膜糖上存在乙酰氧基(AcO)的位置也不是羟基位置。

天然荚膜糖可包含通过磷酸二酯键连接的糖单元。包含磷酸二酯键的糖对水解是不稳定的。

天然荚膜糖和本发明修饰的荚膜糖优选在哺乳动物(如人)中具有免疫原性。哺乳动物可以是成年人或儿童。

天然荚膜糖优选是从以下细菌得到的多糖(或其寡糖片段)：脑膜炎奈瑟球菌(包括血清组A、B、C、W135和Y)、肺炎链球菌(包括血清型1、4、5、6B、9V、14、18C、19F和23F)、B型流感嗜血杆菌、淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和/或绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginisa)。

虽然本发明可应用于任何血清组的脑膜炎奈瑟球菌，但优选使用从血清组A(“MenA”)得到的荚膜糖。MenA荚膜糖在水溶液中特别不稳定，这意味着对这个分子进行化学操作(如偶联到载体蛋白质上)需要用特殊的操作程序。但是，按照本发明修饰的MenA糖在水溶液中是很稳定的。

MenA荚膜多糖{→6)-D-ManpNAc(3/4OAc)-α-(1→OPO₃→}是由N-乙酰基甘露糖胺残基通过α1-6磷酸二酯键连接在一起而构成的，具有如下所示的重复单元。

按照上面的定义，约80-99％的4-位是羟基位置，10-40％的3-位是羟基位置。末端1-羟基也占据一个羟基位置。该末端1-羟基是末端异头羟基。作为-OP(O)(OH)O^-基团一部分的羟基不是羟基位置。

糖-蛋白质偶联物

本发明修饰的糖可以进行任何对于糖类常见的下游加工(如衍生化、偶联、片段化等)。为了提高免疫原性，本发明修饰的糖优选与载体蛋白质偶联。与载体蛋白质的偶联对于儿科疫苗特别有用[6]并且是公知的技术[如参考文献7-15等所综述的]。多糖可直接连接到蛋白质[2，16]或者它可通过接头基团连接。已经提出许多不同类型的接头基团用来将多糖与蛋白质相连[如3，17]。

因此，本发明提供了一种蛋白质和本发明的修饰的糖的偶联物。蛋白质可直接与糖偶联，或者可使用接头。可以使用任何合适的接头化学。修饰多糖的稳定性提高有利于使用各种各样的连接。

如上所述，在一些实施方式中，优选修饰的荚膜糖具有至少一个游离的羟基或氨基，可用作随后与载体蛋白质连接的柄。

具有游离羟基的修饰的荚膜糖可通过选择性地封闭荚膜糖上的羟基得到，或通过使所有的羟基都被封闭的修饰的荚膜糖选择性地脱封闭而得到。或者，可通过将修饰的荚膜糖解聚和分级展示游离羟基。优选的是，至少一个游离羟基是末端异头羟基。末端异头羟基优选作为游离羟基，是因为末端异头羟基可通过将修饰的荚膜糖解聚和分级而展示。

具有游离氨基的修饰的荚膜糖可通过末端异头羟基的还原性胺化而得到，任选接着保护生成的-NH₂。还原性胺化反应可在本发明的修饰步骤之前或之后进行。还原性胺化反应优选在本发明的修饰步骤之前进行，因为可在羟基/封端基团的存在下选择性地保护/去保护生成的-NH₂。

例如，本发明提供了一种制造糖-蛋白偶联物的方法，该方法包括以下步骤：

(a)提供本发明的修饰的荚膜糖，其中所述修饰的糖包含末端异头羟基或衍生自末端异头羟基的氨基；和

(b)通过末端异头羟基或衍生自末端异头羟基的氨基将所述修饰的荚膜糖连接于蛋白质。

所述蛋白质优选为细菌毒素或类毒素，尤其是白喉毒素或类毒素。例如，所述蛋白质优选是CRM₁₉₇。

可用任何已知方法，如参考文献3和17所述的方法通过接头基团进行连接。优选的连接类型是羰基接头，它可通过修饰的糖的游离羟基与CDI反应[18，19]，接着与蛋白质反应，形成氨基甲酸酯连接而形成。另一个优选的连接类型是己二酸接头，它可通过使修饰的糖上的游离-NH₂与己二酸偶联(例如，用二酰亚胺活化)，然后使蛋白质与生成的糖-己二酸中间体偶联而形成[11，20，21]。其它接头包括B-丙酰胺基[22]、硝基苯基-乙胺[23]、卤代酰基卤化物[24]、糖苷键[25]、6-氨基己酸[26]、ADH[27]、C4-C12部分[28]等。

偶联反应可包括：异头碳端基还原为伯羟基，伯羟基的任选保护/去保护；伯羟基与CDI反应，形成CDI氨基甲酸酯中间体；CDI氨基甲酸酯中间体与蛋白质的氨基偶联。

方案2表示两个不同的例子，说明按照本发明荚膜糖如何与载体蛋白质偶联。在第一个例子中，蛋白质通过末端羟基偶联。在第二个例子中，蛋白质通过末端氨基连接。

方案2

直接连接蛋白质可包括氧化多糖，然后与蛋白质进行还原性胺化，如参考文献2和16所述。例如，在所述修饰的荚膜糖的至少一个单糖单元中相应天然荚膜糖的两个邻位羟基不包含封端基团的实施方式中，可通过氧化裂解(oxidative cleavage)(如NaIO₄、Pb(OAc)₄等)将一对或多对邻位羟基转化成醛基。然后可通过还原胺化将修饰荚膜糖连接到蛋白质。

例如，本发明提供一种制造糖-蛋白偶联物的方法，该方法包括以下步骤：

(a)提供本发明的修饰的荚膜糖，其中，所述修饰的荚膜糖的至少一个单糖单元中相应天然荚膜糖的两个邻位羟基不包含封端基团；

(b)通过氧化裂解将至少一对邻位羟基转化成醛基；和

(c)通过还原胺化将修饰荚膜糖连接于蛋白质。

所述蛋白质优选为细菌毒素或类毒素，尤其是白喉毒素或类毒素。例如，所述蛋白质优选是CRM₁₉₇。

如上所述，在一些实施方式中，优选所述修饰的荚膜糖的至少一个单糖单元包含其中R¹被两个邻位羟基取代的封端基团。两个邻位羟基可用作随后与载体蛋白连接的柄。例如，通过氧化裂解(如NaIO₄、Pb(OAc)₄等)可将一对或多对邻位羟基转化成醛基。然后可通过还原胺化将修饰荚膜糖连接到蛋白质。

例如，本发明提供一种制造糖-蛋白偶联物的方法，该方法包括以下步骤：

(a)提供本发明的修饰的荚膜糖，其中至少一个单糖单元包含其中R¹被两个邻位羟基取代的封端基团；

(b)通过氧化裂解将至少一对邻位羟基转化成醛基；和

(c)通过还原胺化将修饰荚膜糖连接于蛋白质。

所述蛋白质优选为细菌毒素或类毒素，尤其是白喉毒素或类毒素。例如，所述蛋白质优选是CRM₁₉₇。

在该方法的一些实施方式中，所述封端基团中存在的所有邻位羟基在步骤(b)中被转化成醛基。在这些实施方式中，产生的醛基的数目取决于修饰的荚膜糖内存在的其中R¹被两个邻位羟基取代的封端基团的总数。在其他实施方式中，选择的氧化裂解条件仅使一部分存在于所述封端基团中的邻位羟基转化成醛基。在这些实施方式中，产生的醛基的数目取决于修饰的荚膜糖内存在的其中R¹被两个邻位羟基取代的封端基团的总数以及选择的条件。在这种实施方式中，修饰的荚膜糖中优选1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％的单糖单元具有封端基团。例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个单糖单元具有被转化成醛基的封端基团。优选地，5-15％，最优选10％的单糖单元具有被转化成醛基的封端基团。

方案3表示两个进一步的例子，说明按照本发明荚膜糖如何与载体蛋白质偶联。在第一个例子(左手侧)中，所有封端基团具有被两个邻位羟基取代的R¹基团。这些邻位羟基中的一定比例(如10％)被转化成与蛋白质偶联的醛基。在第二个例子(右手侧)中，存在两种类型的封端基团。其中一定比例(如10％)具有被两个邻位羟基取代的R¹。所有这些邻位羟基被转化成与蛋白质偶联的醛基。

方案3

优选的载体蛋白是细菌毒素或类毒素，如白喉或破伤风类毒素。这些是在偶联疫苗中常用的。CRM₁₉₇白喉类毒素是特别优选的[29]。其它合适的载体蛋白质包括脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[30]、合成肽[31，32]、热激蛋白[33，34]、百日咳蛋白[35，36]、流感嗜血杆菌的蛋白D[37]、细胞因子[38]、淋巴因子[38]、激素[38]、生长因子[38]、艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[39]、摄铁蛋白[40]等。可使用载体蛋白的混合物。

偶联后，可分离游离和偶联的糖。有许多合适的分离方法，包括疏水色谱、切向超滤、渗滤等。[也参见参考文献41、42等]。

一种载体蛋白可携带多种不同的糖[43]。

药物组合物和方法

用本发明方法制备的组合物是药学上可接受的。除修饰的糖和/或偶联物外，它们可包含其它组分，例如它们一般包含一种或多种药物载体。对这类组分的充分讨论参见参考文献44。因此本发明提供了一种药物组合物，其包含(a)本发明的修饰的糖和/或本发明的偶联物，和(b)药学上可接受的载体。所述组合物优选为免疫原性组合物(如疫苗)。基于糖类或糖-蛋白质偶联物的疫苗是本领域熟知的。

组合物可含有一种或多种缓冲剂。缓冲剂一般包括：磷酸盐缓冲液；Tris缓冲液；硼酸盐缓冲液；琥珀酸盐缓冲液；组氨酸缓冲液；或柠檬酸缓冲液。包含的缓冲剂的浓度一般是5-20mM。

为了控制张力，优选包含生理性盐如钠盐。优选氯化钠(NaCl)，它的浓度可以是1-20mg/ml。可以存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、二水合磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钙等。

组合物的渗透压通常为200mOsm/kg-400mOsm/kg，优选为240-360mOsm/kg，更优选为290-310mOsm/kg。虽然以前报道过渗透压对疫苗接种引起的疼痛无影响[45]，但优选将渗透压保持在此范围内。

组合物的pH通常为5.0-80，更常见为5.5-6.5，例如6.5-7.5。因此，本发明方法可包括在包装前调整散装疫苗pH的步骤。

该组合物优选无菌。该组合物优选无热原，如每剂量含有＜1EU(内毒素单位，标准量度)，优选每剂量＜0.1EU。该组合物优选不含谷蛋白。

该组合物可含有防腐剂，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，疫苗优选应基本不含(即小于5μg/ml)含汞物质，如不含硫柳汞。更优选无汞的疫苗。

该组合物可含有一次免疫的物质，或者可含有多次免疫的物质(即‘多剂量’药盒)。多剂量配置优选含有防腐剂。

疫苗的典型给药体积约为0.5ml。

组合物优选储存于2-8℃。不应冷冻。理想地，应避光保存。

当组合物包括偶联物时，它还可包含未偶联的载体蛋白，但优选未偶联载体的量相对于载体总量小于5％。

本发明组合物适合给予人类患者，本发明提供在患者中产生免疫应答的方法，包括将该组合物给予患者的步骤。本发明也提供了用作药物的本发明的组合物。本发明还提供了本发明的修饰的糖和/或偶联物在制备在患者中产生免疫应答的药物中的应用。这些方法和应用引发的免疫应答通常包括抗体应答，优选抵抗脑膜炎球菌感染的保护性抗体应答。由奈瑟菌属造成的疾病包括脑膜炎、败血病和淋病。优选预防和/或治疗细菌性脑膜炎。

可以各种方式给予该组合物。最优选的免疫途径是肌肉内注射(如注射到上肢或下肢)，但其它可用的途径包括皮下注射、鼻内[46-48]、口服[49]、皮内[50，51]、经皮、透皮[52]等。

