PT729473E - Dissacaridos de glucosamina metodo para a sua preparacao composicao farmaceutica contendo os mesmos e sua utilizacao - Google Patents

Description

84 804 ΕΡ 0 729 473/ΡΤ DESCRICÃ0 "Dissacáridos de glucosamina, método para a sua preparação, composição farmacêutica contendo os mesmos e sua utilização." O presente invento refere-se a dissacáridos de glucosamina específicos, em particular a dissacáridos de glucosamina acilados em 2-N e/ou em 2'-N, nos quais pelo menos um dos grupos acilo é ramificado, e a compostos compreendendo estes dissacáridos. O presente invento refere-se, ainda, a métodos para preparar estes dissacáridos a partir de matérias primas compreendendo a porção lípido A de lipopolissacáridos, em que a matéria prima é submetida a um tratamento alcalino específico. 0 invento refere-se também a composições farmacêuticas compreendendo estes dissacáridos como ingrediente activo, e finalmente à utilização destes dissacáridos em terapia e profilaxia.

Os lipopolissacáridos constituem endotoxinas de microorganismos como as bactérias Gram-negativas, e compreendem um componente polissacárido e um componente lípido. Este componente lípido, também chamado lípido A, determina as propriedades endotóxicas dos lipopolissacáridos (Rietschel E. Th. et aL em Immunobiology, volume 186, páginas 169-190 (1993)).

Em US-A-4 912 094 divulgaram-se lipopolissacáridos modificados que exibem reduzidas propriedades endotóxicas, ao mesmo tempo que mantêm as suas propriedades antigénicas e imunoestimulantes. Estes lipopolissacáridos modificados são desacilados em 3-0 e podem ser convertidos em dissacáridos desacilados em 3-0, por hidrólise ácida. Destes compostos, o dissacárido de monofosforilo desacilado em 3-0 é menos tóxico do que o dissacárido de difosforilo desacilado em 3-0.

Em I. Chem. Soc. Perkín Transi. I, 1984, páginas 2291-2295, divulga-se a síntese de um determinado dissacárido desacilado em 3-0 e em 3'-0 compreendendo um grupo 2- e 2'-acetoxitetradecanamido. Nesta síntese faz-se uso de compostos intermediários nos quais o grupo nas posições 2 e 2' é acilado e o grupo na posição 1 é benzilado. Não se divulgam as actividades biológicas do dissacárido e dos compostos intermediários. 84 804 ΕΡ 0 729 473/ΡΤ 2

Ο presente invento refere-se a dissacáridos que são desacilados em 3-0 e desacilados em 3'-0 ou compreendem, na posição 3-0 e/ou na posição 3'-0 um pequeno grupo acilo ou alquilo ligado a 0 e compreendem pelo menos um grupo acilo ramificado, ligado a N, na posição 2, na posição 2', ou nas duas posições 2 e 2'. Estes compostos exibem uma endotoxicidade ainda menor, ao mesmo tempo que mantêm a actividade biológica (tal como imunomodulação) e possuem actividade anti-cancro.

Foi surpreendente o facto de estes dissacáridos de glucosamina específicos possuírem a combinação de menor endotoxicidade e manutenção de actividade biológica, porque apesar dos dissacáridos sintéticos de glucosamina desacilados em 3-0 e em 3'-0 compreendendo um grupo acilo ligado a N nas posições 2 e 2' (composto 307, Takada, H. et al. em CRC Criticai Reviews in Microbiology, Volume 16, páginas 477-523 (1989); e composto LA-19-PP, Rietschel et al. (1993)) exibirem alguma actividade imunobiológica em ensaios in vitro, essas actividades foram bastante mais fracas do que as de amostras de lípido A bacteriano de referência. Também lhes faltava actividade endotóxica típica.

Em conformidade, o presente invento refere-se a dissacáridos de glucosamina β (1-*6) que possuem a fórmula geral CH2

/ r2 onde R, é um grupo hidroxilo, um grupo di-hidroxifosfonoiloxi ou as suas formas com carga, um grupo aciloxi C^-C5, um grupo alquiloxi CtC5, ou um grupo X; 3 84 804 ΕΡ 0 729 473/ΡΤ R2 e R2· são cada um, um grupo acilo ou um grupo Y, com a condição de que pelo menos R2ou R2. seja o grupo Y; R3 e R3. são cada um, hidrogénio, um grupo alquilo C^-Cg, ou um grupo acilo C,-^; R4 é hidrogénio, um grupo alquilo CVCg, ou um grupo acilo CrC3; R4. é hidrogénio, um grupo acilo CrC5; um grupo alquilo C^Cg, um grupo dimetoxifosfonoilo, ou um grupo fosfono ou as suas formas com carga; e R6, é hidrogénio, um grupo hidroxilo, um grupo di-hidroxifosfonoiloxi, um grupo hidroxissulfoniloxi, as suas formas com carga, ou um grupo Z; onde o grupo X se selecciona do grupo que compreende um grupo carboxialquiloxi 0·,-05, um grupo -0-CH-[(CH2)mC00H][(CH2)nC00H], onde m = 0-5 e n= 0-5, um grupo fosfonoalquilo CVCg, um grupo dimetoxifosfonoiloxi, um grupo hidroxissulfoniloxi, um grupo hidroxissulfonilalquilo C^Cg, e as formas com carga do grupo X; onde o grupo Y se selecciona do grupo que compreende um grupo aciloxiacilo, um grupo acilaminoacilo, um grupo aciltioacilo, um grupo alquiloxiacilo CrC24, um grupo alquilaminoacilo Cl _C24, um grupo alquiltioacilo CrC24; e onde o grupo Z se selecciona do grupo que compreende um grupo alquiloxi C1-C24, um grupo aciloxi CrC24, 84 804 ΕΡ 0 729 473/ΡΤ 4

um ácido 3-desoxi-D-mano-2-octulosónico (KDO); (KD0)n, onden= 1-10; uma cadeia lateral de polissacárido, tal como uma cadeia lateral originária de lipopolissacárido natural; um componente central, tal como um componente originário de um lipopolissacárido natural; e grupo aminoalquil (CT-CgJ-carboxilo; e seus sais.

Estes dissacáridos de glucosamina exibem uma endotoxicidade bastante menor, determinada no teste de lisado amebócito de Limulus (LAL), do que os lipopolissacáridos (LPS) de por exemplo E. coli, o lípido A e o lípido A modificado em conformidade com US-A-4 912 094. Para além disso, estes dissacáridos de glucosamina em conformidade com o invento induzem compostos intermediários reactivos com óxido nítrico e citóquinas, tais como interleucina 1-alfa (IL 1-alfa), IL-6, factor de necrose tumoral (TNF) e prostaglandina (PGE).

Adicionalmente, estes dissacáridos apresentam actividade antitumoral tal como em carcinomatose peritoneal.

Finalmente a toxicidade aguda destes dissacáridos é extremamente baixa. Não se detectaram mortes em ratinhos suíços após uma dose intravenosa de 100 mg de dissacárido por kg de peso corporal. O presente invento refere-se também a um método para preparar esses dissacáridos de glucosamina usando matéria prima de origem biológica, isto é, qualquer matéria prima compreendendo a porção lípido A de polissacáridos de microorganismos, tais como bactérias Gram-negativas. Em conformidade com o invento, esta matéria prima é submetida, pelo menos, a um tratamento alcalino de forma a que os grupos acilo ligados a 0 e/ou oxiacilo ligados a 0 do açúcar sejam removidos. Se adequado, a matéria prima tratada com base pode ser submetida a mais tratamentos, para a remoção do polissacárido e do componente central . (por tratamento ácido), e para alterar ou trocar os substituintes na posição 1, posição 2, posição 3, posição 4, posição 2', posição 3', posição 4' e posição 6'.

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No entanto, os dissacáridos de glucosamina em conformidade com o invento podem ser obtidos também por síntese, partindo do respectivo dissacárido de glucosamina e introduzindo os substituintes pretendidos na posição 2 e/ou 2'.

Devido à endotoxicidade extremamente baixa em combinação com a actividade biológica atrás divulgada, estes dissacáridos em conformidade com o invento constituem um ingrediente activo de eleição de uma composição farmacêutica. Essa composição farmacêutica e os dissacáridos per se podem ser utilizados como agente imunomodulador, agente antitumoral e como componente de uma vacina. 0 dissacárido de glucosamina em conformidade com o invento (um dímero β (1-»6) de D-glucosamina) é caracterizado por cada glucosamina compreender, nas posições 3 e 3', um grupo hidroxilo ou um pequeno grupo acilo ou alquilo ligado a 0, não alterando substancialmente a endotoxicidade e/ou a actividade biológica, e ainda pelo menos um grupo acilo ramificado, ligado a N, na posição 2 ou 2' ou nas duas posições 2 e 2'. A restante posição 2' ou 2 é acilada em N. Presumivelmente, a presença de duas cadeias hidrófobas na posição 2 e na posição 2', das quais pelo menos uma está na forma de um grupo acilo ramificado, confere ao dissacárido a combinação de endotoxicidade extremamente baixa e manutenção da actividade biológica. O grupo acilo ramificado, aqui geralmente referido como o grupo Y, é seleccionado do grupo compreendendo um grupo aciloxiacilo, um grupo acilaminoacilo, um grupo aciltioacilo, e um grupo alquiloxiacilo 0,-024, um grupo alquilaminoacilo e um grupo alquiltioacilo Ci-C24.

No caso do grupo aciloxiacilo, os dois grupos acilo estão ligados através de um átomo de oxigénio, no caso do grupo acilaminoacilo através de um grupo NH, e no caso do grupo aciltioacilo através de um átomo de enxofre. Os outros membros do grupo Y, do grupo alquiloxiacilo 0,-024, do grupo alquilaminoacilo 0,-024, e do grupo alquiltioacilo 0,-024 podem ser obtidos partindo do correspondente hidroxi-ácido gordo.

Preferencialmente, o grupo Y representa um grupo acilo, ligado a N, ramificado na sua posição 3, tal como um grupo 3-aciloxiacilo, um grupo 6 84 804 ΕΡ 0 729 473/ΡΤ 3-acilaminoacilo, e um grupo 3-aciltioacilo. 0 mesmo se aplica aos equivalentes supramencionados de alquilo (C^C^).

Os membros do grupo Y compreendem, de preferência, uma ou duas porções acilo, seleccionadas de preferência de entre resíduos de ácido gordo, resíduos de hidroxi-ácido gordo e resíduos de oxi-ácido gordo. Quando o grupo aciloxiacilo for preferencialmente um grupo 3-aciloxiacilo, essas porções acilo compreenderão um resíduo de 3-hidroxi-ácido gordo ou, no caso do grupo ligado por éster, um resíduo de 3-oxo-ácido gordo. Exemplos típicos do grupo aciloxiacilo são os 3-hidroxi-ácido gordo (C4-C24)acilos que se ligam por éster a um ácido carboxílico 0,-0^ na posição 3-hidroxi. O grupo aciloxiacilo é, de preferência, um 3-hidroxi-ácido gordo (C8-C18)-acilo que se liga a um ácido gordo C10-C18 por éster na posição 3-hidroxi. Estes grupos aciloxiacilo estão presentes no componente lípido A de bactérias Gram-negativas, tais como Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Campyiobacter jejurti, Rhodocydus gelatinosus, Chromobacterium violaceum, Neisseria meningitidis, Salmonella minnesota.

