KR100780868B1

KR100780868B1 - 항암효과를 나타내는 4급 아미노 글루코사민 화합물

Info

Publication number: KR100780868B1
Application number: KR1020060064389A
Authority: KR
Inventors: 김문무; 김세권; 멘디스 비.이.피.
Original assignee: 부경대학교 산학협력단
Priority date: 2006-07-10
Filing date: 2006-07-10
Publication date: 2007-11-30
Also published as: US7855188B2; WO2008007825A1; US20090176978A1

Abstract

본 발명은 항암효과가 있는 하기 <화학식 1>의 4급 아미노 글루코사민 화합물에 관한 것으로, 이는 투여량 및 시간 의존적 방식으로 아포토시스를 유발시켜 항암효과를 발휘함으로써, 이를 통해 항암 치료 효능을 증진시킬 수 있다.

<화학식 1>

글루코사민, 아포토시스, 흑색종세포

Description

항암효과를 나타내는 4급 아미노 글루코사민 화합물{Quarternized Amino Glucosamine Compound for exerting anticancer effect}

도 1은 Glc 및 QAGlc의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 도이다.

도 2는 여러 가지 암세포에 대한 QAGlc의 시간 및 농도 의존적 세포독성 효과를 나타낸 표이다.

도 3은 B16F1 세포에서 QAGlc에 의해 유도된 시간 의존적 DNA 손상을 나타낸 도이다.

도 4는 B16F1 세포에서 QAGlc에 의해 유도된 농도 의존적 DNA 손상을 나타낸 도이다.

도 5는 QAGlc로 처리한 B16F1 세포에서 p53 유전자 발현을 나타낸 도이다.

도 6은 리포터 유전자 분석을 이용하여 분석한 p53 유전자 발현 유도를 나타낸 그래프이다.

도 7은 리포터 유전자 분석을 이용하여 분석한 p21 유전자 발현 유도를 나타낸 그래프이다.

도 8은 QAGlc로 처리한 B16F1 세포에서 포스포 p53 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸 도이다.

본 발명은 항암효과가 있는 하기 <화학식 1>의 4급 아미노 글루코사민(Quarternized amino glucosamine, QAGlc) 화합물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 투여량 및 시간 의존적 방식으로 아포토시스를 유발시켜 항암효과를 발휘함으로써, 이를 통해 항암 치료 효능을 증진시킬 수 있는 4급 아미노 글루코사민에 관한 것이다.

<화학식 1>

아포토시스는 항암제를 포함한 광범위한 자극에 노출됨에 따른 포유류 세포에서 활성화된 일종의 세포 사멸 메카니즘이다. 아포토시스를 유도한다고 밝혀진 화학치료제로는 에토포사이드(etoposide), 덱사메타존(dexamethasone), 빈크리스틴(vincrestine), 시스플래티늄(cisplatinum), 사이클로포스파미 드(cyclophosphamide), 파클리탁셀(paclitaxel), 5'-플루오로데옥시우리딘(5'=fluorodeoxyuridine), 5'-플루오로우라실(5'-fluorouracil) 및 아드리아미신(adriamycin) 등이 있다. 항암제의 효능은 아포토시스에 의해 이들 항암제에 대항하는 종양 세포의 본질적 성향에 의존하는 듯하다. 이는 아포토시스가 항종양제에서의 주요 메카니즘이 될 수 있다는 점을 시사한다.

아포토시스는 조직화된 일련의 과정으로서, 이를 통해 세포는 그 자체의 사멸을 촉진시키게 된다. 아포토시스의 각 단계는 세포 수축, 염색질 응축, 핵 분열 및 뉴클레오솜내의 DNA 파괴를 포함하여, 아포토시스 소체를 생성시킨다. 아포토시스 유도는 신규한 항암 물질을 스크리닝하고 화학치료 약물의 항암 메카니즘을 연구하기 위한 지표로서 사용되고 있다.

키토산을 가수분해시켜 얻어지는 글루코사민은 몇몇의 생물학적 활성을 발휘하는 것으로 보고된 바 있으며, 최근 들어 몇몇 특이적 활성에 중요한 상이한 관능기를 갖는 글루코사민 유도체를 합성하려고 하는 경향이 있어왔다.

