BRPI0806318A2 - sacarìdeos modificados - Google Patents

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BRPI0806318A2
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saccharide
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capsular saccharide
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BRPI0806318-4A
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Angela Bardotti
Paolo Costantino
Francesco Berti
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Novartis Ag
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Abstract

SACARìDEOS MODIFICADOS. Sacarídeos capsulares modificados compreendendo um grupo bloqueador em uma posição de grupo hidroxila em pelo menos uma das unidades de monossacarídeo do sacarídeo capsular nativo correspondente, em que o grupo bloqueador tem a fórmula (Ia) ou (Ib): -OX-Y (Ia) ou -O-R^ 1^ (Ib) em qu X é C(O), S(O) ou SO~ 2~; Y é NR^ 1^R^ 2^ ou R^ 3^; R^ 1^ é C~ 1-6~ alquila subsitituída com 1, 2 ou 3 grupos independentemente selecionados de hidroxila, sulfidrila e amina; R^ 2^ é H ou C~ 1-6~ alquila; e R^ 3^ é C~ 1-6~ alquila; processos para modificar um sacarídeo capsular com os grupos bloqLieadores; conjugados de proteína sacarídea compreendendo o sacarídeo. capsular modificado; processos para fazer os conjugados de proteína sacarídea, composições farmacêuticas compreendendo os sacarídeos capsulares modificados e/ou conjugados de proteína sacarídea; e métodos e usos dos mesmos.

Description

SACARÍDEOS MODIFICADOS
Todos os documentos mencionados aqui são incorporados por referência em sua totalidade.
CAMPO TÉCNICO
Esta invenção está no campo de química de polissacarídeo e relaciona-se aos sacarídeos modificados, processos para sua preparação, e derivados conjugados. Em particular, a invenção relaciona-se aos sacarídeos modificados tendo estabilidade melhorada em água.
TÉCNICA DE FUNDAMENTO
Os polissacarídeos são moléculas biológicas importantes e foram amplamente utilizados na indústria farmacêutica para a prevenção e tratamento de doenças. Por exemplo, os polissacarídeos capsulares foram usados por muitos anos em vacinas contra bactérias capsuladas, tais como meningococo (Neisseria meningitidis) , pneumococo (Streptococcus pneumoniae) e Hib (Hemophilus influenzae tipo B).
Para melhorar a imunogenicidade destes polissacarídeos, particularmente em crianças, as vacinas conjugadas foram desenvolvidas. Estas compreendem um polissacarídeo capsular conjugado a uma proteína carreadora [por exemplo, referências 1, 2, 3] . A conjugação pode fazer antígenos T- independentes em antígenos T-dependentes.
Um problema com muitos tipos de polissacarídeo é a baixa estabilidade em água. A estabilidade de polissacarídeos em água pode depender da natureza das ligações 0-glicosídicas unindo as unidades de sacarídeo. A baixa estabilidade em água é um resultado das ligações 0- glicosídicas sendo prontamente hidrolisadas na presença de ácidos ou glicosidases. O polissacarídeo capsular de meningococo de sorogrupo A é um exemplo de um polissacarídeo tendo baixa estabilidade em água.
A estabilidade de polissacarídeos é um problema particular na fabricação de vacinas conjugadas. A fim de preparar um conjugado de polissacarídeo-proteína, é necessário manipular grupos quimicamente funcionais no polissacarídeo de modo que o polissacarídeo possa ser ligado a uma proteína. A exposição de um polissacarídeo aos reagentes químicos em processos para fazer isto, e particularmente aos ácidos, pode resultar em clivagem indesejável de ligações glicosídicas e conseqüente fragmentação do polissacarídeo. Tal fragmentação é altamente indesejável, causando perda em rendimentos na síntese de conjugados de polissacarídeo-proteína.
Os polissacarídeos que são instáveis desta maneira geralmente requerem escolha cuidadosa de reagentes e condições para contornar os problemas descritos acima.
Entretanto, isto limita os reagentes disponíveis para manipular o polissacarídeo, assim limitando a variedade de ligações que podem ser feitas entre o polissacarídeo e a proteína carreadora. Além disso, a instabilidade destes polissacarídeos significa que é difícil desenvolver procedimentos robustos, que podem ser usados para preparar vacinas em uma escala industrial.
A referência 4 divulga um sacarídeo capsular modificado compreendendo um grupo bloqueador em uma posição de grupo hidroxila em pelo menos uma das unidades de monossacarídeo do sacarídeo capsular nativo correspondente.
O sacarídeo capsular modificado é dito ter melhorado a estabilidade à hidrólise. É um objeto da invenção fornecer os sacarídeos capsulares modificados alternativos ou melhorados que tem estabilidade melhorada à hidrólise.
DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO
A invenção é baseada na descoberta que a modificação de grupos hidroxila em unidades de monossacarideo de sacarídeos capsulares com grupos bloqueadores específicos oferece estabilidade melhorada. Os sacarídeos modificados obtidos pelo processo da invenção são mais estáveis à hidrólise do que seus equivalentes nativos de sacarídeo.
A presente invenção fornece consequentemente um sacarídeo capsular modificado compreendendo um grupo bloqueador em uma posição de grupo hidroxila sobre pelo menos uma das unidades de monossacarideo do sacarídeo capsular nativo correspondente. O grupo bloqueador é definido abaixo. O sacarídeo capsular modificado da presente invenção é mais estável à hidrólise do que seus equivalentes de sacarídeo nativos. Preferivelmente, o sacarídeo capsular modificado da presente invenção retém a reatividade cruzada imunológica com seus equivalentes de sacarídeo nativos.
A presente invenção também fornece processos para modificar um sacarídeo capsular com o grupo bloqueador; conjugados de sacarídeo-proteína compreendendo o sacarídeo capsular modificado; processos para fazer os conjugados de sacarídeo-proteína, composições farmacêuticas compreendendo os sacarídeos capsulares modificados e/ou conjugados de sacarídeo-proteína; e métodos e usos dos mesmos.
Sacarídeos modificados da invenção
A invenção fornece um sacarídeo capsular modificado compreendendo um grupo bloqueador em uma posição de grupo hidroxila em pelo menos uma das unidades de monossacarídeo do sacarídeo capsular nativo correspondente. 0 grupo bloqueador é de fórmula (Ia) ou (Ib):
-O-X-Y (Ia) -O-R1 (Ib)
em que
X é C(O) , S (O) ou SO2;
Y é NR1R2 OU R3;
R1 é alquila C1-6 substituído com 1, 2 ou 3 grupos independentemente selecionados de hidroxila, sulfidril e amina;
R2 é H ou alquila C1-6; e
R3 é alquila C1-6.
Preferivelmente7 o grupo bloqueador é de fórmula (Ia). Nesta modalidade, prefere-se que X seja C(O) . Tal grupos bloqueadores de éster e carbamato têm um efeito estabilizante na ligação glicosídica e podem ser preparados sob condições suaves. Os exemplos de processos para manipular um sacarídeo para fornecer grupos bloqueadores de éster e carbamato são descritos abaixo. Entretanto, a invenção não é limitada aos sacarídeos modificados preparados pelos processos exemplificados aqui, e outros processos para preparar sacarídeos modificados da invenção serão prontamente aparentes à pessoa hábil.
Preferivelmente, R2 é H.
A alquila C1-6 de R1 é substituído com 1, 2 ou 3 grupos independentemente selecionados de hidroxila, sulfidril e amina. Quando alquila C1-6 é substituída com 2 ou 3 grupos, as substituições podem ser com o mesmo grupo ou grupos diferentes, embora tipicamente serão com o mesmo grupo. Preferivelmente, a alquila C1-6 de R1 é substituída cora 1, 2 ou 3 grupos hidroxila.
R1 pode ser substituído em qualquer posição ao longo da cadeia de alquila C1-6 Preferivelmente, pelo menos uma substituição está presente na extremidade distai da cadeia de alquila C1-6. Onde a cadeia de alquila C1-6 é um grupo alquila de cadeia reta, isto significa que a alquila C1-6 é substituída em Cx, onde x é o número total de átomos de carbono na cadeia alquila C1-6. Similarmente, onde a cadeia alquila C1-6 é um grupo alquila de cadeia ramificado, isto significa que a alquila C1-6 é substituída na extremidade distai de uma das ramificações, tipicamente a ramificação mais longa.
Em modalidades preferidas, R1 é substituído com um único grupo, esta substituição sendo na extremidade distai da cadeia alquila C1-6, como discutido acima. Tais grupos são particularmente eficazes em fornecer estabilidade melhorada à hidrólise. Preferivelmente, o único grupo é um grupo hidroxila. Os grupos preferidos incluem portanto, hidróximetila, 2-hidróxietila, 3-hidróxipropil, 4- hidróxibutila, 5-hidróxipentila e 6-hidróxihexila. 0 grupo particularmente preferido é 2-hidróxietila.
Em outras modalidades preferidas, R1 é substituído com dois grupos vicinais, isto é dois grupos em posições adjacentes ao longo da cadeia alquila C1-6. Tais grupos são particularmente eficazes em fornecer estabilidade melhorada à hidrólise. Preferivelmente, os dois grupos vicinais estão na extremidade distai da cadeia alquila C1-6. Onde a cadeia alquila C1-6 é um grupo alquila de cadeia reta, isto significa que os dois grupos vicinais estão em Cx e Cx. x
1 onde χ é o número total de átomos de carbono na cadeia alquila C1-6· Similarmente, onde a cadeia alquila C1-6& é um grupo alquila de cadeia ramificada, isto significa que os dois grupos vicinais estão na extremidade distai de uma das ramificações, tipicamente a ramificação mais longa. Preferivelmente, os dois grupos vicinais são grupos hidroxila. Tais grupos fornecem uma parte para conjugação a uma molécula carreadora, como discutido abaixo. Os grupos preferidos incluem portanto, 1,2-dihidróxietila; 1,2- dihidróxipropila e 2,3-dihidróxipropila; 1,2- dihidróxibutila, 2,3-dihidróxibutila e 3,4-dihidróxibutila; 1.2-dihidróxipentila, 2,3-dihidróxipentila, 3,4- dihidróxipentila e 4,5-dihidróxipentila; e 1,2- dihidróxihexila, 2,3-dihidróxihexila, 3,4-dihidróxihexila, 4,5-dihidróxihexil e 5,6-dihidróxihexila. Como notado acima, prefere-se que os dois grupos vicinais estejam na extremidade distai da cadeia alquila C1-6. Particularmente os grupos preferidos incluem portanto, 1,2-dihidróxietila, 2.3-dihidróxipropila; 3,4-dihidróxibutila, 4,5- dihidróxipentila e 5,6-dihidróxihexila. Um grupo particularmente preferido é 4,5-dihidróxipentila.
Em algumas modalidades, o sacarídeo capsular modificado compreende pelo menos dois tipos de grupo bloqueador (como descrito acima). Por exemplo, prefere-se para o sacarídeo compreender a) pelo menos um grupo bloqueador em que R1 é substituído com um único grupo, esta substituição sendo na extremidade distai da cadeia alquila C1-6 (como descrito acima) ; e b) pelo menos um grupo bloqueador onde R1 é substituído com dois grupos vicinais (como descrito acima). Tais grupos bloqueadores misturados são particularmente eficazes em fornecer a estabilidade melhorada à hidrólise. Além disso, incluindo pelo menos um grupo bloqueador em que R1 é substituído com dois grupos hidroxila vicinais, é fornecido uma parte para conjugação a uma molécula carreadora, como discutido abaixo.
Pref erivelmente, R3 é alquil C1-C3. Mais preferivelmente R3 é C1 alquila (CH3) , embora C2 alquil e C3 alquila são também preferidos.
Os grupos bloqueadores de fórmula -O-X-Y ou -O-R1 podem ser preparados dos grupos hidroxila (por exemplo, como encontrado na molécula nativa) por procedimentos de derivatização padrões, tais como reação do grupo hidroxila com um haleto de acila, haleto de alquila, haleto de sulfonila etc. Consequentemente, o átomo de oxigênio em -0- X-Y é pref erivelmente o átomo de oxigênio do grupo hidroxila, enquanto o grupo -X-Y em -O-X-Y preferivelmente substitui o átomo de hidrogênio do grupo hidroxila. Alternativamente, os grupos bloqueadores podem ser acessíveis através de uma reação de substituição, tal como uma substituição tipo Mitsunobu. Este e outros métodos de preparar grupos bloqueadores dos grupos hidroxila são bem conhecidos.
Tipicamente, os sacarídeos modificados da presente invenção são oligossacarídeos. Os oligossacarídeos podem ser obtidos dos polissacarídeos por quaisquer dos métodos de despolimerização e dimensionamento descritos aqui.
Os sacarídeos capsulares modificados desta invenção são obteníveis dos sacarídeos capsulares nativos. Entretanto, a presente invenção não é limitada aos sacarídeos modificados obtidos dos sacarídeos capsulares nativos. Os sacarídeos capsulares modificados da presente invenção podem ser obtidos por outros métodos, tais como síntese total ou parcial (veja, por exemplo, referência 5).
Nos sacarídeos capsulares modificados da invenção, o número de unidades de monossacarídeo tendo grupos bloqueadores pode variar. Preferivelmente, todo ou substancialmente todas as unidades de monossacarídeo do sacarídeo capsular modificado podem ter grupos bloqueadores . Alternativamente, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% das unidades de monossacarídeo do sacarídeo capsular modificado pode ter grupos bloqueadores. Pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 unidades de monossacarídeo do sacarídeo capsular modificado podem ter grupos bloqueadores.
Onde o sacarídeo capsular modificado compreende pelo menos dois tipos de grupo bloqueador, o número de unidades de monossacarídeo tendo cada tipo de grupo bloqueador pode também variar. Por exemplo, a proporção do número total de grupos bloqueadores feitos por um tipo de grupo bloqueador relativo ao(s) outro(s) tipo(s) de grupo bloqueador pode variar. Em particular, quando houver dois tipos de grupo bloqueador presentes, a razão de um tipo de grupo bloqueador ao outro tipo de grupo bloqueador pode ser selecionada de 1:20, 1:19, 1:18, 1:17, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2 e 1:1. Em particular, na modalidade descrita acima onde o sacarídeo compreende a) pelo menos um grupo bloqueador em que R1 é substituído com um único grupo, esta substituição sendo na extremidade distai da cadeia alquila C1-6; e b) pelo menos um grupo bloqueador em que R1 é substituído com dois grupos vicinais, prefere-se que a razão do tipo anterior de grupo bloqueador ao último tipo de grupo bloqueador seja selecionada de 99:1, 98:2, 97:3, 96:4, 95:5, 94:6, 93:7, 92:8, 91:9, 90:10, 89:11, 88:12, 87:13, 86:14, 85:15, 84:16, 83:17, 82:18, 81:19 e 80:20. Destas razões, 95:5, 94:6, 93:7, 92:8, 91:9, 90:10, 89:11, 88:12, 87:13, 86:14 e 85:15 são particularmente preferidas. Destas, 90:10 é preferida.
Do mesmo modo, o número de grupos bloqueadores em uma unidade de monossacarídeo pode variar. Por exemplo, o número de grupos bloqueadores em uma unidade de monossacarídeo pode ser 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, preferivelmente 1-4, mais preferivelmente 1 ou 2, mais preferivelmente 1.
Em uma modalidade, pelo menos uma unidade de monossacarídeo tendo um grupo bloqueador inclui uma unidade de monossacarídeo não terminal. O termo "unidade de monossacarídeo não terminal" significa uma unidade de monossacarídeo que não é uma das unidades de monossacarídeo terminais na cadeia de oligossacarídeo/polissacarídeo.
Esta invenção engloba sacarídeos capsulares modificados em que todas as posições de grupo hidroxila das unidades de monossacarídeo terminal e não terminal têm um grupo bloqueador. Entretanto, em algumas modalidades preferidas há pelo menos um grupo hidroxila livre ou grupo amino no sacarídeo capsular modificado da presente invenção. Um grupo hidroxila ou grupo amino livre é vantajoso porque fornece uma parte para reações adicionais do sacarídeo capsular modificado, por exemplo, para conjugação a uma molécula carreadora, como discutido abaixo. Quando o sacarídeo modificado contém um grupo hidroxila livre, pode ser um grupo hidroxila anomérico, particularmente um grupo hidroxila anomérico terminal. Quando o sacarídeo modificado contém um grupo amino, pode ser derivado de um grupo hidroxila anomérico. Os grupos amino são prontamente acessíveis dos grupos hidroxila anoméricos por aminação redutiva (usando, por exemplo, NaBH3CN/NH4Cl) . Similarmente, em outras modalidades preferidas, há pelo menos uma unidade de monossacarídeo do sacarídeo capsular modificado onde dois grupos hidroxila vicinais do sacarídeo capsular nativo correspondente não compreendem grupos bloqueadores. Preferivelmente, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ou 20% das unidades de monossacarídeo têm dois grupos hidroxila vicinais desta maneira. Por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 4 0 unidades de monossacarídeo têm dois grupos hidroxila vicinais desta maneira. Preferivelmente, entre 5- 15%, mais preferivelmente 10%, das unidades de monossacarídeo têm dois grupos hidroxila vicinais desta maneira. Os dois grupos hidroxila vicinais na(s) unidade(s) de monossacarídeo são vantajosos, pois fornecem uma parte para conjugação a uma molécula carreadora, como discutido abaixo.
Alternativamente, em algumas modalidades preferidas, pelo menos um ou pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% OU 20% das unidades de monossacarídeo do sacarídeo capsular modificado têm grupos bloqueadores onde R1 é substituído com dois grupos hidroxila vicinais, como descrito acima.
Por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 unidades de monossacarídeo do sacarídeo capsular modificado podem ter tais grupos bloqueadores. Preferivelmente, entre 5-15%, mais preferivelmente 10%, das unidades de monossacarídeo do sacarídeo capsular modificado têm grupos bloqueadores em que R1 é substituído com dois grupos hidroxila vicinais. Mais uma vez, os dois grupos hidroxila vicinais na(s) unidade(s) de monossacarídeo são vantajosos, pois fornecem uma parte para conjugação a uma molécula carreadora, como discutido abaixo.
Foi sugerido na referência 4 que os grupos bloqueadores eficazes são grupos retiradores de elétron. Sem desejar ser limitado pela teoria, acredita-se que as ligações glicosídicas são instáveis à hidrólise devido ao auxílio de um ataque nucleofílico intramolecular de um grupo hidroxila de sacarídeo na ligação glicosídica (isto é, pela formação de um intermediário cíclico). Quanto maior a nucleofilicidade do grupo hidroxila, maior a tendência para ataque nucleofílico intramolecular. Um grupo bloqueador retirador de elétron tem o efeito de deslocalizar o par solitário de oxigênio, desse modo diminuindo a nucleofilicidade do oxigênio e diminuindo a tendência para ataque nucleofílico intramolecular. Surpreendentemente, descobriu-se que os grupos compreendendo alquila Ci-6 substituída com 1, 2 ou 3 grupos independentemente selecionados de hidroxila, sulfidril e amina podem ser grupos bloqueadores eficazes, apesar da presença da hidroxila, sulfidrila ou amina nucleofílica no grupo bloqueador. Além disso, estes grupos substituídos de hidroxila, sulfidrila ou amina são vantajosos, pois permitem uma conjugação mais eficaz do sacarídeo capsular modificado a uma molécula carreadora. Sem desejar ser limitado pela teoria, acredita-se que este efeito surge da hidrofilicidade relativa de grupos compreendendo alquila C1-6 substituída com 1, 2 ou 3 grupos independentemente selecionados de hidroxila, sulfidrila e amina. Além disso, onde o grupo bloqueador compreende alquila Ci-6 substituída com dois grupos hidroxila vicinais, o próprio grupo bloqueador fornece uma parte para conjugação a uma molécula carreadora.
Em todas as modalidades descritas acima, o sacarídeo capsular modificado é preferivelmente um sacarídeo capsular modificado tendo ligações fosfodiéster. Mais preferivelmente, o sacarídeo capsular modificado é um sacarídeo de sorogrupo A de Neisseria meningitidis modificado. Os sacarídeos de sorogrupo A de Neisseria meningitidis são particularmente instáveis à hidrólise.
Quando o sacarídeo capsular modificado é um sacarídeo de sorogrupo A de Neisseria meningitidis modificado, o grupo bloqueador está preferivelmente nas posições 4 e/ou 3, mais preferivelmente na posição 4, do sacarídeo de sorogrupo A de Neisseria meningitidis correspondente. Os grupos bloqueadores nas posições 4 e/ou 3 do sacarídeo de sorogrupo A de Neisseria meningitidis foram mostrados por serem particularmente mais eficazes para melhorar a estabilidade para hidrólise. Em modalidades com grupos bloqueadores de éster (isto é, quando o grupo bloqueador é de fórmula (Ia), X é C(O) e Y é R3) , os inventores descobriram que a estabilidade de um sacarídeo de sorogrupo A de Neisseria meningitidis modificado é influenciado pela proporção de posições 4 e/ou 3 tendo grupos bloqueadores. Por exemplo, a proporção de posições 4 tendo grupos bloqueadores pode ser aproximadamente 0%, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou aproximadamente 100%, com pelo menos 30% e aproximadamente 100% sendo preferidos. Similarmente, a proporção de posições 3 tendo grupos bloqueadores pode ser aproximadamente 0%, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou aproximadamente 100%, com pelo menos 95% e aproximadamente 100% sendo preferidas.