Num primeiro grupo de dissacáridos de glucosamina preferidos, em conformidade com o invento, o grupo aciloxiacilo é o 3-hidroxi-ácido gordo C14-acilo ligado a N, ligado ao ácido gordo C12 por éster na posição 3-hidroxi, com este grupo aciloxiacilo na posição 2'. Num outro dissacárido de glucosamina preferido, em conformidade com o invento, o grupo aciloxiacilo é o 3-hidroxi-ácido gordo C14-acilo ligado a N, ligado ao ácido gordo C14 por éster na posição 3-hidroxi, e o grupo aciloxiacilo está preferencialmente na posição 2'.

Num outro dissacárido de glucosamina preferido de acordo com o invento, o grupo aciloxiacilo é o 3-hidroxi-ácido gordo C14-acilo ligado a N, ligado ao ácido gordo C12 por éster na posição 3-hidroxi, com este grupo aciloxiacilo na posição 2. Num outro dissacárido de glucosamina preferido, em conformidade com o invento, o grupo aciloxiacilo é o 3-hidroxi-ácido gordo C14-acilo ligado a N, ligado ao ácido gordo C12 por éster na posição 3-hidroxi, com o grupo aciloxiacilo na posição 2 e na posição 2'.

Quando o grupo Y compreende um centro quiral, o invento envolve todos os enantiómeros R e S, e qualquer mistura racémica. O outro substituinte ligado a N pode ser um grupo acilo ou também um

84 804 ΕΡ 0 729 473/ΡΤ 7 grupo aciloxiacilo. De acordo com um segundo grupo de dissacári conformidade com o invento, o grupo acilo é um 3-hidroxi-ácido gordo C4-C24, de preferência um 3-hidroxi-ácido gordo Cl0-C18. Nos dissacáridos preferidos em conformidade com o invento, o grupo acilo é um 3-hidroxi-ácido gordo C14, na posição 2 ou na posição 2'.

No entanto, o substituinte ligado a N pode ser, também, um grupo aciloxiacilo definido como anteriormente, e compreendendo um 3-hidroxi-ácido gordo C4-C24-acilo ligado a N, que se liga ao ácido carboxílico C,-C20por éster na posição 3-hidroxi, de preferência um 3-hidroxi-ácido gordo C8-C18-acilo ligado a N, ligado por éster na posição 3-hidroxi ao ácido gordo C10-C18. Mais preferido é o dissacárido onde R2 é o 3-hidroxi-ácido gordo C14-aciio ligado a N, ligado por éster na posição 3-hidroxi ao ácido gordo C12 ou ao ácido gordo C16, e onde R2. é o 3-hidroxi-ácido gordo C,4-acilo ligado a N, ligado por éster na posição 3-hidroxi ao ácido gordo C12ou ao ácido gordo C14.

Note-se que no grupo Y os grupos acilo e/ou o grupo acilo e alquilo podem estar interligados.

Neste fascículo, o termo "resíduo de ácido gordo" significa: uma cadeia substancialmente hidrófoba de C2-C30 átomos, podendo esta cadeia ser linear, ramificada, saturada, mono ou poli-insaturada, contendo inseridos um ou mais heteroátomos, tais como azoto, oxigénio, enxofre, e podendo esta cadeia estar substituída com um ou mais substituintes, tais como hidroxilo, oxo, aciloxi, alcoxi, amino, nitro, ciano, halogéneo, sulfidrilo, desde que a actividade biológica não seja substancialmente afectada, de forma prejudicial. Um exemplo de um resíduo de ácido gordo substituído (compreendendo um substituinte ligado por amida) é divulgado por Onozuka, K. et al. em Int. J. Immunopharmac, Volume 15, páginas 657-664 (1993)). O substituinte R, pode ser um grupo aciloxi 0Γ05 ou um grupo alquiloxi CrC5 enquanto que R4. pode ser um grupo acilo C^-Cg ou um grupo alquilo CVCg, desde que as propriedades dos dissacáridos de glucosamina não sejam afectadas de forma prejudicial. Para além disso, Rt pode ser um grupo hidroxilo e R4 pode ser hidrogénio. De preferência, R, e R4. podem, cada um, ser um grupo contendo fósforo. Esse grupo, em particular, na posição 1 ou posição 4', pode influenciar a actividade biológica, tal como uma diferente estimulação de

84 804 ΕΡ 0 729 473/ΡΤ 8 citóquinas (ver Takada, H.r e Kotani, S., em Bacterial Endotoxic Lipopolysaccharides, Morrison, D.C. e Ryan, J., CRC Press, Volume 1, páginas 107-134 (1992), em particular a página 123). Os dissacáridos preferidos de acordo com o invento compreendem um grupo di-hidroxifosfonoiloxi na posição 1 e um grupo fosfono na posição 4', em que o grupo na posição 1 está, de preferência, na configuração a. O substituinte R, pode também ser representado pelo grupo X. 0 grupo X é geralmente carregado negativamente a pH fisiológico. 0 grupo X pode ser um grupo carboxialquiloxi (C,-Cs). O grupo X pode também ser um ácido dicarboxílico com a fórmula -0-CH-[(CH2)mC00H][(CH2)nC00H], onde m= 0-10 e n= 0-10, tal como m e n igual a 0, m e n igual a1,em=1en=3. O substituinte ácido dicarboxílico na posição 1 onde m e n são 1 é divulgado por Onozuka et al. (1993). Em vez de um ácido dicarboxílico, o grupo X pode ser representado por um grupo fosfonoalquilo (C,-C5), tal como um grupo fosfonometilo ou um grupo fosfonoetilo. 0 grupo substituinte X pode também ter a forma de um grupo sulfato ou de um grupo hidroxissulfonilalquilo (CrC5), tal como um grupo hidroxissulfonilmetilo.

Os substituintes R3 e R3. podem ser um grupo acilo ou alquilo pequenos, que não afecte desfavoravelmente a endotoxicidade e/ou a actividade biológica dos dissacáridos de glucosamina em conformidade com o invento. Exemplos são um grupo alquilo C^Cg, e um grupo acilo 0,-03. De preferência, os substituintes R3 e R3. são ambos hidrogénio, o que significa que a posição 3 e a posição 3' não estão aciladas. 0 substituinte R4 na posição 4 pode ser um grupo alquilo 0,-03 ou um grupo acilo 0,-03, cujo significado se definiu anteriormente. O dissacárido acilado em 4-0 pode ser sintetizado usando 0 método divulgado por Kusumoto S., et al., ACS Symposium Series, Volume 231, páginas 237-254, (1983). No entanto, prefere-se na posição 4 um grupo hidroxilo (R4 = H). 0 substituinte R6. pode ser hidrogénio, um grupo hidroxilo, um grupo di-hidroxifosfonoiloxi, um grupo di-hidroxissulfoniloxi e as suas formas com carga.

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Para melhorar a solubilidade em água dos dissacáridos de glucosamina em conformidade com o invento, o substituinte na posição 6' pode ter um acentuado carácter hidrófilo conferido pelo grupo Z. O grupo Z pode ser ácido 3-desoxi-D-mano-2-octulosónico (KDO) ou várias moléculas de KDO, tais como as presentes no centro interior de polissacáridos naturais directamente adjacentes ao componente lípido A. O grupo Z pode também ser a cadeia de polissacárido completa ou em parte, tal como uma cadeia lateral originária de um lipopolissacárido natural, ou um componente central originário de lipopolissacáridos naturais. 0 grupo Z pode também ser um grupo amino-alquil (C.,-C8)-carboxilo. A solubilidade em água dos dissacáridos em conformidade com o invento é, por um lado, determinada pela presença de grupos com carga, o carácter hidrófilo do substituinte na posição 6'. Por outro lado, a solubilidade em água pode também ser melhorada quando o dissacárido de glucosamina está na forma de um sal, tal como um sal compreendendo um ou mais catiões de metal alcalino e/ou ião amónio formando um par com, por exemplo, grupos di-hidroxifosfonoiloxi, grupos carboxiiato, grupos fosfono, grupos hidroxissulfonoiloxi, e grupos hidroxissulfonilalquilo quando presentes.

Note-se que qualquer cadeia ou porção alquilo ou acilo pode ser linear, ramificada, saturada, mono ou poli-insaturada, tendo inseridos um ou mais heteroátomos tais como azoto, oxigénio, enxofre, e em que a cadeia pode estar substituída com um ou mais substituintes, tais como hidroxilo, oxo, aciloxi, alcoxi, amino, nitro, ciano, halogéneo, sulfidrilo, desde que a actividade biológica não seja, de modo significativo, desfavoravelmente afectada.

Os dissacáridos de glucosamina em conformidade com o invento podem ser obtidos a partir de matérias primas compreendendo a porção lípido A de lipopolissacáridos que estão presentes em microorganismos, tais como bactérias Gram-negativas. Estes lipopolissacáridos estão presentes, por exemplo, numa estrutura de superfície compreendendo parte desses microorganismos e em lipopolissacáridos originários destes. Bactérias Gram-negativas preferidas usadas como fonte de matéria prima são a Escherichia coli e a Haemophilus inf/uenzae. No entanto, pode ser utilizado como matéria prima LPS ou lípido A disponíveis

84 804 ΕΡ 0 729 473/ΡΤ 10 comercialmente. A desacilação selectiva na posição 3 e na posição 3' é efectuada usando um tratamento alcalino. As condições do tratamento alcalino são escolhidas de forma a que ambas as glucosaminas sejam desaciladas em 3-hidroxi. O tratamento alcalino pode ser efectuado usando hidróxidos, carbonatos, e fosfatos, tais como hidróxido de sódio ou carbonato de potássio. Agentes orgânicos alcalinos ilustrativos são as alquilaminas, tais como a dietilamina e a trietilamina. 0 tratamento alcalino é normalmente efectuado num meio aquoso ou orgânico. O pH está, tipicamente, na gama de 10-14, tal como 11-13, em condições práticas o pH é, por exemplo 12,2. 0 tratamento alcalino é normalmente efectuado a uma temperatura entre a temperatura ambiente e 70°C, tal como 37°C. O período de tempo depende do tipo de matéria prima. Partindo de microorganismos, o período de tempo varia entre 1 hora e 10 dias, tal como entre 8 horas e 5 dias, mas está normalmente na gama de 8-40 horas. Partindo de lipopolissacáridos ou de lípido A, o período de tempo pode ser 0,2-10 horas, tal como 1-5 horas. Na prática, o período de tempo é de cerca de 1,5 a 3 horas.

