JP7165468B2 - ｎＯＭＶ－抗原コンジュゲート及びその使用 - Google Patents

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Description

本発明は、二価リンカーを介して、非界面活性剤抽出された未変性の外膜小胞(nOMV)を抗原にコンジュゲートし、nOMV-抗原コンジュゲートを形成する分野のものである。そのコンジュゲートは、免疫化のために有用である。
担体への抗原のコンジュゲーションは、免疫原性、特に多糖に対する免疫原性、を改善するための確立された手順である。例えば、細菌性莢膜多糖(CPS)は、いくつかの重要な特性を欠いている免疫応答を引き起こす天然のT細胞非依存性抗原である。担体へのコンジュゲーションは、これらの糖をT細胞依存性抗原に変換し、次にそれは免疫学的記憶効果をもたらすことができ、幼児においても防御免疫応答を惹起できる。
そのようなコンジュゲートでの1つの公知の担体は、承認されたインフルエンザ菌(H. influenzae)Bコンジュゲートワクチンにおいて担体として含まれている、N.メニンギティディス(N.meningitidis)小胞から形成された「OMPC」外膜タンパク質複合体である(例えばEP-0467714を参照されたい)。OMPCは、タンパク質コンジュゲートにおける担体としても使用されている。例えば、Wu et al. (PNAS USA 2006; 103(48): 18243-18248)は、Pfs25HのOMPCへのコンジュゲーションが、マウスにおいて抗Pfs25H ELISA反応性を生じることにおいて、Pfs25H単独の同様の用量よりも>1,000倍強力であったPfs25H-OMPCコンジュゲートワクチンをもたらしたことを報告している。
OMPCのPfs25Hタンパク質へのコンジュゲーションは、スキーム1に示されるとおりマレイミド活性化Pfs25HをOMPC中のチオール化外膜タンパク質と反応させることによって達成され得る(例えばWO2006/124712を参照されたい)。
Figure 0007165468000001
上記のスキーム1に示されるとおり、及び先行技術の一般的手順により、コンジュゲーション方法及びそのコンジュゲートは、二価ヘテロ二官能性リンカー、すなわち異なる官能基を保有している両末端を有するリンカー成分の使用を企図する。これは、主に、小胞-リンカー中間体が、選択された抗原とではなく別の小胞粒子と交差結合することを、回避するためである。実際のところ、先行技術によれば、リンカーの異なる末端は、意図した部分、すなわち一方の側で小胞と及び他方の末端で抗原との選択的反応を生じるために、小胞上の反応基及び工程に関与する選択された抗原に応じて選択される。しかしこれらの方法は、主にリンカーの選択及び官能基化に関連したいくつかの欠点を負っており、それは、１つに結合される小胞と抗原の選択にいくつかの制限を引き起こす。本出願人は今般、未変性の、非界面活性剤抽出された外膜小胞(nOMV)が出発小胞として使用される場合、一方の側でnOMV表面タンパク質と、及び他方の末端で選択された抗原との結合のために好適な二価リンカーを使用することができることを見出し、それによりnOMV及び抗原の両方の免疫原性活性を依然としてもたらす最終コンジュゲートを提供する。驚くべきことに、本発明において使用されるリンカーが同一の末端官能基を示す場合でさえ、選択された抗原とのnOMVのコンジュゲーションは、コンジュゲーション反応の妨げとなる小胞凝集又は副産物の形成を実質的に伴うことなく達成される。
第一の態様では本発明は、界面活性剤を含まない工程によって得られた未変性外膜小胞(nOMV)であって、二価リンカーによって少なくとも外来性の選択された抗原に結合された少なくとも表面タンパク質残基を有する未変性外膜小胞(nOMV)を含む、免疫原性nOMV-リンカー-抗原コンジュゲートに言及する。
さらなる態様では、本発明は、
i)少なくともnOMV表面タンパク質残基を二価リンカーの第1の末端部分と反応させて、nOMV-リンカー中間体を得るステップ、及び
ii)前記nOMV-リンカー中間体を、少なくとも1つの選択された外来性の抗原と、二価リンカーの第2の末端部分を介して反応させ、それにより本発明のnOMV-リンカー-抗原コンジュゲートを得るステップ
を含む、前記コンジュゲートを調製する方法に言及する。
一つの実施形態では、リンカーは二価ホモ二官能性リンカーであり、すなわち同じ末端官能基を有する。さらに好ましい実施形態では、リンカーは二価ヘテロ二官能性リンカーであり、すなわち異なる末端官能基を有する。
さらなる態様では、本発明は、上に示されるステップi)によって得られた(又は得られる)nOMV-リンカー中間体及び本発明のnOMV-リンカー-抗原コンジュゲートの調製のためのその使用に言及する。
追加的な一態様では、本発明は、免疫原性化合物としての使用のため、特に免疫原性組成物又はワクチンの調製のための上記のnOMV-リンカー-抗原コンジュゲートにも言及する。
さらなる態様では、本発明による免疫原性コンジュゲートは、二価リンカーによって第1の抗原に結合された少なくとも表面タンパク質成分を有するnOMVを含み、ここで前記第1の抗原は、第2の異なる抗原にさらに結合されている。
またさらなる態様では、本発明の免疫原性コンジュゲートは、二価リンカーによって第1の抗原に結合された少なくとも表面タンパク質成分、及び二価リンカーによって第2の異なる抗原に結合された少なくとも別の表面タンパク質成分を有するnOMVを含み、ここで第1の抗原と結合している二価リンカー及び第2の作用物質と結合している二価リンカーは、独立して、同じであるか又は互いに異なっている。
またさらなる態様では、本発明は、上に示すコンジュゲート及び少なくとも1つの薬学的に許容される担体又はアジュバントを含む免疫原性組成物又はワクチン、並びに前記組成物又はワクチンの投与を含む脊椎動物において免疫応答を生じさせるための方法、に言及する。
さらなる態様では、本発明は、免疫原性多価nOMV-リンカー-抗原コンジュゲートの調製のためのnOMVの使用にも言及する。
図１は、SH-マレイミド(malemido)化学によってネズミチフス菌(S. typhimurium)nOMVにコンジュゲートされたCSP又はその断片(NANP)3を用いた免疫後の抗CSP(1A)及び抗OAg(1B)IgG力価を、前記nOMVと物理的に混合されたCSPと比較して示す(アジュバントを用いずに製剤化)。CD1雌マウス、5週齢(群あたり8匹)は、0及び28日目に用量あたり2μg CSP/(NANP)3を用いて皮下免疫された。力価は、0、14、28及び42日目に測定された。 図１Ａの続きである。 ネズミチフス菌nOMVをPfs25抗原と、BS3リンカーを介してコンジュゲートすることによって作製された本発明のnOMVコンジュゲートによって、マウスにおいて誘導された抗Pfs25 IgG応答(0及び28日目に用量あたり200μLでSC注射、0、14、27及び42日目に採血)。 ネズミチフス菌nOMVをfHbp抗原と、BS3リンカーを介してコンジュゲートすることによって作製された本発明のnOMVコンジュゲートによって、マウスにおいて誘導された抗fHbp IgG応答(0及び28日目に用量あたり200μLでSC注射、0、14、27及び42日目に採血)。 MenB nOMVをMenA抗原とSIDEAリンカーを介してコンジュゲートすることによって作製された本発明のnOMVコンジュゲートによって、マウスにおいて誘導された抗MenA IgG応答を、MenA-MenC二価MenBGMMAコンジュゲート、GMMA、CRMコンジュゲート並びにMenA及びGMMAの混合物(コンジュゲートされていない)と比較した。 MenB nOMVをMenC抗原とSIDEAリンカーを介してコンジュゲートすることによって作製された本発明のnOMVコンジュゲートによって、マウスにおいて誘導された抗MenC IgG応答を、MenA-MenC二価MenBGMMAコンジュゲート、GMMA、CRMコンジュゲート並びにMenC及びGMMAの混合物(コンジュゲートされていない)と比較した。
本発明の理解を促進するために、いくつかの用語及び句を下に定義する。次の用語及び句(過去、現在などの時制を含む)の当業者が認識する同義語又は代替語は、具体的に記載されていない場合でも企図される。
本開示及び特許請求の範囲において使用される場合、単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈が明確に異なって定める場合を除いて、複数形を含み、すなわち「a」は、別段示される場合を除いて「1つ以上」を意味する。
用語「約」又は「およそ」は、大体、おおよそ又はその辺りを意味する。用語「約」又は「およそ」は、値が測定又は決定される方法、すなわち測定系の限界又は特定の目的、例えば供給される製剤中の栄養素の量、のために必要な精度に部分的に依存する、当業者によって決定された特定の値についての許容可能な文脈上の誤差範囲にあることをさらに意味する。用語「約」又は「およそ」が数値範囲と共に使用される場合、それは、記載される数値より上又は下に境界を広げることによって範囲を変更する。例えば「約0.2と5.0mg/mlとの間」は、数値範囲の境界が0.2より下及び5.0より上に拡張され、それにより当該特定数値が範囲内と同じ機能的結果を達成することを意味する。例えば「約」及び「およそ」は、当技術分野における実施ごとに、1以内又は1を超える標準偏差の範囲を意味し得る。あるいは「約」及び「およそ」は、所与の値の20%まで、好ましくは10%まで、より好ましくは5%まで、より好ましくは1%までの範囲を意味し得る。
「A及び/又はB」などの句において使用される場合、用語「及び/又は」は、「A及びB」、「A又はB」、「A」及び「B」を含むことが意図される。同様に「A、B及び/又はC」などの句において使用される場合、用語「及び/又は」は、次の実施形態:A、B及びC; A、B又はC; A又はC; A又はB; B又はC; A及びC; A及びB; B及びC; A(単独); B(単独); 並びにC(単独)のそれぞれを包含することが意図される。
別段の指定がない限り、「A%～B%」「A～B%」「A%からB%」「AからB%」「A%～B」「A%からB」という表現はいずれも、それらの通常の慣例的な意味を有する。一部の実施形態ではこれらの表現は同義である。
用語「実質的に」又は「実質的な」は、記載される標準としてすべての重要な態様において記載される又は特許請求される状態が機能することを意味する。したがって「実質的に含まない」は、数値がいくらかの不純物又は物質の存在を示していても、含まない状態としてすべての重要な態様において機能する状態を包含することを意味する。「実質的な」は、90%より大きな、好ましくは95%より大きな、最も好ましくは99%より大きな値を一般に意味する。明細書において及び特許請求の範囲において、特定の値が使用される場合、別段述べられている場合を除いて、用語「実質的に」は、特定の値についての許容可能な誤差範囲を含むことを意味する。
「有効量」は、参照される効果又は結果を生じるのに十分な量を意味する。「有効量」は、述べられる目的に関連する公知の技術を使用して経験的に及び日常的なやり方で決定され得る。
本明細書において使用される場合、「異種」は、2つ以上の参照される分子又は構造が異なる生物由来であることを意味する。例えば、nOMVについて、異種抗原は、それが付加されるnOMV小胞とは異なる生物由来であるものである。本明細書において使用される場合「同種」は、2つ以上の参照される分子又は構造が同じ生物由来であることを意味する。
本明細書において使用される場合、「外来性」は、2つ以上の参照される分子又は構造が天然では互いに関連していないことを意味する。例えば、本明細書におけるnOMV表面糖に対して「外来性」であることが本明細書において意図される選択された抗原は、表面糖に天然では又は生来はコンジュゲートされない抗原を意味し、したがって、抗原及び糖(又はnOMV分子)が同じ生物に起源を有する場合であっても、当該抗原はnOMV分子に天然ではコンジュゲートされていない。このように外来性抗原は、異種抗原である必要はないが、異種抗原は外来性抗原である。
「配列同一性」は、パラメーターであるギャップオープンペナルティー=12及びギャップ伸長ペナルティー=1を用いるアフィンギャップ検索を使用して、MPSRCHプログラム(Oxford Molecular)において実行されるスミス-ウォーターマン相同検索アルゴリズムによって決定され得るが、好ましくは、デフォルトパラメーター(例えばギャップオープニングペナルティー=10.0、及びギャップ伸長ペナルティー=0.5、EBLOSUM62スコアリングマトリクスを使用)を使用してニードルマン-ブンシュグローバルアラインメントアルゴリズム(例えばRubin (2000) Pediatric. Clin. North Am. 47:269-285を参照されたい)によって決定される。このアルゴリズムは、EMBOSSパッケージにおけるニードルツールにおいて好都合に実行される。本出願が特定の配列番号への配列同一性に言及する場合、同一性は配列番号の全長にわたって算出されることが意図される。
用語「w/w%」は、示されるとおり、異なる化合物に対する、又は組成物の全内容物に対する、所与の化合物の重量百分率を示す。
類似的に、用語「v/v%」は、示されるとおり、異なる化合物に対する、又は組成物の全内容物に対する、所与の化合物の体積百分率を示す。
本明細書において使用される場合、用語「糖(saccharide (or sugar))成分」は、単糖類及び多糖単位をその意味に含む。糖成分は、開及び閉(環)形態で存在でき、閉形態が本明細書の構造式で示されるが、開形態も本発明によって包含されることは、理解されるであろう。同様に、糖成分はピラノース及びフラノース形態で存在してよく、ピラノース形態が本明細書の構造式で示されているが、フラノース形態も包含されることは、理解されるであろう。糖成分のさまざまなアノマー形態も包含される。
当技術分野において一般に知られているとおり(例えばhttps://en.wikipedia.org/wiki/Oligosaccharideを参照されたい)、用語「オリゴ糖」は、3～10個の単糖単位を有する多糖をその意味に含む。
別段規定される場合を除いて、用語「ポリペプチド」は、選択された抗原として作用可能である任意の長さのポリペプチドを指す。本発明のポリペプチドを形成するアミノ酸ポリマーは、直鎖又は分岐であってよく、修飾アミノ酸を含んでよく、非アミノ酸によって割り込まれていてよい。用語は、天然で又は介入によって、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作若しくは改変（標識成分とのコンジュゲーションなど）によって改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。同様に定義内に含まれるのは、例えばアミノ酸の1つ以上の類似体(例えば非天然アミノ酸などが挙げられる)及び当技術分野において公知の他の改変を含有するポリペプチドである。ポリペプチドは、一本鎖又は会合鎖として存在してよい。
「平均分子量」は、通常の算術平均によって得られた平均分子量、又は個々の成分、例えばポリペプチドコンジュゲートの場合はアミノ酸の分子質量の平均を示すことが意図される。
