ES2635488T3 - Sacáridos modificados - Google Patents
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Abstract
Un sacárido capsular modificado que comprende un grupo de bloqueo en una posición de grupo hidroxilo en al menos el 80 % de las unidades de monosacáridos del sacárido capsular nativo correspondiente, en el que el grupo de bloqueo tiene la fórmula (Ia): -O-X-Y (Ia) en la que X es C(O); Y es R3; y R3 es alquilo C1-6 en el que el sacárido capsular nativo correspondiente comprende unidades de monosacárido unidas por enlaces fosfodiéster.
Description
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DESCRIPCION
Sacaridos modificados Campo tecnico
La presente invencion se encuentra en el campo de la qmmica de polisacaridos y se refiere a sacaridos modificados, a procedimientos para su preparacion y a derivados conjugados. En particular, la invencion se refiere a sacaridos modificados que tienen estabilidad mejorada en agua.
Tecnica antecedente
El documento WO 2004/019992 se refiere a sacaridos modificados, a conjugados de los mismos y a su fabricacion.
Los polisacaridos son moleculas biologicas importantes y han sido muy utilizados en la industria farmaceutica para la prevencion y el tratamiento de enfermedades. Por ejemplo, los polisacaridos capsulares se han utilizado durante muchos anos en vacunas contra bacterias capsuladas, tales como meningococos (Neisseria meningitidis), pneumococos (Streptococcus pneumoniae) y Hib (Haemophilus influenzae tipo B).
Para aumentar la inmunogenicidad de estos polisacaridos particularmente en ninos, se desarrollaron vacunas conjugadas. Estas comprenden un polisacarido capsular conjugado con una protema transportadora [por ejemplo, Referencias 1,2, 3]. La conjugacion puede convertir antfgenos T-independientes en antfgenos T-dependientes.
Un problema con muchos tipos de polisacaridos es una mala estabilidad en agua. La estabilidad de los polisacaridos en el agua puede depender de la naturaleza de los enlaces O-glicosfdicos que unen las unidades de sacarido. Una escasa estabilidad en el agua es el resultado de que los enlaces O-glicosfdicos se hidrolizan facilmente en presencia de acidos o glicosidasas. El polisacarido capsular del meningococo de serogrupo A es un ejemplo de un polisacarido que tiene poca estabilidad en agua.
La estabilidad de los polisacaridos es un problema particular en la fabricacion de vacunas conjugadas. Con el fin de preparar un conjugado polisacarido-protema, es necesario manipular grupos qmmicamente funcionales sobre el polisacarido para que el polisacarido pueda estar enlazado a una protema. La exposicion de un polisacarido a reactivos qmmicos en procedimientos para hacer esto, y particularmente a acidos, puede dar como resultado una escision indeseable de enlaces glicosfdicos y la consiguiente fragmentacion del polisacarido. Dicha fragmentacion es altamente indeseable, provocando perdidas en los rendimientos en la smtesis de conjugados polisacarido-protema.
Los polisacaridos que son inestables de esta manera generalmente requieren una cuidadosa seleccion de reactivos y condiciones para eludir los problemas descritos anteriormente. Sin embargo, esto limita los reactivos disponibles para manipular el polisacarido, limitando asf la gama de enlaces que pueden hacerse entre el polisacarido y la protema transportadora. Ademas, la inestabilidad de estos polisacaridos hace que sea diffcil desarrollar procedimientos robustos, que puedan utilizarse para preparar vacunas a escala industrial. La referencia 4 desvela un sacarido capsular modificado que comprende un grupo de bloqueo en una posicion de grupo hidroxilo en al menos una de las unidades de monosacaridos del sacarido capsular nativo correspondiente. Se dice que el sacarido capsular modificado tiene una estabilidad mejorada a la hidrolisis. Un objeto de la invencion es proporcionar sacaridos capsulares modificados o mejorados que tengan una estabilidad mejorada a la hidrolisis.
Divulgacion de la invencion
La invencion se basa en el descubrimiento de que la modificacion de grupos hidroxilo en unidades de monosacarido de sacaridos capsulares con grupos de bloqueo espedficos ofrece una estabilidad mejorada. Los sacaridos modificados obtenidos mediante el procedimiento de la invencion son mas estables a la hidrolisis que sus equivalentes de sacaridos nativos.
Por lo tanto, la presente invencion proporciona un sacarido capsular modificado que comprende un grupo de bloqueo en una posicion de grupo hidroxilo en al menos el 80 % de las unidades de monosacaridos del sacarido capsular nativo correspondiente. El grupo de bloqueo se define a continuacion. El sacarido capsular modificado de la presente invencion es mas estable a la hidrolisis que sus equivalentes de sacaridos nativos. Preferentemente, el sacarido capsular modificado de la presente invencion retiene reactividad cruzada inmunologica con su equivalente de sacarido nativo.
La presente invencion tambien proporciona procedimientos para modificar un sacarido capsular con el grupo de bloqueo; conjugados sacarido-protema que comprenden el sacarido capsular modificado; procedimientos para preparar los conjugados sacarido-protema, composiciones farmaceuticas que comprenden los sacaridos capsulares modificados y/o conjugados sacarido-protema; y procedimientos y usos de los mismos.
Sacaridos modificados de la invencion
La invencion proporciona un sacarido capsular modificado que comprende un grupo de bloqueo en una posicion de grupo hidroxilo en al menos el 80 % de las unidades de monosacaridos del sacarido capsular nativo
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correspondiente. en el que el grupo de bloqueo tiene la formula (la) o (Ib):
-O-X-Y (Ia)
en la que X es C(O);
Y es R3; y R3 es alquilo C1-6
en el que el sacarido capsular nativo correspondiente comprende unidades de monosacarido unidas por enlaces fosfodiester.
Tambien se describen en el presente documento grupos de bloqueo de formula (1a) o (lb):
-O-X-Y (la) -O-R1 (Ib)
en la que:
X es S(O) o SO2;
Y es NR1R2;
R1 es alquilo C1.6 sustituido con 1, 2 o 3 grupos seleccionados independientemente de hidroxilo, sulfihidrilo y amina; y
R2 es H o alquilo C1-6.
Preferentemente, el grupo de bloqueo es de formula (la). En esta realizacion, se prefiere que X sea C(O). Dichos grupos de bloqueo carbamato y ester tienen un efecto estabilizador sobre el enlace glicosfdico y pueden prepararse en condiciones moderadas. A continuacion, se describen ejemplos de procedimientos para manipular un sacarido para proporcionar grupos de bloqueo de carbamato y ester. Sin embargo, la invencion no se limita a sacaridos modificados preparados por los procedimientos ilustrados en el presente documento, y otros procedimientos para preparar sacaridos modificados de la invencion seran facilmente evidentes para el experto en la tecnica.
Tal como se describe en el presente documento, R2 es H.
Tal como se describe en el presente documento, el alquilo C1-6 de R1 esta sustituido con 1, 2 o 3 grupos seleccionados independientemente de hidroxilo, sulfihidrilo y amina. Cuando el alquilo C1-6 esta sustituido con 2 o 3 grupos, las sustituciones pueden ser con el mismo grupo o grupos diferentes, aunque tipicamente seran con el mismo grupo. Preferentemente, el alquilo C1-6 de R1 esta sustituido con 1, 2 o 3 grupos hidroxilo.
Como se describe en el presente documento, R1 puede estar sustituido en cualquier posicion a lo largo de la cadena alquilo C1-6. Preferentemente, al menos una sustitucion esta presente en el extremo distal de la cadena alquilo C1-6. Cuando la cadena alquilo C1-6 es un grupo alquilo de cadena lineal, esto significa que el alquilo C1-6 esta sustituido en Cx, en el que x es el numero total de atomos de carbono en la cadena alquilo C1-6. De forma similar, cuando la cadena alquilo C1-6 es un grupo alquilo de cadena ramificada, esto significa que el alquilo C1-6 esta sustituido en el extremo distal de una de las ramificaciones, tipicamente la ramificacion mas larga.
Tal como se describe en el presente documento, R1 esta sustituido con un grupo individual, siendo esta sustitucion en el extremo distal de la cadena alquilo C1-6, como se ha analizado anteriormente. Dichos grupos son particularmente eficaces al proporcionar una estabilidad mejorada a la hidrolisis. Preferentemente, el grupo individual es un grupo hidroxilo. Por lo tanto, los grupos preferidos incluyen hidroximetilo, 2-hidroxietilo, 3-hidroxipropilo, 4- hidroxibutilo, 5-hidroxipentilo y 6-hidroxihexilo. Un grupo particularmente preferido es 2-hidroxietilo.
Tal como se describe en el presente documento, R1 esta sustituido con dos grupos adyacentes, es decir, dos grupos en posiciones adyacentes a lo largo de la cadena alquilo C1-6. Dichos grupos son particularmente eficaces al proporcionar una estabilidad mejorada a la hidrolisis. Preferentemente, los dos grupos adyacentes estan en el extremo distal de la cadena alquilo C1-6. Cuando la cadena alquilo C1-6 es un grupo alquilo de cadena lineal, esto significa que los dos grupos adyacentes estan en Cx y Cx-1 en los que x es el numero total de atomos de carbono en la cadena alquilo C1-6. De forma similar, cuando la cadena alquilo C1-6 es un grupo alquilo de cadena ramificada, esto significa que los dos grupos adyacentes estan en el extremo distal de una de las ramificaciones, tipicamente la ramificacion mas larga. Preferentemente, los dos grupos adyacentes son grupos hidroxilo. Dichos grupos proporcionan un brazo para la conjugacion a una molecula transportadora, como se analiza a continuacion. Por lo tanto, los grupos preferidos incluyen 1,2-dihidroxietilo; 1,2-dihidroxipropilo y 2,3-dihidroxipropilo; 1,2-dihidroxibutilo, 2,3-dihidroxibutilo y 3,4-dihidroxibutilo; 1,2-dihidroxipentilo, 2,3-dihidroxipentilo, 3,4-dihidroxipentilo y 4,5- dihidroxipentilo; y 1,2-dihidroxihexilo, 2,3-dihidroxihexilo, 3,4-dihidroxihexilo, 4,5-dihidroxihexilo y 5,6-dihidroxihexilo.
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Como se ha indicado anteriormente, se prefiere que los dos grupos adyacentes esten en el extremo distal de la cadena alquilo C1-6. Por lo tanto, los grupos particularmente preferidos incluyen 1,2-dihidroxietilo, 2,3-dihidroxipropilo; 3,4-dihidroxibutilo, 4,5-dihidroxipentilo y 5,6-dihidroxihexilo. Un grupo particularmente preferido es 4,5- dihidroxipentilo.
Tal como se describe en el presente documento, el sacarido capsular modificado comprende al menos dos tipos de grupo de bloqueo (como se ha descrito anteriormente). Por ejemplo, se prefiere que el sacarido comprenda a) al menos un grupo de bloqueo en el que R1 esta sustituido con un unico grupo, siendo esta sustitucion en el extremo distal de la cadena alquilo C1-6 (como se ha descrito anteriormente); y b) al menos un grupo de bloqueo en el que R1 esta sustituido con dos grupos adyacentes (como se ha descrito anteriormente). Dichos grupos de bloqueo mixtos son particularmente eficaces al proporcionar una estabilidad mejorada a la hidrolisis. Ademas, al incluir al menos un grupo de bloqueo en el que R1 esta sustituido con dos grupos hidroxilo adyacentes, se proporciona un brazo para la conjugacion con una molecula transportadora, como se analiza a continuacion.
Preferentemente, R3 es alquilo C1-C3. Mas preferentemente, R3 es alquilo Ci (CH3), tambien se prefieren alquilo C2 y alquilo C3.
