EA015551B1 - Конъюгатные вакцины - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области вакцин, представляющих собой конъюгаты капсульных сахаридов пневмококков. Конкретно, предложены мультивалентные иммуногенные композиции против Streptococcus pneumoniae с различными (например, 9 или более) конъюгированными капсульными сахаридами из разных серотипов S. pneumoniae, где композиция содержит конъюгированный капсульный сахарид 18С, который О-ацетилирован менее чем на 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15 или 10%.

Description

Настоящее изобретение относится к улучшенной вакцине против 81гер1ососси8 рпеитошае.

Предшествующий уровень техники

Дети младше 2 лет не дают иммунный ответ на большинство полисахаридных вакцин, поэтому было необходимо сделать полисахариды иммуногенными с помощью химической конъюгации с белковым носителем. Сочетание полисахарида, Т-независимого антигена, с белком, Т-зависимым антигеном, придает полисахариду свойства Т-зависимости, в том числе изотипное переключение, созревание аффинности и индукцию памяти.

Однако возможны проблемы с повторным введением конъюгатов полисахарид-белок или комбинаций конъюгатов полисахарид-белок, образующих мультивалентные вакцины. Например, сообщалось о тестировании вакцины, представляющей собой полисахарид (РВР) Наеторйбик шПиепхае типа Ь с использованием столбнячного анатоксина (ТТ) в качестве белкового носителя, в диапазоне дозировок при одновременной иммунизации (свободным) ТТ и вакциной, представляющей собой конъюгат пневмококкового полисахарида с ТТ, в соответствии со стандартным режимом для младенцев. По мере увеличения дозы пневмококковой вакцины иммунный ответ на полисахаридную РВР-часть вакцины, представляющей собой конъюгат Н1Ь снижался, что указывает на иммунную интерференцию с полисахаридом, возможно, по причине применения того же белка-носителя (Эадап е1 а1, 1пГес1 1ттип. (1998); 66: 2093-2098).

Влияние дозировки белка-носителя на гуморальный ответ на сам белок также оказалось многосторонним. Сообщалось, что у младенцев увеличение дозировки четырехвалентного конъюгата столбнячного анатоксина приводило к уменьшению ответа на столбнячный носитель (Эадап е1 а1., см. выше). Классический анализ этих эффектов комбинированных вакцин описан как индуцированное носителем эпитопное угнетение, что не вполне понятно, но считается результатом избыточного количества белканосителя (Работ, Уассше 17, 126 (1999)). По видимому, это приводит к конкуренции В-клеток к белкуносителю и В-клеток к полисахариду за Тй-клетки. Если преобладают В-клетки к белку-носителю, имеется недостаточно Тй-клеток для осуществления необходимых хелперных функций по отношению к Вклеткам, специфичным к полисахариду. Однако наблюдаемые иммунологические эффекты были неустойчивыми, причем суммарное количество белка-носителя в некоторых случаях усиливало иммунный ответ, а в других случаях ослабляло иммунный ответ.

Следовательно, существуют технические трудности в комбинировании множественных полисахаридных конъюгатов в едином эффективном вакцинном препарате.

81гер1ососсик рпеитошае являются грамположительными бактериями, ответственными за значительную заболеваемость и смертность (особенно среди молодых и старых) и вызывающими инвазивные заболевания, такие как пневмония, бактериемия и менингит, и заболевания, связанные с колонизаций, такие как острый отит среднего уха. Заболеваемость пневмококковой пневмонией в США у лиц старше 60 лет оценивают как 3-8 человек на 100000. В 20% случаев она приводит к бактериемии и другим явлениям, таким как менингит, со смертностью, близкой к 30% даже при лечении антибиотиками.

Пневмококк инкапсулирован в химически связанный полисахарид, который придает серотипическую специфичность. Известно 90 серотипов пневмококков, и капсула представляет собой главный детерминант вирулентности пневмококков, поскольку капсула не только защищает внутреннюю поверхность бактерий от комплемента, но сама является слабо иммуногенной. Полисахариды являются Тнезависимыми антигенами и не могут быть процессированы или презентированы на молекулах главного комплекса гистосовместимости (МНС) для взаимодействия с Т-клетками. Однако они могут стимулировать иммунную систему по альтернативным механизмам, которые включают перекрестное связывание поверхностных рецепторов на В-клетках.

В нескольких экспериментах показано, что защита против инвазивного пневмококкового заболевания наиболее сильно коррелирует с антителами, специфичными к капсуле, и эта защита специфична к серотипу.

81гер1ососсик рпеитошае является наиболее распространенной причиной инвазивных бактериальных заболеваний и отита среднего уха у младенцев и детей младшего возраста. Аналогичным образом, пожилые люди дают плохие ответы на вакцины против пневмококка (Водйтапп е1 а1., (1987), 1. Сегоп1о1. 42:265-270], следовательно, заболеваемость бактериальной пневмонией в этой популяции повышена [Уегдйеке апб Вегк, (1983) Мебкше (ВаШтоге) 62:271-285].

Главные клинические синдромы, вызываемые 8. рпеитошае, широко известны и рассмотрены во всех стандартных медицинских учебниках (Ребкоп Ό8, Миксйег ΌΜ. В: Р1о1кш 8А, Огепйеш \УЛ. ебйогк. Уассшек. 4г1й ебйюп. РЫ1абе1рЫа, \¥В 8аипбегк Со, 2004а: 529-588). К примеру, инвазивное пневмококковое заболевание (ИПЗ) определяют как любую инфекцию, при которой 8. Рпеитошае выделяют из крови или другого в норме стерильного места (Микйег ΌΜ. 81гер1ососси8 рпеитошае. 1п Мапбе11 СЬ, ВеппеИ 1Е, Эобп В (ебк). Ргтс1р1ек апб Ргасйсе оГ 1пГес1юи8 ОЕкеакек (51й еб). №\ν Уогк, СйигсйШ ЬМпд81опе, 2001, р 2128-2147). Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) известна как включающая в себя несколько состояний (обструкция прохождения воздуха, хронический бронхит, бронхиолит или заболевание мелких воздушных путей и эмфизема), которые часто сосуществуют. Пациенты страдают от обострений их состояния, которые обычно связаны с усилением одышки, и часто имеют усиленный ка

- 1 015551 шель, который может быть продуктивным слизевым или гнойным мокротным (^ίίδοη, Еиг Кезрй I 2001 17:995-1007). ХОБЛ определяют физиологически по присутствию необратимой или частично обратимой обструкции дыхательных путей у пациентов с хроническим бронхитом и/или эмфиземой (81апбагб8 Гог 11зе Ладпоыз апб саге оГ раИеп18 \νιΐΚ сКгошс оЬзЕисбуе ри1топагу бшеазе. Атепсап ТЕогас1с 8ое1е1у. Ат I Кезр1г СгД Саге Меб. 1995 Ыоу; 152(5 Ρΐ 2):877-121). Обострения ХОБЛ часто бывают вызваны бактериальными (например пневмококковыми) инфекциями (8еФ1 8, МигрКу ТЕ. Бас1епа1 тГесЕоп т сйготс оЬзЕисбуе ри1топагу бЕеазез т 2000: а ЖПе-оГлКе-аП гех-зем. С1т М1сгоЬю1 Иеу. 2001 Арг;14(2):336-63).

Хотя на рынке имеется вакцина Ргеупаг, содержащая сахариды из серотипов 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Е и 23Е, которые все конъюгированы с белком-носителем СКМ197 (нетоксичный вариант дифтерийного токсина), мало известно о способе изготовления этой вакцины или характеристиках ее сахаридов.

О- или Ν-ацетилирование, как известно, является важным замещением при образовании защитных эпитопов для различных антигенных сахаридов. Обычно нельзя предсказать, является ли присутствие ацетильных групп полезным или разрушительным для эпитопа.

Таким образом, целью настоящего изобретения является разработка улучшенного препарата вакцины, представляющей собой конъюгат полисахаридов множественных серотипов 8ЕерФсоссиз рпеитотае. В частности, предметом настоящего изобретения является разработка вакцины с полезными характеристиками ацетилирования. В частности, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что де-О-ацетилирование капсульного сахарида серотипа 18С может быть полезным в фокусировании иммунного ответа на скелет эпитопов, что может быть полезным в получении иммунного ответа, защищающего как против тех штаммов 18С, которые сильно О-ацетилированы, так и против тех, которые слабо О-ацетилированы.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 - ингибирование объединенных сывороток из мышей, иммунизированных при использовании 8Р1008 или Ргеупаг, в твердофазном иммуноферментном анализе (ЕБ18А);

фиг. 2 - ингибирование объединенных сывороток из мышей, иммунизированных при использовании 8Р1008 или экспериментальных препаратов, содержащих конъюгаты Р818-ОТ_ан или Р818-ТТ_АН, в ЕБ18А.

фиг. 3 - ингибирование, вызванное опсонофагоцитозом, объединенных сывороток из мышей, иммунизированных при использовании 8Р1008 или экспериментальных препаратов, содержащих конъюгаты Р818-ОТ_ан или Р818-ТТ_ан;

фиг. 4 - ингибирование объединенных сывороток из морских свинок, иммунизированных при использовании 8Р1008 или Ргеупаг, в ЕБ18А;

фиг. 5 - ингибирование объединенных сывороток из морских свинок, иммунизированных при использовании 8Р1008 или экспериментальных препаратов, содержащих конъюгаты Р818-ОТ_ан или Р818ТТан, в ЕБ18А;

фиг. 6 - ингибирование, вызванное опсонофагоцитозом, объединенных сывороток из морских свинок, иммунизированных при использовании 8Р1008 или экспериментальных препаратов, содержащих конъюгаты Р818-ОТ_ан или Р818-ТТ_ан;

фиг. 7 - ингибирование объединенных сывороток из младенцев в исследовании 11РпРП&ПЮ07, иммунизированных при использовании 8Р1008 или Ргеупаг.

Описание изобретения

Таким образом, в одном воплощении настоящего изобретения предложена иммуногенная композиция против 8ЕерФсоссиз рпеитошае, содержащая 9 или более, 10 или более, 11 или более, или 13 или более капсульных сахаридов из разных серотипов 8. рпеитошае, которые конъюгированы с белкомносителем, причем композиция содержит конъюгированный капсульный сахарид 18С, который Оацетилирован менее чем на 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15 или 10%.

% О- или Ν-ацетилирования означает % ацетилирования данной пробы сахарида относительно 100% (причем каждая повторяющаяся единица полностью ацетилирована относительно ее ацетилированной структуры). Для облегчения ссылок структура различных повторяющихся единиц сахарида дана ниже.

Р81

Известно, что Р81 О-ацетилирован либо по первой, либо по второй группе -ОН средней повторяющейся единицы сахара.

- 2 015551

- 3 015551

Сахариды можно де-О-ацетилировать различными способами, известными в данной области. Измерение ацетилирования возможно различными способами, известными в данной области; к примеру, можно использовать ЯМР. В одном аспекте капсульный сахарид 18С де-О-ацетилируют обработкой кислотой перед его конъюгацией. К примеру, обработка 1 М уксусной кислотой в течение 40 ч при 60°С (см. Ж) 96/05859, пример 4) дает сахарид 18С, который О-ацетилирован приблизительно на 17% по данным ЯМР. Такая же обработка при 100°С в течение 5-6 ч дает 18С, О-ацетилированный на 30-50%. Нативному 18С из ацетилированного штамма 18С свойственно быть сильно О-ацетилированным (>90%).

В одном воплощении сахарид С18 по настоящему изобретению конъюгирован со столбнячным анатоксином (ТТ), причем возможно 18С является единственным капсульным сахаридом 8. рпеишошае, конъюгированным с ТТ. Капсульные сахариды из разных серотипов 8. рпеишошае можно конъюгировать с 2 или более разными белками-носителями. В одном из воплощений 18С не конъюгирован с пневмолизином. В еще одном воплощении 18С не конъюгирован с СКМ197. Капсульный сахарид 18С по настоящему изобретению можно конъюгировать многими известными способами (см. ниже). В одном воплощении он не конъюгирован с использованием химии восстановительного аминирования, в дополнительном воплощении он конъюгирован с использованием химии восстановительного аминирования (см. ниже).

В типичных случаях иммуногенная композиция (или вакцина) против 81гер1ососсиз рпеишошае по настоящему изобретению будет содержать антигены, представляющие собой капсульный сахарид (предпочтительно конъюгированный), причем сахариды получены по меньшей мере из 9 или по меньшей мере из десяти серотипов 8. рпеишошае. Число капсульных сахаридов 8. рпеишошае может быть в диапазоне от 9 или 10 разных серотипов (или У, валентностей) до 23 разных серотипов (23У). В одном из воплощений имеют место 9, 10, 11, 13 или 15 разных серотипов. В еще одном воплощении этого изобретения вакцина может содержать конъюгированные сахариды 8. рпеишошае и неконъюгированные сахариды 8. рпеишошае. Предпочтительно, суммарное число серотипов сахарида меньше или равно 23. Например, это изобретение может содержать 10 конъюгированных серотипов и 13 неконъюгированных сахаридов. Таким же образом, вакцина может содержать 13 или 16 конъюгированных сахаридов, и 10 или 7 неконъюгированных сахаридов соответственно.

В одном воплощении мультивалентная вакцина против пневмококков по этому изобретению должна быть выбрана из нижеследующих серотипов: 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7Т, 8, 9Ν, 9У, 10А, 11 А, 12Т, 14, 15В, 17Т, 18С, 19А, 19Т, 20, 22Т, 23Т и 33Т, хотя признано, что один или два других серотипа можно заменить в зависимости от возраста реципиента, получающего вакцину, и географического положения, где вакцину будут вводить. Например, 10-валентная вакцина может содержать полисахариды из серотипов 1,4, 5, 6В, 7Т, 9У, 14, 18С, 19Т и 23Т. 11-Валентная вакцина может также включать в себя капсульный сахарид из серотипа 3. Педиатрическая (для младенцев) 12- или 13-валентная вакцина может также включать в себя серотипы 6А и 19А, или 6А и 22Т, или 19А и 22Т, или 6А и 15В, или 19А и 15В, или 22Т и 15В (для 10- или 11-валентного препарата соответственно), тогда как 13-валентная вакцина для пожилых людей может включать в себя серотипы 8 и 12Т, или 8 и 15В, или 8 и 19 А, или 8 и 22Т, или 12Т и 15В, или 12Т и 19А, или 12Т и 22Т, или 15В и 19А, или 15В и 22Т (для 11-валентного препарата). Педиатрическая 14валентная вакцина может включать в себя 10-валентный препарат, описанный выше, с добавлением серотипов 3, 6А, 19А и 22Т; серотипов 6А, 8, 19А и 22Т; серотипов 6 А, 12Т, 19А и 22Т; серотипов 6 А, 15В, 19А и 22Т; серотипов 3, 8, 19А и 22Т; серотипов 3, 12Т, 19А и 22Т; серотипов 3, 15В, 19А и 22Т; сероти

- 4 015551 пов 3, 6 А, 8 и 22Р; серотипов 3, 6 А, 12Р и 22Р; или серотипов 3, 6 А, 15В и 22Р.

Композиция в одном из воплощений включает в себя капсульные сахариды, полученные из серотипов 1, 4, 5, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19Р и 23Р (предпочтительно конъюгированные). В дополнительном воплощении этого изобретения включены по меньшей мере 11 антигенов, представляющих собой сахариды (предпочтительно конъюгированные), например капсульные сахариды, полученные из серотипов 1, 3, 4, 5, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19Р и 23Р. В дополнительном воплощении этого изобретения включены по меньшей мере 12 или 13 антигенов, представляющих собой сахариды; например, вакцина может содержать капсульные сахариды, полученные из серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19А, 19Р и 23Р, или капсульные сахариды, полученные из серотипов 1, 3, 4, 5, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19А, 19Р, 22Р и 23Р, хотя дополнительные сахаридные антигены, например 23-валентные (такие как серотипы 1, 2, 3, 4, 5, 6В, 7Р, 8, 9Ν, 9У, 10А, 11 А, 12Р, 14, 15В, 17Р, 18С, 19А, 19Р, 20, 22Р, 23Р и 33Р), также предусмотрены этим изобретением.

Если в одном из воплощений присутствует капсульный сахарид из серотипа 4, он Ν-ацетилирован более чем на 50, 60, 70, 80, 90%. Если в одном из воплощений присутствует капсульный сахарид из серотипа 9У, он Ν-ацетилирован более чем на 50, 60, 70, 80, 90% и/или О-ацетилирован более чем на 50, 60, 70, 80, 90%. Если в одном из воплощений присутствует капсульный сахарид из серотипа 14, он Νацетилирован более чем на 50, 60, 70, 80, 90%. Если в одном из воплощений присутствует капсульный сахарид из серотипа 1, он Ν-ацетилирован более чем на 50, 60, 70, 80, 90% и/или О-ацетилирован более чем на 50, 60, 70, 80, 90%. Если в одном из воплощений присутствует капсульный сахарид из серотипа 5, он Ν-ацетилирован более чем на 50, 60, 70, 80, 90%. Если в одном из воплощений присутствует капсульный сахарид из серотипа 7Р, он Ν-ацетилирован более чем на 50, 60, 70, 80, 90% и/или О-ацетилирован более чем на 50, 60, 70, 80, 90%.

Вакцина по настоящему изобретению может содержать белок Ό (ΡΌ) из НаеторЫ1и§ шПиепхае (см. например ЕР 0594610) - в частности, из нетипируемого НаешорЫ1и8 шПиеп/ае (ηίΗί). ηίΗί является ключевым патогенным организмом отита среднего уха, и авторы настоящего изобретения показали, что включение этого белка в вакцину против 8!гер!ососси§ риеитошае должно обеспечить некоторый уровень защиты против связанного с НаешорЫ1и8 шПиепхае отита среднего уха (Ргути1а е! а1. 2006 Т1е Раисе!: 367:740-748). В одном из воплощений вакцинная композиция содержит белок Ό. В одном из аспектов ΡΌ присутствует в качестве белка-носителя для одного или более чем одного сахарида. В другом аспекте белок Ό может присутствовать в вакцинной композиции в виде свободного белка. В дополнительном аспекте белок Ό присутствует в качестве как белка-носителя, так и свободного белка. Белок Ό можно использовать в виде полноразмерного белка или в виде фрагмента (\νθ 0056360). В дополнительном аспекте белок Ό присутствует в качестве белка-носителя для большинства сахаридов, например, с белком Ό можно конъюгировать 6, 7, 8, 9 или более сахаридов. В этом аспекте белок Ό может также присутствовать в виде свободного белка.

Вакцина по настоящему изобретению может содержать два или более разных типа белка-носителя. Каждый тип белка-носителя может действовать в качестве носителя для более чем одного сахарида, причем эти сахариды могут быть одними и теми же или разными. Сахариды можно конъюгировать с одним и тем же носителем в одном и том же взаимодействии или можно индивидуально конъюгировать с одним и тем же белком-носителем. Например, серотипы 3 и 4 можно конъюгировать при использовании одного и того же белка-носителя либо с одной и той же молекулой белка-носителя, либо с разными молекулами одного и того же белка-носителя. В одном из воплощений два или более чем два разных сахарида можно конъюгировать при использовании одного и того же белка-носителя либо с одной и той же молекулой белка-носителя, либо с разными молекулами одного и того же белка-носителя.

Каждый/любой капсульный сахарид 8!тер!ососси8 риеитошае можно конъюгировать с белкомносителем, независимо выбранным из группы, состоящей из ТТ, ΌΤ, СКМ197, фрагмента С белка ТТ, Р111Э. продуктов слияния Ρ111ΩΕ (особенно тех, что описаны в νθ 01/98334 и νθ 03/54007), детоксифицированного пневмолизина и белка Ό. В одном из аспектов капсульный сахарид из серотипа 19Р можно конъюгировать с ΌΤ или СКМ 197, предпочтительно с ΌΤ. Более полный перечень белковых носителей, которые можно использовать в конъюгатах по этому изобретению, представлен ниже.

Белок-носитель, конъюгированный с один или более чем одним капсульным сахаридом 8. риеитошае в конъюгатах, присутствующих в иммуногенной композиции по этому изобретению, возможно представляет собой белки семейства полигистидиновой триады (Р1!), их фрагменты или слитые белки. Белки Р1!А, Р1!В, Ρ111Ω или РН1Е могут иметь аминокислотную последовательность, общую на 80, 85, 90, 95, 98, 99 или 100% с последовательностью, раскрытой в νθ 00/37105 или νθ 00/39299 (например с аминокислотной последовательностью 1-838 или 21-838 по 8ЕЦ Ш ΝΟ: 4 в νθ 00/37105 для РйЮ). Например, слитые белки состоят из полноразмерных или частичных 2, 3 или 4 РЫЛ, Р1!В, РйЮ, Р1!Е. Примерами слитых белков являются Р1!А/В, РЫА/Ό, Р1!А/Е, Р1!В/А, РЫВ/ϋ, Р1!В/Е, РйЮ/А, РйЮ/В, РйЮ/Е, Р1!Е/А, Р1ЦЕ/В и РЫЕ/Ό, причем эти белки связаны с первым из указанных на Ν-конце (см., например, νθ 01/98334).

При использовании фрагментов белков Р1! (в отдельности или в качестве части слитого белка), каждый фрагмент возможно содержит один или более чем один мотив гистидиновой триады и/или биспи

- 5 015551 ральный участок таких полипептидов. Мотив гистидиновой триады представляет собой часть полипептида, которая имеет последовательность НххНхН, где Н представляет собой гистидин, и х представляет собой аминокислоту, отличную от гистидина. Биспиральный участок представляет собой область, предсказанную алгоритмом Собз в Ьириз, А с1 а1 (1991) Баепсе 252; 1162-1164. В одном воплощении определенный или каждый фрагмент включает в себя один или более из мотивов гистидиновой триады, а также по меньшей мере один биспиральный участок. В одном воплощении определенный или каждый фрагмент содержит ровно или по меньшей мере 2, 3, 4 или 5 мотивов гистидиновой триады (возможно, с нативной последовательностью Р111 между 2 или более триадами или со внутри-триадной последовательностью, которая более чем на 50, 60, 70, 80, 90 или 100 % идентична нативной пневмококковый внутритриадной последовательности Р11Е например внутри-триадной последовательности, показанной в БЕр ΙΌ N0: 4 в \νϋ 00/37105 для Р11Ю). В одном воплощении определенный или каждый фрагмент содержит ровно или по меньшей мере 2, 3 или 4 биспиральных участка. В одном воплощении белок РЫ1, раскрытый здесь, включает в себя полноразмерный белок с присоединенной сигнальной последовательностью, зрелый полноразмерный белок с удаленным сигнальным пептидом (например 20 аминокислот на Ν-конце), встречающиеся в природе варианты белка Р111 и иммуногенные фрагменты белка РЫ (например фрагменты, описанные выше, или полипептиды, содержащие по меньшей мере 15 или 20 смежных аминокислот из аминокислотной последовательности в νϋ 00/37105 или νϋ 00/39299, причем указанный полипептид способен вызывать иммунный ответ, специфичный для указанной аминокислотной последовательности в νϋ 00/37105 или νϋ 00/39299).