用語「-OAg」(O-抗原)は、検討されるnOMVの表面上のリポ多糖(LPS)又はリポオリゴ糖(LOS)に存在する抗原官能基を示して本発明において使用される。より詳細には、LPSは、リピドA(LPSの毒性の原因である)、コアオリゴ糖、及び-OAg鎖(反復グリカンポリマーであり細菌の血清学的特異性の主な原因)として知られる3個の異なる部分によって一般に形成される。
用語「莢膜多糖/糖」(CPS)は、細菌の細胞エンベロープ外側に位置する層において見出され得る、細菌細胞自体の外側エンベロープの一部である糖を示す。CPSは、幅広い細菌の最も外側の表面上に、及び一部の場合では真菌においてさえ発現される。
用語「懸濁液」は、媒体がいかなる固形粒子も実質的に含まない溶液とは異なり、いくらかの沈殿物又は微粒子又は凝結粒子(flocculating particle)を示す液体媒体をその意味に含む。
別段規定される場合を除いて、用語「コンジュゲーション」は、二価リンカーを介した、具体的にはnOMVと選択された抗原成分を参照する、対象とする実体の結合又は連結を示す。
「免疫学的有効量」によって、その量の個体への投与が、単一用量又は一連のものの一部としてのいずれでも、治療又は予防のために有効であることが意味される。この量は、治療される個体の健康及び身体の状態、年齢、治療される個体の分類学的群(例えば非ヒト霊長類、霊長類など)、抗体を合成する個体の免疫系の能力、所望の防御の程度、ワクチンの製剤、治療する医師による医学的状況の評価及び他の関連要因に応じて変動し得る。その量は、日常的な試験を通じて決定され得る比較的幅広い範囲内にあることが予測される。
本明細書において用語「nOMV」は、培地から単離された及び/又は細胞からそぎ取られた小胞を示し、それらは、界面活性剤又は変性剤に曝露されていない、すなわち非界面活性剤抽出された、無傷の膜小胞である。本発明のnOMVは、外膜タンパク質(OMP)及び/又はリポ多糖(LPS)を天然膜環境におけるそれらの未変性立体構造及び正しい配向で示し、通常、細胞質成分を欠いている。
対照的に、用語「OMV」又は「dOMV」は、グラム陰性細菌の外膜の破壊によって、典型的にはそれらから小胞を形成する界面活性剤抽出工程によって得られる、種々のプロテオリポソーム小胞(proteoliposomic vesicle)を包含する。外膜タンパク質複合体(例えば、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitides)由来OMPC)は、dOMVと同様の三次元構造及び組成を有し、界面活性剤抽出手順を介して単離されることから、そのような定義内にあると考えられる(例えばEP0467714、US4,271,147、US4,459,286及びUS4,830,852を参照されたい)。界面活性剤抽出工程は、LPS及びリン脂質を、免疫防御リポタンパク質と共に除去する。そのような除去は、未変性の小胞構造を変化させ、凝集を促進する。凝集は、方法開発の観点から結果として課題を生じる可能性がある(収率、製造の一貫性及び安定性)。明確に均一なサイズ分布(動的光散乱DLS技術による測定で、典型的には20～250nmの範囲)によって特徴付けられるnOMVとは異なり、dOMVは、界面活性剤によって誘発された小胞凝集によって生じる明確でない不均一なサイズ分布を有する(通常、動的光散乱DLS技術による測定で、550～5500nmの範囲)(一般的参考文献として、Vaccine 28, 2010, 4810を参照されたい)。界面活性剤抽出工程は、細菌細胞溶解の結果として細胞質タンパク質の、OMV含有組成物(例えば、ワクチン)への混入も生じる。
先行技術の方法によれば、dOMV及びnOMVは、透過型電子顕微鏡(TEM)を使用してサイズ、形状及び、不純物又は非OMV材料の混入(dOMVの場合は小胞凝集又は界面活性剤の残留物など)の全体的外観の観点から分析及び記載され得る。dOMVとnOMVとの間の差異に関する詳細な参考文献として、例えばvan de Waterbeemd et al. J. Prot. Res. 12(4) (2013) 1898-1908 "Quantitative Proteomics Reveals Distinct Differences in the Protein Content of Outer Membrane Vesicle Vaccines";及びJ. Klimentova et al. Microbiological Research 170 (2015) 1-9 "Methods of isolation and purification of the outer membrane vesicles from gram-negative bacteria"を参照されたい。
用語「二価ホモ二官能性リンカー」又は「同種リンカー」は、同じ官能基を保有し、かつ一方の側でnOMVタンパク質と、他方の側で選択された抗原と反応できる2つの末端を示す連結ユニットを示し、ここでnOMVタンパク質及び選択された抗原は本明細書の下記で詳細に記載される。
同様に、用語「二価ヘテロ二官能性リンカー」又は「異種リンカー」は、異なる官能基を保有し、かつ一方の側でnOMVタンパク質と、他方の側で選択された抗原と特異的に反応できる2つの末端を示す連結ユニットを示し、ここでnOMVタンパク質及び選択された抗原は本明細書の下記で詳細に記載される。
用語「二価C1～C10アルキル又はアルケニル基」は、メチレン、エチレン、ビニル、アリルなどの1～10個の炭素原子を有する二価飽和又は不飽和アルキル又はアルケニル基をその意味に含む。
上に紹介されたとおり、本発明は、nOMV表面上の少なくともタンパク質単位を1つ以上の選択された外来性抗原(複数可)に、好適な二価リンカー(複数可)を介して共有結合させることによって得られたnOMV-リンカー-抗原コンジュゲートに言及する。言い換えると及び一態様により、本発明は、本明細書の下記でより詳細に記載される本発明の方法によって得られた(又は得られる)nOMV-リンカー-抗原コンジュゲートに言及する。
注目すべきことに、本コンジュゲートは、本明細書の実験パートによってさらに裏付けられるとおり、顕著な免疫原性活性を備えている。実際、コンジュゲートされた抗原に対する免疫応答を誘導することができると共に、本発明のコンジュゲートは、免疫活性が抗原部分に主に依存し、界面活性剤抽出された小胞に依存しない当技術分野のdOMV-抗原コンジュゲートとは異なり、nOMV構成成分に対する免疫応答も誘導できる。対照的に、本発明により、選択された抗原のnOMVタンパク質成分へのコンジュゲーションは、それ自体の免疫応答を誘導するnOMVの能力に著しい影響を与えない。注目すべきことに、nOMV及び選択された抗原(複数可)が異なる供給源由来である場合、本発明のコンジュゲートは、例えば、nOMV及びコンジュゲートされた抗原(複数可)の活性の両方に基づく多価免疫原性組成物又はワクチンの調製のために有用であり得る。
さらに本発明は、ホモ二官能性リンカーが、例えば小胞交差反応又は凝集に関連する先行技術の問題を被ることなく、nOMV-リンカー-抗原コンジュゲートの調製において使用され得ることを驚くべきことに示している。実際、出発nOMVは、リンカーの一方の末端と少なくとも1つの小胞表面タンパク質の適切な官能基とを反応させることによってホモ二官能性リンカーにより官能基化される。それにより、nOMV-リンカー中間体は、選択された抗原とのその後の反応のためにリンカーの他方の末端をいまだ利用可能な状態にしたまま、共有結合的に形成される。それにより、リンカーの第2の末端は、選択された抗原と、特異的かつ選択的に反応し、それは最終nOMV-リンカー-抗原コンジュゲートをもたらし、中間体交差反応又は凝集を実質的に回避する。実施例8aに示されるとおり、出発小胞としてdOMVを検討して実行される場合の同じ反応は、選択された抗原とのその後の反応のために好適でない小胞-リンカー-小胞凝集物の形成をもたらす。出発小胞としてのnOMVの使用は先行技術の凝集の問題を克服できるだけでなく、コンジュゲートされた構成成分の免疫原性プロファイルを保持しながら、本発明による一連のnOMV-リンカー-抗原コンジュゲートの調製をもたらす種々の二官能性リンカーがいまや使用可能であることが驚くべきことにここに見出された。
本発明のコンジュゲートは、未コンジュゲート抗原と比較していくつかの利点、例えば上に考察したとおり二価又は多価免疫原性物質又はワクチンとして作用する能力、及び未コンジュゲート抗原を超える免疫原性の改善を提供する(実施例5及び7を参照されたい)。加えて本発明のコンジュゲートは、今日まで使用されている小胞-タンパク質コンジュゲートを超えるいくつかの利点を有する。第1にnOMVは、抗原がdOMVタンパク質に結合されたdOMVコンジュゲートと比較してより少ないステップを用いて調製することができ、特に、タンパク質誘導体化の高価で時間がかかるステップを必要としない。第2にnOMVの製造は、界面活性剤抽出によるdOMVの調製よりも信頼性があり、また簡便であり得る。さらに、コンジュゲーション混合物由来の未反応抗原は、さらなるコンジュゲーションステップにおける使用のためにリサイクすることができ、それにより実施例3に例示されるとおりコンジュゲートの製造効率を改善する。
第1の態様では、本発明は、非界面活性剤抽出された未変性の外膜小胞(nOMV)のタンパク質残基に二価リンカーを通じてそれぞれ結合された、1つ以上の異なる選択された外来性抗原(複数可)を含むコンジュゲートに言及する。注目すべきことに、nOMVは、例えばデオキシコール酸抽出により、又はEmpigen BB(例えばUS4,707,543を参照されたい)などの双性イオン性界面活性剤を使用して得られた先行技術のdOMVとは異なり、界面活性剤を実質的に使用せずに回収及び単離され得る。
より詳細には、nOMVは、細菌増殖の際に自発的に形成され、培養培地に放出される天然膜小胞である。それらは、例えば、ブロス培養培地中で細菌を培養し、ブロス培養培地中のより小さなnOMVから全細胞を分離し(例えばろ過によって、又は細胞だけをペレット化し、より小さな小胞をペレット化しない低速遠心分離によって)、次に細胞枯渇培地からnOMVを回収すること(例えばろ過によって、示差沈降又は凝集によって、小胞をペレット化する高速遠心分離によって)によって得られる。nOMVの製造における使用のための株は、培養で産生されるnOMVの量に基づいて一般に選択されてよい。上に記載されたとおり、本nOMVは、界面活性剤を含まない手順に続いて回収及び単離されたという事実によって特徴付けられる。好ましくは、nOMVは、発酵ブロス中に放出され、遠心分離及びそれに続くろ過ステップを使用して精製される(一般的参考文献として、例えばClin. Vaccine Immunol. 2016 Apr; 23(4): 304-314を参照されたい)。さらに好ましくは、nOMVは、発酵ブロスに放出され、次の2つの連続するタンジェンシャルフローろ過(TFF)ステップ:(i)nOMVを含有する培養上清が細菌から分離される精密ろ過、及び(ii)nOMVが可溶性タンパク質から分離される限外ろ過(一般的参考文献として、例えばPLoS One. 2015; 10(8): e0134478を参照されたい)を使用して精製される。このように得られたnOMVは、次に本発明において、追加的精製/単離ステップを伴わずに直接使用され得る。ここで検討されるnOMVは、動的光散乱技術によって測定された20～250nmを含む好ましいサイズ分布を有する。
一部の実施形態によれば、nOMVは、野生型細菌から調製されるか、又は一般的に免疫原性を増加させる(例えば、免疫原を高発現するように)、毒性を低減する、莢膜糖合成を阻害する、免疫優性抗原発現を下方制御する等のように遺伝子操作された細菌から調製される。それらは、高ブレブ形成(hyperblebbing)株からも調製され得る。本発明のnOMVはまた、それらの表面上に外因性タンパク質を発現し、またエンドトキシンを枯渇していてもよい。
好ましくは本発明において使用されるnOMVは、小胞産生を増強し、任意選択で抗原(例えばリピドA)を除去若しくは改変し、及び/又は同種抗原若しくは他の生物由来の抗原を過剰発現するように変異している遺伝子改変された細菌株から産生される。前記好ましいnOMVは、例えばPLoS One. 2015; 10(8): e0134478に記載のとおり、膜抗原の一般化モジュール(GMMA)としても公知である。
小胞の自発的生成の増強は、例えば、膜完全性の維持に関与するタンパク質の標的化欠失によって達成され得る。nOMVの外側表面は、それが由来する細菌の外側表面に実質的に対応し、膜に関して膜抗原(例えばリポ多糖、リポオリゴ糖及びリポタンパク質が挙げられる)を維持していることが観察されている。有利なことに、本発明において使用されるnOMVは(界面活性剤抽出されたdOMVとは異なり)、これらの外膜構成成分をその未変性立体構造及び正しい配向で保持しており、それらが由来する細菌株に対する免疫原性を良好に維持している。
一般に、本発明における使用のためのnOMVは、任意の好適な細菌から調製されてよく、ここで好ましい細菌として、以下に限定されないが、ナイセリア属(Neisseria)(例えば、特にA、B、C、Y、X若しくはW135を含む任意の血清群のN.メニンギティディス、又は非病原性ナイセリア由来)、赤痢菌(Shigella)(ソンネ菌(S. sonnei)、フレキシネル菌(S. flexneri)、志賀赤痢菌(S. dysenteriae)又はボイド菌(S. boydii)など)、サルモネラ・エンテリカ各血清型(Salmonella enterica serovars)(パラチフス菌(Salmonella Paratyphi)、腸炎菌(Salmonella Enteritidis)、チフス菌(Salmonella typhi)又はネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)など)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)(例えば、無莢膜型インフルエンザ菌)、コレラ菌(Vibrio cholerae)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、マイコバクテリウム・スメグマチス(Mycobacterium smegmatis)、マイコバクテリウム・ボビス(Mycobacterium bovis)BCG、大腸菌(Escherichia coli)、バクテロイデス属(Bacteroides)(ポルフィロモナス属(Porphyromonas)を含む)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、ピロリ菌(Helicobacter pylori)、ブルセラ・メリテンシス(Brucella melitensis)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス(Actinobacillus actinomycetemcomitans)、ゼノラブダス・ネマトフィルス(Xenorhabdus nematophilus)、モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)又はボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)が挙げられる。
特に好ましい細菌は、ソンネ菌、フレキシネル菌、サルモネラ菌及び髄膜炎菌(meningococcus)のうちの少なくとも1つから選択される。