Tipicamente, a proporção de posições 4 e 3 tendo grupos bloqueadores é aproximadamente a mesma em cada posição. Em outras palavras, a razão de posições 4 tendo grupos bloqueadores para posições 3 tendo grupos bloqueadores é aproximadamente 1:1. Entretanto, em algumas modalidades, a proporção de posições 4 tendo grupos bloqueadores pode variar relativa à proporção de posições 3 tendo grupos bloqueadores. Por exemplo, a razão de posições 4 tendo grupos bloqueadores para posições 3 tendo grupos bloqueadores pode ser 1:20, 1:19, 1:18, 1:17, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3 ou 1:2. Similarmente, a razão de posições 3 tendo grupos bloqueadores para posições 4 tendo grupos bloqueadores pode ser 1:20, 1:19, 1:18, 1:17, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3 OU 1:2. Esta invenção também fornece um sacarídeo de fórmula:
<formula>formula see original document page 15</formula>
η é um inteiro de 1 a 10 0; cada grupo Z é independentemente selecionado de -0H, OAc ou um grupo bloqueador como definido acima; e cada grupo Q é independentemente selecionado de -0H, OAc ou um grupo bloqueador como definido acima;
V é selecionado de -NH2, -NHE, -NE1E2, W2, ou -0-D, onde: E, E1 e E2 são grupos protetores de nitrogênio, que
podem ser os mesmos ou diferentes, e D é um grupo protetor de oxigênio;
W é selecionado de -OH ou um grupo bloqueador como definido acima;
W1 é selecionado de -OH ou um grupo bloqueador como definido acima; W2 é selecionado de -OH ou um grupo bloqueador como definido acima.
e em que pelo menos um (por exemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 3 9 ou 40) dos grupos Z e/ou pelo menos um (por exemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40) dos grupos Q são grupos bloqueadores como definidos acima.
Preferivelmente, η é um inteiro de 15 a 25.
Cada um dos grupos Z n+2 pode ser o mesmo ou diferente um do outro. Do mesmo modo, cada um dos grupos Q n+2 pode ser o mesmo ou diferente um do outro.
V é pref erivelmente -NH2 ou -NHE.
Os grupos protetores de nitrogênio apropriados são grupos silila (tais como TMS, TES,. TBS, TIPS), derivados de acila (tais como, trifluoroacetamidas, metóxicarbonila, etóxicarbonila, t-butóxicarbonila (Boc), benzilóxicarbonila (Z ou Cbz) , 9 -fluorenilmetóxicarbonila (Fmoc), 2- (trimetilsilil)etóxi carbonila, alliloxicarbonila (Alloc), 2,2,2-tricloroetóxicarboniIa (Troc)), derivados de sulfonila (tais como β-trimetilsililetanosulfonila (SES)), derivados de sulfenila, alquil Ci-I2, benzil, benzhidrila, tritila, allila, 9-fenilfluorenila, etc. Um grupo protetor preferido de nitrogênio é Fmoc.
Os grupos protetores de nitrogênio divalentes, que podem ser usados como E1E2, incluem derivados de imida cíclicos (tais como N-ftalimidas, N-ditiasuccinimidas, N- 2,3-difenilmaleimidas), derivados de imina (tais como N- 1,1-dimetiltiometilenoaminas, N-benzilidenoaminas, Ν-p- metóxibenzilidenoaminas, N-difenilmetilenoaminas) ,
derivados de enamina (tais como N-(5,5-dimetil-3-oxo-1- ciclohexenil)aminas), etc. Um grupo protetor de nitrogênio divalente preferido é N-ftalimidil.
Os grupos protetores de oxigênio apropriados incluem ésteres, éteres (por exemplo, éteres de silil ou éteres de alquila) e acetais. Os exemplos específicos incluem allila, acetila, Aloc, benzila, benzilóximetila (BOM), t-butila, tritila, tert-butildimetilsilila (TBS), tert- butildifenilsilila (TBDPS), trietilsilila (TES), trimetilsilila (TMS), tri-isopropilsilila (TIPS), parametóxibenzila (PMB), MEM, metóximetila (MOM), MTM e tetrahidropiranila (THP).
Todos os grupos Z podem ser OH (submetido a pelo menos um dos grupos Z e/ou pelo menos um dos grupos Q sendo grupos bloqueadores). Como uma alternativa a todos os grupos Z sendo 0H, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% dos grupos Z podem ser OAc. Preferivelmente,
aproximadamente 60-90% dos grupos Z são OAc, com o restante dos grupos Z sendo OH ou grupos bloqueadores como definidos acima. Preferivelmente, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ou 40% dos grupos Z são grupos bloqueadores, 60-90% são OAc e o restante é OH.
Preferivelmente, aproximadamente 10-40% dos grupos Z são grupos bloqueadores, 60-90% são OAc e o restante é OH. Alternativamente, aproximadamente 0%, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou aproximadamente 100% dos grupos Z são grupos bloqueadores, com pelo menos 95% e aproximadamente 100% sendo preferido. Todos os grupos Q podem ser OH (submetido a pelo menos um dos grupos Z e/ou grupos Q sendo grupos bloqueadores). Alternativamente, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15% ou 20% dos grupos Q podem ser OAc.
Preferivelmente, aproximadamente 1-20% de grupos Q são OAc, com o restante dos grupos Q sendo OH ou grupos bloqueadores como definidos acima. Preferivelmente, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% dos grupos de Q estão grupos bloqueadores, 1-20% são OAc e o restante é OH. Preferivelmente, aproximadamente 80- 99% dos grupos Q são grupos bloqueadores, 1-20% são OAc e o restante é OH. Alternativamente, aproximadamente 0%, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou aproximadamente 100% dos grupos Q são grupos bloqueadores, com pelo menos 30% e aproximadamente 100% sendo preferido.
A invenção também fornece uma molécula compreendendo uma porção de sacarídeo de fórmula:
<formula>formula see original document page 18</formula> em que T e de formula (A) ou (B)
<formula>formula see original document page 19</formula>
n, Ζ, Q e W são como definidos acima; pelo menos um (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40) dos grupos Z e/ou pelo menos um (por exemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40) dos grupos Q são grupos bloqueadores; e: L é O, NH, NE, S ou SE.
A ligação covalent livre de L pode ser unida a qualquer porção apropriada, por exemplo, -H, -E, um ligante, um carreador de proteína, etc. L é preferivelmente N ou O. É também possível para L ser N, unido a um ligante divalente, a um grupo protetor divalente, ou a um carreador de proteína divalente.As identidades preferidas dos grupos n, Z, QeW são descritas acima.
Esta invenção também fornece uma molécula compreendendo um sacarídeo de fórmula:
<formula>formula see original document page 19</formula> onde T e de formula (A) ou (B):
<formula>formula see original document page 20</formula>
η, Ζ, Q, W, W1 e V são como definidos acima, e pelo menos um (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40) dos grupos Z e/ou pelo menos um (por exemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40) dos grupos Q são de fórmula (IIa) ou (IIb) :
-O-X-Y' (II) - O-R4 (IIb)
em que X é como definido acima;
Y' é NR2R4;
R2 é como definido acima; e
R4 é -C1-4 alquileno-CH (O) ou -C1-5 alquileno-NH, em que o grupo -NH- é parte de uma proteína carreadora.
Preferivelmente, pelo menos um do grupo Z e/ou Q é de fórmula (IIa). Nesta modalidade, prefere-se que X seja C(O) Os grupos R2 preferidos são descritos acima em relação à fórmula (Ia).
Os grupos R4 preferidos incluem -C1 alquileno-CH(O), - C2 alquileno-CH(O), -C3 alquileno-CH(O) e -C4 alquileno- CH (O). Um grupo R4 particularmente preferido é -C3 alquileno-CH(O).
Outros grupos R4 preferidos incluem -C1 alquileno-NH, -C2 alquileno-NH; -C3 alquileno-NH, -C4 alquileno-NH e -C5 alquileno-NH. Um grupo R4 particularmente preferido é -C4 alquileno-NH. As identidades preferidas dos grupos η, Z, Q, W, W1 e V são descritos acima.
Processo para produzir vim sacarídeo modificado.
A invenção fornece um processo modificando um sacarídeo capsular compreendendo as etapas de:
(a) fornecer um sacarídeo capsular tendo pelo menos um grupo hidroxila em uma unidade de monossacarídeo; e
(b) converter pelo menos um referido grupo hidroxila em um grupo bloqueador.
O grupo bloqueador é qualquer dos grupos bloqueadores definidos acima.
O sacarídeo capsular pode ser um sacarídeo capsular nativo (oligossacarídeo ou polissacarídeo). Como uma alternativa, o sacarídeo capsular pode ser, por exemplo, um sacarídeo capsular des-O-acetilado e/ou um sacarídeo capsular tendo um grupo amino terminal (por exemplo, obtido por aminação redutiva).
Um processo preferido para modificar um sacarídeo em que o grupo bloqueador é -OC(O)NR1R2 é quando a etapa (b) compreende as etapas de:
(bl) reagir o sacarídeo capsular com um reagente bifuncional em um solvente orgânico; e
(b2) reagir o produto de etapa (bl) com um composto amino de fórmula (III):
HNR1R2 (III)
em que R1 e R2 são como definidos acima.
O termo "reagente bifuncional" significa qualquer reagente que é capaz de realizar as funções duplas de (i) fornecer na etapa (bl) um primeiro átomo de carbono electrofíIico para acoplar com o(s) grupo(s) hidroxila no sacarídeo; e (ii) fornecer um segundo átomo de carbono electrofilico para acoplar com o grupo amino usado na etapa (b2). Geralmente, o segundo átomo de carbono electrofilico é regenerado do primeiro átomo de carbono electrofilico durante a etapa (b) . O reagente bifuncional fornece uma ligação -C(O)- entre o polissacarideo e o composto amino.
Os reagentes bifuncionais para uso na presente invenção incluem, mas não são limitados a, 1,1'- carbonildiimidazol (CDI), carbonil di-1,2,4-triazol (CDT), carbonil di-1,2,3-benzotriazol (CDB), difenilcarbonato, brometo de cianogeno, fosgeno ou trifosgeno. A pessoa hábil estará ciente de outros reagentes bifuncionais que podem realizar a mesma função que estes.
Um reagente bifuncional preferido é CDI. 0 CDI tem a vantagem de ser um reagente mais suave que, por exemplo, de brometo de fosfogeno ou cianogeno. Em particular, as reações de acoplamento usando CDI não geram gases ácidos hidrohálicos, tais como HCl ou HBr. A geração de gás HCl ou
HBr é indesejável, pois estes gases exigem a depuração da saída da câmara de reação para evitar seu escape na atmosfera. Além disso, a geração de gás HCl ou HBr pode afetar os grupos funcionais sensíveis no sacarídeo, resultando na perda de rendimentos devido à decomposição ou fragmentação do sacarídeo.
O solvente orgânico usado na etapa (bl) é preferivelmente um solvente aprótico. Os solventes apróticos são conhecidos à pessoa hábil na técnica e não contêm nenhum átomo de hidrogênio ionizável. Estes solventes são vantajosos, pois facilitam a reação de grupo(s) hidroxila no sacarldeo com o reagente bifuncional, melhorando a nucleofilicidade do(s) grupo(s) hidroxila. Os solventes apróticos apropriados incluem, mas não são limitados a, dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF) , formamida, triamida hexametilfósforo (HMPT), 1,3- dimetil-3,4,5,6-tetrahidro-2(IH) -pirimidinona (DMPU), dimetilacetamida (DMAC), ou hexametilfosforamida (HMPA). DMSO é preferido.
Na etapa (b2) do processo da invenção, o produto da etapa (b1) é reagido com um composto amino para formar o polissacarídeo modificado. O composto amino usado no processo da presente invenção é de fórmula (III), como definido acima.
Os composto aminos apropriados que podem ser usados na invenção dependem de R1 e R2. Como descrito acima, em modalidades preferidas, R1 é substituído com um único grupo hidroxila, esta substituição sendo na extremidade distai da cadeia alquila C1-6, e R2 é H. Os composto aminos preferidos que podem ser usados na invenção incluem portanto, aminometano1, 2-aminoetanol, 3-aminopropan-1-ol, 4- aminobutan-1-ol, 5-aminohexil-1-ol e 6-aminopentan-1-ol. Um composto amino particularmente preferido é 2-aminoetanol.
Em outras modalidades preferidas, R1 é substituído com dois grupos hidroxila vicinais e R2 é H. Os compostos amino preferidos que podem ser usados na invenção incluem portanto, 1-aminoetano-l,2-diol; 1-aminopropano-l,2-diol e 3-aminopropano-1,2-diol; 1-aminobutano-l,2-diol, 1- aminobutano-2,3-diol e 4-aminobutano-1,2-diol; 1- aminopentano-1,2-diol, l-aminopentano-2,3-diol, 5- aminopentano-2,3-diol e 5-aminopentano-l,2-diol; e 1- aminohexano-1,2-diol,1-aminohexano-2,3-diol, 5-
aminohexano-3,4-diol,6-aminohexano-2,3-diol e 6- minohexano-1,2-diol. Em modalidades particularmente preferidas, R1 é substituído com dois grupos hidroxila vicinais na extremidade distai da cadeia alquila Ci-6. Os composto aminos preferidos que podem ser usados na invenção incluem portanto, 3-aminopropano-1,2-diol, 4-aminobutano- 1,2-diol, 5-aminopentano-1,2-diol e 6-aminohexano-1,2-diol.
Um composto amino particularmente preferido é 5- aminopentano-1,2-diol. Estes podem ser usados na forma de sal (por exemplo, sal de hidrocloreto).
Um processo preferido da invenção é exemplificado no esquema 1 abaixo:
<formula>formula see original document page 24</formula>
Esquema 1
Neste esquema, o sacarídeo (por exemplo, polissacarídeo ou oligossacarídeo MenA) é primeiramente ativado através de pelo menos um de seus grupos hidroxila em uma unidade de monossacarídeo usando CDI em DMSO solvente. O intermediário de carbamato imidazol resultante é preso pela amina R1R2NH (por exemplo, 2-aminoetanol) para dar o sacarídeo modificado.
Os sacarídeos modificados podem alternativamente ser preparados em um processo de uma etapa reagindo um ou mais grupos hidroxila em um sacarídeo capsular com um reagente de fórmula XC(O)NR1R2, em que X é um grupo de saída, e R1 e R2 são como definidos acima. Os grupos de saída apropriados incluem, mas não são limitados a, -Cl, -Br, -CF3, -OC6F5 ou -CCl3.
Um processo preferido para modificar um sacarídeo em que o grupo bloqueador é -OC(O)R3 é quando a etapa (b) compreende a etapa de:
(b1) reagir o sacarídeo capsular com [(R3C(O)2)IO na presença de um catalizador de imidazol.
Este processo é particularmente apropriado para modificar um sacarídeo em que o grupo bloqueador é OC(O)CH3. Nesta modalidade, a etapa (b) compreende a etapa de:
(b1) reagir o sacarídeo capsular com [(CH3C(O))2JO (anidrido acético) na presença de um catalizador de imidazol.
Alternativamente, os sacarídeos capsulares modificados da presente invenção podem ser preparados por meios sintéticos, por exemplo, de unidades de monossacarídeo apropriadas. Tipicamente, a síntese total de um sacarídeo capsular modificado compreende a formação de ligações glicosídicas (por exemplo, ligações fosfodiéster) entre unidades de monossacarídeo apropriadas e então modificar o sacarídeo resultante em qualquer maneira descrita acima. Alternativamente, as unidades de monossacarídeo podem ser modificadas antes de formar as ligações glicosídicas para fornecer o mesmo sacarídeo capsular modificado.
Os sacarídeos capsulares modificados desta invenção são preferivelmente oligossacarídeos. Partindo dos polissacarídeos capsulares nativos, os oligossacarídeos capsulares modificados podem ser obtidos por qualquer um dos dois métodos: (1) modificar o polissacarídeo capsular seguido por despolimerização e dimensionamento do polissacarídeo modificado para formar um oligossacarídeo modificado; ou (2) despolimerizar e dimensionar o polissacarídeo capsular seguido por modificação do oligossacarídeo resultante para formar um oligossacarídeo modificado. Ambos os métodos são englobados dentro da presente invenção. Entretanto, o primeiro método é preferido em determinadas modalidades, já que este método assegura que um grupo hidroxila terminal estará disponível para conjugação subsequente do oligossacarídeo modificado a uma molécula carreadora, tal como uma proteína.
A presente invenção também fornece um processo para modificar um polissacarídeo de sorogrupo A de Neisseria meningitidis compreendendo as etapas de:
(a) fornecer um polissacarídeo de sorogrupo A de Neisseria meningitidis;
(b) despolimerizar e dimensionar o referido polissacarídeo para fornecer um oligossacarídeo; e
(c) converter pelo menos um grupo hidroxila do oligossacarídeo em um grupo bloqueador, como descrito acima A etapa (b) deste processo pode opcionalmente ser seguida por etapa(s) de derivatização conhecidas antes da etapa (c) . As etapas de derivatização conhecidas incluem, por exemplo, animação redutiva seguida pela proteção do grupo -NH2 resultante e/ou des-O-acetilação.
Esta invenção também fornece um processo para modificar um polissacarídeo de sorogrupo A de Neisseria meningitidis compreendendo as etapas de:
(a) fornecer um polissacarídeo de sorogrupo A de Neisseria meningitidis;
(b) converter pelo menos um grupo hidroxila do polissacarídeo em um grupo bloqueador, como descrito acima;
e
(c) despolimerizar e dimensionar o polissacarídeo resultante para fornecer um oligossacarídeo.
A etapa (c) deste processo pode opcionalmente ser seguida por etapas de derivatização conhecidas. As etapas de derivatização conhecidas incluem, por exemplo, a aminação redutiva seguida pela proteção do grupo NH2 resultante e/ou des-O-acetilação.
Quaisquer dos processos descritos acima podem ser seguidos por uma etapa em que os contaminantes (por exemplo, contaminantes de baixo peso molecular) são removidos.
Materiais de partida de sacarídeo capsular
Os sacarídeos capsulares modificados da invenção são obteníveis dos sacarídeos capsulares nativos. 0 termo "sacarídeo capsular nativo" refere-se aos polímeros contendo açúcar (por exemplo, polímeros de açúcares, ácidos de açúcar, amino de açúcares, álcoois polhídricos, álcoois de açúcar, e fosfatos de açúcar etc.) que podem ser encontrados na cápsula de bactérias (ambas Gram-positiva e Gram-negativa) tais como N. meningitidis, S.pneumoniae e H. influenzae. Além disso, o "sacarídeo capsular nativo" inclui ambos polissacarídeos e oligossacarídeos. Os oligossacarídeos capsulares nativos podem ser obtidos despolimerização e dimensionamento de polissacarídeos nativos. A "posição do grupo hidroxila" de um sacarídeo capsular nativo é uma posição no sacarídeo capsular nativo tendo um grupo hidroxila. Entretanto, não inclui posições em ligações glicosídicas, ou resíduos das mesmas, tendo grupos hidroxila (por exemplo, um grupo hidroxila que é parte de uma ligação de fosfato não ocupa uma posição de grupo hidroxila). Nem inclui as posições onde há um grupo acetóxi (AcO) no sacarídeo capsular nativo não são também posições de grupo hidroxila.
0 sacarídeo capsular nativo pode compreender as unidades de sacarídeo ligadas por ligações fosfodiéster. Os sacarídeos compreendendo ligações fosfodiéster podem ser instáveis à hidrólise.
0 sacarídeo capsular nativo e o sacarídeo capsular modificado da invenção são preferivelmente imunogênicos em mamíferos (por exemplo, humanos). 0 mamífero pode ser um adulto ou uma criança humanos.
0 sacarídeo capsular nativo é preferivelmente um polissacarídeo (ou fragmento de oligossacarídeo do mesmo) de N. meningitidis (incluindo sorogrupos A, B, C, W135 e Υ), S.pneumoniae (incluindo sorotipos 1, 4, 5, 6B, 9V, 14,18C, 19F e 23F), H. influenzae tipo B, Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus agalactiae, Escherichia Coli, Salmonella typhi, Streptoeoceus mutans, Cryptococcus neoformans, Moraxella eatarrhalis, Klebsiella pneumoniae, Staphilocoeeus aureus, e/ou Pseudomonas aeruginosa.
Embora a invenção possa ser aplicada a qualquer sorogrupo de N. meningitidis, prefere-se usar um sacarídeo capsular do sorogrupo A ("MenA"). 0 sacarídeo capsular MenA é particularmente instável em solução aquosa, significando que procedimentos especiais precisam ser usados para realizar as manipulações químicas (por exemplo, conjugação às proteínas carreadoras) nesta molécula. Entretanto, os sacarídeos MenA modificados de acordo com a invenção são descobertos por serem vantajosamente estáveis em solução aquosa.
O polissacarídeo capsular MenA {-»6) -D-ManpNAc (3/40Ac) - a-(1-*0P03-»} é composto de resíduos de N-acetilmannosamina ligado junto por ligações al-6 fosfodiéster tendo as unidades de repetição mostradas abaixo.