Quando a matéria prima compreende na posição 6' um componente central que é para remover, a matéria prima é submetida a um tratamento ácido para remover esse componente central. Este tratamento ácido pode ser efectuado antes ou depois do tratamento alcalino supramencionado. O tratamento ácido é efectuado a um pH de 1-5, de preferência numa gama de pH de 2,5-4,5, normalmente a um pH superior a 3 e inferior a 4,5, tal como 3,5. A pH 1 ou inferior, o dissacárido de glucosamina é desfosforilado, resultando numa forma monofosforilada. Os ácidos que podem ser utilizados são ácidos inorgânicos ou orgânicos, tais como ácido clorídrico e ácido acético glaciar. 0 período de tempo para o tratamento ácido é de cerca de 30 minutos a 5 horas, tal como 1-2 horas. Durante o tratamento ácido, a temperatura é elevada até cerca de 70-100°C, tal como 80-100°C, na prática 95°C. Subsequentemente, a temperatura é diminuída até à temperatura ambiente.

Os dissacáridos de glucosamina em conformidade com o invento, podem também ser obtidos partindo do correspondente dímero de glucosamina mono-, di- ou desfosforilada, ligando um grupo aciloxiacilo, um grupo acilaminoacilo e/ou um grupo aciltioacilo tanto na posição 2 como na posição 2'.

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Após a desacilação parcial destes dissacáridos de glucosamina em conformidade com o invento e a separação dos produtos, obtêm-se dissacáridos de glucosamina, possuindo um grupo acilo ramificado na posição 2 ou na posição 2'.

Os dissacáridos de glucosamina em conformidade com o invento podem ser utilizados numa composição farmacêutica ou num medicamento e utilizados como agente imunomodulador para inibir, estimular ou induzir a tolerância da produção de intermediários reactivos com óxido nítrico e citóquinas, dependendo da frequência de aplicação e da dosagem, como agente antitumoral, como por exemplo reactivação das células T, como componente de vacinas, como competidor por locais de ligação de endotoxinas e como modulador de interleucinas. Devido à endotoxicidade extremamente baixa estes dissacáridos são quase ou substancialmente isentos de efeitos secundários.

Os dissacáridos em conformidade com o presente invento podem ser aplicados sistémica ou localmente usando injecção intravenosa, injecção subcutânea, injecção intraperitoneal, injecção intramuscular, e semelhantes. A dosagem variará de acordo com o paciente animal ou humano, idade, peso corporal, sintomas ou doença a ser tratada, efeito terapêutico pretendido, via de administração, termo de tratamento, e semelhantes. Serão obtidos efeitos satisfatórios usando uma dosagem de 0,001 a 500 mg/kg de peso corporal administrados numa ou mais doses diárias ou numa forma de libertação prolongada. A composição farmacêutica pode compreender um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável para, por exemplo, administração não oral de soluções, suspensões ou emulsões aquosas ou não aquosas. As soluções ou as suspensões aquosas podem compreender água destilada ou solução salina fisiológica. As soluções não aquosas podem incluir propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais, tais como azeite, álcoois. A composição pode conter outros aditivos, tais como conservantes, agentes molhantes, agentes emulsionantes, agentes dispersantes e semelhantes.

Para uma maior compreensão do presente invento faz-se referência aos seguintes exemplos.

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Exemplo 1

Fez-se uma cultura de Escherichia coli 1-1147 (depositadas em CNCM em 3 de Outubro, 1991 sob o número 1-1147) num meio de cultura cuja composição é divulgada no Quadro 1.

Quadro 1

Composição do meio de cultura (dissolvido em água) para E. coli 1-1147.

Substância Quantidade/L Inosina 0,200 g Mono-hidrato de ácido cítrico 0,300 g Ácido glutâmico 1,300 g Cloreto de amónio 1,050 g Sulfato de magnésio'7H20 1,110 g Di-hidroge~nofosfato de potássio 1,360 g (KH2P04) 0,300 g Arginina 0,100 g Uracilo 0,017 g Cloreto de cálcio 2,000 g Cloreto de sódio 1 ml Oligometais (sol. reserva 1000xconc.) 10,0 g L-leucina 10,0 g L-lisina.HCI 10,0 g L-serína 10,0 g L-metionina 10,0 g L-valina 10,0 g L-Alanipa 10,0 g L-asparagina 5 ml Glucose (sol. reserva 500 g/l)

Solução de reserva de oligometais: 2,5 g de FeCI2.4H20; 0,25 g de CoCI2.6H20; 0,25 g de NaMo04.7H20; 0,25 g de MnS04.4H20; 0,25 g de ZnS04.7H20; 0,25 g de NiS04.7H20; 0,05 g de H3B04; 0,05 g de CuS04, depois adicionar 1,0 L de H20, misturar e adicionar 1,1 ml de H2S04 (85%).

Ajustou-se o pH do meio de cultura usando NaOH 5N, amónia a 5% ou HCI a 25%. Fez-se a cultura de Escherichia coli 1-1147 a 37°C e a um pH de

84 804 ΕΡ 0 729 473/ΡΤ 13 6,9, com arejamento e agitação (500 rpm).

Inactivou-se, posteriormente, o conteúdo do fermentador usando um tratamento térmico (105°C durante 2 minutos).

Submeteu-se o conteúdo inactivado do fermentador a ultrafiltração (exclusão nominal de 1000kD), e lavaram-se as bactérias retidas usando uma solução aquosa a 0,6% de NaCI. Concentrou-se por ultrafiltração a suspensão bacteriana lavada. O rendimento de biomassa foi de 764 g de peso seco.

Diluiu-se a biomassa até 7,0 g/l e submeteu-se a um tratamento alcalino adicionando 345 ml de NaOH 10,77 N e incubou-se a 37°C durante 40 horas (pH 12,2).

Submeteu-se o extracto alcalino a uma primeira ultrafiltração (exclusão nominal de 1000 kD), e a uma segunda ultrafiltração do permeado (10 kD). Submeteu-se o retentado da segunda ultrafiltração a um tratamento ácido.

Diluiu-se o retentado com 7,0 L de água e acidificou-se usando 370 ml de ácido acético glaciar (pH final 3,52). Aqueceu-se a mistura até 95°C durante 120 minutos enquanto se agitava. Posteriormente, arrefeceu-se a suspensão ácida até 25°C. Separou-se o precipitado por centrifugação (4000xg durante 50 minutos). Suspendeu-se de novo a pelete em água (3,7 I) e submeteu-se a uma extracção usando propan-2-ol (4,3 I) e após 60 minutos a 25°C, adicionaram-se 252 ml de trietilamina (pH 9,0) e continuou-se a agitar durante 24 horas.

Recuperou-se o sobrenadante por centrifugação (4000xg, 25°C durante 50 minutos) e extractou-se de novo a pelete duas vezes usando propan-2-ol a 90%. Combinaram-se os sobrenadantes e submeteram-se a cromatografia de fase inversa (Waters N° 10001, C18 preparativa, 125 Â).

Em alternativa, submeteu-se o extracto tratado com ácido a ultrafiltração e concentrou-se o retentado (>1000 kD) e submeteu-se a diálise contra 5 volumes de água. Diluiu-se o retentado dialisado com 9 volumes de propan-2-ol e ajustou-se o pH até 9 com trietilamina (TEA). Efectuou-se a extracção com agitação durante 2 horas.

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Retirou-se ο sobrenadante como se descreveu antes e extractou-se de novo o precipitado com propan-2-ol. Combinam-se os sobrenadantes e submetem-se a concentração em vácuo (40°C, 12 Torr (0,016 atm)) e submetem-se, finalmente, a cromatografia de fase inversa em C18 Prep Sep Pak (Waters N° 10001).

Dilui-se cada um dos dois sobrenadantes com dois volumes de água e mistura-se com fosfato de tetrabutilamónio (TBAP) 5 mM e aplica-se numa coluna compreendendo 50 g de C18 Prep Sep Pak (marca registada) de cromatografia de fase inversa (Waters N° 10001, C18 preparativa, 125Â) pré-condicionada com 250 ml de CH3CN:H20 a 1:1, (v/v) + TABAP 5 mM. Lavou-se a coluna com CH3CN a 60%:H20 a 1:1 (v/v) + TBAP 5 mM e propan-2-ol a 40%:H2O a 9:1, (v/v) + TBAP 5 mM. Os dissacáridos em conformidade com o invento eluíram numa fracção a CH3CN a 30%:H20 a 1:1 (v/v) -I- TBAP 5 mM e propan-2-ol a 70%:H20 a 9:1 (v/v) + TBAP 5 mM.

Diluiu-se a fracção de dissacárido obtida na cromatografia de fase inversa com água 1:1 (v/v) + TBAP 25 mM e aplicou-se numa coluna de HPLC preparativa (Millipore-Waters Bondapak Cl8 300Â 15 M (marca registada), 300 mmx47 mm de φ). A fracção de dissacárido em conformidade com o invento eluiu em propan-2-ol a 67%:H20 a 9:1 (v/v) + TBAP 25 mM e CH3CN a 33%:H20 a 1:1 (v/v) + TBAP 25 mM. Esta fracção continha 55 mg de dissacárido A em conformidade com o invento.

Dessalificacão do dissacárido

Eliminou-se o sal de uma quantidade alíquota da fracção de dissacárido A do seguinte modo. Condicionou-se uma coluna Sep Pak Vac C18 Plus (marca registada) (sílica C18, 0,6 ml, Waters N° 20515) injectando sucessivamente 5 ml de CHCI3-CH3OH a 2:1 (v/v), 5 ml de CH3CN e 5 ml de CH3CN:H20 a 1:1 (v/v). Adicionou-se a amostra à coluna após diluição da fracção de HPLC com 3 volumes de H20, perfazendo um total de 6 ml de amostra diluída. Eliminou-se, então, o TBAP com 10 ml de CH3CN:H20 a 1:1 (v/v) + 10 ml de HCI mM, seguido de 10 ml de CH3CN. Retirou-se então o dissacárido A puro com 5 ml de CHCI3-CH3OH a 2:1 (v/v).

Secou-se a fracção por evaporação em vácuo (12 Torr) a 35°C. Dissolveu-se de novo o dissacárido A dessalificado em H20:TEA a 1000:1 (v/v)

84 804 ΕΡ 0 729 473/ΡΤ 15 para testes biológicos e bioquímicos ou em clorofórmio: metanol a 2:1 (v/v) para FAB-MS.

Preoaracão da forma de sal de sódio

Pré-condicionou-se uma coluna compreendendo 10 g de Cia Prep Sep Pak de fase inversa (Waters N° 10001, C18 preparativo, 125Â) sucessivamente com 50 ml de CH3CN e 50 ml de CH3CN:H20 a 1:1 (v/v).

Adicionou-se a amostra (fracção de HPLC) à coluna após diluição com 1 volume de H20. Após adsorção, lavou-se a coluna com 100 ml de CH3CN:H20 a 1:1 (v/v) + TBAP 5 mM. Removeu-se, então, o dissacárido com 50 ml de propan-2-ol:H20 a 9:1 (v/v) + TBAP 5 mM.