В частности, термин Ρ111Ό при использовании здесь включает в себя полноразмерный белок с присоединенной сигнальной последовательностью, зрелый полноразмерный белок с удаленным сигнальным пептидом (например 20 аминокислот на Ν-конце), встречающиеся в природе варианты РНЮ и иммуногенные фрагменты РНЮ (например фрагменты, как описано выше, или полипептиды, содержащие по меньшей мере 15 или 20 смежных аминокислот из аминокислотной последовательности РНЮ в νϋ 00/37105 или νϋ 00/39299, причем указанный полипептид способен вызывать иммунный ответ, специфичный к указанной аминокислотной последовательности РНЮ в νϋ 00/37105 или νϋ 00/39299 (например для РйГО, БЕр ΙΌ Νϋ: 4 в νϋ 00/37105).

Если белковый носитель является одинаковым для 2 или более сахаридов в композиции, сахариды могут быть конъюгированы с одной и той же молекулой белкового носителя (причем молекула носителя имеет еще 2 разных сахарида, конъюгированных с ней) [см. к примеру νϋ 04/083251]. Или же, сахариды можно каждый отдельно конъюгировать с разными молекулами белкового носителя (причем каждая молекула белкового носителя имеет только один тип сахарида, конъюгированный с ней).

Примерами белков-носителей, которые можно использовать в настоящем изобретении, являются ΌΤ (дифтерийный анатоксин), ТТ (столбнячный анатоксин) или фрагмент ТТ, ΌΤ СЕМ197 (мутант ΌΤ), другие точковые мутанты ΌΤ, такие как СЕМ 176, СЕМ228, СЕМ 45 (ИсЫба с1 а1 1. Βΐο1. СЫет. 218; 3838-3844, 1973); СЕМ 9, СЕМ 45, СЕМ102, СЕМ 103 и СЕМ107 и другие мутации, описанные в ΝίοΒοΙΙδ аиб Уои1е Сепебса11у Епщпссгсб Τοχίηκ, Еб: Егаике1, Магсе1 Эеккег 1пс, 1992; делеция или мутация С1и-148 в Азр, Οίη или Бег и/или А1а 158 в С1у и другие мутации, раскрытые в ИБ 4709017 или ИБ 4950740; мутация по меньшей мере одного или более чем одного остатка Ьуз 516, Ьуз 526, РЫе 530 и/или Ьуз 534 и другие мутации, раскрытые в ИБ 5917017 или ИБ 6455673; или фрагмент, раскрытый в ИБ 5843711, пневмококковый пневмолизин [Р1у] (Кио е1 а1 (1995) 1пГес( 1ттип 63; 2706-13), включая р1у, который детоксифицирован каким-либо образом, например химическим: бРЬУ-СМВБ (νϋ 04081515, РСТ/ЕР 2005/010258) или бРЬУ-формол; или генетически мутированный для меньшей токсичности (например, при использовании мутаций, известных в данной области), РЫХ, включая РЫ1А, РЫВ, РЫИ, РН1Е и слитые с Р111 белки, например продукт слияния РЫИЕ, продукт слияния РЫВЕ (νϋ 01/98334 и νϋ 03/54007) (Р111 А-Е раскрыт более подробно ниже), ОМРС (белок менингококковой внешней мембраны, обычно экстрагированный из серогруппы В Ν. тешпдй1б1з - ЕР0372501), РогВ (из Ν. тешпдй1б1з), РИ (белок Ό НаеторЫбиз тПиеп/ае - см., например, ЕР 0594610 В) или его иммунологически функциональные эквиваленты, синтетические пептиды (ЕР0378881, ЕР0427347), белки теплового шока (νϋ 93/17712, νϋ 94/03208), коклюшные белки (νϋ 98/58668, ЕР0471177), цитокины, лимфокины, ростовые факторы или гормоны (νϋ 91/01146), искусственные белки, содержащие множественные эпитопы для человеческих Т-клеток типа СИ4+ из различных антигенов, получаемых из патогенов (Еа1ищ е1 а1 (2001) Еиг 1 1ттипо1 31; 3816-3824), такие как белок Ν19 (Вага1бо1 е1 а1 (2004) 1пГес1 1ттип 72; 4884-7), пневмококковый поверхностный белок РзрА (νϋ 02/091998), белки, поглощающие железо, (νϋ 01/72337), токсин А или В из С. бгГйсбе (νϋ 00/61761).

Шгкка е1 а1 Реб1а1пс 1пГесбоиз Игзеазе 1оитпа1. 23(11)-, 1008-14, 2004 Му. описали 11-валентную пневмококковую вакцину, у которой все серотипы конъюгированы с РИ. Однако настоящие авторы изобретения показали, что опсонофагоцитозная активность была лучше у антител, индуцированных конъюгатами, имеющими 19Е, конъюгированный с ΌΤ, при сравнении с 19Е, конъюгированным с РИ. Вдобавок, настоящие авторы изобретения показали, что более высокая перекрестная реактивность с 19А наблюдается, когда 19Е конъюгирован с ΌΤ. Поэтому отличительным признаком композиции по настоящему изобретению является то, что серотип 19Е конъюгирован с ΌΤ или СЕМ 197. В одном из аспектов

- 6 015551 серотип 19Р конъюгирован с ΌΤ. Остальные серотипы сахаридов иммуногенной композиции могут быть все конъюгированы с одним или более чем одним белком-носителем, который не представляет собой ΌΤ (то есть, только 19Р конъюгирован с ΌΤ), или могут быть распределены между одним или более чем одним белком-носителем, который не представляет собой ΌΤ или СЕМ197, и ΌΤ или самим СЕМ197. В одном из воплощений 19Р конъюгирован с ΌΤ или СЕМ 197, и все остальные серотипы конъюгированы с ΡΌ. В дополнительном воплощении 19Р конъюгирован с ΌΤ или СЕМ 197, и остальные серотипы распределены между ΡΌ и ТТ, или ΌΤ, или СЕМ 197. В дополнительном воплощении 19Р конъюгирован с ΌΤ или СЕМ 197, и не более чем один (или два или три) сахарид(а) конъюгирован(ы) с ТТ. В одном из аспектов этого воплощения указанный(е) один (или два) сахарид(а) представляет(ют) собой 18С и/или 12Р. В дополнительном воплощении 19Р конъюгирован с ΌΤ или СЕМ 197, и не более чем два сахарида конъюгированы с ТТ. В дополнительном воплощении 19Р конъюгирован с ΌΤ или СЕМ 197, и остальные серотипы распределены между ΡΌ, ТТ и ΌΤ или СЕМ 197. В дополнительном воплощении 19Р конъюгирован с ΌΤ или СЕМ 197, и остальные серотипы распределены между ΡΌ, ТТ и пневмолизином. В дополнительном воплощении 19Р конъюгирован с ΌΤ или СЕМ 197, и остальные серотипы распределены между ΡΌ, ТТ и СЕМ 197. В дополнительном воплощении 19Р конъюгирован с ΌΤ или СЕМ197, и остальные серотипы распределены между ΡΌ, ТТ, пневмолизином и возможно Ρ111Ω. В дополнительном аспекте этого изобретения капсульный сахарид 18С конъюгирован с ТТ [причем возможно один или два других сахарида конъюгирован(ы) с ТТ], и остальные серотипы распределены между Ρϋ, ΒΤ (или СЕМ197), пневмолизином и возможно Ρ111Ω.

В одном из воплощений иммуногенная композиция по этому изобретению содержит белок Ό из НаеторЫ1и8 тПиспхас. В этом воплощении, если ΡΌ не является одним из белков-носителей, использованных для конъюгации каких-либо сахаридов, то ΡΌ может присутствовать в вакцинной композиции как свободный белок. Если ΡΌ является одним из белков-носителей, использованных для конъюгации сахаридов в композиции по этому изобретению, то возможно ΡΌ может присутствовать в вакцинной композиции как свободный белок.

Термин сахарид во всем этом описании может обозначать полисахарид или олигосахарид и включает в себя оба. Полисахариды выделяют из бактерий, и их размеры можно уменьшать до некоторой степени известными способами (см., например, ЕР497524 и ЕР497525; 8ζιι е1 а1. - СагЬойубга1е Еекеагсй Уо1 152 р7-20 (1986)), предпочтительно микрофлюидизацией. Размеры полисахаридов можно уменьшать для того, чтобы снижать вязкость полисахаридных проб и/или улучшать фильтруемость конъюгированных продуктов. Олигосахариды имеют малое число повторяющихся единиц (в типичных случаях 5-30 повторяющихся единиц) и в типичных случаях представляют собой гидролизованные полисахариды.

Капсульные полисахариды 81гер1ососси5 рпеитошае содержат повторяющиеся олигосахаридные единицы, которые могут содержать до 8 остатков сахаров. Обзор по олигосахаридным блокам ключевых серотипов 81гер1ососси5 рпеитошае см. в 1ΘΝΕ8, СйгМорйег. Уассшек Ьакеб оп 111е се11 кшГасе сагЬойубга1е§ оГ раШодешс Ьас1епа. Ап, Асаб, Вгак. С1епс, 1ипе 2005, уо1.77, №.2, р. 293-324. Ι88Ν 0001-3765. В одном из воплощений антиген, представляющий собой капсульный сахарид, может быть нативным или полноразмерным полисахаридом (то есть, полисахаридом, как он получен из 8. рпеитошае без какойлибо стадии уменьшения размеров или гидролиза), однако в других воплощениях он может представлять собой один или несколько повторяющихся единиц (олигосахаридов) или быть короче, чем полисахарид с нативной длиной или олигосахаридная цепь повторяющихся единиц. В одном из воплощений все сахариды, присутствующие в вакцине, представляют собой полисахариды. Полноразмерные полисахариды можно уменьшать то есть, их размер можно уменьшать различными способами, такими как обработка кислым гидролизом, обработка пероксидом водорода, определение размера при использовании етпЫПех® с последующей обработкой пероксидом водорода для получения олигосахаридных фрагментов или микрофлюидизация.

Авторы настоящего изобретения также отметили, что основной направленностью данной области является использование олигосахаридов для облегчения получения конъюгатов. Авторы изобретения обнаружили, что путем использования конъюгатов нативных полисахаридов или полисахаридов со слегка измененным размером можно реализовать одно или более из нижеследующих преимуществ: (1) конъюгат, имеющий высокую иммуногенность, который является фильтруемым, (2) соотношение полисахарида и белка в конъюгате можно изменять так, что соотношение полисахарида и белка (мас.) в конъюгате можно повышать (что может влиять на эффект супрессии носителем), (3) иммуногенные конъюгаты, подверженные гидролизу, можно стабилизировать применением сахаридов большего размера для конъюгации. Применение полисахаридов большего размера может приводить к большему перекрестному связыванию с носителем конъюгата и может уменьшать высвобождение свободного сахарида из конъюгата. Конъюгатные вакцины, описанные в известном уровне техники, имеют тенденцию к деполимеризации полисахаридов перед конъюгацией для улучшения конъюгации. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что вакцины, представляющие собой конъюгат сахарида, которые сохраняют больший размер сахарида, могут обеспечивать хороший иммунный ответ против пневмококкового заболевания.

Таким образом, иммуногенная композиция по этому изобретению может содержать один или более

- 7 015551 конъюгатов сахарида, причем средний размер (усредненная по массе молекулярная масса; мол. масс.) каждого сахарида до конъюгации выше, чем 80х10³, 100х10³, 200х10³, 300х10³, 400х10³, 500х10³ или 1000х10³ (например, от 80х10³ до 1000х10³; от 90х10³ до 500х10³; от 100х10³ до 400х10³; от 200х10³ до 300х10³). В одном из воплощений один или более чем один конъюгат сахарида по этому изобретению должен иметь средний размер сахарида до конъюгации 50-1600, 80-1400, 100-1000, 150-500 или 200-400 кДа (надо иметь в виду, что, если средний размер представляет собой мол. масс, единицы кДа надо заменять здесь на х10³). В одном из воплощений конъюгат после конъюгации должен быть легко фильтруемым через 0,2-микронный фильтр так, что после фильтрования при сравнении с пробой до фильтрования получают выход более чем 50, 60, 70, 80, 90 или 95%.

Для целей этого изобретения нативный полисахарид относится к сахариду, который не подвергали процессу (например, последующей очистке), целью которого является уменьшение размера сахарида. Полисахарид может стать слегка уменьшенным в размере во время нормальных процедур очистки. Такой сахарид является все еще нативным. Только если полисахарид подвернут методикам определения размера, полисахарид нельзя считать нативным.

Для целей этого изобретения уменьшать размер в кратности до х2 означает, что сахарид подвергают процессу, предназначенному для уменьшения размера сахарида, но сохраняют размер более чем в половину размера нативного полисахарида. х3, х4 и т.д. надо интерпретировать таким же образом, то есть, сахарид подвергают процессу, предназначенному для уменьшения размера полисахарида, но сохраняют размер более чем в треть, четверть и т.д. размера нативного полисахарида.

В одном из аспектов этого изобретения иммуногенная композиция содержит сахариды 8!тер!ососси§ рпеитошае по меньшей мере из 9 или 10 серотипов, конъюгированные с белком-носителем, где по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или каждый из сахаридов 8. рпеитошае представляет(ют) собой нативный полисахарид.

В одном из аспектов этого изобретения иммуногенная композиция содержит сахариды 8!тер!ососСИ5 рпеитошае по меньшей мере из 9 или 10 серотипов, конъюгированные с белком-носителем, где по меньшей мере у 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или каждого из сахаридов 8. рпеитошае размер уменьшен в кратности до х2, х3, х4, х5, х6, х7, х8, х9 или х10. В одном из воплощений этого аспекта большинство сахаридов, например 6, 7, 8 или больше, уменьшены в кратности до х2, х3, х4, х5, х6, х7, х8, х9 или х 10.

Молекулярная масса или средняя молекулярная масса (или размер) сахарида здесь относится к усредненной по массе молекулярной массе (М„, мол. масс.) сахарида, измеренной до конъюгации и измеренной при использовании много-углового рассеяния лазерного света (тиЫ-апДе 1а§ет 1ф1И 5са11ег1пд. МЛЬЬ8).

Методика МЛЬЬ8 хорошо известна в данной области (например, описана в примере 2). Для МЛЬЬ8-анализа пневмококковых сахаридов можно использовать две колонки (Т8КС6000 и 5000Ρνχ1) в комбинации, и сахариды элюируют водой. Сахариды обнаруживают при использовании детектора светорассеяния (к примеру, νναΙΙ Όα\νπ Ό8Ρ, снабженный 10-мВт аргонным лазером при 488 нм) и интерференционного рефрактометра (к примеру, νναΙΙ ОШаЬ Ό8Ρ, снабженного ячейкой Р100 и красным фильтром при 498 нм).

В одном из воплощений сахариды 8. рпеитошае представляют собой нативные полисахариды или нативные полисахариды, которые уменьшены в размере во время нормального процесса экстракции.

В одном из воплощений сахариды 8. рпеитошае уменьшены механическим расщеплением, к примеру микрофлюидизацией или обработкой ультразвуком. Микрофлюидизация и обработка ультразвуком имеют преимущество в том, что уменьшают размер больших нативных полисахаридов достаточно для получения фильтруемого конъюгата. Уменьшение размера происходит в кратности не более чем х20, х10, х8, х6, х5, х4, х3 или х2.

В одном из воплощений иммуногенная композиция содержит конъюгаты 8. рпеитошае, которые получены из смеси нативных полисахаридов и сахаридов, размер которых уменьшен в кратности не более чем х 20. В одном из аспектов этого воплощение размер большинства сахаридов, например 6, 7, 8 или более сахаридов уменьшен в кратности до х2, х3, х4, х5 или х6.

В одном из воплощений сахарид 8!тер!ососси8 рпеитошае конъюгирован с белком-носителем через линкер, к примеру бифункциональный линкер. Линкер возможно является гетеробифункциональным или гомобифункциональным, например имеющим активную аминогруппу и активную карбоксильную группу, 2 активных аминогруппы или две активных карбоксильных группы. Линкер имеет, например, от 4 до 20, от 4 до 12, от 5 до 10 атомов углерода.

Возможным линкером является дигидразид адипиновой кислоты (ΆΌΗ). Другие линкеры включают в себя В-пропионамидо (νθ 00/10599), нитрофенилэтиламин (Сеует е! а1 (1979) Меб. МютоЬю1. 1ттипо1. 165; 171-288), галогеноалкилгалогениды (И8 4057685), гликозидные связи (И8 4673574, И8 4808700), гександиамин и 6-аминокапроновую кислоту (И84459286). В одном из воплощений ΆΌΗ используют в качестве линкера для конъюгации сахарида из серотипа 18С.

Конъюгаты сахаридов, присутствующие в иммуногенных композициях по этому изобретению, можно получать любой известной методикой сочетания. Способ конъюгации может быть основан на ак

- 8 015551 тивации сахарида тетрафторборатом 1-циано-4-диметиламинопиридиния (СЭАР) с образованием цианатного эфира. Таким образом, активированный сахарид можно конденсировать прямо или через спейсерную (линкерную) группу с аминогруппой на белке-носителе. Например, спейсером может быть цистамин или цистеамин с получением тиолированного (!Ыо1а!еб) полисахарида, который можно конденсировать с носителем через тиоэфирную связь, полученную после взаимодействия с малеимидактивированным белком-носителем (например, при использовании ОМВ8) или галогеноацетилированным белком-носителем (например при использовании йодацетимида [например, гидрохлорида этилйодацетимида] или Ν-сукцинимидилбромацетата или 81АВ, или 81А, или 8ВАР). Предпочтительно, цианатный эфир (возможно полученный при использовании СЭАР) подвергают сочетанию с гександиамином или АЭН, и амино-дериватизированный сахарид конъюгируют с белком-носителем с использованием карбодиимида (например, БОАС или ЕЭС) через карбоксильную группу на белковом носителе. Такие конъюгаты раскрыты в опубликованной в рамках РСТ заявки АО 93/15760 на ИшГогтеб 8егу1се§ Ишуег8Йу и в АО 95/08348 и АО 96/29094.

В других подходящих методиках используют карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборан, пара-нитробензойную кислоту, Ν-гидроксисукцинимид, δ-ΝΗδ, ЕЭС Т8ТИ. Многие раскрыты в АО 98/42721. В конъюгации можно использовать карбонильный линкер, который можно получить взаимодействием свободной гидроксильной группы сахарида с СЭ1 (карбонил-бис(имидазол-1-ил)) (Ве!йе11 е! а1 1. Вю1. СЕет. 1979, 254; 2572-4, Неагп е! а1 1. Сйгота!одг. 1981. 218; 509-18) с последующим взаимодействием с белком с образованием карбаматной связи. Это может включать в себя восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, возможно защиту первичной гидроксильной группы и снятие защиты с нее, взаимодействие первичной гидроксильной группы с СЭ1 с образованием промежуточного карбамата СЭ1 и сочетание этого промежуточного карбамата СЭ1 с аминогруппой на белке.

Конъюгаты можно также получать способами прямого восстановительного аминирования как описано в υδ 4365170 (1епп1пд8), ϋδ 4673574 (Апбегаоп) и АО 96/05859. Другие способы раскрыты в ЕР 0161188, ЕР 208375 и ЕР 0477508.

Дополнительный способ включает сочетание активированного цианогенбромидом (или СЭАР) сахарида, дериватизированного гидразидом адипиновой кислоты (АЭН), с белковым носителем карбодиимидной конденсацией (Сйи С. е! а1 1пГес!. 1ттцпйу, 1983 245 256), например при использовании ЕЭАС.

В одном из воплощений гидроксильная группа (предпочтительно активированная гидроксильная группа, например гидроксильная группа, активированная с получением цианатного сложного эфира [например при использовании СЭАР]), на сахариде связана с аминогруппой или карбоксильной группой на белке либо прямо, либо опосредованно (через линкер). Если присутствует линкер, гидроксильную группу на сахариде предпочтительно связывают с аминогруппой на линкере, например, конъюгацией при использовании СЭАР. Дополнительную аминогруппу в линкере (например АЭН) можно конъюгировать с карбоксильной группой на белке, например, использованием карбодиимида, например, использованием ЕЭАС. В одном из воплощений пневмококковый(е) капсульный(е) сахарид(ы) конъюгирован(ы) с линкером сначала, перед конъюгацией линкера с белком-носителем. Или же, линкер можно конъюгировать с носителем перед конъюгацией с сахаридом.

Также можно применять комбинацию методик, причем некоторые конъюгаты сахарид-белок получают использованием СЭАР, и некоторые конъюгаты сахарид-белок получают восстановительным аминированием.

В общем, для сочетания/конъюгации можно применять нижеследующие типы химических групп на белковом носителе:

A) карбоксил (к примеру, через аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту). В одном из воплощений эту группу связывают с аминогруппами на сахаридах прямо или с аминогруппой на линкере использованием карбодиимида, например использованием ЕЭАС;

Б) аминогруппа (к примеру, через лизин). В одном из воплощений эту группу связывают с карбоксильными группами на сахаридах прямо или с карбоксильной группой на линкере использованием карбодиимида, например использованием ЕЭАС. В еще одном воплощении эту группу связывают с гидроксильными группами, активированными использованием СЭАР или САВг прямо на сахаридах или с такими же группами на линкере; с сахаридами или линкерами, имеющими альдегидную группу; с сахаридами или линкерами, имеющими группу, представляющую собой сложный эфир сукцинимида;

B) сульфгидрил (к примеру, через цистеин). В одном из воплощений эту группу связывают с бромили хлорацетилированным сахаридом или линкером, используя малеимид. В одном из воплощений эту группу активируют/модифицируют бис-диазобензидином;

Г) гидроксильная группа (к примеру, через тирозин). В одном из воплощений эту группу активируют/модифицируют бис-диазобензидином;

Д) имидазолильная группа (к примеру, через гистидин). В одном из воплощений эту группу активируют/модифицируют бис-диазобензидином;

Е) гуанидильная группа (к примеру, через аргинин);

Ж) индолильная группа (к примеру, через триптофан).

- 9 015551

На сахариде, в общем, для сочетания можно использовать нижеследующие группы: ОН, СООН или ΝΗ2. Альдегидные группы можно генерировать после разных обработок, известных в данной области, таких как: при использовании перйодата, кислого гидролиза, пероксида водорода и т.д.

Способы прямого сочетания:

Сахарид-ОН + ΟΝΒτ или ΟΌΑΡ цианатный сложный эфир + Ν^-белок конъюгат

Сахарид-альдегид + Ν^-белок основание Шиффа + №ΟΝΒΗ₃ конъюгат

Сахарид-СООН + Ν^-белок + ΕΌΑΟ конъюгат

Сахарид-ΝΗ + СООН-белок + ΕΌΑΟ конъюгат

Способы непрямого сочетания через спейсер (линкер):

Сахарид-ОН + ΟΝΒτ или ΟΌΑΡ цианатный сложный эфир + ΝΗ₂ -— ΝΗ₂ сахарид -— ΝΗ₂ +

СООН-белок + ΕΌΑΟ конъюгат

Сахарид-ОН + ΟΝΒτ или ΟΌΑΡ цианатный сложный эфир + ΝΗ₂ -—8Η сахарид -— 8Η + 8Ηбелок (нативный белок с экспонированным цистеином или полученный после модификации аминогрупп белка использованием 8ΡΌΡ, к примеру) сахарид-8-8-белок

Сахарид-ОН + ΟΝΒτ или ΟΌΑΡ цианатный сложный эфир + ΝΗ₂ -— 8Η сахарид -— 8Η + малеимид-белок (модификация аминогрупп) конъюгат

Сахарид-ОН + ΟΝΒτ или ΟΌΑΡ цианатный сложный эфир + ΝΗ₂ -—8Η сахарид-δΗ + галогеноацетилированный-белок конъюгат

Сахарид-СООН + ΕΌΑΟ + ΝΗ₂ -— ΝΗ₂ сахарид -— ΝΗ₂ + ΕΌΑΟ + СООН-белок конъюгат

Сахарид-СООН + ΕΌΑΟ+ ΝΗ₂ -— 8Η сахарид -— 8Η + δΗ-белок (нативный белок с экспонированным цистеином или полученный после модификации аминогрупп белка с использованием 8ΡΌΡ, к примеру) сахарид-8-8-белок

Сахарид-СООН + ΕΌΑΟ+ ΝΗ₂ -— 8Η сахарид-—8Η + малеимид-белок (модификация аминогрупп) конъюгат

Сахарид-СООН + ΕΌΑΟ + ΝΗ₂ -— 8Η сахарид-δΗ + галогеноацетилированный-белок конъюгат

Сахарид-альдегид + ΝΗ₂-—ΝΗ₂ сахарид -— ΝΗ₂ + ΕΌΑΟ + СООН-белок конъюгат

Примечание: вместо вышеуказанного ΕΌΑΟ можно использовать любой подходящий карбодиимид.

