CN103007277A - A群脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖缀合疫苗及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种A群脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖缀合疫苗及制备方法，制备方法包括如下步骤：将纯化的A群脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖溶解于水中，加热，加过氧化氢反应；超滤去除杂质，并浓缩得到解聚A群流脑多糖溶液；加入ADH和EDAC，反应，加入氰基硼氢化钠，反应，超滤去除杂质，获得衍生的A群流脑荚膜多糖；将衍生的A群流脑荚膜多糖和载体蛋白CRM197溶解于缓冲液中，调节pH，加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐反应。本发明的疫苗，具有200KD以上的分子量，具有更强的免疫原性。本发明的方法工艺流程简单，收率高，生产成本低，且多糖蛋白比相对稳定，并可人为控制，大大提高了结合产物的质量稳定性。

Description

A群脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖缀合疫苗及制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖缀合疫苗及制备方法。

背景技术

基于脑膜炎球菌多糖的疫苗已经被描述，其引起针对荚膜多糖的免疫应答。这些抗体可以对血清型特异性脑膜炎球菌引起补体介导的溶菌作用。脑膜炎球菌多糖疫苗显示对儿童和成人有效，但对于婴儿和幼儿其效能有限。对年幼群体，此多糖的后继给药产生弱加强应答或无加强应答。脑膜炎球菌多糖疫苗的保护期不能持续很长，并且据估计对成人和大于4岁的儿童而言为3到5年。对1至4岁的儿童而言保护期少于3年。

多糖能与主要组织相容性复合体分子结合，而这是抗原呈递和刺激T-辅助淋巴细胞的前提条件，也即它们是非T。细胞依赖性抗原。多糖能够不需T-辅助淋巴细胞的辅助而刺激B淋巴细胞产生抗体。由于对B淋巴细胞的非T-细胞依赖性刺激，这些抗原免疫后缺乏记忆诱导。在成人体内，多糖抗原可以产生非常有效的非T-细胞依赖性应答，但在婴儿和幼儿的不成熟免疫系统中这些非T-细胞依赖性应答却很弱。

非T-细胞依赖性多糖抗原可以通过将多糖共价连接至蛋白质分子（“载体”或“载体蛋白质”）上而转变为T-细胞依赖性抗原。与缀合疫苗的多糖组分结合的B细胞可以被肽特异的T辅助细胞激活，所述肽为缀合的载体蛋白质的一部分。对载体蛋白质的T-辅助细胞应答可以增加针对多糖的抗体的产生。

目前国外已经上市的流脑结合疫苗中，A群流脑荚膜多糖通过连接头和载体蛋白破伤风类毒素（TT），白喉类毒素（DT），流脑膜表面蛋白(MOMP)和白喉蛋白CRM197。中国专利CN1889975A描述的以CRM197为载体和A群寡糖结合的疫苗。该疫苗采用了只具有单一端活性末端的A群寡糖和CRM197进行交流，采用的的连接头是己二酸的琥珀酰亚胺二酯。

多糖结合产物中多糖和蛋白的比例是非常重要的特征。过高和过低的结合比例会大大降低疫苗的免疫原性，使其不适用于疫苗使用。而且在多价结合疫苗共同使用时，载体蛋白的总量也会影响其免疫原性。一般认为必须降低载体蛋白的总体使用量，因此在不降低抗原多糖含量的条件下，必须增加多糖：蛋白的比例，而同时还必须保证高结合比的结合疫苗具有同等或者更好的免疫原性。现在发明的A群疫苗有多种，其结合比例都小于<0.6。如现有的巴斯德A群结合疫苗（DT为载体）的结合比为0.2-0.6之间，罗益和沃森的结合比为0.3-0.7（TT为载体）之间，诺华的A群结合疫苗的结合比为0.3-0.7之间（CRM197为载体）。

中国专利CN1889975A和Michael Broker等人描述的以CRM197为载体和A群寡糖结合的疫苗的平均分子量为150K以下。一般认为大分子量的免疫原会产生更强的免疫反应。因此有必要开发出分子量较大的免疫缀合物。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种A群脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖缀合疫苗的制备方法。