본 발명자들은 게 껍질 유래 키토산을 가수분해시켜 얻은 글루코사민을 이용하여 4급 아미노 글루코사민을 합성하였으며, 이는 암세포주의 분열증식을 분명하게 억제하는 것으로 나타났다. 본 발명자들은 추가의 연구를 수행하여 상기 4급 아미노 글루코사민이 상이한 조건하에서 아포토시스를 유도능이 있음을 시험하여 본 발명에 이르게 되었다.

본 발명의 목적은 4급 아미노 글루코사민 화합물을 제조하고, 이를 통해 아포토시스를 유발시켜 항암효과를 발휘시켜, 항암 치료 효능을 증진시킬 수 있는 항암제를 제공하는데 있다.

이와 같은 목적은 키토산을 가수분해하여 글루코사민을 제조하고, 이를 이용하여 4급 아미노 글루코사민을 제조함으로써 달성되었다.

본 발명은 항암효과가 있는 <하기 화학식 1>의 4급 아미노 글루코사민을 제공한다.

<화학식 1>

본 발명은 또한 상기 <화학식 1>의 4급 아미노 글루코사민을 약제학적 유효성분으로 함유하는 항암제 조성물에 관한 것이다.

상기 항암제 조성물은 산제, 정제, 캡슐제, 분말제, 연고조성물, 용액제, 젤, 페이스트, 첩포제, 과립상으로 제조할 수 있다.

이하, 실시예 및 실험예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 예시한다. 하지만, 이러한 실시예들로 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

4급 아미노 글루코사민의 제조

하기 반응식 1에서와 같이, 키토산을 농축 HCl로 3 시간 동안 산성 가수분해시켜 글루코사민을 제조하고, 생성된 글루코사민 하이드로클로라이드를 100 % 에탄올로 침전시켰다. 글루코사민 하이드로클로라이드를 2,3-에폭시프로필 클로라이드 및 트리-메틸 아민과 반응시켜 4급화시켰다.

<반응식 1>

4급 아미노 글루코사민을 합성하기 위하여, 트리-에틸 아민 용액의 pH를 2.0으로 1차 적정하여 비점을 상승시켰다. 이어서, 등몰비의 에폭시프로필 클로라이드을 적가하고, 1M NaOH 용액을 사용하여 pH를 9로 유지시켰다. 이어서, 글루코사 민을 등몰비로 가하고, 24 시간 동안 교반하여 반응을 진행시켰다. 전체 반응에 걸쳐 pH를 9.0으로 유지하였다. 생성물을 에탄올, 메탄올 및 트리-하이드로플루오라이드를 사용하여 추출해내어, 암갈색 보풀형 고상으로서 4급 아미노 글루코사민을 수득하였다. 신규 합성물의 구조를 원소 분석 및 FT-IR로 확인하였다. 원소 분석 결과를 하기의 표 1에 나타내었고, FT-IR 결과는 도 1에 도시하였다. FT-IR에 의하여 Glc 중의 1,480 cm^-1에서 관찰된 흡수 대역으로부터, 글루코사민의 4급화[N(CH3)3 기 치환)를 확인할 수 있다.

<표 1>

	탄소함량(%)		질소함량(%)		수소함량(%)
	분석값	계산값	분석값	계산값	분석값	계산값
Glc	33.48	33.42	6.61	6.54	6.49	6.51
QAGlc	43.61	43.57	8.19	8.23	8.52	8.47

<실험예 1>

항암효과 시험

대장암세포 (SW480), 폐암세포(A549), 쥐 흑색종 세포(B16F1), 백혈병 암세포 (HL60), 간암세포 (Hep3B)에서 글루코사민 및 4급 아미노 글루코사민의 세포 독성을 평가하기 위하여, 상이한 농도 및 배양 시간 간격으로 MTT 분석을 수행하였다.

