BRPI0806318B1 - sacarídeo capsular modificado, processo para modificar um sacarídeo, conjugado proteína sacarídea, molécula e composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

sacarídeos modificados. sacarídeos capsulares modificados compreendendo um grupo bloqueador em uma posição de grupo hidroxila em pelo menos uma das unidades de monossacarídeo do sacarídeo capsular nativo correspondente, em que o grupo bloqueador tem a fórmula (ia) ou (ib): -ox-y (ia) ou -o-r^ 1^ (ib) em qu x é c(o), s(o) ou so~ 2~; y é nr^ 1^r^ 2^ ou r^ 3^; r^ 1^ é c~ 1-6~ alquila subsitituída com 1, 2 ou 3 grupos independentemente selecionados de hidroxila, sulfidrila e amina; r^ 2^ é h ou c~ 1-6~ alquila; e r^ 3^ é c~ 1-6~ alquila; processos para modificar um sacarídeo capsular com os grupos bloqlieadores; conjugados de proteína sacarídea compreendendo o sacarídeo. capsular modificado; processos para fazer os conjugados de proteína sacarídea, composições farmacêuticas compreendendo os sacarídeos capsulares modificados e/ou conjugados de proteína sacarídea; e métodos e usos dos mesmos.

Description

SACARÍDEO CAPSULAR MODIFICADO, PROCESSO PARA MODIFICAR UM

SACARÍDEO, CONJUGADO PROTEÍNA SACARÍDEA, MOLÉCULA E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA

Todos os documentos mencionados aqui são incorporados por referência em sua totalidade.

CAMPO TÉCNICO

Esta invenção está no campo de química de polissacarídeo e relaciona-se aos sacarídeos modificados, processos para sua preparação, e derivados conjugados. Em particular, a invenção 10 relaciona-se aos sacarídeos modificados tendo estabilidade melhorada em água.

TÉCNICA DE FUNDAMENTO

Os polissacarídeos são moléculas biológicas importantes e foram amplamente utilizados na indústria farmacêutica para 15 a prevenção e tratamento de doenças. Por exemplo, os polissacarídeos capsulares foram usados por muitos anos em vacinas contra bactérias capsuladas, tais como meningococo (Neisseria meningitidis), pneumococo (Streptococcus pneumoniae) e Hib (Hemophilus influenzae tipo B) .

Para melhorar a imunogenicidade destes polissacarídeos, particularmente em crianças, as vacinas conjugadas foram desenvolvidas. Estas compreendem um polissacarídeo capsular conjugado a uma proteína carreadora [por exemplo, referências 1, 2, 3]. A conjugação pode fazer antígenos T-independentes em antígenos T-dependentes.

Um problema com muitos tipos de polissacarídeo é a baixa estabilidade em água. A estabilidade de polissacarídeos em água pode depender da natureza das ligações O-glicosídicas unindo as unidades de sacarídeo. A 30 baixa estabilidade em água é um resultado das ligações Oglicosídicas sendo prontamente hidrolisadas na presença de

Petição 870190048015, de 22/05/2019, pág. 12/23

2/112 ácidos ou glicosidases. O polissacarídeo capsular de meningococo de sorogrupo A é um exemplo de um polissacarídeo tendo baixa estabilidade em água.

A estabilidade de polissacarídeos é um problema particular de vacinas conjugadas.

A fim de preparar um conjugado de polissacarídeo-proteína, necessário manipular grupos quimicamente funcionais no polissacarídeo de modo que o polissacarídeo possa ser ligado a uma proteína. A aos reagentes químicos em processos para fazer isto, particularmente aos ácidos, pode resultar em divagem indesejável de ligações glicosídicas e consequente fragmentação do polissacarídeo. Tal fragmentação é altamente indesejável, causando perda em rendimentos na síntese de conjugados de polissacarídeo-proteína.

Os polissacarídeos que são instáveis desta maneira geralmente requerem escolha cuidadosa de reagentes e problemas descritos acima.

Entretanto, isto limita os reagentes disponíveis para manipular o polissacarídeo, assim limitando a variedade de ligações que podem ser feitas entre o polissacarídeo e a proteína carreadora. Além disso, a instabilidade destes polissacarídeos significa que é difícil desenvolver procedimentos robustos, que podem ser usados para preparar vacinas em uma escala industrial.

A referência 4 divulga um sacarídeo capsular modificado compreendendo um grupo bloqueador em uma posição de grupo hidroxila em pelo menos uma das unidades de monossacarídeo do sacarídeo capsular nativo correspondente. O sacarídeo capsular modificado é dito ter melhorado a

3/112 estabilidade à hidrólise. Ê um objeto da os sacarídeos capsulares modificados alternativos ou melhorados que tem estabilidade melhorada à hidrólise.

de

DIVULGAÇÃO DA

INVENÇÃO baseada na descoberta grupos hidroxila em unidades de monossacarídeo de sacarídeos capsulares com grupos bloqueadores específicos oferece estabilidade melhorada. Os sacarídeos modificados obtidos pelo processo da invenção são mais estáveis à hidrólise do que seus equivalentes nativos de sacarídeo.

sacarídeo capsular modificado compreendendo um grupo bloqueador em uma posição de grupo hidroxila sobre pelo menos uma das unidades de monossacarídeo do sacarídeo capsular nativo correspondente.

O grupo bloqueador é definido abaixo.

O sacarídeo capsular modificado da presente invenção é mais estável à hidrólise do que seus equivalentes de sacarídeo nativos. Preferivelmente, o sacarídeo capsular modificado da presente invenção retém a reatividade cruzada imunológica com seus equivalentes de sacarídeo nativos.

A presente invenção também fornece processos para modificar um sacarídeo capsular com o grupo bloqueador; conjugados de sacarídeo-proteína compreendendo o sacarídeo capsular modificado; processos para fazer os conjugados de sacarídeo-proteína, composições farmacêuticas compreendendo os sacarídeos capsulares modificados e/ou conjugados de sacarídeo-proteína; e métodos e usos dos mesmos.

Sacarídeos modificados da invenção

A invenção fornece um sacarídeo capsular modificado

4/112 compreendendo um grupo bloqueador em uma posição de grupo hidroxila em pelo menos uma das unidades de monossacarídeo do sacarídeo capsular nativo correspondente. O grupo bloqueador é de fórmula (Ia) ou (Ib) :

-O-X-Y (Ia) -0-R¹ (Ib) em que

X é C (O) , S (O) ou S0₂;

Y é NR³R² ou R³;

R¹ é alquila Ci_6 substituído com 1, 2 ou 3 grupos independentemente selecionados de hidroxila, sulfidril e amina;

R² é H ou alquila Ci_₆; e

R³ é alquila Ci_₆.

Preferivelmente, o grupo bloqueador é de fórmula (Ia). Nesta modalidade, prefere-se que X seja C(0) . Tal grupos bloqueadores de éster e carbamato têm um efeito estabilizante na ligação glicosídica e podem ser preparados sob condições suaves. Os exemplos de processos para manipular um sacarídeo para fornecer grupos bloqueadores de éster e carbamato são descritos abaixo. Entretanto, a invenção não é limitada aos sacarídeos modificados preparados pelos processos exemplificados aqui, e outros processos para preparar sacarídeos modificados da invenção serão prontamente aparentes à pessoa hábil.

Preferivelmente, R² é H.

A alquila Ci_₆ de R¹ é substituído com 1, 2 ou 3 grupos independentemente selecionados de hidroxila, sulfidril e amina. Quando alquila Ci-₆ é substituída com 2 ou 3 grupos, as substituições podem ser com o mesmo grupo ou grupos diferentes, embora tipicamente serão com o mesmo grupo.

5/112

Preferivelmente, a alquila Ci_₆ de R¹ é substituída com 1, 2 ou 3 grupos hidroxila.

R¹ pode ser substituído em qualquer posição ao longo da cadeia de alquila Ci_₆. Preferivelmente, pelo menos uma substituição está presente na extremidade distai da cadeia de alquila Ci_₆· Onde a cadeia de alquila Ci_₆ é um grupo alquila de cadeia reta, isto significa que a alquila Ci-₆ é substituída em C_x, onde x é o número total de átomos de carbono na cadeia alquila Ci_₆. Similarmente, onde a cadeia alquila Ci_₆ é um grupo alquila de cadeia ramificado, isto significa que a alquila Ci_₆ é substituída na extremidade distai de uma das ramificações, tipicamente a ramificação mais longa.

Em modalidades preferidas, R¹ é substituído com um único grupo, esta substituição sendo na extremidade distai da cadeia alquila Ci-₆, como discutido acima. Tais grupos são particularmente eficazes em fornecer estabilidade melhorada à hidrólise. Preferivelmente, o único grupo é um grupo hidroxila. Os grupos preferidos incluem portanto, hidróximetila, 2-hidróxietila, 3-hidróxipropil, 4hidróxibutila, 5-hidróxipentila e 6-hidróxihexila. O grupo particularmente preferido é 2-hidróxietila.

Em outras modalidades preferidas, R¹ é substituído com dois grupos vicinais, isto é dois grupos em posições adjacentes ao longo da cadeia alquila Ci__s. Tais grupos são particularmente eficazes em fornecer estabilidade melhorada à hidrólise. Preferivelmente, os dois grupos vicinais estão na extremidade distai da cadeia alquila Ci_₆. Onde a cadeia alquila Ci_₆ é um grupo alquila de cadeia reta, isto significa que os dois grupos vicinais estão em C_x e C_x_i

6/112 onde x é o número total de átomos de carbono na cadeia alquila Ci_₆. Similarmente, onde a cadeia alquila Ci_₆ é um grupo alquila de cadeia ramificada, isto significa que os dois grupos vicinais estão na extremidade distai de uma das ramificações, tipicamente a ramificação mais longa. Preferivelmente, os dois grupos vicinais são grupos hidroxila. Tais grupos fornecem uma parte para conjugação a uma molécula carreadora, como discutido abaixo. Os grupos preferidos incluem portanto, 1,2-dihidróxietila; 1,2dihidróxipropila e 2,3-dihidróxipropila; 1,2dihidróxibutila, 2,3-dihidróxibutila e 3,4-dihidróxibutila;

1.2- dihidróxipentila, 2,3-dihidróxipentila, 3,4- dihidróxipentila e 4,5-dihidróxipentila; e 1,2dihidróxihexila, 2,3-dihidróxihexila, 3,4-dihidróxihexila, 4,5-dihidróxihexil e 5,6-dihidróxihexila. Como notado acima, prefere-se que os dois grupos vicinais estejam na extremidade distai da cadeia alquila Ci__s. Particularmente os grupos preferidos incluem portanto, 1,2-dihidróxietila,

2.3- dihidróxipropila; 3,4-dihidróxibutila, 4,5- dihidróxipentila e 5,6-dihidróxihexila. Um grupo particularmente preferido é 4,5-dihidróxipentila.

Em algumas modalidades, o sacarídeo capsular modificado compreende pelo menos dois tipos de grupo bloqueador (como descrito acima). Por exemplo, prefere-se para o sacarideo compreender a) pelo menos um grupo bloqueador em que R¹ é substituído com um único grupo, esta substituição sendo na extremidade distai da cadeia alquila Ci-6 (como descrito acima) ; e b) pelo menos um grupo bloqueador onde R¹ é substituído com dois grupos vicinais (como descrito acima). Tais grupos bloqueadores misturados

7/112 são particularmente eficazes em fornecer a estabilidade melhorada à hidrólise. Além disso, incluindo pelo menos um grupo bloqueador em que R¹ é substituído com dois grupos hidroxila vicinais, é fornecido uma parte para conjugação a uma molécula carreadora, como discutido abaixo.

Preferivelmente, R³ é alquil Ci-C3. Mais preferivelmente R³ é Cx alquila (CH₃) , embora C₂ alquil e C₃ alquila são também preferidos.

Os grupos bloqueadores de fórmula -O-X-Y ou -0-R¹ podem ser preparados dos grupos hidroxila (por exemplo, como encontrado na molécula nativa) por procedimentos de derivatização padrões, tais como reação do grupo hidroxila com um haleto de acila, haleto de alquila, haleto de sulfonila etc. Consequentemente, o átomo de oxigênio em -0X-Y é preferivelmente o átomo de oxigênio do grupo hidroxila, enquanto o grupo -X-Y em -O-X-Y preferivelmente substitui o átomo de hidrogênio do grupo hidroxila. Alternativamente, os grupos bloqueadores podem ser acessíveis através de uma reação de substituição, tal como uma substituição tipo Mitsunobu. Este e outros métodos de preparar grupos bloqueadores dos grupos hidroxila são bem conhecidos.

Tipicamente, os sacarídeos modificados da presente invenção são oligossacarídeos. Os oligossacarídeos podem ser obtidos dos polissacarídeos por quaisquer dos métodos de despolimerização e dimensionamento descritos aqui.

Os sacarídeos capsulares modificados desta invenção são obteníveis dos sacarídeos capsulares nativos. Entretanto, a presente invenção não é limitada aos sacarídeos modificados obtidos dos sacarídeos capsulares

8/112 nativos. Os sacarídeos capsulares modificados da presente invenção podem ser obtidos por outros métodos, tais como síntese total ou parcial (veja, por exemplo, referência 5) .

Nos sacarídeos capsulares modificados da invenção, o número de unidades de monossacarídeo tendo grupos bloqueadores pode variar. Preferivelmente, todo ou substancialmente todas as unidades de monossacarídeo do sacarideo capsular modificado podem ter grupos bloqueadores . Alternativamente, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% das unidades de monossacarídeo do sacarídeo capsular modificado pode ter grupos bloqueadores. Pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 unidades de monossacarídeo do sacarídeo capsular modificado podem ter grupos bloqueadores.

Onde o sacarídeo capsular modificado compreende pelo menos dois tipos de grupo bloqueador, o número de unidades de monossacarídeo tendo cada tipo de grupo bloqueador pode também variar. Por exemplo, a proporção do número total de grupos bloqueadores feitos por um tipo de grupo bloqueador relativo ao(s) outro(s) tipo(s) de grupo bloqueador pode variar. Em particular, quando houver dois tipos de grupo bloqueador presentes, a razão de um tipo de grupo bloqueador ao outro tipo de grupo bloqueador pode ser selecionada de 1:20, 1:19, 1:18, 1:17, 1:16, 1:15, 1:14,

1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3,

1:2 e 1:1. Em particular, na modalidade descrita acima onde o sacarídeo compreende a) pelo menos um grupo bloqueador em que R¹ é substituído com um único grupo, esta substituição

9/112 sendo na extremidade distai da cadeia alquila Ci_₆; e b) pelo menos um grupo bloqueador em que R¹ é substituído com dois grupos vicinais, prefere-se que a razão do tipo anterior de grupo bloqueador ao último tipo de grupo bloqueador seja selecionada de 99:1, 98:2, 97:3, 96:4, 95:5, 94:6, 93:7, 92:8, 91:9, 90:10, 89:11, 88:12, 87:13, 86:14, 85:15, 84:16, 83:17, 82:18, 81:19 e 80:20. Destas razões,

95:5, 94:6, 93:7, 92:8, 91:9, 90:10, 89:11, 88:12, 87:13, 86:14 e 85:15 são particularmente preferidas. Destas, 90:10 é preferida.

Do mesmo modo, o número de grupos bloqueadores em uma unidade de monossacarídeo pode variar. Por exemplo, o número de grupos bloqueadores em uma unidade de monossacarídeo pode ser 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, preferivelmente

1-4, mais preferivelmente 1 ou 2, mais preferivelmente 1.

Em uma modalidade, pelo menos uma unidade de monossacarídeo tendo um grupo bloqueador inclui uma unidade de monossacarídeo não terminal. O termo unidade de monossacarídeo não terminal significa uma unidade de monossacarídeo que não é uma das unidades de monossacarídeo terminais na cadeia de oligossacarídeo/polissacarídeo.

Esta invenção engloba sacarídeos capsulares modificados em que todas as posições de grupo hidroxila das unidades de monossacarídeo terminal e não terminal têm um grupo bloqueador. Entretanto, em algumas modalidades preferidas há pelo menos um grupo hidroxila livre ou grupo amino no sacarídeo capsular modificado da presente invenção. Um grupo hidroxila ou grupo amino livre é vantajoso porque fornece uma parte para reações adicionais do sacarídeo capsular modificado, por exemplo, para conjugação a uma

10/112 molécula carreadora, como discutido abaixo. Quando o sacarídeo modificado contém um grupo hidroxila livre, pode ser um grupo hidroxila anomérico, particularmente um grupo hidroxila anomérico terminal. Quando o sacarídeo modificado contém um grupo amino, pode ser derivado de um grupo hidroxila anomérico. Os grupos amino são prontamente acessíveis dos grupos hidroxila anoméricos por aminação redutiva (usando, por exemplo, NaBH₃CN/NH₄Cl) .

Similarmente, em outras modalidades preferidas, há pelo menos uma unidade de monossacarídeo do sacarídeo capsular modificado onde dois grupos hidroxila vicinais do sacarídeo capsular nativo correspondente compreendem grupos bloqueadores.

Preferivelmente,

1%,

4%, 5%,

6%,

7%, 8%, 9%, 10%,

11%, 12%, 13%,

14%,

15%, 16%, 17%,

18%, 19% ou 20% das unidades de monossacarídeo têm dois grupos hidroxila

vicinais desta	maneira.	Por	exemplo	, 1,	2, 3, 4	, 5,	6,	7, 8,
9, 10, 11, 12,	13,	14,	15,	16, 17,	18,	19, 20,	21,	22,	23,
24, 25, 26, 27,	28 ,	29,	30,	31, 32,	33,	34, 35,	36,	37,	38,

ou 40 unidades de monossacarídeo têm dois grupos hidroxila vicinais desta maneira. Preferivelmente, entre 5

15%, mais preferivelmente 10%, das unidades de monossacarídeo têm dois grupos hidroxila vicinais desta maneira. Os dois grupos hidroxila vicinais na(s) unidade(s) de monossacarídeo são vantajosos, pois fornecem uma parte para conjugação a uma molécula carreadora, como discutido abaixo.

Alternativamente, em algumas modalidades preferidas, pelo menos um ou pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ou 20% das unidades de monossacarídeo do sacarídeo capsular

11/112 modificado têm grupos bloqueadores onde R¹ é substituído

com	dois grupos	hidroxila vicinais	, como	descrito	acima.
Por	exemplo, 1,	2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,	9, 10,	1 1, 12,	13, 14,
15,	16, 17, 18,	19, 20, 21, 22, 23,	24, 25,	26, 27,	28, 29,

30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 unidades de monossacarídeo do sacarídeo capsular modificado podem ter tais grupos bloqueadores. Preferivelmente, entre 5-15%, mais preferivelmente 10%, das unidades de monossacarídeo do sacarídeo capsular modificado têm grupos bloqueadores em que R¹ é substituído com dois grupos hidroxila vicinais. Mais uma vez, os dois grupos hidroxila vicinais na(s) unidade(s) de monossacarídeo são vantajosos, pois fornecem uma parte para conjugação a uma molécula carreadora, como discutido abaixo.

Foi sugerido na referência 4 que os grupos bloqueadores eficazes são grupos retiradores de elétron. Sem desejar ser limitado pela teoria, acredita-se que as ligações glicosídicas são instáveis à hidrólise devido ao auxílio de um ataque nucleofílico intramolecular de um grupo hidroxila de sacarídeo na ligação glicosídica (isto é, pela formação de um intermediário cíclico). Quanto maior a nucleofilicidade do grupo hidroxila, maior a tendência para ataque nucleofílico intramolecular. Um grupo bloqueador retirador de elétron tem o efeito de deslocalizar o par solitário de oxigênio, desse modo diminuindo a nucleofilicidade do oxigênio e diminuindo a tendência para ataque nucleofílico intramolecular. Surpreendentemente, descobriu-se que os grupos compreendendo alquila Ci_₆ substituída com 1, ou 3 grupos independentemente selecionados de hidroxila, sulfidril e amina podem ser

12/112 grupos bloqueadores eficazes, apesar da presença da hidroxila, sulfidrila ou amina nucleofílica no grupo bloqueador.

Além disso, estes grupos substituídos de hidroxila, sulfidrila ou amina são vantajosos, pois permitem uma sacarídeo capsular modificado a uma molécula carreadora.

Sem desejar ser limitado pela teoria, acredita-se que este efeito surge da hidrofilicidade

Ci_₆ substituída selecionados de relativa de grupos compreendendo alquila com 1, 2 ou 3 grupos independentemente hidroxila, sulfidrila e amina. Além disso, onde o grupo bloqueador compreende alquila Ci_₆ substituída com dois grupos hidroxila vicinais, o próprio grupo bloqueador fornece uma parte para conjugação a uma molécula carreadora.

Em todas as modalidades descritas acima, o sacarídeo capsular modificado é preferivelmente um sacarídeo capsular modificado tendo ligações fosfodiéster. Mais preferivelmente, o sacarídeo capsular modificado é um sacarídeo de sorogrupo A de Neisseria. meningitidis modificado. Os sacarídeos de sorogrupo A de Neisseria meningitidis são particularmente instáveis à hidrólise.

Quando o sacarídeo capsular modificado é um sacarídeo de sorogrupo A de Neisseria meningitidis modificado, o grupo bloqueador está preferivelmente nas posições 4 e/ou 3, mais preferivelmente na posição 4, do sacarídeo de sorogrupo A de Neisseria meningitidis correspondente. Os grupos bloqueadores nas posições 4 e/ou 3 do sacarídeo de sorogrupo A de Neisseria meningitidis foram mostrados por serem particularmente mais eficazes para melhorar a estabilidade para hidrólise.

13/112

Em modalidades com grupos bloqueadores de éster (isto é, quando o grupo bloqueador é de fórmula (Ia), X é C(O) e Y é R³) , os inventores descobriram que a estabilidade de um sacarídeo de sorogrupo A de Neisseria meningitidis modificado ê influenciado pela proporção de posições 4 e/ou 3 tendo grupos bloqueadores. Por exemplo, a proporção de posições 4 tendo grupos bloqueadores pode ser aproximadamente 0%, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou aproximadamente 100%, com pelo menos

30% e aproximadamente 100% sendo preferidos. Similarmente, pode ser aproximadamente 0%, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%,

50%,

60%, 70%, 80%,

90%, 95% ou aproximadamente 100%, com pelo menos 95% aproximadamente 100% sendo preferidas.