本发明第二个目的是提供一种A群脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖缀合疫苗。

一种A群脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖缀合疫苗的制备方法，包括如下步骤：

1)将纯化的A群脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖溶解于水中，加热至50℃-60℃时，加入过氧化氢使过氧化氢质量浓度为0.2%-5%；反应0.5-18小时；使用10KD超滤膜以生理盐水进行超滤去除未反应小分子杂质，并浓缩得到解聚A群流脑多糖溶液，测量其中解聚流脑荚膜多糖分子量和含量；

2)向每克解聚A群流脑荚膜多糖中加入0.1-0.4g己二酸二酰肼和0.1-0.4g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，在pH为4.9-5.5的条件下，反应1-4小时，加入0.3-0.6g氰基硼氢化钠，反应40-60小时，使用10KD超滤膜以纯化水进行超滤去除未反应小分子杂质，获得衍生的A群流脑荚膜多糖；

3)将衍生的A群流脑荚膜多糖和纯化的载体蛋白CRM197溶解于2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液中，使衍生的A群流脑荚膜多糖中酰肼摩尔浓度为0.700–1mmol/L，载体蛋白CRM197浓度为2-4g/L，调节pH到5.8-6.5，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDAC)并使其浓度为2-2.5g/L，在室温下反应1.5-3小时，存放于4℃。

上述方法制备的A群脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖缀合疫苗。

上述疫苗可以通过硫酸铵沉淀或疏水柱层析等方法进行进一步纯化，以去除未参与结合反应的游离流脑荚膜多糖和游离蛋白。

上述A群脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖缀合疫苗中可以加入C群脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖缀合疫苗而构成两价的缀合疫苗。

上述的两价疫苗中还可以加入Y和W-135群脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖缀合疫苗而构成四价的缀合疫苗。

上述疫苗还可以包括佐剂。佐剂选自铝佐剂、弗氏佐剂、单磷酰脂A、CpG、QS-21、霍乱毒素或甲酰甲硫氨酰肽。铝佐剂为磷酸铝或氢氧化铝。

上述疫苗还可以包含药学可接受的防腐剂。防腐剂选自苄醇、对羟苯甲酸酯、硫柳汞、氯代丁醇或苯扎氯铵。

本发明的A群脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖缀合疫苗，具有200KD以上的分子量，比现有的A群脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖缀合疫苗分子量更高，也具有更强的免疫原性。本发明的方法工艺流程简单，收率高，生产成本低，且多糖蛋白比相对稳定（0.4-1.2），并可在这一水平范围内进行相对的人为控制，大大提高了结合产物的质量稳定性。

附图说明

图1为不同疫苗抗A群多糖抗体的滴度。

图2为A群脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖缀合疫苗示意。

具体实施方式

A群流脑荚膜多糖的衍生化反应以及可能产生的产物由下列的反应式所表示。通过过氧化氢的水解A群流脑荚膜多糖的平均分子量大小从100K以上下降至10K到100K之间。通过加入己二酸二酰肼（ADH），1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDAC）和氰基硼氢化钠（NaCNBH3）ADH可以引入到解聚流脑荚膜多糖的磷酸根上，通过加入不同的ADH的量我们可以控制单个解聚流脑荚膜多糖中引入ADH的数目。

在得到了衍生后的A群流脑荚膜多糖后，可以通过加入适当的EDAC来使蛋白质上的羧基和衍生多糖的氨基发生成肽键反应。反应产物可以是多个多糖链接在单一的载体蛋白上（A），也可以是多个多糖链接在多个载体蛋白的聚合物上（B）。通过我们对于衍生的程度以及结合反应中各反应物浓度的控制，可以使大部分的结合产物以B形式存在（见图2）。

本发明的方法确定了脑膜炎奈瑟氏球菌血清型A与载体蛋白CRM197结合反应中的投料比、反应时间、温度和pH值，以控制结合产物的分子量和流脑荚膜多糖与蛋白的比例。发现了流脑荚膜多糖：蛋白结合质量比在0.4-1.2:1之间的缀合物可以引起很强的免疫反应，结合比过高或者过低的缀合物均不能引起合适的免疫反应。