Los grupos de bloqueo de formula -O-X-Y o -O-R1 pueden prepararse a partir de grupos hidroxilo (por ejemplo, como se encuentran en la molecula nativa) por procedimientos de derivatizacion estandar, tal como reaccion del grupo hidroxilo con un haluro de acilo, haluro de alquilo, haluro de sulfonilo, etc. Por lo tanto, el atomo de oxfgeno en -O-X- Y es preferentemente el atomo de oxfgeno del grupo hidroxilo, mientras que el grupo -X-Y en -O-X-Y preferentemente reemplaza el atomo de hidrogeno del grupo hidroxilo. Como alternativa, los grupos de bloqueo pueden ser accesibles a traves de una reaccion de sustitucion, tal como una sustitucion de tipo Mitsunobu. Estos y otros procedimientos de preparacion de grupos de bloqueo a partir de grupos hidroxilo son bien conocidos.
Tfpicamente, los sacaridos modificados de la presente invencion son oligosacaridos. Los oligosacaridos pueden obtenerse a partir de polisacaridos mediante cualquiera de los procedimientos de despolimerizacion y dimensionado descritos en el presente documento.
Los sacaridos capsulares modificados de la presente invencion se pueden obtener a partir de sacaridos capsulares nativos. Sin embargo, la presente invencion no se limita a sacaridos modificados obtenidos a partir de sacaridos capsulares nativos. Los sacaridos capsulares modificados de la presente invencion pueden obtenerse por otros procedimientos, tales como smtesis total o parcial (vease, por ejemplo, la referencia 5).
En los sacaridos capsulares modificados de la invencion, el numero de unidades de monosacarido que tienen grupos de bloqueo puede variar. Preferentemente, todas o sustancialmente todas las unidades de monosacarido del sacarido capsular modificado pueden tener grupos de bloqueo. Como alternativa, al menos el 80 % o 90 % de las unidades de monosacarido del sacarido capsular modificado tienen grupos de bloqueo. Al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 unidades de monosacarido del sacarido capsular modificado pueden tener grupos de bloqueo (con la condicion de que al menos el 80 % de Las unidades de monosacarido tengan grupos de bloqueo).
Cuando el sacarido capsular modificado comprende al menos dos tipos de grupo de bloqueo, el numero de unidades de monosacarido que tienen cada tipo de grupo de bloqueo puede variar. Por ejemplo, la proporcion del numero total de grupos de bloqueo constituidos por un tipo de grupo de bloqueo con relacion al otro tipo o tipos de grupo de bloqueo puede variar. En particular, cuando estan presentes dos tipos de grupo de bloqueo, la relacion de un tipo de grupo de bloqueo con respecto al otro tipo de grupo de bloqueo puede seleccionarse de entre 1:20, 1:19, 1:18, 1:17, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2 y 1:1. En particular, como se ha descrito anteriormente, cuando el sacarido comprende a) al menos un grupo de bloqueo en el que R1 esta sustituido con un grupo individual, siendo esta sustitucion en el extremo distal de la cadena alquilo C1-6; y b) al menos un grupo de bloqueo en el que R1 esta sustituido con dos grupos adyacentes, se prefiere que la relacion del primer tipo de grupo de bloqueo con respecto al ultimo tipo de grupo de bloqueo se seleccione de entre 99:1, 98:2, 97:3, 96:4, 95:5, 94:6, 93:7, 92:8, 91:9, 90:10, 89:11, 88:12, 87:13, 86:14, 85:15, 84:16, 83:17, 82:18, 81:19 y 80:20. De estas relaciones, se prefieren particularmente 95:5, 94:6, 93:7, 92:8, 91:9, 90:10, 89:11, 88:12, 87:13, 86:14 y 85:15. De estas, se prefiere 90:10.
De forma analoga, el numero de grupos de bloqueo en una unidad de monosacarido puede variar. Por ejemplo, el numero de grupos de bloqueo en una unidad de monosacarido puede ser de 1, 2, 3, 4, 5 o 6, preferentemente 1-4, mas preferentemente 1 o 2, mucho mas preferentemente 1.
En una realizacion, la al menos una unidad de monosacarido que tiene un grupo de bloqueo incluye una unidad de monosacarido no terminal. La expresion "unidad de monosacarido no terminal" se refiere a una unidad de monosacarido que no es una de las unidades de monosacarido terminales en la cadena de oligosacaridos/polisacaridos.
La presente invencion incluye sacaridos capsulares modificados en los que todas las posiciones del grupo hidroxilo de las unidades de monosacarido terminales y no terminales tienen un grupo de bloqueo. Sin embargo, en algunas realizaciones preferidas, hay al menos un grupo hidroxilo libre o grupo amino en el sacarido capsular modificado de
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la presente invencion. Un grupo hidroxilo libre o un grupo amino es ventajoso porque proporciona un brazo para reacciones adicionales del sacarido capsular modificado, por ejemplo, para la conjugacion con una molecula transportadora, como se analiza a continuacion. Cuando el sacarido modificado contiene un grupo hidroxilo libre, puede ser un grupo hidroxilo anomerico particularmente un grupo hidroxilo anomerico terminal. Cuando el sacarido modificado contiene un grupo amino, puede obtenerse a partir de un grupo hidroxilo anomerico. Los grupos amino son facilmente accesibles a partir de grupos hidroxilo anomericos mediante aminacion reductora (usando, por ejemplo, NaBH3CN/NH4Cl). De forma similar, en otras realizaciones preferidas, hay al menos una unidad de monosacarido del sacarido capsular modificado donde dos grupos hidroxilo adyacentes del sacarido capsular nativo correspondiente no comprenden grupos de bloqueo. Preferentemente, el 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 % o el 20 % de las unidades monosacarido tienen dos grupos hidroxilo adyacentes de esta manera. Por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 unidades de monosacarido tienen dos grupos hidroxilo adyacentes de esta manera. Preferentemente, entre el 5-15 %, mucho mas preferentemente el 10 %, de las unidades monosacarido tienen dos grupos hidroxilo adyacentes de esta manera. Los dos grupos hidroxilo adyacentes en la unidad o unidades de monosacarido son ventajosos porque proporcionan un brazo para la conjugacion con una molecula transportadora, como se analiza a continuacion.
Como alternativa, al menos uno o al menos un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13
%, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 % o el 20 % de las unidades de monosacarido del sacarido capsular
modificado tienen grupos de bloqueo en los que R1 esta sustituido con dos grupos hidroxilo adyacentes, como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,
25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 unidades de monosacarido del sacarido capsular
modificado pueden tener dichos grupos de bloqueo. Preferentemente, entre el 5-15 %, mucho mas preferentemente el 10 %, de las unidades de monosacarido del sacarido capsular modificado tienen grupos de bloqueo en los que R1 esta sustituido con dos grupos hidroxilo adyacentes. Una vez mas, los dos grupos hidroxilo adyacentes en la unidad o unidades de monosacarido son ventajosos porque proporcionan un brazo para la conjugacion con una molecula transportadora, como se analiza a continuacion.
Se ha sugerido en la referencia 4 que los grupos de bloqueo eficaces son grupos aceptores de electrones. Sin desear quedar ligado a teona alguna, se cree que los enlaces glicosfdicos son inestables a la hidrolisis debido a la asistencia de un ataque nucleofilo intramolecular de un grupo hidroxilo sacarido sobre el enlace glicosfdico (es decir por la formacion de un intermedio dclico). Cuanto mayor es la nucleofilicidad del grupo hidroxilo, mayor es la tendencia al ataque nucleofilo intramolecular. Un grupo de bloqueo aceptor de electrones tiene el efecto de deslocalizar el par aislado de oxfgeno, disminuyendo asf la nucleofilia del oxfgeno y disminuyendo la tendencia al ataque nucleofilo intramolecular. De manera sorprendente, se ha encontrado que los grupos que comprenden alquilo C1-6 sustituido con 1, 2 o 3 grupos seleccionados independientemente de hidroxilo, sulfhidrilo y amina pueden ser grupos de bloqueo eficaces, a pesar de la presencia del hidroxilo nucleofilo, sulphidrilo o amina en el grupo de bloqueo. Ademas, estos grupos sustituidos con hidroxilo, sulfhidrilo o amina son ventajosos, ya que permiten una conjugacion mas eficaz del sacarido capsular modificado con una molecula transportadora. Sin desear quedar ligado a teona alguna, se cree que este efecto surge de la hidrofilicidad relativa de grupos que comprenden alquilo C1-6 sustituido con 1,2 o 3 grupos seleccionados independientemente de hidroxilo, sulphidrilo y amina. Ademas, cuando el grupo de bloqueo comprende alquilo C1-6 sustituido con dos grupos hidroxilo adyacentes, el propio grupo de bloqueo proporciona un brazo para la conjugacion con una molecula transportadora.
En todas las realizaciones descritas anteriormente, el sacarido capsular modificado es un sacarido capsular modificado que tiene enlaces fosfodiester. Preferentemente, el sacarido capsular modificado es un sacarido de serogrupo A modificado de Neisseria meningitidis. Los sacaridos de serogrupo A de Neisseria meningitidis son particularmente inestables a la hidrolisis.
Cuando el sacarido capsular modificado es un sacarido de serogrupo A modificado de Neisseria meningitidis, el grupo de bloqueo esta preferentemente en las posiciones 4 y/o 3, mas preferentemente la posicion 4, del sacarido de serogrupo A de Neisseria meningitidis correspondiente. Se ha demostrado que los grupos de bloqueo en el sacarido de serogrupo A de Neisseria meningitidis en las posiciones 4 y/o 3 son particularmente eficaces para mejorar la estabilidad hacia la hidrolisis.
En realizaciones con grupos de bloqueo ester (es decir cuando el grupo de bloqueo es de formula (la), X es C(O) e Y es R3), los inventores han encontrado que la estabilidad de un sacarido de serogrupo A modificado de Neisseria meningitidis se ve afectada por la proporcion de las posiciones 4 y/o 3 que tienen grupos de bloqueo. Por ejemplo, la proporcion de las posiciones 4 que tienen grupos de bloqueo puede ser de aproximadamente el 0 %, al menos el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o aproximadamente el 100 %, siendo preferido al menos el 30 % y aproximadamente el 100 %. De forma similar, la proporcion de las posiciones 3 que tienen grupos de bloqueo puede ser de aproximadamente el 0 %, al menos el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o aproximadamente el 100 %, siendo preferido al menos el 95 % y aproximadamente el 100 %. Tfpicamente, la proporcion de las posiciones 4 y 3 que tienen grupos de bloque o es aproximadamente la misma en cada posicion. En otras palabras, la relacion de las posiciones 4 que tienen grupos de bloqueo con respecto a las posiciones 3 que tienen grupos de bloqueo es de aproximadamente 1:1. Sin embargo, en algunas realizaciones, la proporcion de las posiciones 4 que tienen grupos de bloqueo puede variar con respecto a la proporcion de
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posiciones 3 que tienen grupos de bloqueo. Por ejemplo, la relacion de las posiciones 4 que tienen grupos de bloqueo con respecto a las posiciones 3 que tienen grupos de bloqueo puede ser 1:20. 1:19, 1:18, 1:17, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3 o 1:2. De forma similar, la relacion de las posiciones 3 que tienen grupos de bloqueo con respecto a las posiciones 4 que tienen grupos de bloqueo puede ser 1:20. 1:19, 1:18, 1:17, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3 o 1:2.
La presente invencion tambien proporciona un sacarido de formula:
en la que
T tiene la formula (A) o (B):
n es un numero entero de 1 a 100;
cada grupos Z se selecciona independientemente de -OH, OAc o un grupo de bloqueo como se ha definido anteriormente; y
cada grupo Q se selecciona independientemente de -OH, OAc o un grupo de bloqueo como se ha definido anteriormente;
V se selecciona entre -NH2, -NHE, -NE1E2, W2, o -O-D, en la que: E, E1 y E2 son grupos protectores de nitrogeno, que pueden ser iguales o diferentes, y D es un grupo protector de oxfgeno;
W se selecciona entre -OH o un grupo de bloqueo como se ha definido anteriormente;
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W1 se selecciona entre -OH o un grupo de bloqueo como se ha definido anteriormente;
W2 se selecciona entre -OH o un grupo de bloqueo como se ha definido anteriormente.
y en la que al menos uno (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23,
24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40) de los grupos Z y el 80-99 % de los grupos Q
son grupos de bloqueo como se ha definido anteriormente, el 1-20 % son OAc y el resto son OH.