Таким образом, типами химической группы на белковом носителе, которые обычно можно использовать для сочетания с сахаридом, являются аминогруппы (к примеру, на лизиновых остатках), СООНгруппы (к примеру, на остатках аспарагиновой и глутаминовой кислоты) и δΗ-группы (если доступны) (к примеру, на цистеиновых остатках).

Предпочтительно, соотношение белка-носителя и сахарида 8. риеишошае находится в промежутке от 1:5 до 5:1; например 1:0,5-4:1, 1:1-3,5:1, 1,2:1-3:1, 1,5:1-2,5:1; например, от 1:2 до 2,5:1; от 1:1 до 2:1 (мас./мас.). В одном из воплощений у большей части конъюгатов, например 6, 7, 8, 9 или более, соотношение белка-носителя и сахарида больше чем 1:1, например 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1 или 1,6:1.

В одном из воплощений по меньшей мере один сахарид 8. риеишошае конъюгирован с белкомносителем через линкер (например ΑΌΗ) при использовании ΟΌΑΡ и ΕΌΑΟ. Например, 18С можно конъюгировать с белком через линкер (например, имеющий две группы гидразино на его концах, такой как ΑΌΗ) при использовании ΟΌΑΡ и ΕΌΑΟ как описано выше. Когда используют линкер, ΟΌΑΡ можно использовать для конъюгации сахарида с линкером, и ΕΌΑΟ можно затем использовать для конъюгации линкера с белком, или альтернативно ΕΌΑΟ можно использовать сначала для конъюгации линкера с белком, после чего ΟΌΑΡ можно использовать для конъюгации линкера с сахаридом.

В общем, иммуногенная композиция по этому изобретению может содержать дозу каждого конъюгата сахарида между 0,1 и 20 мкг, 1 и 10 мкг или 1 и 3 мкг сахарида.

В одном из воплощений иммуногенная композиция по этому изобретению содержит каждый капсульный сахарид 8. риеишошае в дозе 0,1-20 мкг; 0,5-10 мкг; 0,5-5 мкг или 1-3 мкг сахарида. В одном из воплощений капсульные сахариды могут присутствовать в разных дозировках, например некоторые капсульные сахариды могут присутствовать в дозе ровно 1 мкг, или некоторые капсульные сахариды могут присутствовать в дозе ровно 3 мкг. В одном из воплощений сахариды из серотипов 3, 18С и 19Е (или 4, 18С и 19Е) присутствуют в более высоких дозах, чем дозы других сахаридов. В одном из аспектов этого воплощения серотипы 3, 18С и 19Е (или 4, 18С и 19Е) присутствуют в дозе приблизительно или ровно 3 мкг, в то время как другие сахариды в иммуногенной композиции по этому изобретению присутствуют в дозе приблизительно или ровно 1 мкг.

Около или приблизительно определяют как в пределах 10% больше или меньше величины, заданной для целей этого изобретения.

В одном из воплощений по меньшей мере один капсульный сахарид из 8. риеишошае конъюгирован непосредственно с белком-носителем (например, использованием одного из химических способов, описанных выше).

Предпочтительно по меньшей мере один капсульный сахарид 8. риеишошае конъюгирован непо

- 10 015551 средственно при использовании СЭЛР. В одном из воплощений большинство капсульных сахаридов, например 5, 6, 7, 8, 9 или более, связано непосредственно с белком-носителем при использовании СЭЛР (см. №0 95/08348 и №0 96/29094)

Иммуногенная композиция может содержать белки 81тер1ососси8 риеишошае, называемые здесь как белки §1гер1ососси8 риеишошае по этому изобретению. Такие белки можно использовать в качестве белков-носителей, или они могут присутствовать как свободные белки, или они могут присутствовать и как белки-носители, и как свободные белки. Белки 81тер1ососси8 риеишошае по этому изобретению либо находятся на поверхности, по меньшей мере, во время части жизненного цикла пневмококка, либо представляют собой белки, которые пневмококк секретирует или высвобождает. Предпочтительно, белки по этому изобретению выбраны из следующих категорий, таких как: белки, имеющие мотив ЬХХС сигнальной последовательности типа II (где X представляет собой любую аминокислоту, например семейство полигистидиновой триады (РЫ!Х)), холинсвязывающие белки (СЬрХ), белки, имеющие мотив сигнальной последовательности типа I (например 8р101), белки, имеющие мотив БРХТС (где X представляет собой любую аминокислоту, например, 8р128, 8р130), и токсины (например Р1у). Предпочтительными примерами в этих категориях (или мотивах) являются следующие белки или их иммунологически функциональные эквиваленты.

В одном из воплощений иммуногенная композиция по этому изобретению содержит по меньшей мере 1 белок, выбранный из группы, состоящей из семейства полигистидиновой триады (РЫ!Х), семейства холин-связывающих белков (СЬрХ), усеченных форм СЬрХ, семейства Ьу1Х, усеченных форм Ьу1Х, химерных (или слитых) белков усеченный СЬрХ-усеченный Ьу1Х, пневмолизина (Р1у), РкрА, РкаА, 8р128, 8р101, 8р130, 8р125 и 8р133. В дополнительном воплощении иммуногенная композиция содержит 2 или более белков, выбранных из группы, состоящей из семейства полигистидиновой триады (Р111Х). семейства холин-связывающих белков (СЬрХ), усеченных форм СЬрХ, семейства Ьу1Х, усеченных форм Ьу1Х, химерных (или слитых) белков усеченный СЬрХ - усеченный Ьу1Х, пневмолизина (Р1у), РкрА, РкаА и 8р128. В еще одном воплощении иммуногенная композиция содержит 2 или более белков, выбранных из группы, состоящей из семейства полигистидиновой триады (РЫ!Х), семейства холинсвязывающих белков (СЬрХ), усеченных форм СЬрХ, семейства Ьу1Х, усеченных форм Ьу1Х, химерных (или слитых) белков усеченный СЬрХ - усеченный Ьу1Х, пневмолизина (Р1у) и 8р128.

Семейство РЫ (полигистидиновой триады) содержит белки РЫА, РЫВ, РЫЭ и РЫБ. Это семейство отличается последовательностью липидизации, двумя доменами, которые разделяет богатый пролином участком, и несколькими гистидиновыми триадами, возможно участвующими в связывании металла или нуклеозида или в ферментативной активности, (3-5) биспиральными участками, консервативным Ν’концом и гетерогенным С-концом. Оно присутствует во всех тестированных штаммах пневмококков. Гомологичные белки также найдены в других 81тер1ососс1 и в №188епа. В одном из воплощений этого изобретения белком РЫ по этому изобретению является РЫЭ. Однако надо понимать, что термины Рй1 А, В, Ό и Е относятся к белкам, имеющим последовательности, раскрытые в документах, цитированных ниже, а также их встречающиеся в природе (и получаемые человеком) варианты, у которых гомология последовательностей соответствует по меньшей мере 90%-ной идентичности эталонным белкам. Предпочтительно она является 95%-ной и наиболее предпочтительно она является 97%-ной.

Что касается белков РЫХ, РЫЛ раскрыт в №0 98/18930 и также обозначен как 8р36. Как отмечено выше, он является белком из семейства полигистидиновой триады и имеет сигнальный мотив ЬХХС типа II. РЫЭ раскрыт в №0 00/37105 и также обозначен как 8р036Э. Как отмечено выше, он также является белком из семейства полигистидиновой триады и имеет сигнальный мотив ЬХХС типа II. РЫВ раскрыт в №0 00/37105 и также обозначен как 8р036В. Другим членом семейства РЫВ является С3-расщепляющий полипептид, раскрытый в №0 00/17370. Этот белок также входит в семейство полигистидиновой триады и имеет сигнальный мотив ЬХХС типа II. Предпочтительным иммунологически функциональным эквивалентом является белок 8р42, раскрытый в №0 98/18930. В №0 99/15675 раскрыт усеченный РЫВ (приблизительно 79 кДа), который также считают членом семейства РЫХ. РЫБ раскрыт в №0 00/30299 и обозначен как ВУН-3. Упоминание здесь любого белка РЫ означает, что можно использовать иммуногенные фрагменты или продукты слияния этого белка РЫ. Например, ссылка на РЫХ включает в себя иммуногенные фрагменты или продукты слияния любого белка РЫ. Ссылка на РЫЭ или РЫВ также является ссылкой на продукты слияния РЫЭЕ или РЫВЕ, какие найдены, например, в №0 0198334.

Пневмолизин представляет собой мультифункциональный токсин с характерными цитолитическими (гемолитическими) и комплементактивирующими свойствами (КиЬшк е! а1., Ат. Векрк СП Саге Меб, 153:1339-1346 (1996)). Этот токсин не секретируется пневмококками, но высвобождается при лизисе пневмококков под влиянием автолизина. Его эффекты включают в себя, например, стимуляцию продукции воспалительных цитокинов человеческими моноцитами, ингибирование мерцания ресничек на респираторном эпителии человека и снижение бактерицидной активности и миграции нейтрофилов. Наиболее очевидным эффектом пневмолизина является лизис эритроцитов, который включает в себя связывание с холестерином. Поскольку он является токсином, его надо детоксифицировать (то есть, сделать нетоксичным для человека при предоставлении в дозировке, подходящей для защиты) перед тем, как его можно вводить ίη у1уо. Экспрессия и клонирование пневмолизина дикого типа или нативного пневмоли

- 11 015551 зина известны в данной области. См., например, Аа1кег с1 а1. (1пГсс( 1ттип, 55:1184-1189 (1987)), Мйс11с11 е! а1. (ВюсЫт Вюрйук Лс1а, 1007:67-72 (1989) и Мйсйе11 е! а1 (ΝΛΚ.. 18:4010 (1990)). Детоксификацию р1у можно осуществлять химическими способами, например обрабатывать его формалином или глутаральдегидом или их комбинацией (АО 04081515, РСТ/ЕР2005/010258). Такие способы хорошо известны в данной области для различных токсинов. Или же, р1у можно детоксифицировать генетически. Таким образом, это изобретение охватывает производные пневмококковых белков, которые могут быть, например, мутированными белками. Термин мутированный использован здесь для обозначения молекулы, которую подвергли делеции, добавлению или замене одной или более чем одной аминокислоты при использовании хорошо известных методик направленного мутагенеза или любого другого общепринятого способа. Например, как описано выше, мутантный белок р1у можно изменить так, что он будет биологически неактивным, при этом с сохранением его иммуногенных эпитопов, см., например, АО 90/06951, Вепу е! а1. (1пГес1 1ттип, 67:981-985 (1999)) и АО 99/03884.

Понятно, что при использовании здесь термин Р1у относится к мутированному или детоксифицированному пневмолизину, подходящему для медицинского применения (то есть, нетоксичному).

Что касается семейства холин-связывающих белков (СЬрХ), то члены этого семейства исходно были идентифицированы как пневмококковые белки, которые можно очищать холин-аффинной хроматографией. Все холинсвязывающие белки нековалентно связаны с фосфорилхолиновыми группировками тейхоевой кислоты клеточной стенки и связанной с мембраной липотейхоевой кислоты. В структурном отношении они имеют несколько областей, общих для всего семейства, хотя точная природа этих белков (аминокислотная последовательность, длина, и т.д.) может варьировать. В общем, холинсвязывающие белки содержат Ν-концевой участок (Ν), участки консервативных повторов (КТ и/или К2), богатый пролином участок (Р) и консервативный холин-связывающий участок (С), состоящий из многочисленных повторов, которые составляют приблизительно одну половину белка. При использовании в этой заявке термин семейство холин-связывающих белков (СЬрХ) выбран из группы, состоящей из холинсвязывающих белков, идентифицированных в АО 97/41151, РЬсА, 8ркА, РкрС, СЬрА, СЬрЭ и СЬрО. СЬрА раскрыт в АО 97/41151. СЬрО и СЬрО раскрыты в АО 00/29434. РкрС раскрыт в АО 97/09994. РЬсА раскрыт в АО 98/21337. 8ркА представляет собой холин-связывающий белок, раскрытый в АО 98/39450. Предпочтительно, холинсвязывающие белки выбраны из группы, состоящей из СЬрА, РЬсА, 8ркА и РкрС.

Другое предпочтительное воплощение представляет собой усеченные СЬрХ, где СЬрХ является таким, как определено выше, и усеченный относится к белкам СЬрХ, лишенным 50% или более холинсвязывающего участка (С). Предпочтительно, такие белки лишены всего холинсвязывающего участка. Более предпочтительно такие усеченные белки лишены (1) холинсвязывающего участка и (2) также части Ν-концевой половины белка, но сохраняют по меньшей мере один участок повторов (К1 или К2). Еще более предпочтительно, этот усеченный белок имеет 2 участка повторов (К1 и К2). Примерами таких предпочтительных воплощений являются ΝΚ1χΚ2 и К1хК2, проиллюстрированные в АО 99/51266 или АО 99/51188, однако другие холинсвязывающие белки, лишенные такого же холинсвязывающего участка, также входят в объем этого изобретения.

Семейство Ьу1Х представляет собой связанные с мембраной белки, ассоциированные с лизисом клеток. Ν-Концевой домен содержит холинсвязывающий(е) домен(ы), однако семейство Ьу1Х не имеет всех признаков вышеуказанного семейства СЬрА, и, таким образом, для настоящего изобретения семейство Ьу1Х считается отличным от семейства СЬрХ. В отличие от семейства СЬрХ, С-концевой домен содержит каталитический домен белка семейства Ьу1Х. Это семейство содержит Ьу! А, В и С. Что касается семейства Ьу1Х, Ьу1А раскрыт в Копба е! а1., Еиг 1 Вюсйет, 164:621-624 (1987). Ьу1В раскрыт в АО 98/18930 и также обозначен как 8р46. Ьу!С также раскрыт в АО 98/18930 и обозначен еще и как 8р91. Предпочтительным членом этого семейства является Ьу!С.

Другим предпочтительным воплощением являются усеченные Ьу!Х, причем Ьу!Х является таким, как определено выше, и усеченный относится к белкам Ьу1Х, лишенным 50% или более холинсвязывающего участка. Предпочтительно, такие белки лишены всего холинсвязывающего участка. Еще одним предпочтительным воплощением этого изобретения являются химерные (или слитые) белки усеченный СЬрХ-усеченный Ьу1Х. Предпочтительно, оно включает в себя ΝΚ1χΚ2 (или К1хК2) из СЬрХ и С-концевую часть (С!егт, то есть лишенную холин-связывающих доменов) из Ьу!Х (например, Ьу!СС!егт или 8р91 С!егт). Более предпочтительно СЬрХ выбран из группы, состоящей из СЬрА, РЬсА, 8ркА и РкрС. Еще более предпочтительно он представляет собой СЬрА. Предпочтительно Ьу!Х представляет собой Ьу!С (также обозначаемый как 8р91). Другим воплощением настоящего изобретения является усеченный РкрА или РкаА, лишенный холинсвязывающего домена (С) и экспрессирующийся в виде белка, слитого с Ьу!Х. Предпочтительно, Ьу!Х представляет собой Ьу!С.

Что касается РкаА и РкрА, то оба известны в данной области. Например, РкаА и его варианты с делецией трансмембранного участка описаны в Веггу & Ра!оп, 1пГес! 1ттип 1996 Эес:64(12):5255-62. РкрА и его варианты с делецией трансмембранного участка раскрыты, например, в И8 5804193, АО 92/14488 и АО 99/53940.

8р128 и 8р130 раскрыты в АО 00/76540. 8р125 представляет собой пример пневмококкового по

- 12 015551 верхностного белка с мотивом ЬРХТС для закрепления с клеточной стенкой (где X представляет собой любую аминокислоту). Как было обнаружено, любой белок в этом классе пневмококковых поверхностных белков является полезным в контексте этого изобретения и поэтому считается дополнительным белком по этому изобретению. Сам 8р125 раскрыт в XVО 98/18930 и также известен как 2трВ - цинксодержащая металлопротеиназа. 8р101 раскрыт в νθ 98/06734 (где он имеет обозначение # у85993). Он характеризуется сигнальной последовательностью типа I. 8р133 раскрыт в νθ 98/06734 (где он имеет обозначение # у85992). Он также характеризуется сигнальной последовательностью типа I.

Примерами предпочтительных белковых антигенов Могахе11а са1аггйайк, которые можно включать в комбинированную вакцину (особенно для предотвращения отита среднего уха) являются: ОМР106 [νθ 97/41731 (Ап!ех) и νθ 96/34960 (РМС)]; ОМР21 или его фрагменты (νθ 0018910); ЬЬрЛ и/или ЬЬрВ [νθ 98/55606 (РМС)]; ТЬрА и/или ТЬрВ [νθ 97/13785 и νθ 97/32980 (РМС)]; СорВ [Не1тшеп МЕ, е! а1. (1993) 1пГес1. 1ттип. 61:2003-2010]; ИкрА1 и/или ИкрА2 [νθ 93/03761 (итуегкйу оГ Техак)]; ОтрСЭ (ЕР 737085); НакН (РСТ/ЕР 99/03824); Р1Ю (РСТ/ЕР 99/03823); ОМР85 (РСТ/ЕР 00/01468); 11ро06 (СВ 9917977.2); 11ро10 (СВ 9918208.1); Йро11 (СВ 9918302.2); 11ро18 (СВ 9918038.2); Р6 (РСТ/ЕР 99/03038); Ό15 (РСТ/ЕР 99/03822); Отр1А1 (РСТ/ЕР 99/06781); Н1у3 (РСТ/ЕР 99/03257) и ОтрЕ. Примеры нетипируемых антигенов Наеторйбик шПиеп/ае или их фрагментов, которые можно включать в комбинированную вакцину (особенно для предотвращение отита среднего уха), включают в себя: белок фимбрин [(И8 5766608 - Ойю 81а1е Некеагсй Роипбабоп)] и продукты слияния, содержащие пептиды из него [например, слитые пептиды ЬВ1(Г); И8 5843464 (О8И) или VО 99/64067]; ОМР26 ^О 97/01638 (Сойеск)]; Р6 [ЕР 281673 (81а1е итуегкйу оГ Ыете Уотк)]; ТЬрА и/или ТЬрВ; Н1а; НкГ; Н1п47; Н1Г; Нтет1; Нт\т2; Нт\т3; Нт\\4; Нар; Ό15 ν 94/12641); Р2 и Р5 ν 94/26304).

Также может быть полезно комбинировать белки по этому изобретению. Комбинирование означает, что иммуногенная композиция содержит все белки из нижеследующих комбинаций либо в качестве белков-носителей, либо свободных белков, либо смеси тех и других. Например, в комбинации двух белков, как указано здесь ниже, оба белка можно использовать как белки-носители, или оба белка могут присутствовать как свободные белки, или оба могут присутствовать как в качестве носителя, так и в качестве свободного белка, или один может присутствовать в качестве белка-носителя и свободного белка, в то время как другой присутствует только в качестве белка-носителя или только в качестве свободного белка, или один может присутствовать в качестве белка-носителя, а другой в качестве свободного белка. Если имеет место комбинация трех белков, существуют такие же возможности. Предпочтительные комбинации включают в себя, без ограничения ими: РйЕЭ + ΝΚ1χΚ2, РйЕЭ + химерные или слитые белки ΝΡ1 /Р2-8р91С1егт. РйЕЭ + Р1у, РйЕЭ + 8р128, Рй1Э + РкаА, Рй1Э + РкрА, Рй!А + ΝΡ1χΡ2. Рй!А + химерные или слитые белки НК1/В2-8р91С1егт, Рй!А + Р1у, РЫЛ + 8р128, Рй!А + РкаА, Рй!А + РкрА, ΝΚ1/Β2 + Ьу1С, ΝΚ1/Β2 + РкрА, ΝΚ1/Β2 + РкаА, ΝΚ1/Β2 + 8р128, Н1/Н2 + Ьу1С, Κ1/Κ.2 + РкрА, В1/Н2 + РкаА, В1/Н2 + 8р128, В1/Н2 + РйЕЭ, В1/Н2 + Рй!А. Предпочтительно, ΝΚ1/Β2 (или В1/Н2) получен из СЬрА или РкрС. Более предпочтительно, он получен из СЬрА. Другие комбинации включают в себя комбинации 3 белков, такие как РйЮ + ΝΚ1/Β2 + Р1у и Рй!А + ΝΚ1/Β2 + Рй1Э. В одном из воплощений, вакцинная композиция содержит детоксифицированный пневмолизин и РйЕЭ или РйЕЭЕ в качестве белковносителей. В дополнительном воплощении вакцинная композиция содержит детоксифицированный пневмолизин и Рй1Э или РЙ1ЭЕ в качестве свободных белков.

В настоящем изобретении дополнительно предложена вакцина, содержащая иммуногенные композиции по этому изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент.

Вакцины по настоящему изобретению могут содержать адъювант, особенно когда они предназначены для применения у пожилых людей. Подходящие адъюванты включают в себя соль алюминия, такую как гель гидроксида алюминия (квасцы) или фосфат алюминия, но могут также представлять собой соль кальция, магния, железа или цинка, или могут представлять собой нерастворимую суспензию ацилированного тирозина, или ацилированные сахара, дериватизированные катионным или анионным путем сахариды или полифосфазины.

Предпочтительно адъювант выбран в качестве преимущественного индуктора ответа типа ТН1. Такие высокие уровни цитокинов Тй1-типа имеют тенденцию к преимущественной индукции опосредованных клетками иммунных ответов на данный антиген, в то время как высокие уровни цитокинов Тй2-типа имеют тенденцию к преимущественной индукции гуморальных иммунных ответов на антиген.