按照本发明制备的组合物可用于治疗儿童和成人。患者可以小于1岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。患者可以是老年人(如≥50岁，优选≥65岁)、青年(如≤5岁)、住院患者、健康护理人员、军队服务人员和军人、怀孕妇女、慢性疾病患者、免疫缺陷患者和去国外旅行的人。然而该组合物不只适用于这些人群，可以在更广泛的人群中使用。

可以通过单剂量方案或多剂量方案进行治疗。多剂量可用于初免方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可通过相同或不同途径给予各种剂量，例如初免采用胃肠道外途径而加强免疫采用粘膜途径，或者初免采用粘膜途径而加强免疫采用胃肠道外途径等。对于免疫原初(immunological naive)患者，特别适合给予一个以上的剂量(一般是两个剂量)。一般以至少1周(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约12周、约16周等)的间隔给予多个剂量。

可在与其它组合物基本相同的时间(例如在向健康护理专业人员的同一次医疗咨询或就诊期间)，特别是与其他疫苗相同的时间，将本发明的组合物给予患者。

免疫原性组合物包含免疫有效量的糖类抗原，以及需要的任何其它规定组分。‘免疫有效量’指以一次剂量或一系列剂量的一部分，将该剂量给予个体能有效治疗或预防。此量取决于所治疗个体的健康和身体状况、年龄、所治疗个体的分类学地位(如非人灵长动物、灵长动物等)、个体的免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗配方、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素。预计该量将落入可通过常规试验测定的相对较宽的范围内。给药治疗可以是单剂量方案或多剂量方案(如包括加强剂量)。

本发明疫苗可以是预防性(即预防感染)或治疗性(即在感染后治疗疾病)疫苗，但一般是预防性疫苗。

佐剂

本发明组合物宜包含佐剂，佐剂可用于在接受该组合物的患者中提高所引发的免疫应答反应。可用于本发明的佐剂包括但不限于：

·包含钙盐和铝盐(或其混合物)的含矿物质组合物。钙盐包括磷酸钙(如参考文献53公开的“CAP”颗粒)。铝盐包括氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等，所述盐取任何合适的形式(如凝胶、晶体、无定形态等)。优选吸附于这些盐。也可将含有矿物质的组合物制成金属盐的颗粒[54]。下面开始更详细地描述铝盐佐剂。

·水包油乳剂，如下文所详述。

·免疫刺激性寡核苷酸，例如含有CpG基序的寡核苷酸(含有通过磷酸键连接于鸟嘌呤的未甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)、TpG基序[55]、或双链RNA、或含有回文序列的寡核苷酸、或含有聚(dG)序列的寡核苷酸。免疫刺激性寡核苷酸可包含核苷酸修饰/类似物，如硫代磷酸酯修饰，可以是双链或(除RNA外)单链。参考文献56-58公开了可能的类似取代，例如用2’-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献59-64中进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂作用。CpG序列可能导向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[65]。CpG序列可特异性诱导Th1免疫应答，例如CpG-A ODN(寡脱氧核糖核苷酸)，或更特异地诱导B细胞应答，例如CpG-B ODN。参考文献66-68中讨论了CpG-A和CpG-B ODN。CpG优选是CpG-A ODN。优选构建CpG寡核苷酸时使其5’端可为受体所识别。任选将两个CpG寡核苷酸序列的3’端相连接形成“免疫聚体”。参见例如，参考文献65和69-71。有用的CpG佐剂是CpG7909，也称为ProMune^TM(科雷制药集团公司(Coley Phamaceutical Group，Inc.))。免疫刺激性寡核苷酸一般含有至少20个核苷酸。它们可含有少于100个核苷酸。

·3-O-脱酰化单磷酰脂质A(′3dMPL′，也称为′MPL^TM′)[72-75]。3dMPL可由明尼苏达沙门菌(Salmonella minnesota)的无庚糖突变体制备，在化学上类似于脂质A，但缺少酸-不稳定性磷酰基和碱-不稳定性酰基。参考文献76最先描述了3dMPL的制备。3dMPL可以取酰基化不同的相关分子(如具有3、4、5或6个长度可以不同的酰基链)的混合物的形式。两个葡糖胺(也称为2-脱氧-2-氨基-葡萄糖)单糖在其2-位(即2和2′位)碳上N-酰基化，3′位上也有O-酰基化。

·咪唑并喹啉化合物，如咪喹莫特(″R-837″)[77，78]、瑞喹莫德(″R-848″)[79]和其类似物；及其盐(如盐酸盐)。有关免疫刺激性咪唑并喹啉的其它细节可参见参考文献80-84。

·缩氨基硫脲化合物，如参考文献85所述的化合物。参考文献85中也描述了配制、制备和筛选活性化合物的方法。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子如TNF-α方面特别有效。

·色胺酮化合物，如参考文献86所述的化合物。参考文献86中也描述了配制、制备和筛选活性化合物的方法。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子如TNF-α方面特别有效。

·核苷类似物，如(a)艾沙托立宾(Isatorabine)(ANA-245；7-硫杂-8-氧代鸟苷)和其前药：

(b)ANA975；(c)ANA-025-1；(d)ANA380；(e)参考文献87-89所述的化合物；(f)具有下式的化合物：

式中：

R₁和R₂各自独立地是氢、卤素、-NR_aR_b、-OH、C_1-6烷氧基、取代的C_1-6烷氧基、杂环基、取代的杂环基、C_6-10芳基、取代的C_6-10芳基、C_1-6烷基或取代的C_1-6烷基；

R₃不存在，或者是H、C_1-6烷基、取代的C_1-6烷基、C_6-10芳基、取代的C_6-10芳基、杂环基或取代的杂环基；

R₄和R₅各自独立地是氢、卤素、杂环基、取代的杂环基、-C(O)-R_d、C_1-6烷基、取代的C_1-6烷基，或结合在一起形成5元环，如R_4-5：

在所示的化学键处实现结合，

X₁和X₂各自独立地是N、C、O或S；

R₈是氢、卤素、-OH、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、-OH、-NR_aR_b、-(CH₂)_n-O-R_c、-O-(C_1-6烷基)、-S(O)_pR_e或-C(O)-R_d；

R₉是氢、C_1-6烷基、取代的C_1-6烷基、杂环基、取代的杂环基或R_9a，其中R_9a是：

在

所示的化学键处实现结合，

R₁₀和R₁₁各自独立地是氢、卤素、C_1-6烷氧基、取代的C_1-6烷氧基、-NR_aR_b或-OH；

R_a和R_b各自独立地是氢、C_1-6烷基、取代的C_1-6烷基、-C(O)R_d、C_6-10芳基；

R_c各自独立地是氢、磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、C_1-6烷基或取代的C_1-6烷基；

R_d各自独立地是氢、卤素、C_1-6烷基、取代的C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、取代的C_1-6烷氧基、-NH₂、-NH(C_1-6烷基)、-NH(取代的C_1-6烷基)、-N(C_1-6烷基)₂、-N(取代的C_1-6烷基)₂、C_6-10芳基或杂环基；

R_e各自独立地是氢、C_1-6烷基、取代的C_1-6烷基、C_6-10芳基、取代的C_6-10芳基、杂环基或取代的杂环基；

R_f各自独立地是氢、C_1-6烷基、取代的C_1-6烷基、-C(O)R_d、磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯；

n各自独立地是0、1、2或3；

p各自独立地是0、1或2；或者

(g)(a)-(f)中任一项的药学上可接受的盐，(a)-(f)中任一项的互变异构体，或互变异构体的药学上可接受的盐。

·洛索立宾(Loxoribine)(7-烯丙基-8-氧代鸟苷)[90]。

·参考文献91所述化合物，包括：酰基哌嗪化合物、吲哚二酮化合物、四氢异喹啉(THIQ)化合物、苯并环二酮化合物、氨基氮杂乙烯基化合物、氨基苯并咪唑喹啉酮(ABIQ)化合物[92.93]、水合酞酰胺(hydrapthalamide)化合物、苯并苯基酮化合物、异

唑化合物、固醇化合物、喹唑啉酮(quinazilinone)化合物、吡咯化合物[94]、蒽醌化合物、喹喔啉化合物、三嗪化合物、吡唑嘧啶化合物和吲哚化合物[95]。

·参考文献96所述的化合物，包括3，4-二(1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2，5-二酮，星孢素类似物、衍生的哒嗪、色原-4-酮、吲哚满酮、喹唑啉和核苷类似物。

·氨烷基氨基葡糖苷磷酸衍生物，如RC529[97，98]。

·磷腈，如参考文献99和100中所述的聚[二(羧基苯氧基)磷腈](poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene]，“PCPP”。

·小分子免疫增强剂(SMIP)，例如：

N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺

N2，N2-二甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺

N2-乙基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺

N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺

1-(2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺

N2-丁基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺

N2-丁基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺

N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-戊基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺

N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-丙-2-烯基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺

1-(2-甲基丙基)-2-[(苯基甲基)硫代]-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺

1-(2-甲基丙基)-2-(丙硫基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺

2-[[4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙醇

2-[[4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑[4-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙酸乙酯；

4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1，3-二氢-2H-咪唑[4，5-c]喹啉-2-酮；

N2-丁基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

N2-丁基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺

N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺

N2，N2-二甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺

1-{4-氨基-2-[甲基(丙基)氨基]-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基}-2-甲基丙-2-醇

1-[4-氨基-2-(丙基氨基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]-2-甲基丙-2-醇

N4，N4-二苄基-1-(2-甲氧基-2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺。

·皂苷[参考文献131的第22章]是在许多种类植物的树皮、叶、茎干、根甚至花中发现的甾醇糖苷和三萜糖苷的异质群体。已广泛研究了作为佐剂的来自皂树(Quillaia saponaria)Molina树皮的皂苷。皂苷也可购自丽花菝葜(Smilaxornata)(墨西哥菝葜)、满天星(Gypsophilla paniculata)(婚纱花)和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂如QS21以及脂质制剂如ISCOM。QS21以商标Stimulon^TM出售。已采用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已鉴定了用这些技术纯化的特定组分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷优选QS21。制备QS21的方法参见参考文献101。皂苷制剂也可包含甾醇，如胆固醇[102]。皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献131的第23章]。ISCOM通常也含有磷脂如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。ISCOM中可采用任何已知的皂苷。ISCOM优选包含QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。参考文献102-104中进一步描述了ISCOM。任选地，ISCOM可不含其它去污剂[105]。开发基于皂苷的佐剂的综述可参见参考文献106和107。

·细菌ADP-核糖基化毒素(如大肠杆菌(E.coli)不耐热肠毒素″LT″、霍乱毒素″CT″或百日咳毒素″PT″)及其脱毒衍生物，如称为LT-K63和LT-R72的突变毒素[108]。参考文献109中描述了将脱毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐剂，参考文献110中描述了将其用作胃肠道外佐剂。

·生物粘附剂和粘膜粘附剂，如酯化透明质酸微球[111]或壳聚糖及其衍生物[112]。

·由可生物降解和无毒材料(例如聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚正酯、聚酐、聚己酸内酯等)，优选聚(丙交酯-共-乙交酯)形成的微粒(即直径约100nm-150μm，更优选约200nm-30μm，最优选约500nm-10μm的微粒)，这些微粒任选经处理而具有带负电荷表面(例如用SDS处理)或带正电荷表面(例如用阳离子去污剂如CTAB处理)。

·脂质体(参考文献131第13和14章)。适合用作佐剂的脂质体制剂的例子描述于参考文献113-115。

·聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂[116]。这种制剂还包括聚氧乙烯山梨聚糖酯表面活性剂和辛苯糖醇[117]以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂和至少一种其它非离子表面活性剂如辛苯糖醇[118]的混合物。优选的聚氧乙烯醚选自：优选的聚氧乙烯醚选自下组：聚氧乙烯-9-月桂醚(月桂醇聚醚9)、聚氧乙烯-9-硬脂酰基(steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰基醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。

··胞壁酰肽，例如N-乙酰胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(“thr-MDP”)、N-乙酰-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(“去甲MDP”)、N-乙酰葡萄糖胺酰-N-乙酰胞壁酰-L-Al-D-异谷氨酰-L-Ala-二棕榈酰丙酰胺(″DTP-DPP″或″Theramide^TM″)和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(“MTP-PE”)。