마이크로타이터(microtiter) 96-웰 플레이트에서 무장액 매질로 세포를 배양 하고, 시간 간격을 다양화하기 위해 상이한 농도의 시료로 처리하고, MTT 세포 생존력 분석법을 이용하여 항암효과를 분석하였다. 결과를 도 2에 나타내었다. 처리한 지 36 시간 후 QAGlc가 항암효과를 나타내었다. 이러한 항암효과는 농도 의존적이었다.

<실험예 2>

DNA 분획화 분석에 의한 아포토시스 검출

QAGlc의 항암효과 기전을 조사하기 위하여 10 cm 배양 접시에서 배양한 B16F1 세포를 이용하여 상이한 농도의 QAGlc로 전처리하고, 2mM H2O2로 아포토시스를 유도하였다. 이어서, 상이한 시간 동안 배양하였다. 세포를 세정하고, 전체 DNA를 표준 공정으로 추출하였다. DNA를 2% 아가로스 겔상에 전기영동시키고, DNA 분획을 에테듐 브로마이드 염색법에 따라 시각화하였다. 결과를 도 3에 도시하였다.

100 ㎍/mL 농도로 처리한 경우 36 시간 후 DNA 손상이 관찰되었다. 배양 시간의 연장으로(36 시간 이후) 모든 시험 농도에 의한 DNA 손상 효과가 투여량 의존적으로 나타났다.

10 cm 배양 접시에서 배양한 B16F1 세포를 상이한 농도의 QAGlc로 전처리하고, 2mM H2O2로 아포토시스를 유도하였다. 48 시간 동안 배양한 후, 유전자 DNA를 추출하고 2% 아가로스 겔상에 전기영동시켰다. 결과를 도 4에 도시하였다. QAGlc가 투여량 의존적 DNA 손상을 나타내었고, 이는 아포토시스가 유도되었음을 지시한 다. 100 ㎍/mL 농도에서 QAGlc가 보다 큰 DNA 손상을 나타내었다

<실험예 3>

RT-PCR 수행

B16F1 세포를 상이한 농도의 QAGlc로 처리하고, 전체 RNA를 추출하였다. p53, p21 및 G3PDH를 이들의 특정 프라이머로 인코딩하여 p53 및 G3PDH mRNA를 증폭시킨 RT-생성 cDNA를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 생성물은 2% 아가로스 겔상에서 분석하였다, G3PDH의 mRNA가 시료 적재 및 mRNA 집적을 위한 내부 조절인자로서 작용하였다. 결과를 도 5에 나타내었다.

배양한 지 24 시간 및 36 시간 후, QAGlc에 의해 p53 전사가 상향조절되었다. 이러한 효과는 공지된 항암 화합물인 에토포사이드 보다 큰 것이었다.

<실험예 4>

트렌스펙션 및 유전자 리포터 분석

B16F1 세포를 리포펙타민(Invitrogen) 트렌스펙션 방법을 이용하여 p53-kuc, p21-Luc 리포터 벡터 및 β-갈라코시다아제 발현 벡터로 트렌스펙션시켰다. 트렌스펙션시킨 지 24 시간 후, 세포들을 24 웰 플레이트로 계대배양시키고, 상이한 농도의 QAGlc로 처리하였다. 루시페라아제 활성 수치를 공동-트렌스펙션된 β-갈락토시다아제 발현 벡터로 모니터링한 트렌스펙션 효능으로 표준화하였다. 루시페라아제 도입 수준을 촉진되지 않은 세포와 비교한 비율로 측정하였다. 결과를 도 6 에 나타내었다.

QAGlc에 의해 p53 유전자 발현이 투여량 의존적으로 상향 조절되었고, 100 ㎍/mL에서 이러한 효과는 에토포사이드 보다 2 배 큰 것이었다.

상기에 기재한 방법에 따라 p21 유전자를 B16F1 세포에 트렌스펙션시키고, 상대 루시페라아제 활성에 의해 QAGlc 처리 후의 유전자 발현을 측정하였다. 결과를 도 7에 나타내었다.

모든 농도의 QAGlc가 대조구와 비교하여 p21 유전자 발현을 현저하게 등진시켰다.