Различие Тй1- и Тй2-типа иммунного ответа не является абсолютным. В реальности, индивид будет поддерживать иммунный ответ, который описывают как представляющий собой преимущественно Тй1 или преимущественно Тй2. Однако часто удобно рассматривать семейства цитокинов в терминах, которые представлены для мышиных СО4-позитивных Т-клеточных клонов в Моктапп апб СоГГтап (Моктапп, Т.Н. апб СоГГтап, В.Б. (1989) ТН1 и ТН2 се11к: бйТегеп! райетпк оГ 1ушрйокте кестейоп 1еаб !о б1ГГегеп! Гипсйопа1 рторетйек. (Аппиа1 Веу1е\у оГ 1тшипо1оду, 7, р145-173). Ответы Тй1-типа традиционно ассоциируются с продукцией Т-лимфоцитами цитокинов ΙΝΕ-γ и 1Ь-2. Другие цитокины, такие как ЕБ-12, часто прямо ассоциированные с индукцией иммунных ответов Тй1-типа, не продуцируются Т-клетками, Напротив, ответы Тй2-типа ассоциированы с секрецией 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6, ЕБ-10. Подходящие адъювантные

- 13 015551 системы, которые способствуют преимущественно ТМ-ответу, включают в себя: монофосфорил липид А или его производное (или детоксифицированный липид А, в общем см., к примеру, \¥О 2005107798), в частности, 3-де-О-ацилированный монофосфорил липида Α (3Ό-ΜΡΕ) (его получение см. в СВ 2220211 А); и комбинации монофосфорила липида А, предпочтительно 3-де-О-ацилированного монофосфорила липида А, либо с солью алюминия (к примеру фосфатом алюминий или гидроксидом алюминия), либо с эмульсией масло в воде. В таких комбинациях антиген и 3Ό-ΜΡΕ содержатся в одних и тех же структурах, представляющих собой частицы, что делает возможной более эффективную доставку антигенных и иммуностимулирующих сигналов. Исследования показали, что 3Ό-ΜΡΕ способен дополнительно усиливать иммуногенность антигена, адсорбированного на квасцах |Т1юе1еп е! а1. Уассте (1998) 16:708-14; ЕР 689454-В1].

Усиленная система включает в себя комбинацию монофосфорила липида А (или детоксифицированного липида А) и производного сапонина, конкретно, комбинацию 0821 и 3Ό-ΜΡΕ, как раскрыто в \УО 94/00153, или менее реактогенную композицию, где 0821 гасят холестерином, как раскрыто в \УО 96/33739. Особенно сильнодействующий адъювантный препарат, включающий в себя 0821, 3Ό-ΜΡΕ (или детоксифицированный липид А) и токоферол в эмульсии масла в воде, описан в XVО 95/17210. В одном из воплощений иммуногенная композиция дополнительно содержит сапонин, которым может быть 0821. Препарат может также содержать эмульсию масло в воде и токоферол (^О 95/17210). Олигонуклеотиды, содержащие неметилированные СрС, (^О 96/02555), и другие иммуномодулирующие олигонуклеотиды (^О 0226757 и XV О 03507822) также являются преимущественными индукторами ТН1-ответа и подходят для применения в настоящем изобретении.

Конкретные адъюванты выбраны из группы солей металла, эмульсий масло в воде, агонистов То11подобных рецепторов (в частности, агониста То11-подобного рецептора 2, агониста То11-подобного рецептора 3, агониста То11-подобного рецептора 4, агониста То11-подобного рецептора 7, агониста То11подобного рецептора 8 и агониста То11-подобного рецептора 9), сапонинов или их комбинаций.

Адъюванты, которые можно использовать с вакцинными композициями по этому изобретению, представляют собой препарат пузырька или везикулы внешней мембраны из грамотрицательных бактериальных штаммов, таких как раскрыты в XV О 02/09746, конкретно, пузырьков Ν. тешпдШбщ. Адъювантные свойства этих пузырьков можно улучшить сохранением ЛОС (липоолигосахарида) на его поверхности (например, при использовании экстракции низкими концентрациями детергента [например 00,1% дезоксихолата]). ЛОС можно детоксифицировать мутациями ткЬВ(-) или Е1гВ(-), рассмотренными в ^О 02/09746. Адъювантные свойства можно также улучшить сохранением БогВ (и возможно удалением ГогА) из менингококковых пузырьков. Адъювантные свойства можно также улучшить усечением структуры сахаридного ядра внешних ЛОС на менингококковых пузырьках, к примеру, мутацией 1§1В(-). рассмотренной в XV О 2004/014417. Или же, указанные ЛОС (например, изолированные из штамма ткЬВ(-) и/или 1д1В(-)) можно очистить для использования в качестве адъюванта в композиции по этому изобретению.

Дополнительный адъювант, который можно использовать с композициями по этому изобретению, можно выбрать из группы: сапонин, липид А или его производное, иммуностимулирующий олигонуклеотид, фосфат алкилглюкозамина, эмульсия масло в воде или их комбинации. Дополнительным предпочтительным адъювантом является соль металла в комбинации с другим адъювантом. Предпочтительным является то, что этот адъювант является агонистом То11-подобного рецептора, в частности, агонистом То11-подобного рецептора 2, 3, 4, 7, 8 или 9, или сапонином, в частности, 0§21. Дополнительно предпочтительным является то, что адъювантная система содержит два или более чем два адъюванта из указанного перечня. В частности, эти комбинации предпочтительно содержат адъювант сапонин (в частности, 0§21) и/или агонист То11-подобного рецептора 9, такой как СрС-содержащий иммуностимулирующий олигонуклеотид. Другие предпочтительные комбинации содержат сапонин (в частности, 0821) и агонист То11-подобного рецептора 4, такой как монофосфорил липида А или его 3-деацилированное производное, 3Ό-ΜΡΕ, или сапонин (в частности, 0821) и лиганд То11-подобного рецептора 4, такой как алкилглюкозаминидфосфат.

Особенно предпочтительными адъювантами являются комбинации 3Ό-ΜΡΕ и 0821 (ЕР 0671948 В1), эмульсии масло в воде, содержащие 3Ό-ΜΡΕ и 0821 (^О 95/17210, XVО 98/56414), или 3Ό-ΜΡΕ, приготовленные с другими носителями (ЕР 0689454 В1). Другие предпочтительные адъювантные системы содержат комбинацию 3Ό ΜΡΕ, 0821 и СрС-олигонуклеотидов как описано в И8 6558670, И8 6544518.

В одном из воплощений адъювант представляет собой (или содержит) лиганд То11-подобного рецептора (ТЕК) 4, предпочтительно агонист, такой как производное липида А, конкретно, монофосфорил липид А или, более конкретно, 3-деацилированный монофосфорил липид А (3Ό-ΜΡΕ).

3Ό-ΜΡΕ доступен от С1ахо8тйЬК1ше Вю1одюа18 №г111 Атепса и главным образом улучшает ответы Т-клеток типа СИ4+ с фенотипом ΙΕΝ-γ (Т111). Его можно получать в соответствии со способами, раскрытыми в СВ 2220211 А. В химическом отношении он представляет собой смесь 3-деацилированного монофосфорила липида А с 3-, 4-, 5- или 6-ацилированными цепями. Предпочтительно, в композициях по настоящему изобретению используют мелкие частицы 3Ό-ΜΡΕ. Мелкие частицы 3Ό-ΜΡΕ имеют та

- 14 015551 кой размер частицы, что их можно стерилизовать фильтрацией через 0,22-мкм фильтр. Такие препараты раскрыты в международной заявке на патент № XVО 94/21292. Синтетические производные липида А известны и считаются агонистами ТЬК-4 в том числе, без ограничения:

ОМ174 (2-дезокси-6-о-[2-дезокси-2-[(К)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-о-фосфоно-в-Оглюкопиранозил]-2-[(К)-3-гидрокситетрадеканоиламино]-а-О-глюкопиранозилдигидрофосфат) (ν0

95/14026); ОМ 294 ЭР 1,10-бис(однозамещенный фосфат) (38,9К)-3-[(К)-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9(К)-[(К)-3-гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диола (ν0 99/64301 и νθ 00/0462) ОМ 197 МР-Ас ЭР 1-однозамещенный фосфат 10-(6-аминогексаноат) (38,9К)-3-[(К)додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9-[(К)-3-гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10диола (νθ 01/46127).

Другими лигандами ТЬК4, которые можно использовать, являются алкилглюкозаминидфосфаты (АСР), такие как те, что раскрыты в νθ 9850399 или И8 6303347 (также раскрыты способы получения АСР), или фармацевтически приемлемые соли АСР, раскрытые в И8 6764840. Некоторые АСР являются агонистами ТЬК.4, а некоторые АСР являются антагонистами ТЬК4. И те, и другие считаются полезными в качестве адъювантов.

Другим предпочтительным иммуностимулятором для применения в настоящем изобретении является Οιιί1 А и его производные. Οιιί1 А представляет собой препарат сапонина, выделенного из южноамериканского дерева Ош1а)а каропапа МоИпа, и впервые описан как имеющий адъювантную активность в 1974 у Эакдаатб е! а1. (8арошп абщгапГА. АтсЫу. Гиг б1е декаиНе У1гикГогксЬипд, Уо1. 44, 8рттдет Уег1ад, ВетГп, р. 243-254). При использовании ВЭЖХ были выделены очищенные фрагменты ΟιιίΙ А, которые сохраняют адъювантную активность без токсичности, ассоциированной с Οιιί1 А (ЕР 0362278), например 087 и 0821 (также известные как 0А7 и 0А21). 08-21 является натуральным сапонином, полученным из коры ОиШа.)а каропапа МоЕпа, который индуцирует цитотоксические Т-клетки типа СЭ8+ (СТЬ), Т111клетки и преимущественно ответ на 1дС2а-антитела и является предпочтительным сапонином в контексте настоящего изобретения.

Описаны конкретные препараты 0821, которые являются особенно предпочтительными, эти препараты дополнительно содержат стерол (νθ 96/33739). Сапонины, образующие часть настоящего изобретения, могут быть выделены в форме мицелл, смешанных мицелл (предпочтительно, но не исключительно, с солями желчных кислот), или могут быть в форме 18СОМ-матриц (ЕР 0109942 В1), липосом или родственных коллоидных структур, таких как червеобразные или кольцевидные мультимерные комплексы или липидные слоистые структуры и ламеллы, когда их приготавливают с холестерином и липидом, или в форме эмульсии масло в воде (например, как в νθ 95/17210). Сапонины предпочтительно могут быть ассоциированы с солью металла, такой как гидроксид алюминия или фосфат алюминия (νθ 98/15287).

Предпочтительно, сапонин предоставляют в форме липосомы, иммуностимулирующего комплекса 18СОМ или эмульсии масло в воде.

Усиленные системы включают в себя комбинацию монофосфорила липида А (или детоксифицированного липида А) и производного сапонина, конкретно, комбинацию 0821 и 3Э-МРЬ, как раскрыто в νθ 94/00153, или менее реактогенную композицию, где 0821 гасят холестерином, как раскрыто в νθ 96/33739. Особенно сильнодействующий адъювантный препарат, включающий в себя токоферол в присутствии или в отсутствие 0821 и/или 3Э-МРЬ в эмульсии масло в воде, описан в νθ 95/17210. В одном из воплощений иммуногенная композиция дополнительно содержит сапонин, которым может быть 0821.

Также можно использовать иммуностимулирующие олигонуклеотиды или любой другой агонист То11-подобного рецептора (ТЬК) 9. Предпочтительные олигонуклеотиды для применения в адъювантах или вакцинах по настоящему изобретению представляют собой СрС-содержащие олигонуклеотиды, предпочтительно содержащие два или более динуклеотидных мотива СрС, разделенных по меньшей мере тремя, более предпочтительно по меньшей мере шестью или более нуклеотидами. СрС-мотив представляет собой нуклеотид цитозин с последующим нуклеотидом гуанином. СрС-олигонуклеотиды по настоящему изобретению являются в типичных случаях дезоксинуклеотидами. В предпочтительном воплощении межнуклеотидной группировкой в олигонуклеотиде является фосфородитиоат или, более предпочтительно, фосфоротиоатная связь, хотя в объем этого изобретения входят фосфодиэфиры и другие межнуклеотидные связи. Также в объем этого изобретения включены олигонуклеотиды со смешанными межнуклеотидными связями. Способы получения фосфоротиоатных олигонуклеотидов или фосфородитиоатов раскрыты в И8 5666153, И8 5278302 и νθ 95/26204.

Примеры предпочтительных олигонуклеотидов имеют следующие последовательности. Эти последовательности предпочтительно содержат фосфоротиоатные модифицированные межнуклеотидные связи.

ОЛИГО 1 (8Е0 ΙΌ N0:1): ТСС АТС АСС ТТС СТС АСС ТТ (СрС 1826)

ОЛИГО 2 (8Е0 ΙΌ N0:2): ТСТ ССС АСС СТС ССС САТ (СрС 1758)

ОЛИГО 3 (8Е0 ΙΌ N0:3): АСС САТ САС СТС ССС ССТ САС ССС АСС АСС

ОЛИГО 4 (8Е0 ΙΌ N0:4): ТСС ТСС ТТТ ТСТ ССТ ТТТ СТС СТТ (СрС 2006)

ОЛИГО 5 (8Е0 ΙΌ N0:5): ТСС АТС АСС ТТС СТС АТС СТ (СрС 1668)

- 15 015551

ОЛИГО 6 (8ЕО ΙΌ N0:6): ТОО АСО ТТТ ТОО ОСО СОС ОСС О (СрО 5456)

Альтернативные СрО-олигонуклеотиды могут содержать вышеуказанные предпочтительные последовательности, у которых есть непоследовательные делеции или добавления к ним.

СрО-олигонуклеотиды, используемые в настоящем изобретении, можно синтезировать любым способом, известным в данной области (например см. ЕР 468520). Удобным является то, что такие олигонуклеотиды можно синтезировать при использовании автоматического синтезатора.

Адъювант может представлять собой эмульсию масло в воде или может содержать эмульсию масло в воде в комбинации с другими адъювантами. Масляная фаза эмульсионной системы предпочтительно содержит метаболизируемое масло. Значение термина метаболизируемое масло хорошо известно в данной области. Метаболизируемое можно определить как способное к трансформированию метаболизмом (Эог1апб'8 ШнЫнИеб МеФса1 ЭюНопагу, ν.Β. 8апбег§ Сотрапу, 25^4Ь οάίΐίοη (1974)). Это масло может представлять собой любое растительное масло, рыбий жир, животное или синтетическое масло, которое не является токсичным для реципиента и способно к трансформации посредством метаболизма. Орехи, семена и зерна представляют собой обычные источники растительных масел. Синтетические масла также являются частью этого изобретения и могут включать в себя имеющиеся в продаже масла, такие как ΝΕΟΒΕΕ® и другие. Сквален (2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексаноат) представляет собой ненасыщенное масло, которое найдено в больших количествах в жире печени акулы и, в меньших количествах, в оливковом масле, в масле пшеничных зародышей, в масле рисовых отрубей и в дрожжах, и является особенно предпочтительным маслом для применения в этом изобретении. Сквален представляет собой метаболизируемое масло на основании того факта того, что он является промежуточным соединением в биосинтезе холестерина (Мегск шбех, 10'¹' Εάίΐίοη, еп!гу №8619).

В адъювантах, представляющих собой эмульсии масло в воде, также часто используют производные токола (например витамин Е) (ЕР 0382271 В1; И8 5667784; νΟ 95/17210). Производные токола, используемые в масляных эмульсиях (предпочтительно, в эмульсиях масло в воде) по этому изобретению, можно приготавливать, как описано в ЕР 0382271 В1, так как эти производные токола могут представлять собой дисперсии капелек токола, возможно содержащие эмульгатор, предпочтительно менее чем 1 мкм в диаметре. Альтернативно, производные токолов можно использовать в комбинации с другим маслом с образованием масляной фазы масляной эмульсии. Здесь раскрыты примеры масляных эмульсий, которые можно использовать в комбинации с токолом, такие как описанные выше метаболизируемые масла.

Адъюванты, представляющие собой эмульсию масло в воде, были сами по себе предложены как полезные в качестве адъювантных композиций (ЕР 0399843 В), а также комбинации эмульсий масло в воде и других активных агентов были описаны в качестве адъювантов для вакцин (ν0 95/17210; ν0 98/56414; νΟ 99/12565; νΟ 99/11241). Были описаны другие адъюванты, представляющие собой масляную эмульсию, такие как эмульсии вода в масле (И8 5422109; ЕР 0480982 В2) и эмульсии вода в масле в воде (И8 5424067; ЕР 0480981 В). Все они образуют предпочтительные системы масляных эмульсий (в частности, когда включают в себя производные токола) для получения адъювантов и композиций по настоящему изобретению.

Наиболее предпочтительно, масляная эмульсия (к примеру, эмульсии масло в воде) дополнительно содержит эмульгатор, такой как ТVΕΕN 80, и/или стерол, такой как холестерин. Предпочтительная масляная эмульсия (предпочтительно, эмульсия масло-в-воде) содержит метаболизируемое нетоксичное масло, такое как сквалан, сквален или токоферол, такой как альфа-токоферол (и, предпочтительно, как сквален, так и альфа-токоферол) и возможно эмульгатор (или поверхностно-активное вещество), такой как Тетееп 80. Также может быть включен стерол (предпочтительно холестерин). Способ получения эмульсий масло в воде хорошо известен специалисту в данной области. В общем, этот способ включает перемешивание масляной фазы, содержащей токол, с поверхностно-активным веществом, таким как раствор ΡΒ8/ТVΕΕN80™, при последующем гомогенизировании при использовании гомогенизатора, причем специалисту в данной области будет понятно, что этот способ, включающий пропускание этой смеси дважды через иглу шприца, должен быть подходящим для гомогенизирования малых объемов жидкости. В равной мере, способ эмульгации в микрофлюидизаторе (устройство М1108 Мкгойшбюк, максимум 50 прохождений за период 2 мин при максимальном входном давлении 6 бар (600х10³ Па) (выходное давление приблизительно 850 бар (850х10⁵ Па))) может быть адаптирован специалистом в данной области для получения меньших или больших объемов эмульсии. Эту адаптацию можно осуществить обычным экспериментированием, включающим проведение измерений получившейся эмульсии до достижения препарата с капельками масла требуемого диаметра. В эмульсии масло в воде масло и эмульгатор должны быть в водном носителе. Водным носителем может быть, например, забуференный фосфатом физраствор.

Размер капелек масла, обнаруживаемых в стабильной эмульсии масла в воде, предпочтительно составляет менее чем 1 мкм, и он может быть в диапазоне, по существу, 30-600 нм, предпочтительно, по существу, около 30-500 нм в диаметре и наиболее предпочтительно по существу 150-500 нм в диаметре и, в частности, приблизительно 150 нм в диаметре при измерении фотонной корреляционной спектро

- 16 015551 скопией. В этом отношении быть в пределах предпочтительных диапазонов должно быть 80% капелек масла по числу, более предпочтительно в определенном диапазоне размеров находится более чем 90% и наиболее предпочтительно более чем 95% капелек масла по числу. Количества компонентов, присутствующих в масляных эмульсиях по настоящему изобретению, удобным образом находятся в диапазоне 0,5-20% или от 2 до 10% масла (суммарный объем дозы), такого как сквален; и, когда он присутствует, от 2 до 10% альфа-токоферола; и от 0,3 до 3% поверхностно-активного вещества, такого как моноолеат полиоксиэтиленсорбитана. Предпочтительно соотношение масла (предпочтительно сквалена) и токола (предпочтительно α-токоферола) равно или меньше чем 1, поскольку это дает более стабильную эмульсию. Эмульгатор, такой как Тетееп 80 или 8рап 85 также может присутствовать на уровне приблизительно 1%. В некоторых случаях преимуществом может быть то, что вакцины по настоящему изобретению должны дополнительно содержать стабилизатор.

Примеры предпочтительных эмульсионных систем раскрыты в XVО 95/17210, XVО 99/11241 и ХУО 99/12565, которые раскрывают эмульсионные адъюванты на основе сквалена, α-токоферола и ΤΨΕΕΝ 80, возможно приготавливаемые с иммуностимуляторами 0821 и/или 30-МРЬ. Таким образом, в особенно предпочтительном воплощении настоящего изобретения адъювант по этому изобретению может дополнительно содержать дополнительные иммуностимуляторы, такие как ЛПС или его производные и/или сапонины. Примеры дополнительных иммуностимуляторов раскрыты здесь и в Уассте Оекщп Тйе 8иЬиш1 апб Абщуап! Арргоасй 1995, Рйагтасеийса1 Вю1есйпо1оду, Уо1ите 6, Ебк. Ро^е11, М.Р., апб М.Р, Р1епит Ргекк, Νονν Уогк апб Ьопбоп, Ι8ΒΝ 0-306-44867-Х.

В предпочтительном аспекте адъювант и иммуногенные композиции по этому изобретению содержат сапонин (предпочтительно 0821) и/или производное ЛПС (предпочтительно 30-МРЬ) в масляной эмульсии, описанной выше, возможно со стеролом (предпочтительно холестерином). Масляная эмульсия (предпочтительно эмульсия масла в воде) может дополнительно содержать крап 85, и/или лецитин, и/или трикаприлин. Адъюванты, содержащие эмульсию масла в воде, стерол и сапонин, раскрыты в XVО 99/12565.

В типичных случаях для введения человеку сапонин (предпочтительно 0821) и/или производное ЛПС (предпочтительно 30-МРЬ) должны присутствовать в дозе иммуногенной композиции для человека в диапазоне от 1 до 200 мкг, таком как 10-100 мкг, предпочтительно 10-50 мкг на дозу. В типичных случаях масляная эмульсия (предпочтительно, эмульсия масла в воде) должна содержать от 2 до 10% метаболизируемого масла. Предпочтительно она должна содержать от 2 до 10% сквалена, от 2 до 10% альфатокоферола и от 0,3 до 3% (предпочтительно 0,4-2%) эмульгатора (предпочтительно 1\\'ееп 80 [моноолеат полиоксиэтиленсорбитана]). Если присутствуют оба, сквален и альфа-токоферол, соотношение сквален:альфа-токоферол предпочтительно является равным 1 или меньшим чем 1, поскольку это обеспечивает более стабильную эмульсию. В эмульсиях, используемых в этом изобретении, также может присутствовать 8рап 85 (триолеат сорбитана) на уровне от 0,5 до 1%. В некоторых случаях преимуществом может быть то, что иммуногенные композиции и вакцины по настоящему изобретению должны дополнительно содержать стабилизатор, например другие эмульгаторы/поверхностно-активные вещества, в том числе каприловую кислоту (Мегск шбех 10^4Ь Ебйюп, еп!гу № 1739), из которых особенно предпочтительным является трикаприлин.

При включении сквалена и сапонина (предпочтительно 0821) также полезно включать в препарат стерол (предпочтительно холестерин), поскольку это позволяет снизить суммарный уровень масла в эмульсии. Это приводит к снижению стоимости производства, к улучшению общего удобства вакцинации, а также к качественному и количественному улучшению получаемых иммунных ответов, таким как улучшение продукции ΙΡΝ-γ. Соответственно, адъювантная система по настоящему изобретению в типичных случаях содержит соотношение метаболизируемое масло:сапонин (мас./мас.) в диапазоне от 200:1 до 300:1, также настоящее изобретение можно использовать в низкомасляной форме, предпочтительным диапазоном для которой является от 1:1 до 200:1, предпочтительно от 20:1 до 100:1 и наиболее предпочтительно большей частью 48:1, причем эта вакцина сохраняет полезные адъювантные свойства всех компонентов при гораздо более низком профиле реактогенности. Соответственно, особенно предпочтительные воплощения имеют соотношение сквален:О821 (мас./мас.) в диапазоне от 1:1 до 250:1, также предпочтительным диапазоном является от 20:1 до 200:1, предпочтительно от 20:1 до 100:1 и, наиболее предпочтительно, большей частью 48:1. Предпочтительно, также включен стерол (наиболее предпочтительно, холестерин) в соотношении сапонин: стерол, как описано здесь.

Эмульсионные системы по настоящему изобретению предпочтительно имеют малый размер капельки масла в субмикронном диапазоне. Наиболее предпочтительно, размеры капельки масла должны быть в диапазоне от 120 до 750 нм и, наиболее предпочтительно, 120-600 нм в диаметре.