Preferentemente, n es un numero entero de 15 a 25.
Cada uno de los grupos n+2 Z pueden ser iguales o diferentes entre sl De forma analoga, cada uno de los grupos n+2 Q pueden ser iguales o diferentes entre sl
V es preferentemente -NH2 o -NHE.
Los grupos protectores de nitrogeno adecuados son grupos sililo (tal como TMS, TES, TBS, TIPS), derivados de acilo (tal como trifluoroacetamidas, metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, t-butoxicarbonilo (Boc), benciloxicarbonilo (Z o Cbz), 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), 2-(trimetilsilil)etoxi carbonilo, aliloxicarbonilo (Alloc), 2,2,2- tricloroetoxicarbonilo (Troc)), derivados de sulfonilo (tal como p-trimetilsililetanosulfonilo (SES)), derivados de sulfenilo, alquilo C1-12, bencilo, benzhidrilo, tritilo, alilo, 9-fenilfluorenilo, etc.. Un grupo protector de nitrogeno preferido es Fmoc.
Los grupos protectores de nitrogeno divalentes, que pueden usarse como E1E2, incluyen derivados de imida dclica (tal como N-ftalimidas, N-ditiasuccinimidas, N-2,3-difenilmaleimidas), derivados de imina (tal como N-1,1- dimetiltiometilenoaminas, N-bencilidenoaminas, N-p-metoxibencilidenoaminas, N-difenilmetilenoaminas), derivados de enamina (tal como N-(5,5-dimetil-3-oxo-1-ciclohexenil)aminas), etc.. Un grupo protector de nitrogeno divalente preferido es N-ftalimidilo.
Los grupos protectores de oxfgeno adecuados incluyen esteres, eteres (por ejemplo, eteres de sililo o eteres de alquilo) y acetales. Los ejemplos espedficos incluyen alilo, acetilo Aloc, bencilo, benciloximetilo (BOM), t-butilo, tritilo, terc-butildimetilsililo (TbS), terc-butildifenilsililo (tBdPS), trietilsililo (TES), trimetilsililo (TMS), tri-isopropilsililo (TIPS), parametoxibencilo (pMB), MEM, metoximetilo (MOM), MtM y tetrahidropiranilo (THP).
Todos los grupos Z pueden ser OH (sujeto a que al menos uno de los grupos Z sea un grupo de bloqueo). Como una alternativa a que todos los grupos Z sean OH, al menos el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o el 90 % de los grupos Z pueden ser OAc. Preferentemente, aproximadamente el 60-90 % de los grupos Z son OAc, siendo el resto de los grupos Z OH o grupos de bloqueo como se ha definido anteriormente. Preferentemente, al menos el 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 % o el 40 % de los grupos Z son grupos de bloqueo, el 60-90 % son OAc y el resto son OH. Preferentemente, aproximadamente el 10-40 % de los grupos Z son grupos de bloqueo, el 60-90 % son OAc y el resto son OH. Como alternativa, aproximadamente el 0 %, al menos el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o aproximadamente el 100 % de los grupos Z son grupos de bloqueo, siendo preferido al menos el 95 % y aproximadamente el 100 %.
1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 % o el 20 % de los grupos Q pueden ser OAc. Preferentemente, aproximadamente el 1-20 % de los grupos Q son OAc, Preferentemente, el 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o el 99 % de los grupos Q son grupos de bloqueo, el 1-20 % son OAc y el resto son OH. Preferentemente, aproximadamente el 80-99 % de los grupos Q son grupos de bloqueo, el 1-20 % son OAc y el resto son OH. Como alternativa, al menos el 80 %, 90 %, 95 % o aproximadamente el 100 % de los grupos Q son grupos de bloqueo, siendo preferido aproximadamente el 100 %.
La invencion tambien proporciona una molecula que comprende un resto de sacarido de formula:
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en la que
T tiene la formula (A) o (B):
n, Z, Q y W son como se han definido anteriormente; al menos uno (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40) de los grupos Z y el 80-99 % de los grupos Q son grupos de bloqueo como se ha definido anteriormente, el 1-20 % de los grupos Q son OAc y el resto de los grupos Q son OH; y: L es O, NH, NE, S o Se.
El enlace covalente libre de L puede unirse a cualquier resto apropiado, por ejemplo, a -H, -E, un enlazador, una protema transportadora, etc. L es preferentemente N u O. Tambien es posible que L sea N, unido a un enlazador divalente, a un grupo protector divalente, o a un transportador proteico divalente.
Las identidades preferidas de los grupos n, Z, Q y W se han descrito anteriormente.
La presente invencion tambien proporciona una molecula que comprende un sacarido de formula:
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en la que
T tiene la formula (A) o (B):
n, Z, Q, W, W1 y V son como se han definido anteriormente, y al menos uno (por ejemplo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40) de los grupos Z y/o al menos uno (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40) de los grupos Q tienen la formula (IIa) o (IIb):
-O-X-Y' (IIa) -O-R4 (IIb)
en la que
X es como se ha definido anteriormente;
Y' es NR2R4;
R2 es como se ha definido anteriormente; y
R4 es -alquileno C-m-CH(O) o -alquileno C1-5-NH-, en la que el grupo -NH- es parte de un transportador proteico, y en la que al menos el 80 % de las unidades de monosacarido del sacarido tienen grupos de bloqueo como se define en las reivindicaciones 1-4.
Preferentemente, el al menos uno o mas grupos Z y/o Q son de formula (IIa). En esta realizacion, se prefiere que X
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sea C(O).
Los grupos R2 preferidos se han descrito anteriormente en relacion con las formulas (la).
Los grupos R4 preferidos incluyen -alquileno C-i-CH(O), -alquileno C2-CH(O), -alquileno C3-CH(O) y -alquileno C4- CH(O). Un grupo R4 particularmente preferido es -alquileno C3-CH(O).
Otros grupos R4 preferidos incluyen -alquileno C1-NH-, -alquileno C2-NH-; -alquileno C3-NH-, -alquileno C4-NH- y - alquileno C5-NH-. Un grupo R4 particularmente preferido es -alquileno C4-NH-. Las identidades preferidas de los grupos n, Z, Q, W, W1 y V se han descrito anteriormente.
Proceso para producir un sacarido modificado.
La invencion proporciona un procedimiento para modificar un sacarido capsular que comprende las etapas de:
(a) proporcionar un sacarido capsular que tiene al menos un grupo hidroxilo en una unidad de monosacarido; y y
(b) convertir dicho al menos un grupo hidroxilo en un grupo de bloqueo como se ha definido anteriormente en al menos el 80 % de las unidades de monosacarido del sacarido capsular,
la etapa (b) comprende la etapa de:
(bl) hacer reaccionar el sacarido capsular con [(R3C(O)]2O en presencia de un catalizador de imidazol.
El sacarido capsular puede ser un sacarido capsular nativo (oligosacarido o polisacarido). Como alternativa, el sacarido capsular puede ser, por ejemplo, un sacarido capsular des-O-acetilado y/o un sacarido capsular que tiene un grupo amino terminal (por ejemplo obtenido por aminacion reductora).
Se describe en el presente documento un procedimiento para modificar un sacarido en el que el grupo de bloqueo es -OC(O)NR1R2 cuando la etapa (b) comprende las etapas de:
(b1) hacer reaccionar un sacarido capsular con un reactivo bifuncional en un disolvente organico; y (b2) hacer reaccionar el producto de la etapa (bl) con un compuesto amino de formula (Ill):
HNR1R2 (Ill)
en la que R1 y R2 son como se han definido anteriormente.
La expresion "reactivo bifuncional" se refiere a cualquier reactivo que sea capaz de llevar a cabo las funciones duales de (i) proporcionar en la etapa (b1) un primer atomo de carbono electrofilo para acoplarse con el(los) grupo(s) hidroxilo del sacarido; y (ii) proporcionar un segundo atomo de carbono electrofilo para el acoplamiento con el grupo amino usado en la etapa (b2). En general, el segundo atomo de carbono electrofilo se regenera a partir del primer atomo de carbono electrofilo durante la etapa (b). El reactivo bifuncional proporciona una union -C(O)- entre el polisacarido y el compuesto amino.
Los reactivos bifuncionales para su uso en la presente divulgacion incluyen, pero sin limitacion, 1,1'- carbonildiimidazol (CDl), carbonil di-1,2,4-triazol (CDT), carbonil di-1, 2,3-benzotriazol (CDB), difenilcarbonato, bromuro de cianogeno, fosgeno o trifosgeno. El experto en la materia sera consciente de otros reactivos bifuncionales que pueden realizar la misma funcion que estos.
Un reactivo bifuncional preferido es CDl. CDl tiene la ventaja de ser un reactivo mas suave que, por ejemplo, fosgeno o bromuro de cianogeno. En particular, las reacciones de acoplamiento que usan CDl no generan gases de acido hidrohalico, tales como HCl o HBr. La generacion de gas HCl o HBr es indeseable, porque estos gases requieren el lavado de la salida de la camara de reaccion para evitar su escape hacia la atmosfera. Ademas, la generacion de gas HCl o HBr puede afectar a grupos funcionales sensibles en el sacarido, dando como resultado una perdida en los rendimientos debido a la descomposicion o fragmentacion del sacarido.
El disolvente organico usado en la etapa (bl) es preferentemente un disolvente aprotico. Los disolventes aproticos son bien conocidos por los expertos en la tecnica y no contienen ningun atomo de hidrogeno ionizable. Estos disolventes son ventajosos porque facilitan la reaccion del grupo o grupos hidroxilo en el sacarido con el reactivo bifuncional, mejorando la nucleofilicidad del grupo o los grupos hidroxilo. Los disolventes aproticos adecuados incluyen, pero sin limitacion, dimetilsulfoxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), formamida, hexametilfosforo triamida (HMPT), 1,3-dimetil-3,4,5,6-tetrahidro- 2(1H)-pirimidinona (DMPU), dimetilacetamida (DMAC), o hexametilfosforamida (HMPA). Se prefiere DMSO.
En la etapa (b2) del procedimiento descrito en el presente documento, el producto de la etapa (bl) se hace reaccionar con un compuesto amino para formar el polisacarido modificado. El compuesto amino utilizado en el procedimiento de la presente invencion es de formula (lll), como se ha definido anteriormente.
Tal como se describe en el presente documento, los compuestos amino adecuados que pueden usarse dependen de R1 y R2. Como se ha descrito anteriormente, R1 esta sustituido con un unico grupo hidroxilo, siendo esta sustitucion
en el extremo distal de la cadena alquilo C1-6, y R2 es H. Por lo tanto, los compuestos amino preferidos que pueden usarse incluyen aminometanol, 2-aminoetanol, 3-aminopropan-1-ol, 4-aminobutan-1-ol, 5-aminopentan-1-ol y 6- aminohexil-1-ol. Un compuesto amino particularmente preferido es 2-aminoetanol. Como se describe en el presente documento, R1 esta sustituido con dos grupos hidroxilo adyacentes y R2 es H. Por lo tanto, los compuestos amino 5 preferidos que pueden usarse incluyen 1-aminoetano-1,2-diol; 1-aminopropano-1,2-diol y 3-aminopropano-1,2-diol; 1-aminobutano-1,2-diol, 1-aminobutano-2,3-diol y 4-aminobutano-1,2-diol; 1-aminopentano-1,2-diol, 1-aminopentano- 2,3-diol, 5-aminopentano-2,3-diol y 5-aminopentano-1,2-diol; y 1-aminohexano-1,2-diol, 1-aminohexano-2,3-diol, 5- aminohexano-3,4-diol, 6-aminohexano-2,3-diol y 6-aminohexano-1,2-diol. Como se describe en el presente documento, R1 esta sustituido con dos grupos hidroxilo adyacentes en el extremo distal de la cadena alquilo C1-6. Por 10 lo tanto, los compuestos amino preferidos que pueden usarse incluyen 3-aminopropano-1,2-diol, 4-aminobutano-1,2- diol, 5-aminopentano-1,2-diol y 6-aminohexano-1,2-diol. Un compuesto amino particularmente preferido es 5- aminopentano-1,2-diol. Estos pueden usarse en forma de sal (por ejemplo sal clorhidrato).