Tipicamente, e 3 tendo grupos bloqueadores aproximadamente a mesma outras palavras, a razão de posições 4 tendo grupos bloqueadores para posições 3 tendo grupos bloqueadores é aproximadamente 1:1. Entretanto, em algumas modalidades, a grupos bloqueadores pode de grupos bloqueadores. Por exemplo, tendo grupos bloqueadores para tendo grupos bloqueadores pode ser 1:20,

1:19, 1:18,

1:17, 1:16,

1:15,

1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10,

1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5,

1:4,

1:3 ou 1:2. Similarmente, razão de posições 3 tendo grupos bloqueadores para tendo grupos bloqueadores pode ser 1:20,

1:19, 1:18

1:17, 1:16,

1:15,

1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10,

1:9, 1:8,

1:7, 1:6, 1:5, 1:4,

1:3 ou 1:2.

14/112

Esta invenção também fornece um sacarídeo de fórmula: OH

H à

			' O—P—O i I	n
onde T	é de fórmula	T (A) ou (B) :
			H j
	^^AcHI^q	<1 ¢1	AcHl^_w
	\ 1			Ί 1 H
			-H Z—V.
	JH	'η T	ρ	H Hp
	H	w1	H	V
	(A)			(B)
n é um	inteiro	de 1	a 10 0;

cada grupo Z é independentemente selecionado de -OH, OAc ou um grupo bloqueador como definido acima; e cada grupo Q é independentemente selecionado de -OH, OAc ou um grupo bloqueador como definido acima;

V é selecionado de -NH₂, -NHE, -NE¹E², W², ou -0-D, onde: E, E¹ e E² são grupos protetores de nitrogênio, que podem ser os mesmos ou diferentes, e D é um grupo protetor de oxigênio;

W é selecionado de -OH ou um grupo bloqueador como definido acima;

W¹ é selecionado de -OH ou um grupo bloqueador como definido acima;

112

W² é selecionado de -OH ou um grupo bloqueador como definido acima.

	e em que pelo menos um (por exemplo 1, 2,	3,	4, 5, 6,
7,	8, 9	, 10, 1	1,	12,	13, 14,	15,	16, 17,	18,	19,	20,	21,
22,	23,	24, 25,	26,	27,	28, 29,	30,	31, 32,	33,	34,	35,	36,
37,	38 ,	3 9 ou	40)	dos	grupos	Z e	/ou pelo menos	um	(por
exemplo	1, 2, 3	, 4,	5,	6, 7, 8,	9,	10, 11,	12,	13,	14,	15,
16,	17,	18, 19,	20,	21,	22, 23,	24,	25, 26,	27,	28 ,	29,	30,
31,	32,	33, 34,	35,	36,	37, 38,	39	ou 4 0)	dos	grupos Q	são

grupos bloqueadores como definidos acima.

Preferivelmente, n é um inteiro de 15 a 25.

Cada um dos grupos Z n+2 pode ser o mesmo ou diferente um do outro. Do mesmo modo, cada um dos grupos Q n+2 pode ser o mesmo ou diferente um do outro.

V é preferivelmente -NH₂ ou -NHE.

Os grupos protetores de nitrogênio apropriados são grupos silila (tais como TMS, TES, TBS, TIPS), derivados de acila (tais como, trifluoroacetamidas, metóxicarbonila, etóxicarbonila, t-butóxicarbonila (Boc), benzilóxicarbonila (Z ou Cbz) , 9-fluorenilmetóxicarbonila (Fmoc) , 2(trimetilsilil)etóxi carbonila, alliloxicarbonila (Alloc), 2,2,2-tricloroetóxicarbonila (Troe)), derivados de sulfonila (tais como p-trimetilsililetanosulfonila (SES)), derivados de sulfenila, alquil Ci_i₂, benzil, benzhidrila, tritila, allila, 9-fenilfluorenila, etc. Um grupo protetor preferido de nitrogênio é Fmoc.

Os grupos protetores de nitrogênio divalentes, que podem ser usados como E¹E², incluem derivados de imida cíclicos (tais como N-ftalimidas, N-ditiasuccinimidas, N2,3-difenilmaleimidas), derivados de imina (tais como N16/112

1,1-dimetiltiometilenoaminas,

N-benzilidenoaminas,

N-pmetóxibenzilidenoaminas,

N-difenilmetilenoaminas), derivados de enamina (tais como N-(5,5-dimetil-3-oxo-1ciclohexenil)aminas), etc. Um grupo protetor de nitrogênio divalente preferido é N-ftalimidil.

Os grupos protetores de oxigênio apropriados incluem ésteres, éteres (por exemplo, éteres de silil ou éteres de e acetais. Os exemplos específicos incluem allila, acetila,

Aloc, benzila, benzilóximetila (BOM), t-butila, tritila, tert-butildimetilsilila (TBS), tertbutildifenilsilila trietilsilila trimetilsilila (TMS), tri-isopropilsilila (TIPS), parametóxibenzila (PMB), MEM, metóximetila (MOM)

MTM e tetrahidropiranila (THP).

Todos os grupos Z podem ser OH (submetido a pelo menos um dos grupos Z e/ou pelo menos um dos grupos Q sendo grupos bloqueadores). Como uma alternativa a todos os grupos Z sendo OH, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% dos grupos Z podem ser OAc. Preferivelmente, aproximadamente 60-90% dos grupos Z são OAc, com o restante dos grupos Z sendo OH ou grupos bloqueadores como definidos acima. Preferivelmente, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%,

10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ou 40% dos grupos

Z são grupos bloqueadores, 60-90% são OAc e o restante é OH Preferivelmente, aproximadamente 10-40% dos grupos Z são grupos bloqueadores, 60-90% são OAc e o restante é OH. Alternativamente, aproximadamente 0%, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou aproximadamente 10 0% dos grupos Z são grupos bloqueadores, com pelo menos 95% e aproximadamente 100% sendo preferido.

17/112

Todos os grupos Q podem ser OH (submetido a pelo menos um dos grupos Z e/ou grupos Q sendo grupos bloqueadores). Alternativamente, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15% ou 20% dos grupos Q podem ser OAc.

Preferivelmente, aproximadamente 1-20% de grupos Q são OAc, com o restante dos grupos Q sendo OH ou grupos bloqueadores

como	definidos	acima. Preferivelmente, pelo	menos 1%, 2%,
3%,	4%, 5%, 6%	, 7%, 8%, 9%, 10%,	15%, 20%,	25%, 30%, 35%,
40%,	45%, 50%,	55%, 60%, 65%, 70%,	75%, 80%,	85%, 86%, 87%,
88%,	89%, 90%,	91%, 92%, 93%, 94%	·, 95%, 96	%, 97%, 98% ou
99%	dos grupos	de Q estão grupos	bloqueado	res, 1-20% são

OAc e o restante é OH. Preferivelmente, aproximadamente 8099% dos grupos Q são grupos bloqueadores, 1-20% são OAc e o restante é OH. Alternativamente, aproximadamente 0%, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou aproximadamente 100% dos grupos Q são grupos bloqueadores, com pelo menos 30% e aproximadamente 100% sendo preferido.

A invenção também fornece uma molécula compreendendo uma porção de sacarídeo de fórmula:

18/112

em que T	é de fórmula (A)	OU (B):
			H
		AcHN.	o Av-	J^AcHN w
	Z—V.		Ã\--H		—-H
	Tj	H X	Η T	pH Hp
	H		L	H L |
		(A)	1	(B) 1
n,	Z, Q	e W	são como definidos	acima; pelo menos	um
(por exemplo, 1,	, 2,	3, 4, 5, 6, 7,	8, 9, 10,	11, 12, 13, 14,	15,	16,
17, 18,	19, 20,	21,	22, 23, 24, 25	, 26, 27,	28, 29, 30, 31,	32,	33,
34, 35,	36, 37,	38,	39 ou 40) dos	grupos Z	e/ou pelo menos	um	(por
exemplo	1, 2, 3	, 4,	5, 6, 7, 8, 9,	10, 11,	12, 13, 14, 15,	16,	17,
18, 19,	20, 21,	22,	23, 24, 25, 26	, 27, 28,	29, 30, 31, 32,	33,	34,

35, 36, 37, 38, 39 ou 40) dos grupos Q são grupos bloqueadores; e: L é O, NH, NE, S ou SE.

A ligação covalent livre de L pode ser unida a qualquer porção apropriada, por exemplo, -Η, -E, um ligante, um carreador de proteína, etc. L é preferivelmente N ou 0.

É também possível para L ser N, unido a um ligante divalente, a um grupo protetor divalente, ou a um carreador de proteína divalente.As identidades preferidas dos grupos η, Z, Q e W são descritas acima.

Esta invenção também fornece uma molécula compreendendo um sacarídeo de fórmula:

19/112

V

Q,

W, W¹ e η, Z, ou

Η como

3, menos um (por exemplo,

1, 2,

12,	13,	14,	15, 16,	17,	18, 19,
27,	28 ,	29,	30, 31,	32,	33, 34
dos	grupos	Z e/ou pelo menos um
6,	7, 8,	9,	10, 11,	12,	13, 14,
22 ,	23,	24,	25, 26,	27,	28, 29,
37,	38 ,	39	ou 4 0)	dos	grupos

/

30, (Ilb):

20,

15, acima, definidos e pelo (por

35,

4,

5, 6, 7, 8,	9, 10,	11,
21, 22, 23,	24, 25,	26,
36, 37, 38	, 3 9 ou	40)
exemplo 1,	2, 3, 4	, 5,
16, 17, 18,	19, 20,	21,
31, 32, 33,	34, 35,	36,

ou

-O-X-Y' (II) em que X é como definido acima;

Y' é NR²R⁴ ;

R² é como definido acima; e

R⁴ é -Ci-4 alquileno-CH (O) ou -Ci-₅ alquileno-NH, em que o grupo -NH- é parte de uma proteína carreadora.

Preferivelmente, pelo menos um do grupo Z e/ou Q é de fórmula (lia). Nesta modalidade, prefere-se que X seja C(0).

Os grupos R² preferidos são descritos acima em relação à fórmula (Ia) .

Os grupos R⁴ preferidos incluem -C3 alquileno-CH(O), C2 alquileno-CH(O), -C3 alquileno-CH(O) e -C4 alquilenoCH (O) . Um grupo R⁴ particularmente preferido é -C3 alquileno-CH(O).

Outros grupos R⁴ preferidos incluem -C_x alquileno-NH,

20/112

-C2 alquileno-NH; -C3 alquileno-NH, -C4	alquileno-NH	e	-c5
alquileno-NH.	Um grupo R4 particularmente preferido	é	-c4
alquileno-NH.	As identidades preferidas	dos grupos n,	z,	Q,
W, W1 e V são	descritos acima.
Processo	para produzir um sacarídeo	modificado.

A invenção fornece um processo modificando um sacarídeo capsular compreendendo as etapas de:

(a) fornecer um sacarídeo capsular tendo pelo menos um grupo hidroxila em uma unidade de monossacarídeo; e (b) converter pelo menos um referido grupo hidroxila em um grupo bloqueador.

O grupo bloqueador é qualquer dos grupos bloqueadores definidos acima.

O sacarídeo capsular pode ser um sacarídeo capsular nativo (oligossacarídeo ou polissacarídeo). Como uma alternativa, o sacarídeo capsular pode ser, por exemplo, um sacarídeo capsular des-O-acetilado e/ou um sacarídeo capsular tendo um grupo amino terminal (por exemplo, obtido por aminação redutiva).

Um processo preferido para modificar um sacarídeo em que o grupo bloqueador é -OC(O)NR¹R² é quando a etapa (b) compreende as etapas de:

(bl) reagir o sacarídeo capsular com um reagente bifuncional em um solvente orgânico; e (b2) reagir o produto de etapa (bl) com um composto amino de fórmula (III):

HNR'^lR² (III) em que R¹ e R² são como definidos acima.

O termo reagente bifuncional significa qualquer reagente que é capaz de realizar as funções duplas de (i)

112 fornecer na etapa (bl) um primeiro átomo de carbono electrofílico para acoplar com o(s) grupo(s) hidroxila no sacarídeo; e (ii) fornecer um segundo átomo de carbono electrofílico para acoplar com o grupo amino usado na etapa (b2) . Geralmente, é regenerado do o segundo átomo de carbono electrofílico primeiro átomo de carbono electrofílico durante a etapa

O reagente bifuncional fornece uma

-C(O)- entre o polissacarídeo e o composto amino.

Os reagentes bifuncionais para uso na presente invenção incluem, carbonildiimidazol mas não são limitados a, 1,1' (CDI) , carbonil di-1,2,4-triazol (CDT) , carbonil di-1,2,3-benzotriazol (CDB), difenilcarbonato, brometo de cianogeno, fosgeno ou trifosgeno. A pessoa hábil estará ciente de outros reagentes bifuncionais que podem realizar a mesma função que estes.

Um reagente bifuncional preferido é CDI. O CDI tem a vantagem de ser um reagente mais suave que, por exemplo, de brometo de fosfogeno ou cianogeno. Em particular, as reações de acoplamento usando CDI não geram gases ácidos hidrohálicos, tais como HC1 ou HBr. A geração de gás HC1 ou HBr é indesejável, pois estes gases exigem a depuração da saída da câmara de reação para evitar seu escape na atmosfera. Além disso, a geração de gás HC1 ou HBr pode afetar os grupos funcionais sensíveis no sacarídeo, resultando na perda de rendimentos devido à decomposição ou fragmentação do sacarídeo.

O solvente orgânico usado na etapa (bl) é preferivelmente um solvente aprótico. Os solventes apróticos são conhecidos à pessoa hábil na técnica e não contêm nenhum átomo de hidrogênio ionizável. Estes

22/112 solventes são vantajosos, pois facilitam a reação de grupo(s) hidroxila no sacarídeo com o reagente bifuncional, melhorando a nucleofilicidade do(s) grupo(s) hidroxila. Os solventes apróticos apropriados incluem, mas não são limitados a, dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF) , formamida, triamida hexametilfósforo (HMPT), 1,3dimetil-3,4,5,6 -tetrahidro-2(1H)-pirimidinona (DMPU) , dimetilacetamida (DMAC), ou hexametilfosforamida (HMPA). DMSO é preferido.

Na etapa (b2) do processo da invenção, o produto da etapa (bl) é reagido com um composto amino para formar o polissacarídeo modificado. O composto amino usado no processo da presente invenção é de fórmula (III), como definido acima.

Os composto aminos apropriados que podem ser usados na invenção dependem de R¹ e R². Como descrito acima, em modalidades preferidas, R¹ é substituído com um único grupo hidroxila, esta substituição sendo na extremidade distai da cadeia alquila Ci_₆, e R² é H. Os composto aminos preferidos que podem ser usados na invenção incluem portanto, aminometanol, 2-aminoetanol, 3-aminopropan-l-ol, 4aminobutan-1-ol, 5-aminohexil-1-ol e 6-aminopentan-l-ol. Um composto amino particularmente preferido é 2-aminoetanol. Em outras modalidades preferidas, R¹ é substituído com dois grupos hidroxila vicinais e R² é H. Os compostos amino preferidos que podem ser usados na invenção incluem portanto, 1-aminoetano-1,2-diol; 1-aminopropano-1,2-diol e

3-aminopropano-1,2-diol; aminobutano-2,3-diol e aminopentano-1,2-diol,

1-aminobutano-1,2-diol,

4-aminobutano-1,2-diol;

1-aminopentano-2,3-diol,

11523/112 aminopentano-2 ,3-diol

5-aminopentano-l,2-diol;

Ιaminohexano-l,2-diol, l-aminohexano-2,3-diol,

5aminohexano-3,4-diol,

6-aminohexano-2,3-diol

6aminohexano-l,2-diol.

Em modalidades particularmente preferidas, R¹ é substituído com dois grupos hidroxila vicinais na extremidade distai da cadeia alquila Ci_₆. Os composto aminos preferidos que podem ser usados na invenção incluem portanto, 3-aminopropano-1,2-diol, 4-aminobutano1,2-diol, 5-aminopentano-l,2-diol e 6-aminohexano-1,2-diol.

Um composto amino particularmente preferido é

5aminopentano-1,2-diol. Estes podem ser usados na forma de sal (por exemplo, sal de hidrocloreto).

Um processo preferido é exemplificado no esquema 1 abaixo:

DMSO

Sacc = porção sacarídeo

O II

Sacc—O—C—N

V-N

r'r²nh

O

II . ₇

Sacc—O—C—NR R²

Esquema 1

Neste esquema, o sacarídeo (por exemplo, polissacarídeo ou oligossacarídeo MenA) é primeiramente ativado através de pelo menos um de seus grupos hidroxila em uma unidade de monossacarídeo usando CDI em DMSO solvente. O intermediário de carbamato imidazol resultante é preso pela amina R¹R²NH (por exemplo, 2-aminoetanol) para dar o sacarídeo modificado.

Os sacarídeos modificados podem alternativamente ser preparados em um processo de uma etapa reagindo um ou mais

24/112 grupos hidroxila em um sacarídeo capsular com um reagente de fórmula XC(O)NR¹R², em que X é um grupo de saída, e R¹ e R² são como definidos acima. Os grupos de saída apropriados incluem, mas não são limitados a, -Cl, -Br, -CF₃, -OC₆F₅ ou 5 -CC1₃.

Um processo preferido para modificar um sacarídeo em que o grupo bloqueador é -OC(O)R₃ é quando a etapa (b) compreende a etapa de:

(bl) reagir o sacarídeo capsular com [(R³C(O)₂)JO na presença de um catalizador de imidazol.

Este processo é particularmente apropriado para modificar um sacarídeo em que o grupo bloqueador é OC(O)CH₃. Nesta modalidade, a etapa (b) compreende a etapa de:

(bl) reagir o sacarídeo capsular com [ (CH₃C (O) ) ₂] O (anidrido acético) na presença de um catalizador de imidazol.

Alternativamente, os sacarídeos capsulares modificados da presente invenção podem ser preparados por meios 20 sintéticos, por exemplo, de unidades de monossacarídeo apropriadas. Tipicamente, a síntese total de um sacarídeo capsular modificado compreende a formação de ligações glicosídicas (por exemplo, ligações fosfodiéster) entre unidades de monossacarídeo apropriadas e então modificar o 25 sacarídeo resultante em qualquer maneira descrita acima.

Alternativamente, as unidades de monossacarídeo podem ser modificadas antes de formar as ligações glicosídicas para fornecer o mesmo sacarídeo capsular modificado.

Os sacarídeos capsulares modificados desta invenção 30 são preferivelmente oligossacarídeos. Partindo dos

25/112 polissacarídeos capsulares nativos, os oligossacarídeos capsulares modificados podem ser obtidos por qualquer um dos dois métodos: (1) modificar o polissacarídeo capsular seguido por despolimerização e dimensionamento do polissacarídeo modificado para formar um oligossacarídeo modificado; ou (2) despolimerizar e dimensionar o polissacarídeo capsular seguido por modificação do oligossacarídeo resultante para formar um oligossacarídeo modificado. Ambos os métodos são englobados dentro da presente invenção. Entretanto, o primeiro método é preferido em determinadas modalidades, já que este método assegura que um grupo hidroxila terminal estará disponível para conjugação subsequente do oligossacarídeo modificado a uma molécula carreadora, tal como uma proteína.

A presente invenção também fornece um processo para modificar um polissacarídeo de sorogrupo A de Neisseria meningitidis compreendendo as etapas de:

(a) fornecer um polissacarídeo de sorogrupo A de Neisseria meningitidis;

(b) despolimerizar e dimensionar o referido polissacarídeo para fornecer um oligossacarídeo; e (c) converter pelo menos um grupo hidroxila do oligossacarídeo em um grupo bloqueador, como descrito acima

A etapa (b) deste processo pode opcionalmente ser seguida por etapa(s) de derivatização conhecidas antes da etapa (c) . As etapas de derivatização conhecidas incluem, por exemplo, animação redutiva seguida pela proteção do grupo -NH₂ resultante e/ou des-O-acetilação.

Esta invenção também fornece um processo para modificar um polissacarídeo de sorogrupo A de Neisseria

26/112 meningitidis compreendendo as etapas de:

(a) fornecer um polissacarídeo de sorogrupo A de Neisseriã meningitidis;

(b) converter pelo menos um grupo hidroxila do polissacarídeo em um grupo bloqueador, como descrito acima; e (c) despolimerizar e dimensionar o polissacarídeo resultante para fornecer um oligossacarídeo.

A etapa (c) deste processo pode opcionalmente ser seguida por etapas de derivatização conhecidas. As etapas

de derivatização conhecidas incluem,	por	exemplo,	a
aminação redutiva seguida pela proteção do	grupo	nh2
resultante e/ou des-O-acetilação.
Quaisquer dos processos descritos	acima	podem	ser

seguidos por uma etapa em que os contaminantes (por exemplo, contaminantes de baixo peso molecular) são removidos.

Materiais de partida de sacarídeo capsular

Os sacarídeos capsulares modificados da invenção são obteníveis dos sacarídeos capsulares nativos. 0 termo sacarídeo capsular nativo refere-se aos polímeros contendo açúcar (por exemplo, polímeros de açúcares, ácidos de açúcar, amino de açúcares, álcoois polhídricos, álcoois de açúcar, e fosfatos de açúcar etc.) que podem ser encontrados na cápsula de bactérias (ambas Gram-positiva e Gram-negativa) tais como N. meningitidis, S.pneumoniae e H. influenzae. Além disso, o sacarídeo capsular nativo inclui ambos polissacarídeos e oligossacarídeos. Os oligossacarídeos capsulares nativos podem ser obtidos despolimerização e dimensionamento de polissacarídeos nativos. A posição do grupo hidroxila de um sacarídeo

27/112 capsular nativo é uma posição no sacarídeo capsular nativo tendo um grupo hidroxila. Entretanto, não inclui posições em ligações glicosídicas, ou resíduos das mesmas, tendo grupos hidroxila (por exemplo, um grupo hidroxila que é parte de uma ligação de fosfato não ocupa uma posição de grupo hidroxila) . Nem inclui as posições onde há um grupo acetóxi (AcO) no sacarídeo capsular nativo não são também posições de grupo hidroxila.