·由第一种革兰阴性菌制备的外膜蛋白蛋白质体制剂与衍生白第二种革兰阴性菌脂多糖(LPS)制剂的组合，其中外膜蛋白蛋白质体和LPS制剂形成稳定的非共价连接佐剂复合物。这类复合物包括″IVX-908″，它是由脑膜炎奈瑟球菌外膜和LPS组成的复合物。

·甲基肌苷5′-单磷酸酯(″MIMP″)[119]。

·多聚羟化吡咯双烷类化合物[120]，如下式化合物：

式中，R选自：氢，直链或支链、未取代或取代、饱和或不饱和的酰基、烷基(如环烷基)、烯基、炔基和芳基，或其药学上可接受的盐或衍生物。例子包括但不限于：木麻黄(casuarine)、木麻黄-6-α-D-吡喃葡萄糖、3-表-木麻黄、7-表-木麻黄、3，7-二表-木麻黄等。

·γ菊粉[121]或其衍生物，如阿尔加穆林(algammulin)。

·式I、II或III的化合物或其盐：

如参考文献122所述，如′ER 803058′、′ER 803732′、′ER 804053′、′ER 804058′、′ER 804059′、′ER 804442′、′ER 804680′、′ER 804764′、ER 803022或‘ER 804057’，例如：

·大肠杆菌(Escherichia coli)如OM-174的脂质A的衍生物(如参考文献123和124所述)。

·阳离子脂质与(通常为中性)共脂质(co-lipid)的制剂，如氨基丙基-二甲基-肉豆蔻烯酰氧基-溴化丙铵-二植酰基磷脂酰-乙醇胺(″Vaxfectin^TM″)或氨基丙基-二甲基-双十二烷基氧基-溴化丙铵-二油酰基磷脂酰-乙醇胺(″GAP-DLRIE：DOPE″)的制剂。优选含有(±)-N-(3-氨基丙基)-N，N-二甲基-2，3-双(顺-9-四癸烯氧基)-1-丙铵盐的制剂[125]。

·含有连接于含磷酸无环主链的脂质的化合物，如TLR4拮抗剂E5564[126，127]：

参考文献131和132中更详细地讨论了这些和其它佐剂活性物质。

组合物可包含两种或多种所述佐剂。

组合物中的抗原和佐剂一般形成混合物。

水包油乳液佐剂

水包油乳液佐剂作为佐剂是特别有效的。多种这类乳液是已知的，它们一般包含至少一种油和至少一种表面活性剂，油与表面活性剂是可生物降解(可代谢)和生物相容性的。乳液中油滴的直径通常小于5μm，甚至可以是亚微米级，用微流化床实现这种小尺寸以提供稳定的乳液。优选小于220nm的液滴，因为它们可进行过滤除菌。

本发明可使用的油诸如动物油(如鱼油)或植物油。植物油的来源包括坚果、种籽和谷物。坚果油中最常见的是花生油、大豆油、可可油和橄榄油。也可使用获自(例如)霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻油等。在谷物油中，最常见的是玉米油，但也可采用其它谷类如小麦、燕麦、裸麦、稻、画眉草(teff)、黑小麦(triticale)等的油。可从坚果和种籽油开始，通过水解、分离和酯化合适物质制备甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯(不是种籽油中天然产生的)。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油是可代谢的，因此可用于实施本发明。由动物来源获得纯油的过程中必需的分离、纯化、皂化和其它步骤是本领域众所周知的。大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和鲸油如鲸蜡代表了可用于本发明的几种鱼油的例子。通过生化途径用5-碳异戊二烯单位合成许多支链油，它们总称为萜类。鲨鱼肝油含有支链不饱和类萜，称为鲨烯2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯，本文特别优选此类萜。鲨烯的饱和类似物鲨烷也是优选的油。鱼油，包括鲨烯和鲨烷易于从商业来源购得，或可通过本领域已知方法获得。其它优选油是生育酚(见下)。可采用油的混合物。

可通过′HLB′(亲水/亲脂平衡)对表面活性剂分类。本发明优选的表面活性剂的HLB为至少10，优选至少15，更优选至少16。可用于本发明的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80；以商品名DOWFAX出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链EP/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1，2-乙二基)数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇9(曲通(Triton)X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；衍生自十二烷醇、十六烷醇、十八烷醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽表面活性剂)，如三乙二醇单月桂基醚(苄泽30)；聚氧乙烯-9-月桂醚以及去水山梨糖醇酯(通常称为司盘)，如去水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和去水山梨糖醇单月桂酸酯。包含在乳液中的优选表面活性剂是吐温80(聚氧乙烯失水山梨糖醇酯)、司盘85(失水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。可使用表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85混合物。

本发明所用的具体水包油乳液佐剂包括但不限于：

·鲨烯、吐温80和司盘85的亚微米乳液。该乳液的体积组成可以是约5％鲨烯、约0.5％聚山梨酯80和约0.5％司盘85。以重量计，这些比例变为4.3％鲨烯、0.5％聚山梨酯80和0.48％司盘85。此佐剂称为′MF59′[128-130]，如参考文献131的第10章和参考文献132的第12章所详述。MF59乳液宜包含柠檬酸根离子，如10mM柠檬酸钠缓冲液。

·鲨烯、生育酚和吐温80的乳液。该乳液可包含磷酸盐缓冲盐水。它也可含有司盘85(如1％)和/或卵磷脂。这些乳液可含有2-10％鲨烯、2-10％生育酚和0.3-3％吐温80，鲨烯∶生育酚的重量比优选≤1，因为这能提供更稳定的乳液。可通过下述方法制备一种这样的乳液：将吐温80溶解于PBS得到2％溶液，然后将90ml该溶液与5g DL-α生育酚和5ml鲨烯的混合物混合，然后使该混合物微流体化。得到的乳液可含有(如)平均直径为100-250nm，优选约180nm的亚微米油滴。

·鲨烯、生育酚和曲通去污剂(如曲通X-100)的乳液。

·鲨烯、聚山梨酯80和泊洛沙姆401(″普罗流尼^TM L121″)的乳液。可以用磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4配制该乳液。该乳液是一种有用的胞壁酰二肽递送载体，已知与用″SAF-I″佐剂(0.05-1％Thr-MDP、5％鲨烯、2.5％普罗流尼L121和0.2％聚山梨酸酯80)配的苏氨酰基-MDP一起使用[133]。也可不与Thr-MDP一起使用，例如用″AF″佐剂(5％鲨烯、1.25％普罗流尼L121和0.2％聚山梨酸酯80)[134]。优选微流体化。

·含有0.5-50％油、0.1-10％磷脂和0.05-5％非离子型表面活性剂的乳液。如参考文献135所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴尺寸。

·不可代谢油(如轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(如卵磷脂、吐温80或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包含添加剂，例如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂体偶联物(如通过葡糖醛酸的羧基将脂族胺加到脱酰基皂苷上而产生的GPI-0100，参见参考文献136)、二甲基二-十八烷基溴化铵和/或N，N-二-十八烷基-N，N-双(2-羟乙基)丙二胺。

·皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如胆固醇)结合成螺旋胶束的乳液[137]。

可以在递送时，将该乳液与抗原临时混合。因此，在包装或出售的疫苗中该佐剂和抗原可分开保存，使用时配制成最终制剂。抗原通常是水性形式，以便最终通过混合两种液体制备疫苗。混合的两种液体的体积比可变(例如5∶1-1∶5)，但通常约为1∶1。

铝盐佐剂

可使用称为氢氧化铝和磷酸铝的佐剂。这些名称是常规名称，但仅为方便使用，因为它们都不是所代表的实际化合物的准确描述[例如参见参考文献131的第9章]。本发明可采用通常用作佐剂的任何″氢氧化物″或″磷酸盐″佐剂。

称为″氢氧化铝″的佐剂一般是羟基氧化铝盐(通常至少部分为晶体)。可采用红外(IR)光谱将式AlO(OH)代表的羟基氧化铝与其它铝化合物，如氢氧化铝Al(OH)₃区别开，具体区别是1070cm^-1处存在吸收条带和3090-3100cm^-1处存在强肩峰[参考文献131的第9章]。半高时衍射条带的宽度(WHH)反映出氢氧化铝佐剂的结晶度，由于结晶尺寸较小结晶很少的颗粒谱线增宽较大。表面积随WHH的增加而增加，WHH值较大的佐剂显示吸附抗原的能力较强。氢氧化铝佐剂呈典型的纤维形态(例如，电子透射显微照片所见的)。氢氧化铝佐剂的pI通常约11，即在生理pH下佐剂本身具有表面正电荷。据报道，pH 7.4时，氢氧化铝佐剂的吸附能力在每mg Al⁺⁺⁺1.8-2.6mg蛋白质之间。

称为″磷酸铝″的佐剂一般是羟基磷酸铝，也常常含有少量硫酸盐(即羟基磷酸硫酸铝)。可通过沉淀获得这些佐剂，沉淀期间的反应条件和浓度影响磷酸根取代该盐中羟基的程度。羟基磷酸盐的PO₄/Al摩尔比通常为0.3-1.2。羟基磷酸盐因存在羟基而有别于严格的AlPO₄。例如，3164cm^-1处的IR谱带(例如加热到200℃)表明存在结构羟基[参考文献131的第9章]。

磷酸铝佐剂的PO₄/Al³⁺摩尔比通常为0.3-1.2，优选为0.8-1.2，更优选为0.95±0.1。磷酸铝通常是无定形的，尤其是羟基磷酸盐。典型的佐剂是PO₄/Al摩尔比为0.84-0.92的无定形的羟基磷酸铝，每毫升包含0.6mg Al³⁺。磷酸铝通常是颗粒(如在透射电子显微镜照片上观察到的板状形态)。抗原吸附后颗粒直径一般是0.5-20μm(如约5-10μm)。据报道，pH 7.4时磷酸铝佐剂的吸附容量为0.7-1.5毫克蛋白质/毫克Al⁺⁺⁺。

磷酸铝的零电荷点(PZC)与磷酸对羟基的取代程度逆相关，这种取代程度可能取决于用于通过沉淀制备盐的反应条件和反应物浓度。也通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度(更多磷酸根与酸性更高的PZC有关)或加入缓冲液如组氨酸缓冲液(使PZC碱性更强)改变PZC。本发明所用的磷酸铝的PZC通常为4.0-7.0，更优选为5.0-6.5，例如约为5.7。

用于制备本发明组合物的铝盐悬浮液可以，但不一定含有缓冲剂(如磷酸盐或组氨酸或Tris缓冲剂)。该悬浮液优选无菌且无热原。该悬浮液可含有游离的水性磷酸根离子，如浓度为1.0-20mM，优选5-15mM，更优选约10mM的磷酸根离子。该悬浮液也可含有氯化钠。

本发明可使用氢氧化铝和磷酸铝的混合物。在这种情况下，磷酸铝比氢氧化铝多，例如重量比为至少2∶1，例如≥5∶1、≥6∶1、≥7∶1、≥8∶1、≥9∶1等。

给予患者的组合物中Al⁺⁺⁺的浓度优选小于10mg/ml，例如≤5mg/ml、≤4mg/ml、≤3mg/ml、≤2mg/ml、≤1mg/ml等。优选范围是0.3-1mg/ml。

其它抗原

除了修饰的糖和/或偶联物以外，本组合物还可包含其它抗原性组分。例如，组合物可包含一种或多种其它糖类(无论是否按照本发明进行修饰)。例如，组合物可包含脑膜炎奈瑟球菌的血清组C、W135和Y的糖类(如除了修饰的MenA糖以外)。这些通常偶联到载体蛋白质上，并且从脑膜炎奈瑟球菌的不同血清型得到的糖类可以偶联到相同的或不同的载体蛋白质上。当混合物包含从血清组A和C得到的荚膜糖时，优选MenA糖∶MenC糖的比(w/w)大于1(如2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1或更高)。当MenA组分对MenC组分以过量(质量/剂)存在时，观察到了MenA组分的免疫原性提高[138]。