病原性赤痢菌株は、病原特性を媒介する220kbプラスミドを保有している。この「病原性プラスミド」は、標的上皮細胞に対する付着因子、侵入プラスミド抗原、virF、virGなどを包含する、赤痢菌病原性のいくつかの態様についての遺伝子をコードしていることが示されている。本発明において使用される赤痢菌は、病原性プラスミドを保有していても保有していなくてもよい。そのプラスミドの非存在は、工業培養の際に株を安定させ、病原性因子を除去することによって株を弱毒化し(それにより製造の安全性を向上させ)、ShET-2エンテロトキシン(プラスミド上のospD3又はsen遺伝子によってコードされている)の存在を回避し、リピドAのアシル化を担うmsbB遺伝子の第2のコピーであるmsbB2の存在を回避することができる。
サルモネラ菌に関する限り、特に好ましい株は、ネズミチフス菌、腸炎菌及びパラチフスA型から選択される。
髄膜炎菌nOMVも好ましい。そのような小胞は、任意の髄膜炎菌株から調製され得る。小胞は、血清群B株から好ましくは調製されるが、A、C、W135、Y又はXのうちの1つなどのB以外の血清群から調製することも好ましい。株は、任意の血清型(例えば1、2a、2b、4、14、15、16など)、任意の血清亜型(例えばP1.4)及び任意の免疫型(例えばL1、L2、L3、L3,7、L3,7,9、L10など)のものであってよい。髄膜炎菌は、高侵入性及び高病原性系列、好ましくは次の7種の高病原性系列:サブグループI;サブグループIII;サブグループIV-1;ET-5複合体;ET-37複合体;A4クラスター;系列3のいずれかを含む任意の好適な系列由来であってよい。最も好ましくは、nOMVは、NZ98/254株、又はP1.4 PorA血清亜型を有する別の株から調製される。
別の実施形態では、本発明のために有用なnOMVを調製するための細菌は、例えば小胞産生を増強するため、1つ以上の所望の抗原を発現するため、及び/又は望ましくない遺伝子(例えば、毒素をコードしているもの若しくはエンドトキシンなどの毒性産物を生成することに関与している酵素をコードしているもの)をノックアウト若しくは改変するために操作された変異株であってよい。
この方向において、本発明のための他の好ましいnOMVは、サルモネラ菌、特に、機能性TolRタンパク質を発現しないネズミチフス菌(サルモネラ・エンテリカ血清型チフィムリウム(Salmonella enterica serovar Typhimurium)としても知られる)によって産生される。
小胞が大腸菌、赤痢菌又はサルモネラから調製される場合、その細菌は、TolA、TolB、TolQ、TolR及びPalタンパク質のうち4種以下を発現し得る。よって天然の5種のタンパク質のTol-Pal系からの少なくとも1つのタンパク質は、存在しなくてもよく、培養培地における増殖の際に、5種すべてのTol-Palタンパク質を発現する同じ細菌よりも多量の外膜小胞を培地中に放出する細菌をもたらす。好ましくは、TolRは発現されないが、他の4種のタンパク質は発現されてよい(すなわちΔTolR株)。
好ましい実施形態では、大腸菌、赤痢菌又はサルモネラにおける5種のTol-Palタンパク質のうちの少なくとも1つは、例えばタンパク質をコードする遺伝子の欠失又は不活性化によって除去される。それにより細菌は、TolA、TolB、TolQ、TolR及びPalタンパク質のうちの0、1、2、3又は4種を発現し得る。5種のタンパク質の内の1つの除去で十分であり得るが、その場合細菌はこれらのタンパク質の内の4つだけを発現する。好ましくはTolRタンパク質が例えば、出発株のtolR遺伝子の不活性化によって除去される。それにより好ましい細菌は、tolA+ tolB+ tolQ+ TolR- Pal+であってよい。
一部の実施形態では細菌は、5種すべてのTol-Palタンパク質を発現するが、少なくとも1つは高ブレブ形成を生じるように変異している。例えばTolA、TolQ、TolR及び/又はPalタンパク質は、タンパク質が、その膜局在性を保持しているが、Tol-Pal系の他のメンバーとのその相互作用は破壊されるように変異し得る。それにより細菌は、TolA、TolQ及びTolRを内膜中の膜貫通タンパク質として保持し、Palタンパク質を外膜中のペリプラズムに面するリポタンパク質として保持するが、TolA、TolQ、TolR及び/又はPalタンパク質のうちの少なくとも1つは変異しており、完全には機能性でない。
さらに、他の変異が、例えば、大腸菌、赤痢菌又はサルモネラ株におけるΔgalU、ΔgalE又はΔwbaP等のOAg欠損株を生じるように存在してもよい。
さらに好ましい一実施形態では、髄膜炎菌は、機能性MltAタンパク質を発現しない。髄膜炎菌におけるMltA(膜結合型溶解性トランスグリコシラーゼ、GNA33としても知られる)のノックアウトは、多量のnOMVを、それらを容易に精製できる培養培地に自発的に放出する細菌を提供する。例えば小胞は、(i)小胞がそれらのサイズが異なることに基づいて細菌から分離され、小胞がろ液に通過する第1ろ過ステップ、及び(ii)小胞が残余分に保持される第2ろ過ステップを含む、2段階サイズろ過工程を使用して精製できる。
本発明では、-OAgが防御抗原として作用できることから前記nOMVの表面上の-OAgの存在が、二価ワクチンを提供することに有利であることが観察された(例えば、サルモネラ及び赤痢菌由来のnOMV)ことから、-OAgがnOMV上に存在することが好ましい。一部の好ましい株は、ペンタ又はテトラ-アシル化低毒性LPSを有し、それはmsbB、htrB、ddg及び/又はPagPの変異後に、結合された-OAgを含む(例えばRossi O et al, Clin Vaccine Immunol. 2016 Apr 4;23(4):304-14及びRossi O. et al, J. Biol. Chem. 2014 Sep 5;289(36):24922-35を参照されたい)。
ナイセリア属菌では、株は、好ましくは改変fur遺伝子を有する。本実施形態によれば、変異ナイセリア属菌は、LPSのリピドA部分を毒性にすることに関与する少なくとも1つの遺伝子、特にlpxl1遺伝子の発現を低減又はそのスイッチを切るように操作されている。このように生じたnOMVは、アシル化リピドAの低アシル化形態への変換のために、野生型株に対して低減された毒性を示す。
同様に、本発明のための好ましい変異ナイセリア属菌は、莢膜糖合成又は排出に関与する少なくとも1つの遺伝子、特にsynX及び/又はctrA遺伝子の発現を低減する又はそのスイッチを切るように操作されている。このように生じたnOMVは、さまざまな血清型に対して交差防御を示すことができ、そのことは当業者によって特に認められている。
好ましい実施形態では株は、例えばFukusawa et al. (1999), Vaccine 17:2951-2958において開示されているノックアウト及び/又は高発現変異の1つ以上を含み得る。例えば、その中の指針及び命名法に従って、下方制御及び/又はノックアウトのために有用な遺伝子として:(a)Cps、CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Opc、PilC、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA、及び/若しくはTbpB;(b)CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Opc、PhoP、PilC、PmrE、PmrF、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA、及び/若しくはTbpB;(c)ExbB、ExbD、rmpM、CtrA、CtrB、CtrD、GalE、LbpA、LpbB、Opa、Opc、PilC、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA、及び/若しくはTbpB;又は(d)CtrA、CtrB、CtrD、FrpB、OpA、OpC、PilC、PorB、SiaD、SynA、SynB、SynX及び/若しくはSynCが挙げられる。
上に述べたとおり、nOMVは、一般に小胞の表面に位置する、少なくとも1つのタンパク質残基によって二官能性リンカーに共有結合的に連結される。この方向において、タンパク質は、1つ以上のアミノ、チオール又はヒドロキシアミノ酸官能基(後者はアルファヒドロキシ基又はカルボキシアミノ酸官能基の一部である)によってリンカーの末端と好ましくは反応する。好ましくは、タンパク質官能基はアミノ基、より好ましくは一級アミン(-NH2)である。これらの官能基は、目的のアミノ酸部分に天然で存在してよく、又はコンジュゲーションの目的のためにさらに人工的に導入されてもよい。
選択されたリンカーがホモ二官能性二価リンカーである場合、リンカーの末端部分とそれぞれ反応するタンパク質官能基及び抗原官能基が好ましくは同じであることは理解されるであろう。例示として、1つ以上のnOMVタンパク質のリシンアミノ酸残基は、対応する-NH2官能基を介してリンカー(例えばBS3)と反応する。同様に、選択された抗原(例えばPfs25)も、該当アミノ(-NH2)基を介してリンカーの残りの遊離末端部分と反応する。注目すべきことに、及び本記載において十分説明されるとおり、反応は実質的な交差反応及び凝集物形成を伴うことなく起こり、それにより比較の実施例8及び8aに示すとおり、dOMVを使用するものとは異なった、非常に信頼できる多用途の方法で、例えば多価ワクチンの調製のために有用な最終産物をもたらす。
好ましいアミノ酸残基として、以下に限定されないが、アルギニン、リシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸又はグルタミン酸、システイン及びヒスチジンが挙げられる。好ましくはnOMVタンパク質は、遊離アミノ基、好ましくは-NH2基を示す1つ以上のアミノ酸成分を有するものである。さらにより好ましくは前記アミノ酸成分は、アルギニン及び/又はリシンであり、それによりさまざまなアルギニン及び/又はリシンタンパク質由来のさまざまな-NH2基が、本発明によるリンカーと選択的に反応できる。
二価リンカーに関する限り、これは、典型的にはある特定の長さの、好適な水溶性及び極性を有し、そのそれぞれの末端によってnOMVタンパク質及び抗原に共有結合できる分子である。選択されたリンカーの溶解度を最適化するために、硫酸、亜硫酸、リン酸などの1つ以上の極性基を導入したり、又はさらにそれらの対応する塩、可能であれば例えばアルカリ又はアルカリ土類金属塩を使用したりすることが好都合である場合がある。本発明の多用途性により、例えば長さ、極性及び立体障害の観点でさまざまなリンカーを使用することが可能であり、それによりnOMVタンパク質残基及び選択された抗原の両方との共有結合を提供する。それにより本発明は、特にそれらの免疫原性及び活性に関して顕著で特異的な挙動を示す、一連の最終nOMV-リンカー-抗原コンジュゲートの調製を可能にする。
リンカーは、ヘテロ二官能性(すなわち、2つの異なる末端官能基を保有している)又は、好ましくはホモ二官能性(すなわち、等しい末端官能基を有する)であってよい。さらにより好ましくはリンカーは、仮想垂直軸に関して対称である。
したがって、本発明による二価リンカーは、一般式(I):
X-L-X'(I)
（式中、
X及びX'は、互いに異なっているか又は同じであり、好ましくはエステル、アミド又はチオエステル成分を形成することによって一方はnOMVタンパク質と及び他方は選択された抗原と選択的に反応できる官能基であり、
-L-は、酸素(-O-)、硫黄(-S-)、窒素(-NH-又は任意選択で置換された-N-基)などから選択される1つ以上のヘテロ原子によって任意選択で置換され、また任意選択で割り込まれている、二価直鎖又は分岐C1～C15アルキル又はアルケニル基である）
を有する。
一実施形態では、-L-は、好ましくは二価直鎖C3～C12アルキル基であり、任意選択で1つ以上の酸素(-O-)ヘテロ原子によって置換又は割り込まれている。さらにより好ましい実施形態では、-L-は、二価直鎖C3～C6アルキル基である。
式(I)によれば、リンカーは、好ましくは同じであってそれにより二価ホモ官能性リンカーを提供する2つの官能基X及びX'を保有する両末端部分を有することにより、さらに特徴付けられる。一実施形態では、X及び/又はX'基は、ヒドロキシ、チオール又はアミノ官能基とそれぞれ組み合わされた場合にエステル、チオエステル又はアミドを形成する任意のものであってよい。
好ましくは、X及び/又はX'は、N-ヒドロキシスクシンイミドエステルコンジュゲートであり、より好ましくは、
Figure 0007165468000002
 (式中、*は、上記で規定した式(I)中で-L-スペーサーと接触するポイントを表す)
のうちの少なくとも1つから選択される。
したがって、さらに好ましい実施形態では、リンカーは、以下：グルタル酸ジスクシンイミジル (DSG)、ジスクシンイミジルスベレート (DSS)、スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート (SPDP)、スクシンイミジル6-(3-[2-ピリジルジチオ]-プロピオンアミド)ヘキサノエート (LC-SPDP)、スルホスクシンイミジル6-(3'-(2-ピリジルジチオ)プロピオンアミド)ヘキサノエート (スルホ-LC-SPDP)、4-スクシンイミジルオキシカルボニル-α-メチル-α-(2-ピリジルジチオ)トルエン (SMPT)、スルホスクシンイミジル-6-[α-メチル-α-(2-ピリジルジチオ)トルエアミデオ(tolueamideo)]ヘキサノエート (スルホ-LC-SMPT)、スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート (SMCC)、スルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート (スルホ-SMCC)、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル (MBS)、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル (スルホ-MBS)、N-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート (SIAB)、スルホスクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート (スルホ-SIAB)、スクシンイミジル4-(N-マレイミドフェニル)ブチレート (SMPB)、スルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドフェニル)ブチレート (スルホ-SMPB)、N-γ-マレイミドブチリル-オキシスクシンイミドエステル (GMBS)、N-γ-マレイミドブチリル-オキシスルホスクシンイミドエステル (スルホ-GMBS)、スクシンイミジル-6-((((4-(ヨードアセチル)アミノ)メチル)シクロヘキサン-1-カルボニル)アミノ)ヘキサノエート (SIACX)、スクシンイミジル6[6-(((ヨードアセチル)アミノ)ヘキサノイル)アミノ]ヘキサノエート (SIAXX)、スクシンイミジル-4-(((ヨードアセチル)アミノ)メチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート (SIAC)、スクシンイミジル6-[(ヨードアセチル)アミノ]ヘキサノエート (SIAX)及びp-ニトロフェニルヨードアセテート (NPIA)、N-ヒドロキシスクシンイミド、Nオキシスクシンイミド及びアジピン酸N-ヒドロキシスクシンイミドジエステル (SIDEA)及びビス(スルホスクシンイミジル)スベレート(BS3 CAS番号82436-77-9)のうちの少なくとも1つから選択される。