<실험예 5>

웨스턴 블롯 분석

상이한 시간 간격으로 QAGlc 처리 후, 세포를 얼음위에서 30 분 동안 RIPA 완충액[10 mmol 트리스-HCl(pH 7.4), 1% 데옥시콜레이트, 1% NP40, 150 mmol NaCl, 0.1% SDS, 0.2 mmol 페닐메틸 술포닐 플루오라이드, 1 mg/L 아프로티닌 및 1 mg/L 류펩틴]으로 세정하였다. 분리물을 12000×g에서 15 분 동안 원심분리하여 잔해를 제거하였다. 단백질 시료를 4-20% 노벡스 그래디언트 겔(NOvex gradient gel, Invitrogen, USA)을 이용하여 용해시키고, 니트로셀루로오스 멤브레인상으로 전기이동시키고, 10% 탈지 우유로 차단하였다. 제조자의 지시에 따라 화학형광 ECL 분석 키트(Amersham Pharmacia Biosciences, NJ, USA)를 이용하여 포스포릴화된 p53의 단일 클론 항체(Cat. No., Chemicon, CA, USA)로 포스포르-p53 단백질을 검출하 였다. 이미지마스터 소프트웨어(Amersham Pharmacia Biosciences, NJ, USA)를 이용하여 웨스턴 블롯 대역을 정량화하였다. 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에 도시한 바와 같이 QAGlc 처리가 포스포 p53 단백질 수준을 시간 의존적 방식으로 증가시킴을 알 수 있고, 이는 p53 유전자 발현을 상향조절함을 지시한다.

키토산을 산성 가수분해시켜 제조한 클루코사민을 2,3-에폭시프로필 클로라이드 및 트리-메틸 아민과 반응시켜 4급화시켰다. FT-IR 데이터로부터 1480 cm-1에서의 N(CH₃)₃의 흡수 대역으로 글루코사민이 4급화되었음을 확인시켜주었다.

본 발명자들은 4급 아미노 글루코사민이 투여량 및 시간 의존적 방식으로 쥐 흑색종 세포(B16F1)에서 아포토시스를 유도하여 항암 효과를 발휘한다는 사실을 확인하였다.

B16F1 세포를 상이한 농도의 4급 아미노 글루코사민으로 처리하고, MTT 분석을 이용하여 세포 독성을 평가함으로써 4급 아미노 글루코사민의 항암 효과를 시험하였다. 0.01 % 이하의 농도로 48 시간 배양한 후 항암 효과가 관찰되었다. DNA 분획의 아가로스 겔 전기영동으로 아포토시스가 확인되었고, FACS 분석을 통해 4급 아미노 글루코사민이 아포토시스 세포의 생성을 증가시킴을 확인하였다. RT-PCr 생성물은 시간 의존적 방식으로 QAGlc가 p53 및 p21 유전자의 유발을 통해 아포토시스를 유도한다는 사실을 보여주었다. 이러한 효과는 B16F1 세포를 p53 및 p21의 프로모터 플라스미드로 트렌스펙션시키고, 상이한 농도의 QAGlc로 처리함으로써 확인되었다. 웨스턴 블롯 분석에서 관찰된 포스포르 p53의 유발은 4급 아미노 글루코사민이 p53 의존 경로를 통해 아포토시스를 유도한다는 사실을 확인시켜 주었다.

본 발명의 4급 아미노 글루코사민은 투여량 및 시간 의존적 방식으로 아포토시스를 유발시켜 항암효과를 발휘함으로써, 이를 통해 항암 치료 효능을 증진시킬 수 있어, 의약학적으로 유용한 발명인 것이다.

Claims

항암효과가 있는 하기 화학식 1의 4급 아미노 글루코사민 화합물.

<화학식 1>
제1항의 화합물을 약제학적 유효량으로 함유하는 항암제 조성물.
제2항에 있어서, 산제, 정제, 캡슐제, 분말제, 연고조성물, 용액제, 젤, 페이스트, 첩포제, 과립상을 포함하는 것을 특징으로 하는 항암제 조성물.