<formula>formula see original document page 29</formula>
De acordo com as definições acima, aproximadamente 80- 99% das posições 4 são posições de grupo hidroxila, e aproximadamente 10-40% das posições 3 são posições de grupo hidroxila. O grupo 1-hidróxi terminal também ocupa uma posição de grupo hidroxila. 0 grupo 1-hidróxi terminal é um grupo hidroxila anomérico terminal. 0 grupo hidroxila que é parte do grupo -OP(O) (OH)O" não é uma posição de grupo hidroxila. Conjugados de sacarídeo-proteína
Os sacarídeos modificados da invenção podem ser submetidos a qualquer processamento à jusante usual que é aplicado aos sacarídeos (por exemplo, derivatização, conjugação, fragmentação, etc.). Para melhorar a imunogenicidade, os sacarídeos modificados da invenção são conjugados preferivelmente a uma proteína carreadora. A conjugação às proteínas carreadoras é particularmente útil para vacinas pediátricas [6] e é uma técnica bem conhecida [por exemplo, revisto nas refs. 7 a 15 etc.]. O polissacarídeo pode ser ligado diretamente à proteína [2, 16] ou pode ser ligado através de um grupo ligante. Muitos tipos diferentes de grupos ligantes foram propostos para ligar polissacarídeos às proteínas [por exemplo, 3, 17].
A invenção assim fornece um conjugado de uma proteína e um sacarídeo modificado da invenção. A proteína pode ser conjugada ao sacarídeo diretamente, ou um ligante pode ser usado. Qualquer ligante química apropriado pode ser usado. A estabilidade melhorada do polissacarídeo modificado permite vantajosamente que uma variedade ampla de ligações seja usada.
Como descrito acima, em algumas modalidades prefere-se que o sacarídeo capsular modificado tenha pelo menos um grupo hidroxila ou grupo amino livre que podem ser usados como uma parte para ligação subsequente a uma proteína carreadora.
Um sacarídeo capsular modificado tendo um grupo hidroxila livre pode ser obtido seletivamente bloqueando grupos hidroxila em um sacarídeo capsular, ou seletivamente desbloqueando um sacarídeo capsular modificado em que todos os grupos hidroxila estão bloqueados. Alternativamente, um grupo hidroxila livre pode ser revelado despolimerizando e dimensionando um sacarídeo capsular modificado. Preferivelmente, pelo menos um grupo hidroxila livre é um grupo hidroxila anomérico terminal. 0 grupo hidroxila anomérico terminal é preferido como o grupo hidroxila livre, pois um grupo hidroxila anomérico terminal pode ser revelado por despolimerizar e dimensionar um sacarideo capsular modificado.
Um sacarideo capsular modificado tendo um grupo amino livre pode ser obtido por aminação redutiva de um grupo hidroxila anomérico terminal, opcionalmente seguido por proteção do grupo NH2 resultante. A reação de aminação redutiva pode ser realizada antes ou depois da etapa de modificação da presente invenção. Preferivelmente, a aminação redutiva é realizada antes da etapa de modificação da presente invenção já que o grupo NH2 resultante pode seletivamente ser protegido/desprotegido na presença de grupos hidroxila/grupos bloqueadores.
Por exemplo, a presente invenção fornece um processo para fazer um conjugado de sacarídeo-proteina compreendendo as etapas de:
(a) fornecer um sacarideo capsular modificado da invenção, em que o sacarideo modificado compreende um grupo hidroxila anomérico terminal ou um grupo amino derivado de um grupo hidroxila anomérico terminal; e
(b) ligar o sacarideo capsular modificado a uma proteína através do grupo hidroxila anomérico terminal ou o grupo amino derivado de um grupo hidroxila anomérico terminal. A proteína é preferivelmente uma toxina ou toxóide bacteriano, em particular toxina ou toxóide de difteria. Por exemplo, a proteína é pref erivelmente CRMi97.
As ligações através de um grupo ligante podem ser feitas usando qualquer procedimento conhecido, por exemplo, os procedimentos descritos nas referências 3 e 17. Um tipo preferido de ligação é um ligante carbonila, que pode ser formado pela reação de um grupo hidroxila livre do sacarídeo modificado com CDI [18, 19] seguido pela reação com uma proteína para formar uma ligação de carbamato. Umoutro tipo preferido de ligação é um ligante de ácido adípico, que pode ser formado acoplando um grupo -NH2 livre no sacarídeo modificado com ácido adípico (usando, por exemplo, ativação de diimida), e então acoplar uma proteína ao intermediário de ácido adípico-sacarídeo resultante [11, 20, 21] . Outros ligantes incluem B-propionamido [22], nitrofenil-etilamina [23] , haletos de haloacila [24] , ligações glicosídicas [25] , ácido 6-aminocapróico [26] , ADH [27], porções C4 a Ci2 [28] etc.
A conjugação pode envolver: redução do terminal anomérico a um grupo hidroxila primário, proteção/desproteção opcional do grupo hidroxila primário; reação do grupo hidroxila primário com CDI para formar um intermediário de carbamato CDI; e acoplamento do intermediário de carbamato CDI com um grupo amino em uma proteína.
0 esquema 2 mostra dois exemplos diferentes de como um sacarídeo capsular pode ser conjugado a uma proteína carreadora, de acordo com a presente invenção. No primeiro exemplo, a proteína é conjugada através de um grupo hidroxila terminal. No segundo exemplo, a proteína é ligada através de um grupo amino terminal.
<figure> figure see orginal document page </figure>
Esquema 2
As ligações diretas à proteína podem compreender oxidação do polissacarídeo seguido por aminação redutiva com a proteína, como descrito nas, por exemplo, referências 2 e 16. Por exemplo, em modalidades onde há pelo menos uma unidade de monossacarídeo do sacarídeo capsular modificado onde dois grupos hidroxila vicinais do sacarídeo capsular nativo correspondente não compreendem grupos bloqueadores, um ou mais pares de grupos hidroxila vicinais podem ser convertidos em grupos aldeído por clivagem oxidativa (por exemplo, NaIO4, Pb(OAc)4, etc.). 0 sacarídeo capsular modificado pode então ser ligado à proteína por aminação redutiva.
Por exemplo, a presente invenção fornece um processo para fazer um conjugado de sacarídeo-proteína compreendendo as etapas de:
(a) fornecer um sacarídeo capsular modificado da invenção em que haja pelo menos uma unidade de monossacarídeo do sacarídeo capsular modificado onde dois grupos hidroxila vicinais do sacarídeo capsular nativo correspondente não compreendem grupos bloqueadores;
(b) converter pelo menos um dos pares de grupos hidroxila vicinais em grupos aldeído por clivagem oxidativa;
e
(c) ligar o sacarídeo capsular modificado a uma proteína por aminação redutiva.
A proteína é preferivelmente uma toxina ou toxóide bacteriano, em particular toxina ou toxóide de difteria. Por exemplo, a proteína é pref erivelmente CRMi97.
Como descrito acima, em algumas modalidades, é preferido que pelo menos uma das unidades de monossacarídeo do sacarídeo capsular modificado compreende grupos bloqueadores em que R1 é substituído com dois grupos hidroxila vicinais. Os dois grupos hidroxila vicinais podem ser usados como uma parte para ligação subsequente a uma proteína carreadora. Por exemplo, um ou mais pares de grupos hidroxila vicinais podem ser convertidos em grupos aldeído por clivagem oxidativa (por exemplo, NaIO4, Pb(OAc)4, etc.). 0 sacarídeo capsular modificado pode então ser ligado à proteína por aminação redutiva.
Por exemplo, a presente invenção fornece um processo para fazer um conjugado de sacarídeo-proteína compreendendo as etapas de:
(a) fornecer um sacarídeo capsular modificado da invenção em que pelo menos uma das unidades de monossacarídeo compreende grupos bloqueadores em que R1 é substituído com dois grupos hidroxila vicinais;
(b) converter pelo menos um dos pares de grupos hidroxila vicinais em grupos aldeído por clivagem oxidativa;
e
(c) ligar o sacarídeo capsular modificado a uma proteína por aminação redutiva.
A proteína é preferivelmente uma toxina ou toxóide bacteriano, em particular toxina ou toxóide de difteria. Por exemplo, a proteína é pref erivelmente CRM197.
Em algumas modalidades deste processo, todos os grupos hidroxila vicinais presentes nos grupos bloqueadores são convertidos em grupos aldeído na etapa (b). Nestas modalidades, o número grupos aldeído produzidos depende do número total de grupos bloqueadores em que R1 é substituído com dois grupos hidroxila vicinais que estão presentes no sacarídeo capsular modificado. Em outras modalidades, as condições para clivagem oxidativa são selecionadas tais que somente uma proporção dos grupos hidroxila vicinais presentes nos grupos bloqueadores é convertida em grupos aldeído. Nestas modalidades, o número de grupos de aldeído produzidos depende do número total de grupos bloqueadores em que R1 é substituído com dois grupos hidroxila vicinais que estão presentes no sacarídeo capsular modificado e as condições selecionados. Em tais modalidades, prefere-se que 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ou 20% das unidades de monossacarídeo do sacarídeo capsular modificado tenham grupos bloqueadores que são convertidos em grupos aldeido. Por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 unidades de monossacarídeo tem grupos bloqueadores que são convertidos em grupos aldeido. Preferivelmente, entre 5-15%, mais preferivelmente 10%, das unidades de monossacarídeo têm grupos bloqueadores que são convertidos em grupos aldeido.
O esquema 3 mostra dois exemplos adicionais de como um sacarídeo capsular pode ser conjugado a uma proteína carreadora, de acordo com a presente invenção. No primeiro exemplo (lado da mão esquerda), todos os grupos bloqueadores têm um grupo R1 que é substituído com dois grupos hidroxila vicinais. Uma proporção (por exemplo, 10%) destes grupos hidroxila vicinais é convertida em grupos aldeido para conjugação a uma proteína. No segundo exemplo (lado da mão direita), dois tipos de grupo bloqueador estão presentes. Uma proporção destes (por exemplo, 10%) tem um R1 que é substituído com dois grupos hidroxila vicinais. Todos estes grupos hidroxila vicinais são convertidos em grupos aldeido para conjugação a uma proteína.
<figure> figure see orginal document page 36</figure> <figure>formula see original document page 37</figure>
Esquema 3
As proteínas carreadoras preferidas são toxinas ou toxóides bacterianos, tais como toxóides de difteria ou tétano. Estes são geralmente usados em vacinas conjugadas. O toxóide de difteria CRMi97 é particularmente preferido [2 9] . Outras proteínas carreadoras apropriadas incluem a proteína de membrana externa de N. meningitidis [30] , peptídeos sintéticos [31,32], proteínas de choque a calor [33,34], proteínas de coqueluche [35,36], proteína D de H. influenzae [37], citocinas [38], linfocinas [38], hormônios [38], fatores de crescimento [38], toxina A ou B de C.difficile [39], proteínas de captação de ferro [40] etc.
É possível usar misturas de proteínas carreadora.
Após a conjugação, os sacarídeos livres e conjugados podem ser separados. Há muitos métodos apropriados, incluindo cromatografia hidrofóbica, ultrafiltração tangencial, diafiltração etc. [veja também refs. 41, 42 etc . ] .
Uma única proteína carreadora pode carregar sacarídeos diferentes múltiplos [43].
Composições e métodos farmacêuticos
As composições feitas usando os métodos da invenção são farmaceuticamente aceitáveis. Podem incluir componentes além do sacarídeo modificado e/ou conjugado, por exemplo, tipicamente incluirão um ou mais carreadores farmacêuticos. Um discussão completa de tais componentes está disponível na referência 44 . Assim a invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo (a) um sacarídeo modificado da invenção e/ou um conjugado da invenção, e (b) um carreador farmaceuticamente aceitável. A composição é preferivelmente uma composição imunogênica (por exemplo, uma vacina). As vacinas baseadas em sacarídeos ou conjugados de sacarídeo- proteína são conhecidas na técnica.
As composições podem incluir um ou mais tampões. Os tampões típicos incluem: um tampão de fosfato; um tampão de Tris,· um tampão de borato; um tampão de succinato; um tampão de histidina; ou um tampão de citrato. Os tampões serão tipicamente incluídos na faixa 5-20 mM. Para controlar a tonicidade, prefere-se incluir um sal fisiológico, tal como um sal de sódio. O cloreto de sódio (NaCl) é preferido, que pode estar presente entre em 1 e 20 mg/ml. Outros sais que podem estar presentes incluem cloreto de potássio, fosfato de dihidrogênio potássio, dehidrato de fosfato disódio, cloreto de magnésio, cloreto de cálcio, etc.
As composições terão geralmente uma osmolaridade entre 200 mOsm/kg e 400 mOsm/kg, preferivelmente entre, 240-360 mOsm/kg, e cairá mais preferivelmente dentro da faixa de 290-310 mOsm/kg. A osmolaridade tem sido previamente relatada para não ter um impacto na dor causada pela vacinação [45] , mas manter a osmolaridade nesta faixa não obstante é preferida.
O pH de uma composição estará geralmente entre 5,0 e 80, e mais tipicamente entre 5,5 e 6,5, por exemplo, entre 6,5 e 7,5. Um processo da invenção pode portanto, incluir uma etapa de ajustar o pH do volume vacina antes de embalar A composição é preferivelmente estéril. A composição é preferivelmente não-pirogênica, por exemplo, contendo <1 UE (unidade de endotoxina, uma medida padrão) por dose, e preferivelmente <0,1 UE por dose. A composição é preferivelmente glúten livre.
A composição pode incluir um conservante, tal como tiomersal ou 2-fenoxietanol. Prefere-se, entretanto, que a vacina deva estar substancialmente livre de (isto é, menos do que 5 pg/ml) material com mercúrio, por exemplo, tiomersal-livre. As vacinas não contendo mercúrio são mais preferidas.
A composição pode incluir material para uma única imunização, ou pode incluir material para imunizações múltiplas (isto é, um kit ^multidose') . A inclusão de um conservante é preferida em arranjos multidose.
As vacinas são tipicamente administradas em um volume de dosagem de aproximadamente O,5 ml.
As composições são preferivelmente armazenadas entre em 20C e 8°C. Não devem ser congelados. Devem idealmente ser mantidas fora da luz direta.
Onde uma composição inclui um conjugado então pode também compreender a proteína carreadora não conjugada, mas prefere-se que a quantidade de carreador não conjugado relativo à quantidade total desse carreador é menos de 5%.
As composições da invenção são apropriadas para administração aos pacientes humanos, e a invenção fornece um método de aumentar uma resposta imune em um paciente, compreendendo a etapa de administrar tal composição ao paciente. A invenção também fornece as composições da invenção para uso como medicamento. A invenção também fornece o uso de um sacarídeo modificado e/ou de um conjugado da invenção, na fabricação de um medicamento para aumentar uma resposta imune em um paciente. A resposta imune aumentada por estes métodos e usos geralmente incluirão uma resposta de anticorpo, preferivelmente uma resposta de anticorpo protetora contra a infecção meningocócica. As doenças causadas por Neisseria incluem meningite, septicemia e gonorréia. A prevenção e/ou tratamento de meningite bacteriana é preferido.
As composições podem ser administradas em várias maneiras. A rota de imunização mais preferida é por injeção intramuscular (por exemplo, no braço ou perna), mas outras rotas disponíveis incluem injeção subcutânea, intranasal [46-48], oral [49], intradérmica [50,51], transcutânea, transdérmica [52], etc.
As composições preparadas de acordo com a invenção podem ser usadas para tratar crianças e adultos. 0 paciente pode ter menos de 1 ano de idade, 1-5 anos de idade, 5-15 anos de idade, 15-55 anos de idade, ou pelo menos 55 anos de idade. O paciente pode ser idoso (por exemplo, ≥50 anos de idade, preferivelmente ≥65 anos), os jovens (por exemplo, ≤ 5 anos de idade), pacientes hospitalizados, trabalhadores de cuidados médicos, serviço armado e pessoal militar, mulheres gravidas, pacientes cronicamente doentes, pacientes imunodeficientes, e pessoas que viajam ao externa. As composições não são apropriadas unicamente para estes grupos, entretanto, podem ser usadas mais geralmente em uma população.
O tratamento pode ser por uma programação de dose única ou por uma programação de dose múltipla. As doses múltiplas podem ser usadas em uma programação de imunização primária e/ou em uma programação de imunização de reforço.
Em uma programação de dose múltipla as várias doses podem ser dadas pela mesma ou diferentes rotas, por exemplo, principal parenteral e reforço mucosal, um principal mucosal e reforço parenteral, etc. A administração de mais de uma dose (tipicamente duas doses) é particularmente útil em pacientes imunologicamente desprotegidos. As doses múltiplas serão tipicamente administradas pelo menos com 1 semana de distância (por exemplo, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc. ) .
As composições da invenção podem ser administradas aos pacientes substancialmente no mesmo tempo que (por exemplo, durante a mesma consulta ou visita médica a um profissional de cuidados médicos) outras composições, e em particular ao mesmo tempo que outras vacinas.
As composições imunogênicas compreendem uma quantidade imunologicamente eficaz de antígeno de sacarídeo, assim como qualquer outro de outros componentes especificados, como necessário. Por "quantidade imunologicamente eficaz", significa que a administração dessa quantidade a um indivíduo, em uma única dose ou como parte de uma série, é eficaz para tratamento ou prevenção. Esta quantidade varia dependendo da saúde e condição física do indivíduo a ser tratado, idade, grupo taxonômico de indivíduo a ser tratado (por exemplo, primata não humano, primata, etc.), a capacidade do sistema imune do indivíduo para sintetizar anticorpos, o grau de proteção desejado, a formulação da vacina, a avaliação de tratamento do médico da situação médica, e outros fatores relevantes. Espera-se que a quantidade cairá em uma faixa relativamente ampla que possa ser determinada com os ensaios rotineiros. A dosagem de tratamento pode ser uma programação de dose única ou uma programação de dose múltipla (por exemplo, incluindo doses de reforço).
As vacinas de acordo com a invenção podem ser profiláticas (isto é, para prevenir a infecção) ou terapêuticas (isto é, para tratar a doença após infecção), mas serão tipicamente profiláticas. Adjuvantes
As composições da invenção podem vantajosamente incluir um adjuvante, que pode funcionar para melhorar as respostas imunes provocadas em um paciente que recebe a composição. Os adjuvantes que podem ser usados com a invenção incluem, mas não são limitados a:
- Uma composição contendo mineral, incluindo sais de cálcio e sais de alumínio (ou misturas dos mesmos). Os sais de cálcio incluem fosfato de cálcio (por exemplo, as partículas de CAP divulgadas na ref. 53) . Os sais de alumínio incluem hidróxidos, fosfatos, sulfatos, etc., com os sais tomando qualquer forma apropriada (por exemplo, gel, cristalina, amorfa, etc.) . A adsorção a estes sais é preferida. As composições contendo minerais podem também ser formuladas como uma partícula de sal de metal [54]. Os adjuvantes de sal de alumínio são descritos mais detalhadamente abaixo.
Uma emulsão óleo em água, como descrita mais detalhadamente abaixo.
- Um oligonucleotídeo imunoestimulatório, tal como um contendo uma porção CpG (uma seqüência de dinucleotídeo contendo uma citosina não metilada ligada por uma ligação de fosfato a uma guanosina), uma porção TpG [55], um RNA de fita dupla, um oligonucleotídeo contendo uma seqüência palíndroma, ou um oligonucleotídeo contendo uma seqüência poli(dG). Os oligonucleotídeos imunoestimulatórios podem incluir modificações/análogos de nucleotídeo, tais como modificações fósforotioato e podem ser fita dupla ou (exceto para RNA) fita simples. As referências 56 a 58 divulgam as substituições análogas possíveis, por exemplo, substituição de guanosine com 2'-deoxi-7-deazaguanosina. 0 efeito de adjuvante de oligonucleotídeos CpG é ainda discutido nas refs. 59-64. Uma seqüência CpG pode ser direcionada para TLR9, tal como a porção GTCGTT ou TTCGTT [65]. A seqüência CpG pode ser específica para induzir uma resposta imune de Thl, tal como um CpG-A ODN (oligodeoxinucleotídeo), ou pode ser mais específica para induzir uma resposta de célula B, tal como CpG-B ODN. CpG-A e CpG-B ODNs são discutidos nas refs. 66-68.
Preferivelmente, o CpG é um CpG-A ODN. Preferivelmente, o oligonucleotídeo CpG é construído de modo que a extremidade 5' seja acessível para o reconhecimento de receptor. Opcionalmente, duas seqüências de oligonucleotídeo CpG podem ser unidas em suas extremidades 3' para formar "imunômeros". Veja, por exemplo, as referências 65 e 69-71. Um adjuvante de CpG útil é CpG7909, também conhecido como ProMune™ (Coley Pharmaceutical Group, Inc.). Os oligonucleotídeos imunoestimulatórios tipicamente compreenderão pelo menos 20 nucleotídeos. Podem compreender menos de 100 nucleotídeos.
- Lipido A de monofosforil 3-0-desacilado ('3dMPL', também conhecido como 'MPL™') [72-75]. 3dMPL foi preparado de um mutante sem heptose de Salmonella minnesota, e é quimicamente similar ao lipido A, mas falta um grupo fosforil ácido-instável e um grupo acila base-instável. A preparação de 3dMPL foi originalmente descrita na referência 76. 3dMPL pode tomar a forma de uma mistura de moléculas relacionadas, variando por sua acilação (por exemplo, tendo 3, 4, 5 ou 6 cadeias acila, que podem ser de comprimentos diferentes). Os dois monossacarídeos de glucosamina (também conhecidos 2-deoxi-2-amino-glicose) como são N-acilados em seus carbonos de posição 2 (isto é, em posições 2 e 2'), e há também O-acilação na posição 3'.