流脑荚膜多糖与载体蛋白质缀合后，可以利用多种技术对A群脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖缀合物进行纯化以去除未结合的多糖。美国专利6146902上描述了一种涉及在硫酸铵存在下进行超滤的纯化方法。或者，可以通过任意数目的标准技术从未反应的蛋白质和多糖中将缀合物纯化出来，所述标准技术包括大小排阻层析、密度梯度离心、疏水相互作用层析或硫酸铵分级分离等。参见，例如P．W.Anderson等人(1986)，免疫学杂志(J.Immunol.)137:1181-1186。也见于H.J.Jennings和C．Lugowski(1981)免疫学杂志(J.Immunol.)127:1011-1018。我们采用了一种更加简捷的方法。在这种方法中，通过加入硫酸铵将结合产物沉淀下来，而未结合的多糖保留在溶液中，通过固液分离去除游离多糖。

在将多糖与载体蛋白质缀合后，本发明免疫学组合物可以通过混合多种多糖-蛋白质缀合物而制成。也可以加入不同的佐剂，提高疫苗的免疫原性。

本发明的疫苗可以以单一剂量或以系列（即以“加强”或“几次加强）形式施用。例如，就象目前针对预防儿童疾病的其它疫苗所推荐的那样，儿童可以在生命早期比如6个月龄前接受单一剂量或三针剂量。

实施例1

A群流脑荚膜多糖的生产：

A群的流脑荚膜多糖生产菌株(Neisseria meningitides)从中国医学菌种保藏管理中心购买（菌号：CMCC（B）29201）。在50L发酵罐中对A群奈瑟氏脑膜炎球菌进行分别发酵培养。将获得的30L发酵液离心后取得上清并置于一不锈钢罐中，使用100KD膜包超滤浓缩至3L，向浓缩液中加入300ml质量浓度为10%的十六烷基三甲基溴化铵水溶液，搅拌均匀后于4℃静止2小时。将静止后的溶液离心以获得沉淀，向沉淀中加无菌1M氯化钠水溶液至1L，在40℃下实现沉淀的溶解。向溶解液中加入无水乙醇至最终体积浓度为25%，搅拌均匀后于-20℃静止2小时后，离心获得上清；向离心上清中补加无水乙醇至最终体积浓度为80%，搅拌均匀后于-20℃静止2小时后，离心获得沉淀。将沉淀复溶于2L纯化水中，加入来源于林伯氏白色念球菌（Tritirachiumalbum limber）的蛋白酶K至反应浓度为3U/ml，在37℃下反应2小时后，使用100KD膜包超滤15倍体积后最终得到2L超滤液。将超滤液通过0.22um过滤后进行冰冻干燥处理以得到纯化的流脑荚膜多糖粉末，将粉末保存于带有干燥剂的器皿中。

A群流脑荚膜多糖的含量通过P含量方法来测定（Bartlet,G.R.J.1959)。流脑荚膜多糖的分子大小的确定利用凝胶过滤层析柱及利用多角度激光光散射来进行，利用葡聚糖分子大小标准来校准。流脑荚膜多糖的结构完整性由质子1H和13C NMR确定。

实施例2

载体蛋白质的制备

生产菌种白喉杆菌（Corynebacterium diphtheriae）由美国菌种保藏中心（ATCC）购买，菌种号为菌种编号为39255。将冻干的生产白喉CRM197蛋白的种子接种到含培养基的试管中培养16小时。取一份培养物转移至含有生长培养基的0.5升摇瓶中，并将培养瓶在旋转摇床上34.5-36.5℃孵育8小时，从培养瓶取一份培养物转移至含有生长培养基的4升摇瓶中，并将培养瓶在旋转摇床上34.5-36.5℃孵育18小时。用此4升摇瓶的培养物接种含有30L生长培养基的发酵罐。将发酵罐在30-36.5℃，pH 7.4下培养28小时。发酵罐内容物通过离心和深层滤器过滤至收集器中。

将获得的30L发酵液用30KD膜包浓缩至2L，向浓缩液中加入pH 7.5，500mM磷酸缓冲液（钠盐）至最终浓度为10mM。将DEAE层析柱使用10mM磷酸缓冲液平衡后，将浓缩液上样后，使用0.1N氯化钠溶液洗脱得到目的蛋白。

利用10，000NIWCO再生纤维素滤柱，将蛋白质溶液浓缩至5克／升并用10倍体积质量浓度为5%的蔗糖水溶液超滤透析。浓缩的蛋白质溶液通过0.2微米滤膜过滤。在冻干机中冻干蛋白。