组合物还可包含蛋白质抗原。

可包括在本发明组合物中的抗原包括：

-来自脑膜炎奈瑟球菌血清组B的蛋白质抗原(见下文)。

-脑膜炎奈瑟球菌的外膜囊泡(OMV)制品，如参考文献139、140、141、142等中披露的那些。

-幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)抗原如CagA[143-146]、VacA[147、148]、NAP[149、150、151]、HopX[如152]、HopY[如152]和/或脲酶。

-肺炎链球菌的糖抗原[如153，154，155]。

-甲型肝炎病毒，如灭活病毒的抗原[如156，157]。

-乙型肝炎病毒的抗原，如表面和/或核心抗原[如157，158]。

-丙型肝炎病毒的抗原[如159]。

-百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)的无细胞抗原，如百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，也可任选与百日咳杆菌黏附素(pertactin)和/或凝集原2和3组合使用[例如，参考文献160和161]。

-百日咳博德特菌的细胞抗原。

-白喉抗原，如白喉类毒素[如参考文献162的第3章]，如CRM₁₉₇突变体[如163]。

-脊髓灰质炎病毒抗原[如164，165]如灭活骨髓灰质炎病毒(IPV)。

-破伤风抗原，如破伤风类毒素[如参考文献162的第4章]。

-流感嗜血杆菌B的糖抗原[如参考文献166-174]。

-麻疹、腮腺炎和/或风疹抗原[如参考文献162的第9、10和11章]。

-淋病奈瑟球菌抗原。

-肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)抗原[例如，175、176、177、178、179、180、181]。

-沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)抗原[例如，182]。

-牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)抗原[例如，183]。

-狂犬病抗原[如184]如冻干的灭活病毒[如185，RabAvert^TM]。

-流感抗原[如参考文献162的第19章]，如血细胞凝集素和/或神经氨酸酶表面蛋白。

-粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)抗原[如186]。

-无乳链球菌(B型链球菌)的抗原[如187、188]。

-无乳链球菌(B型链球菌)的糖抗原。

-酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A型链球菌)的抗原[如188、189、190]。

-金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抗原[如191]。

-炭疽杆菌(Bacillus anthracis)抗原[如192、193、194]。

-单纯疱疹病毒(HSV)抗原。用于本发明的优选HSV抗原是膜糖蛋白gD。优选使用HSV-2毒株的gD(′gD2′抗原)。该组合物可使用C-末端膜锚定区缺失的gD形式[195]，如包含天然蛋白的氨基酸1-306且C-末端加入天冬酰胺和谷胺酰胺的截短的gD。这种蛋白质形式包含信号肽，信号肽被切割后产生成熟的283个氨基酸的蛋白质。缺失锚定物，以便将该蛋白制备成可溶形式。

-人乳头瘤病毒(HPV)抗原。用于本发明的优选HPV抗原是L1衣壳蛋白，该蛋白可组装形成称为病毒-样颗粒(VLP)的结构。可通过在酵母细胞(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))或昆虫细胞(例如夜蛾(Spodoptera)细胞，如草地贪夜蛾(S.frugiperda)，或果蝇(Drosophila)细胞)中重组表达L1产生VLP。在酵母细胞中，质粒载体可携带L1基因；在昆虫细胞中，杆状病毒载体可携带L1基因。更优选地，该组合物包含来自HPV-16和HPV-18毒株的L1 VLP。已证明这种二价组合非常有效[196]。除了HPV-16和HPV-18毒株外，也可能包含来自HPV-6和HPV-11毒株的L1 VLP。也可能采用致癌性HPV毒株。疫苗可包含20-60μg/ml(如约40μg/ml)L1/HPV毒株。

-黄病毒属病毒，如黄热病病毒、日本脑炎病毒、登革热病毒的四种血清型、蜱媒脑炎病毒、西尼罗河病毒的抗原。

-瘟病毒抗原，如经典的猪热病毒、牛病毒性腹泻病毒和/或边界病病毒的抗原。

-细小病毒，如细小病毒B19的抗原。

-朊病毒蛋白(如CJD朊病毒蛋白)。

-淀粉样蛋白，如β肽[197]。

-癌抗原，如参考文献198的表1或参考文献199的表3和4中列出的那些。

该组合物可包含一种或多种这些额外抗原。

必要时，可使有毒的蛋白质抗原脱毒(如通过化学和/或遗传方式使百日咳毒素脱毒[161])。

当组合物中包含白喉抗原时，也优选包含破伤风抗原和百日咳抗原。相似地，当包含破伤风抗原时，也优选包含白喉和百日咳抗原。相似地，当包含百日咳抗原时，也优选包含白喉和破伤风抗原。

抗原可吸附于铝盐。

组合物中各抗原的浓度一般是至少1μg/ml。通常，任何给定抗原的浓度将足以引发针对该抗原的免疫应答。

作为本发明组合物中使用蛋白质抗原的另一种替代方式，可使用编码该抗原的核酸[如参考文献200-208]。因此，本发明组合物的蛋白质组分可被编码该蛋白的核酸(优选DNA，如质粒形式的DNA)取代。

非糖类脑膜炎球菌抗原

尽管脑膜炎球菌血清组A、C、W135和Y的荚膜糖可用来产生保护性免疫，但相同的方法对于血清组B无效。因此本发明的修饰的糖和偶联物可与非基于荚膜糖的脑膜炎球菌抗原如蛋白质抗原、脂多糖或膜囊泡一起使用(例如单独使用或混合使用)。

已经报道了脑膜炎球菌血清组A[209]和B[210，211]的基因组序列，并可从编码多肽中选择合适的蛋白质抗原[如参考文献212-217]。对候选抗原进行操作以改善异源表达[参考文献218-220]。

一种优选的组合物包含Tbp蛋白和Hsf蛋白[221]。Hsf是一种自转运蛋白[222-224]，也称为nhhA[224]、GNA0992[212]或NMB0992[210]。Tbp是运铁蛋白结合蛋白[225-228]，包括TbpA和TbpB以及TbpA和TbpB的高分子量和低分子量形式。Tbp包括上述各种蛋白质以及蛋白质的复合物以及能够结合运铁蛋白的任何其他蛋白质或其复合物。尽管Tbp可表示TbpA或TbpB的高或低分子量形式，但优选TbpA和/或TbpB的高分子量和低分子量形式同时存在。最优选地，存在TbpA的高分子量和低分子量形式。

另一种优选组合物包含至少一种选自对奈瑟菌属具有不同功能的至少两种不同类型蛋白质中每一种的抗原。这种蛋白质类型的例子有：粘附素、自转运蛋白、毒素、整合外膜蛋白和铁获取蛋白。可如下选择这些抗原，采用参考文献229的命名法：至少一种选自FhaB、NspA PilC、Hsf、Hap、MafA、MafB、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119或NadA的奈瑟菌属粘附素；至少一种选自Hsf、Hap、IgA蛋白酶、AspA或NadA的奈瑟菌属自转运蛋白；至少一种选自FrpA、FrpC、FrpA/C、VapD、NM-ADPRT(NMB1343)以及LPS免疫型(immunotype)L2和LPS免疫型L3之一或两者的奈瑟菌属毒素；至少一种选自TbpA、TbpB、LbpA、LbpB、HpuA、HpuB、Lipo28(GNA2132)、Sibp、NMB0964、NMB0293、FbpA、Bcp、BfrA、BfrB或P2086(XthA)的奈瑟菌属铁获取蛋白；至少一种选自PilQ、OMP85、FhaC、NspA、TbpA、LbpA、TspA、TspB、TdfH、PorB、MItA、HpuB、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA(GNA1946)、NMB1124、NMB1162、NMB1220、NMB1313、NMB1953、HtrA或PLDA(OMPLA)的奈瑟菌属膜相关蛋白，优选外膜蛋白，优选整合外膜蛋白。据说奈瑟菌属抗原的这些组合能导致疫苗抗奈瑟菌属感染的效力异常增强[229]。

特别优选的组合物包含以下五种抗原中的一种或多种[230]：(1)‘NadA’蛋白，优选采取低聚形式(如采取三聚形式)；(2)‘741’蛋白；(3)‘936’蛋白；(4)‘953’蛋白；和(5)‘287’蛋白。

来自MenB的“NadA”(奈瑟菌粘附素A)在参考文献215中被称为蛋白“961”(SEQ ID 2943和2944)，在参考文献210中被称为“NMB1994”(参见GenBank登录号：11352904和7227256)。有关该蛋白的详细描述见于参考文献231。按照本发明的描述被使用时，NadA可有不同的形式。NadA的优选形式是野生型序列的截短或缺失变体，如参考文献218-220所描述的那些形式。尤其优选无C-端膜锚定序列的NadA(如，对于2996株来说，缺失残基351-405)。

来自MenB的“741”蛋白描述于参考文献215中(SEQ ID 2535和2536)，在参考文献210中标记为“NMB1870”(参见GenBank登录号GI：7227128)。血清组A的相应蛋白[209]在GenBank中的登录号为7379322。天然的741是脂蛋白。按照本发明的描述被使用时，741可有不同的形式。741的优选形式是野生型序列的截短或缺失变体，如参考文献218-220所描述的那些形式。尤其，741的N-端可以缺失到并包含其聚甘氨酸序列(即，对于MC58株来说是缺失残基1到72)，在本文中有时用“ΔG”前缀加以区分。这种缺失可增强其表达。缺失还可以去除741的脂化位点。各种741序列可在参考文献220的SEQ ID 1-22、在参考文献232的SEQ ID 1-23、以及在参考文献233的SEQ ID 1-299中找到。

来自于血清组B的“936”蛋白描述于参考文献215中(SEQ ID 2883和2884)，在参考文献210中标记为“NMB2091”(参见GenBank登录号GI：7227353)。血清组A的相应基因[209]在GenBank中的登录号为7379093。按照本发明的描述被使用时，936可有不同的形式。936的优选形式是野生型序列的截短或缺失变体，如参考文献218-220所描述的那些形式。尤其，936的N端前导肽可以是缺失的(例如，对于MC58株来说缺失残基1到23)，被称为936^(NL))。

来自于血清组B的“953”蛋白描述于参考文献215中(SEQ ID 2917和2918)，在参考文献210中标记为“NMB1030”(参见GenBank登录号GI：7226269)。血清组A的相应蛋白[209]在GenBank中的登录号为7380108。按照本发明的描述被使用时，953可有不同的形式。953的优选形式是野生型序列的截短或缺失变体，如参考文献218-220所描述的那些形式。尤其，953的N端前导肽可以是缺失的(例如，对于MC58株来说缺失残基1到19)。

来自于血清组B的“287”蛋白描述于参考文献215中(SEQ ID 3103和3104)，在参考文献210中标记为“NMB2132”，在参考文献212中称为‘GNA2132’(参见GenBank登录号GI：7227388)。血清组A的相应蛋白[209]在GenBank中的登录号为7379057。按照本发明的描述被使用时，287可有不同的形式。287的优选形式是野生型序列的截短或缺失变体，如参考文献218-220所描述的那些形式。更特殊的是，287的N端可以缺失到并包含其聚甘氨酸序列(即，对于MC58株来说是缺失残基1到24，得到ΔG287)。

蛋白287优选来自菌株2996，或者更优选来自菌株394/98。蛋白741优选来自血清组B菌株MC58、2996、394/98或95N477，或来自血清组C菌株90/18311。更加优选菌株MC58。蛋白936、953和NadA优选来自菌株2996。当组合物中包含特定蛋白质抗原(如741或287)时，该组合物可包含一种以上变体形式的抗原，例如是相同的蛋白质但来自一种以上的菌株。这些蛋白质可以串联或单独的蛋白质形式存在。