Особенно сильнодействующий адъювантный препарат (для конечной комбинации с А1РО4 в иммуногенной композиции по этому изобретению) содержит сапонин (предпочтительно 0821), производное ЛПС (предпочтительно 3Э-МРР) и масляную эмульсию (предпочтительно сквален и альфа-токоферол в эмульсии масла в воде) как описано в ^О 95/17210 или в ^О 99/12565 (в частности, адъювантный препарат 11 в примере 2, табл. 1).

- 17 015551

Примеры агониста ТЬК2 включают в себя пептидогликан или липопротеин. Известными агонистами ТЬК7 являются имидазохинолины, такие как имиквимод и резиквимод. Одноцепочечная РНК также является известным агонистом ТЬК (ТЬК8 у людей и ТЬК7 у мышей), тогда как двухцепочечная РНК и поли-1С (полиинозиновая-полицитидиловая кислота - коммерческий синтетический имитатор вирусной РНК) являются примерами агонистов ТЬК3. 3Ό-ΜΡΕ является примером агониста ТЬК4, в то время как СрС является примером агониста ТЬК9.

Иммуногенная композиция может содержать антиген и иммуностимулятор, адсорбированный на соли металла. Вакцинные препараты на основе алюминия, где антиген и иммуностимулятор 3-де-Оацилированный монофосфорил липид Α (3Ό-ΜΡΕ) адсорбированы на одной и той же частице, раскрыты в ЕР 0576478 В1, ЕР 0689454 В1 и ЕР 0633784 В1. В этих случаях на соль алюминия сначала адсорбируют антиген и затем на те же частицы соли алюминия адсорбируют иммуностимулятор 3Ό-ΜΡΕ. Такие способы сначала включают суспендирование 3Ό-ΜΡΕ обработкой ультразвуком в водяной бане до уменьшения размера частиц до 80-500 нм. Антиген в типичных случаях адсорбируют на соли алюминий в течение одного часа при комнатной температуре при перемешивании. Затем добавляют к адсорбированному антигену суспензию 3Ό-ΜΡΕ и инкубируют препарат при комнатной температуре в течение 1 ч и затем хранят при 4°С до использования.

В другом способе иммуностимулятор и антиген находятся на отдельных частицах металла, как описано в ЕР 1126876. Этот улучшенный процесс включает адсорбцию иммуностимулятора на частице соли металла с последующей адсорбцией антигена на другой частице соли металла с последующим смешиванием этих отдельных металлических частиц для получения вакцины. Адъювант для применения в настоящем изобретении может представлять собой адъювантную композицию, содержащую иммуностимулятор, адсорбированный на частице соли металла, отличающуюся тем, что частица соли металла является, по существу, свободной от другого антигена. Более того, в настоящем изобретении предложены вакцины, которые отличаются тем, что иммуностимулятор адсорбирован на частицах соли металла, которые являютс, по существу, свободными от другого антигена, и тем, что частицы соли металла, которые адсорбированы на антигене, являются, по существу, свободными от другого иммуностимулятора.

Соответственно, в настоящем изобретении предложен адъювантный препарат, содержащий иммуностимулятор, который адсорбирован на частице соли металла, отличающийся тем, что эта композиция является, по существу, свободной от другого антигена. Более того, этот адъювантный препарат может быть промежуточным, таким что при использовании такого адъюванта, он требуется для изготовления вакцины. Соответственно, предложен способ получения вакцины, включающий смешивание адъювантной композиции, которая представляет собой один или более чем один иммуностимулятор, адсорбированный на частице металла с антигеном. Предпочтительно, антиген предварительно адсорбирован на соли металла. Указанная соль металла может быть такой же или похожей на соль металла, которая адсорбирована на иммуностимуляторе. Предпочтительно, соль металла представляет собой соль алюминия, например фосфат алюминия или гидроксид алюминия. В настоящем изобретении дополнительно предложена вакцинная композиция, содержащая иммуностимулятор, адсорбированный на первой частице соли металла, и антиген, адсорбированный на соли металла, отличающаяся тем, что первая и вторая частицы соли металла представляют собой отдельные частицы.

Производные или мутации ЛПС или ЛОС или производные липида А, описанные здесь, разработаны так, чтобы быть менее токсичными (например 3Ό-ΜΡΕ), чем нативные липополисахариды, и являются взаимозаменяемыми эквивалентами в том, что относится к любым применениям этих группировок, описанным здесь. Они могут быть лигандами ТЬК4, как описано выше. Другие такие производные раскрыты в АО 020786737, АО 9850399, АО 0134617, АО 0212258, АО 03065806.

В одном из воплощений адъювант, используемый для композиций по этому изобретению, содержит носитель, представляющий собой липосому, (который получен известными способами из фосфолипидов (таких как диолеилфосфатидилхолин [^ОΡС]) и возможно стерола [такого как холестерин]). Такие носители, представляющие собой липосому, могут нести производные липида А [такие как 3Ό-ΜΡΕ - см. выше] и/или сапонины (такие как 0821 - см. выше). В одном из воплощений адъювант содержит (на 0,5 мл дозы) 0,1-10 мг, 0,2-7, 0,3-5, 0,4-2 или 0,5-1 мг (например 0,4-0,6, 0,9-1,1, 0,5 или 1 мг) фосфолипида (к примеру, ПОНС). 0,025-2,5, 0,05-1,5, 0,075-0,75, 0,1-0,3 или 0,125-0,25 мг (например 0,2-0,3, 0,1-0,15, 0,25 или 0,125 мг) стерола (к примеру, холестерина), 5-60, 10-50 или 20-30 мкг (например 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) производного липида А (к примеру, 3Ό-ΜΡΕ) и 5-60, 10-50 или 20-30 мкг (например 515, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) сапонина (к примеру, 0821).

Этот адъювант является особенно подходящим для вакцинных препаратов для пожилых людей. В одном из воплощений вакцинная композиция, содержащая этот адъювант, содержит конъюгаты сахаридов, получаемых, по меньшей мере, из всех нижеследующих серотипов: 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Е, 23Е, 1, 5, 7Е (и могут также содержать один или более из серотипов 3, 6А, 19А и 22Е), причем ΟΜί (геометрическое среднее концентрации, ГСК) титр антител, индуцированных против одного или более чем одного (или всех) компонента(ов) вакцины 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Е и 23Е, незначительно ниже того, который индуцирует вакцина ΡϊΌνηπΐ¹® у вакцинированных людей.

В одном из воплощений адъювант, используемый для композиций по этому изобретению, содержит

- 18 015551 эмульсию масло в воде, полученную из метаболизируемого масла (такого как сквален), эмульгатор (такой как Т\\^гееп 80) и возможно токол (такой как альфа-токоферол). В одном из воплощений адъювант содержит (на 0,5 мл дозы) 0,5-15, 1-13, 2-11, 4-8 или 5-6 мг (например 2-3, 5-6 или 10-11 мг) метаболизируемого масла (такого как сквален), 0,1-10, 0,3-8, 0,6-6, 0,9-5, 1-4 или 2-3 мг (например 0,9-1,1, 2-3 или 45 мг) эмульгатора (такого как Т\уееп 80) и возможно 0,5-20, 1-15, 2-12, 4-10, 5-7 мг (например 11-13, 5-6 или 2-3 мг) токола (такого как альфа-токоферол).

Этот адъювант возможно дополнительно может содержать 5-60, 10-50 или 20-30 мкг (например 515, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) производного липида А (к примеру 3О-МРЬ).

Эти адъюванты являются особенно подходящими для вакцинных препаратов для младенцев или пожилых людей. В одном из воплощений вакцинная композиция, содержащая этот адъювант, содержит конъюгаты сахаридов, полученных по меньшей мере из всех нижеследующих серотипов: 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Е, 23Е, 1, 5, 7Е (и может также содержать один или более чем один из серотипов 3, 6А, 19А, и 22Е), причем ГСК титр антител, индуцированных против одного или более чем одного (или всех) компонентов) вакцины 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Е и 23Е незначительно ниже того, что индуцировано вакциной Ргеупаг® у вакцинированных людей.

Этот адъювант может содержать возможно 0,025-2,5, 0,05-1,5, 0,075-0,75, 0,1-0,3 или 0,125-0,25 мг (например 0,2-0,3, 0,1-0,15, 0,25 или 0,125 мг) стерола (к примеру, холестерина), 5-60, 10-50, или 20-30 мкг (например 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) производного липида А (к примеру, 30-МРЬ) и 5-60, 10-50, или 20-30 мкг (например 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) сапонина (к примеру, Ц821).

Этот адъювант является особенно подходящим для вакцинных препаратов для пожилых людей. В одном из воплощений вакцинная композиция, содержащая этот адъювант, содержит конъюгаты сахаридов, полученных по меньшей мере из всех нижеследующих серотипов: 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Е, 23Е, 1, 5, 7Е (и может также содержать один или более чем один из серотипов 3, 6 А, 19А и 22Е), причем ГСК титр антител, индуцированных против одного или более чем одного (или всех) компонента(ов) вакцины 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Е и 23Е незначительно ниже того, что индуцировано вакциной Ргеупаг® у вакцинированных людей.

В одном из воплощений адъювант, используемый для композиций по этому изобретению, содержит фосфат алюминия и производное липида А (такое как 30-МРЬ). Этот адъювант может содержать (на 0,5 мл дозы) 100-750, 200-500 или 300-400 мкг А1 в виде фосфата алюминия и 5-60, 10-50 или 20-30 мкг (например 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) производного липида А (к примеру, 30-МРЬ).

Этот адъювант является особенно подходящим для вакцинных препаратов для пожилых людей или младенцев. В одном из воплощений вакцинная композиция, содержащая этот адъювант, содержит конъюгаты сахаридов, полученных по меньшей мере из всех нижеследующих серотипов: 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Е, 23Е, 1, 5, 7Е (и может также содержать один или более чем один из серотипов 3, 6А, 19А, и 22Е), причем ГСК титр антител, индуцированных против одного или более чем одного (или всех) компонента(ов) вакцины 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Е и 23Е незначительно ниже того, что индуцирует вакцина Ргеупаг® у вакцинированных людей.

Вакцинные препараты, содержащие иммуногенные композиции по настоящему изобретению, можно использовать для защиты или лечения млекопитающего, подверженного инфекции, введением указанной вакцины системным путем или через слизистую. Эти введения могут включать в себя инъекцию внутримышечным, внутрибрюшинным, внутрикожным или подкожным путем или введение через слизистую в ротовой/пищеварительный, дыхательный, мочеполовой тракты. Можно осуществлять интраназальное введение вакцин для лечения пневмонии или отита среднего уха (поскольку так можно более эффективно предотвращать носительство пневмококков в носоглотке, таким образом ослабляя инфекцию на ее самой ранней стадии). Хотя вакцину по этому изобретению можно вводить в виде однократной дозы, ее компоненты можно также вводить совместно в одно и то же время или в разные моменты времени (к примеру, конъюгаты пневмококковых сахаридов можно вводить раздельно, в одно и то же время или через 1-2 недели после введения любого компонента вакцины, представляющего собой бактериальный белок, для оптимальной координации иммунных ответов относительно друг друга). Для совместного введения возможный ТЫ-адъювант может присутствовать в любом или всех из числа разных введений. Вдобавок к единственному пути введения, можно использовать 2 разных пути введения. Например, сахариды или конъюгаты сахаридов можно вводить внутримышечным (1М) или внутрикожным (Ш) путем, а бактериальные белки можно вводить интраназальным (ΙΝ) или ΙΌ путем. Вдобавок, вакцины по этому изобретению можно вводить 1М путем для примирующих доз и ΙΝ путем для бустерных доз.

Содержание белковых антигенов в вакцине в типичных случаях будет находиться в диапазоне от 1 до 100 мкг, предпочтительно от 5 до 50 мкг, в наиболее типичных случаях в диапазоне от 5 до 25 мкг. После исходной вакцинации субъекты могут получать одну или несколько бустерных иммунизаций через адекватные промежутки.

Получение вакцин в общем описано в Уассше Эекщп (ТНе киЬипб апб аб)иуап1 арргоасЬ (ебк Ро\\е11 М.Е. & №\утап М.1.) (1995) Р1епит Ргекк №\ν Уогк). Инкапсулирование в липосомах описано в Еи11ейоп, Патент США 4235877.

- 19 015551

Вакцины по настоящему изобретению можно хранить в растворе или лиофилизировать. Предпочтительно, раствор лиофилизируют в присутствии сахара, такого как сахароза или лактоза. Еще более предпочтительным является то, что их лиофилизируют и восстанавливают непосредственно перед применением. Лиофилизация может приводить к более стабильной композиции (вакцине) и, возможно, приводить к повышенным титрам антител в присутствии 3^-МΡ^ и в отсутствие адъюванта на основе алюминия.

В одном из аспектов этого изобретения предложен вакцинный набор, включающий флакон, содержащий иммуногенную композицию по этому изобретению, возможно в лиофилизированной форме, и дополнительно включающий флакон, содержащий адъювант, как описано здесь. Предусмотрено, что в этом аспекте изобретения адъювант будет использован для восстановления лиофилизированной иммуногенной композиции.

Хотя вакцины по настоящему изобретению можно вводить любым путем, введение описанных вакцин в кожу (ΙΌ) образует одно из воплощений настоящего изобретения. Человеческая кожа содержит внешнюю роговую кутикулу, называемую роговым слоем, которая покрывает эпидермис. Ниже этого эпидермиса находится слой, который называют дермой, в свою очередь покрывающий подкожную ткань. Исследователи показали, что инъекция вакцины в кожу и, в частности, в дерму стимулирует иммунный ответ, что может также быть связано с множеством дополнительных преимуществ. Внутрикожная вакцинация описанными здесь вакцинами образует предпочтительный признак настоящего изобретения.

Общепринятая методика внутрикожной инъекции, процедура манту, включает стадии очистки кожи и затем, при оттягивании одной рукой и при том, что острие тонкой иглы (калибр 26-31) направлено вверх, введения иглы под углом 10-15°. Когда острие иглы введено, стержень иглы опускают и дополнительно продвигают, прилагая легкое давление для того, чтобы приподнять ее под кожей. Затем очень медленно инъецируют жидкость, чем образуют пузырек или вздутие на поверхности кожи, и затем медленно извлекают иглу.

Недавно были описаны устройства, которые специально предназначены для введения жидких агентов в или через кожу, например устройства, описанные в XVО 99/34850 и ЕР 1092444, а также описаны устройства для струйной инъекции, например, в νθ 01/13977; И8 5480381, И8 5599302, И8 5334144, И8 5993412, И8 5649912, И8 5569189, И8 5704911, И8 5383851, И8 5893397, И8 5466220, И8 5339163, И8 5312335, И8 5503627, И8 5064413, И8 5520639, И8 4596556, И8 4790824, И8 4941880, И8 4940460, νθ 97/37705 и νθ 97/13537. Альтернативные способы внутрикожного введения вакцинных препаратов могут включать общепринятые шприцы и иглы или устройства, предназначенные для баллистической доставки твердых вакцин (νθ 99/27961), или чрескожные пластыри (νθ 97/48440; νθ 98/28037), или нанесение на поверхность кожи (чрезкожная или трансдермальная доставка νθ 98/20734; νθ 98/28037).

Когда вакцины по настоящему изобретению предназначены для введения в кожу или, более конкретно, в дерму, вакцина находится в малом объеме жидкости, конкретно, в объеме между приблизительно 0,05и 0,2 мл.

Содержание антигенов в кожных или внутрикожных вакцинах по настоящему изобретению может быть таким же, как общепринятые дозы во внутримышечных вакцинах (см. выше). Однако признаком кожных или внутрикожных вакцин является то, что эти препараты могут быть низкодозовыми. Соответственно, белковые антигены в низкодозовых вакцинах предпочтительно присутствуют в таких малых количествах, как от 0,1 до 1 мкг, предпочтительно от 0,1 до 5 мкг на дозу; и сахаридные (предпочтительно конъюгированные) антигены могут присутствовать в диапазоне от 0,01 до 1 мкг и предпочтительно от 0,01 до 0,5 мкг сахарида на дозу.

При использовании здесь термин внутрикожная доставка означает доставку вакцины в область дермы в коже. Однако вакцина не обязательно должна быть локализована исключительно в дерме. Дерма представляет собой слой в коже, локализованный между приблизительно 1,0 и приблизительно 2,0 мм от поверхности в коже человека, но между индивидами и в разных частях организма имеет место определенная степень варьирования. В общем, можно предполагать достижение дермы прохождением на 1,5 мм ниже поверхности кожи. Дерма находится между роговым слоем и эпидермисом на поверхности и нижележащим подкожным слоем. В зависимости от способа доставки, вакцина может в конечном счете быть локализованной исключительно или главным образом в пределах дермы, или она может в конечном счете быть распределенной в пределах эпидермиса и дермы.

В настоящем изобретении дополнительно предложена улучшенная вакцина для предотвращения или ослабления отита среднего уха, вызванного НаеторЫ1и§ шЛие^ае, добавлением белков НаеторЫ1и§ тПиег^ае (см. выше), например белка Ό в свободной или конъюгированной форме. Вдобавок, в настоящем изобретении дополнительно предложена улучшенная вакцина для предотвращения или ослабления пневмококковой инфекции у младенцев (например отита среднего уха) на основе добавления одного или двух пневмококковых белков (см. выше) в виде свободного или конъюгированного белка к композиции конъюгата 8. рпеитошае по этому изобретению. Указанные пневмококковые свободные белки могут быть одинаковыми или иными, чем любые белки 8. рпеитошае, использованные как белки-носители. Также в комбинированную вакцину можно включить один или более чем один белковый антиген Могахе11а са1аггНа115 (см. выше) в свободной или конъюгированной форме. Таким образом, настоящее изобре

- 20 015551 тение представляет собой улучшенный способ вызывать (защитный) иммунный ответ против отита среднего уха у младенцев.

В еще одном воплощении настоящее изобретение представляет собой улучшенный способ вызывать (защитный) иммунный ответ у младенцев (в возрасте 0-2 года) введением безопасного и эффективного количества вакцины по этому изобретению. Дополнительные воплощения настоящего изобретения заключаются в том, чтобы предложить антигенные композиции конъюгатов δ. рпеитошае по этому изобретению для применения в медицине и применение конъюгатов δ. рпеитошае по этому изобретению в изготовлении лекарства для предотвращения (или лечения) пневмококкового заболевания.

В еще одном воплощении настоящее изобретение представляет собой улучшенный способ вызывать (защитный) иммунный ответ у пожилого населения (в контексте настоящего изобретения пациентов считают пожилыми, если их возраст равен 50 годам или превышает 50 лет, в типичных случаях превышает 55 лет и обычно превышает 60 лет) введением безопасного и эффективного количества вакцины по этому изобретению, предпочтительно, в сочетании с одним или двумя белками δ. рпеитошае в виде свободного(ых) или конъюгированного(ых) белка(ов), причем свободные белки δ. рпеитошае могут быть теми же или иными, чем любые белки δ. рпеитошае, использованные как белки-носители.

Дополнительный аспект этого изобретения представляет собой способ иммунизации человекареципиента против заболевания, вызываемого инфекцией δ. рпеитошае и возможно НаеторЫ1ик 1пПиепхае, включающий введение реципиенту иммунопротективной дозы иммуногенной композиции или вакцины, или набора по этому изобретению.

Дополнительный аспект этого изобретения представляет собой иммуногенную композицию по этому изобретению для применения в лечении или предупреждении заболевания, вызываемого инфекцией δ.рηеитоη^ае и возможно НаеторШик шПиепхае.

Дополнительный аспект этого изобретения представляет собой применение иммуногенной композиции или вакцины, или набора по этому изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения заболеваний, вызываемых инфекцией δ. рпеитошае и возможно НаеторЫ1ик шПиепхае.

В дополнительном аспекте этого изобретения предложено применение иммуногенной композиции или вакцины по этому изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения заболеваний, вызываемых инфекцией штаммами δ!^ер!ососсик рпеитошае О-ацетилированных серотипов 18С и штаммами де-О-ацетилированных серотипов 18С.

В дополнительном аспекте этого изобретения предложено применение иммуногенной композиции или вакцины по этому изобретению, содержащей конъюгат капсульного сахарида серотипа 19Е, но не содержащей капсульный сахарид из серотипа 19 А, в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения заболеваний, вызываемых инфекцией штаммами δΐ^ер!ососсик рпеитошае серотипа 19 А.

Термины содержащий, содержат и содержит в каждом случае здесь предназначены авторами изобретения быть возможно взаимозаменяемыми с терминами состоящий из, состоят из и состоит из соответственно.

Воплощения, относящиеся здесь к вакцинной композиции по этому изобретению, также являются применимыми к воплощениям, относящимся к иммуногенной композиции по этому изобретению, и наоборот.

Все ссылки или заявки на патент, процитированные в этом описании патента, включены сюда посредством ссылки.

Для лучшего понимания этого изобретения приведены нижеследующие примеры. Эти примеры представляют собой только иллюстрацию, и их не следует считать ограничивающими объем этого изобретения каким-либо образом.

Примеры

Пример 1. Экспрессия белка Ό.

Белок Ό НаеторШик шПиепхае.

Генетическая конструкция для экспрессии белка Ό.

Исходные вещества.

ДНК, кодирующая белок Ό.

Белок Ό является весьма консервативным среди всех серотипов и нетипируемых штаммов Н. шПиепхае. Вектор рН1С348, содержащий последовательность ДНК, кодирующую полный ген белка Ό, был получен от д-ра А. Еогкдгеи, Эераг1теп1 оП МеФса1 М1сгоЫо1о§у, Ишуегкйу оП ЬииП, Ма1то Сепега1 Нокр1!а1, Ма1то, δ\\Όώ2π. Последовательность ДНК белка Ό была опубликована в 1апкоп е! а1. (1991) 1пПес!. 1ттип. 59: 119-125.

Экспрессионный вектор рМС1.

Экспрессионный вектор рМС1 представляет собой производное рВК322 (Сгокк е! а1., 1985), в которое были введены происходящие из бактериофага-λ контрольные элементы для транскрипции и трансляции чужеродных вставленных генов (Ы1а1хтап е! а1., 1983). Вдобавок, ген устойчивости к ампициллину заменен геном устойчивости к канамицину.

- 21 015551

Штамм Е. со11 АК58.

Штамм Е. со11 АК58 получали трансдукцией Ν99 при использовании маточной культуры фага Р1, ранее выращенной на производном 8А500 (§а1Е::Т№0, 1атЫаКИ с1857 АН1). Ν99 и 8А500 представляют собой штаммы Е. со11 К12, полученные из лаборатории д-ра Магйи ВозеиЬегд в Национальном институте здравоохранения США (Ыа!юиа1 1из!1!и!е оГ Неа1!1).

Экспрессионный вектор рМО 1.