O sacarídeo capsular nativo pode compreender as unidades de sacarídeo ligadas por ligações fosfodiéster. Os sacarídeos compreendendo ligações fosfodiéster podem ser instáveis à hidrõlise.

O sacarídeo capsular nativo e o sacarídeo capsular modificado da invenção são preferivelmente imunogênicos em mamíferos (por exemplo, humanos) . 0 mamífero pode ser um adulto ou uma criança humanos.

O sacarídeo capsular nativo é preferivelmente um polissacarídeo (ou fragmento de oligossacarídeo do mesmo) de N. meningitidis (incluindo sorogrupos A, B, C, W135 e Y), S.pneumoniae (incluindo sorotipos 1, 4, 5, 6B, 9V, 14,18C,

19F e 23F) , H. influenzae tipo B, Neisseria gonorrhoeae,

Streptococcus agalactiae, Escherichia Coli,

Salmonella typhi, Streptococcus mutans,

Cryptococcus neoformans,

Moraxella catarrhalis,

Klebsiella pneumoniae,

Staphilococcus aureus, e/ou Pseudomonas aeruginosa.

Embora a invenção possa ser aplicada a qualquer sorogrupo de N. meningitidis, prefere-se usar um sacarídeo capsular do sorogrupo A (MenA). O sacarídeo capsular MenA é particularmente instável em solução aquosa, significando que procedimentos especiais precisam ser usados para

28/112 realizar as manipulações químicas (por exemplo, conjugação às proteínas carreadoras) nesta molécula. Entretanto, os sacarídeos MenA modificados de acordo com a invenção são descobertos por serem vantajosamente estáveis em solução aquosa.

O polissacarídeo capsular MenA {-»6) -D-ManpNAc (3/4OAc) a-(l^OPO₃^>} é composto de resíduos de N-acetilmannosamina ligado junto por ligações al-6 fosfodiéster tendo as unidades de repetição mostradas abaixo.

De acordo com as definições acima, aproximadamente 8099% das posições 4 são posições de grupo hidroxila, e aproximadamente 10-40% das posições 3 são posições de grupo hidroxila. O grupo 1-hidróxi terminal também ocupa uma posição de grupo hidroxila. O grupo 1-hidróxi terminal é um grupo hidroxila anomérico terminal. O grupo hidroxila que é parte do grupo -OP(O) (ΟΗ)Ο' não é uma posição de grupo hidroxila.

29/112

Conjugados de sacarídeo-proteína

Os sacarídeos modificados da invenção podem ser submetidos a qualquer processamento à jusante usual que é aplicado aos sacarídeos (por exemplo, derivatização, conjugação, fragmentação, etc.). Para melhorara imunogenicidade, os sacarídeos modificados da invenção são conjugados preferivelmente a uma proteína carreadora.A conjugação às proteínas carreadoras é particularmente útil para vacinas pediátricas [6] e é uma técnica bem conhecida [por exemplo, revisto nas refs. 7 a 15 etc.] .O polissacarídeo pode ser ligado diretamente à proteína [2, 16] ou pode ser ligado através de um grupo ligante. Muitos tipos diferentes de grupos ligantes foram propostos para ligar polissacarídeos às proteínas [por exemplo, 3, 17].

A invenção assim fornece um conjugado de uma proteína e um sacarídeo modificado da invenção. A proteína pode ser conjugada ao sacarídeo diretamente, ou um ligante pode ser usado. Qualquer ligante química apropriado pode ser usado. A estabilidade melhorada do polissacarídeo modificado 20 permite vantajosamente que uma variedade ampla de ligações seja usada.

Como descrito acima, em algumas modalidades prefere-se que o sacarídeo capsular modificado tenha pelo menos um grupo hidroxila ou grupo amino livre que podem ser usados 25 como uma parte para ligação subsequente a uma proteína carreadora.

Um sacarídeo capsular modificado tendo um grupo hidroxila livre pode ser obtido seletivamente bloqueando grupos hidroxila em um sacarídeo capsular, ou seletivamente 30 desbloqueando um sacarídeo capsular modificado em que todos

30/112 os grupos hidroxila estão bloqueados. Alternativamente, um grupo hidroxila livre pode ser revelado despolimerizando e dimensionando um sacarídeo capsular modificado. Preferivelmente, pelo menos um grupo hidroxila livre é um grupo hidroxila anomérico terminal. O grupo hidroxila anomérico terminal é preferido como o grupo hidroxila livre, pois um grupo hidroxila anomérico terminal pode ser revelado por despolimerizar e dimensionar um sacarídeo capsular modificado.

Um sacarídeo capsular modificado tendo um grupo amino de um grupo hidroxila anomérico terminal, opcionalmente seguido por proteção do grupo NH₂ resultante. A de aminação redutiva pode ser realizada antes ou depois da etapa de

Preferivelmente, a da presente invenção já que o grupo

NH₂ resultante pode seletivamente ser protegido/desprotegido na presença de grupos hidroxila/grupos bloqueadores.

Por exemplo, a presente invenção fornece um processo para fazer um conjugado de sacarídeo-proteína compreendendo as etapas de:

(a) fornecer um sacarídeo capsular modificado da invenção, em que o sacarídeo modificado compreende um grupo hidroxila anomérico terminal ou um grupo amino derivado de um grupo hidroxila anomérico terminal; e (b) ligar o sacarídeo capsular modificado a uma proteína através do grupo hidroxila anomérico terminal ou o grupo amino derivado de um grupo hidroxila anomérico terminal.

31/112

A proteína é preferivelmente uma toxina ou toxóide bacteriano, em particular toxina ou toxóide de difteria.

Por exemplo, a proteína é preferivelmente CRM₁₉₇.

As ligações através de um grupo ligante podem ser feitas usando qualquer procedimento conhecido, por exemplo, os procedimentos descritos nas referências 3 e 17. Um tipo preferido de ligação é um ligante carbonila, que pode ser formado pela reação de um grupo hidroxila livre do sacarídeo modificado com CDI [18, 19] seguido pela reação com uma proteína para formar uma ligação de carbamato. Um outro tipo preferido de ligação é um ligante de ácido adípico, que pode ser formado acoplando um grupo -NH₂ livre no sacarídeo modificado com ácido adípico (usando, por exemplo, ativação de diimida), e então acoplar uma proteína ao intermediário de ácido adípico-sacarídeo resultante [11,

20, 21]. Outros ligantes incluem B-propionamido [22] , nitrofenil-etilamina [23] haletos de haloacila [24] , ligações glicosídicas [25] ácido 6-aminocapróico [26] , ADH [2 7] , porções C₄ a

C₁₂ [28] pode envolver: redução do terminal anomérico um grupo hidroxila primário, primário;

reação do grupo hidroxila primário com CDI para formar um intermediário de carbamato CDI; e acoplamento do intermediário de carbamato CDI com um grupo amino em uma proteína.

O esquema 2 mostra dois exemplos diferentes de como um sacarídeo capsular pode ser conjugado a uma proteína carreadora, de acordo com a presente invenção. No primeiro exemplo, a proteína é conjugada através de um grupo

32/112 hidroxila terminal. No segundo exemplo, a proteína é ligada através de um grupo amino terminal.

OH

1. CDI

2. Proteína-NH2

OC(O)NH- Proteína

2. Proteger o grupo terminal -NH2 com Fmoc

3. Bloquear grupos OH

4. Desproteger -NHFmoc

5. Acoplar ao ácido adípico

6. Conjugação à proteína-NHj

1. Aminação redutiva

OP(O)(OH)O'

Monossacarídeo

Monossacarídeo

Monossacarídeo

Bloqueador

Bloqueador

Bloqueador

NHC(O)(CH₂)4C(O)NH-Proteína

- Bloqueador é um grupo bloqueador

Esquema 2

As ligações diretas à proteína podem compreender oxidação do polissacarídeo seguido por aminação redutiva com a proteína, como descrito nas, por exemplo, referências 2 e 16. Por exemplo, em modalidades onde há pelo menos uma unidade de monossacarídeo do sacarídeo capsular modificado onde dois grupos hidroxila vicinais do sacarídeo capsular nativo correspondente não compreendem grupos bloqueadores, um ou mais pares de grupos hidroxila vicinais podem ser convertidos em grupos aldeído por divagem oxidativa (por exemplo, NaIO₄, Pb(OAc)₄, etc.). O sacarídeo capsular modificado pode então ser ligado à proteína por aminação

33/112 redutiva.

Por exemplo, a presente invenção fornece um processo para fazer um conjugado de sacarídeo-proteína compreendendo as etapas de:

(a) fornecer um sacarídeo capsular modificado da invenção em que haja pelo menos uma unidade de monossacarídeo do sacarídeo capsular modificado onde dois grupos hidroxila vicinais do sacarídeo capsular nativo correspondente não compreendem grupos bloqueadores;

(b) converter pelo menos um dos pares de grupos hidroxila vicinais em grupos aldeído por divagem oxidativa; e (c) ligar o sacarídeo capsular modificado a uma proteína por aminação redutiva.

A proteína é preferivelmente uma toxina ou toxóide bacteriano, em particular toxina ou toxóide de difteria. Por exemplo, a proteína é preferivelmente CRM₁₉₇.

Como descrito acima, em algumas modalidades, é preferido que pelo menos uma das unidades de monossacarídeo 20 do sacarídeo capsular modificado compreende grupos bloqueadores em que R¹ é substituído com dois grupos hidroxila vicinais. Os dois grupos hidroxila vicinais podem ser usados como uma parte para ligação subsequente a uma proteína carreadora. Por exemplo, um ou mais pares de 25 grupos hidroxila vicinais podem ser convertidos em grupos aldeído por divagem oxidativa (por exemplo, NaI0₄, Pb(OAc)₄, etc.). O sacarídeo capsular modificado pode então ser ligado à proteína por aminação redutiva.

Por exemplo, a presente invenção fornece um processo 30 para fazer um conjugado de sacarídeo-proteína compreendendo

34/112 as etapas de:

(a) fornecer um sacarídeo capsular modificado da invenção em que pelo menos uma das unidades de monossacarídeo compreende grupos bloqueadores em que R¹ é substituído com dois grupos hidroxila vicinais;

(b) converter pelo menos um dos pares de grupos hidroxila vicinais em grupos aldeído por divagem oxidativa; e (c) ligar o sacarídeo capsular modificado a uma proteína por aminação redutiva.

A proteína é preferivelmente uma toxina ou toxóide bacteriano, em particular toxina ou toxóide de difteria. Por exemplo, a proteína é preferivelmente CRMi₉₇.

Em algumas modalidades deste processo, todos os grupos hidroxila vicinais presentes nos grupos bloqueadores são convertidos em grupos aldeído na etapa (b) . Nestas modalidades, o número grupos aldeído produzidos depende do número total de grupos bloqueadores em que R¹ é substituído com dois grupos hidroxila vicinais que estão presentes no sacarídeo capsular modificado. Em outras modalidades, as condições para divagem oxidativa são selecionadas tais que somente uma proporção dos grupos hidroxila vicinais presentes nos grupos bloqueadores é convertida em grupos aldeído. Nestas modalidades, o número de grupos de aldeído produzidos depende do número total de grupos bloqueadores em que R¹ é substituído com dois grupos hidroxila vicinais que estão presentes no sacarídeo capsular modificado e as condições selecionados. Em tais modalidades, prefere-se que

15%, 16%, 17%, 18%, 19% ou 20% das unidades de

35/112 monossacarídeo do sacarídeo capsular modificado tenham grupos bloqueadores que são convertidos em grupos aldeído. Por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 4 0 unidades de monossacarídeo tem grupos bloqueadores que são convertidos em grupos aldeído. Preferivelmente, entre 5-15%, mais preferivelmente 10%, das unidades de monossacarídeo têm grupos bloqueadores que são convertidos em grupos aldeído.

O esquema 3 mostra dois exemplos adicionais de como um sacarídeo capsular pode ser conjugado a uma proteína carreadora, de acordo com a presente invenção. No primeiro exemplo (lado da mão esquerda), todos os grupos bloqueadores têm um grupo R¹ que é substituído com dois grupos hidroxila vicinais. Uma proporção (por exemplo, 10%) destes grupos hidroxila vicinais é convertida em grupos aldeído para conjugação a uma proteína. No segundo exemplo (lado da mão direita), dois tipos de grupo bloqueador estão presentes. Uma proporção destes (por exemplo, 10%) tem um R¹ que é substituído com dois grupos hidroxila vicinais. Todos estes grupos hidroxila vicinais são convertidos em grupos aldeído para conjugação a uma proteína.

Polissacarídeo

X Despolimerização

i

36/112 hnr'r² (100% de R¹ são substituídos com dois grupos hidroxila vicinais).

hnr‘r² (10% de R¹ são substituídos com dois grupos hidroxila vicinais , 90% de R* são substituídos com um único grupo hidroxila na extremidade distai da cadeia alquila Ci-ô)·

Ultrafiltração

Ultrafiltração

Oligossacarídeo -C(O)-NR'R²

Clivagem oxidativa de 10% de grupos R

Clivagem oxidativa de todos os grupos R1 substituídos com dois grupos hidroxila vicinais

Ultrafiltração

Ultrafiltração

Oligossacarídeo derivatizado de aldeído

Conjugação à proteína -NHl

Conjugado de oligossacarideo-proteína 90% bloqueado com NR1R2 (R1 é substituído com dois grupos hidroxila vicinais).

Ultrafiltração

Conjugado de oligossacarideo-proteína

90% bloqueado com NR1R2 (R1 é substituído com um único grupo hidroxila na extremidade distai da cadeia alquila C|._ft ).

Esquema 3

As proteínas carreadoras preferidas são toxinas ou toxóides bacterianos, tais como toxóides de difteria ou tétano. Estes são geralmente usados em vacinas conjugadas. O toxóide de difteria CRM₁₉₇ é particularmente preferido [29] . Outras proteínas carreadoras apropriadas incluem a proteína de membrana externa de N. meningitidis [30], peptídeos sintéticos [31,32], proteínas de choque a calor

112 [33,34], proteínas de coqueluche [35,36], proteína D de H. influenzae [37], citocinas [38], linfocinas [38], hormônios [38] , fatores de crescimento [38] , toxina A ou B de C.difficile [39], proteínas de captação de ferro [40] etc. É possível usar misturas de proteínas carreadora.

Após a conjugação, os sacarídeos livres e conjugados podem ser separados. Há muitos métodos apropriados, incluindo cromatografia hidrofóbica, ultrafiltração tangencial, diafiltração etc. [veja também refs. 41, 42 etc.] .

Uma única proteína carreadora pode carregar sacarídeos diferentes múltiplos [43] .

Composições e métodos farmacêuticos

As composições feitas usando os métodos da invenção são farmaceuticamente aceitáveis. Podem incluir componentes além do sacarídeo modificado e/ou conjugado, por exemplo, tipicamente incluirão um ou mais carreadores farmacêuticos. Um discussão completa de tais componentes está disponível na referência 44. Assim a invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo (a) um sacarídeo modificado da invenção e/ou um conjugado da invenção, e (b) um carreador farmaceuticamente aceitável. A composição é preferivelmente uma composição imunogênica (por exemplo, uma vacina) . As vacinas baseadas em sacarídeos ou conjugados de sacarídeoproteína são conhecidas na técnica.

As composições podem incluir um ou mais tampões. Os tampões típicos incluem: um tampão de fosfato; um tampão de Tris; um tampão de borato; um tampão de succinato; um tampão de histidina; ou um tampão de citrato. Os tampões serão tipicamente incluídos na faixa 5-20 mM.

38/112

Para controlar a tonicidade, prefere-se incluir um sal fisiológico, tal como um sal de sódio. O cloreto de sódio (NaCl) é preferido, que pode estar presente entre em 1 e 20 mg/ml. Outros sais que podem estar presentes incluem cloreto de potássio, fosfato de dihidrogênio potássio, dehidrato de fosfato disódio, cloreto de magnésio, cloreto de cálcio, etc.

As composições terão geralmente uma osmolaridade entre 200 mOsm/kg e 400 mOsm/kg, preferivelmente entre, 240-360 mOsm/kg, e cairá mais preferivelmente dentro da faixa de 290-310 mOsm/kg. A osmolaridade tem sido previamente relatada para não ter um impacto na dor causada pela vacinação [45] , mas manter a osmolaridade nesta faixa não obstante é preferida.

O pH de uma composição estará geralmente entre 5,0 e 80, e mais tipicamente entre 5,5 e 6,5, por exemplo, entre 6,5 e 7,5. Um processo da invenção pode portanto, incluir uma etapa de ajustar o pH do volume vacina antes de embalar

A composição é preferivelmente estéril. A composição é preferivelmente não-pirogênica, por exemplo, contendo <1 UE (unidade de endotoxina, uma medida padrão) por dose, e preferivelmente <0,1 UE por dose. A composição é preferivelmente glúten livre.

A composição pode incluir um conservante, tal como tiomersal ou 2-fenoxietanol. Prefere-se, entretanto, que a vacina deva estar substancialmente livre de (isto é, menos do que 5 pg/ml) material com mercúrio, por exemplo, tiomersal-livre. As vacinas não contendo mercúrio são mais preferidas.

A composição pode incluir material para uma única

39/112 imunização, ou pode incluir material para imunizações múltiplas (isto é, um kit 'multidose') . A inclusão de um conservante é preferida em arranjos multidose.

As vacinas são tipicamente administradas em um volume de dosagem de aproximadamente 0,5 ml.

As composições são preferivelmente armazenadas entre em 2°C e 8°C. Não devem ser congelados. Devem idealmente ser mantidas fora da luz direta.

Onde uma composição inclui um conjugado então pode também compreender a proteína carreadora não conjugada, mas prefere-se que a quantidade de carreador não conjugado relativo à quantidade total desse carreador é menos de 5%.

As composições da invenção são apropriadas para administração aos pacientes humanos, e a invenção fornece um método de aumentar uma resposta imune em um paciente, compreendendo a etapa de administrar tal composição ao paciente. A invenção também fornece as composições da invenção para uso como medicamento. A invenção também fornece o uso de um conjugado da invenção, aumentar uma resposta sacarídeo modificado e/ou de um na fabricação de um medicamento para imune em um paciente. A resposta imune aumentada por estes métodos e usos geralmente incluirão uma resposta de anticorpo, preferivelmente uma resposta de anticorpo protetora contra a infecção meningocócica.

As doenças causadas por Neisseria incluem meningite, septicemia e gonorréia. A prevenção e/ou tratamento de meningite bacteriana é preferido.

As composições podem ser administradas em várias maneiras. A rota de imunização mais preferida é por injeção intramuscular (por exemplo, no braço ou perna), mas outras

40/112 rotas disponíveis incluem injeção [46-48], oral [49], intradérmica subcutânea, intranasal [50,51], transcutânea, transdérmica [52], etc.

acordo com a invenção podem ser usadas para tratar crianças e adultos. O paciente pode ter menos de 1 ano de idade, 1-5 anos de idade,

5-15 anos de idade, 15-55 anos de idade, ou pelo menos 55 anos de idade. O paciente pode ser idoso (por exemplo, >50 anos de idade, preferivelmente >65 anos), os jovens (por exemplo, <5 de anos de idade), pacientes hospitalizados, trabalhadores cuidados médicos, serviço armado e pessoal militar, mulheres gravidas, pacientes cronicamente doentes, pacientes imunodeficientes, e pessoas que viajam ao externa. As composições não são apropriadas unicamente para estes grupos, entretanto, podem ser usadas mais geralmente em uma população.

O tratamento pode ser por uma programação de dose única ou por uma programação de dose múltipla. As doses múltiplas podem ser usadas em uma programação de imunização primária e/ou em uma programação de imunização de reforço. Em uma programação de dose múltipla as várias doses podem ser dadas pela mesma ou diferentes rotas, por exemplo, principal parenteral e reforço mucosal, um principal mucosal e reforço parenteral, etc. A administração de mais de uma dose (tipicamente duas doses) é particularmente útil em pacientes imunologicamente desprotegidos. As doses múltiplas serão tipicamente administradas pelo menos com 1 semana de distância (por exemplo, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente semanas, aproximadamente 8 semanas,

41/112 aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc.).

As composições da invenção podem ser administradas aos pacientes substancialmente no mesmo tempo que (por exemplo, durante a mesma consulta ou visita médica a um profissional de cuidados médicos) outras composições, e em particular ao mesmo tempo que outras vacinas.

As composições imunogênicas compreendem uma quantidade imunologicamente eficaz de antígeno de sacarídeo, assim como qualquer outro de outros componentes especifiçados, como necessário. Por quantidade imunologicamente eficaz, significa que a administração dessa quantidade a um indivíduo, em uma única dose ou como parte de uma série, é eficaz para tratamento ou prevenção. Esta quantidade varia dependendo da saúde e condição física do indivíduo a ser tratado, idade, grupo taxonômico de indivíduo a ser tratado (por exemplo, primata não humano, primata, etc.), a capacidade do sistema imune do indivíduo para sintetizar anticorpos, o grau de proteção desejado, a formulação da vacina, a avaliação de tratamento do médico da situação médica, e outros fatores relevantes. Espera-se que a quantidade cairá em uma faixa relativamente ampla que possa ser determinada com os ensaios rotineiros. A dosagem de tratamento pode ser uma programação de dose única ou uma programação de dose múltipla (por exemplo, incluindo doses de reforço).

As vacinas de acordo com a invenção podem ser profiláticas (isto é, para prevenir a infecção) ou terapêuticas (isto é, para tratar a doença após infecção), mas serão tipicamente profiláticas.