Un procedimiento descrito en el presente documento se ilustra en el Esquema 1 a continuacion:
15 En este esquema, el sacarido (por ejemplo, el polisacarido u oligosacarido MenA) se activa primero a traves de al menos uno de sus grupos hidroxilo en una unidad de monosacarido usando CDI en disolvente de DMSO. El intermedio de imidazol-carbamato resultante se atrapa por la amina R1R2NH (por ejemplo, 2-aminoetanol) para dar el sacarido modificado.
Como alternativa, los sacaridos modificados pueden prepararse en un procedimiento de una etapa haciendo 20 reaccionar uno o mas grupos hidroxilo en un sacarido capsular con un reactivo de formula XC(O)NR1R2, en al que X es un grupo saliente, y R1 y R2 son como se han definido anteriormente. Los grupos salientes adecuados incluyen, pero sin limitacion, -Cl, -Br, -CF3, -OC6F5 o -CCl3.
Un procedimiento preferido para modificar un sacarido en el que el grupo de bloqueo es -OC(O)R3 es cuando la etapa (b) comprende la etapa de:
25 (bl) hacer reaccionar el sacarido capsular con [(R3C(O)]2O en presencia de un catalizador de imidazol.
Este procedimiento es particularmente adecuado para modificar un sacarido en el que el grupo de bloqueo es - OC(O)CH3. En esta realizacion, la etapa (b) comprende la etapa de:
(bl) hacer reaccionar el sacarido capsular con [(CH3C(O)]2O (anhfdrido acetico) en presencia de un catalizador de imidazol.
30 Como alternativa, los sacaridos capsulares modificados de la presente invencion pueden prepararse por medios sinteticos, por ejemplo, a partir de unidades de monosacarido adecuadas. Tfpicamente, la smtesis total de un sacarido capsular modificado comprende formar enlaces glicosfdicos (por ejemplo, enlaces fosfodiester) entre unidades de monosacarido adecuadas y luego modificar el sacarido resultante de cualquier manera descrita anteriormente. Como alternativa, las unidades de monosacarido pueden ser modificadas antes de formar los enlaces 35 glicosfdicos para proporcionar el mismo sacarido capsular modificado.
Los sacaridos capsulares modificados de esta invencion son preferentemente oligosacaridos. A partir de polisacaridos capsulares nativos, se pueden obtener oligosacaridos capsulares modificados por cualquiera de dos procedimientos: (1) modificar el polisacarido capsular seguido de despolimerizacion y dimensionamiento del polisacarido modificado para formar un oligosacarido modificado; o (2) despolimerizar y dimensionar el polisacarido 40 capsular seguido por la modificacion del oligosacarido resultante para formar un oligosacarido modificado. Ambos procedimientos se incluyen dentro de la presente invencion. Sin embargo, el primer procedimiento se prefiere en
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ciertas realizaciones, ya que este procedimiento asegura que estara disponible un grupo hidroxilo terminal para la posterior conjugacion del oligosacarido modificado a una molecula transportadora, tal como una protema.
La presente invencion tambien proporciona un procedimiento para modificar un polisacarido del serogrupo A de Neisseria meningitidis que comprende las etapas de:
(a) proporcionar un polisacarido del serogrupo A de Neisseria meningitidis;
(b) despolimerizar y dimensionar dicho polisacarido para proporcionar un oligosacarido; y
(c) convertir al menos un grupo hidroxilo del oligosacarido en un grupo de bloqueo, como se ha descrito anteriormente.
La etapa (b) de este procedimiento puede ir seguida opcionalmente de una o mas etapas de derivatizacion conocidas antes de la etapa (c). Las etapas de derivatizacion conocidas incluyen, por ejemplo, aminacion reductora seguida de proteccion del grupo -NH2 resultante y/o des-O-acetilacion.
La presente invencion tambien proporciona un procedimiento para modificar un polisacarido del serogrupo A de Neisseria meningitidis que comprende las etapas de:
(a) proporcionar un polisacarido del serogrupo A de Neisseria meningitidis;
(b) convertir al menos un grupo hidroxilo del polisacarido en un grupo de bloqueo, como se ha descrito anteriormente; y
(c) despolimerizar y dimensionar el polisacarido resultante para proporcionar un oligosacarido.
La etapa (c) de este procedimiento puede ir seguida opcionalmente de una o mas etapas de derivatizacion conocidas. Las etapas de derivatizacion conocidas incluyen, por ejemplo, aminacion reductora seguida de proteccion del grupo -NH2 resultante y/o des-O-acetilacion.
Cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente puede ir seguido de una etapa en la que se eliminan contaminantes (por ejemplo, contaminantes de bajo peso molecular).
Materiales de partida de sacaridos capsulares
Los sacaridos capsulares modificados de la invencion se pueden obtener a partir de sacaridos capsulares nativos. El termino "sacarido capsular nativo" se refiere a polfmeros que contienen azucar (por ejemplo, polfmeros de azucares, acidos de azucar, amino azucares, alcoholes polihudricos, alcoholes de azucar, y fosfatos de azucaretc.) que pueden encontrarse en la capsula de bacterias (tanto Gram-positivas como Gram-negativas) tales como N.meningitidis, S.pneumoniae y H.influenzae. Ademas, Ademas, el "sacarido capsular nativo" incluye tanto polisacaridos como oligosacaridos. Los oligosacaridos capsulares nativos pueden obtenerse despolimerizando y dimensionando polisacaridos nativos.
La "posicion del grupo hidroxilo" de un sacarido capsular nativo es una posicion en el sacarido capsular nativo que tiene un grupo hidroxilo. Sin embargo, no incluye posiciones en enlaces glicosfdicos, o los residuos de los mismos, que tienen grupos hidroxilo (por ejemplo, un grupo hidroxilo que es parte de un enlace de fosfato no ocupa una posicion de grupo hidroxilo). Tampoco incluye posiciones donde hay un grupo de grupo acetoxi (AcO) en el sacarido capsular nativo, tampoco son posiciones de grupos hidroxilo.
El sacarido capsular nativo comprende unidades sacarido unidas por enlaces fosfodiester. Los sacaridos que comprenden enlaces fosfodiester pueden ser inestables a la hidrolisis.
El sacarido capsular nativo y el sacarido capsular modificado de la invencion son preferentemente inmunogenos en mairnferos (por ejemplo, seres humanos). El mairnfero puede ser un adulto humano o un nino.
El sacarido capsular nativo es preferentemente un polisacarido (o fragmento de oligosacarido del mismo) de N.meningitidis (incluyendo los serogrupos A, B, C, W135 e Y), S.pneumoniae (incluyendo los serotipos 1, 4, 5, 6B, 9V, 14, 18C, 19F y 23F), H.influenzae tipo B, Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, Salmonella typhi, Streptococcus mutans, Cryptococcus neoformans, Moraxella catarrhalis, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, y/o
Pseudomonas aeruginosa.
Aunque la invencion puede aplicarse a cualquier serogrupo de N.meningitidis, se prefiere el uso de un sacarido capsular del serogrupo A ("MenA"). El sacarido capsular MenA es particularmente inestable en solucion acuosa, lo que significa que se necesitan procedimientos especiales para realizar manipulaciones qmmicas (por ejemplo, conjugacion con protemas transportadoras) sobre esta molecula. Sin embargo, los sacaridos MenA modificados de acuerdo con la invencion resultan ventajosamente estables en solucion acuosa.
El polisacarido capsular MenA {^6)-D-ManpNAc(3/4OAc)-a-(1^OPO3^} esta compuesto por residuos de N- acetilmanosamina unidos entre sf por enlaces al-6 fosfodiester que tienen las unidades de repeticion mostradas a continuacion.
De acuerdo con las definiciones anteriores, aproximadamente el 80-99 % de las posiciones 4 son posiciones del grupo hidroxilo, y aproximadamente el 10-40 % de las posiciones 3 son posiciones del grupo hidroxilo. El grupo 1- hidroxi terminal tambien ocupa una posicion del grupo hidroxilo. El grupo 1-hidroxi terminal es un grupo hidroxilo 5 anomerico terminal. El grupo hidroxilo que es parte del grupo -OP(O)(OH)O' no es una posicion del grupo hidroxilo.
Conjugados sacarido-proteina
Los sacaridos modificados de la invencion pueden someterse a cualquier tratamiento aguas abajo usual que se aplique a sacaridos (por ejemplo derivatizacion, conjugacion, fragmentacion, etc.). etc.). Para aumentar la inmunogenicidad, los sacaridos modificados de la invencion se conjugan preferentemente con una protema 10 transportadora. La conjugacion con protemas transportadoras es particularmente util para vacunas pediatricas [6] y es una tecnica bien conocida [por ejemplo revisado en las ref. 7 a 15 etc.]. El polisacarido puede estar unido directamente a la protema [2, 16] o puede unirse a traves de un grupo enlazador. Se han propuesto muchos tipos diferentes de grupos enlazadores para unir polisacaridos a protemas [por ejemplo 3, 17].
Por lo tanto, la invencion proporciona un conjugado de una protema y un sacarido modificado de la invencion. La 15 protema puede conjugarse directamente con el sacarido, o puede usarse un enlazador. Se puede usar cualquier qmmica de enlazador adecuada. La estabilidad mejorada del polisacarido modificado permite usar ventajosamente una amplia gama de enlaces.
Como se ha descrito anteriormente, en algunas realizaciones se prefiere que el sacarido capsular modificado tenga al menos un grupo hidroxilo libre o grupo amino que puede usarse como un brazo para la posterior union a una 20 protema transportadora.
Se puede obtener un sacarido capsular modificado que tiene un grupo hidroxilo libre bloqueando selectivamente grupos hidroxilo en un sacarido capsular, o desbloqueando selectivamente un sacarido capsular modificado en el que se bloquean todos los grupos hidroxilo. Como alternativa, se puede revelar un grupo hidroxilo libre mediante la despolimerizacion y el dimensionado de un sacarido capsular modificado. Preferentemente, el al menos un grupo
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hidroxilo libre es un grupo hidroxilo anomerico terminal. Se prefiere el grupo hidroxilo anomerico terminal como el grupo hidroxilo libre porque un grupo hidroxilo anomerico terminal puede revelarse por despolimerizacion y dimensionamiento de un sacarido capsular modificado.
Se puede obtener un sacarido capsular modificado que tiene un grupo amino libre mediante aminacion reductora de un grupo hidroxilo anomerico terminal, opcionalmente seguido de proteccion del grupo -NH2 resultante. La reaccion de aminacion reductora puede llevarse a cabo antes o despues de la etapa de modificacion de la presente invencion. Preferentemente, la aminacion reductora se lleva a cabo antes de la etapa de modificacion de la presente invencion puesto que el grupo -NH2 resultante puede protegerse/desprotegerse selectivamente en presencia de grupos hidroxilo/grupos de bloqueo.