一実施形態では、本発明での使用のためのアミンと反応性である追加的な好ましい二官能性リンカーは、ハロゲン化アクリロイル(例えば塩化物)、エチレングリコールビス[スクシンイミジルスクシネート]、ビス(スルホスクシンイミジル)トリ(エチレングリコール)(BS(PEG)3)、ビス(スルホスクシンイミジル)テトラ(エチレングリコール)(BS(PEG)4)、ビス(スルホスクシンイミジル)ペンタ(エチレングリコール)(BS(PEG)5)及びビス(スルホスクシンイミジル)ヘキサ(エチレングリコール)(BS(PEG)6)の少なくとも1つから選択され、ここでビス(スルホスクシンイミジル)ペンタ(エチレングリコール)(BS(PEG)5、CAS番号756526-03-1)は、特に好ましい。
本発明によるnOMVタンパク質及び抗原上のチオール官能基と反応できる好ましいホモ二官能性リンカーは、2-ピリジルジチオ、マレイミド又はヨードアセチル残基のうちの少なくとも1つから選択されるX及びX'を有するものである。
上記で規定したnOMVタンパク質ヒドロキシ基との反応のために好適な他のリンカーは、アジピン酸ジヒドラジド (ADH)、β-プロピオンアミド、ニトロフェニル-エチルアミン、ハロゲン化ハロアシル、6-アミノカプロン酸のうちの少なくとも1つから選択される。
好ましいリンカーは、(BS(PEG)5)、グルタル酸ジスクシンイミジル(DSG)又はその塩、SIDEA及びBS3のうちの少なくとも1つから選択され、BS3は、さらにより好ましい(BS3についての一般的参考文献として、例えば米国特許第4,965,338号を参照されたい)。さらに好ましい実施形態によれば、DSGは、約9のpHで操作される場合に特に有用である。驚くべきことに、コンジュゲーション反応の効率は、(BS(PEG)5)又はBS3が二価リンカーとして使用される場合に、実質的に小胞凝集物の形成を伴わずに、好都合に向上させることができる。この点において、本発明によるBS3の使用が、高分子量凝集物を形成するnOMV表面タンパク質の実質的な交差結合をもたらさず、むしろ一方の末端でnOMVとの、及び他方の末端で選択された抗原との選択的反応をもたらすことは強調されるべきである。この挙動は、実施例8及び例8a(比較、dOMVを使用)が記載される本明細書に含まれる実験パートによってさらに裏付けられる。
有利なことに、任意の適切な抗原は、本発明のnOMV-リンカー-抗原コンジュゲートを得るために、nOMVにコンジュゲートされ得る。いずれの場合でも、1つ以上の選択された抗原の結合は、前記抗原を認識し、nOMV中の1つ以上の構成成分も認識する免疫応答を生じさせることができる免疫原性コンジュゲートを産生し、それにより多価ワクチンを好都合に提供する。抗原は、宿主に投与された場合に、その抗原を認識する免疫応答を惹起するのに十分高い濃度で本コンジュゲート中に含まれる。さらに免疫応答は、好ましくは、抗原が由来した病原体に対して、さらにより好ましくは下に列挙する病原体の1つに対して防御的である。
本発明の一実施形態では、nOMVは少なくとも1つの同種抗原、すなわちnOMVが由来するのと同じ生物由来の抗原、にコンジュゲートされる。さらに好ましい実施形態では、選択された抗原は、異種抗原であり、すなわちnOMVが由来する生物と異なる生物由来の抗原である。
いずれの場合でも抗原は、任意の免疫原性ポリペプチド、すなわち対象に投与された場合に免疫応答を惹起できるポリペプチドから一般に選択され得る。本発明で使用されるポリペプチドは、コンジュゲーションのために好適な官能基、好ましくはアミノ又はチオール基、さらにより好ましくは一般式:-NH2若しくは-SHを有する残基又は側鎖を有するアミノ酸を含む。これらの残基は、抗原に天然で存在していてよく、又はそれらはコンジュゲーションの目的のために人工的に導入されてよい。好ましいアミノ酸残基として、以下に限定されないが、アルギニン、リシン、アスパラギン、グルタミン、システイン及びヒスチジンが挙げられる。コンジュゲーションのために最も好ましいアミノ酸残基は、リシンである。
nOMVにコンジュゲートされるポリペプチド抗原は、実質的に純粋又は実質的に単離された形態(すなわち、他のポリペプチドを実質的に含まない)で好ましくは調製される。それらは、種々の手段、例えば化学合成(少なくとも部分的には)によって、プロテアーゼを使用する長いポリペプチドの消化によって、RNAからの翻訳によって、細胞培養物から(例えば、組換え発現から又は天然培養物から)の精製によってなどによって調製されてよい。大腸菌宿主における組換え発現は、有用な発現経路である。ポリペプチド抗原は、種々の形態(例えば、未変性、融合、グリコシル化、非グリコシル化、脂質付加、ジスルフィド架橋など)であってよい。
本発明で使用されるポリペプチド抗原は、好ましくは少なくとも1kDa、より好ましくは少なくとも3.5kDa、さらにより好ましくは10～80kDaの平均分子量を有する。さらにより好ましくは、平均分子量は15～75kDaを含む。
本発明によるnOMVへのコンジュゲーションのためのさらに好ましいポリペプチド抗原は、真菌性、細菌性、原生動物又はウイルスポリペプチド由来のエピトープを含む。好ましい原生動物ポリペプチドは、マラリア原虫(Plasmodium)(熱帯熱マラリア原虫(P.falciparum)、三日熱マラリア原虫(P.vivax)、卵形マラリア原虫(P.ovale)など)由来である。特に好ましい細菌性ポリペプチドは、大腸菌、N.メニンギティディス及び連鎖球菌属(Streptococci)(S.アガラクチア(S.agalactiae)、肺炎球菌(S.pneumoniae)、化膿連鎖球菌(S.pyogenes)など)から選択される。
好ましい大腸菌ポリペプチド抗原として、CTF1232(配列番号14)、3526(SsIE、配列番号15)及び405(FdeC、配列番号16)が挙げられる。非限定的な好ましい例として、赤痢菌又はサルモネラ由来nOMVは、腸内毒素原性大腸菌(ETEC)及び赤痢菌/サルモネラの両方をカバーする二価ワクチンを生成するために、本発明によりCTF1232、3526又は405にコンジュゲートされてよい。
一実施形態では検討されるN.メニンギティディスポリペプチドは、哺乳動物に投与された場合、髄膜炎菌に対して殺菌性である抗体応答を惹起できる。本発明での使用のために好ましいN.メニンギティディスポリペプチドは、下に詳細に記載されるとおり:NHBA、NadA、NsPA、NhhA、App及びfHbpのうちの少なくとも1つから選択される。
NHBA抗原
NHBA抗原は、遺伝子NMB2132(GenBankアクセッション番号GI:7227388;本明細書では配列番号2)として髄膜炎菌血清群B株MC58に関する公表されたゲノム配列に含まれた。多数の株由来のNHBA抗原の配列が、その後、公表されている。NHBA抗原の種々の免疫原性断片も報告されている。本発明での使用のための好ましいNHBA抗原は、(a)配列番号2に対して50%以上の同一性(例えば60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%以上、例えば100%)を有するか、及び/又は(b)配列番号2の少なくとも「n個」連続したアミノ酸の断片を含み、ここで「n個」が7個以上である(例えば8個、10個、12個、14個、16個、18個、20個、25個、30個、35個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、150個、200個、250個以上)、アミノ酸配列を含む。(b)の好ましい断片は、配列番号2由来のエピトープを含む。本発明の最も有用なNHBA抗原は、対象への投与後に、配列番号2のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合できる抗体を惹起できる。本発明での使用のための有利なNHBA抗原は、対象への投与後に殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起できる。
NadA抗原
NadA抗原は、遺伝子NMB1994(GenBankアクセッション番号GI:7227256;本明細書では配列番号3)として髄膜炎菌血清群B株MC58に関する公表されたゲノム配列に含まれた(例えばTettelin et al. (2000) Science 287:1809-1815を参照されたい)。多数の株由来のNadA抗原の配列が、その後、公表されており、ナイセリアアドヘシンとしてのタンパク質の活性は、十分考証されている。NadAの種々の免疫原性断片も報告されている。本発明での使用のための好ましいNadA抗原は、(a)配列番号3に対して50%以上の同一性(例えば60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%以上、例えば100%)を有するか、及び/又は(b)配列番号3の少なくとも「n個」連続したアミノ酸の断片を含み、ここで「n個」が7個以上である(例えば8個、10個、12個、14個、16個、18個、20個、25個、30個、35個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、150個、200個、250個以上)、アミノ酸配列を含む。(b)の好ましい断片は、配列番号3由来のエピトープを含む。本発明の最も好ましいNadA抗原は、対象への投与後に、配列番号3のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合できる抗体を惹起できる。本発明での使用のための有利なNadA抗原は、対象への投与後に殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起できる。配列番号7は、そのような断片の1つである。
NspA抗原
NspA抗原は、遺伝子NMB0663(GenBankアクセッション番号GI:7225888;本明細書では配列番号4)として髄膜炎菌血清群B株MC58に関する公表されたゲノム配列に含まれた(例えばTettelin et al. (2000) Science 287:1809-1815を参照されたい)。多数の株由来のNspA抗原の配列が、その後、公表されている。NspAの種々の免疫原性断片も報告されている。本発明での使用のための好ましいNspA抗原は、(a)配列番号4に対して50%以上の同一性(例えば60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%以上、例えば100%)を有するか、及び/又は(b)配列番号4の少なくとも「n個」連続したアミノ酸の断片を含み、ここで「n個」が7個以上である(例えば8個、10個、12個、14個、16個、18個、20個、25個、30個、35個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、150個、200個、250個以上)、アミノ酸配列を含む。(b)の好ましい断片は、配列番号4由来のエピトープを含む。本発明の最も好ましいNspA抗原は、対象への投与後に、配列番号4のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合できる抗体を惹起できる。本発明での使用のための有利なNspA抗原は、対象への投与後に殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起できる。
NhhA抗原
NhhA抗原は、遺伝子NMB0992(GenBankアクセッション番号GI:7226232;本明細書では配列番号5)として髄膜炎菌血清群B株MC58に関する公表されたゲノム配列に含まれた(例えばTettelin et al. (2000) Science 287:1809-1815を参照されたい)。多数の株由来のNhhA抗原の配列が、その後、公表されており、例えばWO00/66741及びWO01/55182、NhhAの種々の免疫原性断片が報告されている。Hsfとしても知られている。本発明での使用のための好ましいNhhA抗原は、(a)配列番号5に対して50%以上の同一性(例えば60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%以上、例えば100%)を有するか、及び/又は(b)配列番号5の少なくとも「n個」連続したアミノ酸の断片を含み、ここで「n個」が7個以上である(例えば8個、10個、12個、14個、16個、18個、20個、25個、30個、35個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、150個、200個、250個以上)、アミノ酸配列を含む。(b)の好ましい断片は、配列番号5由来のエピトープを含む。本発明の最も好ましいNhhA抗原は、対象への投与後に、配列番号5のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合できる抗体を惹起できる。本発明での使用のための有利なNhhA抗原は、対象への投与後に殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起できる。
App抗原
App抗原は、遺伝子NMB1985(GenBankアクセッション番号GI:7227246;本明細書では配列番号6)として髄膜炎菌血清群B株MC58に関する公表されたゲノム配列に含まれた(例えばTettelin et al. (2000) Science 287:1809-1815を参照されたい)。多数の株由来のApp抗原の配列が、その後、公表されている。Appの種々の免疫原性断片も報告されている。本発明での使用のための好ましいApp抗原は、(a)配列番号6に対して50%以上の同一性(例えば60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%以上、例えば100%)を有するか、及び/又は(b)配列番号6の少なくとも「n個」連続したアミノ酸の断片を含み、ここで「n個」が7個以上である(例えば8個、10個、12個、14個、16個、18個、20個、25個、30個、35個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、150個、200個、250個以上)、アミノ酸配列を含む。(b)の好ましい断片は、配列番号6由来のエピトープを含む。本発明の最も好ましいApp抗原は、対象への投与後に、配列番号6のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合できる抗体を惹起できる。本発明での使用のための有利なApp抗原は、対象への投与後に殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起できる。
fHbp抗原
H因子結合タンパク質は、3種のバリアント(v1、v2及びv3)として存在し、本発明は、これらのいずれも好ましい実施形態として使用できる。