42/112

Adjuvantes

As composições da invenção podem vantajosamente incluir um adjuvante, que pode funcionar para melhorar as respostas imunes provocadas em um paciente que recebe a composição. Os adjuvantes que podem ser usados com a invenção incluem, mas não são limitados a:

- Uma composição contendo mineral, incluindo sais de cálcio e sais de alumínio (ou misturas dos mesmos). Os sais de cálcio incluem fosfato de cálcio (por exemplo, as partículas de CAP divulgadas na ref. 53) . Os sais de alumínio incluem hidróxidos, fosfatos, sulfatos, etc., com os sais tomando qualquer forma apropriada (por exemplo, gel, cristalina, amorfa, etc.). A adsorção a estes sais é preferida. As composições contendo minerais podem também ser formuladas como uma partícula de sal de metal [54]. Os adjuvantes de sal de alumínio são descritos mais detalhadamente abaixo.

Uma emulsão óleo em água, como descrita mais detalhadamente abaixo.

- Um oligonucleotídeo imunoestimulatório, tal como um contendo uma porção CpG (uma sequência de dinucleotídeo contendo uma citosina não metilada ligada por uma ligação de fosfato a uma guanosina), uma porção TpG [55], um RNA de fita dupla, um oligonucleotídeo contendo uma sequência palíndroma, ou um oligonucleotídeo contendo uma sequência poli(dG). Os oligonucleotídeos imunoestimulatórios podem incluir modificações/análogos de nucleotídeo, tais como modificações fósforotioato e podem ser fita dupla ou (exceto para RNA) fita simples. As referências 56 a 58 divulgam as substituições análogas possíveis, por exemplo,

43/112 substituição de guanosine com 2'-deoxi-7-deazaguanosina. O efeito de adjuvante de oligonucleotideos CpG é ainda discutido nas refs. 59-64. Uma sequência CpG pode ser direcionada para TLR9, tal como a porção GTCGTT ou TTCGTT [65] . A sequência CpG pode ser específica para induzir uma

resposta imune de	Thl, tal	como	um CpG-A ODN
(oligodeoxinucleotídeo)	, ou pode	ser	mais	específica para
induzir uma resposta de	célula B,	tal	como	CpG-B ODN. CpG-A
e CpG-B ODNs são	discutidos	nas	refs. 66-68.

Preferivelmente, o CpG é um CpG-A ODN. Preferivelmente, o oligonucleotídeo CpG é construído de modo que a extremidade 5' seja acessível para o reconhecimento de receptor. Opcionalmente, duas sequências de oligonucleotídeo CpG podem ser unidas em suas extremidades 3' para formar imunômeros. Veja, por exemplo, as referências 65 e 69-71. Um adjuvante de CpG útil é CpG7909, também conhecido como ProMune™ (Coley Pharmaceutical Group, Inc.). Os oligonucleotideos imunoestimulatórios tipicamente compreenderão pelo menos 20 nucleotídeos. Podem compreender menos de 100 nucleotídeos.

- Lipido A de monofosforil 3-O-desacilado ('3dMPL', também conhecido como 'MPL™') [72-75]. 3dMPL foi preparado de um mutante sem heptose de Salmonella minnesota, e é quimicamente similar ao lipido A, mas falta um grupo fosforil ácido-instável e um grupo acila base-instável. A preparação de 3dMPL foi originalmente descrita na referência 76. 3dMPL pode tomar a forma de uma mistura de moléculas relacionadas, variando por sua acilação (por exemplo, tendo 3, 4, 5 ou 6 cadeias acila, que podem ser de comprimentos diferentes).

Os dois monossacarídeos de

112 glucosamina (também conhecidos 2-deoxi-2-amino-glicose) como são N-acilados em seus carbonos de posição 2 (isto é, em posições 2 e 2'), e há também O-acilação na posição 3’.

- Um composto de imidazoquinolina, tal como Imiquimod (R-837) [77,78], Resiquimod (R-848) [79], e seus análogos; e sais dos mesmos (por exemplo, os sais de hidrocloreto). Detalhes adicionais sobre imidazoquinolinas imunoestimulatórias podem ser encontrados nas referências 80 a 84.

- Um composto de tiosemicarbazona, tal como aqueles divulgados na referência 85. Métodos de formulação, fabricação, também na e seleção para compostos ativos são descritos referência 85. As tiosemicarbazonas são particularmente eficazes na estimulação de células mononucleares sanguíneas periféricas humanas para a produção de citocinas, tais como TNF-a.

Um composto de triptantrina, tal como aqueles divulgados na referência 86. Os métodos de formulação, fabricação, e seleção para compostos ativos são descritos também na referência 86. As tiosemicarbazonas são particularmente eficazes na estimulação de células mononucleares sanguíneas periféricas humanas para a produção de citocinas, tais como TNF-a.

- Um análogo de nucleosídeo, tal como: (a) Isatorabina (ANA-245;

- tia-8-oxoguanosina) :

e pró-fármacos dos mesmos; (b) ANA975; (c) ANA-025-1;

45/112 (d) ANA380; (e) os compostos divulgados nas referências 87 a 89; (f) um composto tendo a fórmula:

em que:

Ri e R₂ são cada um independentemente H, halo, -NR_aR_b,

-OH, alcóxi Cx-6, alcóxi 0χ-₆ substituído, heterociclila, heterociclila substituída, arila C₆_₁₀, arila C₆_₁₀ substituída, alquila Cx-g, ou alquila Cx_₆ substituída;

R₃ está ausente, H, alquila Cx_₆, alquila 0χ_₆ substituída, arila C₁_₆, arila C₆-io substituída, heterociclila, ou heterociclila substituída;

R₄ e R5 heterociclila são cada um índependentemente H, halo, heterociclila substituída, -C(O)-R_d, alquila

Ci-6, alquila 0χ_₆ substituída, ou ligado junto para formar

Xx e X₂ são cada uma independentemente N, C, O, ou S;

R₈ é H, halo, -OH, alquila Cx_₆, alquenila C₂_₆, alquinila C₂_₆, -OH, -NR_aR_b, - (CH₂) _n-0-R_c, -O-(Ci-₆ alquila),

-S(O)_p(R)_e, ou -C(0) -R_d;

R₉ é H, alquila 0χ.₆, alquila 0χ_₆ substituída, heterociclila, heterociclila substituída ou R_9a, em que R_9a

O.

R<ía

46/112 a ligação sendo conseguida na ligação indicada por um

Rio e Rn são cada um independentemente H, halo, Ci_₆ alcóxi, alcóxi Ci__e substituído, -NR_aR_b ou -OH;

cada R_a e R_b são independentemente H, alquila Ci_₆, alquila Ci-₆ substituída, -C(O)R_d, C₆-io arila;

cada R_c é independentemente H, fosfato, difosfato, trifosfato, alquila Cl-6, ou alquila Ci_₆ substituída;

cada R_d é independentemente H, halo, alquila Ci-₆, alquila C!_₆ substituída, alcóxi Ci_₆, alcóxi Ci_₆ substituído, - NH₂, -NH(alquila Ci_₆) , -NH(alquila Ci_₆ substituída), N(alquila Ci__s)₂, -N(alquila Ci_₆ substituída) ₂, arila C₆-ioz ou heterociclila;

cada R_e é independentemente H, alquila Ci_₆, alquila Ci- ₆ substituída, arila C₆-io, arila C₆-io substituída, heterociclila, ou heterociclila substituída;

cada R_f é independentemente H, alquila Οχ-6, alquila Ci_ ₆ substituída, -C(O)R_d, fosfato, difosfato, ou trifosfato;

cada n é independentemente 0, 1, 2, ou 3;

cada p é independentemente 0, 1, ou 2; ou (g) um sal farmaceuticamente aceitável de quaisquer de (a) a (f) , um tautômero de quaisquer de (a) a (f) , ou um sal farmaceuticamente aceitável do tautômero.

- Loxoribina (7-allil-8-oxoguanosina) [90].

- Os compostos divulgados na referência 91, incluindo: compostos de acilpiperazina, compostos de indolediona, compostos de tetrahidraisoquinolina (THIQ), compostos de benzociclodiona, compostos de aminoazavinil, compostos de quinolinona aminobenzimidazol (ABIQ) [92,93], compostos de hidraptalamida, compostos de benzofenona, compostos de

47/112 isoxazol, compostos de esterol, compostos de quinazilinona, compostos de pirrol [94], compostos de antraquinona, compostos de quinoxalina, compostos de triazina, compostos de pirazalopirimidina, e compostos de benzazol [95].

- Os compostos divulgados na referência 96, incluindo

3.4- di(1H-indol-3-il)-lH-pirrol-2,5-dionas, análogos de estaurosporina, piridazinas derivatizadas, cromen-4-onas, indolinonas, quinazolinas, e análogos de nucleosídeo.

- Um derivado de fosfato de glucosaminida aminoalquila, tal como RC-529 [97,98].

- Um fosfazeno, tal como poli [di(carboxilatofenóxi) fosfazeno] (PCPP) como descrito, por exemplo, nas referências 99 e 100.

- Imunopotenciadores de molécula pequena (SMlPs) tais como:

N2-metil-l- (2-metilpropil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-

2.4- diamina,

N2,N2-dimetil-l-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4,5c] quinolina-2,4-diamina

N2-etil-N2-metil-l-(2-metilpropil)-lH-imidazo [4,5c] quinolina-2,4-diamina

N2-metil-l- (2-metilpropil)-N2-1H-imidazo[4,5c]quinolina-2,4-diamina

1-(2-metilpropil)-N2-propil-lH-imidazo[4,5c]quinolina-2,4-diamina

N2-butil-l-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-

2.4- diamina

N2-butil-N2-metil-l-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c] quinolina-2,4-diamina

N2-metil-l - (2-metilpropil)-N2-pentil-1H-imidazo[4,5-c]

48/112 quinolina-2,4-diamina

N2-metil-l-(2-metilpropil)-N2-prop-2-enil-lH-imidazo [4,5-c]quinolina-2,4-diamina

1-(2-metilpropil)-2[(fenilmetil)tio]-lH-imidazo[4,5-c] quinolin-4-amina

1- (2-metilpropil)-2-(propiltio)-lH-imidazo[4,5-c] quinolin-4-amina

2- [[4-amino-1-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4,5-c] quinolin-2-il](metil)amino]etanol acetato de 2-[[4-amino-l-(2-metilpropil)-1Himidazo[4,5-c] quinolin-2-il] (metil)amino]etila

-amino-1-(2-metilpropil)-1,3-dihidro-2H-imidazo[4,5-c] quinolin-2-ona

N2-butil-l-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-1Himidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina

N2-butil-N2-metil-l-(2-metilpropil)-N4,N4-bis (fenilmetil)-lH-imidazo [4,5-c]quinolina-2,4-diamina

N2-metil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-1Himidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina

N2,N2-dimetil-l-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)

-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina

1-{4-amino-2-[metil(propil)amino]-1H-imidazo[4,5-c]-il} -2-metilpropan-2-ol

1-(4-amino-2-(propilamino)-lH-imidazo[4,5-c]quinolin1-il}-2-metilpropan-2-ol

N4,N4-dibenzil-1-(2-metóxi-2-metilpropil)-N2-propil1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina.

Saponinas [capítulo 22 da ref. 131] , que são um grupo heterólogo de glicosídeos de esterol e glicosídeos de triterpenóide que são encontrados na casca, folhas, caules,

49/112 raizes e mesmo flores de uma variedade ampla de espécies de planta. A saponina da casca da árvore Molina Quillaia saponaria foi amplamente estudada como adjuvante. A saponina o mata pode também ser comercialmente obtida de Smilax (salsaparrilha), Gypsophilla paniculata (véu de noiva),

Saponaria officianalis formulações de adjuvante saponina incluem formulações purificadas, tais como QS21, assim como formulações de lipídio, tais como [SCOMs QS2] é comercializado como

Stimulon™. As usando

HPLC e usando estas técnicas foram identificadas, incluindo QS7,

QS17,

QS18, QS21, QH-A, QH-B e QH-C. Preferivelmente, a na referência. 101. As formulações de saponina podem também compreender um esterol, tal como coleesterol [102] .

As combinações de saponinas e colesteróis podem ser usadas para formar as partículas originais chamadas complexos imunoestimulantes (ISCOMs) [capítulo 23 da ref.

131] . ISCOMs tipicamente também incluem um fosfolipídio, tal como fosfatidiletanolamina ou fosfatidilcolina.

Qualquer saponina conhecida pode ser usada em ISCOMs.

Preferivelmente, o

ISCOM inclui um ou mais de QuilA, QHA e

QHC. ISCOMs são ainda descritos nas refs. 102-104.

Opcionalmente, o

ISCOMS pode ser desprovido de detergente adicional [105].

Uma revisão do desenvolvimento de adjuvantes ã base de saponina pode ser encontrada nas refs.

106 e 107.

As toxinas

ADP-ribosilantes bacterianas (por exemplo, enterotoxina instável ao calor

E. coli LT, toxina de

50/112 cólera CT, ou toxina de coqueluche PT) e derivados desintoxicados das mesmas, tais como as toxinas mutantes conhecidas como LT-K63 e LT-R72 [108] . O uso de toxinas ADP-ribosilantes desintoxicadas como adjuvantes mucosos é descrito na ref. 109 e como adjuvantes parenterais na ref. 110 .

- Bioadesivos e mucoadesivos, tais como microsferas de ácido hialurônico esterifiçadas [111] ou quitosana e seus derivados [112].

- As micropartículas (isto é, uma partícula de ~100nm a ~150pm em diâmetro, mais preferivelmente ~200nm a ~30pm em diâmetro, ou ~500nm a ~10pm em diâmetro) formadas dos materiais que são biodegradáveis e não tóxicos (por exemplo, um ácido poli(α-hidróxi) , um ácido polihidróxibutírico, um poliortoéster, um polianidrido, uma policaprolactona, etc.), com poli (lactida-co-glicolida) sendo preferida, opcionalmente tratada para ter uma superfície negativamente carregada (por exemplo, com SDS) ou uma superfície positivamente carregada (por exemplo, com um detergente catiônico, tal como CTAB).

Lipossomas (Capítulos 13 e 14 da ref. 131) . Os exemplos de formulações de lipossoma apropriadas para uso como adjuvantes são descritas nas refs. 113-115.

- Éteres de polioxietileno e ésteres de polioxietileno [116]. Tais formulações adicionais incluem tensoativos de éster de sorbitano polioxietileno em combinação com um octoxinol [117] assim como éteres de alquil polioxietileno ou tensoativos de éster em combinação com pelo menos um tensoativo não iônico adicional, tal como um octoxinol [118] . Os éteres de polioxietileno preferidos são

51/112 selecionados do seguinte grupo: éter de polioxietileno-9lauril (lauret 9) , éter de polioxietileno-9-esteoril, éter de polioxietileno-8-esteoril, éter de polioxietileno-4lauril, éter de polioxietileno-35-lauril, e éter de polioxietileno-23-lauril.

- Peptideos de muramil, tais como N-acetilmuramil-Ltreonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-Lalanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilglucsaminil-Nacetilmuramil-L-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitóxi propilamida (DTP-DPP, ou Teramida™), N-acetilmuramil-L-alanil-Disoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'dipalmitoil-sn-glicero-3hidróxifosforilóxi)-etilamina (MTP-PE).

Uma preparação de proteossoma de proteína de membrana externa preparada de uma primeira bactéria Gramnegativa em combinação com uma preparação de lipossacarídeo (LPS) derivada de uma segunda bactéria Gram-negativa, em que o proteossoma de proteína de membrana externa e preparações de LPS forma um complexo adjuvante não covalente estável. Tais complexos incluem IVX- 908, um complexo compreendido de membrana externa de Neisseria meningitidis e LPS.

- 5'-monofosfato de metil inosina (MIMP) [119] .

de pirrolizidina polihidroxilada [120], tendo a fórmula:

ch₂oh grupo ramificada, hidrogênio, reta substituído,

compreendendo grupos não substituído ou saturado ou insaturado acila, alquila (por

52/112 alquinila e arila, ou um sal ou derivado farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Os exemplos incluem, mas não são limitados casuarina, casuarina-6-α-D-glucopiranose,

-epi-casuarina,

-epicasuarina, 3,7-diepi-casuarina,

Uma gama inulina [121] ou derivado da mesma, tais como algamulina.

um sal do

Um composto mesmo:

fórmula I,

tCHsk como definido na referência 122, tais como vé (^CH2)rf \, 1 H* Ç

'ER 803058', 'ER 803732', 'ER 804053', ' ER 804058', ' ER 804059',

804442', 'ER 804680',

804057' por exemplo:

'ER 'ER 804764', 'ER 803022' OU o

lk.

ER804057 'ER

YY o

53/112

ER-803022:

Derivados de lipídio A de Escherichia coli, tal como

OM-174 (descrito nas refs. 123 e 124) .

(geralmente neutro), tal como aminopropil-dimetilmiristoleiloxi-propanamínio brometo-difitanoilfosfatidilou aminopropil-dimetil-bisdodeciloxi-propanamínio brometo-dioleoilfosfatidiletanolamina (GAP-DLRIE: DOPE). Formulações contendo sais de tetradeceneiloxi)-1-propanamínio são preferidos [125].

Os compostos contendo lipídios ligados a estrutura principal acíclica contendo fosfato, tal uma como

substâncias ativas adjuvantes dis

Estas outras detalhadamente nas referências 131 e 132.

são

As composições podem incluir dois ou mais dos referidos adjuvantes.

Os antígenos e adjuvantes em uma composição estarão tipicamente em mistura.

54/112

Adjuvantes de emulsão óleo em água

As emulsões óleo em água são particularmente úteis como adjuvantes. Várias tais emulsões são conhecidas, e incluem tipicamente pelo menos um óleo e pelo menos um tensoativo, com o(s) óleo(s) e tensoativo(s) sendo biodegradáveis (metabolisáveis) e biocompatíveis. As gotas de óleo na emulsão são geralmente menos de 5pm em diâmetro, e podem mesmo ter um diâmetro de submícron, com estes tamanhos pequenos sendo conseguidos com um microfluidizador para fornecer emulsões estáveis. As gotas com um tamanho menor do que 220nm são preferidas enquanto podem ser submetidas à esterilização de filtro.

A invenção pode ser usada com óleos, tais como aqueles de uma fonte animal (como peixes) ou vegetal. As fontes para óleos vegetais incluem frutos secos, sementes e grãos. O óleo de amendoim, óleo de soja, óleo de coco, e óleo de oliva, os mais geralmente disponíveis, exemplificam os óleos de fruto seco. O óleo de jojoba pode ser usado, por exemplo, obtido da fava de jojoba. Os óleos de semente incluem óleo de girassol, óleo de semente de algodão, óleo de semente de girassol, óleo de semente de gergelim e semelhantes. No grupo de grão, o óleo de milho é o mais prontamente disponível, mas o óleo de outros grãos de cereal tais como trigo, aveia, centeio, arroz, teff, triticalo e semelhantes pode também ser usados. 6-10 Os ésteres de ácido graxo de carbono de glicerol e 1,2propanodiol, ao não ocorrer naturalmente em óleos de semente, podem ser preparados por hidrólise, separação e esterificação dos materiais de partida apropriados dos óleos de fruto seco e semente. As gorduras e óleos do leite

55/112 mamífero são metabolizáveis e podem portanto ser usados na prática desta invenção. Os procedimentos para separação, purificação, saponificação e outros meios necessários para obter óleos puros das fontes animais são conhecidos na técnica. A maioria de peixes contém óleos metabolizáveis que podem prontamente ser recuperados. Por exemplo, óleo de fígado de bacalhau, óleos de fígado de tubarão, e óleo de baleia, tal como espermacete exemplificam diversos dos óleos de peixes que podem ser usados aqui. Vários óleos de cadeia ramificados são sintetizados bioquimicamente em 5 unidades de isopreno de 5-carbono e são geralmente referidas como terpenóides. O óleo de fígado de tubarão contém terpenóides ramificados, insaturados conhecidos como escaleno, 2,6,10,15,19,23-hexametil- 2,6,10,14,18,22tetracosahexaeno, que é particularmente preferido aqui. O escalano, análogo saturado ao escaleno, é também um óleo preferido.

Os óleos de peixes, incluindo escaleno e escalano, estão prontamente disponíveis das fontes comerciais ou podem ser obtidos por métodos conhecidos na técnica.

Outros óleos preferidos são os tocoferóis (veja

As misturas de óleos podem ser usadas.

Os tensoativos podem ser classificados por seu 'HLB' (balanço hidrófilo/lipofílico). Os tensoativos preferidos de pelo menos 10, preferivelmente pelo menos 15, e mais preferivelmente pelo menos 16. A com tensoativos incluindo, mas não limitados a: tensoativos de ésteres de sorbitano polioxietileno (geralmente referidos como Tweens), especialmente polisorbato 20 e polisorbato

80; copolímeros de oxido de etileno (EO) , óxido de propilene (PO) , e/ou

56/112 óxido de butileno (BO) , vendido sob o nome comercial de DOWFAX™, tal como copolímeros bloco EO/PO lineares; octoxinóis, que podem variar no número de grupos etóxi repetidos (oxi-1,2-etanodiil) , com octoxinol-9 (Triton X100, ou t-octilfenóxipolietóxietanol) sendo de interesse particular; (octilfenóxi)polietóxietanol (IGEPAL CA-630/NP40); fosfolipídios, tais como fosfatidilcolina (lecitina); éteres graxos de polioxietileno derivados dos álcoois lauril, cetil, estearil e oleil (conhecidos como tensoativos de Bri j) , tais como éter de monolauril trietilenoglicol (Brij 30) ; e ésteres de sorbitano (geralmente conhecidos como os SPANs), tais como trioleato de sorbitano (Span 85) e monolaurato de sorbitano. Os tensoativos preferidos para incluir na emulsão são Tween 80 (monooleato de sorbitano polioxietileno), Span 85 (trioleato de sorbitano), lecitina e Triton X-100. As misturas de tensoativos podem ser usadas, por exemplo, misturas de Tween 80/Span 85.