Для получения белка Ώ кодирующую этот белок ДНК клонировали в экспрессионном векторе рМО 1. Эта плазмида использует сигналы из ДНК фага-лямбда для управления транскрипцией и трансляцией вставленных чужеродных генов. Вектор содержит промотор РЬ, оператор ОО и два утилизационных сайта (Ыи!Г и ΝιιΐΗ) для снятия эффектов транскрипционной полярности при наличии Ν-белка (Огозз е! а1., 1985). Векторы, содержащие промотор РЬ, вводят в лизогенного хозяина, представляющего собой Е. со11, для стабилизации плазмидной ДНК. Штаммы лизогенного хозяина содержат ДНК фага-лямбда, дефективного по репликации, которая интегрирована в геном (8Ка1/тап е! а1., 1983). Хромосомная ДНК фагалямбда направляет синтез репрессорного белка с1, который связывается с репрессором ОО в векторе и предотвращает связывание РНК-полимеразы с промотором РЬ и тем самым транскрипцию вставленного гена. Ген с1 экспрессионного штамма АК58 содержит температурочувствительный мутант, так что РЬ направляет транскрипцию, которую можно регулировать температурным сдвигом, то есть, увеличение температуры в культуре инактивирует репрессор и инициирует синтез чужеродного белка. Эта экспрессионная система позволяет контролировать синтез чужеродных белков, особенно тех, которые могут быть токсичными для клетки (8Ыта!ака & ВозеиЬегд, 1981).

Штамм АК58 Е. со11.

Лизогенный штамм АК58 Е. со11, использованный для получения носителя, представляющего собой белок Ώ, является производным стандартного для ΝΙ11 штамма Ν99 Е. со11 К12 (Р^- зи^- да1К2, 1ас7^- !1г^-). Он содержит дефективный лизогенный фаг-лямбда (2πΙΓ::ΤΝ10, 1атЬёаК11^- с1857 АН1). Фенотип К11 предотвращает прекращение синтеза макромолекул хозяина. Мутация с1857 делает с1-репрессор температурочувствительным. Делеция АН1 удаляет правый оперон фага-лямбда и локусы Ью, иуг3 и с11А хозяина. Штамм АК58 генерировали трансдукцией Ν99 при использовании маточной культуры фага Р1, ранее выращиваемой на производном 8А500 (βπΙΓ::ΤΝ 10, 1атЬёаК11^-с1857 ААН1). Введение дефективного лизогена в Ν99 осуществляли при использовании селекции с тетрациклином благодаря присутствию транспозона ΤΝ10, кодирующего устойчивость к тетрациклину в смежном гене да1Е.

Конструирование вектора рМОМЭРРтЭ.

Для конструирования рМОМЭРРтЭ использовали вектор рМО 1, который содержит ген, кодирующий неструктурный белок 81 вируса гриппа (рМОЫ81). Ген белка Ώ амплифицировали с помощью ПЦР из вектора рН1С348 Даизои е! а1. 1991 1иГес!. 1ттии. 59:119-125) с праймерами для ПЦР, содержащими рестрикционные сайты ΝιόΙ и ХЬа1 на 5'- и 3'-концах соответственно. Затем вводили Ж'оГХЬа!-фрагмент в рМОЫ81 между Ысо1 и ХЬа1, таким образом получая слитный белок, содержащий 81 Ν-концевую аминокислоту белка Ν81 и далее белок РЭ. Это вектор обозначили как рМОЫ81РгЭ.

На основании вышеописанной конструкции получали конечную конструкцию для экспрессии белка Ώ. Из рМОЫ81 РгЭ удаляли ВатН1/ВатН1-фрагмент. Этот гидролиз ДНК удаляет область, кодирующую Ν81, за исключением первых трех Ν-концевых остатков. При повтором лигировании векторного гена получали ген, кодирующий слитный белок с нижеследующей Ν-концевой аминокислотной последовательностью:

—МОР 88Η88ΝΜΑΝΤ-N81 Белок ϋ

Этот белок Ώ не содержит лидерного пептида или Ν-концевого цистеина, к которому в норме присоединены липидные цепи. Поэтому белок ни экскретируется в периплазму, ни подвергается липидизации и остается в цитоплазме в растворимой форме.

Конечный конструкт рМО-МЭРРтЭ вводили в штамм-хозяин АВ58 тепловым шоком при 37°С. Бактерии, содержащие плазмиду, подвергали селекции в присутствии канамицина. Присутствие вставки ДНК, кодирующей белок Ώ, демонстрировали расщеплением изолированной плазмиды ДНК выбранными эндонуклеазами. Этот рекомбинантный штамм Е. со11 обозначили как ЕСЭ4.

Экспрессия белка Ώ находится под контролем РЬ-промотора/О^оператора фага-лямбда. Штаммхозяин АВ58 содержит в геноме температурочувствительный ген с1, который при низкой температуре блокирует экспрессию с лямбда-Р]^ связыванием с О При повышении температуры с1 высвобождается из О_ь и белок Ώ экспрессируется.

Получение в малом масштабе.

В конце ферментации клетки концентрируют и замораживают.

Экстракцию из собранных клеток и очистку белка Ώ осуществляли нижеследующим образом. Замороженный осадок клеточной культуры оттаивают и снова суспендируют в растворе для разрушения клеток (цитратный буфер рН 6,0) до конечного Οϋ₆₅₀=60. Эту суспензию дважды пропускают через гомогенизатор высокого давления при Р=1000 бар (100 х10⁵ Па). Гомогенат клеточной культуры осветляют

- 22 015551 центрифугированием, и клеточные остатки удаляют фильтрованием. На первой стадии очистки фильтрованный лизат наносят на колонку для катионообменной хроматографии (8Р 8ерЫагоке Рак! Р1оте). ΓΌ связывается матриксом геля ионным взаимодействием и элюируется на стадии увеличения ионной силы элюционного буфера.

На второй стадии очистки примеси удерживаются на анионообменном матриксе (О 8ерЫагоке Рак! Р1о\у). ΓΌ не связывается с гелем, и его можно собрать промыванием.

На обеих стадиях колоночной хроматографии сбор фракций отслеживают по оптической плотности (0Ό). Поток с анионообменной хроматографической колонки, содержащий очищенный белок Ό, концентрируют ультрафильтрацией.

Содержащий белок Ό материал на фильтре окончательно пропускают через 0,2-мкм мембрану.

Получение в крупном масштабе.

Экстракцию из собранных клеток и очистку белка Ό осуществляли нижеследующим образом. Собранный бульон охлаждают и дважды пропускают прямо через гомогенизатор высокого давления при давлении около 800 бар (80х 10⁵ Па).

На первой стадии очистки гомогенат клеточной культуры разбавляют и наносят на колонку для катионообменной хроматографии (8Р 8ерйатоке Вщ Ьеабк). ΓΌ связывается с гелевым матриксом ионным взаимодействием, и его элюируют на стадии увеличения ионной силы элюционного буфера и фильтруют.

На второй стадии очистки примеси удерживаются анионообменным матриксом (О 8ерйатоке Рак! Р1о\у). ΓΌ не связывается с гелем и может быть собран промыванием.

На обеих стадиях колоночной хроматографии сбор фракций отслеживают по оптической плотности (0Ό). Поток с анионообменной хроматографической колонки, содержащий очищенный белок Ό, концентрируют и подвергают фильтрационному диализу ультрафильтрацией.

Содержащий белок Ό материал на фильтре окончательно пропускают через 0,2-мкм мембрану.

Пример 1б. Экспрессия Р11ГО.

Белок Р11ГО является членом семейства пневмококковых белков гистидиновой триады (РЫ!), которые характеризуются присутствием гистидиновых триад (мотив НХХНХН). Р11ГО представляет собой молекулу из 838 аминокислот (а-к.) и несет 5 гистидиновых триад (см. аминокислотную последовательность в Меб1ттипе №0 00/37105 8ЕС ГО N0: 4 и последовательность ДНК в 8ЕС ГО N0: 5). Р11ГО также содержит обогащенный пролином участок в середине (аминокислотные позиции 348-380). Р11ГО имеет Νконцевую сигнальную последовательность из 20 а-к. с мотивом ЬХХС.

Генетическая конструкция

Последовательность гена зрелого белка Меб1ттипе Р11ГО (от а-к. 21 до а-к. 838) переносили рекомбинантным способом в Е. со11 при использовании вектора рТСМР14 собственного изготовления, который нес промотор фага-лямбда. Штаммом-хозяином Е. со11 является АВ58, который несет термочувствительный репрессор с1857, делающий возможным тепловую индукцию промотора.

Для амплификации гена р11ГО полимеразную цепную реакцию осуществляли с плазмиды Меб1ттипе (несущей ген р11ГО из 8!гер!ососсик рпеитошае, штамм №г\тау 4 (серотип 4) - 8ЕС ГО N0: 5, как описано в №0 00/37105). Для амплификации гена р11ГО в двух фрагментах использовали праймеры, специфичные только для гена р11ГО. Эти праймеры несут рестрикционные сайты либо Νώ;1 и Крп1, либо Крп1 и ХЬа1. Эти праймеры не гибридизуются с каким-либо нуклеотидом из вектора, но только с последовательностями, специфичными для гена р11ГО. Искусственный старт-кодон АТС вводили при использовании первого праймера, несущего рестрикционный сайт Νάο1. Затем вставляли полученные продукты ПЦР в вектор для клонирования рСЕМ-Т (Рготеда) и подтверждали последовательность ДНК. Затем осуществляли субклонирование фрагментов в экспрессионном векторе ТСМР14 при использовании стандартных методик и трансформировали этим вектором Е. со11 АК58.

Очистка РЬГО

Очистку Р11ГО осуществляли следующим образом.

Выращивание клеток Е.со11 в присутствии канамицина: рост в течение 30 ч при 30°С, затем индукция в течение 18 ч при 39,5°С.

Разрушение клеток Е.соК из цельной культуры при 0Ό+115 в присутствии 5 мМ ЭДТА и 2 мМ РМ8Р (фенилметилсульфонилфторида) в качестве ингибиторов протеаз: Вапше, 2 прохода, 1000 бар (100х10⁵Па).

Захват антигена и удаление клеточных остатков хроматографией при использовании 8!теат1ше О ХЬ в режиме расширенного ложа при комнатной температуре (20°С); колонку промывают при использовании 150 мМ №1С1 + 0,25% эмпигена при рН 6,5 и элюируют при использовании 400 мМ №1С1 + 0,25% эмпигена в 25 мМ калий-фосфатном буфере при рН 7,4.

Фильтрование на картридже 8аЛоЬтап 150 (0,45 + 0,2 мкм).

Связывание антигена ^АС-хроматографией на 2п⁺⁺-хелатирующей Сефарозе РР при рН 7,4 в присутствии 5 мМ имидазола при 4°С; колонку промывают при использовании 5 мМ имидазола и 1% эмпигена и элюируют 50 мМ имидазолом, в обоих случаях в 25 мМ калий-фосфатном буфере при рН 8,0.

- 23 015551

Слабо анионообменная хроматография в положительном режиме на Егас!оде1 ΕΜΌ ΌΕΆΕ при рН 8,0 (25 мМ фосфат калия) при 4°С: колонку промывают при использовании 140 мМ №1С1 и элюируют при 200 мМ №С1, тогда как примеси (белки и ДНК) остаются адсорбированными на ионообменнике.

Концентрирование и ультрафильтрация при использовании 2 мМ фосфата Nа/Κ при рН 7,15 на мембране для 50 кДа.

Стерилизующая фильтрация очищенной массы на 0,2-мкм фильтровальном картридже М1Шрак-20.

Пример 1в. Экспрессия пневмолизина.

Пневмококковый пневмолизин получали и детоксифицировали как описано в АО 2004/081515 и АО 2006/032499.

Пример 2. Получение конъюгатов.

В данной области хорошо известно, как получать очищенные пневмококковые полисахариды. Для целей этих примеров полисахариды получали в сущности как описано в ЕР072513 или близкородственными способами. До конъюгации полисахаридов можно подгонять по размеру микрофлюидизацией, как описано ниже.

Условия активация и сочетания являются специфическими для каждого полисахарида. Они приведены в табл. 1. Полисахариды с установленными размерами (за исключением Р85, 6В и 23Е) растворяли в 2 М №С1, 0,2 М №1С1 или воде для инъекций (ВДИ). Оптимальную концентрацию полисахарида оценивали для всех серотипов. Все серотипы, за исключением серотипа 18С, конъюгировали прямо с белком-носителем как подробно описано ниже. Получали два альтернативных конъюгата серотипов 22Е: один конъюгированный прямо, один конъюгированный через АЭН-линкер.

К раствору полисахарида добавляли СЭАР (соотношение СЭАР/Р8 0,5-1,5 мг/мг Р8) из 100-мг/мл маточного раствора в ацетонитриле или в растворе ацетонитрил/вода 50%/50%. Через 1,5 мин добавляли 0,2 М-0,3 М №1ОН с получением специфического для активации значения рН. Активацию полисахарида осуществляли при этом рН за время 3 мин при 25°С. К активированному полисахариду добавляли очищенный белок (белок Ό, РИФ, пневмолизин или ΌΤ) (количество зависит от исходного соотношения Р8/белок-носитель), и сочетание осуществляли при специфическом рН в течение вплоть до 2 ч (в зависимости от серотипа) при контроле рН. Затем для гашения непрореагировавших цианатных сложноэфирных групп добавляли к смеси 2 М раствор глицина. Для гашения доводили значение рН до 9,0. Раствор перемешивали в течение 30 мин при 25°С и затем в течение ночи при 2-8°С при использовании непрерывного медленного перемешивания.

Получение 18С.

18С связывали с белком-носителем через линкер дигидразид адипиновой кислоты (ΆΌΗ). Перед конъюгацией полисахарид серотипа 18С подвергали микрофлюидизации.

Дериватизация столбнячного анатоксина при использовании ЕЭАС.

Для дериватизации столбнячного анатоксина (ТТ) разбавляли очищенный ТТ до 25 мг/мл в 0,2 М №С1 и добавляли спейсер ΆΌΗ для достижения конечной концентрации 0,2 М. Когда спейсер полностью растворялся, значение рН доводили до 6,2. Затем добавляли ЕЭАС (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид) до достижения конечной концентрации 0,02 М, и смесь перемешивали в течение 1 ч при контроле рН. Реакцию конденсации останавливали увеличением рН до 9,0 в течение по меньшей мере 30 мин при 25°С. Затем дериватизированный ТТ подвергали фильтрационному диализу (мембрана СО на 10 кДа) для удаления оставшихся реагентов ΆΌΗ и ЕЭАС.

Наконец, стерилизовали массу ТТ_АН фильтрацией и перед стадией сочетания хранили при -70°С.

Химическое сочетание ТТ_АН с Р8 18С.

Подробности параметров конъюгации можно найти в табл. 1.

Разбавляли 2 г подвергнутого микрофлюидизации Р8 до определенной концентрации в воде и доводили до 2 М №1С1 добавлением порошка №С1.

Добавляли свежеприготовленный раствор СЭАР (100 мг/мл в ацетонитриле/ВДИ 50/50 об./об.) для достижения надлежащего соотношения СЭАР/Р8.

Повышали рН до активирующего значения рН 9,0 добавлением 0,3 М №1ОН и стабилизировали этот рН, пока не добавляли ТТ_АН.

Через 3 мин добавляли дериватизированный ТТ_АН (20 мг/мл в 0,2 М №1С1) для достижения соотношения ТТ_АН/Р8, равного 2; рН доводили до значения сочетания рН 9,0. Раствор оставляли на один час при контроле рН.

Для гашения добавляли к смеси Р8/ТТ_ан/СЭАР 2 М раствор глицина. Доводили рН до рН гашения (рН 9,0).

Раствор перемешивали в течение 30 мин при 25°С и затем оставляли на ночь при 2-8°С при использовании непрерывного медленного перемешивания.

Конъюгат Р822Е_ан-РЫО.

Во втором способе конъюгации для этого сахарида (первый представляет собой способ прямой конъюгации Р822-РЬФ, показанный в табл. 1) 22Е связывали с белком-носителем через линкер дигидразид адипиновой кислоты (ΆΌΗ). Полисахарид серотипа 22Е перед конъюгации подвергали микрофлюидизации.

- 24 015551

Дериватизация РБ 22Е.

Активацию и сочетание осуществляли при 25°С с непрерывным перемешиванием в термостатированной водяной бане.

Подвергнутый микрофлюидизации РБ22Е разбавляли с получением конечной концентрации РБ 6 мг/мл в 0,2 М №С1, и раствор доводили до значения рН 6,05 ± 0,2 при использовании 0,1 н. НС1. Добавляли свежеприготовленный раствор СРАР (100 мг/мл в ацетонитриле/ВДИ, 50/50) до достижения надлежащего соотношения СРАР'РБ (1,5/1 об./об.).

Повышали значение рН до активирующего рН 9,00 ± 0,05 добавлением 0,5 М №С)11 и стабилизировали при этом значении рН, пока не добавляли АРН.

Через 3 мин добавляли АРН до достижения надлежащего соотношения АРН'РБ (8,9/1 мас.); рН доводили до значения сочетания рН 9,0.

Раствор оставляли на 1 ч при контроле рН. Производное РБ_АН концентрировали и подвергали фильтрационному диализу.

Сочетание.

Добавляли РКП) при 10 мг/ мл в 0,2 М №С1 к производному РБ22Е_АН для достижения соотношения РЫЭ/РБ22Е_ан 4/1 (мас.). Доводили рН до 5,0 ± 0,05 при использовании НС1. Добавляли вручную раствор ТРАС (20 мг/мл в 0,1 М Трис-НС1 рН 7,5) в течение 10 мин (250 мкл/мин) для достижения 1 мг ЕЭАС/мг РБ22Е_ан. Получившийся раствор инкубировали в течение 150 мин (хотя также использовали промежуток времени 60 мин) при 25°С при перемешивании и контроле рН. Раствор нейтрализовали добавлением 1 М Трис-НС1 рН 7,5 (1/10 конечного объема) и оставляли на 30 мин при 25°С.

Перед элюцией на БерЫасгу1 Б400НЕ конъюгат осветляли с использованием 5-мкм фильтра М1шзаг1.

Получившийся конъюгат имеет конечное соотношение РКПТРБ 4,1 (мас./мас.), содержание свободного РБ ниже чем 1%, и антигенность (α-РБ/а-РБ) 36,3% при антигенности против РКП) 7,4%.

Очистка конъюгатов.

Для удаления малых молекул (в том числе РМАР) и неконъюгированного РБ и белка конъюгаты очищали гель-фильтрацией при использовании колонки для гель-фильтрации с БерЫасгу1 Б400НЕ, уравновешенной с 0,15 М №С1 (Б500НЕ для 18С). На основании разных молекулярных размеров компонентов этой реакционной смеси, первыми элюировали конъюгаты РБ-РЭ, РБ-ΤΤ, РБ-РЫЭ, РБ-пневмолизин или РБ-ΌΤ и далее свободный РБ, затем свободный РР или свободный ΡΤ и, наконец, РМАР и другие соли (№С1, глицин).

Фракции, содержащие конъюгаты, детектировали по УФ₂₈₀ нм. Фракции объединяли в соответствии с их Кб, стерилизовали фильтрацией (0,22 мкм) и хранили при +2-8°С. В препаратах конъюгатов определяли соотношения РБ/белок

Специфические условия активации/сочетания/гашения для конъюгатов Р8 8. Риеитошае-белок В/ТТ/БТ/РЬШ/Р1у

Наличие цфлюид в обозначении столбца указывает, что сахарид перед конъюгацией был подвергнут микрофлюидизации. Размеры сахаридов после микрофлюидизации даны в табл. 2.

Таблица 1. Специфические условия активации/сочетания/гашения для конъюгатов РБ Б. рпеитошае Белок РТТ ПТРКгРР1у

Серотип	1 цфлюид	4 цфлюид	5	6А	6В	7Р цфлюид
Конц. Ρδ (мг/мл)	2,5	2,5	7,1	5,0	5,0	5,0
Растворение Ρδ	вди	вди	вди	N30 2М	ЫаС1 2М	ЫаС1 2М
Конц. Ρϋ (мг/мл)	10,0	10,0	5,0	5,0	5,0	10,0
Исходное соотношение Ρϋ/Ρδ (масс.)	1,5/1	1,5/1	1/1	1/1	1,1/1	1,2/1
Конц. СОАР (мг/мг Ρδ)	0,50	0,50	0,79	0,83	0,83	0,75
рНа=рНс=рНа	9,0/9,0/9,0	9,5/9,5/9,0 (	9,0/9,0/9,0 <	9,5/9,5/9,0	9,5/9,5/9,0	9,5/9,5/9,0
Серотип	9У цфлюид	14 цфлюид	18С цфлюид	19А цфлюид	19Р цфлюид	22Р цфлюид	23Р
Конц. Ρδ (мг/мл)	5,0	5,0	4,5	15,0	9,0	6,0	2,38
РастворениеР δ	ИаС1 2М	ЫаС1 2М	№С1 2 М	№С1 2 М	ИаС! 2М	№С1 0,2 М	№С1 2М
Конц, белканосителя (мг/мл)	10,0	10,0	20,0 (ТТ)	10,0 (Р!у)	20,0 (ОТ)	10,0 (РНЮ)	5,0
Исходное соотношение белокноситель/Ρδ (масс.)	1,2/1	1,2/1	2/1	2,5/1	1,5/1	3/1	1/1
Конц СОАР (мг/мг Ρδ)	0,50	0,75	0,75	1,5	1,5	1,5	0,79
рНа=рНс=рНа	9,5/9,5/9,0	9,5/9,5/9,0	9,0/9,0/9,0	9,0/9,0/9,0	9,0/9,0/9,0	9,0/9,0/9,0	9,5/9,5/9,0

Примечание: рНа,с,ц соответствует рН для активации, сочетания и гашения соответственно.

- 25 015551

Описание.

Каждый конъюгат был охарактеризован и отвечал спецификациям, описанным в табл. 2. Содержание полисахарида (мкг/мл) измеряли резорциновым методом, и содержание белка (мкг/мл) измеряли методом Лоури. Конечное соотношение Ρ8/ΡΩ (мас.) определяли по соотношению этих концентраций.

Содержание свободного полисахарида (%).

Содержание свободного полисахарида конъюгатов, выдержанных при 4°С или хранившихся 7 дней при 37°С, определяли на супернатанте, полученном после инкубации с антителами против α-белканосителя и насыщенным сульфатом аммония и последующего центрифугирования.

Для количественного определения свободного полисахарида в супернатанте использовали ЕБ18А на α-Ρ8/α-Ρ8. Отсутствие конъюгата также контролировали по ЕБ18А на а-белок-носитель/а-Е8.

Антигенность.

Антигенность тех же конъюгатов анализировали в сэндвич-ЕЕ18А, в котором захватывающими и детектирующими были антитела против Ρ8 и против белка соответственно.

Содержание свободного белка (%).

Неконъюгированный белок-носитель можно отделять от конъюгата на стадии очистки. Содержание свободного оставшегося белка определяли при использовании эксклюзионной хроматографии (Т8К 5000-ΡνΧΕ) с последующим УФ-детектированием (214 нм). Условия элюции позволяли разделять свободный белок-носитель и конъюгат. Затем определяли содержание свободного белка в массах конъюгата по калибровочной кривой (от 0 до 50 мкг/мл белка-носителя). Свободный белок-носитель в % получали нижеследующим образом: % свободного носителя = (свободный носитель (мкг/мл )/(суммарная концентрация соответствующего белка-носителя, измеренная по Лоури (мкг/мл)х100%).

Стабильность.

Распределение молекулярных масс (К_ау) и стабильность измеряли гель-фильтрацией при использовании ВЭЖХ-8ЕС (Т8К 5000-ΡνΧΕ) для конъюгатов, выдержанных при 4°С и хранившихся в течение 7 дней при 37°С.

В табл. 2 (см. комментарий под ней) представлена 10/11/13/14-валентная характеристика.