蛋白质浓度通过Lowry，O.H.等人(1951)生物化学杂志(Journal of BiologicalChemistry)193，265-275页的方法确定。蛋白质纯度通过测定无菌度、LAL（内毒素）含量和电泳方法确定。

实施例3

一种A群脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖缀合疫苗的制备方法，包括如下步骤：（1）向反应器中装入2.5g纯化的A群流脑荚膜多糖粉末，加入纯水至流脑荚膜多糖浓度为4g/L时在4℃的温度下使流脑荚膜多糖溶解。再将反应罐加热升温，再补纯水稀释流脑荚膜多糖使其浓度至1.25g/L的用于后续的反应浓度。按照表1将流脑荚膜多糖溶液加热至设定温度，加入30%过氧化氢，使过氧化氢质量浓度为表1所示；温度和反应时间如表1所示，关闭加热器并通过冰水浴循环将溶液迅速冷却至室温；用10KD超滤膜进行超滤，用生理盐水超滤10倍体积，然后浓缩超滤液得到超滤回流浓缩液，最终解聚A群流脑多糖浓度为15g/L，用HPSEC-MALLS（高压分子筛—MALLS系统）测量其中解聚流脑荚膜多糖分子量和含量；贮存于5℃。

表1为不同条件下反应，解聚A群流脑荚膜多糖得出的结果。

表1解聚反应条件和产物分子量

（2）将解聚好的不同批次的纯化解聚A群流脑荚膜多糖分别加入反应三角瓶中，并用纯化水将其稀释到反应所需要的浓度6g/L。加入己二酸二酰肼（ADH）使其浓度达到反应所需的1g/L，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDAC）使其浓度达到反应所需的1g/L，利用酸碱调节反应体系的pH值至5.0，并将其控制此pH值，在室温环境下按照表2设定的反应时间1进行反应，结束后加入氰基硼氢化钠（NaCNBH₃），使其最终浓度达到2g/L，再次调节反应体系的pH值至5.0，在室温环境中，在搅拌的条件下按照表2所示反应时间2反应。

反应结束后，使用10KD超滤膜以纯化水进行超滤去除未反应小分子杂质，获得衍生的A群流脑荚膜多糖；最终，将衍化后的多糖浓缩至约15g/L，4℃保存。酰肼的含量可以用Snyder,S.L.and Sobocinski,P.Z.(1975)方法测定。

表2衍化反应的条件和产物中肼酰含量

（3）向三角瓶中装入衍生的A群流脑荚膜多糖（反应浓度为700-1000pmol/μL酰肼）以及纯化的CRM197蛋白质（反应浓度为2~4g/L蛋白质）溶解于2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液中，使衍生的A群流脑荚膜多糖中酰肼摩尔浓度见表3，载体蛋白CRM197浓度见表3，调节pH见表3，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐并使其浓度见表3，在室温下反应时间见表3时，存放于4℃。然后再进行纯化。

用硫酸铵进行盐析沉淀以纯化A群多糖与CRM197蛋白质的单价结合物，向反应混合物中加入硫酸铵晶体，使硫酸铵最终浓度达到300g/L，在过程中要多次少量的加入硫酸铵并同时用磁力搅拌器不停缓慢搅拌，待硫酸铵溶解充分，且反应体系中蛋白沉淀均匀稳定时，停止搅拌，用离心机以11000g的速度将硫酸铵沉淀后的反应产物进行分离。移除上清收集沉淀，用对沉淀进行复溶，待沉淀完全溶解后，用囊式滤器对结合原液开始过滤，过滤后连接好装有50KDa滤膜的超滤系统用生理盐水（0.85%NaCl溶液）对结合原液进行20次等体积超滤，滤除硫酸铵沉淀过程中残留的硫酸铵等小分子，收集回流并用囊式滤器再一次过滤除菌，最终将过滤好的结合产物保存于4℃冰箱中。

表3结合反应的条件和产物中结合比及分子量

多糖的量利用与在解聚和衍生多糖中所用相同的方法测定。蛋白质的量通过Lowry方法确定。结合物的分子大小利用凝胶过滤层析柱来确定，所述凝胶过滤层析柱的商品名为“TSK6000PW”，其利用DNA作为空体积标记物、ATP作为总体积标记物以及牛甲状腺球蛋白作为参考标记物。另外，从TSK6000PW柱上洗脱的结合物的分子大小通过多角度激光光散射测定。结合物的抗原特性利用双夹心ELISA方法，通过与抗多糖血清型特异性抗体的结合来测定。结合物纯度通过测游离多糖的量、游离蛋白质的量（利用毛细管电泳）、无菌度、LAL（内毒素）含量、残余EDAC含量以及残余铵离子含量来确定。