- Um composto de imidazoquinolina, tal como Imiquimod ("R-83 7") [77,78], Resiquimod ("R-848") [79], e seus análogos; e sais dos mesmos (por exemplo, os sais de hidrocloreto). Detalhes adicionais sobre imidazoquinolinas imunoestimulatórias podem ser encontrados nas referências 80 a 84.
- Um composto de tiosemicarbazona, tal como aqueles divulgados na referência 85. Métodos de formulação, fabricação, e seleção para compostos ativos são descritos também na referência 85. As tiosemicarbazonas são particularmente eficazes na estimulação de células mononucleares sangüíneas periféricas humanas para a produção de citocinas, tais como TNF-a.
Um composto de triptantrina, tal como aqueles divulgados na referência 86. Os métodos de formulação, fabricação, e seleção para compostos ativos são descritos também na referência 86. As tiosemicarbazonas são particularmente eficazes na estimulação de células mononucleares sangüíneas periféricas humanas para a produção de citocinas, tais como TNF-a.
- Um análogo de nucleosídeo, tal como: (a) Isatorabina (ANA-24 5; 7-tia-8-oxoguanosina) :
<formula>formula see original document page 45</formula>
e pró-fármacos dos mesmos; (b) ANA975; (c) ANA-025-1; (d) ANA380; (e) os compostos divulgados nas referências 87 a 89; (f) um composto tendo a fórmula:
<formula>formula see original document page 46</formula>
em que:
R1 e R2 são cada um independentemente H, halo, -NRaRb/ -OH, alcóxi C1-6, alcóxi C1-6 substituído, heterociclila, heterociclila substituída, arila C6-10, arila C6-10 substituída, alquila C1-6, ou alquila C1-6 substituída;
R3 está ausente, H, alquila C1-6, alquila C1-6 substituída, arila C1-6 arila C6-10 substituída, heterociclila, ou heterociclila substituída;
R4 e R5 são cada um independentemente H, halo, heterociclila, heterociclila substituída, -C(O)-Rd, alquila C1-6, alquila C1.6 substituída, ou ligado junto para formar um anel de 5 mem-ros como em R4-5:
<formula>formula see original document page 46</formula>
a ligaçao senuo uunaeyuiud nas ligações indicadas por um
X1 e X2 são cada uma independentemente N, C, O, ou S;
R8 é H, halo, -OH, alquila C1-6, alquenila C2-6, alquinila C2-6, -OH, -NRaRb, -(CH2)n-O-Rc, -O- (C1-6 alquila), -S(O)p(R)e, OU -C(O)-Rd;
R9 é H, alquila C1-6, alquila C1-6 substituída, heterociclila, heterociclila substituída ou R9a, em que R9a é:
<formula>formula see original document page 46</formula> a ligação sendo conseguida na ligação indicada por um
R10 e Rn são cada um independentemente H, halo, C1-6 alcóxi, alcóxi C1-6 substituído, -NRaRb ou -OH;
cada Ra e Rb são independentemente H, alquila C1-6, alquila C1-5 substituída, -C(O)Rd, C6-10 arila;
cada Rc é independentemente H, fosfato, difosfato, trifosfato, alquila Cl-6, ou alquila C1-6 substituída;
cada Rd é independentemente H, halo, alquila C1-6, alquila C1-6 substituída, alcóxi C1-6, alcóxi C1-6 substituído, - NH2, -NH (alquila C1-6) , -NH(alquila C1-6 substituída), - N (alquila C1-6)2/ -N (alquila C1-6 substituída) 2, arila C6-10, ou heterociclila;
cada Re é independentemente H, alquila C1-6, alquila C1- 6 substituída, arila C6-10, arila C6-10 substituída, heterociclila, ou heterociclila substituída;
cada Rf é independentemente H, alquila C1-6, alquila C1- 6 substituída, -C(O)Rd, fosfato, difosfato, ou trifosfato; cada η é independentemente 0, 1, 2, ou 3;
cada ρ é independentemente 0, 1, ou 2; ou
(g) um sal farmaceuticamente aceitável de quaisquer de (a) a (f) , um tautômero de quaisquer de (a) a (f) , ou um sal farmaceuticamente aceitável do tautômero.
- Loxoribina (7-allil-8-oxoguanosina) [90] .
- Os compostos divulgados na referência 91, incluindo: compostos de acilpiperazina, compostos de indolediona, compostos de tetrahidraisoquinolina (THIQ), compostos de benzociclodiona, compostos de aminoazavinil, compostos de quinolinona aminobenzimidazol (ABIQ) [92,93], compostos de hidraptalamida, compostos de benzofenona, compostos de isoxazol, compostos de esterol, compostos de quinazilinona, compostos de pirrol [94], compostos de antraquinona, compostos de quinoxalina, compostos de triazina, compostos de pirazalopirimidina, e compostos de benzazol [95].
- Os compostos divulgados na referência 96, incluindo 3,4-di(lH-indol-3-il)-lH-pirrol-2,5-dionas, análogos de estaurosporina, piridazinas derivatizadas, cromen-4-onas, indolinonas, quinazolinas, e análogos de nucleosídeo.
- Um derivado de fosfato de glucosaminida aminoalquila, tal como RC-529 [97,98].
- Um fosfazeno, tal como poli[di(carboxilatofenóxi) fosfazeno] ("PCPP") como descrito, por exemplo, nas referências 99 e 100.
- Imunopotenciadores de molécula pequena (SMIPs) tais como:
N2-metil-l-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolina- 2,4-diamina,
N2,N2-dimetil-l-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4,5- c]quinolina-2,4-diamina
N2-etil-N2-metil-l-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4,5- c]quinolina-2,4-diamina
N2-metil-l-(2-metilpropil)-N2-IH-imidazo[4,5- c]quinolina-2,4-diamina
1-(2-metilpropil)-N2-propil-lH-imidazo[4,5- c]quinolina-2,4-diamina
N2-butil-l-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolina- 2,4-diamina
N2-butil-N2-metil-l-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4,5-c] quinolina-2,4-diamina
N2-metil-l-(2-metilpropil)-N2-pentil-IH-imidazo[4,5-c] quinolina-2,4-diamina
N2-metil-l-(2-metilpropil)-N2-prop-2-enil-lH-iraidazo [4,5-c]quinolina-2,4-diamina
1-(2-metilpropil)-2 [ (fenilmetil)tio]-lH-imidazo[4 , 5-c] quinolin-4-amina
1-(2-metilpropil)-2-(propiltio)-lH-imidazo[4 , 5-c] quinolin-4-amina
2-[[4-amino-l-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4,5-c] quinolin-2-il] (metil)amino]etanol
acetato de 2-[[4-amino-l-(2-metilpropil)-IH- imidazo[4,5-c] quinolin-2-il](metil)amino]etila
4-amino-l-(2-metilpropil)-1,3-dihidro-2H-imidazo[4,5-c] quinolin-2-ona
N2-butil-l-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-IH- imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina
N2-but i1-N2-me t i1-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis (fenilmetil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina
N2-metil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-IH- imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina
N2 , N2-dimetil-l-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil) -lH-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina
1-{4-amino-2-[metil(propil)amino]-IH-imidazo[4, 5-c] - il} -2-metilpropan-2-ol
1-{4-amino-2-(propilamino)-lH-imidazo[4,5-c]quinolin- 1-il}-2-metilpropan-2-ol
N4 , N4-dibenzil-1-(2-metóxi-2-metilpropil)-N2-propil- IH-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina.
Saponinas [capítulo 22 da ref. 131], que são um grupo heterólogo de glicosídeos de esterol e glicosídeos de triterpenóide que são encontrados na casca, folhas, caules, raízes e mesmo flores de uma variedade ampla de espécies de planta. A saponina da casca da árvore Molina Quillaia saponaria foi amplamente estudada como adjuvante. A saponina pode também ser comercialmente obtida de Smilax ornata (salsaparrilha), Gypsophilla paniculata (véu de noiva) , e Saponaria officianalis (raiz de sabão) . As formulações de adjuvante saponina incluem formulações purificadas, tais como QS21, assim como formulações de lipídio, tais como [SCOMs QS2] é comercializado como Stimulon™. As composições de saponina foram purificadas usando HPLC e RP-HPLC. As frações purificadas específicas usando estas técnicas foram identificadas, incluindo QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B e QH-C. Preferivelmente, a saponina é QS21. Um método de produção de QS21 é divulgado na referência. 101. As formulações de saponina podem também compreender um esterol, tal como coleesterol [102].
As combinações de saponinas e colesteróis podem ser usadas para formar as partículas originais chamadas complexos imunoestimulantes (ISCOMs) [capítulo 23 da ref.
131] . ISCOMs tipicamente também incluem um fosfolipídio, tal como fosfatidiletanolamina ou fosfatidilcolina. Qualquer saponina conhecida pode ser usada em ISCOMs. Preferivelmente, o ISCOM inclui um ou mais de QuilA, QHA e QHC. ISCOMs são ainda descritos nas refs. 102-104.
Opcionalmente, o ISCOMS pode ser desprovido de detergente adicional [105]. Uma revisão do desenvolvimento de adjuvantes à base de saponina pode ser encontrada nas refs. 106 e 107.
- As toxinas ADP-ribosilantes bacterianas (por exemplo, enterotoxina instável ao calor E.coli "LT", toxina de cólera "CT", ou toxina de coqueluche »pt") e derivados desintoxicados das mesmas, tais como as toxinas mutantes conhecidas como LT-K63 e LT-R72 [108] . O uso de toxinas ADP-ribosilantes desintoxicadas como adjuvantes mucosos é descrito na ref. 109 e como adjuvantes parenterais na ref. 110 .
- Bioadesivos e mucoadesivos, tais como microsferas de ácido hialurônico esterifiçadas [111] ou quitosana e seus derivados [112].
- As micropartículas (isto é, uma partícula de -IOOnm a ~150μιη em diâmetro, mais preferivelmente ~200nm a ~30pm em diâmetro, ou ~500nm a -IOpm em diâmetro) formadas dos materiais que são biodegradáveis e não tóxicos (por exemplo, um ácido poli(α-hidróxi), um ácido polihidróxibutírico, um poliortoéster, um polianidrido, uma policaprolactona, etc.), com poli(lactida-co-glicolida) sendo preferida, opcionalmente tratada para ter uma superfície negativamente carregada (por exemplo, com SDS) ou uma superfície positivamente carregada (por exemplo, com um detergente catiônico, tal como CTAB).
Lipossomas (Capítulos 13 e 14 da ref. 131) . Os exemplos de formulações de lipossoma apropriadas para uso como adjuvantes são descritas nas refs. 113-115.
- Éteres de polioxietileno e ésteres de polioxietileno [116]. Tais formulações adicionais incluem tensoativos de éster de sorbitano polioxietileno em combinação com um octoxinol [117] assim como éteres de alquil polioxietileno ou tensoativos de éster em combinação com pelo menos um tensoativo não iônico adicional, tal como um octoxinol [118]. Os éteres de polioxietileno preferidos são selecionados do seguinte grupo: éter de polioxietileno-9- lauril (lauret 9), éter de polioxietileno-9-esteoril, éter de polioxietileno-8-esteoril, éter de polioxietileno-4- lauril, éter de polioxietileno-35-lauril, e éter de polioxietileno-23-lauril.
- Peptideos de muramil, tais como N-acetilmuramil-L- treonil-D-isoglutamina ("thr-MDP"), N-acetil-normuramil-L- alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilglucsaminil-N- acetilmuramil-L-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitóxi propilamida ("DTP-DPP", ou "Teramida™"), N-acetilmuramil-L-alanil-D- isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'dipalmitoil-sn-glicero-3- hidróxifosforilóxi)-etilamina ("MTP-PE").
Uma preparação de proteossoma de proteína de membrana externa preparada de uma primeira bactéria Gram- negativa em combinação com uma preparação de lipossacarideo (LPS) derivada de uma segunda bactéria Gram-negativa, em que o proteossoma de proteína de membrana externa e preparações de LPS forma um complexo adjuvante não covalente estável. Tais complexos incluem "IVX- 908", um complexo compreendido de membrana externa de Neisseria meningitidis e LPS.
- 5'-monofosfato de metil inosina ("MIMP") [119].
- Um composto de pirrolizidina polihidroxilada [120], tal como um tendo a fórmula:
onde R é selecionado do grupo compreendendo grupos hidrogênio, reta ou ramificada, não substituído ou substituído, saturado ou insaturado acila, alquila (por exemplo, cicloalquila), alquenila, alquinila e arila, ou um sal ou derivado farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Os exemplos incluem, mas não são limitados a: casuarina, casuarina-6-α-D-glucopiranose, 3-epi-casuarina, 7-epi- casuarina, 3,7-diepi-casuarina, etc.
- Uma gama inulina [121] ou derivado da mesma, tais como algamulina.
Um composto de fórmula I, II ou III, ou um sal do mesmo:
<formula>formula see original document page 53</formula>
como definido na referência 122, tais como 1ER 803058', xER 803732', * ER 804053', sER 804058', iER 804059', iER 804442', vER 804680', iER 804764', vER 803022' ou vER 804 057' por exemplo:
<formula>formula see original document page 53</formula> <formula>formula see original document page 54</formula>
- Derivados de lipídio A de Escherichia coli, tal como OM-174 (descrito nas refs. 123 e 124).
- Uma formulação de um lipídio catiônico e co-lipídio (geralmente neutro), tal como aminopropil-dimetil- miristoleiloxi-propanamínio brometo-difitanoilfosfatidil- etanolamina ("Vaxfectin™") ou aminopropil-dimetil-bis- dodeciloxi-propanamínio brometo-dioleoiIfosfatidil- etanolamina ("GAP-DLRIE: DOPE"). Formulações contendo sais de ( ± )-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(syn-9- tetradeceneiloxi)-1-propanamínio são preferidos [125] .
Os compostos contendo lipídios ligados a uma estrutura principal acíclica contendo fosfato, tal como TLR4 antagonista E5564 [126,127]:
<formula>formula see original document page 54</formula>
Estas e outras substâncias ativas adjuvantes são discutidas mais detalhadamente nas referências 131 e 132.
As composições podem incluir dois ou mais dos referidos adjuvantes.
Os antígenos e adjuvantes em uma composição estarão tipicamente em mistura. Adjuvantes de emulsão óleo em água
As emulsões óleo em água são particularmente úteis como adjuvantes. Várias tais emulsões são conhecidas, e incluem tipicamente pelo menos um óleo e pelo menos um tensoativo, com o(s) óleo(s) e tensoativo(s) sendo biodegradáveis (metabolisáveis) e biocompativeis. As gotas de óleo na emulsão são geralmente menos de 5μπι em diâmetro, e podem mesmo ter um diâmetro de submicron, com estes tamanhos pequenos sendo conseguidos com um microfluidizador para fornecer emulsões estáveis. As gotas com um tamanho menor do que 22Onm são preferidas enquanto podem ser submetidas à ésterilização de filtro.
A invenção pode ser usada com óleos, tais como aqueles de uma fonte animal (como peixes) ou vegetal. As fontes para óleos vegetais incluem frutos secos, sementes e grãos. O óleo de amendoim, óleo de soja, óleo de coco, e óleo de oliva, os mais geralmente disponíveis, exemplificam os óleos de fruto seco. 0 óleo de jojoba pode ser usado, por exemplo, obtido da fava de jojoba. Os óleos de semente incluem óleo de girassol, óleo de semente de algodão, óleo de semente de girassol, óleo de semente de gergelim e semelhantes. No grupo de grão, o óleo de milho é o mais prontamente disponível, mas o óleo de outros grãos de cereal tais como trigo, aveia, centeio, arroz, teff, triticalo e semelhantes pode também ser usados. 6-10 Os ésteres de ácido graxo de carbono de glicerol e 1,2- propanodiol, ao não ocorrer naturalmente em óleos de semente, podem ser preparados por hidrólise, separação e esterificação dos materiais de partida apropriados dos óleos de fruto seco e semente. As gorduras e óleos do leite mamífero são metabolizáveis e podem portanto ser usados na prática desta invenção. Os procedimentos para separação, purificação, saponificação e outros meios necessários para obter óleos puros das fontes animais são conhecidos na técnica. A maioria de peixes contém óleos metabolizáveis que podem prontamente ser recuperados. Por exemplo, óleo de fígado de bacalhau, óleos de fígado de tubarão, e óleo de baleia, tal como espermacete exemplificam diversos dos óleos de peixes que podem ser usados aqui. Vários óleos de cadeia ramificados são sintetizados bioquimicamente em 5 unidades de isopreno de 5-carbono e são geralmente referidas como terpenóides. O óleo de fígado de tubarão contém terpenóides ramificados, insaturados conhecidos como escaleno, 2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22- tetracosahexaeno, que é particularmente preferido aqui. 0 escalano, o análogo saturado ao escaleno, é também um óleo preferido. Os óleos de peixes, incluindo escaleno e escalano, estão prontamente disponíveis das fontes comerciais ou podem ser obtidos por métodos conhecidos na técnica. Outros óleos preferidos são os tocoferóis (veja abaixo). As misturas de óleos podem ser usadas.
Os tensoativos podem ser classificados por seu 'HLB' (balanço hidrófilo/lipofílico). Os tensoativos preferidos da invenção têm um HLB de pelo menos 10, preferivelmente pelo menos 15, e mais pref erivelmente pelo menos 16. A invenção pode ser usada com tensoativos incluindo, mas não limitados a: tensoativos de ésteres de sorbitano polioxietileno (geralmente referidos como Tweens), especialmente polisorbato 20 e polisorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propilene (PO), e/ou óxido de butileno (BO) , vendido sob o nome comercial de DOWFAX™, tal como copolímeros bloco EO/PO lineares; octoxinóis, que podem variar no número de grupos etóxi repetidos (oxi-1,2-etanodiil), com octoxinol-9 (Triton X- 100, ou t-octilfenóxipolietóxietanol) sendo de interesse particular; (octilfenóxi)polietóxietanol (IGEPAL CA-630/NP- 40); fosfolipídios, tais como fosfatidilcolina (Iecitina); éteres graxos de polioxietileno derivados dos álcoois lauril, cetil, estearil e oleil (conhecidos como tensoativos de Bri j) , tais como éter de monolauril trietilenoglicol (Brij 30) ; e ésteres de sorbitano (geralmente conhecidos como os SPANs) , tais como trioleato de sorbitano (Span 85) e monolaurato de sorbitano. Os tensoativos preferidos para incluir na emulsão são Tween 8 0 (monooleato de sorbitano polioxietileno), Span 85 (trioleato de sorbitano), lecitina e Triton X-100. As misturas de tensoativos podem ser usadas, por exemplo, misturas de Tween 80/Span 85.
Os adjuvantes de emulsão óleo em água específicos úteis com a invenção incluem, mas não são limitados a:
- Uma emulsão submícron de escaleno, Tween 80, e Span 85. A composição da emulsão por volume pode ser aproximadamente 5% de escaleno, aproximadamente 0,5% de polisorbato 80 e aproximadamente 0,5% de SPANs 85. Em termos de peso, estas razões se tornaram 4,3% de escaleno, 0,5% de polisorbato 80 e 0,48% de SPANs 85. Este adjuvante é conhecido como 'MF59' [128-130], como descrito mais detalhadamente no capítulo 10 da ref. 131 e capítulo 12 da ref. 132. A emulsão MF59 inclui vantajosamente íons de citrato, por exemplo, 10 mM de tampão de citrato de sódio. - Uma emulsão de escaleno, um tocoferol, e Tween 80. A emulsão pode incluir solução salina tamponada de fosfato. Pode também incluir Span 85 (por exemplo, em 1%) e/ou lecitina. Estas emulsões podem ter de 2 a 10% de escaleno, de 2 a 10% de tocoferol e de 0,3 a 3% de Tween 80, e a razão de peso de escaleno:tocoferol é preferivelmente <1, pois isto fornece uma emulsão mais estável. Tal emulsão pode ser feita dissolvendo Tween 80 em PBS para dar uma solução de 2%, misturando então 90ml desta solução com uma mistura de (5g de DL-α-tocoferol e 5ml de escaleno) , microfluidizando então a mistura. A emulsão resultante pode ter gotas de óleo de submxcrons, por exemplo, com um diâmetro médio entre 100 e 250nm, preferivelmente aproximadamente 18 0nm.
- Uma emulsão de escaleno, um tocoferol, e um detergente Triton (por exemplo, Triton X-100).
- Uma emulsão de escalano, polisorbato 80 e poloxâmero 401 ("Pluronic™ L121"). A emulsão pode ser formulada em solução salina tamponada de fosfato, pH 7,4. Esta emulsão é
2 0 um veículo de liberação útil para dipeptídeos de muramil, e tem sido usada com treonil-MDP no adjuvante "SAF-1" [133] (0,05-1% Thr-MDP, 5% de escalano, 2,5% de Pluronic L121 e 0,2% de polisorbato 80). Pode também ser usado sem o Thr- MDP, como no adjuvante "AF" [134] (5% de escalano, 1,25%
25 Pluronic L121 e 0,2% polisorbato 80). A microfluidização é preferida.
- Uma emulsão tendo de 0,5-50% de um óleo, 0,1-10% de um fosfolipidio, e 0,05-5% de um tensoativo não iônico. Como descrito na referência 13 5, os componentes de
30 fosfolipídio preferidos são fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, esfingomielina e cardiolipina. Os tamanhos de gota de submícrons são vantaj osos.