可包含在本发明组合物中的其他MenB多肽抗原包括包含以下氨基酸序列的那些：参考文献213的SEQ ID NO：650；参考文献213的SEQ ID NO：878；参考文献213的SEQ ID NO：884；参考文献213的SEQ ID NO：4；参考文献214的SEQ ID NO：598；参考文献215的SEQ ID NO：818；参考文献215的SEQ IDNO：864；参考文献215的SEQ ID NO：866；参考文献215的SEQ ID NO：1196；参考文献215的SEQ ID NO：1272；参考文献215的SEQ ID NO：1274；参考文献215的SEQ ID NO：1640；参考文献215的SEQ ID NO：1788；参考文献215的SEQ ID NO：2288；参考文献215的SEQ ID NO：2466；参考文献215的SEQID NO：2554；参考文献215的SEQ ID NO：2576；参考文献215的SEQ IDNO：2606；参考文献215的SEQ ID NO：2608；参考文献215的SEQ ID NO：2616；参考文献215的SEQ ID NO：2668；参考文献215的SEQ ID NO：2780；参考文献215的SEQ ID NO：2932；参考文献215的SEQ ID NO：2958；参考文献215的SEQ ID NO：2970；参考文献215的SEQ ID NO：2988，或包含某氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列：(a)与所述序列具有50％或更高相同性(如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高)；和/或(b)包含所述序列中至少n个连续氨基酸的片段，其中n是7或更大(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。(b)的优选片段包含相关序列的表位。可包含这些多肽中的一个以上(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多)。

然而，在一些实施方式中，本发明的组合物包含相同的但来自一种以上菌株的蛋白质。已经发现该方法对于741蛋白有效。该蛋白是引发抗-脑膜炎球菌抗体应答的极其有效的抗原，并在所有脑膜炎球菌血清组中表达。系统进化分析显示，该蛋白质分为两组，其中一组又可一分为二，从而总共得到三种变体[234]，而抗特定变体的抗血清在相同变体组内具有杀菌作用，但对于表达其他两种变体之一的菌株无活性，即存在变体内交叉保护，但不存在变体间交叉保护[232，234]。因此，为使交叉株效力最大，优选的是组合物中应包含一种以上的蛋白741的变体。

本发明的组合物包含小量(如小于t种抗原，其中t是10、9、8、7、6、5、4或3)纯化的血清组B蛋白质。所述蛋白质优选在异源宿主内重组表达，然后纯化。对于包含t种MenB抗原的组合物，可能存在t种独立的多肽，但为进一步降低复杂程度，优选至少两种抗原作为一条多肽链表达(‘杂交’蛋白[参考文献218-220])，即t种抗原形成少于t种的多肽。杂交蛋白主要提供两个优点：首先，本身不稳定或弱表达的蛋白质可通过加入能克服该问题的合适的杂交伴侣来辅助；其次，商业制造被简化，这是由于为制造两种单独使用的蛋白质只需要采取一次表达和纯化。本发明组合物中所包括的杂合体可包含上面列出的五种蛋白质中的两种或多种(即2、3、4或5种)。优选由5种蛋白质中的2种构成的杂合体。

另一种优选的组合物包含血清组B脂寡糖(LOS)[235]。LOS可与血清组B多肽一起使用或者可代替它/它们使用。

膜囊泡也可用于该组合物。这些囊泡可以是通过破坏脑膜炎球菌外膜以形成包括外膜中蛋白质组分的外膜囊泡而获得的任何蛋白脂质体(proteoliposomic)囊泡。‘OMV’是从细菌人工制备的(如通过去污剂处理)，因此不同于微囊泡(MV[236])和‘天然OMV’(‘NOMV’[237])，这两者都是在细菌生长过程中自发形成并被释放到培养基中的天然行速成的膜囊泡。可通过在肉汤培养基中培养奈瑟菌属、由肉汤培养基中的较小泡(bled)分离完整细胞、然后从耗尽细胞的培养基中收集MV，从而获得MV。通常根据培养物内产生的MV的量来选择用于制造MV的菌株，如参考文献238和239描述了具有高MV产量的奈瑟菌属。也可从mltA敲除株获得囊泡[240]。

为降低热原活性，优选的是细菌应具有低内毒素(LPS)水平。合适的突变株细菌是已知的，如奈瑟菌属突变株[241]和螺杆菌属突变株[242]。从革兰阴性菌制备耗尽LPS的外膜的方法描述于参考文献243。

所述细菌可以是野生型菌，或者可以是重组菌。优选的重组菌过表达(相对于相应的野生型菌株)诸如NspA、蛋白287[244]、蛋白741[244]、TbpA、TbpB、超氧化物歧化酶[245]等免疫原。细菌可表达一种以上的PorA I类外膜蛋白，如2、3、4、5或6种PorA亚型：P1.7，16；P1.5，2；P1.19，15；P1.5c，10；P1.12，13；和P1.7h，4[如参考文献246和247]。

可用于本发明的其他重组菌具有一种或多种突变以降低(或者优选敲除)特定基因产物的表达(如见参考文献248和249)。优选的被下调和/或敲除的基因包括：(a)Cps、CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Opc、PilC、PorA、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB[248]；(b)CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Opc、PhoP、PilC、PmrE、PmrF、PorA、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB[249]；(c)裂解糖基转移酶NMB0033[250]；(d)ExbB、ExbD、rmpM、CtrA、CtrB、CtrD、GalE、LbpA、LpbB、Opa、Opc、PilC、PorA、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB[251]；和(e)CtrA、CtrB、CtrD、FrpB、OpA、OpC、PilC、PorA、PorB、SiaD、SynA、SynB和/或SynC[252]。

优选的作为这些非糖类抗原来源的血清组B菌株是MC58、2996、H44/76、394/98和新西兰菌株98/254。然而，要使用的最佳血清型和菌株将取决于特定地理区域内流行的菌株。例如，脑膜炎球菌可以是任何血清型(如1、2a、2b、4、14、15、16等)、任何血清亚型(P1.2；P1.4；P1.5；P1.5，2；P1.7，16；P1.7，16b；P1.9；P1.9，15；P1.12，13；P1.13；P1.14；P1.15；P1.21，16；P1.22，14；等)和任何免疫型(如L1；L3，3，7；L10；等)，优选菌株包括：(a)B：4：P1.4；(b)B：4：P1.15；(c)B：15：P1.7，16；和(d)B：4：P1.7b，4。脑膜炎球菌可来自任何合适谱系，包括超侵入性和超毒性的谱系，如以下七种超毒性谱系中的任何一种：亚群I；亚群III；亚群IV-1；ET-5复合体；ET-37复合体；群落A4；谱系3。用多基因座酶电泳法(MLEE)确定这些谱系，但也可采用多基因座序列分型法(MLST)对脑膜炎球菌进行分类[参考文献253]，例如，用MLST确定ET-37复合体是ST-11复合体，ET-5复合体是ST-32(ET-5)，谱系3是ST-41/44，等等。

非糖类抗原通常诱导有效抵抗MenB超毒性(hypervirulent)谱系A4、ET-5和谱系3中两种或三种的血清杀菌抗体反应。它们还可诱导对超毒性谱系亚群I、亚群III、亚群IV-1或ET-37复合体中一种或多种以及对其它谱系(如超侵入性谱系)的杀菌反应。这些抗体反应可在小鼠中方便地测量并且是疫苗功效的标准指标[如参见参考文献212的尾注14]。血清杀菌活性(SBA)测量补体介导的细菌杀灭，并可采用人或幼兔补体来测定。WHO标准要求疫苗能在90％以上的接受者中诱导SBA升高至少4倍。

该组合物不需要诱导针对这些超毒性谱系内每种MenB菌株的杀菌抗体，而是说(例如)，对于具体超毒性谱系内脑膜炎球菌血清组B的四个或多个菌株的任何给定组，该组合物诱导的抗体对该组中至少50％(如60％、70％、80％、90％或更多)有杀菌性。优选的菌株组包括在以下至少四个国家中分离的菌株：GB、AU、CA、NO、IT、US、NZ、NL、BR和CU。血清的杀菌效价优选为至少1024(如2¹⁰、2^U、2¹²、2¹³、2¹⁴、2¹⁵、2¹⁶、2¹⁷、2¹⁸或更高，优选至少2¹⁴)，即以1/1024的比例稀释时血清能够杀伤至少50％的具体菌株的受试细菌，如参考文献212所述。

优选组合物可诱导对以下血清组B脑膜炎球菌菌株的杀菌反应：(i)来自A4群落的菌株961-5945(B：2b：P1.21，16)和/或菌株G2136(B：-)；(ii)来自ET-5复合体的菌株MC58(B：15：P1.7，16b)和/或菌株44/76(B：15：P1.7，16)；(iii)来自谱系3的菌株394/98(B：4：P1.4)和/或菌株BZ198(B：NT：-)。更优选的组合物可诱导对菌株961-5945、44/76和394/98的杀菌反应。菌株961-5945和G2136都是奈瑟球菌MLST参比菌株[参考文献254中编号638和1002]。菌株MC58可从广泛来源获得(如ATCC BAA-335)，它是参考文献210中测序的菌株。菌株44/76被广泛使用和表征(如参考文献255)，它是奈瑟球菌MLST参比菌株之一[参考文献254中编号237；参考文献256中表2的第32行]。菌株394/98最初在1998年来源于新西兰，已经有数篇采用此菌株的发表研究(如参考文献257和258)。菌株BZ198是另一种MLST参比菌株[参考文献254中编号409；参考文献256中表2的第41行]。该组合物还可诱导针对来自ET-37复合物的W135血清组菌株LNP17592(W135：2a：P1.5，2)的杀菌反应。

概述

术语“含有”包括“包含”以及“由...组成”，例如“含有”X的组合物可仅由X组成或可包含其它物质，例如X+Y。

术语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。必要时，可从本发明定义中删去术语″基本上″。

与数值x相关的术语“约”表示，例如x±10％。

术语“烷基”在文中表示直链和支链形式的烷基基团。然而，术语“烷基”通常表示直链形式的烷基基团。所述烷基可被1、2或3个选自-O-、-NH-或-S-的杂原子打断。所述烷基也可被1、2或3个双键或三键打断。然而，术语“烷基”通常表示不具有杂原子中断或者双键或三键中断的烷基基团。当提及C_1-6烷基时表示含有1和6之间任何碳原子数目的烷基基团(如C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆)。

术语“烯基”在文中表示如上文所定义的二价烷基基团。当提及C_1-5烯基时表示含有1和5之间任何碳原子数目的烯基基团(如C₁、C₂、C₃、C₄、C₅)。类似地，当提及C_1-4烯基时表示含有1和4之间任何碳原子数目的烯基基团(如C₁、C₂、C₃、C₄)。

术语“氨基”包括式-NH₂或-NH-E的基团，其中E是氮保护基。典型的氮保护基的例子如上所述。

术语“胺”表示式-NH₂的基团，文中另有说明除外。

术语“修饰的荚膜糖”表示可通过适当修饰从天然荚膜糖获得的糖。因此，天然荚膜糖中重复单糖单元的基础序列在本发明的修饰的荚膜糖内得以保留。

术语“糖”包括寡糖(如含有2-39个单糖单元)和多糖(如含有40个或更多单糖单元)。如原本在细菌中所发现的，天然荚膜糖通常采取多糖形式。多糖可被处理以得到较短的寡糖。寡糖可通过将天然多糖纯化和/或解聚随后定径(如通过温和酸水解、通过加热、通过排阻层析等等)获得。

将动物(特别是牛)材料用于培养细胞时，它们应获自未患传染性海绵状脑病(TSE)，特别是未患牛海绵状脑病(BSE)的来源。总之，优选在完全不含动物来源物质的情况下培养细胞。

应理解，可离子化的基团可以本文式中所示的中性形式存在，或者可以带电形式存在，这取决于pH。因此，磷酸基团可以是-P-O-(OH)₂，此式仅代表中性磷酸基团，本发明也包括其它带电形式。类似地，文中提及阳离子和阴离子基团时应表示生理条件下基团上存在的电荷，如胺-NH₂被质子化得到阳离子性-NH³⁺基团，这种质子化是生理pH下发生的。此外，羧基-COOH去质子化得到阴离子性-COO^-基团，这种质子化可在生理pH下发生。此外，本发明包括带电形式的本发明分子的盐。糖环可以是开环或闭环形式，虽然本文结构式中显示的是闭环形式，但本发明也包括开环形式。类似地，本发明包括本发明分子的异构形式，包括互变异构体(如亚胺/烯胺互变异构体)、构象异构体、对映体、非对映体等。