Por ejemplo, la presente invencion proporciona un procedimiento para preparar un conjugado sacarido-protema que comprende las etapas de:
(a) proporcionar un sacarido capsular modificado de la invencion, en el que el sacarido modificado comprende un grupo hidroxilo anomerico terminal o un grupo amino derivado de un grupo hidroxilo anomerico terminal; y
(b) unir el sacarido capsular modificado a una protema a traves del grupo hidroxilo anomerico terminal o el grupo amino derivado de un grupo hidroxilo anomerico terminal.
La protema es preferentemente una toxina o toxoide bacteriano, en particular una toxina o toxoide de difteria. Por ejemplo, la protema es preferentemente CRM197.
Los enlaces a traves de un grupo enlazador pueden realizarse usando cualquier procedimiento conocido, por ejemplo, los procedimientos descritos en las referencias 3 y 17. Un tipo preferido de enlace es un enlazador carbonilo, que puede formarse por reaccion de un grupo hidroxilo libre del sacarido modificado con CDI [18, 19] seguido de reaccion con una protema para formar un enlace carbamato. Otro tipo preferido de union es un enlazador de acido adfpico, que puede formarse acoplando un grupo -NH2 libre en el sacarido modificado con acido adfpico (usando, por ejemplo, activacion de diimida), y a continuacion acoplando una protema al intermedio sacarido-acido adfpico resultante. [11, 20, 21]. Otros enlazadores incluyen B-propionamido [22], nitrofenil-etilamina [23], haluros de haloacilo [24], enlaces glicosfdicos [25], acido 6-aminocaproico [26], ADH [27], restos de C4 a C12 [28] etc.
La conjugacion puede implicar: reduccion del termino anomerico en un grupo hidroxilo primario, proteccion/desproteccion opcional del grupo hidroxilo primario; reaccion del grupo hidroxilo primario con CDI para formar un intermedio de carbamato de CDI; y acoplar el intermedio de carbamato de CDI con un grupo amino en una protema.
El Esquema 2 muestra dos ejemplos diferentes de como un sacarido capsular puede conjugarse a una protema transportadora, de acuerdo con la presente invencion. En el primer ejemplo, la protema se conjuga a traves de un grupo hidroxilo terminal. En el segundo ejemplo, la protema esta unida a traves de un grupo amino terminal.
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Las uniones directas a la protema pueden comprender la oxidacion del polisacarido seguido de aminacion reductora con la protema, como se describe, por ejemplo, en las referencias 2 y 16. Por ejemplo, en las realizaciones en las que hay al menos una unidad de monosacarido del sacarido capsular modificado donde dos grupos hidroxilo adyacentes del sacarido capsular nativo correspondiente no comprenden grupos de bloqueo, uno o mas pares de grupos hidroxilo adyacentes pueden convertirse en grupos aldehndo por escision oxidativa (por ejemplo NaIO4, Pb(OAc)4, etc.). El sacarido capsular modificado puede unirse entonces a la protema mediante aminacion reductora.
Por ejemplo, la presente invencion proporciona un procedimiento para preparar un conjugado sacarido-protema que comprende las etapas de:
(a) proporcionar un sacarido capsular modificado de la invencion en el que hay al menos una unidad de monosacarido del sacarido capsular modificado donde dos grupos hidroxilo adyacentes del sacarido capsular nativo correspondiente no comprenden grupos de bloqueo;
(b) convertir al menos uno de los pares de grupos hidroxilo adyacentes en grupos aldehndo por escision oxidativa; y
(c) unir el sacarido capsular modificado a una protema por aminacion reductora.
La protema es preferentemente una toxina o toxoide bacteriano, en particular una toxina o toxoide de difteria. Por ejemplo, la protema es preferentemente CRM197.
Como se ha descrito anteriormente, al menos una de las unidades de monosacarido del sacarido capsular modificado comprenden grupos de bloqueo en los que R1 esta sustituido con dos grupos hidroxilo adyacentes. Los dos grupos hidroxilo adyacentes pueden usarse como un brazo para la posterior union a una protema transportadora. Por ejemplo, uno o mas pares de grupos hidroxilo adyacentes pueden convertirse en grupos aldehndo por escision oxidativa (por ejemplo, NaIO4 Pb(OAc)4, etc.). El sacarido capsular modificado puede unirse
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entonces a la protema mediante aminacion reductora.
Por ejemplo, se describe en el presente documento un procedimiento para preparar un conjugado sacarido-protema que comprende las etapas de:
(a) proporcionar un sacarido capsular modificado de la invencion en el que al menos una de las unidades de monosacarido comprenden bloques de bloqueo en los que R1 esta sustituido con dos grupos hidroxilo adyacentes;
(b) convertir al menos uno de los pares de grupos hidroxilo adyacentes en grupos aldehndo por escision oxidativa; y
(c) unir el sacarido capsular modificado a una protema por aminacion reductora.
La protema es preferentemente una toxina o toxoide bacteriano, en particular una toxina o toxoide de difteria. Por ejemplo, la protema es preferentemente CRM197.
Tal como se describe en el presente documento, todos los grupos hidroxilo adyacentes presentes en los grupos de bloqueo se convierten en grupos aldehndo en la etapa (b). En algunas realizaciones, el numero de grupos aldehndos producidos depende del numero total de grupos de bloqueo en los que R1 esta sustituido con dos grupos hidroxilo adyacentes que estan presentes en el sacarido capsular modificado. En otras realizaciones, las condiciones para la escision oxidativa se seleccionan de tal forma que solo una proporcion de los grupos hidroxilo adyacentes presentes en los grupos de bloqueo se convierten en grupos aldetndo. En algunas realizaciones, el numero de grupos aldehndos producidos depende del numero total de grupos de bloqueo en los que R1 esta sustituido con dos grupos hidroxilo adyacentes que estan presentes en el sacarido capsular modificado y las condiciones seleccionadas. En dichas realizaciones, se prefiere que el 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 % o el 20 % de las unidades de monosacarido del sacarido capsular modificado tengan grupos de bloqueo que se conviertan en los grupos aldehndo. Por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 unidades de monosacarido tienen grupos de bloqueo que se convierten en grupos aldehndo. Preferentemente, entre el 5-15 %, mucho mas preferentemente el 10 %, de las unidades de monosacarido tienen grupos de bloqueo que se convierten en grupos aldehndo.
El Esquema 3 muestra dos ejemplos adicionales de como un sacarido capsular puede conjugarse a una protema transportadora, tal como se describe en el presente documento. En el primer ejemplo (a la izquierda), todos los grupos de bloqueo tienen grupo R1 que esta sustituido con dos grupos hidroxilo adyacentes. Una proporcion (por ejemplo, 10 %) de estos grupos hidroxilo adyacentes se convierte en grupos aldehndo para su conjugacion con una protema. En el segundo ejemplo (a la derecha), estan presentes dos tipos de grupo de bloqueo. Una proporcion de estos (por ejemplo 10 %) tienen un R1 que esta sustituido con dos grupos hidroxilo adyacentes. Todos estos grupos hidroxilo adyacentes se convierten en grupos aldehndo para su conjugacion con una protema.
Las protemas transportadoras preferidas son toxinas o toxoides bacterianos, tales como toxoides de difteria o tetanos. Estos son comunmente utilizados en las vacunas conjugadas. Se prefiere particularmente el toxoide de difteria CRM197 [29]. Otras protemas transportadoras adecuadas incluyen la protema de la membrana externa de 5 N.meningitidis [30], peptidos sinteticos [31,32], protemas de choque termico [33, 34], protemas de la tos ferina [35,36], protema D de H.influenzae [37], citocinas [38], linfocinas [38], hormonas [38], factores de crecimiento [38], toxina A o B de C.difficile [39], protemas captadoras de hierro [40] etc. Es posible usar mezclas de protemas transportadoras.
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Despues de la conjugacion, pueden separarse sacaridos libres y conjugados. Existen muchos procedimientos adecuados, incluyendo cromatograffa hidrofoba, ultrafiltracion tangencial, diafiltracion, etc. [veanse tambien las ref. 41, 42 etc.].
Una protema transportadora individual puede llevar multiples sacaridos diferentes [43].
Composiciones y procedimientos farmaceuticos
Las composiciones hechas usando los procedimientos de la invencion son farmaceuticamente aceptables. Pueden incluir componentes ademas del sacarido modificado y/o conjugado, por ejemplo, incluiran tipicamente uno o mas vehmulos farmaceuticos. Una discusion exhaustiva de dichos componentes se encuentra disponible en la referencia 44. Por lo tanto, la invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende (a) un sacarido modificado de la invencion y/o un conjugado de la invencion, y (b) un vehmulo farmaceuticamente aceptable. La composicion es preferentemente una composicion inmunogena (por ejemplo, una vacuna). Las vacunas basadas en sacaridos o conjugados sacarido-protema se conocen bien en la tecnica.
Las composiciones pueden incluir uno o mas tampones. Los tampones tfpicos incluyen: un tampon fosfato; un tampon Tris; un tampon borato; un tampon succinato; un tampon histidina; o un tampon citrato. Los tampones tfpicamente se incluiran en el intervalo 5-20 mM.
Para controlar la tonicidad, se prefiere que incluyan una sal fisiologica, tal como una sal sodica. Se prefiere cloruro sodico (NaCl), que puede estar presente entre 1 y 20 mg/ml. Otras sales que pueden estar presentes incluyen cloruro de potasio, dihidrogenofosfato potasico, fosfato disodico deshidratado, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, etc.
Las composiciones tendran generalmente una osmolalidad de entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, preferentemente entre 240-360 mOsm/kg, y preferentemente se encontraran dentro del intervalo de 290-310 mOsm/kg. Se ha notificado previamente que la osmolalidad no tiene un impacto en el dolor causado por la vacunacion [45], pero se mantiene preferentemente la osmolalidad en este intervalo.
El pH de una composicion estara generalmente entre 5,0 y 80, y mas tipicamente entre 5,5 y 6,5, por ejemplo, entre 6,5 y 7,5. Un procedimiento de la invencion puede incluir por lo tanto una etapa de ajuste del pH de la vacuna en bruto antes de su envasado.
La composicion es preferentemente esteril. La composicion es preferentemente no pirogena, por ejemplo, que contiene <1 UE (unidad de endotoxina, una medida estandar) por dosis, y preferentemente <0,1 UE por dosis. La composicion es preferentemente sin gluten.
La composicion puede incluir un conservante tal como tiomersal o 2-fenoxietanol. Se prefiere, sin embargo, que la vacune este sustancialmente libre de (es decir menos de 5 pg/ml) material de mercurio, por ejemplo, libre de tiomersal. Las vacunas que no contienen mercurio son las mas preferidas.
La composicion puede incluir material para una unica inmunizacion, o puede incluir material para multiples inmunizaciones (es decir un "kit multidosis"). Se prefiere la inclusion de un conservante en las disposiciones multidosis.
Las vacunas se administran tfpicamente en un volumen de dosificacion de aproximadamente 0,5 ml.
Las composiciones se almacenan preferentemente entre 2 °C y 8 °C. No deben congelarse. Idealmente deben mantenerse alejadas de la luz directa.
Cuando una composicion incluye un conjugado, tambien puede comprender una protema transportadora no conjugada, pero se prefiere que la cantidad de vehmulo no conjugado con respecto a la cantidad total de ese vehmulo sea inferior al 5 %.
Las composiciones de la invencion son adecuadas para la administracion a pacientes humanos, y la invencion proporciona composiciones de la invencion para su uso en un procedimiento para aumentar una respuesta inmune en un paciente, que comprende la etapa de administrar dicha composicion al paciente. La invencion tambien proporciona las composiciones de la invencion para su uso como medicamentos. La invencion tambien proporciona el uso de un sacarido modificado y/o de un conjugado de la invencion, en la fabricacion de un medicamento para aumentar una respuesta inmune en un paciente. La respuesta inmunitaria suscitada por estos usos incluira generalmente una respuesta de anticuerpos, preferentemente una respuesta de anticuerpos protectores contra la infeccion meningococica. Las enfermedades causadas por Neisseria incluyen meningitis, septicemia y gonorrea. Se prefiere la prevencion y/o el tratamiento de la meningitis bacteriana.