制备的疫苗可以通过硫酸铵沉淀或疏水柱层析等方法进行进一步纯化，以去除未参与结合反应的游离流脑荚膜多糖和游离蛋白。

实验证明本实施例制备的疫苗可以加入C群脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖缀合疫苗而构成两价的缀合疫苗。

实验证明本实施例制备的疫苗加入Y和W-135群脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖缀合疫苗而构成四价的缀合疫苗。

实验证明本实施例制备的疫苗加入选自铝佐剂、弗氏佐剂、单磷酰脂A、CpG、QS-21、霍乱毒素或甲酰甲硫氨酰肽的佐剂。其中铝佐剂为磷酸铝或氢氧化铝最好。

实验证明本实施例制备的疫苗还可以包含药学可接受选自苄醇、对羟苯甲酸酯、硫柳汞、氯代丁醇或苯扎氯铵的防腐剂。

实施例4

A群流脑荚膜多糖-CRM197缀合疫苗的小鼠免疫试验

选取实施例3制备的的表3中列出的多糖蛋白比分别为2.7：1，1.7:1、1.2:1、0.8：1,0.6:1,0.4:1和0.23:1的A群流脑荚膜多糖CRM197缀合疫苗和阴性对照组即生理盐水（0.85%氯化钠），进行小鼠免疫试验，共8组，每组10只，小鼠（健康状况良好的,体重在12-14g的BALB∕c雌性小鼠（SPF级）），每只小鼠皮下注射1.25μg。进行3次免疫，其间间隔为2周，并在接种后2周采集其血液样本。通过小鼠免疫应答反应高低确定不同结合比的缀合疫苗的免疫原性。

利用ELISA方法测定抗A群流脑荚膜多糖的抗体的水平。利用牛血清白蛋白将A群流脑荚膜多糖连接至滴定孔上。血清样本与结合在ELISA微量滴定板孔上的过量的每一种流脑荚膜多糖孵育。孵育后，用缓冲液洗涤滴定孔，并将能够结合抗流脑荚膜多糖抗体的二级抗体-酶缀合物加至抗体-多糖复合体中进行孵育。孵育后，用缓冲液洗涤滴定孔，并将化学底物加至多糖-流脑多糖抗体-二级抗体一酶缀合物中。经酶水解化学底物的一部分后导致颜色形成。颜色形成的量与结合在滴定孔中的多糖-流脑多糖抗体-二级抗体-酶缀合物的量成正比。用得到空白孔光吸收值2.1倍以上的最大稀释倍数为抗体滴度。各种不同结合比的疫苗的平均滴度如图1所示。数据结果表明A群流脑荚膜多糖CRM197缀合疫苗能够引起有效的免疫反应，且其最优多糖蛋白比为0.4-1.2。

Claims (2)

1.一种A群脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖缀合疫苗的制备方法，其特征是包括如下步骤：

1)将纯化的A群脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖溶解于水中，加热至50℃-60℃时，加入过氧化氢使过氧化氢质量浓度为0.2%-5%；反应0.5-18小时；使用10KD超滤膜以生理盐水进行超滤去除未反应小分子杂质，并浓缩得到解聚A群流脑多糖溶液，测量其中解聚流脑荚膜多糖分子量和含量；

2)向解聚A群流脑荚膜多糖中加入己二酸二酰肼和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，在pH为4.9-5.5的条件下，反应1-4小时，加入氰基硼氢化钠，反应40-60小时，使用10KD超滤膜以纯化水进行超滤去除未反应小分子杂质，获得衍生的A群流脑荚膜多糖；

3)将衍生的A群流脑荚膜多糖和纯化的载体蛋白CRM197溶解于2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液中，使衍生的A群流脑荚膜多糖中酰肼摩尔浓度为0.700–1mmol/L，载体蛋白CRM197浓度为2-4g/L，调节pH到5.8-6.5，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐并使其浓度为2-2.5g/L，在室温下反应1.5-3小时，存放于4℃。

2.用权利要求1的方法制备的A群脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖缀合疫苗。

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