在确定血清组后，脑膜炎球菌分类包括血清型、血清亚型和免疫型，标准术语表为血清组、血清型、血清亚型和免疫型，其中由冒号分开，如B：4：P1.15：L3，7，9。在血清组B内，某些谱系常常可引起疾病(超侵袭性的)，某些谱系所导致的疾病比其他谱系更严重(超毒性的)，而另外一些谱系却根本不致病。现在已知有7种具有超毒性的谱系，分别是亚群I、III和IV-1、ET-5复合物、ET-37复合物、A4簇和谱系3。这些谱系已通过多基因座酶电泳(MLEE)方法确定，但是也可以用多基因座序列分型(MLST)方法对脑膜炎球菌进行分类[参考文献256]。

附图简要说明

图1提供了化学合成CRM₁₉₇-MenA偶联物的流程。展示了“MenA10/90”(MenA寡糖，在约10％的单糖单元上包含4，5-二羟基戊基氨基甲酸酯封端基团，在约90％的单糖单元上包含2-羟基乙基氨基甲酸酯封端基团)和“MenA10/0”(MenA寡糖，在约10％的单糖单元上包含4，5-而羟基戊基氨基甲酸酯封端基团)的通用结构。

图2提供了分级之前(图A)和之后(图B)MenA寡糖的214nm阴离子交换分析概况。

图3提供了25℃时未经化学修饰的MenA寡糖(图A)、MenA10/90寡糖(图B)和MenA10/0寡糖(图C)的600MHz¹H NMR谱。

图4比较了37℃储存期间未经化学修饰的MenA寡糖、MenA10/90寡糖和MenA10/0寡糖产生的磷酸单酯的百分比。

图5提供了MenA寡糖的³¹P NMR谱。

图6比较了通过³¹P NMR测得的37℃储存期间未经化学修饰的MenA寡糖、MenA10/90寡糖和MenA10/0寡糖的聚合度(DP)。

图7提供了以下CRM-MenA寡糖偶联物的SDS-PAGE概况：泳道M-分子量标记；泳道1-CRM；泳道2-CRM-MenA10/90；和泳道3-CRM-MenA10/0。

图8比较了37℃储存期间CRM-MenA10/90寡糖偶联物和CRM-MenA10/0寡糖偶联物释放的游离糖(FS)。

图9比较了37℃储存期间CRM-MenA10/90寡糖偶联物和CRM-MenA10/0寡糖偶联物产生的磷酸单酯百分比。

本发明实施方式

实施例1

MenA寡糖的修饰

MenA多糖的受控水解

通过化学水解MenA多糖溶液产生MenA寡糖。简言之，将MenA多糖溶于50mM乙酸缓冲液pH 4.75使最终浓度达到10mg/ml。在73℃加热溶液直到聚合度(DP)达到约10。通过监测溶液光学活性(αHg 365nm)随时间的变化来控制水解，采用以下等式计算DP：DP＝1/{0.5817[1-(α_t/α_m)]}，其中α_m是当溶液温度为50℃时6种样品的平均旋光强度，α_t是t时刻的旋光强度。当与DP相对应的α值达到10时停止水解。水解反应结束时将溶液室温冷却并将pH校准到约6.5。

MenA寡糖的大小分级

MenA多糖的受控酸性水解产生具有目标平均DP的多分散性。为制备偶联物，可采用两步大小分级进一步限制寡糖多分散性。这些分级步骤通常使MenA寡糖的DP从大约10的值变化到15和20之间的值，所述值由总磷(Pt)和最终磷酸单酯(Pm)值之间的摩尔比来测量。Pt浓度按照参考文献259中描述的方法测定，Pm通过测量马铃薯酸性磷酸酶参与的酶反应释放的无机磷酸盐来测定[260]。

简言之，MenA水解产物首先通过30KDa切向流过滤膜超滤以除去高分子量物质。该过程当中，产物被浓缩约10倍，然后用13体积的5mM乙酸缓冲液(pH 6.5)渗滤。收集含有所需寡糖的渗出物并弃去残余物。

在第二个步骤中，通过阴离子交换柱层析将渗出物分级。该步骤被设计成能除去DP小于6的免疫原性可能较弱的低Mw物质[261]。将30KDa超滤获得的寡糖混合物加载到之前用5mM乙酸钠，pH 6.5平衡的Q-Sepharose FastFlow填充的柱上。寡糖/填充体积的比值为17mg/ml填充树脂。然后柱子用5柱体积(cv)平衡缓冲液洗涤。然后在柱上施加10cv 5mM乙酸钠缓冲液/125mM NaCl，pH 6.5洗液以洗脱DP≤6的寡糖。然后用5mM乙酸钠缓冲液/500mM NaCl，pH 6.5洗脱以回收所需寡糖组分。用5cv 2M NaCl剥离并用1MNaOH清洗完成该过程。

用分析型阴离子交换层析来测量分级之前和之后的寡糖多分散性。简言之，MenA寡糖的多分散性采用Mono-Q HR 5/5柱通过HPLC分析。用水平衡之后将1ml含有约1mg糖的样品加载到柱上，然后用0到60％的NaCl 1M线性梯度以0.5ml的流速展开。在214nm监测色谱图。用指定DP分别为5和6(通过质谱和¹H NMR证实)的单分散性MenA寡糖的标准制品来鉴定检测的多分散性样品中DP低于6的寡糖的存在或去除。图2显示了水解产物(图A)与分级的MenA寡糖(图B)的分析概况的比较。

抗衡离子交换

两步大小分级过程得到的Q-Sepharose洗脱液在3KDa膜上超滤以交换钠抗衡离子与四丁基铵，后者为寡糖提供非水性溶剂溶解度。简言之，MenA寡糖溶液用4体积10mM四丁基溴化铵渗滤，随后10体积水渗滤。收集含有所需产物的渗余物并弃去渗出物。通过旋转蒸发除去渗余物中的水。

MenA寡糖的化学修饰

MenA寡糖用1，1′-羰二咪唑(CDI)活化随后仅与1-氨基-4，5-戊二醇(APD)或与APD和2-氨基乙醇(ETA)反应以获得两种不同的目标结构(图1)：

i)在10％单糖单元上含有4，5-二羟基戊基氨基甲酸酯封端基团并在约90％的单糖单元上含有2-羟基乙基氨基甲酸酯封端基团的MenA寡糖(MenA10/90)；

ii)在约10％单糖单元上含有4，5-二羟基戊基氨基甲酸酯封端基团的MenA寡糖(MenA10/0)。

简言之，将上述3KDa膜超滤衍生的MenA寡糖溶于DMSO使终浓度约为10mg/ml。在该溶液中加入20倍摩尔过量的CDI(相对于MenA单糖单元的摩尔数)并将溶液室温搅拌2小时。然后在活化的寡糖溶液中加入9体积冷的(-20℃)乙酸乙酯，然后加入2M CaCl₂溶液至最终摩尔浓度与MenA单糖单元相等。将该混合物搅拌30分钟，在寡糖沉降后通过抽吸除去大部分上清液并通过离心回收沉淀，用乙酸乙酯洗涤3次并真空干燥。

为加入封端基团，将活化的寡糖溶于DMSO至终浓度为10mg/ml。为获得“MenA10/0”寡糖，加入0.1倍摩尔过量(相对于MenA单糖单元的摩尔数)的APD，并将反应物室温搅拌2小时。之后边搅拌边加入19体积的0.25M磷酸钠缓冲液，pH 6.5。该操作期间形成的任何絮状物通过0.2μm膜过滤除去。为获得“MenA10/90”寡糖，加入0.6倍摩尔过量的三乙胺和0.1倍摩尔过量的APD并将反应物室温搅拌2小时。随后，在该溶液中加入50倍摩尔过量的ETA(相对于MenA单糖单元的摩尔数)，将溶液室温下继续搅拌2小时。之后再次边搅拌边加入19体积0.25M磷酸钠缓冲液，pH 6.5并通过0.2μm膜过滤除去任何絮状物。

通过3KDa膜超滤从过量低分子量试剂中纯化衍生寡糖的粗溶液。将溶液首先浓缩约20倍，然后用10体积0.1M磷酸钠缓冲液，pH 7.2和随后的10体积蒸馏水渗滤。从渗余物中回收纯化产物并弃去渗出物。

通过 ¹ H NMR证实化学修饰

化学修饰的MenA寡糖通过NMR鉴定以证实已经发生了所需的化学修饰。

天然MenA寡糖的¹H NMR谱示于图3A。该图谱与公开文献一致[262，263]。对纯APD和ETA进行的¹H NMR得到以下信号：APD信号：HOCH₂ ^ACH^B(OH)CH₂ ^CCH₂ ^DCH₂ ^ENH₂(H^A，3.6ppm，H^B，3.7ppm，H^C，1.5ppm，H^D，1.6ppm，H^E，2.7ppm)；ETA信号：HOCH₂ ^FCH₂ ^GNH₂(H^F，4.4ppm，H^G，3.6ppm)。这些赋值被用作鉴别衍生寡糖图谱中APD和ETA信号的指导。MenA10/90寡糖的¹H NMR谱示于图3B。MenA10/0寡糖的¹H NMR谱示于图3C。被引入N-乙酰-甘露糖胺4和/或3位的ETA或APD基团与羰基之间的共价键被HSQC谱中检测到的(¹H，¹³C)异核相关性证实。检测到羰基与ETA的H^G或APD的H^E之间的大范围相关峰。类似地，羰基与N-乙酰-甘露糖胺的3/4位中的成对(germinal)质子大范围相关。将来自APD和MenA的所选信号整合以便估算通过化学处理引入的APD基团的百分比。将1.5ppm(APD基团)的H^D+H^C重叠信号与4.6ppm(MenA寡糖)的H₂峰整合。在不同实验中，6％到14％的MenA单糖单元被APD基团取代。按照相同方法，用3.6ppm(ETA基团)的H^F重叠信号与4.6ppm(MenA寡糖)的H₂峰的比值估算ETA基团。由于与APD信号(H^A，3.6ppm，以及H^B，3.7ppm)部分重叠，将H^D+H^C值的3/4减去H^F的积分。在不同实验中，66％到85％的MenA单糖单元被ETA基团取代。如所预计的，在图3C中，与ETA基团相关的信号不存在，这证实了预计的结构和NMR作为结构阐明和相同性评估工具的适用性。图3A表明O-乙酰化在血清组A脑膜炎球菌多糖酸性水解后被保留，且尽管氨基甲酸酯基团改变了局部磁场并使赋值更加复杂，但O-乙酰化状态在化学修饰后似乎被维持(图3B和3C)。

MenA寡糖的稳定性

作为磷酸二酯键水解的结果，MenA寡糖的降解导致新形成磷酸单酯基团。将MenA10/90和MenA10/0寡糖的稳定性与天然寡糖的稳定性进行比较。

简言之，将浓度为1.4-3mg/ml的MenA寡糖溶液在10mM组氨酸缓冲液，pH 7.2中37℃培育。在为期42天的不同时间点上分析寡糖在储存期间产生的磷酸单酯的量。

图4显示上述三种寡糖在37℃储存期间磷酸单酯基团增加。磷酸单酯的百分比用[Pm(t)-Pm(0)]x100/[(Pt(0)-Pm(0)]计算，其中Pm(t)和Pt(t)是t时刻磷酸单酯基团和总磷的浓度；Pm(0)和Pt(0)是0时刻磷酸单酯基团和总磷的浓度。总磷(Pt)浓度按照参考文献259中描述的方法测定，最终磷酸单酯(Pm)通过测量马铃薯酸性磷酸酶参与的酶反应释放的无机磷酸盐来测定[260]。

MenA10/90和MenA10/0寡糖显示出与天然寡糖相比稳定性改善，随时间释放磷酸单酯基团的趋势降低可证实此点。这些结果显示，通过用本发明的封端基团封闭N-乙酰甘露糖胺4和3位的羟基可增强MenA寡糖的稳定性。