Las composiciones se pueden administrar de diversas maneras. La ruta de inmunizacion mas preferida es por inyeccion intramuscular (por ejemplo, en el brazo o la pierna), pero otras rutas disponibles incluyen inyeccion subcutanea, intranasal [46-48], oral [49], intradermica [50,51], transcutanea, transdermica [52 ], etc.
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Las composiciones preparadas de acuerdo con la invencion pueden usarse para tratar tanto a ninos como a adultos. El paciente puede tener menos de 1 ano de edad, 1-5 anos de edad, 5-15 anos de edad, 15-55 anos de edad, o al menos 55 anos de edad. El paciente puede ser anciano (por ejemplo >50 anos de edad, preferentemente >65 anos), joven (por ejemplo <5 anos), pacientes hospitalizados, trabajadores de la salud, personal militar y de las fuerzas armadas, mujeres embarazadas, enfermos cronicos, pacientes inmunodeprimidos, personas que han viajado al extranjero. Estas composiciones no son unicamente adecuadas para estos grupos, sin embargo, y pueden usarse de manera mas general en una poblacion.
El tratamiento puede ser una pauta de una sola dosis o una pauta de multiples dosis. Pueden usarse multiples dosis en una pauta de inmunizacion primaria y/o en una pauta de inmunizacion de refuerzo. En una pauta de multiples dosis, las diversas dosis pueden administrarse por la misma o por diferentes rutas, por ejemplo, un cebado parenteral y un refuerzo mucosal, un cebado mucosal y un refuerzo parenteral, etc. La administracion de mas de una dosis (tfpicamente dos dosis) es particularmente util en los pacientes inmunologicamente no expuestos previamente. Se aplicaran multiples dosis separadas por al menos 1 semana (por ejemplo, aproximadamente 2 semanas aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc.).
Las composiciones de la invencion pueden administrarse a pacientes en sustancialmente el mismo tiempo que (por ejemplo durante la misma consulta medica o visita a un profesional de la salud) otras composiciones, y en particular al mismo tiempo que otras vacunas.
Las composiciones inmunogenas comprenden una cantidad inmunologicamente eficaz de antfgeno de sacarido, asf como cualquier otro de otros componentes especificados, segun sea necesario. Por "cantidad inmunologicamente eficaz", se entiende que la administracion de esa cantidad a un individuo, ya sea en una unica dosis o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento o la prevencion. Esta cantidad vana dependiendo de la salud y condicion ffsica del individuo a tratar, la edad, el grupo taxonomico del individuo a tratar (por ejemplo primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de proteccion deseado, la formulacion de la vacuna, la evaluacion del medico tratante de la situacion medica, y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad este en un intervalo relativamente amplio que se puede determinar a traves de ensayos de rutina. El tratamiento de dosificacion puede ser un programa de dosis unica o un programa de dosis multiples (por ejemplo, incluyendo dosis de refuerzo).
Las vacunas de acuerdo con la invencion pueden ser profilacticas (es decir para prevenir la infeccion) o terapeuticas (es decir, para tratar la enfermedad despues de la infeccion), pero normalmente seran profilacticas.
Adyuvantes
Las composiciones de la invencion pueden incluir ventajosamente un adyuvante, que pueden funcionar para potenciar las respuestas inmunitarias suscitadas en un paciente que recibe la composicion. Los adyuvantes que se pueden usar con la invencion incluyen, pero sin limitacion:
• Una composicion que contiene mineral, incluyendo sales de calcio y sales de aluminio (o mezclas de las mismas). Las sales de calcio incluyen fosfato calcico (por ejemplo, las partfculas "CAP" desveladas en la referencia 53). Las sales de aluminio incluyen hidroxidos, fosfatos, sulfatos, etc., adoptando las sales cualquier forma adecuada (por ejemplo gel, cristalina, amorfa, etc.). Se prefiere la adsorcion a estas sales. Las composiciones que contienen minerales tambien pueden formularse en forma de una partfcula de una sal metalica [54]. Los adyuvantes de sales de aluminio se describen en mas detalle mas adelante.
• Una emulsion de aceite en agua, como se describe con mas detalle a continuacion.
• Un oligonucleotido inmunoestimulador, tal como uno que contiene un motivo CpG (una secuencia dinucleotfdica que contiene una citosina no metilada unida por un enlace fosfato a una guanosina), un motivo TpG [55], un ARN bicatenario, un oligonucleotido que contiene una secuencia palmdroma, o un oligonucleotido que contiene una secuencia poli(dG). Los oligonucleotidos inmunoestimuladores pueden incluir modificaciones/analogos de nucleotidos, tales como modificaciones fosforotioato y pueden ser bicatenarios o (excepto para el ARN) monocatenarios. Las referencias 56 a 58 desvelan posibles sustituciones analogas, por ejemplo, el reemplazo de guanosina con 2'-desoxi-7-desazaguanosina. El efecto adyuvante de los oligonucleotidos de CpG se discute adicionalmente en las ref. 59-64. Una secuencia CpG puede dirigirse a TLR9, tal como el motivo GTCGTT o TTCGTT [65]. La secuencia CpG pueden ser espedfica para una respuesta inmune de Thl, tal como un ODN (oligodesoxinucleotido) CpG-A, o puede ser mas espedfica para inducir una respuesta a linfocitos B, tal como un ODN CpG-B. los ODN CpG-A y CpG-B se analizan en las ref. 66-68. Preferentemente, el CpG es un ODN CpG- A. Preferentemente, el oligonucleotido CpG se construye de manera que el extremo 5' sea accesible para el reconocimiento del receptor. Opcionalmente, dos secuencias de oligonucleotido CpG pueden unirse en sus extremos 3' para formar "inmunomeros". Vease, por ejemplo, las referencias 65 y 69-71. Un adyuvante CpG util es CpG7909, tambien conocido como ProMune™ (Coley Pharmaceutical Group, Inc.). Los oligonucleotidos inmunoestimuladores comprenderan tfpicamente al menos 20 nucleotidos. Pueden comprender menos de 100 nucleotidos.
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• monofosforil Ifpido A 3-O-desacilado ("3dMPL", tambien conocido como "MPL™") [72-75]. 3dMPL se ha preparado a partir de un mutante sin heptosa de Salmonella minnesota, y es qmmicamente similar al Upido A pero carece de un grupo fosforilo inestable a acido y un grupo acilo inestable a base. La preparacion de 3dMPL se describio originalmente en la referencia 76. 3dMPL puede tomar la forma de una mezcla de moleculas relacionadas, variando por su acilacion (por ejemplo, teniendo 3, 4, 5 o 6 cadenas acilo, que pueden ser de diferentes longitudes). Los dos monosacaridos de glucosamina (tambien conocido como 2-desoxi-2-amino- glucosa) estan N-acilados en sus carbonos de la posicion 2 (es dear, en las posiciones 2 y 2'), y tambien hay O- acilacion en la posicion 3'.
• Un compuesto de imidazoquinolina, tal como Imiquimod ("R-837") [77,78], Resiquimod ("R-848") [79], y sus analogos; y sales del mismo (por ejemplo las sales clorhidratos). Pueden encontrarse mas detalles sobre imidazoquinolinas inmunoestimuladoras en las referencias 80 a 84.
• Un compuesto de tiosemicarbazona, tal como los desvelados en la referencia 85. Los procedimientos de formulacion, fabricacion y cribado para compuestos activos tambien se describen en la referencia 85. Las tiosemicarbazonas son particularmente eficaces en la estimulacion de celulas mononucleares de sangre periferica humana para la produccion de citocinas, tal como TNF-a.
• Un compuesto de triptantrina, tal como los desvelados en la referencia 86. Los procedimientos de formulacion, fabricacion y cribado para compuestos activos tambien se describen en la referencia 86. Las tiosemicarbazonas son particularmente eficaces en la estimulacion de celulas mononucleares de sangre periferica humana para la produccion de citocinas, tal como TNF-a.
• Un analogo nucleosfdico, tales como: (a) Isatorabina (ANA-245; 7-tia-8-oxoguanosina):
y profarmacos del mismo; (b) ANA975; (c) ANA-025-1; (d) ANA380; (e) los compuestos desvelados en las referencias 87 a 89; (f) un compuesto que tiene la formula:
en la que:
cada uno de Ri y R2 es independientemente H, halo, -NRaRb, -OH, alcoxi C1-6, alcoxi C1-6 sustituido, heterociclilo, "heterociclilo sustituido", arilo C6-10, arilo C6-10 sustituido, alquilo C1-6, o alquilo C1-6 sustituido;
R3 esta ausente, H, alquilo C1-6, alquilo C1-6 sustituido, arilo C6-10, arilo C6-10 sustituido, heterociclilo, o heterociclilo sustituido;
cada uno de R4 y R5 es independientemente H, halo, heterociclilo, "heterociclilo sustituido", -C(O)-Rd, alquilo C1-6, alquilo C1-6 sustituido, o unidos juntos para formar un anillo de 5 miembros como en R4-5:
nW
“<a
*1
X2
Rg
consiguiendose la union en los enlaces indicados por -~w cada uno de X1 y X2 es independientemente N, C, O o S;
Re es H, halo, -Oh, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, -OH, -NRaRb, -(CH2)n-O-Rc, -O-(alquilo C1.6), - S(O)pRa, o -C(O)-Rd;
R9 es H, alquilo C1-6, alquilo C1.6 sustituido, heterociclilo, heterociclilo sustituido o Rga, en la que Rga es:
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consiguiendose la union en el enlace indicado por -~w
cada uno de R10 y R11 es independientemente H, halo, alcoxi C1-6, alcoxi C1-6 sustituido, -NRaRb, o -OH;
cada Ra y Rb es independientemente H, alquilo C1-6, alquilo C1-6 sustituido, -C(O)Rd, arilo C6-10;
cada Rc es independientemente H, fosfato, difosfato, trifosfato, alquilo C1-6, o alquilo C1-6 sustituido;
cada Rd es independientemente H, halo, alquilo C1-6, alquilo C1-6 sustituido, alcoxi C1-6, alcoxi C1-6 sustituido, -
NH2, -NH(alquilo C1.6), -NH(alquilo C1.6 sustituido), -N(alquilo C1-a)2, -N(alquilo C1.6 sustituido)2, arilo C6-10, o
heterociclilo;
cada Re es independientemente H, alquilo C1-6, alquilo C1.6 sustituido, arilo Ca-10, arilo Ca-10 sustituido, heterociclilo, o heterociclilo sustituido;
cada Rf es independientemente H, alquilo C1-6, alquilo C1.6 sustituido, -C(O)Rd, fosfato, difosfato, o trifosfato; cada n es independientemente 0, 1, 2, o 3; cada p es independientemente 0, 1 o 2; o
o (g) una sal farmaceuticamente aceptable de cualquiera de (a) a (f), un tautomero de cualquiera de (a) a (f), o una sal farmaceuticamente aceptable del tautomero.
• Loxoribina (7-alil-8-oxoguanosina) [90].
• Compuestos desvelados en la referencia 91, incluyendo: compuestos de acilpiperazina, compuestos de indolediona, compuestos de tetrahidraisoquinolina (THIQ), compuestos de benzociclodiona, compuestos de aminoazavinilo, compuestos de aminobenzoimidazol quinolinona (ABIQ) [92,93], compuestos de hidrafhalamida, compuestos de benzofenona, compuestos de isoxazol, compuestos de esterol, compuestos de quinazilinona, compuestos de pirrol [94], compuestos de antraquinona, compuestos de quinoxalina, compuestos de triazina, compuestos de pirazalopirimidina, y compuestos de benzazol [95].