- Uma emulsão óleo em água submícron de um óleo não metabolisável (tal como óleo mineral leve) e pelo menos um tensoativo (tal como lecitina, Tween 80 ou Span 80) . Os aditivos podem ser incluídos, tais como QuilA saponina, colesterol, um conjugado de saponina-lipófilo (tal como GPI-0100, descrito na referência 136, produzido pela adição de amina alifática à desacilsaponina através do grupo carboxila de ácido glucurônico), brometo de dimetiidioctadecilamônio e/ou N,N-dioctadecil-N,N-bis(2 - hidróxietil)propanodiamina.
- Uma emulsão em que uma saponina (por exemplo, QuilA ou QS21) e um esterol (por exemplo, um colesterol) são associados como micelas helicoidais [137].
As emulsões podem ser misturadas com o antígeno extemporaneamente, no momento da liberação. Assim o adjuvante e antígeno podem ser mantidos separadamente em uma vacina empacotada ou distribuída, pronta para formulação final no momento de uso. 0 antígeno estará geralmente em uma forma aquosa, tal que a vacina é finalmente preparada misturando dois líquidos. A razão de volume dos dois líquidos para misturar pode variar (por exemplo, entre 5:1 e 1:5), mas é geralmente aproximadamente 1:1.
Adjuvantes de sal de alumínio
Os adjuvantes conhecidos como hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio podem ser usados. Estes nomes são convencionais, mas são usados para conveniência somente, como nenhum é uma descrição precisa do composto químico real que está presente (por exemplo, veja o capítulo 9 da referência 131) . A invenção pode usar quaisquer dos adjuvantes de "hidróxido" ou "fosfato" que estão em uso geral como adjuvantes.
Os adjuvantes conhecidos como "hidróxido de alumínio" são sais tipicamente de oxihidróxido de alumínio, que são geralmente pelo menos parcialmente cristalinos. 0 oxihidróxido de alumínio, que pode ser representado pela fórmula AlO(OH), pode ser distinto de outros compostos de alumínio, tais como hidróxido de alumínio Al(OH)3, por espectroscopia de infravermelho (IR), em particular pela presença de uma banda de adsorção em 1070cm_1 e um sobreposição forte em 3090-3100CTTT1 [capítulo 9 da ref . 131] . O grau de cristalinidade de um adjuvante de hidróxido de alumínio é refletido pela largura da banda de difração na meia altura (WHH), com partículas fracamente cristalinas mostrando maior alargamento de linha devido aos tamanhos de cristalito menores. A área de superfície aumenta enquanto WHH aumenta, e os adjuvantes com valores mais elevados de WHH foram vistos por ter maior capacidade para adsorção de antígeno. Uma morfologia fibrosa (por exemplo, como visto em micrografia de eletrônica de transmissão) é típica para adjuvantes de hidróxido de alumínio. O pi de adjuvantes de hidróxido de alumínio é tipicamente aproximadamente 11, isto é, o próprio adjuvante tem uma carga de superfície positiva em pH fisiológico. As capacidades adsorptivas entre 1,8-2,6 mg de proteína por mg Al+++ em pH 7,4 foram relatadas para adjuvantes de hidróxido de alumínio. Os adjuvantes conhecidos como "fosfato de alumínio" são tipicamente hidróxifosfatos de alumínio, freqüentemente também contendo uma pequena quantidade de sulfato (isto é, sulfato de hidróxifosfato de alumínio) . Podem ser obtidos por precipitação, e as condições de reação e concentrações durante a precipitação influenciam o grau de substituição de fosfato por hidroxila no sal. Os hidróxifosfatos têm geralmente uma razão molar P04/A1 entre 0,3 e 1,2. Os hidróxifosfatos podem ser distintos de AlPO4 estrito pela presença de grupos hidroxila. Por exemplo, uma banda de espectro de IR em 3164cm"1 (por exemplo, quando aquecido a 200°C) indica a presença de hidroxilas estruturais [cap.9 da ref . 131] .
A razão molar de P04/A13+ de um adjuvante de fosfato de alumínio estará geralmente entre 0,3 e 1,2, preferivelmente entre 0,8 e 1,2, e mais preferivelmente 0,95+0,1. O fosfato de alumínio será geralmente amorfo, particularmente para sais de hidróxifosfato. Um adjuvante típico é hidróxifosfato de alumínio amorfo com razão molar de P04/Al entre 0,84 e 0,92, incluído em 0, 6mg Al3+/ml. 0 fosfato de alumínio será geralmente particulado (por exemplo, morfologia tipo placa como visto em micrografias de eletrônica de transmissão). Os diâmetros típicos das partículas estão na faixa de 0,5-20pm (por exemplo, aproximadamente 5-10μm) após qualquer adsorção de antígeno.
As capacidades adsorptivas entre 0,7-1,5 mg de proteína por mg de Al+++ em pH 7,4 foram relatadas para adjuvantes de fosfato de alumínio.
0 ponto de carga zero (PZC) de fosfato de alumínio é inversamente relacionado ao grau de substituição de fosfato para hidroxila, e este grau de substituição pode variar dependendo das condições de reação e concentração de reagentes usados preparando o sal por precipitação. PZC é também alterado mudando a concentração de Ions fosfato livres em solução (mais fosfato é associado com um PZC mais ácido) ou adicionando um tampão, tal como um tampão de histidina (torna PZC mais básico). Os fosfatos de alumínio usados de acordo com a invenção terão geralmente um PZC entre 4,0 e 7,0, mais preferivelmente entre 5,0 e 6,5, por exemplo aproximadamente 5,7.
As suspensões de sais de alumínio usadas para preparar as composições da invenção podem conter um tampão (por exemplo, um tampão de fosfato ou um de histidina ou um de Tris) , mas isto não é sempre necessário. As suspensões são preferivelmente estéreis e livres de pirogênio. Uma suspensão pode incluir os íons de fosfato aquosos livres, por exemplo, presentes em uma concentração entre 1,0 e 2 0 mM, preferivelmente entre 5 e 15 mM, e mais preferivelmente aproximadamente 10 nM. As suspensões podem também compreender cloreto de sódio.
A invenção pode usar uma mistura de ambos um hidróxido de alumínio e um fosfato de alumínio. Neste caso pode haver mais fosfato de alumínio do que hidróxido, por exemplo, uma razão de peso de pelo menos 2:1, por exemplo, >5:1, .>6:1, >7:1, >8:1, >9:1, etc.
A concentração de Al+++ em uma composição para administração a um paciente é preferivelmente menos do que lOmg/ml, por exemplo, 5 mg/ml, 4 mg/ml, 3 mg/ml, 2 mg/ml, 1 mg/ml, etc. Uma faixa preferida está entre 0,3 e 1 mg/ml.
Antígenos adicionais Assim como sacarídeos e/ou conjugado modificados, a composição pode compreender componentes antigênicos adicionais. Por exemplo, a composição pode incluir um ou mais sacarídeos adicionais (mesmo se modificados de acordo com a invenção). Por exemplo, a composição pode compreender sacarídeos de sorogrupos C, W135 e Y de N. meningitidis (por exemplo, além de um sacarídeo MenA modificado) . Estes serão tipicamente conjugados às proteínas carreadoras, e sacarídeos dos diferentes sorogrupos de N. meningitidis podem ser conjugados às mesmas ou proteínas carreadoras diferentes. Onde uma mistura compreende sacarídeos capsulares dos sorogrupos Ae C, prefere-se que a razão (peso/peso) de sacarídeo MenA:sacarídeo de MenC seja maior que 1 (por exemplo 2:1, 3:1, 4:1, 5:1; 10:1 ou maior). A imunogenicidade melhorada do componente MenA tem sido observada quando está presente em excesso (massa/dose) ao componente MenC [13 8].
A composição pode também compreender antígenos de proteína.
Os antígenos que podem ser incluídos na composição da invenção incluem:
um antígeno de proteína de sorogrupo B de N. meningitidis (veja abaixo).
- uma preparação de vesícula de membrana externa (OMV) de N. meningitidis, tal como aquelas divulgadas nas refs. 139, 140, 141, 142 etc.
- antígenos de Helicobacter pylori, tais como CagA [143 a 146], VacA [147, 148], NAP [149, 150, 151], HopX [por exemplo, 152], HopY [por exemplo, 152] e/ou urease.
- um antígeno de sacarídeo de Streptococcus pneumoniae [por exemplo, 153, 154, 155].
- um antígeno de vírus de hepatite A, tal como vírus inativado [por exemplo, 156, 157] .
um antígeno de vírus de hepatite B, tal como antígenos de superfície e/ou núcleo [por exemplo 157, 158] .
- um antígeno de vírus de hepatite C [por exemplo,159] .
- um antígeno acelular de Bordetella pertussis, tal como holotoxina de coqueluche (PT) e hemaglutinina filamentosa (FHA) de B.pertussis, opcionalmente também em combinação com pertactina e/ou aglutinonênios 2 e 3 [por exemplo, refs. 160 e 161] .
- um antígeno de Bordetella pertussis celular. um antígeno de dif teria, tal como um toxóide de difteria [por exemplo, capítulo 3 da ref. 162], por exemplo, o mutante CRMx97 [por exemplo, 163] .
- antígenos de poliomielite [por exemplo, 164, 165] tais como o vírus de poliomielite inativado (IPV).
- um antígeno de tétano, tal como um toxóide de tétano [por exemplo, capítulo 4 da ref. 162] .
- um antígeno de sacarídeo de Haemophilus influenzae B [por exemplo, refs. 166 a 174].
antígenos de sarampo, caxumba e/ou rubéola [por exemplo, capítulos 9, 10 e 11 da ref. 162] .
- um antígeno de N. gonorrhoeae.
- um antígeno de Clamydia pneumoniae [por exemplo, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181].
- um antígeno de Clamydia trachomatis [por exemplo,182] .
- um antígeno de Porphyromonas gingivalis [por exemplo, 183] .
- antígeno(s) de raiva [por exemplo, 184] tais como vírus inativado liofilizado [por exemplo, 185, RabAvert™].
- antígeno(s) de gripe [por exemplo, 19 da ref. 162], tal como proteínas de superfície de hemaglutinina e/ou neuraminidase.
- um antígeno de Moraxella catarrhalis [por exemplo, 186] .
um antígeno de Streptococcus agalactiae (Streptococcus de grupo B) [por exemplo 187, 188] .
- um antígeno de sacarídeo de Streptococcus agalactiae (streptococcus de grupo B).
- um antígeno de Streptococcus pyogenes (streptococcus de grupo A) [por exemplo, 188, 189, 190] .
- um antígeno de Staphylococcus aureus [por exemplo, 191] .
- um antígeno de Bacillus anthracis [por exemplo, 192, 193, 194] .
- um antígeno de vírus de herpes simplex (HSV). Um antígeno de HSV preferido para uso com a invenção é glicoproteína de membrana gD. Prefere-se usar gD de uma cepa HSV-2 (antígeno 'gD2') . A composição pode usar uma forma de gD em que a região de ancoramento de membrana C- terminal foi deletada [195], por exemplo, um gD truncado compreendendo aminoácidos 1-306 da proteína natural com adição de aparagina e glutamina no C-terminal. Esta forma de proteína inclui o peptídeo de sinal que é clivado para render uma proteína de aminoácido 283 madura. A deleção do ancoramento permite a proteína ser preparada na forma solúvel. um antígeno de papilomavírus humano (HPV). Os antígenos de HPV preferidos para uso com a invenção são proteínas de capsídeo LI, que podem montar para formar estruturas conhecidas como partículas tipo vírus (VLPs). Os VLPs podem ser produzidos pela expressão recombinante de Ll em células de levedura (por exemplo, em S.cerevisiae) ou em células de inseto (por exemplo, em células de Spodoptera, tais como S.frugiperda, ou em células de Drosophila) . Para células de levedura, os vetores de plasmídeo podem carregar o(s) gene(s) de LI; para células de inseto, os vetores de baculovírus podem carregar o(s) gene(s) de LI. Mais preferivelmente, a composição inclui Ll VLPs das cepas de HPV-16 e HPV-18. Esta combinação bivalente foi mostrada por ser altamente eficaz [196]. Além das cepas de HPV-16 e HPV- 18, é também possível incluir Ll VLPs de cepas HPV-6 e HPV- 11. O uso de cepas de HPV oncogênicas é também possível. Uma vacina pode incluir entre 20-60pg/ml (por exemplo, aproximadamente 4 0pg/ml) de Ll por cepa de HPV.
um antígeno de um vírus na família flaviviridae (gênero flavivirus), tal como vírus da febre amarela, vírus da encefalite japonesa, quatro sorotipos de vírus da Dengue, vírus da encefalite do carrapato, vírus do Oeste do Nilo.
- um antígeno de pestivirus, tal como de vírus da febre suína clássico, vírus da diarréia viral bovina, e/ou vírus da doença de fronteira.
um antígeno de parvovírus, por exemplo, de parvovírus B19.
- uma proteína de príon (por exemplo, proteína de príon CJD)
- uma proteína amilóide, tal como um beta peptídeo [197]
- um antígeno de câncer, tal como aqueles listados na Tabela 1 da ref. 198 ou nas tabelas 3 e 4 da ref. 199.
A composição pode compreender um ou mais destes antigenos adicionais.
Os antigenos de proteína tóxicos podem ser desintoxicados se necessário (por exemplo, desintoxicação de toxina de coqueluche por meios químicos e/ou genéticos [161] ) .
Onde um antígeno de difteria é incluído na composição prefere-se também incluir antígeno de tétano e antigenos de coqueluche. Similarmente, onde um antígeno de tétano é incluído prefere-se também incluir antigenos de difteria e de coqueluche. Similarmente, onde um antígeno de coqueluche é incluído prefere-se também incluir antigenos de difteria e de tétano.
Os antigenos podem ser adsorvidos a um sal de alumínio.
Os antigenos na composição estarão tipicamente presentes em uma concentração de pelo menos lpg/ml cada um.
Geralmente, a concentração de qualquer antígeno dado será suficiente para provocar uma resposta imune contra esse antígeno.
Como uma alternativa para usar antigenos de proteínas na composição da invenção, o ácido nucleico codificando o antígeno pode ser usado [por exemplo, refs. 200 a 208]. Os componentes de proteína das composições da invenção podem assim ser substituídos pelo ácido nucleico (preferivelmente DNA, por exemplo, na forma de um plasmídeo) codificando a proteína.
Antigenos meningocócicos não sacarídeos Embora os sacarídeos capsulares de sorogrupos meningocócicos A, C, W135 e Y podem ser usados para gerar imunidade protetora, a mesma abordagem não trabalhou para o sorogrupo B. Assim os sacarídeos e conjugados modificados da invenção podem ser usados juntos (por exemplo, separadamente ou em mistura) com antígenos meningocócicos que não são baseados em sacarídeos capsulares, por exemplo, antígenos de proteína, lipopolissacarídeos, ou vesículas de membrana.
As seqüências de genoma para sorogrupos meningocócicos A [209] e B [210,211] foram relatadas, e antígenos de proteína apropriados podem ser selecionados dos polipeptídeos codificados [por exemplo, refs. 212-217]. Os antígenos de candidato foram manipulados para melhorar a expressão heteróloga [refs. 218 a 220] .
Uma composição preferida inclui uma proteína Tbp e uma proteína Hsf [221]. Hsf é uma proteína autotransportadora [222-224] , também conhecida como nhhA [224] , GNA0992 [212] ou NMB0992 [210] . Tbp é a proteína de ligação de transferrina [225-228] , e engloba TbpA e TbpB e as formas de alto peso molecular e baixo peso molecular de TbpA e TbpB. Tbp engloba proteínas individuais descritas acima e complexos das proteínas e quaisquer outras proteínas ou complexos das mesmas capazes de ligar transferrina. Embora Tbp possa referir às formas moleculares de alto e baixo peso molecular de TbpA ou TbpB, é preferido que ambas as formas de peso molecular alto e peso molecular baixo de TbpA e/ou TbpB estejam presentes. Mais preferivelmente, TbpA de peso molecular alto e peso molecular baixo está presente. Outra composição preferida inclui pelo menos um antígeno selecionado de cada um de pelo menos duas categorias diferentes de proteína tendo funções diferentes dentro da Neisseria. Os exemplos de tais categorias de proteínas são: adesinas, proteínas autotransportadoras, toxinas, proteínas de membrana externas integrais e proteínas de aquisição de ferro. Estes antígenos podem ser selecionados como segue, usando a nomenclatura de referência 229: pelo menos uma adesina de Neisseria selecionada do grupo consistindo de FhaB, NspA PiIC, Hsf, Hap, MafA, MafB, Omp26, NMB0315, NMB0995, NMB1119 e NadA; pelo menos um autotransportador de Neisserial selecionado do grupo consistindo de Hsf, Hap, protease de IgA, AspA, e NadA; pelo menos uma toxina de Neisserial selecionada do grupo consistindo de FrpA, FrpC, FrpA/C, VapD, NM-ADPRT (NMB134 3) e um ou outro ou ambos LPS imunotipo L2 e LPS imunotipo L3; pelo menos uma proteína de aquisição de Fe de Neisserial selecionada do grupo consistindo de TbpA, TbpB, LbpA, LbpB, HpuA, HpuB, Lipo28 (GNA2132), Sibp, NMB0964, NMB0293, FbpA, Bcp, BfrA, BfrB e P2086 (XthA) ; pelo menos uma proteína associada à membranade Neisserial, preferivelmente proteína de membrana externa, particularmente proteína de membrana externa integral, selecionada do grupo consistindo de PilQ, OMP85, FhaC, NspA, TbpA, LbpA, TspA, TspB, TdfH, PorB, MItA, HpuB, HimD, HisD, GNAl8 7 0, OstA, HlpA (GNA1946), NMB1124, NMB1162, NMB1220, NMB1313, NMB1953, HtrA, e PLDA (OMPLA). Estas combinações de antígenos de Neisserial são ditas conduzir a uma melhora surpreendente da eficácia da vacina contra infecção de Neisserial [229] . As composições particularmente preferidas incluem um ou mais dos seguintes cinco antígenos [230]: (1) uma proteína iNadA', preferivelmente na forma oligomérica (por exemplo, na forma trimérica); (2) uma proteína v741'; (3) uma proteína v936'; (4) uma proteína %953'; e (5) uma proteína x287'.
4NadA' (adesina A de Neisserial) de MenB é divulgado como a proteína '961' na referência 215 (ID. de SEQs. 2943 e 2944) e como ,NMB1994' na referência 210 (veja também o GI de acesso de GenBank: 11352904 e 7227256). Um estudo detalhado da proteína pode ser encontrado na referência 231. Quando usado de acordo com a presente invenção, NadA pode tomar várias formas. As formas preferidas de NadA são variantes de truncamento ou deleção da seqüência tipo selvagem, tal como aquelas divulgadas nas referências 218 a 220. Em particular, NadA sem seu ancoramento de membrana C- terminal é preferido (por exemplo, deleção de resíduos 351- 405 para a cepa 2996).
A proteína (741' de MenB é divulgada na referência 215 (ID. de SEQs. 2535 e 2536) e como vNMB 1870' na referência 210 (veja também número de acesso de GenBank: 7227128). A proteína correspondente no sorogrupo A [209] tem o número de acesso de GenBank 7379322. 741 é naturalmente uma lipoproteína. Quando usada de acordo com a presente invenção, a proteína 741 pode tomar várias formas. As formas preferidas de 741 são variantes de truncamento ou deleção da seqüência tipo selvagem, tal como aquelas divulgadas nas referências 218 a 220. Em particular, o N- terminal de 741 pode ser deletado até e incluindo sua seqüência de poli-glicina (isto é, deleção de resíduos 1 a 72 para a cepa MC58) , que pode às vezes ser distinguida aqui pelo uso de um prefixo vAG' . Esta deleção pode melhorar a expressão. A deleção também remove sítio de lipidação de v741'. As várias seqüências de 741 podem ser encontradas nas ID. de SEQs. 1 a 22 da referência 22 0, nas ID. de SEQs. 1 a 23 da referência 232, e em ID. de SEQs. 1- 299 da referência 233.
A proteína '936' do sorogrupo B é divulgada na referência 215 (ID. de SEQs. 2883 e 2884) e como XNMB2091' na referência 210 (veja também o número de acesso de GenBank GL72273 53). O gene correspondente no sorogrupo A [209] tem o número de acesso de GenBank 7379093. Quando usada de acordo com a presente invenção, a proteína 93 6 pode tomar várias formas. As formas preferidas de 936 são variantes de truncamento ou deleção da seqüência tipo selvagem, tal como aquelas divulgadas nas referências 218 a 220. Em particular, o peptídeo líder N-terminal de 936 pode ser deletado (por exemplo, deleção dos resíduos 1 a 23 para cepa MC58, para dar 936(NL)).
A proteína λ 953' do sorogrupo B é divulgada na referência 215 (ID. de SEQs. 2917 e 2918) e como *NMB1030' na referência 210 (veja também GI de número de acesso de GenBank: 7226269) . A proteína correspondente no sorogrupo A [209] tem o número de acesso de GenBank 7380108. Quando usada de acordo com a presente invenção, a proteína 953 pode tomar várias formas. As formas preferidas de 953 são variantes de truncamento ou deleção da seqüência tipo selvagem, tal como aquelas divulgadas nas referências 218 a 220. Em particular, o peptídeo líder N-terminal de 953 pode ser deletado (por exemplo, deleção de resíduos 1 a 19 para cepa MC58).