类似地，用³¹P NMR分析[264]来评价与天然寡糖相比在10mM组氨酸缓冲液pH 7.2中37℃储存42天时修饰的MenA寡糖的稳定性。简言之，通过链内磷酸二酯基团(P_链内)和磷酸单酯非还原性末端基团(P_{非还原性末端})之间的摩尔比来确定平均解聚度(avDP)(图5)。

avDP＝[P_链内+1]/P_{非还原性末端}

同样，MenA10/90和MenA10/0寡糖显示出与天然寡糖相比稳定性改善，所有时间点上聚合度较高可证实此点(图6)。

表I

CRM₁₉₇-MenA偶联物

通过受控的高碘酸盐氧化产生反应性醛基

MenA10/90和MenA10/0寡糖中衍生自APD的4，5-二羟基戊基氨基甲酸酯封端基团的邻位羟基用有限的高碘酸钠氧化以产生反应性醛基。简言之，使0.1M磷酸钠缓冲液，pH 7.2配制的MenA10/90和MenA10/0寡糖的溶液与每摩尔MenA单糖单元0.1摩尔NaIO₄反应。反应在黑暗中搅拌进行，并在225nm进行分光光度计监测。约2小时后225nm吸光度达到平台期。反应产生的醛基的量通过分析氧化反应期间释放的甲醛的等摩尔量来确定[265]。加入终浓度与NaIO₄等摩尔的乙二醇终止反应。

与4，5-二羟基戊基氨基甲酸酯封端基团的最初数量相比，醛基的产生是几乎定量的。

氧化寡糖的纯化

氧化的寡糖通过3KDa膜超滤纯化。将溶液浓缩2倍然后用10体积0.5MNaCl渗滤，接着用10体积蒸馏水渗滤。收集含有所需产物的渗余物并弃去渗出物。通过旋转蒸发除去渗余物中的水。

与CRM ₁₉₇ 偶联

通过还原胺化将氧化的MenA寡糖与CRM₁₉₇(白喉毒素的非毒性变体)偶联[266]，从而分别获得CRM-MenA10/90和CRM-MenA10/0(图1)。

简言之，以每摩尔蛋白质13摩尔醛基的比例将氧化的MenA寡糖溶于50mg/ml CRM₁₉₇溶液。加入100mM磷酸钠缓冲液，pH 7.2以使得最终的蛋白质浓度为30mg/ml。然后加入10mM磷酸钠缓冲液，pH 7.2配制的2M NaBH₃CN溶液以使得NaBH₃CN相对于醛基70倍摩尔过量。反应在37℃进行3天。然后加入14体积10mM磷酸钠缓冲液，pH 7.2，之后加入25倍摩尔过量的NaBH₄(相对于醛基的摩尔数)。将pH控制在8.5并将混合物室温搅拌2小时以猝灭任何残留的醛基。在猝灭步骤结束时再将pH校正到7.2，并将溶液通过孔径0.2μm的膜过滤。

偶联物的纯化

然后通过30KDa膜超滤从过量的试剂和残余物、未反应的寡糖中纯化偶联物。反应混合物用100体积0.01M磷酸钠缓冲液，pH 7.2渗滤，接着用50体积10mM组氨酸，pH 7.2渗滤。然后，含有纯化偶联物的溶液通过孔径为0.2μm的膜过滤并于2-8℃储存。

验证与CRM ₁₉₇ 的偶联

MenA寡糖与CRM₁₉₇的偶联通过SDS-Page证实(图7)。SDS-Page按照参考文献267进行，使用7.5％丙烯酰胺为堆积胶，7.5％丙烯酰胺为分离胶。电泳之前用样品缓冲液1∶4处理样品并煮沸10分钟。电泳在200V恒压下进行约40分钟。凝胶用考马斯染色液显色约20分钟并用乙酸/EtOH溶液(7/40％)脱色约4小时。

图7中，偶联物的曲线相比CRM₁₉₇向较高分子量迁移且明显不同于CRM₁₉₇。SDS-Page分析还证实存在高分子量物质。该物质可能是在偶联反应期间形成的，能使每个寡糖分子有多个CRM₁₉₇附着点。

还分析了偶联物的糖和蛋白质含量。观察到糖/蛋白质比例从0.20到0.32(wt/wt)。

CRM₁₉₇-MenA偶联物的稳定性

CRM₁₉₇-MenA偶联物的稳定性通过测量磷酸二酯键水解导致的未偶联糖类随时间的释放来确定。

Centricon 30装置(容量2ml)用1ml蒸馏水冲洗并离心两次。在940μl含有约0.3mg/ml糖的样品(CRM-MenA10/90或CRM-MenA10/0)中加入60μl盐水。将混合物加入装置之前按照上文所述测量总磷含量。装置在1942g离心，直到渗余物室中留下100-200μl溶液，然后用2x1ml盐水洗涤并再次离心。回收渗出物室中的溶液并用盐水将样品体积调至3ml。按上文所述分析各样品衍生的渗出物的总磷含量。

数值(P2/P1)x100代表游离糖的百分比，其中P1是Centricon处理前的总磷，P2是Centricon处理后的总磷。通过掺杂实验来证实通过膜回收的游离寡糖，方法是在940μl样品或盐水中加入60μl约2mg/ml寡糖，然后进行上述分离过程。回收率始终超过80％。

图8显示，相比CRM-MenA10/0，CRM-MenA10/90偶联物显示出释放游离糖的趋势降低。FS(游离糖)按照FS％(t)-FS％(0)计算，其中FS％(t)和FS％(0)分别是t和0时刻的游离糖百分比。

还通过测量储存期间磷酸单酯的产生确定了CRM₁₉₇-MenA偶联物的稳定性。简言之，将浓度范围从157到253μg/ml的偶联物溶液在10mM组氨酸缓冲液，pH 7.2中37℃培育。在为期42天的不同时间点上分析偶联物在储存期间产生的磷酸单酯的量。

图9显示上述两种偶联物在37℃储存期间磷酸单酯基团的增量。如上所述计算磷酸单酯的百分比。相比CRM-MenA10/0，CRM-MenA10/90偶联物显示出产生磷酸单酯的趋势降低。

CRM-MenA偶联物的免疫原性

为评价MenA偶联物引发识别天然MenA荚膜多糖的抗体的能力，在小鼠中进行了免疫原性实验。

疫苗制剂

将CRM-MenA10/90和CRM MenA10/0偶联物与磷酸钠缓冲液和AlPO₄悬浮液混合，使得在10mM磷酸钠缓冲液，pH 7.2中的终浓度为20μg/ml糖和0.6mg/ml Al³⁺。对于无佐剂制剂，AlPO₄悬浮液用磷酸钠缓冲液代替。免疫接种之前所得疫苗用盐水1∶5稀释。

小鼠的免疫

每组8只6-8周龄的雌性Balb/c小鼠用0.5ml含2μg糖的偶联疫苗皮下免疫2或3次。在两次注射方案中，第一次和第二次剂量之间的间隔为4周。在免疫之前和第二次剂量2周后进行采血。在三剂量方案中，在第0、14和28天给予疫苗并在0时刻、第三次免疫1天前(2个血清剂量之后)和14天后(3个血清剂量之后)进行采血。

免疫原性

分析免疫小鼠血清中的特异性抗-MenA荚膜多糖总IgG抗体的总量以及针对脑膜炎奈瑟球菌血清组A的补体介导的血清杀菌活性(SBA)。

基本按照参考文献268所述方法，但根据动物血清分析进行适度改进，以测定特异性抗-MenA荚膜多糖总IgG抗体。各个体小鼠血清通过滴定曲线一式两份分析。抗-MenA多糖效价采用基于参考线测定法(Reference Line AssayMethod)的软件，以小鼠Elisa单位(MEU)计算。计算各免疫组的几何平均效价(GMT)。

对各免疫组的II次免疫后和III次免疫后(当适用时)血清库进行SBA测量。标准SBA方法基于添加0.25％葡萄糖的MH(Mueller Hinton)肉汤中检测菌株(MenA F8238)的接种物。细菌培养物在5％CO₂下37℃培育，当细菌达到早期指数生长期(约0.220-0.240OD₆₀₀)时终止生长。然后用1％BSA的GBBS缓冲液将细菌稀释到10^-4并在存在热灭活血清库(56℃灭活30分钟)和25％幼兔血清作为补体来源时在5％CO₂下37℃培育1小时。然后将反应混合物铺到MH琼脂上并于37℃培育过夜。杀菌效价表示为杀死50％细菌时血清稀释度的倒数。

表II显示了抗-MenA荚膜多糖总IgG效价，表示为通过ELISA测得的GMT(+/-95置信限)以及CRM-MenA10/90和CRM-MenA10/0诱导的SBA效价。两种偶联物都能够在小鼠中诱导具有杀菌功能活性的特异性抗-MenA多糖抗体。

疫苗

2次免疫后ELISA效价

2次免疫后SBA效价

	GMT(+/-95％CI)
			CRM-MenA 10/0批号5/AlPO4	346(230；520)	＞4096＜8192
CRM-MenA 10/90批号5/AlPO4	270(217；336)	4096

表II

在第二个实验中，在有和没有AlPO₄时检测CRM-MenA10/90在小鼠中的免疫原性。CRM-MenA10/90的免疫原性在表III中证实，该表显示了第二次和第三次免疫后诱导的特异性抗-MenA IgG抗体效价和这些抗体的补体介导的杀菌活性。发现免疫前效价为阴性(SBA＜4)。这些数据表明存在佐剂增强抗体应答情况。在偶联物中观察到的免疫原性显然是寡糖与蛋白质载体化学偶联的结果，因为MenA寡糖、CRM₁₉₇和AlPO₄的物理混合物没有免疫原性。

疫苗	2次免疫后ELISA效价GMT(+/-95％CI)	3次免疫后ELISA效价GMT(+/-95％CI)	2次免疫后SBA效价	3次免疫后SBA效价
					CRM-MenA10/90批号11AlPO4	867(585；1285)	1299(1008；1675)	2048	4096
CRM-MenA10/90批号11	388(249；604)	426(241；751)	1024	2048
					寡MenA10/90批号11+CRM197+AlPO4(未偶联抗原的物理混合物)	2	2	＜4	＜4

表III

实施例2

MenA多糖的修饰

MenA多糖的化学修饰

在170mg(2.5mmol)咪唑和1mL CH₃CN中加入20mg天然MenA荚膜多糖(0.072mmol)。用磁力棒搅拌，加入163μL(1.59mmol)乙酸酐并将反应物于55℃培育21小时。咪唑∶乙酸酐的摩尔比为2∶4。用Centricon纤维素膜(截止分子量为1kDa)对Milli-Q水(1∶7体积/体积)进行渗滤步骤以纯化反应产物。最后将物质真空干燥(SpeedVac)。

通过 ¹ H NMR和 ¹³ C NMR证实化学修饰

为建立乙酰化程度，通过¹H和¹³C NMR光谱法表征修饰的MenA荚膜多糖的完整结构。

用定量NMR分析来量化糖链的O-乙酰化水平。O-乙酰化百分比用与H₁(N-乙酰-甘露糖胺残基C-1位上的质子)相比H₂ ^3OAc峰(C-3上被O-乙酰化的N-乙酰-甘露糖胺残基C-2位上的质子)、H₂ ^4OAc峰(C-4上被O-乙酰化的N-乙酰-甘露糖胺残基C-2位上的质子)和H₂ ^deOAc峰(未被O-乙酰化的N-乙酰-甘露糖胺残基C-2位上的质子)的积分来估算。通过H₂ ^3OAc和H₂ ^4OAc峰积分之和获得总的O-乙酰化水平。

％O-乙酰化＝[H₂ ^3OAc+H₂ ^4OAc]/[H₁ ^OAc+H₁ ^deOAc]

此外，O-乙酰化百分比用与H₁(N-乙酰-甘露糖胺残基C-1位上的质子)相比H₂ ^3OAc/H₂ ^4OAc峰(C-3上被O-乙酰化的N-乙酰-甘露糖胺残基C-3位上的质子以及C-4上被O-乙酰化的N-乙酰-甘露糖胺残基C-4位上的质子)的积分来估算。