Конъюгаты белка можно адсорбировать на фосфате алюминия и объединять с получением готовой вакцины.

Заключение.

Были получены иммуногенные конъюгаты, которые, как потом было показано, являются компонентами перспективных вакцин.

Таблица 2. Характеристики конъюгатов

Конъюгаты	Размер Ρδ (Да χ 103)	Соотношение носитель/Р8	Свободный Р8 (ЕИ8А)	Свободный носитель	Антигенность Р8 (ЕЫ8А)	Размер конъюгата (кДа)
Р81-Р0	349- 382*	1,5-1,6	1,0%-1,2%	3,9%-4,8%	87%-95%	1499-1715
Ρ84-Ρϋ	93-100*	1,5-1,6	4,7- 6,5%	3,2%-4,0%	90%-96%	1303-1606
Р85-Р0***	367-443	0,80	8,7-11,2%	2,2%-3,8%	93%-108%	1998-2352
Р86А-РО	11001540	0,61	4,5%	Не делали	45,9%	Не делали
Р86В- Р0***	10691391	0,7-0,8	1,3-1,6%	<2,0%	68%-75%	4778-5235
Р87Р-Р0	255- 264*	1,1-1,2	<1%	<1,4%	58%	3907-4452
Ρ89ν-Ρϋ	258- 280*	1,3-1,5	<1%	<1,3%	67%-69%	9073-9572
Ρ814-ΡΩ	232241*	1,4	<1%	<1,5%	70%	3430-3779
Р818С-ТТ	89-97*	2,2-2,4	1,5-2,2%	<4%	46%-56%	5464-6133
Р819А-Р1у*	151	3,2	<1%		29%
Р819Р-ОТ	133143*	1,4-1,5	4,1%-5,9%	<1,2%<1,3%	82%-88%	2059-2335
Р822Е- РЬЮ*	159- 167	2,17	5,8	Не делали	37%	Не делали
Р822ЕΑΗΡίΊΐϋ*	159- 167	3,66-4,34	<1%	Не делали	28-31%	Не делали
Р823Р- Р0***	914- 980	0,5	1,4-1,9%	3,7%-4,9%	137%-154%	2933-3152

*Ρ8 размер после микрофлюидизации нативного Ρ8

10-Валентную вакцину получали смешиванием конъюгатов серотипов 1, 4, 5, 6В, 7Е, 9У, 14, 18С,

- 26 015551

19Р и 23Р (например, в дозе 1, 3, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 3, 1 мкг сахарида соответственно на дозу для человека). 11-Валентную вакцину получали дополнительным добавлением конъюгата серотипа 3 из табл. 5 (например, при 1 мкг сахарида на дозу для человека). 13-Валентную вакцину получали дополнительным добавлением вышеуказанных конъюгатов серотипов 19А и 22Р (причем 22Р связан с Ρ111Ό либо прямо, либо альтернативно через ΑΌΗ-линкер) [например, в дозе по 3 мкг каждого сахарида на дозу для человека]. 14-Валентную вакцину можно получать дополнительным добавлением вышеуказанного конъюгата серотипа 6 (например, в дозе 1 мкг сахарида на дозу для человека).

Пример 3. Доказательство того, что включение белка Ό ИаеторИПш тПиепхае в иммуногенную композицию по этому изобретению может обеспечить улучшенную защиту против острого отита среднего уха (ОСУ).

План исследования.

В исследовании использовали вакцину 11Ρη-ΡΌ, содержащую серотипы 1, 3, 4, 5, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19Р и 23Р, причем каждый конъюгирован с белком Ό из Н. тПиепхае (см. табл. 5 в примере 4). Субъектов рандомизировали в две группы для получения четырех доз либо вакцины 11Ρη-ΡΌ, либо Ηηνπχ в возрасте приблизительно 3, 4, 5 и 12-15 месяцев. Все субъекты одновременно получали вакцину (^ТΡа-ΗΒV-IΗΥ/Η^Ь) 1пГаппх-11еха от Ο8Κ Β^о1од^са15 в возрасте 3, 4 и 5 месяцев. 1пГаппх-11еха представляет собой комбинацию Ρеά^аπx и ΗίΒ, смешанных перед введением. Отслеживание эффективности для анализа В соответствии с протоколом начинали через 2 недели после введения третьей дозы вакцины и продолжали до достижения возраста 24-27 месяцев. Носоглоточное носительство 8. рпеитошае и Η. ίηПпепхае оценивали в выбранных подгруппах субъектов.

Родителям предлагали обращаться к исследователю, если их ребенок заболевал, у него была боль в ухе, спонтанная перфорация барабанной перепонки или спонтанные выделения в ухо. Если исследователь подозревал эпизод ОСУ, ребенка немедленно направляли к специалисту отоларингологу для подтверждения диагноза. Клинический диагноз ОСУ был основан либо на внешнем виде барабанной перепонки (то есть, покраснение, вздутие, потеря светоотражения), либо на присутствии жидких выделений в среднем ухе (продемонстрированных простой или пневматической отоскопией или микроскопией). Вдобавок, должны присутствовать по меньшей мере два из нижеследующих признаков или симптомов: ушная боль, ушные выделения, потеря слуха, повышенная температура, сонливость, раздражительность, анорексия, рвота или диарея. Если отоларинголог подтвердил клинический диагноз, образец жидкости из среднего уха собирали пункций барабанной перепонки для бактериологического тестирования.

Для субъектов с повторными визитами из-за болезни считали, что новые эпизоды ОСУ начинаются, если прошло более чем 30 дней с начала предыдущего эпизода. Вдобавок, эпизод ОСУ считали новым бактериальным эпизодом, если имели место отличия изолированной(ого) бактерии/серотипа от предыдущего изолята, независимо от интервала между двумя последовательными эпизодами.

Результаты испытания.

Всего в исследование были включены 4968 младенцев: 2489 в группу 11Ρη-ΡΌ и 2479 в контрольную группу. Между двумя группами не было существенных отличий в демографических характеристиках или факторах риска.

Определение клинических эпизодов и случаев ОСУ.

Во время периода отслеживания по протоколу в сумме зарегистрировано 333 эпизода клинического ОСУ в группе 11 Ρη-ΡΌ и 499 в контрольной группе.

Таблица 3 показывает защитную эффективность вакцины 11 Ρη-ΡΌ и обеих 7-валентных вакцин, ранее тестированных в Финляндии (Б8ко1а е1 а1 Ν Εη§1 I Μеά 2001; 344: 403-409 и К11р1 е1 а/С1т 1пГес1 Όίδ 2003 37:1155-64) против любого эпизода ОСУ и ОСУ, вызванного разными пневмококковыми серотипами, Н. тПиепхае. ΝΈΗ7 и М. са1атгйа118. Статистически достоверное и клинически значимое снижение на 33,6% груза всех заболеваний ОСУ достигнуто с 11 Ρη-ΡΌ, независимо от этиологии (табл. 3). Суммарная эффективность вакцины 11 Ρη-ΡΌ против эпизодов ОСУ из-за любого из 11 пневмококковых серотипов была 57,6% (табл. 3).

Другим важным результатом в настоящем исследовании является защита на 35,6%, обеспеченная вакциной 11 Ρη-ΡΌ против ОСУ, вызванного Н. тПиепхае (и конкретно, защита на 35,3%, обеспеченная ΝΓΗί). Этот результат имеет большое клиническое значение с учетом возросшей важности Н. тПиепхае в качестве главной причины ОСУ в эпоху пневмококковых конъюгатных вакцин. Вместе с защитой, обеспеченной против ОСУ, вакцина 11 Ρη-ΡΌ также снижает носоглоточное носительство Н. тПиепхае после бустерной дозы на втором году жизни. Эти результаты контрастируют с предыдущими наблюдениями в Финляндии, где с обеими 7-валентными пневмококковыми конъюгатными вакцинами наблюдали увеличение эпизодов ОСУ из-за Н. тПиепхае (Е5ко1а е1 а1 и К11р1 е1 а1) в качестве свидетельства этиологического замещения.

Отчетливую корреляцию между защитой против эпизодов ОСУ из-за Ηί и уровнями антител против белка-носителя Ό установить не удалось, поскольку пост-первичные концентрации 1дС-антител против ΡΌ у вакцинированных при использовании 11 Ρη-ΡΌ, которые оставались без эпизодов Ηί-ОСУ, были, по существу, такими же, что и постпервичные уровни 1дС-антител против ΡΌ, измеренные у вакцинированных при использовании в 11Ρη-ΡΌ, у которых в период отслеживания эффективности развивался по

- 27 015551 меньшей мере один эпизод Н1-ОСУ. Однако хотя и нельзя установить корреляцию между биологическим эффектом вакцины и постпервичной иммуногенности 1дС против 1Т), разумно считать, что белокноситель РЭ, который является весьма консервативным среди штаммов Н. тйиеп/ае, внес большой вклад в индукцию защиты против Н1.

Влияние на заболевание ОСУ сопровождалось влиянием на носоглоточное носительство, которое было таким же по величине для пневмококков вакцинного серотипа и для Н. 1пГ1иеп/ае (фиг. 1). Это снижение носоглоточного носительства Н. 1пГ1иеп7ае у вакцинированных при использовании РЭконъюгатных вакцин подтверждает гипотезу о прямом защитном эффекте РЭ-конъюгатной вакцины против Н. шйиеп/ае, даже если защитная эффективность может не коррелировать с иммунными 1дСответами против РЭ при определении в ЕР18А.

В следующем ниже эксперименте с объединенными в пул сыворотками от младенцев, иммунизированных 11-валентным препаратом по этому примеру или 10-валентной вакциной примера 2 (см. также табл. 1 и 2 и комментарии под ними), использовали модель отита среднего уха у шиншилл. Оба пула индуцируют значительное снижение процента животных с отитом среднего при сравнении с пулом доиммунной сыворотки. Отсутствует значительное различие между 10-и 11-валентными иммунными пулами. Это показывает, что обе вакцины имеют одинаковый потенциал индукции защиты против отита среднего уха, вызванного в этой модели нетипируемыми Н. тйиеп/ае.

Таблица 3

Тип эпизода АОМ	11Ρη-Ρϋ	Ргеупаг в ΡϊηΟΜ (Евко1а е! а1.	7ν-ΟΜΡ в ΓίηΟΜ (ΚίΙΙϊρ θΐ а1.)
η	УЕ	η	%	УЕ	η	УЕ
11Ρη -Ρϋ	Конт.	%	95%-ный ди	7νСКМ	Конт.	95%д НУ	ный И ВУ	7νОМР	Конт.	%	95%-ный ди
НУ	ВУ	НУ	ВУ
N	2455	2452				786	794				805	794
Любой ОСУ	333	499	33,6	20,8	44,3	1251	1345	6	-4	16	1364	1345	-1	-12	10
Любой ОСУ с ЖСУ	322	474	32,4	19,0	43,6	1177	1267	7	-5	17	1279	1267	0	-12	10
Пневмококк подтвержден посевом	92	189	51,5	36,8	62,9	271	414	34	21	45	314	414	25	11	37
Вакцинные серотипы пневмокка(*)	60	141	57,6	41,4	69,3	107	250	57	44	67	110	250	56	44	66
				Другие бактериальные патогены
Н. тЯиепгае	44	68	35,6	3,8	57,0	315	287	-11	-34	8	315	287	-9	-32	10
Нетипируемые Н. тЯиепгае (ΝΤΗΪ)	41	63	35,3	1,8	57,4	НО	НО	НО	НО	НО	НО	НО	ЫС	НО	НО
М. са1агг!1аПз	31	34	9,4	-52,5	46,1	379	381	-1	-19	15	444	381	-16	-36	2

НО = не опубликовано; N = число субъектов в когорте для определения эффективности в соответствии с протоколом; п = число эпизодов; ДИ = доверительный интервал; НУ = нижний уровень; ВУ = верхний уровень; Конт. = контроль; ЖСУ = жидкость в среднем ухе. * Вакцинные пневмококковые серотипы: для 11Рп-РЭ = псеротипов; для Ргеупаг и 7у-ОМР = 7 серотипов.

Пример 4. Селекция белка-носителя для серотипа 19Р.

Использовали анализ ЕЫ8А.

Способ ЕЫ8А при ингибировании 22Р в сущности основан на анализе, предложенном в 2001 Сопсерсюп апб РгаксН и описанным Непскаег1к е! а1., 2006, СИшса1 апб Уасте 1ттипо1оду 13:356-360. Вкратце, очищенные пневмококковые полисахариды смешивали с метилированным человеческим сывороточным альбумином и адсорбировали на сильно связывающие микротитровальные планшеты Νιπκ' Мах1когр™(Вокк11бе, ΏΚ) в течение ночи при 4°С. Планшеты блокировали 10%-ной фетальной бычьей сывороткой (РВ8) в забуференном фосфатом физрастворе (РВ8) в течение 1 ч при комнатной температуре при встряхивании. Пробы сывороток разбавляли РВ8, содержащем 10% РВ8, 10 мкг/мл полисахарида клеточной стенки (88Ι) и 2 мкг/мл пневмококкового полисахарида серотипа 22Р (АТСС), и дополнительно разбавляли на микротитровальных планшетах тем же буфером. Внутренний контроль, который калибровали по стандартной сыворотке 89-8Р при использовании концентраций 1дС в 89-8Р, специфичных к серотипу, обрабатывали тем же путем и включали в каждый планшет. После промывки связанные антитела детектировали при использовании конъюгированных с пероксидазой моноклональных антител против человеческих 1дС (81га1есН 8с1еп11йс Ь1б., 8ойат, ϋΚ), разбавленных в 10%-ной РВ8 (в РВ8) и инкубируемых в течение 1 ч при комнатной температуре при встряхивании. Окрашивание осуществляли при использовании готового к применению однокомпонентного набора для иммуноанализа с субстратом фермента пероксидазы тетраметилбензидином (ВюВаб, Негси1ек, СА, И8) в темноте при комнатной температуре. Реакцию останавливали с помощью 0,18 М Н₂8О₄, и оптическую плотность считывали при 450 нм. Концентрации серотип-специфичных 1дС (в мкг/мл) в пробах вычисляли по точкам оптической плотности в определенных пределах кривой для сыворотки внутреннего стандарта, которую моделировали 4-параметрическим лог-логистическим уравнением, рассчитанным при использовании программы 8оГ1Мах Рго™ (Мо1еси1аг Эеуюек, 8иппууа1е, СА). Уровнем отсечки в ЕЙ18А был 0,05 мкг/мл 1дС для

- 28 015551 всех серотипов с учетом предела выявления и предела количественного определения.

Анализ опсонофагоцитоза.

На консультационной встрече ВОЗ в июне 2003 было рекомендовано использовать анализ опсонофагоцитоза (ОФЦ), описанный в Котего-81етег е! а1С1т П1а§п ЬаЬ 1ттипо1 2003 10 (6): рр1019-1024. Этот протокол использовали для тестирования ОФЦ-активности серотипов в нижеследующих анализах.

Получение конъюгатов.

В исследованиях 11Рп-РП&П1-001 и 11Рп-РП&П1-007 включили три 11-валентных вакцинных препарата (таблица 4), в которых 3 мкг полисахарида 19В были конъюгированы с дифтерийным анатоксином (19ВЭТ) вместо 1 мкг полисахарида, конъюгированного с белком Ώ (19В-РЭ). Параметры конъюгации для исследований 11 Рп-РЭ, 11 Рп-РП&П1-001 и 11 Рп-РП&П1-007 раскрыты в табл. 5, 6 и 7 соответственно.

Ответы по антителам против пневмококков и по ОФЦ-активности против серотипа 19В через один месяц после первичной вакцинации этими препаратами 19В-ЭТ показаны в табл. 8 и 9 соответственно.

Табл. 10 показывает концентрации антител против 22Р в ЕЫ8А и проценты субъектов, достигших порога в 0,2 мкг/мл до и после бустерной вакцинации 23-валентным простым полисахаридом.

Показано, что опсонофагоцитозная активность отчетливо улучшалась для антител, индуцированных этими препаратами 19В-ЭТ, как демонстрировано более высокими уровнями серопозитивности (опсонофагоцитозные титры не меньше чем 1:8) и геометрическим средним титров (ГСТ) ОФЦ через месяц после первичной вакцинации (табл. 9). Через один месяц после бустерной вакцинации 23-валентным простым полисахаридом опсонофагоцитозная активность антител против 19В оставалась значительно лучше у детей, получивших первичную вакцинацию препаратами 19В-ЭТ (табл. 11).

Табл. 12 представляет данные по иммуногенности после бустерной дозы 11Рп-РЭ у годовалых детей, ранее получивших первичную вакцинацию конъюгатами 19В-ЭТ или 19В-РЭ, при сравнении с 4-й последовательной дозой Ргеупаг®. С учетом случаев вспышек, о которых сообщалось после введения Ргеупаг® в США, улучшенная опсонофагоцитозная активность против серотипа 19В, когда он конъюгирован с белком-носителем ЭТ, может быть достоинством для вероятно подходящей вакцины. Табл. 13 представляет данные по ЕЫ8А и ОФЦ для конъюгата 19В-ЭТ с учетом перекрестной реактивности серотипа 19А. Было найдено, что 19В-ОТ индуцирует низкую, но значительную ОФЦ-активность против 19А.

Таблица 4. Конъюгатные вакцинные препараты против пневмококков, использованные в клинических исследованиях

Препарат

пневмококковый серотип, мкг/белок-носитель

ΑΙ3+ ΜΓ

1

3

4

5

6Β

7Ε

9ν

14

18С

19Ρ

23Ρ

11Ρη-Ρϋ

1/Ρϋ

1/Ρϋ

1/Ρϋ

1/Ρϋ

1/Ρϋ

1/Ρϋ

1/Ρϋ

1/Ρϋ

1/Ρϋ

1/Ρϋ

1/Ρϋ

<0,8

19ΡΌΤ Форма 1

3/Ρϋ

3/Ρϋ

3/Ρϋ

3/Ρϋ

10/ϋΤ

3/Ρϋ

3/Ρϋ

3/Ρϋ

3/Ρϋ

3/ϋΤ

5/ϋΤ

<0,35

19ΡΌΤ Форма 2

3/Ρϋ

2/Ρϋ

2/Ρϋ

3/Ρϋ

5/ϋΤ

3/Ρϋ

2/Ρϋ

2/Ρϋ

2/Ρβ

3/ϋΤ

5ЮТ

<0,35

19ΡΌΤ Форма 3

3/Ρϋ

3/Ρϋ

3/Ρϋ

3/Ρϋ

3/Ρϋ

3/Ρϋ

3/Ρϋ

3/Ρϋ

3/Ρϋ

3/ϋΤ

3/Ρϋ

= 0,5

Таблица 5. Специфические условия активации/сочетания/гашения для

конъюгатов Ρ8 З.рпеитотае-Белок ϋ/ΤΤ/ϋΤ
Серотип	1 Нативный	3 цфлюид	4 Нативный	5 Нативный	6В Нативный	7Р Нативный
Конц. Ρ8 (мг/мл)	1,5	2	2,0	7,5	5,5	3,0
Растворение Ρδ	№СИ50мМ	№С12М	вди	вди	№С1 2 М	ЫаС1 2 М
Конц. Ρϋ (мг/мл)	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0
Исходное соотношение Ρδ/Ρϋ (масс./масс.)	1/0,7	1/1	1/1	1/1	1/1	1/1
Конц. СОАР (мг/мг Р8)	0,75	0,75	0,75	0,75	0,75	0,75
рНа=рНс=рНа	9,0/9,0/9,0	9,5/9,5/9,0	8,8/8,8/9,0	9,0/9,0/9,0	9,5/9,5/9,0	9,0/9,0/9,0
Длительность сочетания	60 минут	60 минут	45 минут	40 минут	60 минут	60 минут

Серотип	9ν Нативный	14 Нативный	18С Нативный	19Р Нативный	23Р Нативный
Конц. Ρδ мг/мл)	1,75	2,5	1,75	4,0	2,5
Растворение Ρδ	ЫаС1 2 М	№С1 2 М	вди	ИаС1 2 М	ЫаС1 2 М
Конц. Ρϋ (мг/мл)	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0
Исходное соотношение	1/0,75	1/0,75	1/1,2	1/1	1/1
Ρδ/Ρϋ (масс./масс.) Конц. СОАР ( мг/мг Ρδ)	0,75	0,75	0,75	0,75	0,75
рНа=рНс=рНа	8,5/8,5/9,0	9,0/9,0/9,0	9,0/9,0/9,0	9,5/9,5/9,0	),5/9,5/9,0
Длительность сочетания	60 минут	60 минут	45 минут	30 минут	60 минут

- 29 015551

Таблица 6. Специфические условия активации/сочетания/гашения конъюгатов Ρ8 8.рпеитошае-белок Ό/ΌΤ для исследования 11 Ρп-Ρ^&^^-001

Серотип	1 цфлюид	3 цфлюид	4 цфлюид	5 цфлюид	6В цфлюид	7Р Нативный
Конц. РЗ (мг/мл)	4	2,0	2,5	7,5	10	3,0
Растворение РЗ	№С1 2 М	№С1 2 М	ЫаС1 2 М	ЫаС1 2 М	№С1 2 М	№С1 2 М
Конц. РР (мг/мл)	10,0	5,0	5,0	5,0 ЫаС1 2 М	20 (РТ) №С1 2 М	5,0
Исходное соотношение РР/РЗ (масс./масс.)	1,2/1	1/1	1/1	1/1	1,5/1	1/1
Конц. СРАР (мг/мг РЗ)	1,50	0,75	1,5	2	1,5	0,75
рНа=рНс=рНа	9,0/9,0/9,0	9,5/9,5/9,0	9,5/9,5/9,0	9,0/9,0/9,0	9,5/9,5/9,0	9/9/9
Длительность сочетания	60 минут	60 минут	60 минут	60 минут	60 минут	60 минут

Серотип Конц. РЗ (мг/мл)	9ν Нативный 1,75	14 Нативный 2,5	18С цфлюид 5,0	19Р цфлюид 9,0	23Р цфлюид 10
Растворение РЗ	№С1 2 М	№С1 2 М	№С1 2 М	№С1 2 М	№С1 2 М
Конц, белка-носителя (мг/мл)	5,0	5,0	5,0	20 (РТ)	10 (РТ)
Исходное соотношение белокноситель/Р8 (масс./масс.)	0,75/1	0,75/1	1,2/1	1,5/1	1,5/1
Конц. СРАР (мг/мг РЗ)	0,75	0,75	1,5	1,5	0,75
рНа=рНс=рНа	8,5/8,5/9,0	9,0/9,0/9,0	9,0/9,0/9,0	9,0/9,0/9,0	9,5/9,5/9,0
Длительность сочетания	60 минут	60 минут	30 минут	60 минут	60 минут

Таблица 7. Специфические условия активации/сочетания/гашения конъюгатов Ρ8 8.рпеитошае-белок Ό/ΌΤ для

Ρη-ΡΡ&Ρι-007

цфлюид

9,0/9,0/9,0

Длительность сочетания

9,0/9,0/9,0

120 минут

Конц. Р5 (мг/мл)

Растворение Р8 носителя (мг/мл)

Исходное соотношение белокноситель/РЗ (масс./масс.)