Purificou-se a fracção resultante da seguinte forma. Condicionou-se uma coluna de fluxo rápido compreendendo 20 ml de Q-Sepharose (marca registada) (Pharmacia 17-0510-01) sucessivamente com 30 ml de NaOH 1M, lavou-se com H20 para neutralizar, com 30 ml de HCI 1M e lavou-se com HzO para neutralizar.

Aplicou-se a amostra directamente na coluna. Após a adsorção, eliminou-se o material não adsorvido com 200 ml de H20 e 100 ml de propan-2-ol:H20 a 9:1 (v/v). Eluiu-se o dissacárido com 100 ml de NaCI a 0,9%:isopropanol a 1:1 (v/v).

Efectuou-se a purificação final do seguinte modo. Pré-condicionou-se uma coluna compreendendo 10 g de CJ8 Prep Sep Pak de fase inversa, sucessivamente com 50 ml de CH3CN, 50 ml de CHCI3-CH3OH a 2:1 (v/v), 50 ml de CH3CN e 50 ml de CH3CN a 50%:H20 a 1:1 (v/v). Adicionou-se a amostra à coluna após diluição com 1 volume de H20. Após adsorção, lavou-se a coluna sucessivamente com 200 ml de H20, 200 ml de propan-2-ol:H20 a 9:1 (v/v) e 50 ml de CH3CN. Eluíu-se o dissacárido com 50 ml de CHCI3-CH3OH a 2:1 (v/v). Secou-se a fracção por evaporação em vácuo (12 Torr) a 35°C. O sal de sódio era livremente solúvel em água (até 100 mg/ml).

Exemplo 2

Fez-se uma cultura de Haemophilus infíuenzae (adquirido da National

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Collection of Type Cultures (ATCC 9795)) num meio de cultura cuja composição se divulga no Quadro 2.

Quadro 2

Composição do principal meio de cultura para Haemophilus influenzae.

Substância Quantidade/I Cloreto de sódio 2 g Mono-hidrogenofosfato de sódio 2 g Acetato de sódio 0,5 g Aneurina 0,300 g Ácido nicotínico 0,300 g Solução de lactato de sódio a 70% 2 ml Solução de lactato de amónio a 60% 2 ml Extracto de carne 7,5 g Peptona 1 5 g Peptona de soja 1 g Triptona 3 g Extracto de levedura 7,5 g Glucose 3 g

Suplementou-se o meio de cultura com hemina (10 mg/l) e NADH (4 mg/l). Ajustou-se o pH até 7,0±0,3 usando NaOH 5N ou HCI a 25%. Após o início da formação de uma fase estacionária, interrompeu-se a cultura e inactivou-se o conteúdo do fermentador através de um tratamento térmico (100°C durante 100 segundos). Submeteu-se a cultura inactivada a centrifugação e diluiu-se a biomassa separada, com solução aquosa de NaCI a 0,6% (aproximadamente 60 g/l). Efectuou-se o tratamento alcalino adicionando NaOH 10N até à concentração final de 0,2 N de NaOH. Efectua-se este tratamento a 37°C durante 5 dias em agitação contínua.

Submeteu-se o lisado tratado com base directamente a um tratamento ácido após acidificação até pH 3,5 usando ácido acético glaciar. Aqueceu-se a mistura até 95°C durante 120 minutos e posteriormente arrefeceu-se até à temperatura ambiente.

Centrifugou-se o precipitado (10000 χ g, 30 minutos, a 4°C) e desprezou-se o sobrenadante.

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Fez-se novamente a suspensão do precipitado em CH3CN:H20 1:1 (v/v), e regulou-se o pH até pH 9 usando TEA. Após centrifugação (15 000xg, 10 minutos), ajustou-se o sobrenadante a TBAP 5 mM. Aplicou-se o sobrenadante numa coluna de Pak Vak C13 (10 g de sílica C18, 35 ml, Waters N° 43345) condicionada usando 50 ml de CH3CN:H20 a 1:1 (v/v). Eluíu-se a fracção contendo o dissacárido B em conformidade com o invento com 50 ml de propan-2-ol:H20 a 9:1 (v/v) + TBAP 5 mM.

Concentrou-se esta fracção por evaporação (35°C, 12 Torr) até cerca de 2 ml. Centrifugou-se a fracção (15000 χ g, 5 minutos) e aplicou-se o sobrenadante numa coluna C18 de HPLC semi-preparativa (Macherey-Nagel N° 715806, 250 mmx10 mm de φ, Nucleosil 300-7C18 (marca registada)). A fracção contendo dissacárido B em conformidade com o invento eluiu numa fracção compreendendo CH3CN a 28%:H20 a 1:1 (v/v) + TBAP 25 mM e propan-2-ol a 72%:H20 a 9:1 (v/v) + TBAP 25 mM.

Dessalificou-se o dissacárido B usando um método semelhante ao do exemplo 1.

Exemplo 3

Submeteu-se lipopolissacárido de Escherichia coli 0111:B4 (Sigma, produto N° L3024) a um tratamento alcalino em NaOH 0,2 M a 37°C durante 1,5 horas. Neutralizou-se a solução usando ácido fosfórico 1M.

Concentraram-se 400 μΙ da solução de LPS tratada com base, por ultrafiltração (Millipore Ultrafree-MC, UFC3 LGC 00, exclusão nominal de 10 kD).

Diluiu-se o retentado {>10 kD) em 400 μΙ de H20 e submeteu-se a um tratamento ácido ajustando até 0,2 M ácido acético usando ácido acético glaciar. Aqueceu-se a solução acidificada até 95°C durante 120 minutos. Após arrefecimento até 25°C, sedimentou-se o precipitado por centrifugação (15000xg, 10 minutos) e desprezou-se o sobrenadante. Dissolveu-se o precipitado em 20 μΙ de H20:TEA a 1000:1 (v/v) e aplicou-se esta solução numa coluna de HPLC analítica C18 (Supelco N° 58985, Supelcosil LC-18 (marca registada), 3 μητι, 150 mmx4,6 mm de φ). A fracção de dissacárido em conformidade com o invento eluiu numa fracção compreendendo CH3CN a

84 804 ΕΡ 0 729 473/ΡΤ 18 42%:Η20 a 1:1 (ν/ν) + ΤΒΑΡ 5 mM β propan-2-ol a 58%:Η20 a 9:1 (ν/ν) + ΤΒΑΡ 5 mM.

Exemplo 4

Preparou-se uma solução de 2 mg/ml de lípido A de Escherichia coli F-583 (Sigma, Produto N° L5399) em H20:TEA 1000:1 (v/v), e submeteu-se esta solução a um tratamento alcalino usando NaOH 0,2 M a 37°C durante 2,5 horas. Neutralizou-se a solução usando ácido fosfórico 1M.

Aplicou-se a solução neutralizada numa coluna de HPLC analítica (Supelco N° 58958, Supelcosil LC-18, 3 μιτι, 150 mmx4,6 mm de φ). 0 dissacárido em conformidade com o invento eluiu a CH3CN a 42%:H20 a 1:1 (ν/ν) + TBAP 5 mM e propan-2-ol a 58%:H20 a 9:1 (v/v) + TBAP 5 mM.

Exemplo 5

Trata-se di-hidrogenofosfato de 2-amino-2-desoxi-6-0-(2-amino-2-desoxi-4-0-fosfono-p-D-glucopiranosil)-cc-D-glucopiranosilo [Holst et al. Eur. J. Biochem. 214 (1993) 695-701] em metanol com metóxido de sódio (exactamente 4,0 equiv. mol) e depois com anidrido de (R)-3-dodecanoiloxitetradecanóico (2,2 equiv. mol.) [preparado pela reacção de ácido (R)-3-dodecanoiloxitetradecanóico com DCC (0,5 equiv. mol.) em diclorometano anidro, ver Charon et al. J. Chem. Soc. Perkin Trans. I (1984) 2291-2295]. Após 12 horas à temperatura ambiente, adiciona-se água (2 x o volume de metanol) e extracta-se a mistura com éter dietílico (para remover o ácido 3-dodecanoiloxitetradecanóico). Concentra-se a fase aquosa e submete-se o dissacárido C bruto em conformidade com o invento, a HPLC de fase inversa. Dissolve-se o produto em H20:TEA a 1000:1 (v/v) e adiciona-se fosfato de tetrabutilamónio (TBAP) até uma concentração de 5 mM. Aplica-se então esta solução numa coluna de HPLC preparativa (Millipore-Waters Bondapak C18 300Â 15 M, 300 mmx47 mm de φ). Elui-se o dissacárido C com um gradiente de CH3CN:H20 a 1:1 (v/v) + TBAP 25 mM (solvente A) e propan-2-ol:H20 a 9:1 (v/v) + TBAP 25 mM (solvente B) (50% de A:50% de B a 0% de A: 100% de B, a 1 %/min, caudal 80 ml/min.). Consegue-se a dessalificação do seguinte modo. Dilui-se com água a fracção de HPLC contendo dissacárido C depois aplica-se numa coluna C18 Sep Pak Pfus (marca registada) (Waters) (sílica gel C18 de fase inversa pré-condicionada sucessivamente com CHCI3:CH3OH a 2:1 (v/v), CH3CN, CH3CN:H20 a 1:1 (v/v)). Elimina-se o TBAP lavando sucessivamente

84 804 ΕΡ 0 729 473/ΡΤ 19 com CH3CN:H20 a 1:1 (v/v), HCI 10 mM e CH3CN. Elui-se o dissacárido C puro com CHCI3:CH3OH a 2:1 (v/v).

Exemplo 6

Trata-se a fase aquosa contendo o dissacárido C obtido no Exemplo 5 (antes da purificação) com hidróxido de sódio aquoso (exactamente 1,0 equiv. mol.; concentração que conduz a um pH inicial de 12,5); após 24 horas à temperatura ambiente, ajustou-se a mistura a um pH de 6,5 a 7 e aplicou-se numa coluna de HPLC preparativa (Millipore-Waters Bondapak C13 300Á 15 M, 300 mmx47 mm de φ). Eluíram-se os dissacáridos A e D com um gradiente de CH3CN:H20 a 1:1 (v/v) + TBAP 25 mM (solvente A) e propan-2-ol:H20 a 9:1 (v/v) + TBAP 25 mM (solvente B) (75% de A:25% de B até 0% de A: 100% de B, a 1 %/min, caudal de 80 ml/min.). Dessalificam-se as fracções de HPLC contendo os dissacáridos A e D da forma descrita para o dissacárido C no exemplo 5.

Exemplo comparativo (não em conformidade com o invento)

Preparou-se uma solução de 10 mg/ml de lípido A de Escheríchia coli F-583 (Sigma, Produto N° L5399) em H20:trietilamina a 1000:1 (v/v) e posteriormente submeteu-se a um tratamento alcalino com NaOH 0,2 M a 37°C durante 20 minutos. Este período de tempo foi apenas suficiente para desacilar o lípido A em 3-0 (Myers et al. em Cellular and Molecular Aspects of Endotoxin Reactions, páginas 145-156 [1990], Elsevier Science Publishers).

Neutralizou-se a solução com ácido ortofosfórico. Para ensaios biológicos, diluiu-se em TEA a 0,1 %/NaCI a 0,9% e usou-se sem mais purificação.