• Compuestos desvelados en la referencia 96, incluyendo 3,4-di(1H-indol-3-il)-1H-pirrol-2,5-dionas, analogos de estaurosporina, piridazinas derivatizadas, cromen-4-onas, indolinonas, quinazolinas, y analogos nucleosfdicos.
• Un derivado de fosfato de aminoalquilo glucosaminida, tal como RC-529 [97,98].
• Un fosfazeno, tal como poli[di(carboxilatofenoxi)fosfazeno] ("PCPP") como se describe, por ejemplo, en las referencias 99 y 100.
• Inmunopotenciadores de molecula pequena (SMIP), tales como:
N2-metil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina N2,N2-dimetil-1-(2-metilpropil)-1H-
imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina N2-etil-N2-metil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolina- 2,4-diamina N2-metil-1-(2-metilpropil)-N2-propil-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina 1-(2-metilpropil)-N2-propil-1H- imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina N2-butil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina N2-butil- N2-metil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina N2-metil-1-(2-metilpropil)-N2-pentil-1H- imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina N2-metil-1-(2-metilpropil)-N2-prop-2-enil-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4- diamina 1-(2-metilpropil)-2-[(fenilmetil)tio]-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina 1-(2-metilpropil)-2-(propiltio)-1H- imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina 2-[[4-amino-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-2-il](metil)amino]etanol acetato de 2-[[4-amino-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-2-il](metil)amino]etilo 4-amino-1-(2- metilpropil)-1,3-dihidro-2H-imidazo[4,5-c]quinolin-2-ona N2-butil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-1H- imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina N2-butil-N2-metil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-1H-imidazo[4,5- c]quinolina-2,4-diamina
N2-metil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina N2,N2-dimetil-1-(2- metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina 1-{4-amino-2-[metil(propil)amino]-1H- imidazo[4,5-c]quinolin-1-il}-2-metilpropan-2-ol 1-[4-amino-2-(propilamino)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]-2- metilpropan-2-ol N4,N4-dibencil-1-(2-metoxi-2-metilpropil)-N2-propil-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina.
Saponinas [capftulo 22 de la ref. 131], que son un grupo heterologo de glicosidos de esterol y glicosidos triterpenoides que se encuentran en la corteza, hojas, tallos, rafces e incluso flores de una amplia gama de especies de plantas. Las saponinas de la corteza del arbol quillay Quillaia saponaria Molina se han estudiado ampliamente como adyuvantes. Las saponinas tambien pueden obtenerse en el mercado a partir de Smilax ornata (sarsaprilla), Gypsophilla paniculata (velo de novia), y Saponaria officianalis (saponaria). Las formulaciones de adyuvante de saponina incluyen formulaciones purificadas, tal como QS21, asf como formulaciones de lfpidos, tales como ISCOM. QS21 se comercializa como Stimulon™. Las composiciones de saponina se han purificado usando HPLC y RP-HPLC. Se han identificado fracciones purificadas espedficas usando estas tecnicas, incluyendo QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B y QH-C. Preferentemente, la saponina
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es QS21. Un procedimiento de produccion de QS21 se desvela en la ref. 101. Las formulaciones de saponina tambien pueden comprender un esterol, tal como colesterol [102]. Las combinaciones de saponinas y colesteroles pueden utilizarse para formar partfculas unicas denominadas complejos inmunoestimulantes (ISCOM) [capftulo 23 de la ref. 131]. Los ISCOM tambien incluyen tipicamente un fosfolfpido tal como fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina. Cualquier saponina conocida puede ser usada en ISCOM. Preferentemente, el ISCOM incluye uno o mas de QuilA, QHA y QHC. Los ISCOM se describen adicionalmente en las ref. 102-104. Opcionalmente, los ISCOM pueden estar desprovistos de detergente adicional [105]. Puede encontrarse una revision del desarrollo de adyuvantes basados en saponina en las ref. 106 y 107.
• Toxinas de ribosilacion de ADP bacterianas (por ejemplo la enterotoxina inestable al calor E.coli "LT", toxina del colera "CT", o toxina de pertussis "PT") y derivados detoxificados de las mismas, tales como las toxinas mutantes conocidas como LT-K63 y LT-R72 [108]. El uso de toxinas de ribosilacion de ADP desintoxicadas como adyuvantes de la mucosa se describe en la ref. 109 y como adyuvantes parenterales en la ref. 110.
• Bioadhesivos y mucoadhesivos, tales como microesferas de acido hialuronico esterificado [111] o quitosano y sus derivados [112].
• Las micropartfculas (es decir una partfcula de ~100 nm a ~150 pm de diametro, mas preferentemente de ~200 nm a ~30 pm de diametro, o de ~500 nm a ~10 pm de diametro) formadas a partir de materiales que son biodegradables y no toxicos (por ejemplo, un poli(acido a-hidroxi), un acido polihidroxibutrnco, un poliortoester, un polianhndrido, una policaprolactona, etc.), prefiriendose poli(lactida-co-glicolida), tratada opcionalmente para que tenga una superficie cargada negativamente (por ejemplo, con SDS) o una superficie cargada positivamente (por ejemplo, con un detergente cationico, tal como CTAb).
• Liposomas (capttulos 13 y 14 de la ref. 131). Los ejemplos de formulaciones de liposomas adecuados para su uso como adyuvantes se describen en las ref. 113-115.
• Eteres de polioxietileno y esteres de polioxietileno [116]. Dichas formulaciones incluyen ademas tensioactivos de ester de polioxietileno sorbitan en combinacion con un octoxinol [117] asf como tensioactivos de eteres o ester de polioxietileno alquilo en combinacion con al menos un tensioactivo no ionico adicional, tal como octoxinol [118]. Los eteres de polioxietileno se seleccionan entre el siguiente grupo: eter de polioxietilen-9-laurilo (lauril eter 9), polioxietilen-9-esteoril eter, polioxitilen-8-esteoril eter, polioxietilen-4-lauril eter, polioxietilen-35-lauril eter, y polioxietilen-23-lauril eter.
• Peptidos de muramilo, tales como N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina ("thr-MDP"), N-acetil-normuramil-L- alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilglucsaminil-N-acetilmuramil-L-A1-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxi propilamida ("DTP-DPP", o "Theramida™), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'dipalmitoil-sn-glicero-3- hidroxifosforiloxi)-etilamina ("MTP-PE").
• Una preparacion de proteosomas proteicos de membrana externa preparada a partir de una primera bacteria Gram negativa en combinacion con una preparacion de liposacarido (LPS) derivada de una segunda bacteria Gram negativa, en la que el proteosoma proteico de membrana externa y las preparaciones de LPS forman un complejo coadyuvante no covalente estable. Tales complejos incluyen "IVX-908", un complejo compuesto por la membrana externa de Neisseria meningitidis y LPS.
• Metil inosina 5'-monofosfato ("MIMP") [119].
• Un compuesto de pirrolizidina polihidroxilada [120], tal como uno que tiene la formula:
donde R se selecciona entre el grupo que comprende hidrogeno, grupos lineales o ramificados, sin sustituir o sustituidos, saturados o insaturados acilo, alquilo (por ejemplo cicloalquilo), alquenilo, alquinilo y arilo, o una sal farmaceuticamente aceptable o derivado de los mismos. Los ejemplos incluyen, pero sin limitacion: casuarina, casuarina-6-a-D-glucopiranosa, 3-epi-casuarina, 7-epi-casuarina, 3,7-diepi-casuarina, etc.
• Una gamma inulina [121] o derivado de la misma, tal como algamulina.
• Un compuesto de formula I, II o III, o una sal del mismo:
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como se define en la referencia 122, tal como "ER 803058", "ER 803732", "ER 804053", "ER 804058", "ER 804059", "ER 804442", "ER 804680", "ER 804764", ER 803022 o "ER 804057", por ejemplo:
• Derivados de Ifpido A de Escherichia coli tal como OM-174 (descritos en las ref. 123 y 124).
• Una formulacion de un lfpido cationico y un co-lfpido (normalmente neutro), tal como aminopropil-dimetil- miristoleiloxi-propanaminio bromuro-difitanoilfosfatidil-etanolamina ("Vaxfectin™") o aminopropil-dimetil-bis- dodeciloxi-propanaminio bromuro-dioleoilfosfatidil-etanolamina ("GAP-DLRIE:DOPE"). Se prefieren las formulaciones que contienen sales (±)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(syn-9-tetradecenoiloxi)-1- propanaminio [125].
• Compuestos que contienen lfpidos unidos a una cadena principal adclica que contiene fosfato, tal como el antagonista TLR4 E5564 [126,127]:
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Estos y otros adyuvantes-sustancias activas se analizan con mas detalle en las referencias 131 y 132. Las composiciones pueden incluir dos o mas de dichos adyuvantes.
Los antigenos y adyuvantes en una composicion estaran tipicamente en mezcla.
Adyuvantes de emulsion de aceite en agua
Las emulsiones de aceite en agua son particularmente utiles como coadyuvantes. Se conocen varias emulsiones de este tipo, que tipicamente incluyen al menos un aceite y al menos un tensioactivo, siendo el uno o mas aceites y tensioactivos biodegradables (metabolizables) y biocompatibles. Las gotitas de aceite en la emulsion son generalmente de menos de 5 pm de diametro, e incluso pueden tener un diametro submicrometrico, siendo estos pequenos tamanos obtenidos con un microfluidificador para proporcionar emulsiones estables. Se prefieren gotitas con un tamano inferior a 220 nm, ya que pueden someterse a esterilizacion por filtracion.
La invencion se puede usar con aceites tales como los de una fuente animal (tal como el pescado) o vegetal. Las fuentes de aceites vegetales incluyen nueces, semillas y granos. El aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite de coco y aceite de oliva, que son los mas comunmente disponibles, ilustran los aceites de nueces. Puede usarse aceite de yoyoba, por ejemplo, obtenido de la alubia de la yoyoba. Los aceites de semillas incluyen aceite de cartamo, aceite de semillas de algodon, aceite de girasol, aceite de sesamo y similares. En el grupo de los granos, el aceite de mafz es el mas facilmente disponible, pero tambien se puede usar el aceite de otros cereales tales como trigo, avena, centeno, arroz, teff, triticale y similares. Los esteres de acidos grasos de 6-10 carbonos de glicerol y 1,2-propanodiol, aunque no aparecen naturalmente en los aceites de semillas, pueden prepararse mediante hidrolisis, separacion y esterificacion de los materiales adecuados partiendo de los aceites de nueces y semillas. Las grasas y aceites de leche de mairnfero son metabolizables y por lo tanto pueden usarse en la practica de la presente invencion. Los procedimientos para la separacion, purificacion, saponificacion y otros medios necesarios para obtener aceites puros de fuentes animales se conocen bien en la tecnica. La mayona de los peces contienen aceites metabolizables que pueden recuperarse facilmente. Por ejemplo, el aceite de hugado de bacalao, aceites de hugado de tiburon, y el aceite de ballena, tal como el esperma de ballena ejemplifican varios de los aceites de peces que pueden usarse en el presente documento. Una serie de aceites de cadena ramificada se sintetizan bioqmmicamente en unidades de isopreno de 5 carbonos, y se citan generalmente como terpenoides. El aceite de hugado de tiburon contiene terpenoides ramificados e insaturados conocidos como escualeno, 2,6,10,15,19,23-hexametil- 2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno, que se prefiere particularmente en el presente documento. El escualano, el analogo saturado del escualeno, es tambien un aceite preferido. Los aceites de pescado, incluyendo escualano y escualeno, estan facilmente disponibles a traves de fuentes comerciales o pueden obtenerse mediante procedimientos conocidos en la tecnica. Otros aceites preferidos son los tocoferoles (vease mas adelante). Pueden usarse mezclas de aceites.