Os adjuvantes de emulsão óleo em água específicos úteis com a invenção incluem, mas não são limitados a:

- Uma emulsão submícron de escaleno, Tween 80, e Span

85. A composição da emulsão por volume pode ser aproximadamente 5% de escaleno, aproximadamente 0,5% de polisorbato 80 e aproximadamente 0,5% de SPANs 85. Em termos de peso, estas razões se tornaram 4,3% de escaleno,

0,5% de polisorbato 80 e 0,48% de SPANs 85. Este adjuvante é conhecido como 'MF59' [128-130], como descrito mais detalhadamente no capítulo 10 da ref. 131 e capítulo 12 da ref. 132. A emulsão MF59 inclui vantajosamente íons de citrato, por exemplo, 10 mM de tampão de citrato de sódio.

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- Uma emulsão de escaleno, um tocoferol, e Tween 80. A emulsão pode incluir solução salina tamponada de fosfato. Pode também incluir Span 85 (por exemplo, em 1%) e/ou lecitina. Estas emulsões podem ter de 2 a 10% de escaleno, de 2 a 10% de tocoferol e de 0,3 a 3% de Tween 80, e a razão de peso de escaleno:tocoferol é preferivelmente <1, pois isto fornece uma emulsão mais estável. Tal emulsão pode ser feita dissolvendo Tween 80 em PBS para dar uma solução de 2%, misturando então 90ml desta solução com uma mistura de (5g de DL-α-tocoferol e 5ml de escaleno), microfluidizando então a mistura. A emulsão resultante pode ter gotas de óleo de submícrons, por exemplo, com um diâmetro médio entre 100 e 250nm, preferivelmente aproximadamente 180nm.

Uma emulsão de escaleno, um tocoferol, e um detergente Triton (por exemplo, Triton X-100).

- Uma emulsão de escalano, polisorbato 80 e poloxâmero 401 (Pluronic™ L121). A emulsão pode ser formulada em solução salina tamponada de fosfato, pH 7,4. Esta emulsão é um veículo de liberação útil para dipeptídeos de muramil, e tem sido usada com treonil-MDP no adjuvante SAF-1 [133] (0,05-1% Thr-MDP, 5% de escalano, 2,5% de Pluronic L121 e 0,2% de polisorbato 80) . Pode também ser usado sem o ThrMDP, como no adjuvante AF [134] (5% de escalano, 1,25% Pluronic L121 e 0,2% polisorbato 80). A microfluidização é preferida.

Uma emulsão tendo de 0,5-50% de um óleo, 0,1-10% de um fosfolipídio, e

0,05-5% de um tensoativo não iônico.

Como descrito na referência

135, os componentes de fosfolipídio preferidos fosfatidilcolina,

58/112 fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, esfingomielina e cardiolipina. Os tamanhos de gota de submícrons são vantaj osos.

- Uma emulsão óleo em água submícron de um óleo não metabolisável (tal como óleo mineral leve) e pelo menos um tensoativo (tal como lecitina, Tween 80 ou Span 80) . Os aditivos podem ser incluídos, tais como QuilA saponina, colesterol, um conjugado de saponina-lipófilo (tal como GPI-0100, descrito na referência 136, produzido pela adição de amina alifática à desacilsaponina através do grupo carboxila de ácido glucurônico), brometo de dimetiidioctadecilamônio e/ou N,N-dioctadecil-N,N-bis(2hidróxietil)propanodiamina.

- Uma emulsão em que uma saponina (por exemplo, QuilA ou QS21) e um esterol (por exemplo, um colesterol) são associados como micelas helicoidais [137] .

As emulsões podem ser misturadas com o antígeno extemporaneamente, no momento da liberação. Assim o adjuvante e antígeno podem ser mantidos separadamente em uma vacina empacotada ou distribuída, pronta para formulação final no momento de uso. O antígeno estará geralmente em uma forma aquosa, tal que a vacina é finalmente preparada misturando dois líquidos. A razão de volume dos dois líquidos para misturar pode variar (por exemplo, entre 5:1 e 1:5), mas é geralmente aproximadamente 1:1.

Adjuvantes de sal de alumínio

Os adjuvantes conhecidos como hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio podem ser usados. Estes nomes são

59/112 convencionais, mas são usados para conveniência somente, como nenhum é uma descrição precisa do composto químico real que está presente (por exemplo, veja o capítulo 9 da referência 131). A invenção pode usar quaisquer dos adjuvantes de hidróxido ou fosfato que estão em uso geral como adjuvantes.

Os adjuvantes conhecidos como hidróxido de alumínio são sais tipicamente de oxihidróxido de alumínio, que são geralmente pelo menos parcialmente cristalinos. O oxihidróxido de alumínio, que pode ser representado pela fórmula AIO(OH), pode ser distinto de outros compostos de alumínio, tais como hidróxido de alumínio A1(OH)₃, por espectroscopia de infravermelho (IR), em particular pela presença de uma banda de adsorção em 1070cm^_1 e um sobreposição forte em 3090-3100cm^_1 [capítulo 9 da ref. 131]. O grau de cristalinidade de um adjuvante de hidróxido de alumínio é refletido pela largura da banda de difração na meia altura (WHH), com partículas fracamente cristalinas mostrando maior alargamento de linha devido aos tamanhos de cristalito menores. A área de superfície aumenta enquanto WHH aumenta, e os adjuvantes com valores mais elevados de WHH foram vistos por ter maior capacidade para adsorção de antígeno. Uma morfologia fibrosa (por exemplo, como visto em micrografia de eletrônica de transmissão) é típica para adjuvantes de hidróxido de alumínio. O pi de adjuvantes de hidróxido de alumínio é tipicamente aproximadamente 11, isto é, o próprio adjuvante tem uma carga de superfície positiva em pH fisiológico. As capacidades adsorptivas entre 1,8-2,6 mg de proteína por mg Al⁺⁺⁺ em pH 7,4 foram relatadas para adjuvantes de hidróxido de alumínio.

60/112

Os adjuvantes conhecidos como fosfato de alumínio são tipicamente hidróxifosfatos de alumínio, frequentemente também contendo uma pequena quantidade de sulfato (isto é, sulfato de hidróxifosfato de alumínio). Podem ser obtidos por precipitação, e as condições de reação e concentrações durante a precipitação influenciam o grau de substituição de fosfato por hidroxila no sal. Os hidróxifosfatos têm geralmente uma razão molar PO₄/A1 entre 0,3 e 1,2. Os hidróxifosfatos podem ser distintos de A1PO₄ estrito pela 10 presença de grupos hidroxila. Por exemplo, uma banda de espectro de IR em 3164cm^_1 (por exemplo, quando aquecido a 200°C) indica a presença de hidroxilas estruturais [cap.9 da r e f . 131].

A razão molar de PO₄/A1³⁺ de um adjuvante de fosfato de «

alumínio estará geralmente entre 0,3 e 1,2, preferivelmente entre 0,8 e de alumínio sais de

1,2, e mais preferivelmente 0,95+0,1. O fosfato será geralmente amorfo, particularmente para hidróxifosfato. Um adjuvante típico é hidróxifosfato de alumínio amorfo com razão molar de PO₄/A1 entre 0,84 e 0,92, incluído em 0,6mg Al³⁺/ml. O fosfato de alumínio será geralmente particulado (por exemplo, morfologia tipo placa como visto em micrografias de eletrônica de transmissão).

Os diâmetros típicos das partículas estão na faixa de 0,5-20pm (por exemplo, aproximadamente 5-10pm) após qualquer adsorção de antígeno.

As capacidades adsorptivas entre 0,7-1,5 mg de proteína por mg de Al⁺⁺⁺ em pH 7,4 foram relatadas para adjuvantes de fosfato de alumínio.

O ponto de carga zero (PZC) de fosfato de alumínio é inversamente relacionado ao grau de substituição de fosfato

61/112 para hidroxila, e este grau de substituição pode variar dependendo das condições de reação e concentração de reagentes usados preparando o sal por precipitação. PZC é também alterado mudando a concentração de íons fosfato livres em solução (mais fosfato é associado com um PZC mais ácido) ou adicionando um tampão, tal como um tampão de histidina (torna PZC mais básico). Os fosfatos de alumínio usados de acordo com a invenção terão geralmente um PZC entre 4,0 e 7,0, mais preferivelmente entre 5,0 e 6,5, por exemplo aproximadamente 5,7.

As suspensões de sais de alumínio usadas para preparar as composições da invenção podem conter um tampão (por exemplo, um tampão de fosfato ou um de histidina ou um de Tris), mas isto não é sempre necessário. As suspensões são preferivelmente estéreis e livres de pirogênio. Uma suspensão pode incluir os íons de fosfato aquosos livres, por exemplo, presentes em uma concentração entre 1,0 e 20 mM, preferivelmente entre 5 e 15 mM, e mais preferivelmente aproximadamente 10 nM. As suspensões podem também compreender cloreto de sódio.

A invenção pode usar uma mistura de ambos um hidróxido de alumínio e um fosfato de alumínio. Neste caso pode haver mais fosfato de alumínio do que hidróxido, por exemplo, uma razão de peso de pelo menos 2:1, por exemplo, >5:1, >6:1, >7:1, >.8:1, 9 : 1, etc.

A concentração de Al⁺⁺⁺ em uma composição para administração a um paciente é preferivelmente menos do que lOmg/ml, por exemplo, 5 mg/ml, 4 mg/ml, 3 mg/ml, 2 mg/ml, 1 mg/ml, etc. Uma faixa preferida está entre 0,3 e 1 mg/ml.

Antígenos adicionais

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Assim como sacarídeos e/ou conjugado modificados, a composição pode compreender componentes antigênicos adicionais. Por exemplo, a composição pode incluir um ou mais sacarídeos adicionais (mesmo se modificados de acordo com a invenção). Por exemplo, a composição pode compreender sacarídeos de sorogrupos C, W135 e Y de N. meningitidis (por exemplo, além de um sacarídeo MenA modificado) . Estes serão tipicamente conjugados às proteínas carreadoras, e sacarídeos dos diferentes sorogrupos de N. meningitidis podem ser conjugados às mesmas ou proteínas carreadoras diferentes. Onde uma mistura compreende sacarídeos capsulares dos sorogrupos A e C, prefere-se que a razão (peso/peso) de sacarídeo MenA:sacarídeo de MenC seja maior que 1 (por exemplo 2:1, 3:1, 4:1, 5:1; 10:1 ou maior). A imunogenicidade melhorada do componente MenA tem sido observada quando está presente em excesso (massa/dose) ao componente MenC [138].

A composição pode também compreender antígenos de proteína.

Os antígenos que podem ser incluídos na composição da invenção incluem:

um antígeno de proteína de sorogrupo B de N. meningitidis (veja abaixo).

- uma preparação de vesícula de membrana externa (OMV) de N. meningitidis, tal como aquelas divulgadas nas refs. 139, 140, 141, 142 etc.

antígenos de Helicobacter pylori, tais como CagA [143 a 146] , VacA [147, 148] , NAP [149, 150, 151] , HopX [por exemplo, 152], HopY [por exemplo, 152] e/ou urease.

- um antígeno de sacarídeo de Streptococcus pneumoniae

63/112 [por exemplo, 153, 154, 155] .

- um antígeno de vírus de hepatite A, tal como vírus inativado [por exemplo, 156, 157] .

um antígeno de vírus de hepatite B, tal como antígenos de superfície e/ou núcleo [por exemplo 157, 158].

- um antígeno de vírus de hepatite C [por exemplo, 159] .

- um antígeno acelular de Bordetella pertussis, tal como holotoxina de coqueluche (PT) e hemaglutinina filamentosa (FHA) de B.pertussis, opcionalmente também em combinação com pertactina e/ou aglutinonênios 2 e 3 [por exemplo, refs. 160 e 161] .

- um antígeno de Bordetella pertussis celular.

um antígeno de difteria, tal como um toxóide de difteria [por exemplo, capítulo 3 da ref. 162], por exemplo, o mutante CRM₁₉₇ [por exemplo, 163] .

- antígenos de poliomielite [por exemplo, 164, 165] tais como o vírus de poliomielite inativado (IPV).

- um antígeno de tétano, tal como um toxóide de tétano [por exemplo, capítulo 4 da ref. 162] .

- um antígeno de sacarídeo de Haemophilus influenzae B [por exemplo, refs. 166 a 174] .

antígenos de sarampo, caxumba e/ou rubéola [por exemplo, capítulos 9, 10 e 11 da ref. 162].

- um antígeno de N. gonorrhoeae.

- um antígeno de Clamydia pneumoniae [por exemplo, 175,

176, 177, 178, 179, 180, 181] .

- um antígeno de Clamydia trachomatis [por exemplo, 182] .

um antígeno de Porphyromonas gingivalis [por exemplo,

64/112

183] .

- antígeno(s) de raiva [por exemplo, 184] tais como vírus inativado liofilizado [por exemplo, 185, RabAvert™].

- antígeno(s) de gripe [por exemplo, 19 da ref. 162], tal como proteínas de superfície de hemaglutinina e/ou neuraminidase.

- um antígeno de Moraxella catarrhalis [por exemplo, 186] .

um antígeno de Streptococcus agalactiae (Streptococcus de grupo B) [por exemplo 187, 188].

- um antígeno de sacarídeo de Streptococcus agalactiae (streptococcus de grupo B).

- um antígeno de Streptococcus pyogenes (streptococcus de grupo A) [por exemplo, 188, 189, 190] .

- um antígeno de Staphylococcus aureus [por exemplo, 191] .

- um antígeno de Bacillus anthracis [por exemplo, 192,

193, 194] .

- um antígeno de vírus de herpes simplex (HSV). Um antígeno de HSV preferido para uso com a invenção é glicoproteína de membrana gD. Prefere-se usar gD de uma cepa HSV-2 (antígeno 'gD2') . A composição pode usar uma forma de gD em que a região de ancoramento de membrana Cterminal foi deletada [195], por exemplo, um gD truncado compreendendo aminoácidos 1-306 da proteína natural com adição de aparagina e glutamina no C-terminal. Esta forma de proteína inclui o peptídeo de sinal que é clivado para render uma proteína de aminoácido 283 madura. A deleção do ancoramento permite a proteína ser preparada na forma solúvel.

65/112 um antígeno de papilomavírus humano (HPV). Os antígenos de HPV preferidos para uso com a invenção são proteínas de capsídeo Ll, que podem montar para formar estruturas conhecidas como partículas tipo vírus (VLPs). Os VLPs podem ser produzidos pela expressão recombinante de Ll em células de levedura (por exemplo, em S.cerevisiae) ou em células de inseto (por exemplo, em células de Spodoptera, tais como S. frugiperda, ou em células de Drosophila') . Para células de levedura, os vetores de plasmídeo podem carregar o(s) gene(s) de Ll; para células de inseto, os vetores de baculovírus podem carregar o(s) gene(s) de Ll. Mais preferivelmente, a composição inclui Ll VLPs das cepas de HPV-16 e HPV-18. Esta combinação bivalente foi mostrada por ser altamente eficaz [196]. Além das cepas de HPV-16 e HPV18, é também possível incluir Ll VLPs de cepas HPV-6 e HPV11. O uso de cepas de HPV oncogênicas é também possível. Uma vacina pode incluir entre 20-60pg/ml (por exemplo, aproximadamente 40pg/ml) de Ll por cepa de HPV.

um antígeno de um vírus na família flaviviridae (gênero flavivirus), tal como vírus da febre amarela, vírus da encefalite japonesa, quatro sorotipos de vírus da Dengue, vírus da encefalite do carrapato, vírus do Oeste do Nilo.

um antígeno de pestivirus, tal como de vírus da febre suína clássico, vírus da diarréia viral bovina, e/ou vírus da doença de fronteira.

um	antígeno	de parvovírus, por	exemplo, de
parvovírus	B19.
uma	proteína	de príon (por exemplo	, proteína de
príon CJD)
uma	proteína	amilóide, tal como um	beta peptídeo

66/112 [197]

- um antígeno de câncer, tal como aqueles listados na

Tabela 1 da ref. 198 ou nas tabelas 3	e 4 da ref. 199.
A composição pode	compreender	um ou	mais destes
antígenos adicionais.
Os antígenos de	proteína	tóxicos	podem ser

desintoxicados se necessário (por exemplo, desintoxicação de toxina de coqueluche por meios químicos e/ou genéticos [161] ) .

Onde um antígeno de difteria é incluído na composição prefere-se também incluir antígeno de tétano e antígenos de coqueluche. Similarmente, onde um antígeno de tétano é incluído prefere-se também incluir antígenos de difteria e de coqueluche. Similarmente, onde um antígeno de coqueluche é incluído prefere-se também incluir antígenos de difteria e de tétano.

Os antígenos podem ser adsorvidos a um sal de alumínio.

Os antígenos na composição estarão tipicamente presentes em uma concentração de pelo menos lpg/ml cada um. Geralmente, a concentração de qualquer antígeno dado será suficiente para provocar uma resposta imune contra esse antígeno.

Como uma alternativa para usar antígenos de proteínas na composição da invenção, o ácido nucleico codificando o antígeno pode ser usado [por exemplo, refs. 200 a 208]. Os componentes de proteína das composições da invenção podem assim ser substituídos pelo ácido nucleico (preferivelmente DNA, por exemplo, na forma de um plasmídeo) codificando a proteína.

Antígenos meningocôcicos não sacarídeos

67/112

Embora os sacarídeos capsulares de sorogrupos meningocócicos A, C, W13 5 e Y podem ser usados para gerar imunidade protetora, a mesma abordagem não trabalhou para o sorogrupo B. Assim os sacarídeos e conjugados modificados da invenção podem ser usados juntos (por exemplo, separadamente ou em mistura) com antígenos meningocócicos que não são baseados em sacarídeos capsulares, por exemplo, antígenos de proteína, lipopolissacarídeos, ou vesículas de membrana.

As sequências de genoma para sorogrupos meningocócicos A [209] e B [210,211] foram relatadas, e antígenos de proteína apropriados podem ser selecionados dos polipeptídeos codificados [por exemplo, refs. 212-217], Os antígenos de candidato foram manipulados para melhorar a expressão heteróloga [refs. 218 a 220] .

Uma composição preferida inclui uma proteína Tbp e uma proteína Hsf [221]. Hsf é uma proteína autotransportadora [222-224] , também conhecida como nhhA [224] , GNA0992 [212] ou NMB0992 [210] . Tbp é a proteína de ligação de transferrina [225-228] , e engloba TbpA e TbpB e as formas de alto peso molecular e baixo peso molecular de TbpA e TbpB. Tbp engloba proteínas individuais descritas acima e complexos das proteínas e quaisquer outras proteínas ou complexos das mesmas capazes de ligar transferrina. Embora Tbp possa referir às formas moleculares de alto e baixo peso molecular de TbpA ou TbpB, é preferido que ambas as formas de peso molecular alto e peso molecular baixo de TbpA e/ou TbpB estejam presentes. Mais preferivelmente, TbpA de peso molecular alto e peso molecular baixo está presente.

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Outra composição preferida inclui pelo menos um antígeno selecionado de cada um de pelo menos duas categorias diferentes de proteína tendo funções diferentes dentro da Neisseria. Os exemplos de tais categorias de proteínas são: adesinas, proteínas autotransportadoras, toxinas, proteínas de membrana externas integrais e proteínas de aquisição de ferro. Estes antígenos podem ser selecionados como segue, usando a nomenclatura de referência 229: pelo menos uma adesina de Neisseria selecionada do grupo consistindo de FhaB, NspA PilC, Hsf, Hap, MafA, MafB, Omp26, NMB0315, NMB0995, NMB1119 e NadA; pelo menos um autotransportador de Neisserial selecionado do grupo consistindo de Hsf, Hap, protease de IgA, AspA, e NadA; pelo menos uma toxina de Neisserial selecionada do grupo consistindo de FrpA, FrpC, FrpA/C, VapD, NM-ADPRT (NMB1343) e um ou outro ou ambos LPS imunotipo L2 e LPS imunotipo L3; pelo menos uma proteína de aquisição de Fe de

Neisserial selecionada do grupo consistindo de TbpA,

TbpB,

LbpA, LbpB, HpuA, HpuB,

Lipo28 (GNA2132), Sibp, NMB0964,

NMB0293, FbpA,

Bcp, BfrA,

BfrB

P2086 (XthA);

pelo menos uma proteína associada membranade

Neisserial, preferivelmente proteína de membrana externa, particularmente proteína de membrana externa integral, selecionada do grupo consistindo de PilQ,

OMP85,

FhaC, NspA,

TbpA, LbpA, TspA, TspB, TdfH, PorB, MItA,

HpuB, HimD, HisD,

GNA1870, OstA, HlpA (GNA1946), NMB1124,

NMB1162, NMB1220,

NMB1313, NMB1953, HtrA, e

PLDA (OMPLA).

Estas combinações de antígenos de Neisserial uma melhora surpreendente da eficácia da vacina contra infecção de

Neisserial [229].

69/112

As composições particularmente preferidas incluem um ou mais dos seguintes cinco antígenos [230]: (1) uma proteína 'NadA', preferivelmente na forma oligomérica (por exemplo, na forma trimérica); (2) uma proteína '741'; (3) uma proteína '936'; (4) uma proteína '953'; e (5) uma proteína '287' .

'NadA' (adesina A de Neisserial) de MenB é divulgado como a proteína '961' na referência 215 (ID. de SEQs. 2943 e 2944) e como 'NMB1994' na referência 210 (veja também o GI de acesso de GenBank: 11352904 e 7227256) . Um estudo detalhado da proteína pode ser encontrado na referência 231 Quando usado de acordo com a presente invenção, NadA pode tomar várias formas. As formas preferidas de NadA são variantes de truncamento ou deleção da sequência tipo selvagem, tal como aquelas divulgadas nas referências 218 a 220. Em particular, NadA sem seu ancoramento de membrana Cterminal é preferido (por exemplo, deleção de resíduos 351405 para a cepa 2996).

A proteína '741' de MenB é divulgada na referência 215 (ID.

de SEQs. 2535 e 2536) e como 'NMB 1870' na referência

210 (veja também número de acesso de

GenBank: 7227128). A proteína correspondente no sorogrupo

A [2 09] tem o número de acesso de GenBank

7379322.