Para FAB-MS purificou-se uma amostra deste lípido A tratado com base por HPLC de fase inversa (Superco N° 58985, Supelcosil LC18, 3 μπη, 15mmx4,6 mm de φ). Dessalificou-se o pico principal eluindo a CH3CN a 18%:H20 a 1:1 (v/v) + TBAP 5 mM e propan-2-ol a 82%:H20 a 9:1 (v/v) + TBAP 5 mM nas condições descritas no Exemplo 1. A análise de FAB-MS originou um ião molecular de 1570,1 unidades de massa (calculado 1569,1 unidades de massa).

Caracterfsticas físico-químicas de dissacáridos em conformidade com o invento

Submeteram-se os dissacáridos A e B obtidos nos exemplos 1 e 2 a 84 804 ΕΡ 0 729 473/ΡΤ 20

caracterizações físico-químicas.

Determinou-se a glucosamina após hidrólise ácida (HCI 4M, 16 horas, 100°C, atmosfera de árgon) e formação de derivados usando isotiocianato de fenilo e posterior análise quantitativa por HPLC (ver Anumula, K. R. et a/., Analytical Biochemistry, volume 179, páginas 113-122 [1991]).

Determinaram-se os ácidos gordos totais, após hidrólise ácida (HCI 4M, 4 horas, 100°C), por metilação usando BF3 na presença de metanol e determinação quantitativa por cromatografia gasosa (coluna OV-1, Hewlett Packard) (ver Miller, L., Gas-Liquid Chromatography of Cellular Fatty Acids as a Bacterial Identification Aid, Gas Chromatography Application Note, páginas 228-237 [1984]).

Determinaram-se os ácidos gordos ligados por éster por cromatografia gasosa após tratamento usando NaOCH3 (ver Rietschel, E. T. et al., European Journal of Biochemistry, Volume 28, páginas 166-173 [1972]).

Determinou-se o fosfato em conformidade com o método de Ames (ver Ames, B. N., Methods in Enzymology, volume 8, páginas 115-118 [1966]).

Determinou-se o ácido 3-desoxi-D-mano-2-octulosónico (KDO) usando o método de Karkhanis, Y. D. et al. (Analytical Biochemistry, volume 58, páginas 595-601 [1978]).

Uma solução de dissacárido A compreendia 2,1 pmol/ml de fosfato; 1,9 pmol/ml de glucosamina; 1,0 Limol/ml de ácido gordo C12:0 e 2,2 pmol/ml de ácido gordo 30H-C14:0. Só se detectou o ácido gordo C12:0 após a libertação de resíduos de ácido gordo ligado por éster, mostrando que os resíduos ácido gordo 30H-C14:0 estavam ligados por amida. Não se detectou KDO (<1 mole por 10 moles de dissacárido A).

Em conformidade, o dissacárido contém por mole, 2 moles de fosfato, 2 moles de glucosamina, 2 moles de ácido gordo 3OH-C14:0 e 1 mole de ácido gordo C12;0. A espectroscopia de massa de bombardeamento atómico rápido (FAB-MS), modo negativo, da amostra em CHCI3:CH30H 1:1 (v/v), 84 804 ΕΡ 0 729 473/ΡΤ 21

concentração de 1 mg/ml. Usou-se um espectrómetro de massa VG ZAB-2SE regulado a Vacc de 8 kV para produzir um espectro a 30 kV e uma corrente de emissão de 1 μΑ. Calibra-se o espectrómetro usando césio-iodo. 0 espectro de FAB-MS é fornecido na Figura 1.0 dissacárido A apresenta um pico molecular a 1 133,55 unidades de massa (massa calculada 1133,3). Outros picos sugerem uma fragmentação do produto durante a análise. 0 pico a 1053,5 representa a perda de um grupo fosfato e a 951,3 a perda do ácido gordo C12. O espectro de FAB-MS do dissacárido B é fornecido na Figura 2 e mostra um pico molecular a 1161,8 unidades de massa (calculado 1161,3). O pico a 1183,8 unidades de massa representa a adição de sódio. O pico a 951,6 representa a perda de um ácido gordo C14. O pico a 973,6 unidades de massa representa o fragmento do pico 951,6 com um ião de sódio. 0 espectro de H-RMN (Bruker 360 MHz) do dissacárido A (sal de sódio em D20) é fornecido na Figura 3 e o seu espectro de 13C-RMN (Bruker 90 MHz) é fornecido nas figuras 4 e 5 (escala alargada).

As fórmulas estruturais dos seguintes dissacáridos de β-D-glucosamina-(1 -6)-a-D-glucosamina: * Dissacárido A (di-hidrogenofosfato de 2-desoxi-6-0-[2-desoxi-2-[(R)-3-dodecanoiloxitetradecanoilamino]4-0-fosfono-p-D-glucopiranosil]-2-[(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]-a-D-glucopiranosilo); * Dissacárido B (di-hidrogenofosfato de 2-desoxi-6-0-[2-desoxi-2-[(R)-3- tetradecanoiloxitetradecanoilamino]-4-0-fosfono-p-D-glucopiranosil]-2-[(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]-a-D-glucopiranosilo); * Dissacárido C (di-hidrogenofosfato de 2-desoxi-6-0-[2-desoxi-2-[(R)-3- dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-0-fosfono-p-D-glucopiranosil]-2-[(R)-3-dodecanoiloxitetradecanoilamino]-a-D-glucopiranosilo); * Dissacárido D (di-hidrogenofosfato de 2-desoxi-6-0-[2-desoxi-2-[(R)-3- hidroxitetradecanoilamino]-4-0-fosfono-3-D-glucopiranosil]-2-[(R)-3-dodecanoiloxitetradecanoilamino]-a-D-glucopiranosilo); são a seguir divulgadas.

ο

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Endotoxicidade e actividade biológica de dissacáridos em conformidade com o invento

Determinou-se a endotoxicidade e a actividade biológica do dissacárido A (exemplo 1) e do dissacárido B (exemplo 2) e compararam-se com as de lipopolissacárido originário de Escherichia co/i 0111:B4 (Sigma, Produto N° L3024), de lípido A (Sigma, Produto N° L5399; usado como matéria prima no exemplo 4), e de lípido A desacilado em 3-0 originário de lípido A de Escherichia coli F583 (preparado como no exemplo comparativo), mas sem purificação por HPLC. 1. Endotoxicidade

Determinou-se a endotoxicidade no teste de lisado de amebócito de Limulus (LAL). Este teste baseia-se na observação de que as endotoxinas induzem a coagulação da hemolinfa de Limulus polyphemus.

No teste de gelificação, misturaram-se diluições em série do composto a testar com LAL 1:1 (v/v) (Haemachem Inc., LAL de sensibilidade 0,06 unidades de endotoxina/ml) e incubou-se a mistura durante uma hora a 37°C. Depois, monitorizou-se a formação de gel medindo a densidade óptica a 405 nm. Determinou-se a última diluição que formou um gel invertendo a placa de microtitulação da reacção. Determinou-se a actividade de endotoxina nas amostras por comparação com diluições de um padrão de lipopolissacárido (1 unidade de endotoxina= 0,1 ng de LPS).

Mediu-se também a endotoxicidade no teste cromogénico, no qual se mediu a activação de uma protease em LAL por LPS usando um cromogénio (Ac-lle-Glu-Ala-Arg-pNA; Bio Whittaker Kit N° 50-650U). Avaliou-se a formação de cor (libertação de pNA (p-nitroanilina)) a 405 nm.

Incubaram-se previamente a 37°C durante 10 minutos as amostras e posteriormente adicionou-se LAL compreendendo cromogénio. Mediu-se o tempo necessário para atingir uma densidade óptica de 0,2 a 405 nm. Calculou-se a actividade da endotoxina comparativamente a uma curva de referência obtida para padrões de LPS.

Os resultados encontram-se expressos no Quadro 3 em ng de LPS por ng de produto.

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Quadro 3

Actividade endotóxica em LAL(ng/ng)

Tipo de teste E coli de LPS'’ Lípido A Lípido A desacilado em 3-0 Dissacárido A Dissacárido B Dissacárido A de monofosforilo Gelificação 0,910,4 (n = 6) 0,6±0,3 (n = 3) 1,0=0,1 (n = 2) 0,003±0,002 (π = 12) 0,004±0,002 In = 7) 0,003110.0013 (n = 10) Cromogénio 0,70 (n = 1) 0,7±0,3 (n = 3) 1,70±0,95 (n = 3) 0,0014+0.0013 (n = 9) 0,0008±0,0006 (n = 7) 0,001610,0009 (n = 10) ! Actividade endotóxica de LPS em LAL= 1 ng/ng, os dados experimentais estão na gama de 0,3-3 ng/ng.

Deste modo, o Quadro 3 mostra que os dissacáridos A e B em conformidade com o invento apresentam a menor endotoxicidade, em particular no que diz respeito ao lípido A desacilado em 3-0 em conformidade com US-A-4 912 094. 2. Actividade biológica in vitro induzida em macrófagos de ratinhos C57BL/6

Recolheu-se medula óssea da anca, do fémur e da tíbia de ratinhos C57BL/6, machos, de seis semanas de idade. Após a homogeneização da suspensão de medula em meio modificado por Dulbecco e centrifugação, fez-se novamente a suspensão da pelete em meio modificado por Dulbecco e fez-se uma cultura das células a uma concentração de 4x105 células por ml no mesmo meio suplementado com 30% de sobrenadante de fibroblastos L-929 (uma fonte comum para factor 1 estimulante de colónias [CSF-1]) e 20% de soro de cavalo.

Após 7 dias, recolheram-se os macrófagos maduros e fez-se novamente uma suspensão em meio modificado por Dulbecco compreendendo 5% de soro de vitelo fetal até uma concentração de 7χ106 células por mililitro. Misturou-se a 1:1 (v/v) esta suspensão de células com amostras diluídas no mesmo meio e usou-se nos testes biológicos realizados em placas de microtitulação com 70000 células/poço (incubação a 37°C durante 22 horas, 100% de humidade e 8% de C02).

Produção de óxido nítrico (IMO) O óxido nítrico (NO) é produzido por macrófagos em resposta a infecções bacterianas e em particular a LPS. O NO parece possuir propriedades citostáticas e citotóxicas. O NO é extremamente reactivo e rapidamente

84 804 ΕΡ 0 729 473/ΡΤ 25 convertido por oxidação, em nitrito e nitrato.

Determinou-se a formação de nitrito usando o teste de Griess (adição de cloridrato de N-(1-naftil)etilenodiamina [1 g/l em água] e p-aminobenzenossulfonamida [10 g/l em H3P04a 5%], 1:1 (v/v)). Calculou-se a concentração de nitrito nos sobrenadantes de macrófagos activados, por comparação com padrões de NaN02.

Os resultados são divulgados no Quadro 4.

Quadro 4

Produção de NO nos sobrenadantes de macrófagos estimulados por LPS e produtos derivados.