A proteína x 287' de sorogrupo B é divulgada na referência 215 (ID. de SEQs. 3103 e 3104), como XNMB2132' na referência 210, e como XGNA2132' na referência 212 (veja também GI de número de acesso de GenBank: 7227388). A proteína correspondente no sorogrupo A [209] tem um número de acesso de GenBank 7379057. Quando usada de acordo com a presente invenção, a proteína 287 pode tomar várias formas. As formas preferidas de 287 são variantes de truncamento ou deleção da seqüência tipo selvagem, tal como aquelas divulgadas nas referências 218 a 220. Em particular, o N- terminal de 287 pode ser deletado até e incluir sua seqüência de poli-glicina (por exemplo, deleção de resíduos 1 a 24 para a cepa MC58, para dar AG28 7).
A proteína 287 é preferivelmente da cepa 2996 ou, mais preferivelmente, da cepa 394/98. A proteína 741 é preferivelmente das cepas de sorogrupo B MC58, 2996, 394/98, ou 95N477, ou da cepa de sorogrupo C90/18311. A cepa MC58 é mais preferida. As proteínas 936, 953 e NadA são preferivelmente da cepa 2996. Onde uma composição inclui um antígeno de proteína particular (por exemplo, 741 ou 287), a composição pode incluir esse antígeno em mais de uma forma variante, por exemplo, a mesma proteína, mas de mais de uma cepa. Estas proteínas podem ser incluídas como proteínas tandem ou separadas.
Outros antígenos de polipeptídeo de MenB que podem ser incluídos nas composições da invenção incluem aqueles compreendendo uma das seguintes seqüências de aminoácido: ID. de SEQ. N°.: 650 da ref. 213; ID. de SEQ. N°: 878 da ref. 213; ID. de SEQ. N°.: 8 84 da ref. 213; ID. de SEQ. N°.: 4 da ref. 214; ID. de SEQ. N0.: 598 da ref. 215; ID. de SEQ. N0.: 818 da ref. 215; ID. de SEQ. N0.: 864 da ref. 215; ID. de SEQ. N0.: 866 da ref. 215; ID. de SEQ. N0.: 1196 da ref. 215; ID. de SEQ. N0.: 1272 da ref. 215; ID. de SEQ. N0.: 1274 da ref. 215; ID. de SEQ. N0.: 1640 da ref. 215; ID. de SEQ. N0.: 1788 da ref. 215; ID. de SEQ. N0.: 2288 da ref. 215; ID. de SEQ. N0.: 2466 da ref. 215; ID. de SEQ. N0.: 2554 de referência 215; ID. de SEQ. N0.: 2576 da ref. 215; ID. de SEQ. N0.: 2606 da ref. 215; ID. de SEQ. N0.: 2608 da ref. 215; ID. de SEQ. N0.: 2616 da ref. 215; ID. de SEQ. N0.: 2668 da ref. 215; ID. de SEQ. N°.2780 da ref. 215; ID. de SEQ. N0.: 2932 da ref. 215; ID. de SEQ. N0.: 2958 da ref. 215; ID. de SEQ. N0.: 2970 da ref. 215; ID. de SEQ. N0.: 2988 da ref. 215, ou um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácido que: (a) tem 50% ou mais identidade (por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) às referidas seqüências; e/ou (b) compreende um fragmento de pelo menos η aminoácidos consecutivos das referidas seqüências, em que η é 7 ou mais (por exemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou mais) . Os fragmentos preferidos para (b) compreendem um epitopo da seqüência relevante. Mais do que um (por exemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou mais) destes polipeptídeos pode ser incluídos.
Em algumas modalidades, entretanto, a composição da invenção inclui a mesma proteína, mas de mais de uma cepa. Esta abordagem foi descoberta por ser eficaz com a proteína 741. Esta proteína é um antígeno extremamente eficaz para provocar respostas de anticorpo antimeningocócico, e é expressa através de todos os sorogrupos meningocócicos. A análise filogenética mostra que a proteína se divide em dois grupos, e que uma destas se divide outra vez para dar três variantes no total [234] , e enquanto o soro aumentado contra um dado variante é bactericida dentro de mesmo grupo variante, não está ativo contra cepas que expressam uma das outras duas variantes, isto ê, há proteção cruzada intra- variante, mas não proteção cruzada de inter-variante [232,234] . Para eficácia máxima de cepa cruzada, portanto,, prefere-se que uma composição deva incluir mais de uma variante de proteína 741.
As composições da invenção incluem um número pequeno (por exemplo, menos do que t antígenos, onde t é 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 ou 3) de proteínas de sorogrupo B purificadas.
As proteínas são preferivelmente expressas recombinantemente em um hospedeiro heterólogo e então purificadas. Para uma composição incluindo t antígenos de MenB, pode haver polipeptídeos de t separados mas, para reduzir a complexidade ainda mais, prefere-se que pelo menos dois dos antígenos sejam expressos como uma única cadeia de polipeptídeo (uma proteína 'híbrida' [refs. 218 a 220] ) isto é tal que os antígenos t formam menos polipeptídeos t. As proteínas híbridas oferecem duas vantagens principais: primeiro, uma proteína que pode ser instável ou fracamente expressa por si própria pode ser ajudada adicionando um parceiro híbrido apropriado que supera o problema; segundo, a fabricação comercial é simplificada como somente uma expressão e purificação necessária para ser empregada a fim de produzir duas proteínas separadamente úteis. Um híbrido incluído em uma composição da invenção pode compreender dois ou mais (isto é, 2, 3, 4 ou 5) das cinco proteínas listadas acima. Os híbridos consistindo de duas das cinco proteínas são preferidos.
Outra composição preferida inclui o lipooligossacarídeo de sorogrupo B (LOS) [235] . O LOS pode ser usado além do(s) polipeptídeo(s) de sorogrupo B ou pode ser usado no lugar dele(s).
As vesículas de membrana podem também ser usadas nas composições. Estas vesículas podem ser de qualquer vesícula proteolipossômica obtidas rompendo uma membrana externa meningocócica para formar vesículas da membrana externa que incluem componentes de proteína da membrana externa. iOMVs' são preparados artificialmente de bactérias (por exemplo, por tratamento de detergente) e são assim distintos das microvesículas (MVs [236]) e de 'OMVs nativos' ('NOMVs' [237]), ambos os quais são vesículas de membrana de ocorrência natural que se formam espontaneamente durante o crescimento bacteriano e são liberadas no meio de cultura. Os MVs podem ser obtidos cultivando Neisseria em meio de cultura de caldo, separando células inteiras das bolhas menores no meio de cultura de caldo, e então coletando os MVs do meio esgotado de célula. As cepas para uso na produção de MVs podem geralmente ser selecionadas com base na quantidade de MVs produzida em cultura, por exemplo, refs. 238 e 239 descrevem Neisseria com produção de MV elevada. As vesículas podem também ser obtidas das cepas de nocaute de mltA [24 0].
Para reduzir a atividade pirogênica, prefere-se que a bactéria deva ter baixos níveis de endotoxina (LPS). As bactérias mutantes apropriadas são conhecidas, por exemplo, Neisseria mutante [241] e Helicobacter mutante [242]. Os processos para preparar as membranas externas esgotadas de LPS das bactérias gram-negativas são divulgados na referência 243.
A bactéria pode ser uma bactéria tipo selvagem, ou pode ser uma bactéria recombinante. As bactérias recombinantes preferidas super-expressam (relativa à cepa tipo selvagem correspondente) imunógenos, tais como NspA, proteína 287 [244] , proteína 741 [244] , TbpA, TbpB, dismutase superóxido [245], etc. A bactéria pode expressar mais de uma proteína de membrana externa PorA classe I, por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou 6 de subtipos PorA: PI.7,16; Pl.5,2; PI.19,15; PI.5c,10; Pl.12,13; e Pl.7h,4 [por exemplo, refs. 246 e 247] .
Outras bactérias recombinantes que podem ser usadas com a invenção têm uma ou mais mutações para diminuir (ou, preferivelmente, nocautear) a expressão de produtos de gene particulares (por exemplo, veja as refs 248 e 249) . Os genes preferidos para para sub-regulação e/ou nocaute incluem: (a) Cps, CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Ope, PilC, PorA, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, e/ou TbpB [248] ; (b) CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Ope, PhoP, PilC, PmrE, PmrF, PorA, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, e/ou TbpB [249] ; (c) transglicosilase lítica NMB0033 [250]; (d) ExbB, ExbD, rmpM, CtrA, CtrB, CtrD, GalE, LbpA, LpbB, Opa, Ope, PilC, PorA, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, e/ou TbpB [251] ; e (e) CtrA, CtrB, CtrD, FrpB, OpA, OpC, PilC, PorA, PorB, SiaD, SynA, SynB, e/ou SynC [252] . As cepas preferidas dentro do sorogrupo B como a fonte para estes antígenos não sacarídeos são MC58, 2996, H44/76, 394/98 e cepa 98/254 da Nova Zelândia. Os melhores sorotipos e cepas para usar, entretanto, dependerão das cepas predominantes em uma posição geográfica particular. Por exemplo, o meningococo pode ser de qualquer sorotipo (por exemplo, 1, 2a, 2b, 4, 14, 15, 16, etc.), de qualquer sorosubtipo (PI.2; Pl.4; Pl.5; Pl.5,2; PI.7,16; PI.7,16b PI.9; PI.9,15; PI.12,13; Pl.13 ; Pl.14 ; Pl.15 ; PI.21,16 PI.22,14; etc.) e de qualquer imunotipo (por exemplo, Ll L3,3,7; LIO; etc.), e as cepas preferidas incluem: (a) B:4:Pl.4; (b) B:4:P1.15; (c) B:15:Pl.7,16; e (d) B:4:PI.7b,4. O meningococo pode ser de qualquer linhagem apropriada, incluindo linhagens hiperinvasivas e hipervirulentas, por exemplo, quaisquer das seguintes sete linhagens hipervirulentes: subgrupo I; subgrupo III; subgrupo IV-1; ET-5 complexo; ET-37 complexo; A4 conjunto; linhagem 3. Estas linhagens foram definidas pela eletroforese de enzima multilocus (MLEE), mas a tipagem de seqüência multilocus (MLST) foi usada também para classificar o meningococci [ref. 253], por exemplo, o ET-37 complexo é o ST-Il complexo por MLST, o ET-5 complexo é ST- 32 (ET-5), a linhagem 3 é ST-41/44, etc.
Os antígenos não sacarídeos podem ser usados para induzir uma resposta de anticorpo bactericida de soro que é eficaz contra duas ou três das linhagens de MenB hipervirulentas A4, ET-5 e linhagem 3. Podem adicionalmente induzir respostas de anticorpo bactericidas contra um ou mais das linhagens hipervirulentas subgrupo I, subgrupo III, subgrupo IV-I ou ET-3 7 complexo, e contra outras linhagens, por exemplo, linhagens hiperinvasivas. Estas respostas de anticorpo são convenientemente medidas em camundongos e são um indicador padrão da eficácia de vacina [por exemplo, veja a nato final 14 da referência 212] . A atividade bactericida de soro (SBA) mede a morte bacteriana mediada por complemento, e pode ser analisada usando complemento humano ou de coelho bebê. Os padrões WHO exigem uma vacina para induzir pelo menos um aumento de 4 vezes em SBA em mais de 90% de receptores.
A composição não precisa induzir anticorpos bactericidas contra cada cepa de MenB dentro destas linhagens hipervirulentas; ao invés, para qualquer grupo dado de quatro de mais cepas de meningococo de sorogrupo B dentro de uma linhagem hipervirulenta particular, os anticorpos induzidos pela composição são bactericidas contra pelo menos 50% (por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais) do grupo. Os grupos preferidos de cepas incluirão cepas isoladas em pelo menos quatro dos seguintes países: GB, AU, CA, NO, IT, US, NZ, NL, BR, e CU. 0 soro tem preferivelmente um título bactericida de pelo menos 1024 (por exemplo. 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218 ou maior, pref erivelmente pelo menos 214) isto é, o soro é capaz de matar pelo menos 50% das bactérias teste de uma cepa particular quando diluído 1/1024, como descrito na referência 212 .
As composições preferidas podem induzir respostas bactericidas contra as seguintes cepas de meningococo de sorogrupo B: (i) de conjunto A4, cepa 961-5945 (B:2b:Pl.21,16) e/ou cepa G2136 (B:-) ; (ii) de ET-5 complexo, cepa MC58 (B: 15: Pl. 7, 16b) e/ou cepa 44/76 (Β:15:Pl.7,16); (iii) de linhagem 3, cepa 394/98 (B:4:P1.4) e/ou cepa BZ198 (B:NT:-). Mais composições preferidas podem induzir respostas bactericidas contra as cepas 961-5945, 44/76 e 394/98. As cepas 961-5945 e G2136 são ambas as cepas de referência de Neisseria MLST [ids. 638; 1002 na ref. 254] . A cepa MC58 está amplamente disponível (por exemplo, ATCC BAA-335) e foi a cepa sequenciada na referência 210. A cepa 44/76 foi amplamente utilizada e caracterizada (por exemplo, ref. 255) e é uma das cepas de referência de Neisseria MLST [id. 237 na ref. 254; fileira 32 da tabela 2 na ref. 256] . A cepa 394/98 foi originalmente isolada na Nova Zelândia em 1998, e houve diversos estudos publicados usando esta cepa (por exemplo, refs. 257 e 258) . A cepa BZ198 é outra cepa de referência de MLST [id. 409 na ref. 254; fileira 41 da tabela 2 na ref. 256] . A composição pode adicionalmente induzir uma resposta bactericida contra a cepa LNP17592 de sorogrupo W135 (W135:2a:Pl.5,2), de ET-37 complexo.
Geral
O termo "compreendendo" engloba "incluindo" assim como "consistindo", por exemplo uma composição "compreendendo" X pode consistir exclusivamente em X ou pode incluir algo adicional, por exemplo, X + Y.
A palavra "substancialmente" não exclui "completamente", por exemplo, uma composição que está "substancialmente livre" de Y pode estar completamente livre de Y. Onde necessário, a palavra "substancialmente" pode ser omitida da definição da invenção.
O termo "aproximadamente" com relação a um valor numérico χ significa, por exemplo, x+10%. O termo "alquila" é usado aqui para se referir aos grupos alquila em formas reta e ramificada. Entretanto, o termo "alquila" refere-se geralmente aos grupos alquila em formas retas. O grupo alquila pode ser interrompido com 1, 2 ou 3 heteroátomos selecionados -O, -NH- ou -S. O grupo alquila pode também ser interrompido com 1, 2 ou 3 ligações duplas e/ou triplas. Entretanto, o termo "alquila" refere- se geralmente ao grupo alquila não tendo nenhuma interrupção de heteroátomo ou interrupções de ligação dupla
ou tripla. Onde referência é feita a alquila C1-6, significa que o grupo alquila pode conter qualquer número de átomos de carbono entre 1 e 6 (por exemplo C1, C2, C3, C4, C5, C6) .
O termo "alquileno" é usado aqui para se referir a um grupo alquila divalente, como definido acima. Onde
referência é feita ao alquileno C1-5, significa que o grupo alquileno pode conter qualquer número de átomos de carbono entre 1 e 5 (por exemplo, C1, C2, C3, C4, C5) . Similarmente, onde referência é feita ao alquileno C1-4, significa que o grupo alquileno pode conter qualquer número de átomos de carbono entre 1 e 4 (por exemplo, C1, C2, C3, C4) .
O termo "grupo amino" inclui grupos de fórmula -NH2 ou -NH-E, onde E é um grupo protetor de nitrogênio. Os exemplos de grupos protetores de nitrogênio típicos são descritos acima.
O termo "amina" significa um grupo de fórmula -NH2, a menos que o contexto indicar de outra maneira.
O termo "sacarídeo capsular modificado" significa um sacarídeo que é obtenível de um sacarídeo capsular nativo pela modificação apropriada. Consequentemente, a seqüência básica de unidades de repetição de monossacarídeo no sacarídeo capsular nativo é retida nos sacarídeos capsulares modificados da presente invenção.
O termo "sacarídeo" engloba oligossacarídeos (por exemplo, contendo 2 a 3 9 unidades de monossacarídeo) e polissacarídeos (por exemplo, contendo 4 0 ou mais unidades de monossacarídeo). Como encontrado naturalmente nas bactérias, os sacarídeos capsulares nativos tomam geralmente a forma de polissacarídeos. Os polissacarídeos podem ser manipulados para dar oligossacarídeos mais curtos.
Os oligossacarídeos podem ser obtidos por purificação e/ou despolimerização seguido por dimensionamento do polissacarídeo nativo (por exemplo, por hidrólise em ácido suave, por aquecimento, por cromatografia de dimensionamento etc.).
Onde os materiais animais (e particular bovinos) são usados na cultura de células, devem ser obtidos das fontes que estão livres de encafalopatias espongiformes transmissíveis (TSEs), e em particular livres de encefalopatia espongiforme bovina (EBS). No geral, prefere- se para células de cultura na ausência total de materiais derivados de animal.
Será apreciado que os grupos ionizáveis podem existir na forma neutra mostrada nas fórmulas aqui, ou podem existir na forma carregada, por exemplo, dependendo do pH.
Assim um grupo fosfato pode ser mostrado como -P-O-(OH)2, esta fórmula é meramente representativa do grupo fosfato neutro, e outros formas carregadas são englobadas pela invenção. Similarmente, as referências aqui aos grupos catiônicos e aniônicos devem ser tiradas para referir à carga que está presente nesse grupo sob condições fisiológicas, por exemplo, onde uma amina -NH2 é protonada para dar o grupo catiônico NH3+, esta protonação é uma que ocorre em pH fisiológico. Além disso, onde uma carboxila - COOH é deprotonada para dar ogrupo aniônico -C00", esta protonação pode ocorrer em pH fisiológico. Além disso, a invenção engloba sais das formas carregadas de moléculas da invenção. Os anéis de açúcar podem existir na forma aberta e fechada e, enquanto as formas fechadas são mostradas em fórmulas estruturais aqui, as formas abertas são também englobadas pela invenção. Similarmente, a invenção engloba formas isoméricas das moléculas da invenção, incluindo tautômeros (por exemplo, tautômeros de imina/enamina) , conformadores, enantiômeros, diastereoisômeros, etc.
Após o sorogrupo, a classificação meningocócica inclui sorotipo, sorosubtipo e então imunotipo, e a nomenclatura de padrão lista sorogrupo, sorotipo, sorosubtipo, e imunotipo, cada um separado por dois pontos, por exemplo B:4:Pl.15:L3,7,9. Dentro do sorogrupo B, algumas linhagens causam doença freqüentemente (hiperinvasiva), algumas linhagens causam formas mais severas de doença do que outras (hipervirulentas), e outras raramente causam doença. Sete linhagens hipervirulentas são reconhecidas, especificamente subgrupos I, III e IV-I, ET-5 complexo, ET- 37 complexo, conjunto A4 e linhagem 3. Estes foram definidos por eletroforese de enzima multilocus (MLEE), mas tipagem de seqüência multilocus (MLST) foi usada também para classificar o meningococci [ref. 256] .
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 fornece um esquema para a síntese química de conjugados de MenA CRMi97. As estruturas predominantes de "MenA10/90" (oligossacarídeo MenA compreendendo um grupo bloqueador de 4,5-dihidróxipentilcarbamato em aproximadamente 10% das unidades de monossacarídeo e um grupo bloqueador 2-hidróxietilcarbamato em aproximadamente 90% das unidades de monossacarídeo) e "MenA 10/0" (oligossacarídeo MenA compreendendo um grupo bloqueador 4,5-dihidróxipentilcarbamato em aproximadamente 10% das unidades de monossacarídeo) são representados.
A Figura 2 fornece o perfil analítico de troca de ânion em oligossacarídeos de MenA 214 mmantes (painel A) e após dimensionamento (painel B).
A Figura 3 fornece o espectro de 600 MHz 1H em 250C de oligossacarídeo MenA sem a modificação química (painel A), oligossacarídeo MenA 10/90 (painel B) e oligossacarídeo MenAlO/0 (painel C).
A Figura 4 compara a porcentagem de fosfomonoéster desenvolvida durante o armazenamento em 370C pelo oligossacarídeo MenA sem modificação química, oligossacarídeo MenA 10/90 e oligossacarídeo MenA10/0.
A Figura 5 fornece o espectro 31P NMR de oligossacarídeo MenA.
Figura 6 compara o grau de polimerização (DP), medido por 31P NMR, durante o armazenamento em 37 0C de oligossacarídeo MenA sem modificação química, oligossacarídeo MenA10/90 e oligossacarídeo MenA10/0.
A Figura 7 fornece o perfil de SDS-PAge de conjugados de oligossacarídeo de CRM-MenA: Marcadores Linha M - Mw; Linha 1 - CRM; Linha 2 - CRM-MenA 10/90; e linha 3 - CRM- MenA 10/0.
A Figura 8 compara o sacarídeo livre (FS) liberado durante o armazenamento em 37°C dos conjugado de oligossacarídeo CRM-MenA10/90 e conjugados de oligossacarídeo de CRM-MenA10/0.
A Figura 9 compara a porcentagem de fosfomonoéster desenvolvida durante o armazenamento em 37°C pelos conjugados de oligossacarídeo CRM- MenA 10/90 e conjugados de oligossacarídeo CRM-MenA 10/90.