v1 fHbpは、(a)配列番号8に対して少なくともk'%の同一性を有するアミノ酸配列、及び/又は(b)配列番号8の断片を好ましくは含む。k'は、同一性の百分率を指し、1から100までの任意の数として定められ得る。アミノ酸又は核酸配列に関して、一般に、本出願において使用される同一性は、具体的な参照体に対し、少なくとも40%から始まり、より高い百分率、例えば60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%以上、例えば100%までである。
断片は、配列番号8由来の少なくとも1つのエピトープを好ましくは含む。好ましくはv1 fHbpは、v1株に対して、例えばMC58株(ATCCから「BAA-335」として入手可能である)に対して殺菌性である抗体を惹起できる。
v2 fHbpは、(a)配列番号1に対して少なくともk'%の同一性を有するアミノ酸配列、及び/又は(b)配列番号1の断片を好ましくは含む。「k」及び断片についての情報は上に示されている。断片は、配列番号1由来の少なくとも1つのエピトープを好ましくは含む。好ましくはv2 fHbpは、v2株に対して、例えばM2091 (ATCC 13091)株に対して殺菌性である抗体を惹起できる。
v3 fHbpは、(a)配列番号9に対して少なくともk'%の同一性を有するアミノ酸配列、及び/又は(b)配列番号9の断片を好ましくは含む。「k」及び断片についての情報は上に示されている。断片は、配列番号9由来の少なくとも1つのエピトープを好ましくは含む。好ましくはv3 fHbpは、v3株に対して、例えばM01-240355株に対して殺菌性である抗体を惹起できる。
A群連鎖球菌(Group A Streptococcus)(GAS)、B群連鎖球菌(Group B Streptococcus)(GBS)及び肺炎連鎖球菌属(Pneumococcus)由来の抗原も同等に好ましい。非限定的な例として、GAS25(Slo)、GAS40(SpyAD)及びGAS57(SpyCEP)抗原は、本発明の一部の実施形態によりコンジュゲートに組み込まれてよい。
マラリア原虫抗原は、さらに好ましい。これらは、任意の好適な種由来であってよく、好ましい種は、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫及び卵形マラリア原虫から選択される。
さらに別の好ましい抗原は、寄生生物の接合子及びオーキネート形態の表面に発現される熱帯熱マラリア原虫の有性段階抗原であるPfs25(配列番号10)である。別の好ましい抗原は、伝播阻止ワクチン候補であるPfs48/45である。近年、伝播阻止抗体に関する3個の公知のエピトープを含有している、Pfs48/45のC末端10システイン断片(10C)が、GLURP(RO)、無性血液段階抗原グルタミン酸リッチタンパク質、のN末端部分とのキメラとして作製された。得られた融合タンパク質(RO10C)は、げっ歯類において高レベルの伝播阻止抗体を惹起した(Theisen et al. (2014) Vaccine 32:2623-2630を参照されたい)。Shing et al. (2015) Vaccine 33:1981-1986は、正しくフォールドされたコンフォーマーの収量を増加させる末端切断型6C-断片を含有するキメラについて記載している。RO6C構築物は、ラットにおいて高力価伝播阻止抗体を惹起できた。RO6C(配列番号11)は、本発明によりコンジュゲートされ得る好ましい抗原である。
別の好ましい抗原は、スポロゾイト周囲タンパク質(CSP;配列番号12)である。
CSP由来のより短いペプチドも、本発明によりコンジュゲートされてよい。例えば、CSP由来の12アミノ酸(NANP)3ペプチド(配列番号13)は、好ましい実施形態で使用され得る。
さらに別の好ましい実施形態では、抗原は糖類種である。実際に本発明は、1つ以上の選択された糖抗原をnOMVにコンジュゲートするためにも好適であり、それにより糖は、それらの全長天然形態で使用され得る。代替として、特定のサイズの画分も有利に選択され得る。したがって糖は、それらの天然の長さから断片化されてもよく、任意選択でこれらの断片のサイズ画分が使用されてもよい。さらに糖は、天然原料から精製された糖に限定されず、合成又は半合成糖が代わりに使用されてよい。本発明により使用される多糖抗原は、二価リンカーとの反応を可能にするために一般に官能基化されている。それにより、一実施形態では、抗原が多糖である場合、本発明は、前記抗原のアノマーヒドロキシ基のアルデヒドへの酸化を含み、例えばNaIO4及びNaBH4を当技術分野において公知の手順により使用する、アミノ基への還元的アミノ化変換を続いて行う。このように多糖抗原は、nOMV-リンカー-抗原コンジュゲートを生じるようにnOMVに既に結合されたリンカーの末端部分との反応のために好適な-NH2基を示す。
好ましい糖抗原は、細菌性莢膜糖(CPS)である。これらとして、以下に限定されないが、インフルエンザ菌B型;ナイセリア・メニンギティディス血清群A、C、W135、X及びY、ここで血清群A及びCは特に好ましい;肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及び33F; チフス菌(Salmonella enterica serovar Typhi)を含むサルモネラのVi、全長又は断片(fViと示される)のいずれか;ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)血清型Ia、Ib及びIII;化膿連鎖球菌、赤痢菌種、の少なくとも1つから選択される莢膜糖が挙げられる。
好ましい実施形態では、nOMVは、髄膜炎菌由来、好ましくは血清群B株から調製された、GMMAであり、選択された抗原は、ナイセリア・メニンギティディス血清群A又はC由来莢膜糖であり、さらにより好ましくはSIDEAリンカーを介してGMMAにコンジュゲートされている。
いずれの場合でも、及び上に述べたとおり選択された抗原は、同じ又は異なる細菌株由来のnOMVにコンジュゲートされてよく、それにより多価ワクチンを提供する。これに関して、本発明のより好ましい実施形態では、nOMV及び糖抗原は、異なる細菌株由来である。
他の好ましい糖抗原は、βグルカンであり、C.アルビカンス(C.albicans)に対する防御のために特に有用である(一般的参考文献として、Sandlin et al. (1995) Infect. Immun., 63:229-37を参照されたい)。
他の好ましい糖抗原は、A群連鎖球菌(GAS)に対する防御のためのポリラムノースオリゴ糖である。未変性のGAS糖は、NAcGlcNで置換されたポリラムノース骨格を有する。ポリラムノースの合成オリゴ糖、又は未変性のGAS糖の構造を有するオリゴマーを、本発明によりnOMVにコンジュゲートしてもよい。
本発明のコンジュゲートは、マウスにおける研究によって実証され、本明細書に含まれる実験パートによって裏付けられるとおり、免疫原性である。
上に記載されたとおり、さらなる態様では、本発明は、本明細書の下記でより詳細に記載されるとおり、nOMV-リンカー-抗原コンジュゲートを調製するための方法であって、少なくともnOMVタンパク質残基と二価リンカーの第1の末端部分との反応と、それに続くそのようなリンカーの第2の末端部分と選択された外来性抗原との反応を含む、方法に言及する。
したがって一実施形態によれば、本発明は、nOMV-リンカー-抗原コンジュゲートの調製のための方法であって、
(i)nOMV表面上の少なくとも1つのタンパク質を二価リンカーと反応させて、nOMV-リンカー中間体を形成するステップ、及び
(ii)そのように得られたnOMV-リンカー中間体を、少なくとも外来性抗原と反応させて、本発明のnOMV-リンカー-抗原コンジュゲートを形成するステップ
を含む、方法に言及する。
一実施形態によれば、nOMVは例えば選択されたリンカー又はコンジュゲーション条件に応じて、5から9まで、好ましくは5から7まで、又は7から9までのpHを選択するために、MES(2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸)緩衝液、ホウ酸緩衝液又はPBS(リン酸緩衝生理食塩水)などの適切な緩衝液に最初に懸濁される。同じpH範囲は、本明細書の下記で詳細に記載されるとおり、リンカーの遊離末端と選択された抗原との間の反応のために、ステップii)についても使用される。
ステップi)後にnOMV官能基化の割合は、使用される二価リンカーの種類に主に依存して、15%～60%である。これに関して、リンカーの遊離末端での反応性官能基の%は、前記反応官能基の種類及び安定性に応じて15%～40%、好ましくは30%～35%である。実際に、そのような範囲は、工程の実施有効性を可能にし、それによりさらに多量の本発明の最終抗原コンジュゲートをもたらすことは、注目される。
それにより得られた緩衝化懸濁物は、2～10mg/mL、好ましくは3～6mg/mLのnOMV濃度を有する。選択されたリンカーは、例えばnOMV上の-NH2基に応じて、好ましくは過剰量で、さらにより好ましくは-NH2の1モルあたり10～20等量の量で一般に添加される。
リンカーに応じて、取扱及び有効性を促進するため、すなわち全体収率及び再現性の観点から結果を改善するために、DMSOなどの極性乾燥溶媒に予防的に溶解することは好都合であり得る。
次に混合物は、室温(例えば約15～40℃)で一定時間、一般に30分間～4時間インキュベートされる。続いてそのように得られたnOMV-リンカー中間体は、例えば超遠心分離法によって精製され、次にステップii)により選択された抗原と反応させる。抗原は、リン酸緩衝生理食塩水などの適切な緩衝液に一般に溶解される。抗原は、nOMV-リンカー中間体に対して好ましくは2:1～1:2のw/w比の範囲、又はより好ましくは1:1比の量で加えられる。反応は、例えばHPLC/SECによってモニターでき、最終産物形成は、SDS page/ウエスタンブロット分析によって確認され得る。
代替的実施形態としてコンジュゲーション反応は、i)抗原をリンカーと反応させて、抗原-リンカー中間体を形成するステップ、及び(ii)そのように形成された抗原-リンカー中間体を、nOMV上の少なくとも1つのタンパク質と反応させて、nOMV-リンカー-抗原コンジュゲートを形成するステップを含む。
別の選択肢として、コンジュゲーション反応は、(i)抗原を第1のリンカーと反応させて、抗原-リンカー中間体を形成するステップ、(ii)nOMV上の少なくとも1つのタンパク質を第2のリンカーと反応させて、nOMV-リンカー中間体を形成するステップ、及び(iii)抗原-リンカーをnOMV-リンカーと反応させて、nOMV-リンカー-抗原コンジュゲートを形成するステップを含む。
当業者は、ホモ二官能性リンカーが使用される場合、上に詳細に説明されるとおり反応に関与するタンパク質及び抗原官能基が同じ化学的実体であることを理解する。
したがって好ましい一実施形態により、本発明の方法は、
(i)少なくともnOMVタンパク質の-NH2基と二価ホモ二官能性リンカーとを反応させて、nOMV-リンカー中間体を形成するステップ、及び
(ii)前記中間体と選択された外来性抗原上の-NH2基とを反応させて、本発明のnOMV-リンカー-抗原コンジュゲートを形成するステップ
を含む。
この種のコンジュゲーション反応は、例示的に、GMMAを未変性小胞として、BS3をリンカーとして使用して、下のスキーム2に説明される。
Figure 0007165468000003
リンカーがnOMVの表面上のタンパク質と反応し、抗原が異なる官能基を含む場合(小胞上のタンパク質上にアミン及び抗原上にチオールなど、又はその逆)、上記の一般式(I)のX-L-X'(式中X及びX'は上記で規定したとおり互いに異なり、Lは上記で規定した成分である)のヘテロ二官能性リンカーを使用することは好ましい。X基は、1つの官能基、例えばnOMVタンパク質上のアミンと反応でき、一方X'基は、異なる官能基、例えば選択された抗原上のチオールと反応できる。好ましくはX基はN-ヒドロキシスクシンイミド又はN-オキシスクシンイミドであり、一方X'基は、2-ピリジルジチオ、マレイミド又はヨードアセチル基のうちの少なくとも1つから選択される。
本発明の代替的コンジュゲーション方法は、抗原を第1のリンカーと、及び小胞上のタンパク質を第2のリンカーと反応させ、次に第1の及び第2のリンカーを一緒に反応させて、コンジュゲートを形成することを含む。
例示として、抗原又はnOMV上のタンパク質のいずれかは、マレイミド基で終結しているリンカーと反応させてもよく、例えば、一級アミン又は抗原若しくはnOMV上のタンパク質のいずれかをスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(SMCC)又はN-(γ-マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミドエステル(GMBS)と反応させることによりそのようにしてもよい。抗原又はnOMV上のタンパク質上のチオールを、次にマレイミドと反応させ得る。チオールは、nOMV上のタンパク質若しくは抗原にとって天然のものであってよく、又はチオールはnOMV上のタンパク質若しくは抗原を別のリンカーと反応させた結果であってもよい。この種のコンジュゲーション反応は、例示的に、GMMA及びfHbpを抗原として使用して下のスキーム3に説明される。
Figure 0007165468000004
有利なことに、その多用途性により、本発明は、種々のコンジュゲートの調製のために使用することができ、免疫原性コンジュゲートを得るための簡便で信頼できる方法を見出す課題に直面した場合に、当業者によって特に認められる。
さらなる代替として、小胞上のタンパク質は、実施例6に例示されるとおり、(i)アルキンを含むように小胞タンパク質を改変すること、(ii)アジドを含むように抗原を改変すること、次に(iii)アルキンとアジドとを反応させること(「クリック化学」として知られる)によって抗原に連結され得る。代替的に抗原は、アルキンを含むように改変されてよく、小胞はアジドを含むように改変されてよい。この種のコンジュゲーション反応は、例示的に、GMMAを小胞として、及びfHbpを抗原として使用し、銅不含有クリック化学を使用して下のスキーム4に説明される。
Figure 0007165468000005
本発明は、選択された小胞の表面上に異なる抗原の多価提示を可能にする、種々に官能基化されたnOMVの調製のためにも有用である。
したがって、好ましい実施形態により、本発明は、上に記載されるnOMVを含み、二価リンカーを介して第1の抗原に結合された少なくともタンパク質成分を有する免疫原性コンジュゲートに言及し、ここで前記第1の抗原は、第2の異なる抗原に結合されている。この方向において、2つの選択された抗原(本明細書においてAg1及びAg2として示される)は、抗原であり得る。この方向において、2つの選択された抗原(本明細書においてAg1及びAg2として示される)は、抗原1-抗原2誘導体(Ag1-Ag2)をもたらすように一つに結合してもよく、次に、上に記載される好適な二価リンカーによって、選択されたnOMV表面タンパク質成分に結合し、一般式(I):
nOMV-リンカー-Ag1-Ag2 (I)
によって示されるコンジュゲートをもたらすことができる。
代替的に、nOMVタンパク質残基は、上に記載されるリンカーを介して、選択されたAg1に最初に結合し、次に第2のAg2を前記Ag1残基にさらに結合して、上記の一般式(I)のコンジュゲートをもたらすことができる。