Produto Actividade máxima *’ Actividade mínima -i 50% de actividade *' Actividade de NO a 50% em nmol N02/ml Número de análises LPS de E. coli 100 0,0004 0,01 7 n = 6 Lípido A 50 0,005 0,07 5 n = 7 Lípido A desacilado em 3-0 50 0,005 0,16 5 n = 3 Dissacárido A 50 0,016 0,16 5 n = 6 Dissacárido B 16 0,0005 0,05 5 n = 1 Dissacárido A de monofosforilo 50 5 8 4 n = 1 '! Concentração de produto expressa como _ug/ml, correspondendo a actividade de NO induzida. Concentração em NOz/ml extrapolada a partir da curva de diluições em série. 0 LPS induz a produção de NO mais elevada. O lípido A, o lípido A desacilado em 3-0, o dissacárido A e o dissacárido B induzem produção de NO da mesma ordem.

Deste modo, os dissacáridos A e B induzem a produção de NO em macrófagos tão fortemente quanto o lípido A e o lípido A desacilado em 3-0.

Produção de interleucina-1a (IL-1a) A IL-1a é produzida por várias células incluindo macrófagos quando estimuladas por LPS. Algumas actividades de IL-1a descritas incluem a activação de células T, indução de expressão de receptores de IL-2 e de expressão de genes de citóquinas em células T, co-estimulação de proliferação

84 804 ΕΡ 0 729 473/ΡΤ 26 de células Β e secreção de Ig, e aumento de activação induzida por IL-2 e IFN de citotoxicidade mediada por NK, indução de síntese de proteínas em fase aguda e indução de febre.

Avaliou-se a concentração de IL-1a nos sobrenadantes de macrófagos por um teste ELISA (estojo GENZYME, lntertest-1a (marca registada)).

Os resultados estão resumidos no Quadro 5.

Quadro 5

Produção de IL-1a nos sobrenadantes de macrófagos estimulados por LPS e produtos derivados.

Produto Maior concentração testada Concentração 500 pg/ml Actividade mínima detectada Concentração [pg/ml] IL-1 cx [pg/ml] IL-1a [pg/ml] Concentração [.ug/ml] IL-1a [pg/ml] Branco = TEA a 0,1 % 500 <15 *> <15 ·' <15 '' LPS de E. coli 1600 295±129 170”’ 1,56 18±4 Lípido A 500 53±35 53±35 50 1718 Lípido A desacilado em 3-0 500 56±19 56±19 160 2116 Dissacárido A 500 75±45 75145 16 19111 0 limite de detecção do teste é na ordem de 15 pg/ml.

Concentração de IL-1a extrapolada a partir da curva de diluições em série. Não foi possível determinar a produção máxima de IL-1a, uma vez que a produção ainda estava a aumentar na maior concentração usada. A indução de produção de IL-1cc a uma concentração de 500 pg/ml não é significativamente diferente para o lípido A, para o lípido A desacilado em 3-0 e para o dissacárido A. 0 LPS induz mais fortemente a produção de IL-1a. A produção de IL-1a pelo dissacárido A é pelo menos tão forte como pelo lípido A e pelo lípido A desacilado em 3-0.

Produção de interleucina-6 (IL-6) 0 IL-6 é produzido por monócitos ou macrófagos, linfócitos T e B activados. O IL-6 induz, entre outras, a proliferação de certos tipos de células, inibição de crescimento de certas linhas de células de melanoma, diferenciação 84 804 ΕΡ 0 729 473/ΡΤ 27

de linfócitos Β e estimulação de secreção de IgG, diferenciação de células T citotóxicas e uma fraca actividade antiviral.

Determinou-se a concentração de IL-6 nos sobrenadantes de macrófagos por um teste de ELISA (Estojo ENDOGEN, EM-IL-6).

Os resultados estão resumidos no Quadro 6.

Quadro 6

Produção de IL-6 nos sobrenadantes de macrófagos estimulados por LPS e produtos derivados.

Produto Actividade máxima Actividade mínima 50% de actividade Concentração [pg/ml] IL-6 [pg/ml] Concentração [pg/ml] IL-6 [pg/ml] Concentração [pg/ml] IL-6 [pg/ml] Branco = TEA a 0,1 % 500 1150±80 0 710±240 LPS de E. cofi 25 13860±2750 0,006 2400±960 0,3 6950 Lípido A 160 a 0,016'' 3000 a 2200*’ 0,016 2460150 ND"’ ND"’ Lípido A desacilado em 3-0 160 a 0,01 6*» 2850 a 2200*' 0,016 24101160 ND"1 ND”’ Dissacárido A 50 5700±2650 0,016 8501350 1 2850 ’’ A actividade induzida é relativamente constante na gama testada e não apresenta um máximo. ND= não determinado. A actividade induzida pela concentração mais fraca de produto testado (0.016) é ainda superior a 50% de actividade. A estimulação de secreção de IL-6 pelo dissacárido A é significativamente menor do que pelo LSP. No entanto, o dissacárido A induz mais fortemente a produção de IL-6 em macrófagos do que o lípido A e o lípido A desacilado em 3-0.

Produção de factor alfa de necrose tumoral (TNF-a) 0 TNF-a é principalmente produzido por macrófagos e monócitos estimulados por LPS. As actividades induzidas por TNF-α são inter alia uma actividade antiviral, citólise e citóstase de certos tipos de células, crescimento de certas linhas celulares, expressão de antigénios tais como complexos de histocompatibilidade maior de classes I e II, necrose de sarcoma induzido por metilcolantreno, activação de leucócitos polimorfonucleares (PMN), activação de osteoclasto e reabsorção óssea. O TNF-α é também um mediador principal

84 804 ΕΡ 0 729 473/ΡΤ 28 no choque tóxico e na sépsia.

Determinou-se a concentração do TNF-α nos sobrenadantes de macrófagos por um teste de ELISA (estojo GENZYME, teste de factor mTNF-a).

Os resultados estão apresentados no Quadro 7.

Quadro 7

Produção de TNF-α nos sobrenadantes de macrófagos por LPS e produtos derivados.

Produto Maior concentração testada Concentração 500 pg/ml Actividade mínima detectada Concentração [pg/ml] TNF-a [pg/ml] TNF-a [pg/ml] Concentração [pg/ml] TNF-a [pg/ml] Branco = TEA a 0,1 % 500 138±9 1 38±9 0 <100 · LPS de E. coli 100 a 6,25 257 a 284 130'"1 0,006 175±55 Lípido A 500 223±64 223±64 0,016 118±9 Lípido A desacilado em 3-0 500 311±72 311±72 0,016 115±6 Dissacárido A 500 530+139 530+139 0,16 159±43 '! 0 limite de detecção do teste é da ordem de 100 pg/ml. A concentração de TNF-α é relativamente constante entre 100 e 6,25 pg/ml de LPS, e diminui para concentrações superiores a 200 ug/ml. "Ί A concentração de TNF-α é extrapolada a partir da curva de diluições em série. Não foi possível determinar a produção máxima de TNF-α, uma vez que a produção ainda estava a aumentar na maior concentração usada.

Ao contrário dos outros testes, a produção de TNF-α induzida por LPS foi menor do que pelo dissacárido A. O dissacárido A induziu o TNF-α igual ou mais fortemente do que o lípido A ou o lípido A desacilado em 3-0.

Produção de Prostaglandina E2 (PGE2)

Os PGE1 e PGE2 são os principais metabolitos de ácido araquidónico sintetizado por macrófagos estimulados por LPS, TNF-α, ou IL-1. Os PGE exibem actividades imunomoduladoras em linfócitos T e B. Parecem induzir uma estimulação dos Th2 e uma inibição de subpopulações Th1 de linfócitos T e um desvio no isótipo de imunoglobulinas. 29 84 804 ΕΡ 0 729 473/ΡΤ

Mediu-se a concentração de PGE2 nos sobrenadantes de macrófagos por um teste de RIA (estojo PAESEL + LOREI, estojo de RIA 36-104-6001 prostaglandina E2 3H).

Os resultados são resumidos no Quadro 8

Quadro 8

Produção de PGE2 nos sobrenadantes de macrófagos estimulados por LPS e produtos derivados.

Produto Maior concentração que induz uma actividade Menor concentração que induz uma actividade Concentração [pg/ml] PGE2 [pg/ml] Concentração [pg/ml] PGE2 [pg/ml] Branco = TEA a 0,1% 500 < 80*' < 80 ’> LPS de E. coli 1600 1120±135 6,25 153±29 Lípido A 500 < 80'1 ... < 80 *' Lípido A desacilado em 3-0 500 240±25 500 240±25 Dissacárido A 500 540±65 16 80±41 '' 0 limite de detecção do teste é da ordem de 80 pg/ml. Não foi possível determinar a produção máxima de PGE2, uma vez que na maior concentração usada a produção ainda estava a aumentar. A estimulação da produção de PGE2 pelo dissacárido A é significativamente menor do que para o LPS. No entanto, o dissacárido A foi mais activo do que o lípido A e o lípido A desacilado em 3-0. O lípido A não induziu a produção de PGE2 e o lípido A desacilado em 3-0 apenas induziu na maior concentração usada.

Conclusão

Os dissacáridos em conformidade com o invento são activos in vitro e induzem a produção de NO, IL-1a, IL-6, TNF-α e PGE2. Os dissacáridos em conformidade com o invento são tão activos, ou mesmo mais activos, do que o lípido A e o lípido A desacilado em 3-0, mas exibem uma endotoxicidade significativamente menor, tal como se determina pelo teste de LAL. A menor actividade do lípido A e do lípido A desacilado em 3-0 pode dever-se a diferenças de pureza. Os dissacáridos A e B são purificados por HPLC, o lípido A é uma preparação biológica comercial (Sigma L-5399) e o lípido A desacilado em 3-0 é preparado em conformidade com US-A-4 912 054, partindo da

84 804 ΕΡ 0 729 473/ΡΤ 30 preparação comercial de lípido A. O único produto com maior actividade é o LPS que na generalidade induziu uma maior resposta e necessitou de uma menor concentração para induzir um sinal significativo. 3. Actividade biológica in vivo

Investigou-se a actividade biológica in vivo de dissacárido A para a actividade antitumoral contra carcinomatose peritoneal induzida em ratos BDIX. Injectaram-se intraperitonealmente em ratos, células Pro b {106 células por rato) obtidas em conformidade com o método de Martin (Martin, F. et a/., International Journal of Câncer, Volume 32, páginas 623-627 [1983]). Após 10 dias, aparecem numerosos nódulos sólidos no mesentério nos locais leitosos e progressivamente invadem a cavidade peritoneal (ver Lagadec, P. et aí., Invasion and Metastasis, Volume 7, páginas 83-95 [1987]). Após 4-5 semanas apareceu ascite hemorrágica e todos os ratos morreram em 8-12 semanas.

Começou-se a imunoterapia 14 dias após a injecção das células tumorais Pro b. O tratamento consistiu em injecções intraperitoneais de dissacárido A; doses de 0,1, 0,3 e 0,8 mg/kg de peso corporal. Dissolveu-se dissacárido A numa solução aquosa de NaCI a 0,9% e trietilamina a 0,1%. Os ratos receberam cinco injecções, uma cada 3,5 dias. Injectou-se um grupo de controlo com a solução aquosa. Ambos os grupos compreendiam 10 ratos.