MODOS PARA REALIZAR A INVENÇÃO EXEMPLO 1
Modificação de oligossacarídeo de Men A Hidrólise controlada de polissacarídeo MenA Os oligossacarídeos de MenA foram gerados por hidrólise química de uma solução de polissacarídeo MenA. Momentaneamente, o polissacarídeo MenA foi solubilizado em uma concentração final de 10 mg/ml em 50 mM de tampão de acetato, pH 4,75. A solução foi aquecida em 73°C até que um grau de polimerização (DP) de aproximadamente 10 fosse alcançado. A hidrólise foi controlada monitorando a variação da atividade ótica da solução (a Hg 3 65 nm) sobre o tempo de acordo com a seguinte equação: DP=I/(0,5817[1- (at/am)] }, onde o am é o valor médio do poder rotatório ótico de 6 amostras quando a solução de temperatura é 50°C, e at é o poder rotatório ótico no tempo t. A hidrólise foi parada quando o valor de α correspondendo a um DP de 10 foi alcançado. No fim da reação de hidrólise a solução foi resfriada na temperatura ambiente e o pH corrigido para aproximadamente 6,5.
Fracionamento de tamanho de oligossacarídeo MenA
A hidrólise ácida controlada de polissacarídeo MenA gera uma polidispersão com o DP médio alvo. Para a preparação conjugada, a polidispersão de oligossacarídeo pode ser mais restringida usando um fracionamento de tamanho de duas etapas. Estas etapas de dimensionamento mudam tipicamente o DP dos oligossacarídeos de MenA de um valor de aproximadamente 10 a um valor entre 15 e 20, como medido pela razão molar entre valores de fósforo total (Pt) e fosfato de monoéster terminal (Pm). A concentração de Pt foi determinada de acordo com o método descrito na referência 259 e Pm foi determinado medindo o fosfato inorgânico liberado pela reação enzimática com fosfatase ácida de batata [260].
Momentaneamente, o hidrolisado de MenA ultrafiltrado primeiramente através de uma membrana de fluxo tangencial de 30 KDa para remover espécies de alto peso molecular. Durante este procedimento o produto foi concentrado aproximadamente 10 vezes e então diafiltrado contra 13 volumes de tampão de acetato 5 mM, pH 6,5. O permeado, contendo os oligossacarídeos desejados, foi coletado enquanto o retido foi rejeitado.
Na segunda etapa, o permeado foi fracionado por cromatografia de coluna de troca aniônica. Esta etapa é projetada para remover espécies de Mw baixa caracterizada por um DP de menos de 6, que podem ser fracamente imunogênicas [261]. A mistura de oligossacarídeo obtida da ultraf iltração de 3 0 KDa foi carregada em uma coluna embalada com Q-Sefarose Fast Flow equilibrada previamente com 5 mM de acetato de sódio, pH 6,5. A razão oligossacarídeo/volume embalado foi 17 mg/ml de resina embalada. A coluna foi lavada então com 5 volumes de coluna (cv) do tampão de equilíbrio. Uma lavagem de 10 cv de 5 mM de tampão de acetato de sódio/125 mM de NaCl7 pH 6,5 foi então aplicado à coluna para eluir oligossacarídeos de DP <6. A fração de oligossacarídeo desejada foi então recuperada por eluição cora 5 mM de tampão de acetato de sódio/125 mM de NaCl, pH 6,5. A remoção com 5 cv de NaCl 2M e sanitização com IM de NaOH terminaram o procedimento.
A cromatografia de troca de ânion analítica foi usada para medir a polidispersão de oligossacarídeo antes e depois do fracionamento. Momentaneamente, as polidispersões de oligossacarídeo MenA foram analisadas por HPLC queusando uma coluna Mono-Q HR 5/5. Após equilíbrio com água, 1 ml de amostra contendo aproximadamente 1 mg de sacarídeo foi carregado na coluna, que foi então desenvolvida com uma forma linear de 0 a 60% de NaCl 1 M na taxa de fluxo de 0,5 ml. 0 cromatograma foi monitorado em 214 nm. Uma preparação padrão de um oligossacarídeo MenA monodispersado tendo um DP definido de 5 e 6 respectivamente como evidenciado pela espectrometria de massa e 1H NMR, foi usado para identificar a presença ou remoção de oligossacarídeos tendo um DP menor de 6 nas amostras de polidispersão testadas. A Figura 2 mostra os perfis analíticos do hidrolisado (painel A) em comparação ao oligossacarídeo MenA dimensionado (painel B).
Troca de contra-íon
O eluatp de Q-Sefarose do procedimento de fracionamento de tamanho de duas etapas foi ultrafiltrado em uma membrana de 3 KDa a fim de trocar o contra-íon de sódio com tetrabutilamônio, que conferencia solubilidade ao oligossacarídeo em solventes não aquosos. Momentaneamente, a solução de oligossacarídeo MenA diafiltrada contra 4 volumes de 10 mM de tetrabutilamôniobrometo seguido por 10 volumes de água. O retido, contendo o produto desejado, foi coletado e o permeado descartado. A água foi removida do retido por evaporação rotatória.
Modificação química de oligossacarídeo MenA O oligossacarídeo MenA foi modificado usando ativação de 1, 1'-carbonildiimidazol (CDI) seguida pela reação com 1- amino-4,5-pentandiol (APD) sozinho ou APD e 2-aminoetanol (ETA) , a fim de obter duas estruturas alvo diferentes (Figura 1) :
i) Oligossacarídeo MenA compreendendo um grupo bloqueador de 4,5-dihidróxipentilcarbamato em aproximadamente 10% das unidades de monossacarídeo e um grupo bloqueador de 2-hidróxietilcarbamato em aproximadamente 90% das unidades de monossacarídeo (MenA 10/90); e
ii) Oligossacarídeo MenA compreendendo um grupo bloqueador de 4,5-dihidróxipentilcarbamato em aproximadamente 10% das unidades de monossacarídeo (MenA 10/0).
Momentaneamente, o oligossacarídeo MenA derivado da ultrafiltração de membrana de 3 KDa descrito acima foi solubilizado em DMSO a uma concentração final de aproximadamente 10 mg/ml. A esta solução um excesso molar de 20 vezes de CDI (relativo ao número de mols de unidades de monossacarídeo MenA) foi adicionado e a solução foi agitada em temperatura ambiente por 2 horas. A solução de oligossacarídeo ativada foi então adicionada a 9 volumes de acetato de etila frio (-20°C) seguido por uma solução de 2 M de CaCl2 a uma concentração final equimolar com as unidades de monossacarídeo MenA. A mistura foi agitada por 30 minutos e, após sedimentação do oligossacarídeo, a maioria do sobrenadante foi removida por sucção e o pélete recuperado por centrifugação, lavado 3 vezes com acetato de etila e seco sob vácuo.
Para adição de grupos bloqueadores, o oligossacarídeo ativado foi solubilizado em DMSO a uma concentração final de 10 mg/ml. Para obter o oligossacarídeo "MenAlO/O", um excesso molar de 0,1 vez (relativo ao número de mols de unidades de monossacarídeo MenA) de APD foi adicionado, e a reação foi agitada por 2 horas em temperatura ambiente. Após este tempo, dezenove volumes de tampão de fosfato de sódio 0,25 M, pH 6.5 foram adicionados sob agitação. Qualquer opalescência formada durante esta operação foi removida por filtragem através de uma membrana de 0,2 μπι. Para obter o oligossacarídeo "MenA 10/90", um excesso molar de 0,6 vez de trietilamina e um excesso de molar de 0,1 vez de APD foi adicionado e a reação foi agitada por 2 horas em temperatura ambiente. Subseqüentemente, um excesso molar de 50 vezes (relativo ao número de mols de unidades de monossacarídeo MenA) de ETA foi adicionado e a reação continuou sob agitação por 2 horas adicionais. Mais uma vez, após este tempo dezenove volumes de tampão de fosfato de sódio de 0,25 M, pH 6,5 foram adicionados sob agitação e qualquer opalescência foi removida por filtragem através de uma membrana de 0,2 μπι.
As soluções cruas de oligossacarídeo derivatizado foram purificadas do excesso de reagentes de baixo peso molecular por ultrafiltração em uma membrana de 3 KDa. As soluções foram primeiramente concentradas aproximadamente a 20 vezes e então diafiltradas contra 10 volumes de tampão de fosfato de sódio de 0,1 M, pH 7,2, seguido por 10 volumes de água destilada. Os produtos purificados foram recuperados dos retidos, com os permeados sendo descartados.
Confirmação de modificações químicas por 1H NMR
Os oligossacarídeos de MenA quimicamente modificados foram caracterizados por NMR para confirmar que as modificações químicas desejadas tinham ocorrido.
0 espectro de 1H NMR do oligossacarídeo MenA nativo é mostrado na figura 3, painel A. 0 espectro está em conformidade com a literatura publicada [262, 263] . 1H NMR conduzido em APD e ETA puros deu os seguintes sinais: sinais de APD: HOCH2aCHb(OH) CH2cCH2dCH2eNH2 (Ha em 3,6 ppm, Hb em 3,7 ppm, Hc em 1,5 ppm, H0 em 1,6 ppm, He em 2,7 ppm); sinais ETA: HOCH2fCH2gNH2 (Hf em 4,4 ppm, Hg em 3,6 ppm). Estas atribuições foram usadas como um guia para identificar os sinais APD e ETA nos espectros dos oligossacarídeos derivatizados. Os espectros de 1H NMR do oligossacarídeo MenA 10/90 são relatados na figura 3, painel Β. 0 espectro de IH NMR do oligossacarídeo MenA 10/0 é relatado na figura 3, painel C. A ligação covalente entre ETA ou os grupos APD e os grupos carbonila introduzidos na posição 4 e/ou 3 de N-acetil-mannosamina foi confirmada pela correlação heteronuclear (1H, 13C) detectada nos espectros de HSQC. Os picos de correlação de faixa longa entre os grupos carbonila e o Hg de ETA ou He de APD foram detectados. Similarmente, os grupos carbonila deram correlação de faixa longa com prótons geminais em posição 3/4 de N-acetil-mannosamina. As porcentagens de grupos APD introduzidos pelo tratamento químico foram estimadas por integração de sinais selecionados vindo de APD e MenA. Os sinais de HD+HC sobrepostos em 1,5 ppm (grupos APD) foram integrados versus o pico H2 em 4,6 ppm (oligossacarídeo MenA). Em experimentos diferentes de 6% a 14% das unidades de monossacarídeo MenA foram substituídas com grupos APD. Depois da mesma abordagem, os grupos ETA foram estimados pela razão com sinais Hf sobrepostos em 3,6 ppm (grupos ETA) versus o pico H2 em 4,6 ppm (oligossacarídeo MenA) . Devido a sobreposição parcial com os sinais APD (Ha em 3,6 ppm e Hb em 3,7 ppm) a integral de Hf foi subtraída por 3/4 do valor de Hd+Hc . Em experimentos diferentes de 66% a 85% das unidades de monossacarídeo MenA foram substituídas com grupos ETA. Como esperado, na figura 3, os sinais do painel C relativos aos grupos ETA não estão presentes, que confirma a estrutura proposta e a conformidade de NMR como uma ferramenta para a elucidação de estrutura e avaliação de identidade. Figura 3, painel A indica que a O-acetilação é preservada após a hidrólise ácida de polissacarídeo meningocócico de sorogrupo A e, embora os grupos de carbamato mudem o campo magnético local e façam a atribuição mais complicada, o status de O-acetilação parece ser mantido após a modificação química (figura 3, painéis B e C) .
Estabilidade de oligossacarídeo MenA
A degradação de oligossacarídeos Mena, uma conseqüência de hidrólise em ligações fosfodiéster, resulta em grupos de fosfomonoéster recentemente formados. A estabilidade de oligossacarídeos MenA 10/90 e MenA 10/0 foi comparada com a estabilidade de um oligossacarídeo nativo.
Momentaneamente, as soluções dos oligossacarídeos MenA, em uma faixa de concentração de 1,4 a 3 mg/ml, foram incubadas em 37°C em tampão de histidina de 10 mM, pH 7,2. Em pontos diferentes de tempo durante 42 dias, os oligossacarídeos foram analisados para a quantidade de fosfomonoéster gerada durante o armazenamento.
A Figura 4 mostra o incremento de grupos fosfomonoéster durante o armazenamento em 370C para os três oligossacarídeos mencionados acima. A porcentagem de fosfomonoéster foi calculada como [Pm(t)-Pm(0) ] χ 100/[(Pt(0)-Pm(O)], onde Pm(t) e Pt(t) são as concentrações de grupos fosfomonoéster e fósforo total no tempo t; e Pm (0) e Pt(O) são as concentrações de grupos fosfomonoéster e de fósforo total no tempo 0. A concentração total de fósforo (Pt) foi determinada de acordo com o método descrito na referência 259 e o fosfato de monoéster terminal (Pm) foi determinado medindo o fosfato inorgânico liberado pela reação enzimática com a fosfatase ácida de batata [260].
Os oligossacarídeos MenA 10/90 e MenA 10/0 mostraram estabilidade melhorada comparada ao oligossacarídeo nativo, como evidenciado pela tendência reduzida de liberar grupos fosfomonoéster sobre o tempo. Estes resultados mostram que a estabilidade do oligossacarídeo MenA pode ser melhorada bloqueando os grupos hidroxila em posição 4 e 3 de N- acetilmannosamina com um grupo bloqueador de acordo com a presente invenção.
Similarmente, a análise 31P NMR [264] foi usada para avaliar a estabilidade dos oligossacarídeos MenA modificados em comparação com o oligossacarídeo nativo em 37°C por 4 2 dias em pH 7,2 de tampão de histidina 10 mM. Momentaneamente, o grau médio de despolimerização (avDP) foi determinado pela razão molar entre o fosfodiéster nos grupos em cadeia (Pin cadeia) e nos grupos de extremidade não redutores de fosf omonoéster (Pextremidade não red) (figura 5) .
avDP = [P em Cadeia + 1] / Pextremidade não red
Mais uma vez, os oligossacarídeos MenA 10/90 e MenA 10/0 mostraram a estabilidade melhorada comparada ao oligossacarídeo nativo, como evidenciado pelo grau de polimerização maior em qualquer ponto de tempo (figura 6).
Tabela I
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Tabela I
Conjugados de CRMi97-MenA
Geração de grupos aldeídos reativos por oxidação de periodato controlada
Os grupos hidroxila vicinais dos grupos bloqueadores 4,5-dihidróxipentilcarbamato derivados de APD nos oligossacarídeos MenA10/90 e MenA10/0 foram oxidados por tratamento de periodato de sódio limitado para gerar grupos aldeídicos reativos. Momentaneamente, as soluções de oligossacarídeos MenA10/90 e MenA10/0 em tampão de fosfato de sódio de 0,1 M, pH 7,2, foram reagidos com 0,1 mol de NaIO4 por mol de unidades de monossacarídeo MenA. As reações foram realizadas no escuro com agitação, e 30 monitoradas espectrofotometricamente em 225 nm. Após aproximadamente 2 horas a absorvência de 225 nm alcançou um platô. A quantidade de grupos aldeidicos gerados pela reação foi determinada analisando a quantidade equimolar de formaldeído liberada durante a oxidação [265]. As reações foram paradas pela adição de etileno glicol a uma concentração final equimolar com o NaIO4.
A geração de grupos aldeidicos foi quase quantitativa em comparação ao número inicial de grupos bloqueadores 4,5- dihidróxipentilcarbamato.
Purificação de oligossacarídeos oxidados
Os oligossacarídeos oxidados foram purificados por ultrafiltração em uma membrana de 3 KDa. As soluções foram concentrada 2 vezes e então diafiltrada contra 10 volumes de NaCl de 0,5 M seguido por 10 volumes de água destilada.
O retido, contendo o produto desejado, foi coletado e o permeado descartado. A água foi removida do retido por evaporação rotatória.
Conjugação à CRMi97
Os oligossacarídeos de MenA oxidados foram conjugados à CRMi97, um mutante não tóxico da toxina de difteria [266] , através de aminação redutiva para obter CRM-MenA 10/90 e CRM-MenA10/0 respectivamente (figura 1) .
Momentaneamente, os oligossacarídeos de MenA oxidados foram solubilizados em 50 mg/ml de solução de CRMi97 em uma razão de 13 mols de grupos aldeidicos por mol de proteína. o tampão de fosfato de sódio de 100 mM, pH 7,2, foi adicionado para obter uma concentração de proteína final de 30 mg/ml. Uma solução de 2M de NaBH3CN em tampão de fosfato de sódio de 10 mM, pH 7,2, foi então adicionado para obter um excesso de molar de 7 0 vezes de NaBH3CN com relação aos grupos aldeídicos. As reações foram realizadas por 3 dias em 37°C. Quatorze volumes de tampão de fosfato de sódio 10mM, pH 7,2, foram então adicionados, seguido por um excesso molar de 25 vezes de NaBH4 (relativo ao número de mols de grupos aldeídicos). O pH foi controlado em 8,5 e as misturas foram agitadas por 2 horas em temperatura ambiente a fim de resfriar quaisquer grupos aldeídicos residuais. No fim da etapa de resfriamento, o pH foi corrigido outra vez a 7,2, e as soluções filtradas através de uma membrana de poro de 0,2 pm.
Purificação de conjugado
Os conjugados foram purificados do excesso de reagentes e oligossacarídeos residuais, não reagidos pelo ultrafiltração em uma membrana de 3 0 KDa. As misturas de reação foram diafiltradas contra 100 volumes de tampão de fosfato de sódio de 0,01 M, pH 7,2, seguido por 50 volumes de 10 mM de histidina, pH 7,2. As soluções contendo os conjugados purificados foram então filtradas através de uma membrana de poro de 0,2 pm e armazenadas em 2-80C.
Confirmação de conjugação à CRM197
A conjugação dos oligossacarídeos MenA à CRMi97 foi demonstrada por SDS-Page (figura 7). A SDS-Page foi realizada de acordo com a referência 267 usando 7,5% acrilamida para empilhar e 7,5% de acrilamida para a separação de gel. Antes da eletroforese, as amostras foram tratadas 1:4 com tampão de amostra e fervidas por 10 min. A eletroforese foi realizada em 200 V de voltagem constante por aproximadamente 4 0 min. Os géis foram desenvolvidos com uma solução de tinta de Coomassie por aproximadamente 2 0 min e descolorida no ácido acético/solução de EtOH (7/40%) por aproximadamente 4 horas.
O perfil dos conjugado na figura 7 é deslocado para pesos moleculares mais elevados comparados a CRMi97, e é marcadamente diferente de CRM197. A análise de SDS-Page também demonstra a presença de material de alto peso molecular. Este material pode ser formado durante a reação de conjugação, que permite pontos de união múltiplos da CRM197 por molécula de oligossacarídeo.
Os conjugado foram também analisados para teor de sacarídeo e proteína. As razões de sacarídeo/proteína variando de 0,20 a 0,32 (peso/peso) foram observadas.
Estabilidade de conjugados de CRM197-MenA
A estabilidade dos conjugado de CRMi97-MenA foi determinada medindo a liberação de sacarídeo não conjugado sobre o tempo, que os resultados da hidrólise das ligações de fosfodiéster.
Centricon 30 dispositivos (2 ml de capacidade) foi condicionado enxaguando com 1 ml de água destilada e girando duas vezes. 60 μΐ de solução salina foi adicionado à amostra de 940 μΐ (CRM-MenA 10/90 ou CRM-MenA10/0) contendo aproximadamente 0,3 mg/ml de sacarídeo. 0 teor de fósforo total foi medido como descrito acima antes de adicionar as misturas aos dispositivos. Os dispositivos foram girados em 1942 g até que 100-200μ1 de solução foi deixado na câmara de retido, e então lavado com 2x 1 ml de solução salina e girados outra vez. A solução na câmara de permeado foi recuperada e o volume de amostra foi ajustado com a solução salina para 3 ml. 0 permeado derivado de cada amostra foi analisado para o teor total de fósforo como descrito acima. O valor (P2/P1) χ 100, onde o Pl é o fósforo total antes de tratamento de centricon e P2 é o fósforo total após o tratamento de centricon, representa a porcentagem do sacarídeo livre. Os experimentos de pico para demonstrar a recuperação do oligossacarídeo livre através da membrana foram conduzidos adicionando 6 0 μΐ de aproximadamente 2 mg/ml de oligossacarídeo a 940 μΐ de amostra ou solução salina e então aplicando o procedimento de separação descrito acima. A recuperação foi consistentemente acima de 80%.
A Figura 8 mostra que o conjugado CRM-MenA 10/90 mostrou uma tendência reduzida para liberar sacarídeo livre comparado a CRM-MenA10/0. FS (sacarídeo livre) é calculado como FS%(t)-FS%(0) onde FS%(t) e FS%(0) são as porcentagens livres de sacarídeo no tempo t e 0 respectivamente.
A estabilidade dos conjugado de CRMi97-MenA foi determinada também medindo a geração de fosfomonoéster durante o armazenamento. Momentaneamente, as soluções dos conjugado, em uma faixa de concentração de 157 a 253 pg/ml, foram incubadas em 37°C no tampão de histidina de 10 mM, pH 7,2. Em pontos de tempo diferentes durante 42 dias, os conjugados foram analisados para a quantidade de fosfomonoéster gerada durante o armazenamento.