741 é naturalmente uma lipoproteína. Quando usada de acordo com a presente invenção, a proteína

741 pode tomar várias formas. As formas preferidas de

741 são variantes de truncamento ou deleção da sequência tipo selvagem, tal como aquelas divulgadas nas referências 218 a 220. Em particular, o Nterminal de 741 pode ser deletado até e incluindo sua sequência de poli-glicina (isto é, deleção de resíduos 1 a

70/112 para a cepa MC58), que pode às vezes ser distinguida aqui pelo uso de um prefixo 'AG' . Esta deleção pode melhorar a expressão. A deleção também remove sítio de lipidação de '741' . As várias sequências de 741 podem ser encontradas nas ID. de SEQs. 1 a 22 da referência 220, nas ID. de SEQs. 1 a 23 da referência 232, e em ID. de SEQs. 1299 da referência 233.

A proteína '936' do sorogrupo B é divulgada na referência 215 (ID. de SEQs. 2883 e 2884) e como 'NMB2091' na referência 210 (veja também o número de acesso de GenBank GL7227353). O gene correspondente no sorogrupo A [209] tem o número de acesso de GenBank 7379093. Quando usada de acordo com a presente invenção, a proteína 936 pode tomar várias formas. As formas preferidas de 936 são variantes de truncamento ou deleção da sequência tipo selvagem, tal como aquelas divulgadas nas referências 218 a 220. Em particular, o peptídeo líder N-terminal de 936 pode ser deletado (por exemplo, deleção dos resíduos 1 a 23 para cepa MC5 8, para dar 93 6^<NL)) .

A proteína '953' do sorogrupo B é divulgada na referência 215 (ID. de SEQs. 2917 e 2918) e como 'NMB1030' na referência 210 (veja também GI de número de acesso de GenBank: 7226269). A proteína correspondente no sorogrupo A [209] tem o número de acesso de GenBank 7380108. Quando usada de acordo com a presente invenção, a proteína 953 pode tomar várias formas. As formas preferidas de 953 são variantes de truncamento ou deleção da sequência tipo selvagem, tal como aquelas divulgadas nas referências 218 a 220. Em particular, o peptídeo líder N-terminal de 953 pode ser deletado (por exemplo, deleção de resíduos 1 a 19 para

71/112 cepa MC5 8).

A proteína '287' de sorogrupo B é divulgada na referência 215 (ID. de SEQs . 3103 e 3104), como 'NMB2132' na referência 210, e como 'GNA2132' na referência 212 (veja também GI de número de acesso de GenBank: 7227388) . A proteína correspondente no sorogrupo A [209] tem um número de acesso de GenBank 7379057. Quando usada de acordo com a presente invenção, a proteína 287 pode tomar várias formas. As formas preferidas de 287 são variantes de truncamento ou deleção da sequência tipo selvagem, tal como aquelas divulgadas nas referências 218 a 220. Em particular, o Nterminal de 287 pode ser deletado até e incluir sua sequência de poli-glicina (por exemplo, deleção de resíduos 1 a 24 para a cepa MC58, para dar AG287).

A proteína 287 é preferivelmente da cepa 2996 ou, mais preferivelmente, da cepa 394/98. A proteína 741 é preferivelmente das cepas de sorogrupo B MC58, 2996, 394/98, ou 95N477, ou da cepa de sorogrupo C90/18311. A cepa MC58 é mais preferida. As proteínas 936, 953 e NadA são preferivelmente da cepa 2996. Onde uma composição inclui um antígeno de proteína particular (por exemplo, 741 ou 287), a composição pode incluir esse antígeno em mais de uma forma variante, por exemplo, a mesma proteína, mas de mais de uma cepa. Estas proteínas podem ser incluídas como 25 proteínas tandem ou separadas.

Outros antígenos de polipeptídeo de MenB que podem ser incluídos nas composições da invenção incluem aqueles compreendendo uma das seguintes sequências de aminoácido: ID. de SEQ. N° . : 650 da ref. 213; ID. de SEQ. N° : 878 da 30 ref. 213; ID. de SEQ. N° . : 884 da ref. 213; ID. de SEQ. N°.:

72/112 da ref. 214; ID. de SEQ. N° . : 598 da ref. 215; ID. de SEQ

N° . : 818 da ref. 215; ID. de SEQ. N° . : 864 da ref. 215; ID.

de SEQ. N°.:	866	da ref. 215; ID. de SEQ.	N° . :	1196 da ref.
215;	ID. de	SEQ.	N° . :	1272	da ref.	215;	ID.	de	SEQ.	N° . :
1274	da ref.	215;	ID.	de SEQ	. N°.: 1640 da ref	. 215; ID. de
SEQ.	N° . : 1788 da ref	. 215;	ID. de	SEQ.	N° . :	228	8 da	ref .
215;	ID. de	SEQ.	N° . :	2466	da ref.	215 ;	ID.	de	SEQ.	N° . :
2554	de referência 215; ID.	de SEQ.	N° . :	2576	da	ref.	215;
ID.	de SEQ. N°.:	2606	da ref	. 215; ID. de	SEQ.	N° .	. : 2608 da
ref .	215; ID	. de	SEQ.	N° . :	2616 da	ref .	215 ;	ID	. de	SEQ.
N° . :	2668 da	ref .	215 ;	ID. de SEQ. N	°.2 7 8 0 da	ref.	. 215;	ID.
de SEQ. N°.:	2932	da ref. 215; ID. de SEQ	. N° .	: 2958 da ref
215 ;	ID. de	SEQ.	N° . :	2970	da ref.	215;	ID.	de	SEQ.	N° . :

2988 da ref. 215, ou um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido que: (a) tem 50% ou mais identidade (por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) às referidas sequências; e/ou (b) compreende um fragmento de pelo menos n aminoácidos consecutivos das referidas sequências, em que n é 7 ou mais (por exemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou mais) . Os fragmentos preferidos para (b) compreendem um epitopo da sequência relevante. Mais do que um (por exemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou mais) destes polipeptideos pode ser incluídos.

Em algumas modalidades, entretanto, a composição da invenção inclui a mesma proteína, mas de mais de uma cepa. Esta abordagem foi descoberta por ser eficaz com a proteína 741. Esta proteína é um antígeno extremamente eficaz para provocar respostas de anticorpo antimeningocócico, e é expressa através de todos os sorogrupos meningocócicos. A

112 análise filogenética mostra que a proteína se divide em dois grupos, e que uma destas se divide outra vez para dar três variantes no total [234], e enquanto o soro aumentado contra um dado variante é bactericida dentro de mesmo grupo variante, não está ativo contra cepas que expressam uma das outras duas variantes, isto é, há proteção cruzada intravariante, mas não proteção cruzada de inter-variante [232,234] . Para eficácia máxima de cepa cruzada, portanto,, prefere-se que uma composição deva incluir mais de uma variante de proteína 741.

As composições da invenção incluem um número pequeno (por exemplo, menos do que t antígenos, onde t é 10, 9, 8,

7, 6, 5, 4 ou 3) de proteínas de sorogrupo B purificadas.

As proteínas são preferivelmente expressas recombinantemente em um hospedeiro heterólogo e então purificadas. Para uma composição incluindo t antígenos de MenB, pode haver polipeptídeos de t separados mas, para reduzir a complexidade ainda mais, prefere-se que pelo menos dois dos antígenos sejam expressos como uma única cadeia de polipeptídeo (uma proteína 'híbrida' [refs. 218 a 220] ) isto é tal que os antígenos t formam menos polipeptídeos t. As proteínas híbridas oferecem duas vantagens principais: primeiro, uma proteína que pode ser instável ou fracamente expressa por si própria pode ser ajudada adicionando um parceiro híbrido apropriado que supera o problema; segundo, a fabricação comercial é simplificada como somente uma expressão e purificação necessária para ser empregada a fim de produzir duas proteínas separadamente úteis. Um híbrido incluído em uma composição da invenção pode compreender dois ou mais (isto

74/112 é, 2, 3, 4 ou 5) das cinco proteínas listadas acima. Os híbridos consistindo de duas das cinco proteínas são preferidos.

Outra composição preferida inclui o lipooligossacarídeo de sorogrupo B (LOS) [235]. O LOS pode ser usado além do(s) polipeptídeo(s) de sorogrupo B ou pode ser usado no lugar dele(s).

As vesículas de membrana podem também ser usadas nas composições. Estas vesículas podem ser de qualquer vesícula proteolipossômica obtidas rompendo uma membrana externa meningocócica para formar vesículas da membrana externa que incluem componentes de proteína da membrana externa. 'OMVs' são preparados artificialmente de bactérias (por exemplo, por tratamento de detergente) e são assim distintos das microvesículas (MVs [236]) e de OMVs nativos' ('NOMVs' [237]), ambos os quais são vesículas de membrana de ocorrência natural que se formam espontaneamente durante o crescimento bacteriano e são liberadas no meio de cultura. Os MVs podem ser obtidos cultivando Neisseria em meio de cultura de caldo, separando células inteiras das bolhas menores no meio de cultura de caldo, e então coletando os MVs do meio esgotado de célula. As cepas para uso na produção de MVs podem geralmente ser selecionadas com base na quantidade de MVs produzida em cultura, por exemplo, refs. 238 e 239 descrevem Neisseria com produção de MV elevada. As vesículas podem também ser obtidas das cepas de nocaute de mltA [240].

Para reduzir a atividade pirogênica, prefere-se que a bactéria deva ter baixos níveis de endotoxina (LPS). As bactérias mutantes apropriadas são conhecidas, por exemplo,

75/112

Neisseria mutante [241] e Helicobacter mutante [242] . Os processos para preparar as membranas externas esgotadas de LPS das bactérias gram-negativas são divulgados na referência 243.

A bactéria pode ser uma bactéria tipo selvagem, ou pode ser uma bactéria recombinante. As bactérias recombinantes preferidas super-expressam (relativa à cepa tipo selvagem correspondente) imunógenos, tais como NspA, proteína 287 [244] , proteína 741 [244] , TbpA, TbpB, dismutase superóxido [245], etc. A bactéria pode expressar mais de uma proteína de membrana externa PorA classe I, por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou 6 de subtipos PorA: Pl.7,16; Pl.5,2; Pl.19,15; P1.5c,10; PI.12,13; e P1.7h,4 [por exemplo, refs. 246 e 247] .

Outras bactérias recombinantes que podem ser usadas com a invenção têm uma ou mais mutações para diminuir (ou, preferivelmente, nocautear) a expressão de produtos de gene particulares (por exemplo, veja as refs 248 e 249) . Os genes preferidos para para sub-regulação e/ou nocaute incluem: (a) Cps, CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE,

HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Ope, PilC, PorA, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, e/ou TbpB [248] ; (b) CtrA,

CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK,

Opa, Ope, PhoP, PilC, PmrE, PmrF, PorA, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, e/ou TbpB [249] ; (c) transglicosilase lítica

NMBOO33 [250]; (d) ExbB, ExbD, rmpM, CtrA, CtrB, CtrD, GalE,

LbpA, LpbB, Opa, Ope, PilC, PorA, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, e/ou TbpB [251]; e (e) CtrA, CtrB, CtrD, FrpB, OpA, OpC, PilC, PorA, PorB, SiaD, SynA, SynB, e/ou SynC

76/112

As cepas preferidas dentro do sorogrupo B como a fonte para estes sacarídeos são MC58, 2996, H44/76,

394/98 e cepa 98/254 da Nova Zelândia. Os melhores sorotipos e cepas para usar, entretanto, dependerão das cepas predominantes em uma

Por exemplo, o meningococo pode ser de qualquer sorotipo (por exemplo, 1, 2a, 2b,

4,

14,

15, 16, sorosubtipo (P1.2; Pl. 4;

PI.5,2;

Pl.7,16; Pl.7,16b;

P1.9; Pl.9,15; Pl.12,13;

PI. 13 ; Pl.14

P1.15; Pl.21,16;

Pl.22,14; etc.) e de qualquer imunotipo (por exemplo,

Ll;

L3,3,7 ; LIO; etc.), e as cepas preferidas incluem:

(a) apropriada, (b) B:4:P1.15;

O meningococo pode

B:15:Pl.7,16; e (d) ser de qualquer linhagem incluindo linhagens hiperinvasivas hipervirulentas, por exemplo, quaisquer das seguintes sete linhagens hipervirulentes:

subgrupo

I; subgrupo

III;

subgrupo IV-I; ET-5 complexo;

ET-37 complexo; A4 conjunto;

linhagem 3. Estas linhagens foram definidas pela eletroforese de enzima multilocus (MLEE), mas a tipagem de sequência multilocus (MLST) foi usada também para classificar o meningococci [ref. 253], por exemplo, o ET-37 complexo é o ST-11 complexo por MLST, o ET-5 complexo é ST32 (ET-5), a linhagem 3 é ST-41/44, etc.

Os antígenos não sacarídeos podem ser usados para induzir uma resposta de anticorpo bactericida de soro que é eficaz contra duas ou três das linhagens de MenB hipervirulentas A4, ET-5 e linhagem 3. Podem adicionalmente induzir respostas de anticorpo bactericidas contra um ou mais das linhagens hipervirulentas subgrupo I, subgrupo III, subgrupo IV-I ou ET-37 complexo, e contra outras linhagens,

77/112 por exemplo, linhagens hiperinvasivas. Estas respostas de convenientemente medidas em camundongos e são um indicador padrão da eficácia de vacina [por exemplo, veja a nato final da referência

212] . A atividade bactericida de soro por complemento, e humano ou de coelho (SBA) mede a morte bacteriana mediada pode bebê.

para induzir pelo menos ser analisada

Os padrões um aumento usando complemento

WHO exigem uma vacina de 4 vezes em SBA em mais de 90% de receptores.

bactericidas contra cada linhagens hipervirulentas;

precisa induzir anticorpos cepa de ao invés,

MenB para dado de quatro de mais cepas de meningococo dentro de anticorpos contra pelo dentro destas qualquer grupo de sorogrupo B uma linhagem hipervirulenta particular, os induzidos pela menos 50% (por mais) do grupo. Os grupos exemplo, 60%, 70%, 80%, 90% ou cepas isoladas em pelo menos quatro dos seguintes países:

GB, AU, CA, NO, IT, US, NZ, NL, BR, e preferivelmente um título bactericida de (por exemplo. 2¹⁰, 2¹¹, 2¹², 2¹³, 2 maior, preferivelmente pelo menos capaz de matar pelo menos 50% das

CU.

pelo

O soro tem menos 1024 «15 / /

2¹⁶ é, bactérias cepa particular quando diluído 1/1024, referência 212.

preferidas podem como bactericidas contra as seguintes cepas sorogrupo B:

(B:2b:P1.21,16) complexo, cepa e/ou

MC5 8

2¹⁷, teste

2¹⁸ ou soro é de uma descrito na induzir respostas de meningococo de de conjunto A4, cepa G2136 (B:-);

cepa 961-5945 (ii) de ET-5 (B : 15 : PI. 7,16b) e/ou cepa 44/76

78/112 (Β:15:PI.7,16); (iii) de linhagem 3, cepa 394/98 (B:4:P1.4) e/ou cepa BZ198 (B:NT:-). Mais composições preferidas podem induzir respostas bactericidas contra as cepas 961-5945, 44/76 e 394/98. As cepas 961-5945 e G2136 são ambas as cepas de referência de Neisseria. MLST [ids. 638; 1002 na ref. 254] . A cepa MC58 está amplamente disponível (por exemplo, ATCC BAA-335) e foi a cepa sequenciada na referência 210. A cepa 44/76 foi amplamente utilizada e caracterizada (por exemplo, ref. 255) e é uma das cepas de referência de Neisseria MLST [id. 237 na ref. 254; fileira 32 da tabela 2 na ref. 256] . A cepa 394/98 foi originalmente isolada na Nova Zelândia em 1998, e houve diversos estudos publicados usando esta cepa (por exemplo, refs. 257 e 258) . A cepa BZ198 é outra cepa de referência de MLST [id. 409 na ref. 254; fileira 41 da tabela 2 na ref 2 5 6] . A composição pode adicionalmente induzir uma resposta bactericida contra a cepa LNP17592 de sorogrupo W135 (W135:2a:PI.5,2), de ET-37 complexo.

Geral

O termo compreendendo engloba incluindo assim como consistindo, por exemplo uma composição compreendendo X pode consistir exclusivamente em X ou pode incluir algo adicional, por exemplo, X + Y.

A palavra substancialmente não exclui completamente, por exemplo, uma composição que está substancialmente livre de Y pode estar completamente livre de Y. Onde necessário, a palavra substancialmente pode ser omitida da definição da invenção.

O termo aproximadamente com relação a um valor numérico x significa, por exemplo, x+10%.

79/112

O termo alquila é usado aqui para se referir aos grupos alquila em formas reta e ramificada. Entretanto, o termo alquila refere-se geralmente aos grupos alquila em formas retas. O grupo alquila pode ser interrompido com 1, 2 ou 3 heteroátomos selecionados -O, -NH- ou -S. O grupo alquila pode também ser interrompido com 1, 2 ou 3 ligações duplas e/ou triplas. Entretanto, o termo alquila referese geralmente ao grupo alquila não tendo nenhuma interrupção de heteroátomo ou interrupções de ligação dupla ou tripla. Onde referência é feita a alquila Ci_₆, significa que o grupo alquila pode conter qualquer número de átomos de carbono entre 1 e 6 (por exemplo Ci, C₂, C₃, C₄, C₅, C₆) .

O termo alquileno é usado aqui para se referir a um grupo alquila divalente, como definido acima. Onde referência é feita ao alquileno Ci_₅, significa que o grupo alquileno pode conter qualquer número de átomos de carbono entre 1 e 5 (por ^xemplo, Ci, C₂, C₃, C₄, C₅) . Similarmente, onde referência és feita ao alquileno Ο₃.₄, significa que o grupo alquileno pode conter qualquer número de átomos de

carbono	entre	1 e 4	(por exemplo, Clz C2, C3,	C4) .
O termo	grupo	amino inclui grupos de	fórmula -NH2 ou
-NH-E,	onde	E é	um grupo protetor de	nitrogênio. Os
exemplos	de	grupos	protetores de nitrogênio típicos são

descritos acima.

O termo amina significa um grupo de fórmula -NH₂, a menos que o contexto indicar de outra maneira.

O termo sacarídeo capsular modificado significa um sacarídeo que é obtenível de um sacarídeo capsular nativo pela modificação apropriada. Consequentemente, a sequência básica de unidades de repetição de monossacarídeo no

80/112 sacarídeo capsular nativo é retida nos sacarídeos capsulares modificados da presente invenção.

O termo sacarídeo engloba oligossacarídeos (por exemplo, contendo 2 a 39 unidades de monossacarídeo) e polissacarídeos (por exemplo, contendo 40 ou mais unidades de monossacarídeo). Como encontrado naturalmente nas bactérias, os sacarídeos capsulares nativos tomam geralmente a forma de polissacarídeos. Os polissacarídeos podem ser manipulados para dar oligossacarídeos mais curtos 10 Os oligossacarídeos podem ser obtidos por purificação e/ou despolimerização seguido por dimensionamento do polissacarídeo nativo (por exemplo, por hidrólise em ácido suave, por aquecimento, por cromatografia de dimensionamento etc.).

Onde os materiais animais (e particular bovinos) são usados na cultura de células, devem ser obtidos das fontes que estão livres de encafalopatias espongiformes transmissíveis (TSEs), e em particular livres de encefalopatia espongiforme bovina (EBS). No geral, prefere20 se para células de cultura na ausência total de materiais derivados de animal.

Será apreciado que os grupos ionizáveis podem existir na forma neutra mostrada nas fórmulas aqui, ou podem existir na forma carregada, por exemplo, dependendo do pH. 25 Assim um grupo fosfato pode ser mostrado como -P-O-(OH)₂, esta fórmula é meramente representativa do grupo fosfato neutro, e outros formas carregadas são englobadas pela invenção. Similarmente, as referências aqui aos grupos catiônicos e aniônicos devem ser tiradas para referir à 30 carga que está presente nesse grupo sob condições

81/112 fisiológicas, por exemplo, onde uma amina -NH₂ é protonada para dar o grupo catiônico NH^{3 +} , esta protonação é uma que ocorre em pH fisiológico. Além disso, onde uma carboxila COOH é deprotonada para dar ogrupo aniônico -COO', esta protonação pode ocorrer em pH fisiológico. Além disso, a invenção engloba sais das formas carregadas de moléculas da invenção. Os anéis de açúcar podem existir na forma aberta e fechada e, enquanto as formas fechadas são mostradas em fórmulas estruturais aqui, as formas abertas são também englobadas pela invenção. Similarmente, a invenção engloba formas isoméricas das moléculas da invenção, incluindo tautômeros (por exemplo, tautômeros de imina/enamina), conformadores, enantiômeros, diastereoisômeros, etc.

Após o sorogrupo, a classificação meningocócica inclui sorotipo, sorosubtipo e então imunotipo, e a nomenclatura de padrão lista sorogrupo, sorotipo, sorosubtipo, e imunotipo, cada um separado por dois pontos, por exemplo B : 4 : PI.15:L3,7,9. Dentro do sorogrupo B, algumas linhagens causam doença frequentemente (hiperinvasiva), algumas linhagens causam formas mais severas de doença do que outras (hipervirulentas), e outras raramente causam doença. Sete linhagens hipervirulentas são reconhecidas, especificamente subgrupos I, III e IV-I, ET-5 complexo, ET37 complexo, conjunto A4 e linhagem 3. Estes foram definidos por eletroforese de enzima multilocus (MLEE), mas tipagem de sequência multilocus (MLST) foi usada também para classificar o meningococci [ref. 256].

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 fornece um esquema para a síntese química de conjugados de MenA CRMi₉₇ . As estruturas predominantes de

82/112

MenA10/90 (oligossacarídeo MenA compreendendo um grupo bloqueador de 4,5-dihidróxipentilcarbamato em aproximadamente 10% das unidades de monossacarídeo e um grupo bloqueador 2-hidróxietilcarbamato em aproximadamente 5 90% das unidades de monossacarídeo) e MenA 10/0 (oligossacarídeo MenA compreendendo um grupo bloqueador

4,5-dihidróxipentilcarbamato em aproximadamente 10% das unidades de monossacarídeo) são representados.