Seis semanas após a injecção das células tumorais efectuou-se a autópsia. Avaliou-se em ocultação a extensão da carcinomatose peritoneal e classificaram-se os ratos por ordem crescente de carcinomatose.

As classificações dos tamanhos dos nódulos são as seguintes:

Classe 0: nenhum nódulo de tumor visível;

Classe 1: alguns nódulos de tamanho inferior a 0,2 cm;

Classe 2: demasiados nódulos para serem contados, de tamanho até 0,5 cm; Classe 3: tumores de tamanho até 1 cm;

Classe 4: cavidade tumoral totalmente invadida por tumores, tamanho com alguns cm.

Os resultados são revistos no Quadro 9.

84 804 ΕΡ 0 729 473/ΡΤ 31

Quadro 9

Actividade antitumoral in vivo de dissacárido A em carcinomatose peritoneal.

Dissacárido Número de ratos com Efeito de Volume de ascite Efeito de A carcinomatose de classe: produto [ml/rato] produto (dose) 0 1 2 3 4 (1) Limites Média (2) 0 mg/kg 0 1 1 2 6 0-64 40±24 0,1 mg/kg 0 2 0 4 4 NS 0-18 7±7 p<0,001 0,3 mg/kg 2 3 2 2 1 p<0,01 0-20 2±6 p<0,001 0,8 mg/kg 1 6 1 1 1 p<0,01 0-2 0±1 p<0,001

Calculou-se a significância estatística da actividade antitumoral pelo teste de Kruskal-Wallis (1) ou (2) usando análise de variância.

Obviamente, o dissacárido A possui um efeito antitumoral dependente da dose. 4. Toxicidade aguda

Injectou-se dissacárido A na veia da cauda de ratinhos NMRI (6-7 semanas de idade), fêmeas e machos. Uma dose até 100 mg/kg de peso corporal não induziu qualquer morte.

Exemplo 7 A matéria prima é lipopolissacárido de Pseudomonas aeruginosa (Sigma, Produto N° L7018). A estrutura do Lípido A é já conhecida (ver Kulshin et ai em Eur. J. Biochem. 198 (1991) 697-704). Ao contrário do lípido A de E. coli, a espécie predominante contém resíduos de aciloxiacilo em ambos os grupos amino do esqueleto de difosfato de diglucosamina. Adicionalmente, existe um ácido 3-hidroxidecanóico na posição 3', mas o mesmo resíduo gordo-acilo está presente apenas na posição 3 numa fracção menor. A remoção deste resíduo gordo-acilo na posição 3' conduziria a um análogo do dissacárido C. A posterior hidrólise conduziria a perda do resíduo gordo-acilo esterificado no grupo aciloxiacilo ou na posição 2 ou 2'. Estas estruturas são análogas aos dissacáridos C e D.

Dissolveu-se lipopolissacárido de Ps. Aeruginosa (Sigma L7018) em acetato de sódio 0,1 M, pH 4,0, a 5 mg/ml e aqueceu-se durante 120 minutos Λ

84 804 ΕΡ Ο 729 473/ΡΤ 32 a 100°C. Após arrefecimento, adicionaram-se 0,5 volumes de propan-2-ol seguidos de fosfato de tetrabutilamónio (TBAP) até 25 mM de concentração final. Adicionou-se trietilamina (TEA) até pH 9,0 (aproximadamente, papeis de pH). Aplicou-se a mistura numa Sep-Pak C18 (Waters) com reciclagem (10 passagens). Lavou-se a Sep-Pak com 10 ml de TBAP 5 mM em acetonitrilo:H20 a 1:1 (v/v) seguido de 10 ml de acetonitrilo. Eluíram-se as substâncias adsorvidas com 4 ml de clorofórmio: metanol a 2:1 (v/v).

Purificaram-se os dois picos principais, PsA1 e PsA2 (figura 6), por HPLC e analisaram-se os ácidos gordos. A composição do ácido gordo corresponde às moléculas descritas por Kulshin et al. (quadro em baixo). O PsA1 é menos hidrófobo do que o PsA2 uma vez que elui da coluna com um menor tempo de retenção (Rt). Tal corresponde à molécula com dois resíduos de ácido 20H-C12:0. O PsA2 tem o 20H-C12:0 e o C12.0.

Pico Ácido gordo identificado PsA1 30H-C10:0 20H-C12:0 30H-C12:0 PsA2 30H-C10:0 C12:0 20H-C12:0 30H-C12:0

Removeu-se o solvente por evaporação rotativa e dissolveu-se novamente o resíduo em TEA a 0,2% em água.

Adicionou-se hidróxido de sódio à solução de lípido A de Ps. aeruginosa até uma concentração de 0,2 M e incubou-se a solução à temperatura ambiente durante 60 minutos. Neutralizou-se então a solução com ácido ortofosfórico (8,5%). Aplicou-se depois num sistema de HPLC de fase inversa {HP1050 com uma coluna de fase inversa de 3 pm, Supelco LC18, com pré-coluna) equilibrada em 75% de solvente A (TBAP 5 mM em acetonitrilo:água a 1:1 (v/v)), 25% de solvente B (TBAP 5 mM em propan-2-ol:água a 9:1 (v/v)) e eluída com um gradiente de 2% de solvente B/min a 100% de B. Detectaram-se os picos por absorção a 210 nm. Recolheram-se os picos

84 804 ΕΡ 0 729 473/ΡΤ principais (ver figura 7). Diluíram-se esses picos com 2 volumes de água e aplicaram-se em cartuchos Sep-Pak C18 equilibrados em solvente A. Lavaram-se as Sep-Pak com 10 ml de cloreto de sódio a 0,45% em propan-2-ol:H20 a 1:3 (v/v), 10 ml de água e 10 ml de acetonitrilo. Eluíram-se as substâncias adsorvidas com 4 ml de clorofórmio: metanol a 2:1 (v/v) e removeram-se os solventes em azoto. Dissolveram-se novamente as fracções em 100 μΙ de água.

Analisou-se o teor de gordo-acilo das fracções por cromatografia gasosa após hidrólise com HCI 4M, 100°C, 4 h. Converteram-se os ácidos gordos libertados nos ésteres de metilo em conformidade com Miller (Miller, L. Gas Chromatography application note 228-37 [Hewlett Packard]) e analisaram-se num cromatograma gasoso Hewlett-Packard 5890 com uma coluna de sílica fundida (Supelco 2-4026) com referência a ésteres de metilo de ácido gordo padrão (Supelco).

Após a hidrólise do extracto de lípido A, observam-se muitos picos em HPLC de fase inversa. Recolheram-se os picos principais (PsAOHI, 2, 4 e 6) da HPLC. Os ácidos gordos identificados em cada fracção são apresentados em baixo.

Pico Ácido gordo identificado PsAOHI 30H-C1 2:0 20H-C12:0 PsAOH2 30H-C1 2:0 20H-C1 2:0 PsAOH4 30H-C1 2:0 C1 2:0 PsAOH6 30H-C1 2:0 20H-C1 2:0 C1 2:0

As fórmulas estruturais desses dissacáridos são as seguintes: *

PsAOHI: Di-hidrogenofosfato de 2-desoxi-6-0-[2-desoxi-2-[(R)-3-[(S)-2-hidroxidodecanoiloxi]dodecanoilamino]-4-0-fosfono-P-D-glucopiranosil]-2- 84 804 ΕΡ Ο 729 473/ΡΤ 34

[(R)-3-hidroxidodecanoilamino]-a-D-glucopiranosilo; * PsAOH2: Di-hidrogenofosfato de 2-desoxi-6-0-[2-desoxi-2-[(R)-3- hidroxidodecanoilamino]-4-0-fosfono-p-D-glucopiranosil]-2-[(R)-3-[(S)-2-hidroxidodecanoiloxi]dodecanoilamino]-a-D-glucopiranosilo; * PsAOH4: Di-hidrogenofosfato de 2-desoxi-6-0-[2-desoxi-2-[(R)-3-dodeca-noiloxidodecanoilamino]-4-0-fosfono-p-D-glucopiranosil]-2-[(R)-3-hidroxidodecanoilamino]-a-D-glucopiranosilo; * PsAOH6: Di-hidrogenofosfato de 2-desoxi-6-0-[2-desoxi-2-[(R)-3-dodeca-noiloxidodecanoilamino]-4-0-fosfono-p-D-glucopiranosil]-2-[(R)-3-[{S)-2-hidro-xidodecanoiloxi]dodecanoilamino]-a-D-glucopiranosilo; apresentam-se seguidamente.

Dissacárido E (PsAOHD

OH

Troa o

OH /

84 804 ΕΡ 0 729 473/ΡΤ 36

Dissacárido Η (PsAOH6)

Ο

Analisaram-se as fracções também por espectrometria de massa de electrovaporização (ES-MS) no modo negativo. Usou-se um instrumento VG Biotech BIO-Q com um analisador de triplo quadrupolo. Diluíram-se 2 a 4 μΙ de cada amostra em 10 μΙ de acetonitrilo: água: solução de amónia a 25%, 50:50:1 (v/v). Depois, injectaram-se 10 μΙ directamente na fonte do espectrómetro de massa. Usou-se como eluente acetonitrilo: água: solução de amónia a 25%, 50:50:1 (v/v), a 7 μΙ/min. Para a análise da fragmentação dos iões principais, submeteram-se os iões progenitores do primeiro quadrupolo a decomposição activada por colisão no segundo quadrupolo usando árgon como gás de colisão. Detectaram-se os iões "filhos" no terceiro quadrupolo. A massa calculada para cada um dos picos e a massa observada por ES-MS são apresentadas em baixo.

84 804 ΕΡ Ο 729 473/ΡΤ 37

Pico Massa calculada Massa observada PsAOHI 1093,5 1093,4 PsAOH2 1093,5 1093,1 PsAOH4 1077,5 1077,0 PsAOH6 1275,8 1275,7

Existe uma correspondência muito boa em cada caso.

No caso do PsAOHI e do PsAOH2 as massa são idênticas. Isto indica que estes representam duas isoformas da molécula, sabe-se que os lípidos A fragmentam em determinadas condições analíticas em espectrometria de massa (Kulshin, 1991; and Cotter et a!., Biomed. Encl. Mass Spectrom. 14 (1987), 591-598). Com uma adição de 102 unidades de massa produzem-se iões que representam a metade não redutora da molécula. Assim, com dois MS em série, pode-se fragmentar o ião primário no primeiro MS e detectar os iões "filhos" no segundo MS. Isto elimina a possibilidade dos iões secundários observados serem contaminantes; estes têm de resultar do ião original por fragmentação. A massa dos iões "filhos" esperada para cada fracção e as massas observadas em MS-MS são seguidamente apresentadas.