A Figura 9 mostra o incremento de grupos fosfomonoéster durante o armazenamento em 37°C para os dois conjugados mencionados acima. A porcentagem de fosfomonoéster foi calculada como descrito acima: o conjugado CRM-MenA 10/90 mostrou uma tendência reduzida para gerar fosfomonoéster comparado a CRM-MenA10/0.
Imunogenicidade de conjugados de CRM-MenA A fim de avaliar a habilidade dos conjugados MenA para provocar os anticorpos que reconhecem o polissacarídeo capsular nativo de MenA, os experimentos de imunogenicidade foram conduzidos em camundongos.
Formulação de vacina
Os conjugados de CRM-MenA 10/90 e CRM MenA 10/0 foram misturados com o tampão de fosfato de sódio e uma suspensão AlPO4 para obter concentrações finais de sacarídeo de 20 pg/ml e 0,6 mg/ml de Al3+ em 10 mM de tampão de fosfato de sódio, pH 7,2. Para formulações sem adjuvantes, a suspensão de AlPO4 foi substituída com o tampão de fosfato de sódio. Antes da imunização, as vacinas resultantes foram diluídas 1:5 com solução salina.
Imunização de camundongos
Os grupos de 8 camundongos Balb/c, fêmeas de 6-8 semanas, foram imunizados duas ou três vezes s.c. com 0,5 ml de vacinas conjugadas contendo 2 pg de sacarídeo. No caso da programação de duas-injeções, o intervalo entre a primeira e a segunda dose foi de quatro semanas. Os sangramentos foram executados antes da imunização e duas semanas após a segunda dose. No caso da programação de três doses, as vacinas foram dadas em 0, 14 e 28 dias e os sangramentos foram executados no tempo zero, um dia antes (pós 2 doses de soro) e 14 dias após (pós 3 doses de soro) a terceira imunização.
Imunogenicidade
Os soros dos camundongos imunizados foram analisados para anticorpos IgG totais de polissacarídeo capsulares anti-MenA específicos e para atividade bactericida de soro mediada por complemento (SBA) contra sorogrupo A de Neisseria meningitidis.
Os anticorpos IgG totais de polissacarídeo capsulares anti-MenA específicos foram determinados essencialmente de acordo com o método de referência 268, adaptado para análise de soros animais. Cada soro individual de camundongo foi analisado em duplicata por uma curva de titulação. Os tíitulos de polissacarídeo Anti-MenA foram calculados como unidade de Elisa de camundongo (MEU)/ml usando o software baseado no método de ensaio de linha de referência. Os títulos de média geométrica (GMT) foram calculados para grupos de cada imunização.
SBA foi medido em associações de soros pós II e pós III (onde apropriado) para cada grupo de imunização. 0 protocolo padrão de SBA foi baseado na inoculação da cepa bacteriana de teste (MenA F8238) no caldo de Mueller Hinton com a adição de 0,25% glicose. A cultura bacteriana foi incubada em 37 0C na presença de CO2 5% e o crescimento parado quando as bactérias alcançaram a fase exponencial adiantada de crescimento, ao redor de 0,220-0,240 OD60O- As bactérias foram então diluídas a IO"4 com 1% BSA em tampão de GBBS e incubadas por 1 hora em 3 7 0C com CO2 5% na presença de associações de soros inativados por calor (30 minutos em 56 °C) e 25% de soro de coelho bebê como uma fonte de complemento. As misturas de reação foram então plaqueadas em ágar de Mueller Hinton e incubadas durante a noite em 37°C. Os títulos bactericidas foram expressos como a diluição de soro recíproca rendendo a morte de 50% das bactérias.
A tabela II mostra os títulos de IgG totais de polissacarídeo anti-MenA capsulares expressos como GMT (+/- 95 limites de confiança) como medidos por ELISA e os títulos de SBA induzidos por CRM-MenA 10/90, e CRM-MenA10/0 Ambos os conjugado foram capazes de indução em anticorpos de polissacarídeo anti-MenA específicos de camundongos com atividade funcional bactericida.
<table>table see original document page 99</column></row><table> Tabela II
Em um segundo experimento, a imunogenicidade em camundongos de CRM-MenA 10/90 foi testada com e sem AlPO4. A imunogenicidade do CRM-MenA 10/90 é confirmada na tabela III, que mostra os títulos de anticorpo de IgG anti-MenA específicos induzidos após duas e três imunizações e a atividade bactericida mediada por complemento destes anticorpos. Os títulos de pré-imunização foram descobertos sendo negativos (SBA <4). Estes dados sugerem que a presença do adjuvante melhora a resposta do anticorpo. A imunogenicidade observada no conjugado é claramente uma conseqüência da conjugação química do oligossacarídeo à proteína carreadora, como uma mistura física de oligossacarídeo MenA, CRMi97 e AlPO4 não foi imunogênico.
<table>table see original document page 99</column></row><table> Tabela Ml EXEMPLO 2
Modificação de polissacarídeo Men A
Modificação química de polissacarídeo MenA
20 mg de polissacarídeo capsular nativo MenA (0,072
mmol) foi adicionada a 170 mg (mmol 2,5) de imidazol e 1 mL
de CH3CN. Agitando com uma barra magnética, 163 μϋ. (1,59
mmol) de anidrido acético foi adicionado e a reação foi
incubada em 55 0C por 21 h. A razão de molar de
imidazol:anidrido acética foi 2:4. Uma etapa de
diafiltração usando uma membrana de celulose de Centricon
(limite de peso molecular 1 kDa) contra água de Milli-Q
(1:7 vol/vol) foi usada para purificar o produto de reação.
O material foi finalmente seco sob o vácuo (SpeedVac).
Confirmação de modificações químicas por 1H e 13C NMR
Para estabelecer o grau de acetilação, uma caracterização estrutural completa do polissacarídeo capsular MenA modificado foi realizada por espectroscopia 1H e 13C NMR.
A análise de NMR quantitativa foi usada para quantificar o nível de O-acetilação das cadeias de sacarídeo. A porcentagem de O-acetilação foi estimada por integração de pico de H230Ac (prótons em posição C-2 dos resíduos de N-acetil-mannosamina O-acetilados em C-3), pico de H240Ac (próton na posição C-2 dos resíduos de N-acetil- mannosamina O-acetilados em C-4) e pico de H2de0Ac (próton na posição C-2 dos resíduos de N-acetil-mannosamina sem 0- acetilação) , em comparação com H1 (próton na posição C-I dos resíduos de N-acetil-mannosamina) . 0 nível total de 0- acetilação foi obtido pela soma de integrações de pica H230Ac e H240Ac. %O-Acetilação = [H23OAc + U24OAc/ [H1OAC+ H1deOAc].
Além disso, a porcentagem de O-acetilação foi estimada por integração de pico de H23OA7/H24OAc (próton na posição C-3 dos resíduos de N-acetil-mannosamina O-acetilados em C-3 e próton na posição C-4 dos resíduos de N-acetil-mannosamina O-acetilados em C-4), em comparação com H1 (próton na posição C1 dos resíduos de N-acetil-mannosamina).
%O-Acetilação = [H23OAc/H24OAc/[H10Ac + H1de0Ac]
Estabilidade de polissacarídeos Mena
A análise 31P NMR foi usada para avaliar a estabilidade do polissacarídeo capsular MenA modificado inteiramente acetilado em comparação com o polissacarídeo nativo e o oligossacarídeo correspondente em 37°C por 42 dias em 10 mM de tampão de histidina pH 7,2, como descrito acima.
O polissacarídeo MenA modificado inteiramente O- acetilado foi muito mais estável do que o polissacarídeo capsular nativo e o oligossacarídeo correspondente.
<table>table see original document page 101</column></row><table>
Tabela IV
Estes resultados confirmam que a estabilidade do oligossacarídeo MenA pode ser melhorada bloqueando os grupos hidroxila em posição 4 e 3 de N-acetilmannosamina com um grupo bloqueador de acordo com a presente invenção.
Será compreendido que a invenção foi descrita como exemplo somente e as modificações podem ser feitas enquanto permanecendo dentro do escopo e conceito inventivo da invenção.
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Claims (58)

1. Sacarídeo capsular modificado caracterizado pelo fato de que compreende um grupo bloqueador em uma posição do grupo hidroxila em pelo menos uma das unidades de monossacarídeo do sacarídeo capsular nativo correspondente, em que o grupo bloqueador tem a fórmula (Ia) ou (Ib): -O-X-Y (Ia) - O-R1 (Ib) em que X é C(O) , S (O) ou SO2; Y é NR1R2 OU R3; Rl é C1- 6 alquila substituída com 1, 2 ou 3 grupos independentemente selecionados de hidroxila, sulfidrila e amina; R2 é H ou C1-6 alquila; R3 é C1-6 alquila.
2. Sacarídeo capsular modificado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o grupo bloqueador tem a fórmula (Ia).
3. Sacarídeo capsular modificado, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que X é C(O).
4. Sacarídeo capsular modificado, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que Y é NR1R2.
5. Sacarídeo capsular modificado, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que R2 é H.
6. Sacarídeo capsular modificado, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que R1 é substituído com 1, 2 ou 3 grupos hidroxila.
7. Sacarídeo capsular modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4, 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que R1 é substituído com um único grupo, esta substituição sendo na extremidade distai da cadeia Ci-6 alquila.
8. Sacarídeo capsular modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4, 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que Rl é substituído com dois grupos vicinais.
9. Sacarídeo capsular modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4, 5, 6, 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que o sacarídeo compreende a) pelo menos um grupo bloqueador em que R1 é substituído com um único grupo, esta substituição sendo na extremidade distai da cadeia C1.6 alquila e b) pelo menos um grupo bloqueador em que R1 é substituído com dois grupos vicinais.
10. Sacarídeo capsular modificado, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a razão de grupos bloqueadores em que R1 é substituído com um único grupo para grupos bloqueadores em que R1 é substituído com dois grupos vicinais é 90:10.
11. Sacarídeo capsular modificado, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que Y é R3.
12. Sacarídeo capsular modificado, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que R3 é CH3.
13. Sacarídeo capsular modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, -10, 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que pelo menos 10% das unidades de monossacarídeo do sacarídeo têm grupos bloqueadores.
14. Sacarídeo capsular modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, -10, 11, 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que todas as unidades de monossacarídeo do sacarídeo têm grupos bloqueadores.
15. Sacarídeo capsular modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, -10, 11, 12, 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que o sacarídeo capsular nativo correspondente compreende unidades de monossacarídeo ligadas por ligações de fosfodiéster.
16. Sacarídeo capsular modificado, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o sacarídeo capsular nativo correspondente é um sacarídeo de Neisseria meningitidis do sorogrupo A.
17. Sacarídeo capsular modificado, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o grupo bloqueador está em quaisquer das 3 e/ou 4 posições do sacarídeo de Neisseria meningitidis do sorogrupo A correspondente.
18. Sacarídeo capsular modificado, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o grupo bloqueador está em quaisquer das 4 posições do sacarídeo de Neisseria meningitidis do sorogrupo A correspondente.
19. Sacarídeo capsular modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, -10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que o sacarídeo capsular modificado é um oligossacarídeo.
20. Sacarídeo capsular modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, -10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que o sacarídeo modificado compreende um grupo hidroxila anomérico terminal ou um grupo amino derivado de um grupo hidroxila anomérico terminal.
21. Sacarídeo capsular modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, -10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que há pelo menos uma unidade de monossacarídeo do sacarídeo capsular modificado onde dois grupos hidroxila vicinais do sacarídeo capsular nativo correspondente não compreende grupos bloqueadores.
22. Sacarídeo capsular modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, -10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das unidades de monossacarídeo do sacarídeo compreende grupos bloqueadores em que R1 é substituído com dois grupos hidroxila vicinais.
23. Sacarídeo caracterizado pelo fato de possuir a fórmula: <formula>formula see original document page 117</formula> onde que T tem a fórmula (A) ou (B): <formula>formula see original document page 118</formula> η é um inteiro de 1 a 100; cada grupo Z é independentemente selecionado de OH, OAc ou um grupo bloqueador como definido nas reivindicações -1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 OU 8 OU 11 ou 12; e cada grupo Q é independentemente selecionado de 0H, OAc ou um grupo bloqueador como definido nas reivindicações -1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 ou 11 ou 12; V é selecionado de -NH2, -NHE, -NE1E2, W2, ou -O-D, onde: E, E1 e E2 são grupos protetores de nitrogênio, que podem ser os mesmos ou diferentes, e D é um grupo protetor de oxigênio; W é selecionado de -OH ou um grupo bloqueador como definido nas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 ou 11 ou 12; W1 é selecionado de -OH ou um grupo bloqueador como definido nas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 ou 11 ou 12; W2 é selecionado de -OH ou um grupo bloqueador como definido nas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 ou 11 ou 12; e em que pelo menos um dos grupos Z e/ou pelo menos um dos grupos Q são grupos bloqueadores como definido nas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 ou 11 ou 12.
24. Sacarídeo, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que pelo menos 10% dos grupos Z são grupos bloqueadores.
25. Sacarídeo, de acordo com a reivindicação 23 ou 24, caracterizado pelo fato de que η é um inteiro de 15 a 25.
26. Sacarídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23, 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que pelo menos 1% dos grupos Q são grupos bloqueadores.
27. Processo para modificar um sacarídeo capsular caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) fornecer um sacarídeo capsular tendo pelo menos um grupo hidroxila em uma unidade de monossacarídeo; e (b) converter pelo menos um grupo hidroxila em um grupo bloqueador como definido nas reivindicações 1, 2, 3, -4, 5, 6, 7 ou 8 ou 11 ou 12.
28. Processo, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o grupo bloqueador é - OC(O)NR1R2 e etapa (b) compreende as etapas de: (bl) reagir o sacarídeo capsular com um reagente bifuncional em um solvente orgânico; e (b2) reagir o produto de etapa (bl) com um composto amino de fórmula (I): HNR1R2 (I) em que R1 e R2 são como definidos nas reivindicações 1 a 8 .
29. Processo, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o grupo bloqueador é - OC(O)R3 e etapa (b) compreende a etapa de: (bl) reagir o sacarídeo capsular com [(R3C(O)I2O na presença de um catalisador de imidazol.
30. Processo, de acordo com a reivindicação 2 8 ou 29, caracterizado pelo fato de que o sacarídeo capsular na etapa (a) é um oligossacarídeo capsular.
31. Processo, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o oligossacarideo capsular é obtido por despolimerização e dimensionamento do polissacarideo capsular nativo correspondente.
32. Processo, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o sacarídeo capsular na etapa (a) é um polissacarideo capsular nativo e o processo ainda compreende uma etapa (c) em que o produto da etapa (b) é dimensionado, desse modo fornecendo um oligossacarideo capsular modificado.
33. Processo para modificar um polissacarideo de Neisseria meningitidis do sorogrupo A caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) fornecer um polissacarideo de Neisseria meningitidis do sorogrupo A nativo; (b) despolimerização e dimensionamento do referido polissacarideo para fornecer um oligossacarideo; e (c) converter pelo menos um grupo hidroxila do oligossacarideo em um grupo bloqueador, das reivindicações -27, 28 ou 29.
34. Processo para modificar um polissacarideo de Neisseria meningitidis do sorogrupo A caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) fornecer um polissacarideo de Neisseria meningitidis do sorogrupo A nativo; (b) converter pelo menos um grupo hidroxila do polissacarideo em um grupo bloqueador das reivindicações 27 a 29; e (c) despolimerizar e dimensionar o polissacarideo resultante.
35. Processo caracterizado pelo fato de que é para preparar o sacarídeo capsular modificado das reivindicações -1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, -18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou 26 que é um processo de síntese total compreendendo formar ligações glicosídicas entre duas ou mais unidades de monossacarídeo.
36. Sacarídeo capsular modificado caracterizado pelo fato de que é obtido pelo processo das reivindicações 27, -28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ou 35.
37. Conjugado de proteína sacarídea caracterizado pelo fato de ser de um sacarídeo modificado das reivindicações -1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, -18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou 26 OU 36.
38. Conjugado, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a proteína é uma toxina ou toxóide bacteriano.
39. Conjugado, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que a toxina ou toxóide bacteriano é toxina ou toxóide da difteria.
40. Conjugado, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a toxina ou toxóide bacteriano é CRM197.
41. Processo para fazer um conjugado de proteína sacarídea caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (c) fornecer um sacarídeo capsular modificado da reivindicação 20; e (d) conjugar o sacarídeo capsular modificado a uma proteína através do grupo hidroxila anomérico terminal ou do grupo amino derivado de um grupo hidroxila anomérico terminal.
42. Processo para fazer um conjugado de proteína sacarídea caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) fornecer um sacarídeo capsular modificado da reivindicação 21; (b) converter pelo menos um dos pares de grupos hidroxila vicinais em grupos aldeído por clivagem oxidativa; e (c) ligar o sacarídeo capsular modificado a uma proteína por aminação redutiva.
43. Processo para fazer um conjugado de proteína sacarídea caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) fornecer um sacarídeo capsular modificado da reivindicação 22; (b) converter pelo menos um dos pares de grupos hidroxila vicinais em grupos aldeído por clivagem oxidativa; e (c) ligar o sacarídeo capsular modificado a uma proteína por aminação redutiva.
44. Processo, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que todos os grupos hidroxila vicinais presentes nos grupos bloqueadores são convertidos em grupos aldeído na etapa (b).
45. Processo, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que as condições para a clivagem oxidativa são selecionadas, tais que somente uma proporção dos grupos hidroxila vicinais presentes nos grupos bloqueadores é convertida em grupos de aldeído na etapa
46. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41, 42, 43, 44 ou 45, caracterizado pelo fato de que a proteína é como definida em quaisquer das reivindicações 38, 39 ou 40.
47. Conjugado de proteína sacarídea de um sacarídeo modificado caracterizado pelo fato de ser obtido pelo processo das reivindicações 41, 42, 43, 44, 45 ou 46.
48. Molécula caracterizada pelo fato de que compreende uma porção sacarídea de fórmula: <formula>formula see original document page 123</formula> em que T tem a fórmula (A) ou (B): <formula>formula see original document page 123</formula> n é um inteiro de 1 a 100; cada grupo Z é independentemente selecionado de OH ou um grupo bloqueador como definido nas reivindicações 1, 2, -3, 4, 5, 6, 7 ou 8 OU 11 ou 12; e cada grupo Q é independentemente selecionado de OH ou um grupo bloqueador como definido nas reivindicações 1, 2, -3, 4, 5, 6, 7 ou 8 ou 11 ou 12; W é selecionado de OH ou um grupo bloqueador como definido nas reivindicaçõesl, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 ou 11 ou 12; L é O, NH, NE, S ou Se; em que a ligação covalente livre de L é unida a um carreador de proteína; e em que o carreador de proteína é como definido nas reivindicações 38, 3 9 ou 40; e em que pelo menos um dos grupos Z e/ou pelo menos um dos grupos Q são grupos bloqueadores como definidos nas reivindicaçõesl, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 ou 11 ou 12.
49. Molécula caracterizada pelo fato de que compreende um sacarídeo de fórmula: <formula>formula see original document page 124</formula> em que T tem a fórmula (A) ou (B): <formula>formula see original document page 124</formula> η, Ζ, Q, W, W1 e V são como definidos na reivindicação -23, e pelo menos um dos grupos Z e/ou pelo menos um dos grupos Q tem a fórmula (IIa) ou (IIb): -O-X-Y' (Ha) -O-R4 (IIb) em que X é C(O), S(O) ou SO2; Y' é NR2R4; R2 é H ou Ci-6 alquil; e R4 é C1-4 alquileno-CH (O) ou -C1-5 alquiIeno-NH-, em que o grupo -NH- é parte de um carreador de proteína; e em que o carreador de proteína é uma proteína definida nas reivindicações 38, 3 9 ou 40.
50. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende (a) um sacarídeo modificado das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, -14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 OU 26 OU 36 e/ou um conjugado de proteína sacarídea das reivindicações -37, 38, 3 9 ou 4 0 ou 47 e/ou uma molécula da reivindicação -48 ou 49, e (b) um carreador farmaceuticamente aceitável.
51. Composição, de acordo com a reivindicação 50, caracterizada pelo fato de que ainda compreendende um antígeno de sacarídeo de um ou mais dos sorogrupos de N.meningitidis C1 W135 e Υ, o sacarídeo opcionalmente sendo um oligossacarídeo e opcionalmente sendo conjugado a uma proteína carreadora.
52. Composição, de acordo com a reivindicação 50 ou -51, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um adjuvante de vacina.
53. Composição, de acordo com a reivindicação 52, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é um fosfato de alumínio.
54. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50, 51, 52 ou 53, caracterizada pelo fato de que é uma vacina contra uma doença causada por N. meningitidis.
55. Método para gerar uma resposta de anticorpo em um mamífero caracterizado pelo fato de que compreende administrar a composição farmacêutica das reivindicações 50 a 54 ao mamífero.
56. Sacarídeo modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, -13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 OU 26 OU -36; conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37, 38, 3 9 ou 4 0 ou 47; ou molécula, de acordo com a reivindicação 4 8 ou 49, caracterizado pelo fato de ser para uso como um medicamento.
57. Uso do polissacarídeo modificado das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, -14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 OU 26 OU 36, ou conjugado das reivindicações 37, 38, 39 ou 40 ou 47, ou molécula, da reivindicação 48 ou 49, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para prevenir ou tratar uma doença causada por uma ou mais bactérias encapsuladas.
58. Uso, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a doença é meningite bacteriana.
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