A Figura 2 fornece o perfil analítico de troca de ânion em oligossacarídeos de MenA 214 mmantes (painel A) e após dimensionamento (painel B).

A Figura 3 fornece o espectro de 600 MHz ¹H em 25°C de oligossacarídeo MenA sem a modificação química (painel A) , oligossacarídeo MenA 10/90 (painel B) e oligossacarídeo 15 MenA10/0 (painel C) .

A Figura 4 compara a porcentagem de fosfomonoéster desenvolvida durante o armazenamento em 37°C pelo oligossacarídeo MenA sem modificação química, oligossacarídeo MenA 10/90 e oligossacarídeo MenA10/0.

0 A Figura 5 fornece o espectro ³¹P NMR de oligossacarídeo MenA.

Figura 6 compara o grau de polimerização (DP), medido por ³¹P NMR, durante o armazenamento em 37 °C de oligossacarídeo MenA sem modificação química, 25 oligossacarídeo MenA10/90 e oligossacarídeo MenAlO/0.

A Figura 7 fornece o perfil de SDS-PAge de conjugados de oligossacarídeo de CRM-MenA: Marcadores Linha M - Mw; Linha 1 - CRM; Linha 2 - CRM-MenA 10/90; e linha 3 - CRMMenA 10/0.

A Figura 8 compara o sacarídeo livre (FS) liberado

83/112 durante o armazenamento em 37°C dos conjugado de oligossacarídeo CRM-MenA10/90 e conjugados de oligossacarídeo de CRM-MenA10/0.

A Figura 9 compara a porcentagem de fosfomonoéster desenvolvida durante o armazenamento em 37°C pelos conjugados de oligossacarídeo CRM- MenA 10/90 e conjugados de oligossacarídeo CRM-MenA 10/90.

MODOS PARA REALIZAR A INVENÇÃO

EXEMPLO 1

Modificação de oligossacarídeo de Men A

Hidrólise controlada de polissacarídeo MenA

Os oligossacarídeos de MenA foram gerados por hidrólise química de uma solução de polissacarídeo MenA. Momentaneamente, o polissacarídeo MenA foi solubilizado em uma concentração final de 10 mg/ml em 5 0 mM de tampão de acetato, pH 4,75. A solução foi aquecida em 73°C até que um grau de polimerização (DP) de aproximadamente 10 fosse alcançado. A hidrólise foi controlada monitorando a variação da atividade ótica da solução (a Hg 365 nm) sobre o tempo de acordo com a seguinte equação: DP=1/(0,5817[1(a_t/a_m)J }, onde o a_m é o valor médio do poder rotatório ótico de 6 amostras quando a solução de temperatura é 50°C, e a_t é o poder rotatório ótico no tempo t. A hidrólise foi parada quando o valor de α correspondendo a um DP de 10 foi alcançado. No fim da reação de hidrólise a solução foi resfriada na temperatura ambiente e o pH corrigido para aproximadamente 6,5.

Fracionamento de tamanho de oligossacarídeo MenA

A hidrólise ácida controlada de polissacarídeo MenA gera uma polidispersão com o DP médio alvo. Para a

84/112 preparação conjugada, a polidispersão de oligossacarídeo pode ser mais restringida usando um fracionamento de tamanho de duas etapas. Estas etapas de dimensionamento mudam tipicamente o DP dos oligossacarídeos de MenA de um valor de aproximadamente 10 a um valor entre 15 e 20, como medido pela razão molar entre valores de fósforo total (Pt) e fosfato de monoéster terminal (Pm). A concentração de Pt foi determinada de acordo com o método descrito na referência 259 e Pm foi determinado medindo o fosfato inorgânico liberado pela reação enzimática com fosfatase ácida de batata [260].

Momentaneamente, o hidrolisado de MenA ultrafiltrado primeiramente através de uma membrana de fluxo tangencial de 3 0 KDa para remover espécies de alto peso molecular. Durante este procedimento o produto foi concentrado aproximadamente 10 vezes e então diafiltrado contra 13 volumes de tampão de acetato 5 mM, pH 6,5. O permeado, contendo os oligossacarídeos desejados, foi coletado enquanto o retido foi rejeitado.

Na segunda etapa, o permeado foi fracionado por cromatografia de coluna de troca aniônica. Esta etapa é projetada para remover espécies de Mw baixa caracterizada por um DP de menos de 6, que podem ser fracamente imunogênicas [261]. A mistura de oligossacarídeo obtida da ultraf iltração de 3 0 KDa foi carregada em uma coluna embalada com Q-Sefarose Fast Flow equilibrada previamente com 5 mM de acetato de sódio, pH 6,5. A razão oligossacarídeo/volume embalado foi 17 mg/ml de resina embalada. A coluna foi lavada então com 5 volumes de coluna (cv) do tampão de equilíbrio. Uma lavagem de 10 cv de 5 mM

85/112 de tampão de acetato de sódio/125 mM de NaCl, pH 6,5 foi então aplicado ã coluna para eluir oligossacarídeos de DP 56. A fração de oligossacarídeo desejada foi então recuperada por eluição com 5 mM de tampão de acetato de sódio/125 mM de NaCl, pH 6,5. A remoção com 5 cv de NaCl 2M e sanitização com 1M de NaOH terminaram o procedimento.

A cromatografia de troca de ânion analítica foi usada para medir a polidispersão de oligossacarídeo antes e depois do fracionamento. Momentaneamente, as polidispersões de oligossacarídeo MenA foram analisadas por HPLC queusando uma coluna Mono-Q HR 5/5. Após equilíbrio com água, 1 ml de amostra contendo aproximadamente 1 mg de sacarídeo foi carregado na coluna, que foi então desenvolvida com uma forma linear de 0 a 60% de NaCl 1 M na taxa de fluxo de 0,5 ml. O cromatograma foi monitorado em 214 nm. Uma preparação padrão de um oligossacarídeo MenA monodispersado tendo um DP definido de 5 e 6 respectivamente como evidenciado pela espectrometria de massa e ^TH NMR, foi usado para identificar a presença ou remoção de oligossacarídeos tendo um DP menor de 6 nas amostras de polidispersão testadas. A Figura 2 mostra os perfis analíticos do hidrolisado (painel A) em comparação ao oligossacarídeo MenA dimensionado (painel B).

Troca de contra-íon

O eluatp de Q-Sefarose do procedimento de fracionamento de tamanho de duas etapas foi ultrafiltrado em uma membrana de 3 KDa a fim de trocar o contra-íon de sódio com tetrabutilamônio, que conferência solubilidade ao oligossacarídeo em solventes não aquosos. Momentaneamente, a solução de oligossacarídeo MenA diafiltrada contra 4

86/112 volumes de 10 mM de tetrabutilamôniobrometo seguido por 10 volumes de água. O retido, contendo o produto desejado, foi coletado e o permeado descartado. A água foi removida do retido por evaporação rotatória.

Modificação química de oligossacarídeo MenA

O oligossacarídeo MenA foi modificado usando ativação de 1,1'-carbonildiimidazol (CDI) seguida pela reação com 1amino-4,5-pentandiol (APD) sozinho ou APD e 2-aminoetanol (ETA) , a fim de obter duas estruturas alvo diferentes (Figura 1):

i) Oligossacarídeo	MenA compreendendo um	grupo
bloqueador	de	4,	5-dihidróxipentilcarbamato	em
aproximadamente	10%	das	unidades de monossacarídeo	e um
grupo bloqueador	de 2-hidróxietilcarbamato	em
aproximadamente	90%	das	unidades de monossacarídeo	(MenA
10/90) ; e
ii) Oligossacarídeo	MenA compreendendo um	grupo
bloqueador	de	4,	5-dihidróxipentilcarbamato	em
aproximadamente	10%	das	unidades de monossacarídeo	(MenA

10/0).

Momentaneamente, o oligossacarídeo MenA derivado da ultrafiltração de membrana de 3 KDa descrito acima foi solubilizado em DMSO a uma concentração final de aproximadamente 10 mg/ml. A esta solução um excesso molar de 20 vezes de CDI (relativo ao número de mols de unidades de monossacarídeo MenA) foi adicionado e a solução foi agitada em temperatura ambiente por 2 horas. A solução de oligossacarídeo ativada foi então adicionada a 9 volumes de acetato de etila frio (~20°C) seguido por uma solução de 2 M de CaCl₂ a uma concentração final equimolar com as

87/112 unidades de monossacarídeo MenA. A mistura foi agitada por 30 minutos e, após sedimentação do oligossacarídeo, a maioria do sobrenadante foi removida por sucção e o pélete recuperado por centrifugação, lavado 3 vezes com acetato de etila e seco sob vácuo.

Para adição de grupos bloqueadores, o oligossacarídeo ativado foi solubilizado em DMSO a uma concentração final de 10 mg/ml. Para obter o oligossacarídeo MenA10/0, um excesso molar de 0,1 vez (relativo ao número de mols de unidades de monossacarídeo MenA) de APD foi adicionado, e a reação foi agitada por 2 horas em temperatura ambiente. Após este tempo, dezenove volumes de tampão de fosfato de sódio 0,25 M, pH 6.5 foram adicionados sob agitação. Qualquer opalescência formada durante esta operação foi removida por filtragem através de uma membrana de 0,2 pm. Para obter o oligossacarídeo MenA 10/90, um excesso molar de 0,6 vez de trietilamina e um excesso de molar de 0,1 vez de APD foi adicionado e a reação foi agitada por 2 horas em temperatura ambiente. Subsequentemente, um excesso molar de 5 0 vezes (relativo ao número de mols de unidades de monossacarídeo MenA) de ETA foi adicionado e a reação continuou sob agitação por 2 horas adicionais. Mais uma vez, após este tempo dezenove volumes de tampão de fosfato de sódio de 0,25 M, pH 6,5 foram adicionados sob agitação e qualquer opalescência foi removida por filtragem através de uma membrana de 0,2 pm.

As soluções cruas de oligossacarídeo derivatizado foram purificadas do excesso de reagentes de baixo peso molecular por ultrafiltração em uma membrana de 3 KDa. As soluções foram primeiramente concentradas aproximadamente a

88/112 vezes e então diafiltradas contra 10 volumes de tampão de fosfato de sódio de 0,1 M, pH 7,2, seguido por 10 volumes de água destilada. Os produtos purificados foram recuperados dos retidos, com os permeados sendo descartados

Confirmação de modificações químicas por ¹H NMR

Os oligossacarídeos de MenA quimicamente modificados foram caracterizados por NMR para confirmar que as modificações químicas desejadas tinham ocorrido.

O espectro de ¹H

NMR do oligossacarídeo MenA nativo é mostrado na figura

3, painel A. O espectro está em conformidade com a literatura publicada [262, 263] ^XH NMR conduzido em APD e ETA puros deu os seguintes sinais:

sinais de APD: HOCH₂ ^ACH^B (OH) CH2^cCH2^DCH2^ENH2 ( H^a em 3,6 ppm, H^B em 3,7 ppm, H^c em 1,5 ppm, H^D em 1,6 ppm,

H^e em 2,7 ppm) ;

sinais

ETA: HOCH₂ ^FCH2^GNH2 (H^f em 4,4 ppm,

H^g em 3,6 ppm) .

Estas um guia para identificar os sinais APD e ETA nos espectros dos oligossacarídeos derivatizados. Os espectros de ¹H NMR do oligossacarídeo

MenA 10/90 são relatados na figura 3, painel B. O espectro de 1H NMR do oligossacarídeo MenA 10/0 é relatado na figura 3, painel C. A ligação covalente entre ETA ou os grupos APD e os grupos carbonila introduzidos na posição 4 e/ou 3 de N-acetil-mannosamina foi confirmada pela correlação heteronuclear (¹H, ¹³C) detectada nos espectros de HSQC. Os picos de correlação de faixa longa entre os grupos carbonila e o H^G de ETA ou H^E de APD foram detectados. Similarmente, os grupos carbonila deram correlação de faixa longa com prótons geminais em posição 3/4 de N-acetil-mannosamina. As porcentagens de grupos APD introduzidos pelo tratamento químico foram estimadas por

89/112 integração de sinais selecionados vindo de APD e MenA. Os sinais de H^D+H^C sobrepostos em 1,5 ppm (grupos APD) foram integrados versus o pico H2 em 4,6 ppm (oligossacarídeo MenA) . Em experimentos diferentes de 6% a 14% das unidades de monossacarídeo MenA foram substituídas com grupos APD. Depois da mesma abordagem, os grupos ETA foram estimados pela razão com sinais H^F sobrepostos em 3,6 ppm (grupos ETA) versus o pico H2 em 4,6 ppm (oligossacarídeo MenA). Devido a sobreposição parcial com os sinais APD (H^A em 3,6 ppm e H^b em 3,7 ppm) a integral de H^F foi subtraída por 3/4 do valor de H^D+H^C. Em experimentos diferentes de 66% a 85% das unidades de monossacarídeo MenA foram substituídas com grupos ETA. Como esperado, na figura 3, os sinais do painel C relativos aos grupos ETA não estão presentes, que confirma a estrutura proposta e a conformidade de NMR como uma ferramenta para a elucidação de estrutura e avaliação de identidade. Figura 3, painel A indica que a O-acetilação é preservada após a hidrólise ácida de polissacarídeo meningocócico de sorogrupo A e, embora os grupos de carbamato mudem o campo magnético local e façam a atribuição mais complicada, o status de O-acetilação parece ser mantido após a modificação química (figura 3, painéis B e C) .

Estabilidade de oligossacarídeo MenA

A degradação de oligossacarídeos Mena, uma consequência de hidrólise em ligações fosfodiéster, resulta em grupos de fosfomonoéster recentemente formados. A estabilidade de oligossacarídeos MenA 10/90 e MenA 10/0 foi comparada com a estabilidade de um oligossacarídeo nativo.

Momentaneamente, as soluções dos oligossacarídeos MenA,

90/112 em uma faixa de concentração de 1,4 a 3 mg/ml, foram incubadas em 37°C em tampão de histidina de 10 mM, pH 7,2.

Em pontos diferentes de tempo durante 42 dias, os oligossacarídeos foram analisados para a quantidade de fosfomonoéster gerada durante o armazenamento.

A Figura 4 mostra o incremento de grupos fosfomonoéster durante o armazenamento em 37°C para os três oligossacarídeos mencionados acima. A porcentagem de fosfomonoéster foi calculada como [Pm(t)-Pm(0) ] x 100/[(Pt(0)-Pm(0)], onde Pm(t) e Pt(t) são as concentrações de grupos fosfomonoéster e fósforo total no tempo t; e Pm (0) e Pt(0) são as de grupos fosfomonoéster e de fósforo total no tempo 0.

concentração total de fósforo (Pt) foi determinada de acordo com o método descrito na referência 259 e fosfato de monoéster terminal (Pm) foi determinado medindo o fosfato inorgânico liberado pela reação enzimática com a fosfatase ácida de batata [260] .

Os oligossacarídeos MenA 10/90 e MenA 10/0 mostraram estabilidade melhorada comparada ao oligossacarídeo nativo, como evidenciado pela tendência reduzida de liberar grupos fosfomonoéster sobre o tempo. Estes resultados mostram que a estabilidade do oligossacarídeo MenA pode ser melhorada bloqueando os grupos hidroxila em posição 4 e 3 de Nacetilmannosamina com um grupo bloqueador de acordo com a presente invenção.

Similarmente, a análise ³¹P NMR [264] foi usada para avaliar a estabilidade dos oligossacarídeos MenA modificados em comparação com o oligossacarídeo nativo em 37°C por 42 dias em pH 7,2 de tampão de histidina 10 mM.

91/112

Momentaneamente, o grau médio de despolimerização (avDP) foi determinado pela razão molar entre o fosfodiéster nos grupos em cadeia (P_{in cadeia}) e nos grupos de extremidade não redutores de f osf omonoéster (Pextremidade não red) (figura 5) .

avDP = [Pem Cadeia + 1] / Pextremidade não red

Mais uma vez, os oligossacarídeos MenA 10/90 e MenA 10/0 mostraram a estabilidade melhorada comparada ao oligossacarídeo nativo, como evidenciado pelo grau de polimerização maior em qualquer ponto de tempo (figura 6).

Tabela I

Amostra	avDP
Od	7d	14d	21d	28d	35d	42d
Oligo MenA Nativo	19.2	17.5	17.1	14.7	13.8	12.8	11.5
Oligo MenA 10/0	24.9	23.8	22.6	20.5	19.1	18.2	16.8
Oligo MenA 10/90	24.3	24.3	24.1	23.5	23.5	23.6	23.1

Tabela I

Conjugados de CRM₁₉₇-MenA

Geração de grupos aldeídos reativos por oxidação de periodato controlada

Os grupos hidroxila vicinais dos grupos bloqueadores 4,5-dihidróxipentilcarbamato derivados de APD nos oligossacarídeos MenA10/90 e MenA10/0 foram oxidados por tratamento de periodato de sódio limitado para gerar grupos aldeídicos reativos. Momentaneamente, as soluções de oligossacarídeos MenA10/90 e MenAlO/0 em tampão de fosfato de sódio de 0,1 M, pH 7,2, foram reagidos com 0,1 mol de NaIO₄ por mol de unidades de monossacarídeo MenA. As reações foram realizadas no escuro com agitação, e monitoradas espectrofotometricamente em 225 nm. Após

92/112 aproximadamente 2 horas a absorvência de 225 nm alcançou um platô. A quantidade de grupos aldeidicos gerados pela reação foi determinada analisando a quantidade equimolar de formaldeído liberada durante a oxidação [2 6 5] . As reações foram paradas pela adição de etileno glicol a uma concentração final equimolar com o NaI0₄.

A geração de grupos aldeidicos foi quase quantitativa em comparação ao número inicial de grupos bloqueadores 4,5dihidróxipentilcarbamato.

Purificação de oligossacarídeos oxidados

Os oligossacarídeos oxidados foram purificados por ultrafiltração em uma membrana de 3 KDa. As soluções foram concentrada 2 vezes e então diafiltrada contra 10 volumes de NaCl de 0,5 M seguido por 10 volumes de água destilada. O retido, contendo o produto desejado, foi coletado e o permeado descartado. A água foi removida do retido por evaporação rotatória.

Conjugação à CRMi₉₇

Os oligossacarídeos de MenA oxidados foram conjugados à CRM₁₉₇, um mutante não tóxico da toxina de difteria [266] , através de aminação redutiva para obter CRM-MenA 10/90 e CRM-MenA10/0 respectivamente (figura 1).

Momentaneamente, os oligossacarídeos de MenA oxidados foram solubilizados em 50 mg/ml de solução de CRMi₉₇ em uma razão de 13 mols de grupos aldeidicos por mol de proteína. O tampão de fosfato de sódio de 100 mM, pH 7,2, foi adicionado para obter uma concentração de proteína final de 30 mg/ml. Uma solução de 2M de NaBH₃CN em tampão de fosfato de sódio de 10 mM, pH 7,2, foi então adicionado para obter um excesso de molar de 7 0 vezes de NaBH₃CN com relação aos

93/112 grupos aldeídicos. As reações foram realizadas por 3 dias em 37°C. Quatorze volumes de tampão de fosfato de sódio lOmM, pH 7,2, foram então adicionados, seguido por um excesso molar de 25 vezes de NaBH₄ (relativo ao número de mols de grupos aldeídicos). O pH foi controlado em 8,5 e as misturas foram agitadas por 2 horas em temperatura ambiente a fim de resfriar quaisquer grupos aldeídicos residuais. No fim da etapa de resfriamento, o pH foi corrigido outra vez a 7,2, e as soluções filtradas através de uma membrana de poro de 0,2 pm.

Purificação de conjugado

Os conjugados foram purificados do excesso de reagentes e oligossacarídeos residuais, não reagidos pelo ultraf iltração em uma membrana de 30 KDa. As misturas de reação foram diafiltradas contra 100 volumes de tampão de fosfato de sódio de 0,01 M, pH 7,2, seguido por 50 volumes de 10 mM de histidina, pH 7,2. As soluções contendo os conjugados purificados foram então filtradas através de uma membrana de poro de 0,2 pm e armazenadas em 2-8°C.

Confirmação de conjugação à CRM₁₉₇

A conjugação	dos	oligossacarídeos	MenA	a CRMig,	foi
demonstrada por	SDS-	Page (figura 7) .	A	SDS-Page	foi
realizada de acordo	com a referência	267	usando	7,5%

acrilamida para empilhar e 7,5% de acrilamida para a separação de gel. Antes da eletroforese, as amostras foram tratadas 1:4 com tampão de amostra e fervidas por 10 min. A eletroforese foi realizada em 200 V de voltagem constante por aproximadamente 40 min. Os géis foram desenvolvidos com uma solução de tinta de Coomassie por aproximadamente 20 min e descolorida no ácido acético/solução de EtOH (7/40%)

94/112 por aproximadamente 4 horas.

O perfil dos conjugado na figura 7 é deslocado para pesos moleculares mais elevados comparados a CRM₁₉₇, e é marcadamente diferente de CRM₁₉₇. A análise de SDS-Page 5 também demonstra a presença de material de alto peso molecular. Este material pode ser formado durante a reação de conjugação, que permite pontos de união múltiplos da CRMi₉₇ por molécula de oligossacarídeo.

Os conjugado foram também analisados para teor de sacarídeo e proteína. As razões de sacarídeo/proteína variando de 0,20 a 0,32 (peso/peso) foram observadas.

Estabilidade de conjugados de CRMi₉₇-MenA

A estabilidade dos conjugado de CRMi₉₇-MenA foi determinada medindo a liberação de sacarídeo não conjugado 15 sobre o tempo, que os resultados da hidrólise das ligações de fosfodiéster.