いずれの場合でも、好ましいnOMVは、GMMA小胞である。式(I)におけるAg1及びAg2は、上に記載の好ましい抗原から選択されてよく、タンパク質又は多糖成分のいずれかである。好ましくは、本明細書において意図される多官能基化のために使用される抗原は、両方ともタンパク質若しくは両方とも多糖である。
さらなる実施形態により、本発明は、一般式(II):
Ag1-リンカー-nOMV-リンカー-Ag2(II)
によって示されるコンジュゲートをもたらすように、二価リンカーによって第1の抗原(Ag1)に結合された少なくとも表面タンパク質成分、及び二価リンカーによって第2の異なる抗原(Ag2)に結合された少なくとも別の表面タンパク質成分を有するnOMVを含む免疫原性コンジュゲートに言及する。
式(II)において示されるとおり、Ag1及びAg2は、好適なリンカーを介してnOMVにそれぞれ個々に結合される。この方向において、Ag1又はAg2へのnOMVタンパク質の結合のためのリンカーは、独立に同じ又は互いに異なっていてよい。
式(II)のコンジュゲートは、特定の官能基化パターンを使用することによってnOMV、好ましくはGMMAの選択的多官能基化を有利に提供できる。式(II)におけるAg1及びAg2は、上に記載の好ましい抗原から選択されてよく、タンパク質又は多糖成分のいずれかである。好ましくは、本明細書において意図される多官能基化のために使用される抗原は、両方ともタンパク質若しくは両方とも多糖である。
したがってより好ましい実施形態によれば、本発明は、式(II)のコンジュゲートに言及し、式中、Ag1は、ナイセリア・メニンギティディス(Nesseria mengitidis)血清群A(MenA)の莢膜糖を含み、Ag2はナイセリア・メニンギティディス血清群C(MenC)の莢膜糖を含み、さらにより好ましくは、GMMA小胞であるnOMVであって、より好ましくはナイセリア・メニンギティディス血清群B、さらにより好ましくはfHbp v2及びv3を発現するナイセリア・メニンギティディス血清群Bから得られたnOMVを有する。
さらにより好ましくは、それぞれAg1及びAg2に、好ましくはMenA及びMenCにそれぞれに結合された2つのリンカーは、同じものであり、より好ましくはSIDEAである。この点において得られた多官能基化GMMAは、本願実験パートにおいて得られたSBAデータによって裏付けられるとおり、MenB、MenA又はMenC由来のナイセリア属細菌に対する免疫原性物質として使用され得る。
一実施形態では、前記コンジュゲートは、上に記載される本手順により活性化MenA及びMenC多糖の混合物をGMMAに加えることを含む方法によって調製される。MenA及びMenC多糖は、SIDEAを用いる反応によって好ましくは活性化され、それにより好適なSIDEA-MenA及びSIDEA-MenC誘導体を提供し、SIDEA成分の末端部分を通じてnOMVタンパク質の-NH2基と反応でき、それにより上記の一般式(II)のコンジュゲートをもたらす。
ウエスタンブロット及びHPAEC-PAD分析は、コンジュゲートの形成を確認し、その際、MenA及びMenC糖はリンカーを介してGMMA表面タンパク質に無作為に結合されており、nOMVの凝集はdlsによって検出されない。
当業者は、提案された技術の多用途性に照らして、本発明が、nOMV、好ましくはGMMAの、2つより多い異なる抗原さえも用いた、多官能基化のために好適に使用され得ることを認識する。上に示されるとおり異なる抗原を選択する可能性に加えて、本発明は、異なる抗原の異なる量の導入も可能にし、それにより、例えば選択された抗原又は使用されるnOMVに対する抗原/nOMV比を調節する。
したがって追加的実施形態により、本発明は、一般式(II)のコンジュゲートに言及し、式中、Ag1はHibを含み、Ag2はHiaを含み、前記Ag1及びAg2は、GMMA、好ましくは百日咳GMMAにそれぞれ個々に、さらにより好ましくはBS3リンカーによってコンジュゲートされる。さらなる追加的実施形態では、本発明は、一般式(II)のコンジュゲートに言及し、式中、Ag1はETEC 405(FdeC、配列番号16)を含み、Ag2はETEC3526(SsIE、配列番号15)を含み、前記Ag1及びAg2は、GMMA、好ましくはソンネ菌(Shigella sonnei)GMMAに互いに独立に、さらにより好ましくはBS3リンカーによって、コンジュゲートされる。
さらなる態様では、本発明は、医薬としての、具体的には免疫原性物質として、さらにより好ましくは本明細書に示される病原体の1つ以上に対する使用のための、本発明のコンジュゲートに言及する。言い換えると、本発明は、免疫原性組成物の製造のための本コンジュゲートの使用に言及する。
さらなる態様では、本発明は、本発明のコンジュゲート及び少なくとも1つの追加的な薬学的に許容される担体、賦形剤又はアジュバントを含む免疫原性組成物、好ましくはワクチンに言及する。一般に、薬学的に許容される担体、賦形剤又はアジュバントは、組成物を投与されている患者に有害な抗体の産生をそれ自体は誘導せず、投与され得る任意の物質であってよい。薬学的に許容される担体及び賦形剤は、当技術分野において使用されるものであり、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体が挙げられる。湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝物質などの補助物質も、先行技術によるそのようなビヒクル中に存在してよい。
本発明は、本発明のコンジュゲートを哺乳動物又は他の脊椎動物に投与することを含む、脊椎動物、好ましくは哺乳動物において免疫応答を生じさせる方法も提供する。本発明は、そのような方法における使用のための本発明のコンジュゲートも提供する。免疫応答は、好ましくは防御的であり、好ましくは抗体を含む。方法は、追加免疫(booster)応答を生じ得る。
哺乳動物は、好ましくはヒトである。疾患が予防される対象は、本発明のコンジュゲートが投与される対象と同じでない場合がある。例えば、コンジュゲートは、子孫を防御するために雌(妊娠前又は妊娠中)に投与されてよい(いわゆる「母子免疫」)。本発明のコンジュゲートは、他の哺乳動物、例えばウシ、ヒツジ及びブタ(特にサルモネラ属種に対して)並びに魚及び家禽を含む他の非哺乳動物脊椎動物を免疫するためにも使用され得る。
本発明は、治療における使用のための本発明のコンジュゲート(例えば、免疫原性組成物として又はワクチンとして)を提供する。本発明は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物において免疫応答を生じさせるための方法に使用するための本発明のコンジュゲートも提供する。本発明は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物において免疫応答を生じさせるための医薬の製造における本発明のコンジュゲートの使用も提供する。使用及び方法は、上に記載されたコンジュゲート中の抗原及びnOMVに応じて、種々の疾患を予防/治療するために特に有用である。本発明の好ましいコンジュゲートは、ヒト対象の許容される割合に対して、各抗原成分についての抗体保有率に関する判定基準を上回る抗体力価を患者に付与できる。それを超えると宿主が抗原に対して抗体陽転したと考えられる関連抗体力価を有する抗原は、周知であり、そのような力価は、WHOなどの組織によって公表されている。対象の統計的に有意な試料の好ましくは80%超、より好ましく90%超、さらにより好ましくは93%超、最も好ましくは96～100%が、抗体陽転する。
本発明の免疫原性組成物は、一般に、患者に直接投与される。直接送達は、非経口注射(例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内若しくは組織の間質腔への)によって、又は直腸内、経口、経膣、局所、経皮的、鼻腔内、眼内、耳内、肺内又は他の粘膜内投与によって達成され得る。筋肉内投与は、例えば大腿又は上腕に対するものが好ましい。注射は、針(例えば、皮下針)を介してよいが、無針注射を代替的に使用してもよい。本発明は、全身免疫及び/又は粘膜免疫を惹起するために使用されてよい。投薬治療は、単回投薬スケジュール又は複数回投薬スケジュールであってよい。複数投薬は、初回免疫スケジュール及び/又は追加免疫スケジュールにおいて使用されてよい。初回投薬スケジュールの後に追加投薬スケジュールを行ってもよい。各初回免疫投薬の間(例えば、4～16週間の間)、及び初回免疫と追加免疫との間の好適なタイミングは、日常的に決定され得る。
感染は身体の種々の領域を冒し、そのため本発明の組成物は、種々の形態で調製されてよい。例えば組成物は、液体溶液又は懸濁液のいずれかで注射可能として調製されてよい。注射前の液体ビヒクルへの溶解又は懸濁に好適な固体形態も調製されてよい。組成物は、例えば軟膏、クリーム又は粉剤として局所投与用に調製されてよい。組成物は、例えば、錠剤若しくはカプセルとして、又はシロップ(任意選択で風味付けられる)として経口投与のために調製されてよい。組成物は、例えば微粉末又はスプレーを使用する吸入剤として肺への投与のために調製されてよい。組成物は、座薬又は膣座薬として調製されてよい。組成物は、例えば滴下剤として経鼻、耳又は眼への投与のために調製されてよい。非経口注射のために好適な組成物は、最も好ましい。組成物は、好ましくは滅菌されている。それは、好ましくは発熱物質不含有である。それは、例えばpH6からpH8の間で、一般におおよそpH7で好ましくは緩衝化される。本発明の組成物は、ヒトに対して等張性であってよい。免疫原性組成物は、本発明のコンジュゲートの免疫学的有効量、及び必要に応じて他の特定の構成成分のいずれかを含む。投薬治療は、単回投薬スケジュール又は複数回投薬スケジュール(例えば追加免疫投薬を含む)であってよい。組成物は、他の免疫調節剤と組み合わせて投与されてよい。
本発明の組成物において任意選択で使用され得るアジュバントとして、以下に限定されないが、不溶性金属塩、水中油型乳液(例えばMF59若しくはAS03、両方ともスクアレンを含有している)、サポニン、LPSの無毒性コンジュゲート(モノホスホリルリピドA若しくは3-O-脱アシル化MPLなど)、免疫賦活性オリゴヌクレオチド、解毒化細菌性ADP-リボシル化毒素、微小粒子、リポソーム、イミダゾキノロン又はその混合物が挙げられる。免疫賦活剤として作用する他の物質は、例えばWatson, Pediatr. Infect. Dis. J. (2000) 19:331-332において開示されている。水酸化アルミニウム及び/又はリン酸アルミニウムアジュバントの使用は、特に好ましい。これらの塩として、オキシ水酸化物及び水酸化リン酸が挙げられる。塩は、任意の好適な形態(例えばゲル、結晶、アモルファスなど)を取っていてよい。
1つの病原体由来のnOMV及び第2の病原体由来の選択された抗原を含む本発明のコンジュゲートは、多価ワクチンの調製のための免疫原性化合物として有用であり得る。
本発明の好ましいnOMV-リンカー-抗原コンジュゲートは、次の表1に示されている。
Figure 0007165468000006
したがって本コンジュゲートは、表1に列挙される病原体に対する免疫原性物質として特に有用である。特に、データは、MenA及び/又はMenC由来の莢膜糖にコンジュゲートされたMenB由来のGMMAが担体タンパク質としてCRM197を使用して得られたものに匹敵するか又は良好でさえあるr/hSBA結果を示すことを確認した。SBAデータは、実際、MenA及びMenCに対する並びにMenBに対する免疫原性応答を確認している(特に、実施例12、13及び14を参照されたい)。
これは、本コンジュゲートを、本明細書に記載され、詳細に裏付けられているとおり、例えば、以下に限定されないがMenB及びMenC並びに/又はMenAに対する、多価免疫原性組成物又はワクチンの調製のために好適に使用できることを意味している。
本発明は、その範囲にいかなる限定も課すことなく、以下の実験パートによって説明される。
実験パート
実施例1
nOMV産生
実施例において用いられるnOMVは、例えばClin Vaccine Immunol. 2016 Apr; 23(4): 304-314に開示されるとおり、ネズミチフス菌又はN.メニンギティディスB株から調製された、GMMA小胞である。前記nOMVの特徴は、次の表2に示されている。
Figure 0007165468000007
実施例2
BS3リンカーを介したnOMVコンジュゲーション(Pfs25-ネズミチフス菌nOMVコンジュゲーション)
マラリア抗原Pfs25を下に記載される手順に従ってネズミチフス菌nOMV小胞にコンジュゲートした。100mMホウ酸緩衝液pH9中タンパク質濃度4mg/mLのnOMVに、BS3リンカー(反応混合物中48mg/mL)を加えた。混合物を25℃の制御温度で30分間、インキュベートした。この後、活性化nOMVを超遠心(110000rpm、16分間、4℃)によって精製し、Pfs25抗原を直ちに加えた。コンジュゲーションステップでは、1:1比のnOMV:Pfs25をPBS中Pfs25濃度2.7mg/mlで、室温での一晩インキュベーションに使用した。コンジュゲートを超遠心(110000rpm、16分間、4℃)によって精製し、PBS中に再懸濁した。SDS page/ウエスタンブロット分析による特徴付けにより、コンジュゲート形成が確認された。競合的ELISAによる分析は、最終コンジュゲートにおいて全タンパク質に対するPfs25のw/w比として19.2%を示した。中間体活性化nOMVは、62%のNH2基がリンカーで誘導体化され、及びnOMV上のNH2基の32%に活性エステル基が導入されたことによって特徴付けられた。dlsによって検証されたとおり、BS3を用いるnOMV活性化及び続くコンジュゲーションの両方のステップにおいて交差結合(crosslinking)は確認されなかった。
実施例3
BS3化学(リサイクルfHbp)によってネズミチフス菌nOMVに連結されたfHbp v2
fHbp v2抗原をBS3化学によってネズミチフス菌nOMVにコンジュゲートした。その反応は、nOMV-BS3に対するfHbpのw/w比1、PBS中0.92mg/mLのfHbp v2濃度を用いた実施によって行った。さらなるコンジュゲートは、第1のコンジュゲーションバッチから未反応fHbp v2をリサイクルし、nOMV-BS3の新鮮バッチを用いるコンジュゲーションのためにそれを再使用し、同じコンジュゲーション条件を使用することによって作製した。SDS PAGEウエスタンブロット分析は、リサイクルされたfHbp v2も用いてコンジュゲート形成を確認した。
実施例4
本発明によるSH-マレイミド化学によってネズミチフス菌nOMVに連結されたCSP及び(NANP)3-SH
実施例4.1: N-ε-マレイミドカプロイル-オキシスクシンイミドエステル(EMCS)リンカーを用いるCSP誘導体化
PBS中270μg/mLの濃度のCSPに、EMCSリンカー(DMSO中10mg/mL溶液として)をリンカーとタンパク質のLys残基とのモル比が1:1になるように加えた。溶液を室温で4時間混合し、次に誘導体化タンパク質を10mM MES pH6に対してPD10カラムによって精製した。得られた産物をマイクロBCAによって特徴付けた(64%回収)。
実施例4.2: SHリンカーによるネズミチフス菌nOMVの誘導体化