％O-乙酰化＝[H₂ ^3OAc/H₂ ^4OAc]/[H₁ ^OAc+H₁ ^deOAc]

MenA多糖的稳定性

如上所述，用³¹P NMR分析来评价与天然多糖和相应的寡糖相比，在10mM组氨酸缓冲液pH 7.2中37℃储存42天的过程中，完全乙酰化的修饰的MenA荚膜多糖的稳定性。

完全O-乙酰化的修饰的MenA多糖比天然荚膜多糖和相应寡糖稳定得多。

表IV

这些结果证实，通过用本发明的封端基团封闭N-乙酰甘露糖胺4和3位的羟基可增强MenA寡糖的稳定性。

应理解，仅以举例的方式描述了本发明，可在本发明的范围和构思内进行修改。

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Claims (58)

1.一种修饰的荚膜糖，其在相应的天然荚膜糖至少一个单糖单元的羟基位置包含封端基团，其中所述封端基团具有式(Ia)或(Ib)：

-O-X-Y    (Ia)     -O-R¹     (Ib)

其中

X是C(O)、S(O)或SO₂；

Y是NR¹R²或R³；

R¹是被1、2或3个独立选自羟基、巯基或胺的基团取代的C_1-6烷基；

R²是H或C_1-6烷基；

R³是C_1-6烷基。

2.如权利要求1所述的修饰的荚膜糖，其特征在于，所述封端基团具有式(Ia)。

3.如权利要求2所述的修饰的荚膜糖，其特征在于，X是C(O)。

4.如权利要求2或3所述的修饰的荚膜糖，其特征在于，Y是NR¹R²。

5.如权利要求4所述的修饰的荚膜糖，其特征在于，R²是H。

6.如权利要求4或5所述的修饰的荚膜糖，其特征在于，R¹被1、2或3个羟基取代。

7.如权利要求4-6中任一项所述的修饰的荚膜糖，其特征在于，R¹被单个基团取代，该取代发生在C_1-6烷基链的远端。

8.如权利要求4-6中任一项所述的修饰的荚膜糖，其特征在于，R¹被两个邻位基团取代。

9.如权利要求4-8中任一项所述的修饰的荚膜糖，其特征在于，所述糖包含：a)至少一个封端基团，其中R¹被单个基团取代，该取代发生在C_1-6烷基链的远端，和b)至少一个封端基团，其中R¹被两个邻位基团取代。

10.如权利要求9所述的修饰的荚膜糖，其特征在于，其中R¹被单个基团取代的封端基团与其中R¹被两个邻位基团取代的封端基团的比例为90∶10。

11.如权利要求2或3所述的修饰的荚膜糖，其特征在于，Y是R³。

12.如权利要求11所述的修饰的荚膜糖，其特征在于，R³是CH₃。

13.如上述权利要求中任一项所述的修饰的荚膜糖，其特征在于，所述糖中至少10％的单糖单元具有封端基团。

14.如上述权利要求中任一项所述的修饰的荚膜糖，其特征在于，所述糖中所有单糖单元具有封端基团。

15.如上述权利要求中任一项所述的修饰的荚膜糖，其特征在于，所述相应的天然荚膜糖包含通过磷酸二酯键连接的单糖单元。

16.如权利要求15所述的修饰的荚膜糖，其特征在于，所述相应的天然荚膜糖是脑膜炎奈瑟球菌血清组A糖类。

17.如权利要求16所述的修饰的荚膜糖，其特征在于，所述封端基团位于相应的脑膜炎奈瑟球菌血清组A糖类的任何4-和/或3-位。

18.如权利要求17所述的修饰的荚膜糖，其特征在于，所述封端基团位于相应的脑膜炎奈瑟球菌血清组A糖类的任何4-位。

19.如上述权利要求中任一项所述的修饰的荚膜糖，其特征在于，所述修饰的荚膜糖是寡糖。

20.如上述权利要求中任一项所述的修饰的荚膜糖，其特征在于，所述修饰的糖包含末端异头羟基或衍生自末端异头羟基的氨基。

21.如权利要求1-19中任一项所述的修饰的荚膜糖，其特征在于，所述修饰的荚膜糖的至少一个单糖单元中相应天然荚膜糖的两个邻位羟基不包含封端基团。

22.如权利要求1-19中任一项所述的修饰的荚膜糖，其特征在于，所述糖的至少一个单糖单元包含R¹被两个邻位羟基取代的封端基团。

23.一种具有下式的糖：

其中

T具有式(A)或(B)：

n是1-100的整数；

各Z基团独立选自OH、OAc或如权利要求1-8或11-12所定义的封端基团；和

各Q基团独立选自OH、OAc或如权利要求1-8或11-12所定义的封端基团；

V选自-NH₂、-NHE、-NE¹E²、W²或-O-D，其中：E、E¹和E²是氮保护基，所述保护基可以是相同或不同的，且D是氧保护基；

W选自-OH或如权利要求1-8或11-12中任一项所定义的封端基团；

W¹选自-OH或如权利要求1-8或11-12中任一项所定义的封端基团；

W²选自-OH或如权利要求1-8或11-12中任一项所定义的封端基团；

且其中至少一个Z基团和/或至少一个Q基团是如权利要求1-8或11-12所定义的封端基团。

24.如权利要求23所述的糖，其特征在于，至少10％的Z基团是封端基团。

25.如权利要求23或24所述的糖，其特征在于，n是15-25的整数。

26.如权利要求23-25中任一项所述的糖，其特征在于，至少1％的Q基团是封端基团。

27.一种修饰荚膜糖的方法，该方法包括以下步骤：

(a)提供在单糖单元上具有至少一个羟基的荚膜糖；和

(b)将所述至少一个羟基转化成如权利要求1-8或11-12所定义的封端基团。

28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述封端基团是-OC(O)NR¹R²，且步骤(b)包括以下步骤：

(b1)在有机溶剂中将荚膜糖与双功能试剂反应；和

(b2)将步骤(b1)的产物与式(I)的氨基化合物反应：

HNR¹R²      (I)

其中R¹和R²如权利要求1-8中任一项所定义。

29.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述封端基团是-OC(O)R³，且步骤(b)包括以下步骤：

(b1)在存在咪唑催化剂时使荚膜糖与[(R³C(O)]₂O反应。

30.如权利要求28或29所述的方法，其特征在于，步骤(a)中的所述荚膜糖是荚膜寡糖。

31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述荚膜寡糖可通过将相应天然荚膜多糖解聚和分级获得。

32.如权利要求30所述的方法，其特征在于，步骤(a)的所述荚膜糖是天然荚膜多糖，且该方法还包括步骤(c)，其中将步骤(b)的产物分级从而得到修饰的荚膜寡糖。

33.一种修饰脑膜炎奈瑟球菌血清组A多糖的方法，该方法包括以下步骤：

(a)提供天然脑膜炎奈瑟球菌血清组A多糖；

(b)将所述多糖解聚和分级以提供寡糖；和

(c)将所述寡糖的至少一个羟基转化成如权利要求27-29中任一项所述的封端基团。

34.一种修饰脑膜炎奈瑟球菌血清组A多糖的方法，该方法包括以下步骤：

(a)提供天然脑膜炎奈瑟球菌血清组A多糖；

(b)将所述多糖的至少一个羟基转化成如权利要求27-29中任一项所述的封端基团；和

(c)将所得多糖解聚和分级。

35.一种制备如权利要求1-26中任一项所述的修饰的荚膜糖的方法，所述方法是一种包括在两个或更多单糖单元之间形成糖苷键的全合成方法。

36.一种通过权利要求27-35中任一项所述方法可获得的或者获得的修饰的荚膜糖。

37.一种如权利要求1-26或36中任一项所述修饰的糖的糖-蛋白质偶联物。

38.如权利要求37所述的偶联物，其特征在于，所述蛋白质是细菌毒素或类毒素。

39.如权利要求38所述的偶联物，其特征在于，所述细菌毒素或类毒素是白喉毒素或类毒素。

40.如权利要求39所述的偶联物，其特征在于，所述细菌毒素或类毒素是CRM₁₉₇。

41.一种制造糖-蛋白质偶联物的方法，该方法包括以下步骤：

(c)提供如权利要求20所述的修饰的荚膜糖；和

(d)通过末端异头羟基或衍生自末端异头羟基的氨基将所述修饰的荚膜糖偶联于蛋白质。

42.一种制造糖-蛋白质偶联物的方法，该方法包括以下步骤：

(a)提供如权利要求21所述的修饰的荚膜糖；

(b)通过氧化裂解将至少一对邻位羟基转化成醛基；和

(c)通过还原胺化将所述修饰的荚膜糖连接于蛋白质。

43.一种制造糖-蛋白质偶联物的方法，该方法包括以下步骤：

(a)提供如权利要求22所述的修饰的荚膜糖；

(b)通过氧化裂解将至少一对邻位羟基转化成醛基；和

(c)通过还原胺化将所述修饰的荚膜糖连接于蛋白质。

44.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述封端基团中存在的所有邻位羟基在步骤(b)中转化成醛基。

45.如权利要求43所述的方法，其特征在于，选择的氧化裂解条件仅使一部分存在于所述封端基团中的邻位羟基在步骤(b)中转化成醛基。

46.如权利要求41-45中任一项所述的方法，其特征在于，所述蛋白质如权利要求38-40中任一项所定义。

47.一种通过权利要求41-46中任一项所述方法可获得的或者获得的修饰糖的糖-蛋白质偶联物。

48.一种包含下式所示糖部分的分子：

其中

T具有式(A)或(B)：

n是1-100的整数；

各Z基团独立选自OH或如权利要求1-8或11-12中任一项所定义的封端基团；和

各Q基团独立选自OH或如权利要求1-8或11-12中任一项所定义的封端基团；

W选自-OH或如权利要求1-8或11-12所定义的封端基团；

L是O、NH、NE、S或Se；

其中，L的游离共价键结合于蛋白质载体，

且其中所述蛋白质载体如权利要求38-40中任一项所定义。

且其中至少一个Z基团和/或至少一个Q基团是如权利要求1-8或11-12所定义的封端基团。

49.一种包含下式所示糖的分子：

其中

T具有式(A)或(B)：

n、Z、Q、W、W¹和V如权利要求23所定义，且至少一个Z基团和/或至少一个Q基团具有式(IIa)或(IIb)：

-O-X-Y’(IIa)      -O-R⁴  (IIb)

其中

X是C(O)、S(O)或SO₂；

Y’是NR²R⁴；

R²是H或C_1-6烷基；和

R⁴是-C_1-4亚烷基-CH(O)或-C_1-5亚烷基-NH-，其中-NH-基团是蛋白质载体的一部分；

且其中所述蛋白质载体是如权利要求38-40中任一项所定义的蛋白质。

50.一种药物组合物，其包含(a)如权利要求1-26或36中任一项所述的修饰的糖和/或如权利要求37-40或47中任一项所述的糖-蛋白质偶联物和/或如权利要求48或49所述的分子，和(b)药学上可接受的载体。

51.如权利要求50所述的组合物，还包含来自脑膜炎奈瑟球菌血清组C、W135和Y中一种或多种的糖类抗原，所述糖任选为寡糖并任选偶联于载体蛋白。

52.如权利要求50或51所述的组合物，还包含疫苗佐剂。

53.如权利要求52所述的组合物，其特征在于，所述佐剂是磷酸铝。

54.如权利要求50-53中任一项所述的组合物，其为抗脑膜炎奈瑟球菌所致疾病的疫苗。

55.一种在哺乳动物中产生抗体应答的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物如权利要求50-54中任一项所述的药物组合物。

56.如权利要求1-26或36中任一项所述的修饰的糖；如权利要求37-40或47中任一项所述的偶联物；或如权利要求48或49所述的分子，其被用作药物。

57.如权利要求1-26或36中任一项所述的修饰的糖，或权利要求37-40或47中任一项所述的偶联物，或如权利要求48或49所述的分子在制造用于预防或治疗一种或多种荚膜菌所致疾病的药物中的应用。

58.如权利要求57所述的应用，其特征在于，所述疾病是细菌性脑膜炎。

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