Centricon 30 dispositivos (2 ml de capacidade) foi condicionado enxaguando com 1 ml de água destilada e girando duas vezes. 60 μΐ de solução salina foi adicionado 20 ã amostra de 940 μΐ (CRM-MenA 10/90 ou CRM-MenA10/0) contendo aproximadamente 0,3 mg/ml de sacarídeo. O teor de fósforo total foi medido como descrito acima antes de adicionar as misturas aos dispositivos. Os dispositivos foram girados em 1942 g até que 100-200μ1 de solução foi 25 deixado na câmara de retido, e então lavado com 2x 1 ml de solução salina e girados outra vez. A solução na câmara de permeado foi recuperada e o volume de amostra foi ajustado com a solução salina para 3 ml. O permeado derivado de cada amostra foi analisado para o teor total de fósforo como 30 descrito acima.

95/112

O	valor (P2/P1)	X	100, onde	o PI	é	o	fósforo	total
antes	de tratamento	de	centricon	e P2	é	o	fósforo	total
após o	tratamento de	centricon, representa	a	porcentagem do

sacarídeo livre. Os experimentos de pico para demonstrar a recuperação do oligossacarídeo livre através da membrana foram conduzidos adicionando 60 μΐ de aproximadamente 2 mg/ml de oligossacarídeo a 94 0 μΐ de amostra ou solução salina e então aplicando o procedimento de separação descrito acima. A recuperação foi consistentemente acima de 80%.

A Figura 8 mostra que o conjugado CRM-MenA 10/90 mostrou uma tendência reduzida para liberar sacarídeo livre comparado a CRM-MenA10/0. FS (sacarídeo livre) é calculado como FS%(t)-FS%(0) onde FS%(t) e FS%(0) são as porcentagens livres de sacarídeo no tempo t e 0 respectivamente.

A estabilidade dos conjugado de CRM₁₉₇-MenA foi determinada também medindo a geração de fosfomonoéster durante o armazenamento. Momentaneamente, as soluções dos conjugado, em uma faixa de concentração de 157 a 253 pg/ml, foram incubadas em 37°C no tampão de histidina de 10 mM, pH 7,2. Em pontos de tempo diferentes durante 42 dias, os conjugados foram analisados para a quantidade de fosfomonoéster gerada durante o armazenamento.

A Figura 9 mostra o incremento de grupos fosfomonoéster durante o armazenamento em 37°C para os dois conjugados mencionados acima. A porcentagem de fosfomonoéster foi calculada como descrito acima: O conjugado CRM-MenA 10/90 mostrou uma tendência reduzida para gerar fosfomonoéster comparado a CRM-MenA10/0.

Imunogenicidade de conjugados de CRM-MenA

96/112

A fim de avaliar a habilidade dos conjugados MenA para provocar os anticorpos que reconhecem o polissacarídeo capsular nativo de MenA, os experimentos de imunogenicidade foram conduzidos em camundongos.

Formulação de vacina

Os conjugados de CRM-MenA 10/90 e CRM MenA 10/0 foram misturados com o tampão de fosfato de sódio e uma suspensão A1PO₄ para obter concentrações finais de sacarídeo de 20 pg/ml e 0,6 mg/ml de Al³⁺ em 10 mM de tampão de fosfato de sódio, pH 7,2. Para formulações sem adjuvantes, a suspensão de AIPO4 foi substituída com o tampão de fosfato de sódio. Antes da imunização, as vacinas resultantes foram diluídas 1:5 com solução salina.

Imunização de camundongos

Os grupos de 8 camundongos Balb/c, fêmeas de 6-8 semanas, foram imunizados duas ou três vezes s.c. com 0,5 ml de vacinas conjugadas contendo 2 pg de sacarídeo. No caso da programação de duas-injeções, o intervalo entre a primeira e a segunda dose foi de quatro semanas. Os sangramentos foram executados antes da imunização e duas semanas após a segunda dose. No caso da programação de três doses, as vacinas foram dadas em 0, 14 e 28 dias e os sangramentos foram executados no tempo zero, um dia antes (pós 2 doses de soro) e 14 dias após (pós 3 doses de soro) a terceira imunização.

Imunogenicidade

Os soros dos camundongos imunizados foram analisados para anticorpos IgG totais de polissacarídeo capsulares anti-MenA específicos e para atividade bactericida de soro mediada por complemento (SBA) contra sorogrupo A de

97/112

Neisseria meningitidis.

Os anticorpos IgG totais de polissacarídeo capsulares anti-MenA específicos foram determinados essencialmente de acordo com o método de referência 268, análise de soros animais. Cada soro adaptado para individual de camundongo foi analisado em duplicata por uma curva de titulação.

calculados

Os tíitulos de polissacarídeo Anti-MenA foram como unidade de Elisa de camundongo (MEU)/ml usando o software baseado no método de ensaio de linha de referência. Os títulos de média geométrica (GMT) foram calculados para grupos de cada imunização.

SBA foi medido em associações de soros pós II e pós III (onde apropriado) para cada grupo de imunização. O protocolo padrão de SBA foi baseado na inoculação da cepa bacteriana de teste (MenA F8238) no caldo de Mueller Hinton com a adição de 0,25% glicose. A cultura bacteriana foi incubada em 37°C na presença de CO₂ 5% e o crescimento parado quando as bactérias alcançaram a fase exponencial adiantada de crescimento, ao redor de 0,220-0,240 OD₆oo · As bactérias foram então diluídas a IO’⁴ com 1% BSA em tampão

de GBBS	e	incubadas por	1 hora	em 37°C	com C02 5%	na
presença	de	associações de	soros	inativados	por calor	(30
minutos	em	56°C) e 25% de	soro	de coelho	bebê como	uma

fonte de complemento. As misturas de reação foram então plaqueadas em ágar de Mueller Hinton e incubadas durante a noite em 37°C. Os títulos bactericidas foram expressos como a diluição de soro recíproca rendendo a morte de 50% das bactérias.

A tabela II mostra os títulos de IgG totais de polissacarídeo anti-MenA capsulares expressos como GMT (+/

98/112 limites de confiança) como medidos por ELISA e os títulos de SBA induzidos por CRM-MenA 10/90, e CRM-MenA10/0 Ambos os conjugado foram capazes de indução em anticorpos de polissacarídeo anti-MenA específicos de camundongos com atividade funcional bactericida.

Vacina	Título pós 2 ELISA GMT (+/- 95 % Cl)	Título pós 2 SBA
CRM-MenA 10/0 lot 5/ A1PO4	346 (230; 520)	>4096<8192
CRM-MenA 10/90 lot 5 /A1PO4	270 (217,-336)	4096

Tabela II

Em um segundo experimento, a imunogenicidade em camundongos de CRM-MenA 10/90 foi testada com e sem A1PO₄. A imunogenicidade do CRM-MenA 10/90 é confirmada na tabela III, que mostra os títulos de anticorpo de IgG anti-MenA específicos induzidos após duas e três imunizações e a atividade bactericida mediada por complemento destes anticorpos. Os títulos de pré-imunização foram descobertos sendo negativos (SBA <4). Estes dados sugerem que a presença do adjuvante melhora a resposta do anticorpo. A imunogenicidade observada no conjugado é claramente uma consequência da conjugação química do oligossacarídeo à proteína carreadora, como uma mistura física de oligossacarídeo MenA, CRMi₉₇ e A1PO₄ não foi imunogênico.

Vacina	Título pós 2 ELISA GMT (+/- 95 % Cl)	Título pós 3 ELISA . GMT (+/- 95 % Cl)	Título pós 2 SBA	Título pós 3 SBA
CRM-MenA 10/90 lotl 1 ΑΙΡΟ<	867 (585; 1285)	1299(1008; 1675)	2048	4096
CRM-MenA 10/90 lot 11	388 (249; 604)	426(241;751)	1024	2048
OligoMenA 10/90 lot 11 + CRMW+ AIPO, (mistura física de antígenos não conjugados)	2	2	<4	<4

TabelalII

99/112

EXEMPLO 2

Modificação de polissacarideo Men A

Modificação química de polissacarídeo MenA mg de polissacarídeo capsular nativo MenA (0,072 mmol) foi adicionada a 170 mg (mmol 2,5) de imidazol e 1 mL de CH₃CN.

Agitando com uma barra magnética,

163 pL (1,59 mmol) de anidrido acético foi adicionado e foi incubada em 55°C por 21 h.

de molar de imidazol:anidrido acética foi

2:4. Uma etapa de diafiltração usando uma membrana de celulose de Centricon (limite de peso molecular 1 kDa) contra água de Milli-Q (1:7 vol/vol) foi usada para purificar o produto de reação.

O material foi finalmente seco sob o vácuo (SpeedVac).

Confirmação de modificações químicas por ¹H e ¹³C NMR

Para estabelecer o grau de acetilação, uma completa do polissacarídeo capsular MenA modificado foi realizada por espectroscopia ³H e ¹³C NMR.

A análise de NMR quantitativa foi usada para das cadeias de foi estimada por dos resíduos de N-acetil-mannosamina

O-acetilados em

C-3), pico dos resíduos de

N-acetilmannosamina O-acetilados em C-4) e pico de H₂ ^de0Ac (próton na posição C-2 dos resíduos de N-acetil-mannosamina sem 0acetilação), em comparação com H₃ (próton na posição C-l dos resíduos de

N-acetil-mannosamina). O nível total de 0acetilação foi obtido pela soma de integrações de pica τ τ 3 OAc __ τ τ 4 OAc h₂ e h₂ **

100/112 %0-Acetilação = [H₂ ^3OAc + H2^40Ac/ [Hi°^Ac+ Hx^de0Ac] .

Além disso, a porcentagem de O-acetilação foi estimada por integração de pico de H₂ ^3OA7/H₂ ^4OAc (próton na posição C-3 dos resíduos de N-acetil-mannosamina O-acetilados em C-3 e próton na posição C-4 dos resíduos de N-acetil-mannosamina O-acetilados em C-4), em comparação com H1 (próton na posição Cl dos resíduos de N-acetil-mannosamina).

%0-Acetilação = [H₂ ^3OAc/H2^4OAc/ [Hx^OAc + H_x ^de0Ac]

Estabilidade de polissacarídeos Mena

A análise ³¹P NMR foi usada para avaliar a estabilidade do polissacarídeo capsular MenA modificado inteiramente acetilado em comparação com o polissacarídeo nativo e o oligossacarídeo correspondente em 37°C por 42 dias em 10 mM de tampão de histidina pH 7,2, como descrito acima.

O polissacarídeo MenA modificado inteiramente 0acetilado foi muito mais estável do que o polissacarídeo capsular nativo e o oligossacarídeo correspondente.

Amostra	avDP
Od	7d	14d	21d	28d	35d	42d
Pol i. MenA Nativa.	>50	>50	44.6	29.6	269	20.8-	18.3
Oligo MenA Nativo	17.3	15.5	13.0	12.0	11.0	10.4	9.6
Pol i. MenA completamente Ac	>50	>50	>50	>50	>50	>50	>50

Tabela IV

Estes resultados confirmam que a estabilidade do oligossacarídeo MenA pode ser melhorada bloqueando os grupos hidroxila em posição 4 e 3 de N-acetilmannosamina com um grupo bloqueador de acordo com a presente invenção.

Será compreendido que a invenção foi descrita como exemplo somente e as modificações podem ser feitas enquanto *

101/112 permanecendo dentro do escopo e conceito inventivo da invenção.

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6660735,	6660747, 6664260, 6664264,	6664265,	6667312
6670372,	6677347, 6677348, 6677349,	6683088,	6703402
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30:154-159.

Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Sacarídeo capsular modificado caracterizado pelo fato de que compreende um grupo bloqueador em uma posição do grupo hidroxila em pelo menos 80% das unidades de monossacarídeo do sacarídeo capsular nativo correspondente, em que o grupo bloqueador tem a fórmula (Ia):

   -O-X-Y (Ia) em que

   X é C(O);

   Y é R³;

   R3 é C1-6 alquila;

   em que o sacarídeo capsular nativo correspondente compreende unidades de monossacarídeo ligadas por ligações fosfodiéster.
2. 2. Sacarídeo capsular modificado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R³ é CH3.
3. 3. Sacarídeo capsular modificado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que todas as unidades de monossacarídeo do sacarídeo têm grupos bloqueadores.
4. 4. Sacarídeo capsular modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o sacarídeo capsular nativo correspondente é um sacarídeo de

   Neisseria meningitidis do sorogrupo A.
5. 5. Sacarídeo capsular modificado, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o grupo

   bloqueador está em quaisquer das 3 e/ou 4 posições do sacarídeo de Neisseria meningitidis do sorogrupo A correspondente. 6. Sacarídeo capsular modificado, de acordo com a

   reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o grupo

   Petição 870190048015, de 22/05/2019, pág. 13/23

   2/10 bloqueador está em quaisquer das 4 posições do sacarídeo de Neisseria meningitidis do sorogrupo A correspondente.

   7. Sacarídeo capsular modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o sacarídeo capsular modificado é um oligossacarídeo.

   8. Sacarídeo capsular modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o sacarídeo modificado compreende um grupo hidroxila anomérico terminal ou um grupo amino derivado de um grupo hidroxila anomérico terminal.

   9. Sacarídeo capsular modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que há pelo menos uma unidade de monossacarídeo do sacarídeo capsular modificado onde dois grupos hidroxila vicinais do sacarídeo capsular nativo correspondente não compreende grupos bloqueadores.

   10. Sacarídeo capsular modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das unidades de monossacarídeo do sacarídeo compreende grupos bloqueadores em que R¹ é substituído com dois grupos hidroxila vicinais.

   11. Sacarídeo caracterizado pelo fato de possuir a fórmula:

   Petição 870190048015, de 22/05/2019, pág. 14/23

   3/10 cada grupo Z é independentemente selecionado de OH, OAc ou um grupo bloqueador de fórmula (Ia); e cada grupo Q é independentemente selecionado de OH, OAc ou um grupo bloqueador de fórmula (Ia);

   V é selecionado de -NH₂, -NHE, -NE¹E², W², ou -O-D, onde:

   E, E¹ e E² são grupos protetores de nitrogênio, que podem ser os mesmos ou diferentes, e D é um grupo protetor de oxigênio;

   W é selecionado de -OH ou um grupo bloqueador de fórmula (Ia) ;

   W¹ é selecionado de -OH ou um grupo bloqueador de fórmula (Ia);

   W² é selecionado de -OH ou um grupo bloqueador de fórmula (Ia);

   e em que pelo menos um dos grupos Z e 80-99% dos grupos

   Q são grupos bloqueadores de fórmula (Ia), 1-20% dos grupos Q são OAc e o restante dos grupos Q são OH, em que um grupo bloqueador de fórmula (Ia) é:

   -O-X-Y (Ia)

   em que X é 0(0); Y é R₃; R3 é Ci-6 alquila

   12. Sacarídeo, de acordo com a reivindicação 11,

   Petição 870190048015, de 22/05/2019, pág. 15/23

   4 / 10 caracterizado pelo fato de que pelo menos 10% dos grupos Z são grupos bloqueadores.

   13. Sacarídeo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que n é um inteiro de 15 a 25.

   14. Processo para modificar um sacarídeo capsular caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

   (a) fornecer um sacarídeo capsular tendo pelo menos um grupo hidroxila em uma unidade de monossacarídeo; e (b) converter pelo menos um grupo hidroxila em um grupo bloqueador de fórmula (Ia) em pelo menos 80% das unidades de monossacarídeos do sacarídeo capsular;

   em que o grupo bloqueador de fórmula (Ia) é:

   -O-X-Y (Ia) em que

   X é C(O);

   Y é R3;

   R3 é C1-6 alquila.

   15. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) compreende a etapa de:

   (b1) reagir o sacarídeo capsular com [(R³C(O)]2O na presença de um catalisador de imidazol.

   16. Processo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o sacarídeo capsular na etapa (a) é um oligossacarídeo capsular.

   17. Processo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o oligossacarídeo capsular é obtido por despolimerização e dimensionamento do polissacarídeo capsular nativo correspondente.

   18. Processo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o sacarídeo capsular na etapa

   Petição 870190048015, de 22/05/2019, pág. 16/23

   5 / 10 (a) é um polissacarídeo capsular nativo e o processo ainda compreende uma etapa (c) em que o produto da etapa (b) é dimensionado, desse modo fornecendo um oligossacarídeo capsular modificado.

   19. Processo para modificar um polissacarídeo de Neíssería meningitidis do sorogrupo A caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

   (A) (a) fornecer um polissacarídeo de Neíssería meningitidis do sorogrupo A nativo;

   (b) despolimerização e dimensionamento do referido polissacarídeo para fornecer um oligossacarídeo; e

   (c) converter pelo menos um grupo hidroxila do oligossacarídeo em um grupo bloqueador, de acordo com a reivindicação 14 ou 15. (B) (a) fornecer um polissacarídeo de Neisseria meningitidis do sorogrupo A nativo; (b) converter pelo menos um grupo hidroxila do polissacarídeo em um grupo bloqueador de acordo com a reivindicação 14 ou 15; e (c) despolimerizar e dimensionar o polissacarídeo

   resultante.

   20. Processo para preparar o sacarídeo capsular modificado das reivindicações 1 a 13 caracterizado pelo fato de que é um processo de síntese total compreendendo formar ligações glicosídicas entre duas ou mais unidades de monossacarídeo.

   21. Conjugado de proteína sacarídea caracterizado pelo fato de ser de um sacarídeo modificado das reivindicações 1 a 13.

   Petição 870190048015, de 22/05/2019, pág. 17/23
6. 6 / 10

   22. Conjugado, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a proteína é uma toxina ou toxóide bacteriano. 23. Conjugado, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a toxina ou toxóide bacteriano

   é toxina ou toxóide da difteria.

   24 . Conjugado, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a toxina ou toxóide bacteriano é CRM197. 25 . Processo para fazer um conjugado de proteína

   sacarídea caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

   (A) (a) fornecer um sacarídeo capsular modificado da reivindicação 8; e (b) conjugar o sacarídeo capsular modificado a uma proteína através do grupo hidroxila anomérico terminal ou do

   grupo amino derivado de um grupo hidroxila anomérico terminal; ou (B) (a) fornecer um sacarídeo capsular modificado da reivindicação 9; (b) converter pelo menos um dos pares de grupos

   hidroxila vicinais em grupos aldeído por clivagem oxidativa; e (c) ligar o sacarídeo capsular modificado a uma proteína por aminação redutiva; ou (C) (a) fornecer um sacarídeo capsular modificado da reivindicação 10;

   (b) converter pelo menos um dos pares de grupos

   Petição 870190048015, de 22/05/2019, pág. 18/23
7. 7 /10 hidroxila vicinais em grupos aldeido por clivagem oxidativa; e (c) ligar o sacarídeo capsular modificado a uma proteína por aminação redutiva.

   26. Processo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a proteína é uma toxina ou toxóide bacteriano.

   27. Molécula caracterizada pelo fato de que compreende uma porção sacarídea de fórmula:

   cada grupo Z é independentemente selecionado de OH ou um grupo bloqueador de fórmula (Ia); e cada grupo Q é independentemente selecionado de OH ou um grupo bloqueador de fórmula (Ia);

   W é selecionado de OH ou um grupo bloqueador de fórmula

   Petição 870190048015, de 22/05/2019, pág. 19/23
8. 8/10 (Ia) ;

   L é O, NH, NE, S ou Se;

   em que a ligação covalente livre de L é unida a um carreador de proteína; e em que o carreador de proteína é uma toxina ou toxóide bacteriano; e em que pelo menos um dos grupos Z e 80-99% dos grupos Q são grupos bloqueadores de fórmula (Ia), 1-20% dos grupos Q são OAc e o restante dos grupos Q são OH, em que um grupo bloqueador de fórmula (Ia) é:

   -O-X-Y (Ia) em que

   X é 0(0);

   Y é R₃;

   R₃ é Ci-6 alquila.

   28. Molécula caracterizada pelo fato de que compreende um sacarídeo de fórmula:

   Petição 870190048015, de 22/05/2019, pág. 20/23
9. 9 / 10 n é um número inteiro de 1 a 100;

   cada grupo Z é independentemente selecionado de OH, OAc ou um grupo bloqueador de fórmula (Ia); e cada grupo Q é independentemente selecionado de OH, OAc ou um grupo bloqueador de fórmula (Ia);

   V é selecionado de -NH2, -NHE, -NE¹E², W², ou -O-D, onde: E, E¹ e E² são grupos protetores de nitrogênio, que podem ser os mesmos ou diferentes, e D é um grupo protetor de oxigênio;

   W é selecionado de -OH ou um grupo bloqueador de fórmula (Ia);

   W¹ é selecionado de -OH ou um grupo bloqueador de fórmula (Ia); W² é selecionado de -OH ou um grupo bloqueador de fórmula (Ia); e pelo menos um dos grupos Z e/ou pelo menos um dos grupos Q tem a fórmula (IIa) ou (IIb): -O-X-Y' (Ila) -O-R⁴ (IIb)

   em que X é C(O), S(O) ou SO2;

   Y' é NR²R⁴;

   R² é H ou C1-6 alquil; e

   R⁴ é C1-4 alquileno-CH(O) ou -C1-5 alquileno-NH-, em que o grupo -NH- é parte de um carreador de proteína; e em que o carreador de proteína é uma toxina ou toxóide bacteriano e em que pelo menos 80% das unidades de monossacarídeo do sacarídeo possui grupos bloqueadores de fórmula (Ia):

   -O-X-Y (Ia) em que

   X é C(O);

   Y é R3;

   R3 é C1-6 alquila.

   Petição 870190048015, de 22/05/2019, pág. 21/23
10. 10 / 10

    29. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende (a) um sacarídeo modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e/ou um conjugado de proteína sacarídea de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 24 e/ou uma molécula de acordo com a reivindicação 27 ou 28, e (b) um carreador farmaceuticamente aceitável.

    30. Composição, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que ainda compreendende um antígeno de sacarídeo de um ou mais dos sorogrupos de N.meningitidis C, W135 e Y, o sacarídeo opcionalmente sendo um oligossacarídeo e opcionalmente sendo conjugado a uma proteína carreadora.

    31. Composição, de acordo com a reivindicação 29 ou 30, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um adjuvante de vacina.

    32. Composição, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é um fosfato de alumínio. 33. Composição, de acordo com qualquer uma das

    reivindicações 29 a 32, caracterizada pelo fato de que é uma vacina contra uma doença causada por N. meningitidis.