Конц. СРАР

Серотип	1 Нативный	3 цфлюид	4 Нативный	5 Нативный	6В Нативный	7Р цфлюид
Конц. РЗ (мг/мл)	1,5	2,0	2	7,5	5,5	5,0
Растворение	№С1 150	№С1 2М	вди	вди	№С! 2М	ИаС! 2М
РЗ	мм
Конц. РР (мг/мл)	5,0	5,0	5,0	5,0	5	10
Исходное соотношение РР/Р8 (масс./масс.)	0,7/1	1/1	1	1/1	1/1	1,2/1
Конц. СРАР (мг/мг РЗ)	0,75	0,75	0,75	0,75	0,75	0,75
рНа=рНс=рНа	9,0/9,0/9,0	9,5/9,5/9,0	8,8/8,8/9,0	9,0/9,0/9,0	9,5/9,5/9,0	9,579,5/9
Длительность сочетания	60 минут	60 минут	45 минут	40 минут	60 минут	60 минут

Серотип

- 30 015551

Таблица 8. Процент субъектов с концентрацией антител против 19Р не менее чем 0,20 мкг/мл и со значениями геометрических средних концентраций (ГСК) антител против 19Р (ГСК с 95%-ным ДИ; мкг/мл) через один месяц после первичной вакцинации при использовании 1 мкг 19Р-РЭ, 3 мкг 19Р-ЭТ или Ргеупаг (2 мкг 19Р-СКМ) (общая группа)

Группа	11Ρη-Ρϋ&Οΐ-001 (22Е-ЕИ8А)	11Ρη-ΡΟ&ϋί-007	(22Е-ЕИ8А)
N	% >0,20 мкг/мл (95%-ный ДИ)	ГСК (мкг/мл) (95%-ный ДИ)	N	% >0,20 мкг/мл (95%-ный ДИ)	ГСК (мкг/мл) (95%-ный ДИ)
ПРп-Ρϋ	152	98,7 (95,3-99,8)	1,93 (1,67-2,22)	50	100 (92,9-100)	2,78 (2,31-3,36)
19Р-ЦТ Форма 1*	146	99,3 (96,2-100)	2,88 (2,45-3,38)	-	-	-
19Е-ЭТ Форма 2*	150	96,0 (91,5-98,5)	2,43 (2,01-2,94)	-	-	-
19Ε-ΌΤ Форма 3*	-	-	-	50	96,0 (86,3-99,5)	3,70 (2,58-5,30)
Ргеупаг	148	98,6 (95,2-99,8)	2,98 (2,60-3,41)	41	97,6 (87,1-99,9)	2 41 (2,15-3,94)

* Состав разных препаратов представлен в табл. 4.

Таблица 9. Процент субъектов с титром ОФЦ для 19Р не менее чем 1:8 и значениями геометрических средних титра (ГСТ) ОФЦ для 19Р через один месяц после первичной вакцинации при использовании 1 мкг 19Р-РЭ, 3 мкг 19Р-ЭТ или Ргеупаг (2 мкг 19Р-СКМ) (общая группа)

		11Ρη-Ρϋ&Οΐ-001		11Ρη-ΡΟ&ϋΐ-007
Группа	N	£1:8 (95%-ный ДИ)	ГСТ (95%-ный ДИ)	N	£1:8 (95%-ный ДИ)	ГСТ (95%-ный ДИ)
11Ρη-Ρϋ	136	84,6 (77,4-90,2)	77,8 (58,1-104,4)	46	95,7 (85,2-99,5)	167,8 (118,1-238,6)
19Γ-ϋΤ Форма Г	137	95,6 (90,7-98,4)	263,2 (209,4-330,7)	-	-	-
19Е-ЦТ Форма 2*	139	92,1 (86,3-96,0)	218,9 (166,5-287,9)	-	-	-
19Е-ЦТ Форма 3*	-	-	-	49	91,8 (80,4-97,7)	403,1 (225,7-719,9)
Ргеупаг	131	86,3 (79,2-91,6)	82 6 (61,1-111,6)	38	81,6 (65,7-92,3)	65,0 (37,7-112,2)

* Состав разных препаратов представлен в табл. 4.

Таблица 10. Процент субъектов с концентрацией антител против 19Р не менее чем 0,20 мкг/мл и ГСК антител против 19Р (мкг/мл) до и через один месяц после бустерной вакцинации 23-валентным простым полисахаридом у детей, получивших первичную вакцинацию при использовании 1 мкг 19Р-РЭ, 3 мкг

19Р-ЭТ или Ргеупаг (2 мкг 19Р-СКМ) (общая группа)

Первичная группа	11ΡΠ-ΡΟ&ΟΪ-002 (ЕЫ8А на 22Е)
До бустерной вакцинации	Через один месяц после бустерной вакцинации 23-валентным Р8
N	% £0,20 мкг/мл (95%-ный ДИ)	ГСК (мкг/ мл) (95%-ный ДИ)	N	% £0,20 мкг/мл (95%-ный ДИ)	ГСК (мкг/мл) (95%-ный ДИ)
11Ρη-Ρϋ	70	77,1 (65,6-86,3)	0,67 (0,45-0,98)	67	94,0 (85,4-98,3)	11,50 (7,76-17,03)
19ΕΌΤ Форма Г	68	91,2 (81,8-96,7)	0,71 (0,54-0,94)	69	98,6 (92,2-100)	14,50 (10,47-20,07)
19ЕГОТ Форма 2*	74	81,1 (70,3-89,3)	0,59 (0,43-0,80)	72	95,8 (88,3-99,1)	9,90 (6,74-14,54)
Ргеупаг	65	64,6 (51,8-76,1)	0,40 (0,27-0,60)	67	100 (94,6-100)	9,40 (6,95-12,71)

* Состав разных препаратов представлен в табл. 4.

Таблица 11. Процент субъектов с титром ОФЦ для 19Р не меньше чем 1:8 и СГТ для ОФЦ до и через один месяц после бустерной вакцинации 23-валентным простым полисахаридом у детей, получивших первичную вакцинацию при использовании 1 мкг 19Р-РЭ, 3 мкг 19Р-ЭТ или Ргеупаг (2 мкг 19Р-СКМ) (суммарный группа)

Первичная группа	11ΡΠ-ΡΟ&ΟΪ-002
До бустерной вакцинации	Через один месяц после бустерной вакцинации 23валентным Р8
	N	%£1:8 (95%-ный ДИ)	ГСТ (95%-ный ДИ)	N	%>1:8 (95%-ный ДИ)	ГСТ (95%-ный ДИ)
11Ρη-Ρϋ	29	27,6 (12,7-47,2)	10,9 (5,0-23,7)	28	82,1 (63,1-93,9)	408,0 (157,3-1058,3)
19ΕΌΤ Форма 1*	19	47,4 (24,4-71,1)	18,1 (7,2-45,7)	18	94,4 (72,7-99,9)	1063,8 (386,6-2927,5)
19Ε-ϋΤ Форма 2*	27	33,3 (16,5-54,0)	8,5 (4,7-15,3)	28	100 (87,7-100)	957,6 (552,8-1659,0)
Ргеупаг	24	12,5 (2,7-32,4)	8,1 (3,4-19,6)	23	82,6 (61,2-95,0)	380,9 (133,2-1089,5)

* Состав разных препаратов представлен в табл. 4.

- 31 015551

Таблица 12. Процент субъектов с концентрациями антител не менее чем 0,2 мкг/мл, ОФЦ не менее чем 1:8 и ГСК/СГТ антител против пневмококков 19Е через один месяц после бустерной вакцинации при использовании 11Р11-Р1) или Ргеупаг у детей, получивших первичную вакцинацию при использовании 1 мкг 19Е-РВ, 3 мкг 19Е-ОТ или Ргеупаг (2 мкг 19Е-СКМ) (общая группа)

Первичная группа	11Ρη-ΡΟ&ϋϊ-002
Анализ 22Ε-Ε1-Ι8Α	Анализ ОФЦ
N	%^1:8 (95%-ный ДИ)	ГСК (95%-ный ДИ)	N	%>1:8 (95%-ный ДИ)	гст (95%-ный ДИ)
11Ρη-Ρϋ	70	100 (94,9-100)	4,52 (3,7-5,5)	21	100 (83,9-100)	255,6 (135,5-481,9)
19ΕΌΤ Форма 1*	66	98,5 (91,8-100)	3,45 (2,8-4,3)	23	95,7 (78,1-99,9)	374,0 (192,6-726,2)
19ΕΌΤ Форма 2*	70	98,6 (92,3-100)	3,80 (2,9-4,9)	29	96,6 (82,2-99,9)	249,1 (144,7-428,7)
Ргеупаг	69	97,1 (89,9-99,6)	2,56 (2,0-3,3)	31	96,8 (83,3-99,9)	528,7 (319,4-875,2)

* Состав разных препаратов представлен в табл. 4.

Таблица 13. Процент субъектов с концентрациями антител не менее чем 0,2 мкг/мл, ОФЦ не менее чем 1:8 и ГСК/ГСТ для антител против пневмококков 19А через один месяц после первичной вакцинации при использовании 1 мкг 19Е-РВ, 3 мкг 19Е-ОТ или Ргеупаг (2 мкг 19Е-СКМ) (общая группа)

Группа	11Ρη-Ρϋ&Οϊ-001
Анализ 22Е-ЕИ8А	Анализ ОФЦ
N	%£1:8 (95%-ный ДИ)	ГСК (95%-ный ДИ)	N	%>1:8 (95%-ный ДИ)	ГСТ (95%-ный ДИ)
11Ρη-Ρϋ	45	28,9 (16,4-44,3)	0,09 (0,07-0,11)	52	7,7 (2,1-18,5)	5,2 (4,0-6,8)
19ΕΌΤ Форма 2*	51	29,4 (17,5-43,8)	0,11 (0,08-0,16)	59	27,1 (16,4-40,3)	12,4 (7,6-20,3)
Ргеупаг	55	18,2 (9,1-30,9)	0,10 (0,08-0,12)	61	3,3 (0,4-11,3)	4,6 (3,8-5,6)

* Состав разных препаратов представлен в табл. 4.

Пример 5. Ингибирование антител против-Р818С полисахаридами с разными уровнями Оацетилирования.

1. Введение.

Анализы ингибирования антител, специфичных к капсульным полисахаридам пневмококков (антиРпР8 АЬ), были разработаны для сравнения эпитопов пневмококковых капсульных полисахаридов (Р8) в их нативной форме или после процессинга для конъюгации. Вдобавок к характеризации конъюгатов, полученных авторами настоящего изобретения, эти тесты также использовали для сравнения уровня Оацетилирования, имеющего место в конъюгате Ргеупаг 18С(-СКМ).

Целью описанных здесь экспериментов было сравнение партий нативных полисахаридов 18С и других Р8 18С, имеющих разные уровни О-ацетильных групп, присутствующих на Р8 в этих анализах. Использовали антисыворотки против 8Р1008 (пример 3), 18С-ТТ (пример 2), 18С-ЭТ и Ргеупаг.

2. Материалы и методы.

Полисахариды.

Р818С ох 007: содержание О-ацетила 17% (по ЯМР).

Получен способом, описанным в ν0 96/05859, пример 4 (гидролиз уксусной кислотой), при последующем окислении перйодатом.

Р818С ох 011: содержание О-ацетила 79% (по ЯМР).

Получен из подвергнутого микрофлюидизации Р8 при последующем мягком гидролизе пероксидом водорода и окислении перйодатом.

Сыворотки.

Типоспецифичные антитела получали объединением сывороток младенцев из исследования 11РпР1)&1)1007, иммунизированных либо 8Р1008 (11Р11-Р1)), либо Ргеупаг. Объединенные сыворотки мышей и морских свинок получали из животных, иммунизированных 8Р1008, Ргеупаг или экспериментальными препаратами, содержащими конъюгаты Р818-1)Т_ЛН или Р818-ТТ_ан (АН = при использовании ΑΌΗ-линкера)

Методы.

ЕЫ8А:

микропланшеты покрывали нативным Р8-18С;

антитела против РпР8 18С ингибировали предварительной инкубацией с серийными 2-кратными разведениями Р8, О-ацетилированного на 79% или де-О-ацетилированного, и затем добавляли в покрытые микропланшеты;

затем обрабатывали планшеты как в обычной процедуре анализа ЕЫ8А на антитела против Р8;

вычисляли процент ингибирования сывороток против РпР8 (ингибирование против отсутствия ингибирования) и откладывали на графике против концентрации ингибитора.

- 32 015551

Опсонофагоцитоз.

Антитела против РηРδ 18С разбавляли так, что уничтожение штамма 18С δ. рпеитошае в классическом анализе опсонофагоцитоза ингибировалось на 95-100% предварительной инкубацией с серийными 2-кратными разведениями Рδ, О-ацетилированных на 79% или де-О-ацетилированных, которых вводили смесь для опсонофагоцитозной реакции;

затем анализ опсонафагоцитоза на δ. рпеитошае осуществляли как обычно;

вычисляли процент ингибирования антисывороток против РηРδ (ингибирование против отсутствия ингибирования) и откладывали его на графике против концентрации ингибитора.

3. Результаты.

Для определения важности уровня О-ацетилирования 18С Рδ осуществляли эксперименты с ингибированием в ΕΟδΆ и опсонофагоцитозом. Слабо О-ацетилированный Рδ-18С получали уксуснокислым гидролизом и окислением при использовании перйодата. Двумя Рδ, тестированными ингибированием в ЕЬКА и ОФЦ, были Рδ18С007 с 17% О-ацетилирования и Р818С011 с 79% О-ацетилирования.

3.1. Эксперименты с мышами при использовании ЕЫБА и опсонофагоцитоза.

Ингибирование в ЕЬ18А объединенных сывороток из мышей, иммунизированных при использовании δР1008 или Ргеуиаг (фиг. 1).

Ингибирование в ЕЫБА объединенных сывороток из мышей, иммунизированных δР1008 или экспериментальными препаратами, содержащими конъюгаты Γδ^-ΟΤΑ,ιι или Рδ18-ТТ_ΆΗ (фиг. 2).

В ЕЬ18А используют О-ацетилированный нативный Рδ в качестве покрывающего антигена и возрастающие концентрации ОΆс-Рδ (011) или де-ОΆс-Рδ (007) в качестве ингибиторов. Удивительным является то, что антитела против Ргеупаг в равной степени ингибируются Рδ-18С, О-ацетилированным на 79% или де-ОАс, в то время как, напротив, антисыворотки против 18С-РЭ, 18С-ТТ_АН и 18С-ОТ_АН более легко ингибируются О-ацетилированным на 79% Рδ-18С, чем де-ОАс.

Из этого следует, что мыши, иммунизированные конъюгатом Рδ18С-Р^, продуцирует антитела взаимодействием с О-ацетилированным Рδ и со скелетом эпитопов Рδ. Этот результат имеет важность с учетом того, что 18С Рδ этого конъюгата является сильно О-ацетилированным, и предрасположенности В-клеточного спектра мышей Ва1Ь/с к взаимодействию с О-ацетилированными эпитопами.

Несмотря на эту предрасположенность, мыши, иммунизированные Ртеупаг, почти не продуцируют антитела взаимодействием с О-ацетилированным эпитопом (О-ацетилированный на 79% и де-Оацетилированный Рδ ингибируют аналогичным образом связывание антител против Ргеупаг с нативным Рδ), откуда весьма вероятно, что в Ргеупаг Рδ18С(-СΚМ) О-ацетилирование отсутствует или очень слабое.

Ингибирование опсонофагоцитоза объединенными сыворотками из мышей, иммунизированных δР1008 или экспериментальными препаратами, содержащими конъюгаты Рδ18-^Τ_АН или Рδ18-ΤΤ_ΆΗ (фиг. 3).

В анализе ОФЦ более сильное ингибирование уничтожения, опосредованного антителами, также наблюдали с сильно О-ацетилированным полисахаридом. Тем не менее, содержание О-ацетила для штамма, использованного в анализе опсонофагоцитоза, не известно.

3.2. Эксперименты с морскими свинками при использовании ЕЫБА и опсонофагоцитоза.

Ингибирование в ЕЫБА объединенных сывороток из морских свинок, иммунизированных при использовании δР1008 или Ргеупаг (фиг. 4).

Ингибирование в ЕЫБА объединенных сывороток из морских свинок, иммунизированных δ₽1008 или экспериментальными препаратами, содержащими конъюгаты Рδ18-^Τ_АН или Γδ^-ТТ^ (фиг. 5).

Ингибирование опсонофагоцитоза, вызываемого объединенными сыворотками из морских свинок, иммунизированных δ₽1008 или экспериментальными препаратами, содержащими конъюгаты Рδ18-^Τ_АН или Рδ18-ΤΤ_ΆΗ (фиг. 6).

У морских свинок не наблюдали явных отличий в ингибирование при использовании ЕЬ18А или ОФЦ, откуда следует, что морские свинки продуцируют антитела, главным образом направленные против скелетных эпитопов полисахарида 18С и не подверженные влиянию содержания О-ацетила в этом антигене.

3.3. Эксперименты с человеческими сыворотками.

Ингибирование объединенных в пул сывороток из младенцев из исследования 11РиР^&^^007, иммунизированных δ₽1008 или Ргеупаг (фиг. 7).

Как наблюдали с мышиными антисыворотками, у младенцев более сильное ингибирование антител против 8С-РЭ наблюдали с Γδ, О-ацетилированными на 79%. 18^₽δ, использованный для получения конъюгата δ₽1008, является сильно О-ацетилированным (больше чем на 90%).

Это показывает, что младенцы продуцировали антитела как против скелетных, так и против Оацетилированных эпитопов ^Ο-Εδ. То наблюдение, что сыворотки против Ргеупаг (18С-СКМ) аналогичным образом ингибируются О-ацетилированными на 79% и де-О-ацетилированными ₽δ, свидетельствует о том, что антитела против Ргеупаг взаимодействуют почти исключительно со скелетными эпитопами ₽δ. Вместе с наблюдениями на мышиных сыворотках это показывает, что 18С ₽δ, который в Ргеупаг находится в конъюгате 18С-СКМ, не является О-ацетилированным или очень слабо О-ацетилирован.

- 33 015551

4. Обсуждение.

В обоих анализах при использовании ЕЬ18А и опсонофагоцитоза способность нейтрализовать антитела мышей и младенцев к 11Рп-РЭ (8Р1008) была у Р8 18С с 79% О-ацетилирования лучше, чем у Р8 18С только с 17% О-ацетилирования.

Оба Р818С, как с 79% О-ацетилирования, так и с 17% О-ацетилирования, показали одну и ту же способность нейтрализовать сыворотки против Ргеупаг.

Из этого следует очень слабое О-ацетилирование или отсутствие О-ацетилирования Р8-18С в вакцине Ргеупаг при сравнении вакцинами С8К, представляющими собой конъюгат 18С.

Фокусирование иммунного ответа на скелетные эпитопы может быть полезным в формировании образования антител как против тех штаммов 18С, которые являются сильно О-ацетилированными, так и против тех, которые являются слабо О-ацетилированными.

Claims (16)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Иммуногенная композиция против 81гер1ососсик рпеитошае, содержащая 9 или более, 10 или более, 11 или более или 13 или более капсульных сахаридов из разных серотипов 8. рпеитошае, которые конъюгированы с белком-носителем, где указанная композиция содержит конъюгированный капсульный сахарид С18, который О-ацетилирован менее чем на 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15 или 10%.
2. 2. Иммуногенная композиция по п.1, где капсульный сахарид С18 конъюгирован со столбнячным анатоксином (ТТ) и где, возможно, 18С является единственным капсульным сахаридом 8. рпеитошае, конъюгированным с ТТ.
3. 3. Иммуногенная композиция по любому из пп.1 и 2, где капсульный сахарид 18С конъюгирован непосредственно с белком-носителем или где капсульный сахарид 18С конъюгирован с белкомносителем через линкер.
4. 4. Иммуногенная композиция против 81гер1ососсик рпеитошае по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что содержит капсульный сахарид из серотипа 19Е, конъюгированный с дифтерийным анатоксином (ИТ) или СНМ197, причем 19Е может являться единственным сахаридом в композиции, конъюгированным с дифтерийным анатоксином (ИТ) или СНМ197.
5. 5. Иммуногенная композиция по п.4, где капсульный сахарид 19Е Ν-ацетилирован более чем на 50, 60, 70, 80 или 90%.
6. 6. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-5, где, по меньшей мере, капсульные сахариды из серотипов 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Е и 23Е присутствуют в виде конъюгированных капсульных сахаридов.
7. 7. Иммуногенная композиция по п.6, где капсульный сахарид из серотипа 4 Ν-ацетилирован более чем на 50, 60, 70, 80, 90%.
8. 8. Иммуногенная композиция по п.6 или 7, где капсульный сахарид из серотипа 9У Ν-ацетилирован более чем на 50, 60, 70, 80, 90% и/или О-ацетилирован более чем на 50, 60, 70, 80, 90%.
9. 9. Иммуногенная композиция по пп.6-8, где капсульный сахарид из серотипа 14 Ν-ацетилирован более чем на 50, 60, 70, 80, 90%.
10. 10. Иммуногенная композиция по пп.6-9, дополнительно содержащая капсульный сахарид из серотипа 1 в виде конъюгированного капсульного сахарида, где, возможно, капсульный сахарид из серотипа 1 Ν-ацетилирован более чем на 50, 60, 70, 80, 90% и/или капсульный сахарид из серотипа 1 Оацетилирован более чем на 50, 60, 70, 80, 90%.
11. 11. Иммуногенная композиция по пп.6-10, дополнительно содержащая капсульный сахарид из серотипа 5 в виде конъюгированного капсульного сахарида, причем, возможно, капсульный сахарид из серотипа 5 Ν-ацетилирован более чем на 50, 60, 70, 80, 90%.
12. 12. Иммуногенная композиция по пп.6-11, дополнительно содержащая капсульный сахарид из серотипа 7Е в виде конъюгированного капсульного сахарида, где, возможно, капсульный сахарид из серотипа 7Е Ν-ацетилирован более чем на 50, 60, 70, 80, 90% и/или О-ацетилирован более чем на 50, 60, 70, 80, 90%.
13. 13. Применение иммуногенной композиции по пп.1-12 в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения заболеваний, вызываемых инфекцией 81гер1ососсик рпеитошае.
14. 14. Применение иммуногенной композиции по пп.1-12 в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения заболеваний, вызываемых инфекцией О-ацетилированными штаммами серотипа 18С и де-О-ацетилированными штаммами серотипа 18С 81гер1ососсик рпеитошае.
15. 15. Вакцинный набор, включающий первый контейнер, содержащий иммуногенную композицию против 81гер1ососсик рпеитошае, содержащую 9 или более, 10 или более, 11 или более или 13 или более капсульных сахаридов из разных серотипов 8. рпеитошае, которые конъюгированы с белком-носителем, где не менее и не более чем 1 (или 2, или 3) капсульный(ых) сахарид(а) конъюгирован(ы) со столбнячным анатоксином, и второй контейнер, содержащий вакцину ИТРа или ЭТР\у.
16. 16. Вакцинный набор, включающий первый контейнер, содержащий иммуногенную композицию против 81гер1ососсик рпеитошае, содержащую 9 или более, 10 или более, 11 или более или 13 или более капсульных сахаридов из разных серотипов 8. рпеитошае, которые конъюгированы с белком-носителем,

    - 34 015551 где не менее и не более чем 1 (или 2, или 3) капсульный(ых) сахарид(а) конъюгирован(ы) со столбнячным анатоксином, и второй контейнер, содержащий МепАСАУ (конъюгированные капсульные сахариды Ν. тешпдШШк А, С, А135 и Υ), где один или более, или все конъюгированные капсульные сахариды во втором контейнере конъюгированы со столбнячным анатоксином.