Pico Massa calculada de fragmento Massa observada de fragmento PsAOHI 558,5 ou 756,8 756,1 PsAOH2 558,5 ou 756,8 557,7 PsAOH4 558,5 ou 740,8 739,9 PsAOH6 558,5 ou 740,8 740,1

Estas observações identificam claramente as estruturas dos dissacáridos E, F, G, e H.

Para comparação interna, analisou-se o dissacárido A também por ES-MS. A massa calculada foi de 768,9 e a massa observada do fragmento foi de 768.

Testou-se a actividade biológica das fracções por estimulação de produção de nitrito em macrófagos peritoneais de murino, como se descreveu acima.

Determinou-se a quantidade de cada análogo na solução de reserva a 38 84 804 ΕΡ 0 729 473/ΡΤ partir da absorção em HPLC relativamente à do dissacárido A. As fracções apresentam actividades da mesma ordem que o dissacárido A (figura 8). O dissacárido H, que tem dois grupos aciloxiacilo e mais nenhum outro resíduo de gordo-acilo, é o mais activo. A posição do aciloxiacilo, 2 versus 2', tem apenas uma influência menor na actividade.

Para eliminar a possibilidade da actividade se dever a contaminação das amostras por outras substâncias tais como LPS, purificaram-se novamente os dissacáridos E, F, G e H em HPLC de fase inversa e recolheram-se também as regiões da linha de base da HPLC imediatamente antes e depois do pico e trataram-se do mesmo modo que as fracções que continham os picos de material. Testou-se a actividade das fracções do pico e as fracções da linha de base. Os picos que continham o dissacárido E, F, G e H apresentaram actividade semelhante à observada no primeiro ensaio. As amostras de branco, representando as regiões do perfil de HPLC imediatamente antes e depois do pico de análogo de lípido A, eram inactivas. A estimulação de produção de nitrito está assim associada especificamente aos análogos de lípido A.

Determinou-se a endotoxicidade dos dissacáridos E, F e G usando o teste cromatogénico de LAL (ver infra). No entanto, em vez de usar 1 mg/ml de albumina de soro bovino, usaram-se 0,1 mg/ml. Os resultados (n= 4 ou 6) foram obtidos em duas séries de experiências e são seguidamente apresentados.

Amostra

Actividade endotóxica em LAL (mg/mg) LPS de E. coli Lípido A de E. coli

Dissacárido E Dissacárido F Dissacárido G Dissacárido H

0,58±0,14 0,32±0,06 0,000005±0,000002 0,000025±0,000026 0,00006±0,00003 0,000003±0,000002

Por OM Pharma e

DEUTSCHE OM ARZNEIMITTEL GmbH

i

Claims (32)

1. 84 804 ΕΡ 0 729 473/ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Dissacárido de glucosamina β(1->·6) possuindo a fórmula geral

   R2 onde R1 é um grupo hidroxilo, um grupo di-hidroxifosfonoiloxi ou as suas formas com carga, um grupo aciloxi CrC5, um grupo alquiloxi CrC5, ou um grupo X; R2 e R2. são cada um, um grupo acilo ou um grupo Y com a condição de que pelo menos R2ou R2, é o grupo Y; R3 e R3. são cada um, hidrogénio, um grupo alquilo C,^, ou um grupo acilo C-i-C3; R4 é hidrogénio, um grupo alquilo C^Cg, ou um grupo acilo CrC3; R4. é hidrogénio, um grupo acilo C^Cg,· um grupo alquilo C^Cg, ou um grupo dimetoxifosfonoilo, ou um grupo fosfono ou as suas formas com carga; e R6. é hidrogénio, um grupo hidroxilo, um grupo di-hidroxifosfonoiloxi, um grupo hidroxissulfoniloxi, as suas formas com carga; ou

   84 804 ΕΡ 0 729 473/ΡΤ 2/5 um grupo Ζ; onde ο grupo X se selecciona do grupo que compreende um grupo carboxialquiloxi C^-Cg; um grupo -0-CH-[(CH2)mC00H][(CH2)nC00H]; onde m = 0-5 e n = 0-5; um grupo fosfonoalquilo C^Cg; um grupo dimetoxifosfonoiloxi; um grupo hidroxissulfoniloxi, um grupo hidroxissulfonilalquilo CrCs, e as formas com carga do grupo X; onde o grupo Y se selecciona do grupo que compreende um grupo aciloxiacilo, um grupo acilaminoacilo, um grupo aciltioacilo um grupo alquiloxiacilo Cl-C24, um grupo alquilaminoacilo CrC24f um grupo alquiltioacilo C1-C24; e onde o grupo Z se selecciona do grupo que compreende um grupo alquiloxi C.,-C24, um grupo aciloxi C1-C24, ácido 3-desoxi-D-mano-2-octulosónico (KDO); (KD0)n, onde n= 1-10; uma cadeia lateral de polissacárido, tal como uma cadeia lateral originária de lipopolissacárido natural; um componente central, tal como um componente originário de um lipopolissacárido natural; e grupo aminoalquiKCVCgl-carboxilo e seus sais.
2. 2. Dissacárido de acordo com a reivindicação 1, onde o grupo Y compreende um grupo 3-aciloxiacilo, um grupo 3-acilaminoacilo, e um grupo 3-aciltioacilo.
3. 3. Dissacárido de acordo com a reivindicação 1 ou 2, onde o grupo Y é um grupo aciloxiacilo.
4. 4. Dissacárido de acordo com as reivindicações 1-3, onde o grupo acilo é 84 804 ΕΡ Ο 729 473/ΡΤ 3/5

   um resíduo de ácido gordo, um resíduo de 3-hidroxi-ácido gordo, um resíduo de 3-oxo-ácido gordo.
5. 5. Dissacárido de acordo com as reivindicações 1-4, onde o grupo aciloxiacilo, o grupo acilaminoacilo e o grupo aciltioacilo que formam o grupo Y, compreendem porções acilo seleccionadas do grupo compreendendo um resíduo de ácido gordo, um resíduo de 3-hidroxi-ácido gordo, um resíduo de 3-oxo-ácido gordo.
6. 6. Dissacárido de acordo com as reivindicações 3-5, onde o grupo Y é um grupo aciloxiacilo que é um 3-hidroxiacilo c4-c24 ligado a N, de preferência ácido gordo C8-C18-acilo ligado por éster a um acilo CrC20 na posição 3-hidroxi, de preferência ácido gordo C10-C18-acilo.
7. 7. Dissacárido de acordo com a reivindicação 6, onde o grupo aciloxiacilo é o 3-hidroxi-ácido gordo C14-acilo ligado a N, ligado por éster ao ácido gordo C12 na posição 3-hidroxi.
8. 8. Dissacárido de acordo com a reivindicação 6, onde o grupo aciloxiacilo é o 3-hidroxi-ácido gordo C14-acilo ligado a N, ligado por éster ao ácido gordo C14 na posição 3-hidroxi.
9. 9. Dissacárido de acordo com as reivindicações 1-8, onde R2. é o grupo Y.
10. 10. Dissacárido de acordo com as reivindicações 1-8, onde R2 é o grupo Y.
11. 11. Dissacárido de acordo com as reivindicações 1-10, onde o resíduo de 3-hidroxi-ácido gordo é um 3-hidroxi-C4-C24, de preferência um 3-hidroxi-ácido gordo C10-Cl8.
12. 12. Dissacárido de acordo com a reivindicação 11, onde o resíduo de 3-hidroxi-ácido gordo é 3-hidroxi-ácido gordo C14. 3. Dissacárido de acordo com as reivindicações 11 ou 1 2, onde R2 é o resíduo de 3-hidroxi-ácido gordo.

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13. 14. Dissacárido de acordo com as reivindicações 11 ou 12, onde R2. é o resíduo de 3-hidroxi-ácido gordo.
14. 15. Dissacárido de acordo com as reivindicações 1-10, onde R2 e R2. são ambos um grupo Y.
15. 16. Dissacárido de acordo com a reivindicação 15, onde R2 e R2. são ambos um grupo aciloxiacilo compreendendo um 3-hidroxiacilo C4-C24 ligado a N, de preferência ácido gordo C8-C18-acilo, ligado por éster a um acilo na posição 3-hidroxi, tal como a um ácido gordoC10-C18-acilo.
16. 17. Dissacárido de acordo com a reivindicação 16, onde R2 é o 3-hidroxi-ácido gordo C14-acilo ligado a N, ligado por éster a um ácido gordo C16 na posição 3-hidroxi, e onde R2. é o 3-hidroxi-ácido gordo C14-acilo ligado a N, ligado por éster a um ácido gordo C12na posição 3-hidroxi.
17. 18. Dissacárido de acordo com as reivindicações 1-17, onde ^ é um grupo di-hidroxifosfonoiloxi.
18. 19. Dissacárido de acordo com as reivindicações 1-18, onde R4 é hidrogénio.
19. 20. Dissacárido de acordo com as reivindicações 1-19, onde R, está na configuração a.
20. 21. Dissacárido de acordo com as reivindicações 1-20, onde R3 é hidrogénio.
21. 22. Dissacárido de acordo com as reivindicações 1-21, onde R3. é hidrogénio.
22. 23. Dissacárido de acordo com as reivindicações 1-22, onde R6. é um grupo hidroxilo.
23. 24. Dissacárido de acordo com as reivindicações 1-23, onde R4. é um grupo fosfono.
24. 25. Dissacárido de acordo com as reivindicações 1-24, onde o dissacárido está na forma de sal compreendendo um ou mais catiões. 84 804 ΕΡ 0 729 473/ΡΤ 5/5
25. 26. Dissacárido de acordo com a reivindicação 25, onde os catiões são iões de metal alcalino.
26. 27. Método para preparar um dissacárido de acordo com as reivindicações 1-26, compreendendo os passos de: (i) proporcionar uma matéria prima compreendendo uma porção lípido A de microorganismos compreendendo lipopolissacáridos; e (ii) submeter a matéria prima a um tratamento alcalino de modo que a porção lípido A seja desacilada em O na posição 3 e na posição 3'.
27. 28. Método de acordo com a reivindicação 27, onde a matéria prima é seleccionada do grupo que compreende microorganismos compreendendo lipopolissacáridos, bactérias Gram-negativas, uma estrutura de superfície compreendendo uma fracção desses microorganismos e bactérias Gram-negativas, ou um lipopolissacárido desses microorganismos e bactérias Gram-negativas.
28. 29. Método de acordo com as reivindicações 27 ou 28, onde a matéria prima é um lípido A de bactérias Gram-negativas.
29. 30. Método de acordo com as reivindicações 27-29, onde o tratamento alcalino é precedido ou seguido por um tratamento ácido para remover a porção central e a cadeia lateral de polissacárido.
30. 31. Composição farmacêutica compreendendo como ingrediente activo um dissacárido de acordo com as reivindicações 1-26 e um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável.
31. 32. Dissacárido de acordo com as reivindicações 1-26 para utilizar como agente imunomodulador, e/ou agente antitumoral.
32. 33. Dissacárido de acordo com as reivindicações 1-26 para usar como componente de uma vacina. Lisboa, Por OM Pharma e DEUTSCHE OM ARZNEIMITTEL GmbH