nOMVを100mMホウ酸緩衝液pH8に再懸濁し、100mMホウ酸緩衝液pH11中に2.6mg/mL DTT、13.16mg/mL EDTA及び7.04mg/mL N-アセチル-DL-ホモシステインチオラクトンリンカーを含有する活性化緩衝液を加えた。nOMVは2.3mg/mLであり、GMMA上のNH2基に対するリンカーのモル比は7に等しかった。nOMV-SHを超遠心(110000rpm、4℃、1時間)によって精製し、100mM MES緩衝液pH6中に回収した。nOMV-SHをマイクロBCAによって(80%タンパク質回収)及びTNBSによって特徴付けたところ、NH2基の54%が活性化されたことが示された。
実施例4.3: EMCSリンカーによるネズミチフス菌nOMVの誘導体化
nOMVを100mM NaPi pH7.2に再懸濁し、それにEMCSリンカー(DMSO中20mg/mL溶液として)をリンカーとタンパク質のLys残基とのモル比が0.6:1となり、nOMV濃度が3.94mg/mLとなるように加えた。その反応物を、室温で4時間混合し続け、nOMV-EMCSを超遠心(110000rpm、4℃、1時間)によって精製した。誘導体化nOMVを100mM MES緩衝液pH6中に回収した。nOMV-EMCSを、活性化NH2基の割合(30%)を評価するためにマイクロBCA(87%タンパク質回収)及びTNBS及びエルマン比色分析法によって特徴付けた。
実施例4.4 CSP-EMCSによるnOMV-SHのコンジュゲーション
EMCSリンカーにより予め誘導体化したCSPタンパク質を、nOMV-SHにコンジュゲートした。コンジュゲーションは、100mM MES pH6中96.7μg/mLのCSP濃度で、nOMVとCSPとの比1:1 w/wで実施した。反応物を室温で4時間混合し続け、コンジュゲートを超遠心(110000rpm、4℃、1時間)によって精製し、PBS中に回収した。全タンパク質含有量に対するコンジュゲート化CSPの量は、コンジュゲーション混合物のHPLC-SEC分析によって評価されて0.33(w/w)であった。SDS PAGE/ウエスタンブロット分析により、コンジュゲート形成が確認された。
実施例4.5: (NANP)3-SHによるnOMV-EMCSのコンジュゲーション
末端Cys残基を有する(NANP)3-SHタンパク質を、MES 100mM pH6中のnOMV-EMCSに、8.7mg/mLの濃度で、nOMVに対して1のw/w比で加えた。反応物を室温で4時間混合し続け、コンジュゲートを超遠心(110000rpm、4℃、1時間)によって精製し、PBS中に回収した。全タンパク質含有量に対するコンジュゲート化(NANP)3の量は、コンジュゲート上のエルマン及びHPAEC-PAD分析による算出で0.31(w/w)であった。SDS PAGE/ウエスタンブロット分析は、コンジュゲート形成を確認した。
実施例5
マウスにおける実施例4のコンジュゲートの免疫原性
マウスを実施例4に従って調製したnOMV-CSP及びnOMV-(NANP)3コンジュゲートによって0及び28日目に皮下免疫した。用量あたり2μg CSP又は(NANP)3の物理的混合物nOMV+CSPと、比較した。抗CSP IgG力価を0、14、28及び42日目に測定し、結果を図1Aに示す。
両方のnOMVコンジュゲートは、nOMVと物理的に混合されたCSPよりも高い抗CSP特異的応答を誘導した(ダンの事後分析を用いるクラスカル-ウォリス検定、それぞれ42日目にnOMV-CSPについてp=0.002及びnOMV-(NANP)3についてp=0.001)。
両方のコンジュゲートは、応答をブーストする能力を示した(14日目～42日目)。
-OAgに対するIgG力価も評価した。nOMV表面上のCSP又は(NANP)3の存在は、特異的抗OAg IgG応答を誘導するnOMVの能力に影響を与えなかった(図1B)。
実施例6
SH-マレイミド又はクリック化学によってネズミチフス菌nOMVに連結されたfHbp v1.1
実施例6.1:SHリンカーによるネズミチフス菌nOMV誘導体化
nOMVを100mMホウ酸緩衝液pH8に懸濁し、100mMホウ酸緩衝液pH11中に2.6mg/mL DTT、13.16mg/mL EDTA及び7.04mg/mL N-アセチル-DL-ホモシステインチオラクトンリンカーを含有する活性化緩衝液を加えた。nOMVは3.0mg/mLであり、nOMV上のNH2基に対するリンカーのモル比は6.63に等しかった。反応物を、室温で4時間混合し続け、次にnOMV-SHを50mM MES 0.5mM DTT緩衝液pH6に対する透析によって精製した。nOMV-SHをローリーによって(75%タンパク質回収)及びTNBSによって特徴付けたところ、NH2基の41%が活性化されたことが示された。
実施例6.2: N-ε-マレイミドカプロイル-オキシスクシンイミドエステル(EMCS)リンカーによるfHbp v1.1誘導体化
PBS中1.25mg/mLの濃度のfHbpにEMCSリンカー(DMSO中10mg/mL溶液として)を、リンカーとタンパク質のLys残基とのモル比が0.2:1になるように加えた。溶液を室温で4.5時間混合し、次に誘導体化されたタンパク質を10mM MES pH6に対してPD10カラムによって精製した。得られた産物をマイクロBCAによって(95%回収)、HPLC-SEC及びSDS-PAGEによって特徴付けたところ、非誘導体化タンパク質に関してタンパク質凝集は示されず、MALDI-MSはタンパク質1分子あたりに平均3個のリンカーが導入されたことが示された。
実施例6.3: fHbp-EMCSによりnOMV-SHのコンジュゲーション
fHbp-EMCSをnOMV-SHにコンジュゲートした。コンジュゲーションは、fHbp濃度2mg/mLでnOMVとfHbpとのw/w比 2:1で実施した。反応物を室温で5時間混合し続け、コンジュゲートをPBSに対してVivaspin 100kによって精製した。コンジュゲート形成をSDS page/ウエスタンブロット分析によって確認した。
実施例6.4: アルキンリンカーによるネズミチフス菌nOMV誘導体化
nOMVを100mM NaPi pH7.2中に懸濁し、DMSO中のclick-easy BCN N-ヒドロキシスクシンイミドエステルI(Berry Associates)リンカー25mg/mLを加えた。nOMVは8.9mg/mLであり、GMMA上のNH2基に対するリンカーのモル比は0.6に等しかった。反応物を、室温で4時間混合し続け、次にnOMV-アルキンをNaPi 100mM pH7.2に対する透析によって精製した。nOMV-アルキンをローリーによって(72%タンパク質回収)及びTNBSによって特徴付けたところ、NH2基の40%が活性化されたことが示された。
実施例6.5: NHS-PEG4-N3リンカーによるfHbp v1.1の誘導体化
PBS中1.25mg/mLの濃度のfHbpに-N3リンカー(DMSO中25mg/mL溶液として)を、リンカーとタンパク質のLys残基とのモル比0.2:1になるように加えた。溶液を室温で6時間混合し、次に誘導体化タンパク質をNaPi 10mM pH7.2に対してPD10カラムによって精製した。得られた産物をマイクロBCAによって(87%回収)、HPLC-SEC及びSDS-PAGEによって特徴付けたところ、非誘導体化タンパク質に関してタンパク質凝集は示されず、MALDI-MSはタンパク質1分子あたりに平均2個のリンカーが導入されたことが示された。
実施例6.6: nOMV-アルキンとfHbp-N3とのコンジュゲーション
fHbp-N3をnOMV-アルキンにコンジュゲートした。コンジュゲーションは、1.67mg/mLのfHbp濃度でnOMVとfHbpとのw/w比 2:1で実施した。反応物を室温で5時間混合し続け、コンジュゲートをPBSに対してVivaspin 100kによって精製した。コンジュゲート形成をSDS page/ウエスタンブロット分析によって確認した。
実施例7
実施例6で得られたコンジュゲートのマウスにおける免疫原性
マウスを合成コンジュゲートを用いて0及び28日目に皮下免疫し、fHbp単独、nOMV単独及びnOMVと物理的に混合したfHbpと比較した。用量あたり2.5μgの全タンパク質(1.75μg nOMV及び0.75μg fHbp、コンジュゲート中の全タンパク質に対するfHbpのw/w比は0.3と推定される)を使用した。すべての抗原は、アルヒドロゲル(Alhydrogel) 0.7mg/mL Al3+及び10mMヒスチジンを用いて製剤化した。
コンジュゲートによって誘導された抗体は、組換えfHbp単独又はnOMVと物理的に混合した組換えfHbpと比較してより高い殺菌活性を有し、さまざまな髄膜炎菌株に対する幅広い防御を示した(表3)。コンジュゲート由来の血清も侵襲性マラウイ臨床単離D23580ネズミチフス菌株に対する殺菌性を生じ、誘導された抗OAg IgG応答に関してnOMV単独に劣らなかった(表3)。
Figure 0007165468000008
実施例8
BS3化学によってfHbp-SH v3タンパク質にコンジュゲートされたMenB nOMV(コンジュゲーション後の凝集形成なし)
100mM MES緩衝液pH6中タンパク質濃度2.8mg/mLのMenB nOMVに、BS3リンカー(反応混合物中50mg/mL)を加えた。混合物を25℃の制御温度で30分間、インキュベートした。この後、活性化nOMVを超遠心(110000rpm、16分間、4℃)によって精製し、fHbp-SH v3を直ちに加えた。コンジュゲーションステップでは、w/w比1:1のnOMVとfHbp-SHとをPBS中nOMV濃度1.7mg/mlで使用した。室温で一晩混合した後、コンジュゲートを超遠心(110000rpm、16分間、4℃)によって精製し、PBS中に回収した。SDS page/ウエスタンブロットによる特徴付けにより、コンジュゲート形成が確認された。nOMV-BS3及び最終コンジュゲートをHPLC-SEC/MALSによって未変性nOMVと比較したところ、凝集形成は示さなかった(下表)。
Figure 0007165468000009
実施例8a(比較)
BS3リンカーを介したdOMVコンジュゲーション
dOMV(MenB由来)を次の条件下でBS3リンカーを用いる反応のための出発材料として検査した。
- pH:6.5
- BS3濃度:50mg/mL
- dOMV濃度:1.011mg/mL
- 25℃で、30分間の反応時間
- UC (110Krpm、16分間、4℃)による精製
反応は、主な結果としてdOMV凝集物及び副産物をもたらした。凝集/交差結合をdls分析及びSEC/MALSによって検証した。
実施例9
GAS-PSにコンジュゲートされたネズミチフス菌nOMV
nOMVへのコンジュゲーションの前にGAS PSをADHリンカーにより末端誘導体化した。PSをAcONa 20mM pH4.5に30mg/mLで可溶化し、ADH及びNaBH3CN両方をPSに対してw/w比1:1で加えた。溶液を30℃で5日間混合した。この後、産物をNaCl 3M及び水に対して2つのPD10カラムによってそれぞれ精製した。PS-ADHをHPAEC-PADによって(78%回収)及びTNBSによって特徴付けたところ、すべてのPS鎖がADHリンカーで活性化されたことが見出された。
100mM MES緩衝液pH6中タンパク質濃度4.4mg/mLのnOMVに、反応混合物中50mg/mLでBS3リンカーを加えた。混合物を25℃の制御温度で30分間、インキュベートした。この後、活性化nOMVを超遠心(110000rpm、16分間、4℃)によって精製し、GAS PS-ADHを直ちに加えた。コンジュゲーションステップでは、比1:3のnOMVとGAS PS-ADHとをPBS中GAS PS-ADH濃度10mg/mlで使用した。室温で一晩インキュベーション後、コンジュゲートを超遠心(110000rpm、16分間、4℃)によって精製し、PBS中に回収した。マイクロBCA、HPAEC-PAD及びNTAによる特徴付けは、nOMVの粒子あたり平均107 PS鎖の推定を可能にした。
同じコンジュゲーションプロトコールを式(Rha)4-(CH2)3-NH2及び(Rha)6-(CH2)3-NH2の合成オリゴ糖のnOMVへのコンジュゲートに適用した。生じたコンジュゲートは、nOMV粒子あたり平均876及び640個のオリゴ糖鎖を有した。
実施例10
BS3化学によってネズミチフス菌nOMV粒子をPfs25又はfHbp v2抗原にコンジュゲートすることによって得られた本発明のコンジュゲートのin vivoデータ
CD1雌マウスをBS3化学によってPfs25又はfHbp抗原にコンジュゲートした全タンパク質ネズミチフス菌nOMV粒子2.5μgを用いて、0及び28日目に皮下免疫した。すべての抗原はAlhydrogel(0.7mg/mL Al3+)に吸着させた。抗Pfs25(図2)及び抗fHbp v2(図3)IgG力価を0、14、27及び42日目に測定した。
実証されたとおり、nOMV-BS3コンジュゲートは、高い抗抗原特異的IgG応答を誘導できた。
実施例11
SIDEAリンカーを介したMenA-GMMA-MenCコンジュゲートの調製
fHbpを過剰発現している髄膜炎菌B GMMAを、50mM NaH2PO4緩衝液pH7.2中タンパク質濃度10mg/mLで、当技術分野において公知の手順に従って、SIDEAリンカーにより予め末端誘導体化(Vaccine 1992 10(10):691-698)したMenA及びMenC糖(avDP 15)にMenA/MenCとnOMVとのw/w比10:1で、同時に加えた。混合物を室温で一晩インキュベートした。この後、生じたコンジュゲートを超遠心(2x、110000rpm、1時間、4℃)によって精製し、PBS中に懸濁した。SDS PAGEウエスタンブロットによる分析により、nOMVに連結された両方の糖を用いたコンジュゲート形成が確認された。コンジュゲートは、HPAEC-PAD及びマイクロBCA分析によって決定された、それぞれ0.10及び0.12の、タンパク質に対するMenAのw/w比及びタンパク質に対するMenCのw/w比によって特徴付けられ、それぞれ19.3%のMenAフリー糖及び4.3%のMenCフリー糖を示した(コンジュゲートのC4 SPE処置後のHPAEC-PAD分析による)。
実施例12
SIDEAリンカーを介するMenA-GMMAコンジュゲートの調製
fHbpを過剰発現している髄膜炎菌B GMMAを、50mM NaH2PO4緩衝液pH7.2中タンパク質濃度10mg/mLで、当技術分野において公知の手順に従って、SIDEAリンカーにより予め末端誘導体化(Vaccine 1992 10(10):691-698)したMenA多糖(avDP 15)にMenAとnOMVとのw/w比10:1で、加えた。混合物を室温で一晩インキュベートした。この後に生じたコンジュゲートを超遠心(2x、110000rpm、1時間、4℃)によって精製し、PBS中に懸濁した。SDS PAGEウエスタンブロットによる分析により、コンジュゲート形成が確認された。コンジュゲートは、HPAEC-PAD及びマイクロBCA分析によって決定された、タンパク質に対するMenAのw/w比0.054によって特徴付けられ、コンジュゲートのC4 SPE処置後のHPAEC-PAD分析によって遊離MenAは検出されなかった。
実施例13
SIDEAリンカーを介するMenC-GMMAコンジュゲートの調製
表題のコンジュゲートの調製のために、MenAの代わりにMenC由来の抗原を使用して、実施例12において使用されたものと同じ手順に従った。コンジュゲートの特徴付けを下の表に報告する。
Figure 0007165468000010
実施例14
マウスにおける免疫原性研究
CD1雌マウス、5～6週齢(群あたり8匹)を、0及び28日目に用量あたり1μgのMenA又はMenCを用いて筋肉内免疫した。GMMAコンジュゲートを、MenA-CRM197又はMenC-CRM197コンジュゲートと、及びMenA又はMenC多糖に物理的に混合したGMMAと、比較した。
すべての抗原は、Alhydrogel(0.7mg/mL Al3+)に吸着させた。抗MenA及びMenC IgG力価を-1、27及び42日目に測定し(図2)、42日目に各群からプールした血清のSBA力価をMenA、MenC及びMenB株のパネルに対して測定した。
実施例14a
抗MenA IgG/SBA
IgG応答
図4に示すとおり、マウスにおける免疫原性研究は、以下：
- MenA-CRM197と比較してより高い抗MenA IgG応答がMenA-GMMAコンジュゲートによって誘導されること
- MenAのGMMAへのコンジュゲーションは多糖に対する液性免疫応答を増強すること
- 二価コンジュゲートは、同じGMMA粒子上のMenCの存在による干渉を伴わずに、MenA-GMMAコンジュゲートに匹敵する抗MenA IgG応答を誘導すること
を示した。
MenAに対するSBA
Figure 0007165468000011
実施例14b
抗MenC IgG/SBA
マウスにおいて検査したコンジュゲート
IgG応答
図5に示すとおり、マウスにおける免疫原性研究は、以下：
- MenC-CRM197と比較して同様の抗MenC IgG応答がMenC-GMMAによって誘導されること
- MenCのGMMAへのコンジュゲーションはOSに対する液性免疫応答を増強すること
を示した。
MenCに対するSBA
Figure 0007165468000012
実施例14c
抗MenB SBA
MenA及び/又はMenCにコンジュゲートされたGMMAについてのMenBに対するSBA
Figure 0007165468000013
上記のデータは、本発明による同じGMMAへの1つ以上の抗原のコンジュゲーションが、抗原又はGMMAの非常に良好な免疫原性プロファイルをいまだ提供することを示している。これは、本コンジュゲートが抗原の干渉を示さず、種々の病原体に対する多価免疫原性組成物又はワクチンの調製のためのコンジュゲートの使用可能性を確認していることを意味する。
シークエンスリスティング
>配列番号1[fHbp v2]
Figure 0007165468000014
>配列番号2[NHBA]
Figure 0007165468000015
>配列番号3[NadA]
Figure 0007165468000016
>配列番号4[NspA]
Figure 0007165468000017
>配列番号5[NhhA]
Figure 0007165468000018
>配列番号6[App]
Figure 0007165468000019
Figure 0007165468000020
>配列番号7[NadA断片]
Figure 0007165468000021
>配列番号8[fHbp v1]
Figure 0007165468000022
>配列番号9[fHbp v3]
Figure 0007165468000023
>配列番号10[Pfs25]
Figure 0007165468000024
>配列番号11[RO6C]
Figure 0007165468000025
>配列番号12[CSP]
Figure 0007165468000026
Figure 0007165468000027
>配列番号13[(NANP)3]
Figure 0007165468000028
>配列番号14[CTF1232]
Figure 0007165468000029
>配列番号15[3526, SslE]
Figure 0007165468000030
>配列番号16[405, FdeC]
Figure 0007165468000031

Claims (28)

  1. 二価リンカーによって少なくとも抗原に結合された少なくとも表面タンパク質成分を有する未変性の外膜小胞(nOMV)を含む免疫原性コンジュゲート。
  2. 二価リンカーによって第1の抗原に結合された少なくとも表面タンパク質成分を有するnOMVを含み、前記第1の抗原は、第2の異なる抗原にさらに結合されている、請求項1に記載の免疫原性コンジュゲート。
  3. 二価リンカーによって第1の抗原に結合された少なくとも表面タンパク質成分及び二価リンカーによって第2の異なる抗原に結合された少なくとも別の表面タンパク質成分を有するnOMVを含む、請求項1に記載の免疫原性コンジュゲート。
  4. 前記二価リンカーが、一般式(I):
    X-L-X'(I)
    （式中、
    X及びX'は、互いに異なっているか又は同じであり、一方はnOMVタンパク質残基と、他方は抗原と選択的に反応できる官能基であり、
    -L-は、酸素(-O-)、硫黄(-S-)、窒素(-NH-又は任意選択で置換された-N-基)などから選択される1つ以上のヘテロ原子によって、任意選択で置換され、また任意選択で割り込まれている、二価直鎖又は分岐C1～C15アルキル又はアルケニル基である）
    を有する、請求項1～3のいずれか一項に記載の免疫原性コンジュゲート。
  5. 前記二価リンカーが、X=X'を有するホモ二官能性リンカーである、請求項4に記載の免疫原性コンジュゲート。
  6. 前記二価リンカーが、グルタル酸ジスクシンイミジル (DSG)、ジスクシンイミジルスベレート (DSS)、スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート (SPDP)、スクシンイミジル6-(3-[2-ピリジルジチオ]-プロピオンアミド)ヘキサノエート (LC-SPDP)、スルホスクシンイミジル6-(3'-(2-ピリジルジチオ)プロピオンアミド)ヘキサノエート (スルホ-LC-SPDP)、4-スクシンイミジルオキシカルボニル-α-メチル-α-(2-ピリジルジチオ)トルエン(SMPT)、スルホスクシンイミジル-6-[α-メチル-α-(2-ピリジルジチオ)トルエアミデオ]ヘキサノエート (スルホ-LC-SMPT)、スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート (SMCC)、スルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート (スルホ-SMCC)、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル (MBS)、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル (スルホ-MBS)、N-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート(SIAB)、スルホスクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート (スルホ-SIAB)、スクシンイミジル4-(N-マレイミドフェニル)ブチレート (SMPB)、スルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドフェニル)ブチレート(スルホ-SMPB)、N-γ-マレイミドブチリル-オキシスクシンイミドエステル (GMBS)、N-γ-マレイミドブチリル-オキシスルホスクシンイミドエステル (スルホ-GMBS)、スクシンイミジル-6-((((4-(ヨードアセチル)アミノ)メチル)シクロヘキサン-1-カルボニル)アミノ)ヘキサノエート (SIACX)、スクシンイミジル6[6-(((ヨードアセチル)アミノ)ヘキサノイル)アミノ]ヘキサノエート (SIAXX)、スクシンイミジル-4-(((ヨードアセチル)アミノ)メチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(SIAC)、スクシンイミジル6-[(ヨードアセチル)アミノ]ヘキサノエート (SIAX)、p-ニトロフェニルヨードアセテート (NPIA)、N-ヒドロキシスクシンイミド、Nオキシスクシンイミド、アジピン酸N-ヒドロキシスクシンイミドジエステル (SIDEA)、ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート (BS3)、ハロゲン化アクリロイル (例えば塩化物)、エチレングリコールビス[スクシンイミジルスクシネート]、ビス(スルホスクシンイミジル)トリ(エチレングリコール) (BS(PEG)3)、ビス(スルホスクシンイミジル)テトラ(エチレングリコール) (BS(PEG)4)、ビス(スルホスクシンイミジル)ペンタ(エチレングリコール) (BS(PEG)5)、ビス(スルホスクシンイミジル)へキサ(エチレングリコール) (BS(PEG)6)、アジピン酸ジヒドラジド (ADH)、β-プロピオンアミド、ニトロフェニル-エチルアミン、ハロゲン化ハロアシル並びに6-アミノカプロン酸、のうちの少なくとも1つから選択される、請求項4に記載の免疫原性コンジュゲート。
  7. 第1の抗原が、Hibを含み、第2の抗原が、Hiaを含み、前記第1の及び第2の抗原が、BS3リンカーによってGMMA百日咳小胞にそれぞれ個々にコンジュゲートされている、請求項3に記載の免疫原性コンジュゲート。
  8. 第1の抗原が、ETEC 405を含み、第2の抗原が、ETEC 3526を含み、前記第1の及び第2の抗原が、BS3リンカーによってGMMAソンネ菌小胞にそれぞれ個々にコンジュゲートされている、請求項3に記載の免疫原性コンジュゲート。
  9. 請求項1～8のいずれか一項に記載の免疫原性コンジュゲートを調製するための方法であって、
    i)前記nOMVを、界面活性剤を含まない工程によって得るステップ、及び
    iia)ステップi)で得たnOMVを発酵ブロスに放出し、遠心分離及びそれに続くろ過を使用して精製するステップ、又は
    iib)ステップi)で得たnOMVを発酵ブロスに放出し、2つの連続するタンジェンシャルフローろ過(TFF)ステップを使用して精製するステップ、
    を含む、方法。
  10. 請求項1～8のいずれか一項に記載の免疫原性コンジュゲートを調製するための方法であって、
    i)前記nOMVを野生型細菌から産生させるステップ、又は
    ii)前記nOMVを、小胞産生を増強し、かつ任意選択で抗原をさらに除去又は改変するように、及び/又は同種抗原若しくは他の生物由来の抗原を過剰発現するように変異している遺伝子改変細菌株から産生させるステップ、
    を含む、方法。
  11. 前記nOMVが、ナイセリア属、赤痢菌、サルモネラ・エンテリカ各血清型、インフルエンザ菌、コレラ菌、百日咳菌、マイコバクテリウム・スメグマチス、マイコバクテリウム・ボビスBCG、大腸菌、バクテロイデス属、緑膿菌、ピロリ菌、ブルセラ・メリテンシス、カンピロバクター・ジェジュニ、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス、ゼノラブダス・ネマトフィルス、モラクセラ・カタラーリス、又はボレリア・ブルグドルフェリから選択される細菌から得られる、請求項1～8のいずれか一項に記載の免疫原性コンジュゲート。
  12. 前記nOMV、二価リンカー及び抗原が、以下:
    Figure 0007165468000032
    のとおり選択される、請求項1に記載の免疫原性コンジュゲート。
  13. 前記nOMV、二価リンカー及び抗原が、以下:
    Figure 0007165468000033
    のとおり選択される、請求項12に記載の免疫原性コンジュゲート。
  14. SIDEAである二価リンカーによって第1の抗原に結合されている少なくとも表面タンパク質成分、及びSIDEA又はBS3である二価リンカーによって第2の異なる抗原に結合されている少なくとも別の表面タンパク質成分を有するnOMVを含む、請求項3に記載の免疫原性コンジュゲート。
  15. BS3である二価リンカーによって第1の抗原に結合されている少なくとも表面タンパク質成分、及びBS3である二価リンカーによって第2の異なる抗原に結合されている少なくとも別の表面タンパク質成分を有するnOMVを含む、請求項3に記載の免疫原性コンジュゲート。
  16. 前記第1の抗原が、ナイセリア・メニンギティディス血清群C(MenC)のオリゴマーを含み、前記第2の抗原が、ナイセリア・メニンギティディス血清群A(MenA)のオリゴマーを含む、請求項3、14又は15に記載の免疫原性コンジュゲート。
  17. ナイセリア・メニンギティディス血清群C(MenC)のオリゴマーを含む前記第1の抗原、及びナイセリア・メニンギティディス血清群A(MenA)のオリゴマーを含む前記第2の抗原が、SIDEAリンカーによってnOMVにそれぞれ個々に結合されている、請求項16に記載の免疫原性コンジュゲート。
  18. 前記nOMVが、GMMA小胞である、請求項1～8又は11～17のいずれか一項に記載の免疫原性コンジュゲート。
  19. 前記nOMVが、ナイセリア・メニンギティディス血清群Bから得られるGMMA小胞である、請求項1～3及び16～17のいずれか一項に記載の免疫原性コンジュゲート。
  20. 前記nOMVが、fHbp v2及びv3を発現するナイセリア・メニンギティディス血清群Bから得られるGMMA小胞である、請求項19に記載の免疫原性コンジュゲート。
  21. 請求項1～8又は11～20のいずれか一項に記載の免疫原性コンジュゲートを調製するための方法であって、
    i)少なくともnOMV表面タンパク質残基を二価リンカーの第1の末端部分と反応させて、nOMV-リンカー中間体を得るステップ、及び
    ii)前記nOMV-リンカー中間体を、少なくとも1つの抗原と、二価リンカーの第2の末端部分を介して反応させ、それによりnOMV-リンカー-抗原コンジュゲートを得るステップ
    を含む、方法。
  22. nOMVと請求項1～8又は11～20のいずれか一項で定義される二価リンカーとからなり、少なくともnOMV表面タンパク質残基に二価リンカーの第1の末端部分が共有結合してなるnOMV-リンカー中間体。
  23. 請求項1～8又は11～20のいずれか一項のnOMV-リンカー-抗原の調製のための、請求項22に記載のnOMV-リンカー中間体の使用。
  24. 請求項1～8又は11～20のいずれか一項に記載のコンジュゲート及び少なくとも1つの薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む、免疫原性組成物。
  25. 医薬としての使用のための、請求項1～8、11～20又は24のいずれか一項に記載の免疫原性コンジュゲート又は組成物。
  26. 脊椎動物において免疫応答を誘導するための請求項25に記載の使用のための、免疫原性コンジュゲート又は組成物。
  27. 請求項1～8又は11～20のいずれか一項に記載の免疫原性コンジュゲート又は請求項24に記載の免疫原性組成物を含む、ワクチン。
  28. 免疫原性コンジュゲートの調製のためのnOMVの使用であって、前記免疫原性コンジュゲートが請求項1～8又は11～20のいずれか一項において定義されたものである、使用。
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