Los tensioactivos pueden clasificarse segun su "HLB" (equilibrio hidrofilo/lipofilo). Los tensioactivos de la invencion preferidos tienen un HLB de al menos 10, preferentemente al menos 15, y mas preferentemente al menos 16. La invencion puede usarse con tensioactivos incluyendo, pero sin limitacion: los tensioactivos de esteres de polioxietileno sorbitan (normalmente citados como Tween), especialmente el polisorbato 20 y el polisorbato 80; copolfmeros de oxido de etileno (EO), oxido de propileno (PO), y/o oxido de butileno (BO), comercializado con el nombre comercial DOWFAX™, tal como copolfmero de bloque de EO/PO lineal; octoxinoles, que pueden variar en el numero de grupos etoxi de repeticion (oxi-1,2-etanodiilo), siendo octoxinol-9 (Triton X-100, o t- octilfenoxipolietoxietanol) de particular interes; (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolfpidos tal como fosfatidilcolina (lecitina); esteres grasos de polioxietileno derivados de alcoholes launlicos, cetflicos, esteanlicos y oleflicos (conocidos como tensioactivos Brij), tal como trietilenglicol monolauril eter (Brij 30); y esteres de sorbitan (conocidos comunmente como los SPAN), tal como trioleato de sorbitan (Span 85) y monolaurato de sorbitan. Los tensioactivos preferidos para incluir en la emulsion son Tween 80 (monooleato de polioxietilensorbitan), Span 85 (trioleato de sorbitan), lecitina y Triton X-100. Pueden usarse mezclas de tensioactivos, por ejemplo, mezclas Tween 80/Span 85.
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Los adyuvantes de emulsion de aceite en agua espedficos utiles con la invencion incluyen, pero sin limitacion:
• Una emulsion submicronica de escualeno, Tween 80, y Span 85. La composicion de la emulsion en volumen puede ser de aproximadamente el 5 % de escualeno, aproximadamente el 0,5 % de polisorbato 80 y aproximadamente el 0,5 % de Span 85. En terminos de peso, estas proporciones se convierten en le 4,3 % de escualeno, el 0,5 % de polisorbato 80 y el 0,48 % de Span 85. Este adyuvante se conoce como "MF59" [128130], como se describe con mas detalle en el Capftulo 10 de la ref. 131 y el capftulo 12 de la ref. 132. La emulsion MF59 incluye ventajosamente iones citrato, por ejemplo, tampon citrato sodico 10 mM.
• Una emulsion de escualeno, un tocoferol, y Tween 80. La emulsion puede incluir una solucion salina tamponada con fosfato. Tambien puede incluir Span 85 (por ejemplo al 1 %) y/o lecitina. Estas emulsiones pueden tener del 2 al 10 % de escualeno, del 2 al 10 % de tocoferol y del 0,3 al 3 % de Tween 80, y la relacion en peso de escualeno:tocoferol es preferentemente <1, ya que proporciona una emulsion mas estable. Una emulsion de este tipo se puede preparar disolviendo Tween 80 en PBS para dar una solucion al 2 %, mezclando despues 90 ml de esta solucion con una mezcla de (5 g de DL-a-tocoferol y 5 ml de escualeno), y despues microfluidizando la mezcla. La emulsion resultante puede tener gotitas de aceite submicronicas, por ejemplo con un diametro medio de entre 100 y 250 nm, preferentemente aproximadamente 180 nm.
• Una emulsion de escualeno, un tocoferol y un detergente Triton (por ejemplo, Triton X-100).
• Una emulsion de escualano, polisorbato 80 y poloxamero 401 ("Pluronic™ L121"). La emulsion se puede formular en solucion salina tamponada con fosfato, pH 7,4. Esta emulsion es un vefuculo de suministro util para dipeptidos de muramilo y se ha usado con treonil-MDP en el adyuvante "SAF-1" [133] (0,05-1 % de Thr-MDP, 5 % de escualano, 2,5 % de Pluronic L121 y 0,2 % de Polisorbato 80). Tambien puede usarse sin el Thr-MDP, como en el adyuvante "AF" [134] (5 % de escualano, 1,25 % de Pluronic L121 y 0,2 % de Polisorbato 80). Se prefiere la microfluidizacion.
• Una emulsion que tiene del 0,5-50 % de un aceite, el 0,1-10 % de un fosfoftpido, y el 0,05-5 % de un tensioactivo no ionico. Tal como se describe en la referencia 135, los componentes fosfolipfdicos preferidos son fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, acido fosfatfdico, esfingomielina y cardiolipina. Los tamanos de gota submicrometricos son ventajosos.
• Una emulsion submicronica de aceite en agua de un aceite no metabolizable (tal como aceite mineral ligero) y al menos un tensioactivo (tal como lecitina, Tween 80 o Span 80). Pueden incluirse aditivos tales como QuilA saponina, colesterol, un conjugado saponina-lipofilo (tal como GPI-0100, descrito en la referencia 136, producido por adicion de amina alifatica a desacilsaponina a traves del grupo carboxilo de acido glucuronico), bromuro de dimetildioctadecilamonio y/o N,N-dioctadecil-N,N-bis (2-hidroxietil) propanodiamina.
• Una emulsion en la que una saponina (por ejemplo QuilA o QS21) y un esterol (por ejemplo un colesterol) se asocian como micelas helicoidales [137].
Las emulsiones pueden mezclarse extemporaneamente con el antfgeno, en el momento de la administracion. Por lo tanto, el adyuvante y el antfgeno pueden mantenerse por separado en una vacuna envasada o distribuida, lista para la formulacion final en el momento de su uso. El antfgeno estara generalmente en una forma acuosa, de manera que la vacuna se prepara finalmente mezclando dos ftquidos. La relacion en volumen de los dos ftquidos para mezclar puede variar (por ejemplo entre 5:1 y 1:5) pero es generalmente de aproximadamente 1:1.
Adyuvantes de sales de aluminio
Pueden usarse los adyuvantes conocidos como hidroxido de aluminio y fosfato de aluminio. Estos nombres son convencionales, pero se usan solo por conveniencia, ya que ninguno es una descripcion precisa del compuesto qmmico real que esta presente (por ejemplo, vease el capftulo 9 de la referencia 131). La invencion puede usar cualquiera de los adyuvantes de "hidroxido" o "fosfato" que se usan generalmente como adyuvantes.
Los adyuvantes conocidos como "hidroxido de aluminio" son tfpicamente sales de oxihidroxido de aluminio, que normalmente son al menos parcialmente cristalinas. El oxihidroxido de aluminio, que puede representarse por la formula AlO(OH), puede distinguirse de otros compuestos de aluminio, tales como hidroxido de aluminio Al(OH)3, mediante espectroscopfa infrarroja (IR), en particular por la presencia de una banda de adsorcion a 1070 cm'1 y un fuerte desnivel a 3090-3100 cm-1 [capftulo 9 de la ref. 131]. El grado de cristalinidad de un adyuvante de hidroxido de aluminio se refleja por el ancho de la banda de difraccion a media altura (WHH), mostrando las partfculas poco cristalinas un mayor ensanchamiento de la ftnea debido a los tamanos cristalinos menores. El area superficial aumenta a medida que aumenta la WHH, y se ha demostrado que los adyuvantes con mayores valores de WHH tienen mayor capacidad de adsorcion de antfgeno. Un morfologfa fibrosa (por ejemplo tal como se observa en micrograffas electronicas de transmision) es tfpica para los adyuvantes de hidroxido de aluminio. El pi de los adyuvantes de hidroxido de aluminio es tfpicamente aproximadamente 11, es dear, el propio adyuvante tiene una carga superficial positiva a pH fisiologico. Se han comunicado capacidades de adsorcion de entre 1,8-2,6 mg de protema por mg de Al+++ a pH 7,4 para adyuvantes de hidroxido de aluminio.
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Los adyuvantes conocidos como "fosfato de aluminio" son tipicamente hidroxifosfatos, que a menudo contienen tambien una pequena cantidad de sulfato (es dear, sulfato de hidroxisulfato de aluminio). Pueden obtenerse por precipitacion, y las condiciones y concentraciones de reaccion durante la precipitacion influyen en el grado de sustitucion de fosfato para el hidroxilo en la sal. Los hidroxifosfatos tienen generalmente una relacion molar PO4/Al entre 0,3 y 1,2. Los hidroxifosfatos pueden distinguirse de AlPO4 estrictos por la presencia de grupos hidroxilo. Por ejemplo, una banda de espectro IR a 3164 cm-1 (por ejemplo, cuando se calienta a 200 °C) indica la presencia de hidroxilos estructurales [cap. 9 de ref. 131]
La relacion molar PO4/Al3+ de un adyuvante de fosfato de aluminio sera en general entre 0,3 y 1,2, preferentemente entre 0,8 y 1,2, y mas preferentemente 0,95 ± 0,1. El fosfato de aluminio sera generalmente amorfo, particularmente para sales de hidroxifosfato. Un adyuvante tipico es hidroxifosfato de aluminio amorfo con una relacion molar PO4/Al entre 0,84 y 0,92, incluida a 0,6 mg de Al3+/ ml. El fosfato de aluminio sera generalmente particulado (por ejemplo, morfologfa tipo placa como se ve en microgratias electronicas de transmision). Los diametros tipicos de las particulas estan en el intervalo de 0,5-20 pm (por ejemplo, aproximadamente 5-10 pm) despues de cualquier adsorcion de antigeno. Se han comunicado capacidades de adsorcion de entre 0,7-1,5 mg de protema por mg de Al+++ a pH 7,4 para adyuvantes de fosfato de aluminio.
El punto de carga cero (PZC) del fosfato de aluminio esta inversamente relacionado con el grado de sustitucion del hidroxilo por fosfato, y este grado de sustitucion puede variar dependiendo de las condiciones de reaccion y la concentracion de reactivos utilizados para preparar la sal por precipitacion. El PZC tambien se altera cambiando la concentracion de iones fosfato libres en solucion (mas fosfato esta asociado con un PZC mas acido) o anadiendo un tampon, tal como un tampon de histidina (hace que el PZC sea mas basico). Los fosfatos de aluminio usados de acuerdo con la invencion tendran un PZC de entre 4,0 y 7,0, mas preferentemente entre 5,0 y 6,5 por ejemplo, aproximadamente 5,7.
Las suspensiones de sales de aluminio usadas para preparar composiciones de la invencion pueden contener un tampon (por ejemplo un fosfato o una histidina o un tampon Tris), pero no siempre es necesario. Las suspensiones son preferentemente esteriles y estan libres de pirogenos. Una suspension puede incluir iones fosfato acuoso libres, por ejemplo, presentes a una concentracion entre 1,0 y 20 mM, preferentemente entre 5 y 15 mM, y mas preferentemente de aproximadamente 10 mM. Las suspensiones tambien pueden contener cloruro de sodio.
La invencion puede usar una mezcla tanto de hidroxido de aluminio como de fosfato de aluminio. En este caso, puede hacer mas fosfato de aluminio que hidroxido, por ejemplo, una relacion en peso de al menos 2:1, por ejemplo >5:1, >6:1, >7:1, >8:1, >9:1, etc.
La concentracion de Al+++ en una composicion para su administracion a un paciente es preferentemente menor de 10 mg/ml, por ejemplo <5 mg/ml, <4 mg/ml, <3 mg/ml, <2 mg/ml, <1 mg/ml, etc. Un intervalo preferido es entre 0,3 y 1 mg/ml.
Antigenos adicionales
Ademas de los sacaridos y/o conjugados modificados, la composicion puede comprender otros componentes antigenicos. Por ejemplo, la composicion puede incluir uno o mas sacaridos adicionales (modificados o no segun la invencion). Por ejemplo, la composicion puede comprender sacaridos de los serogrupos C, W135 e Y de N. meningitidis (por ejemplo, ademas de un sacarido MenA modificado). Estos se conjugaran tipicamente con protemas transportadoras, y sacaridos de diferentes serogrupos de N.meningitidis pueden conjugarse con la misma o diferentes protemas transportadoras. Cuando una mezcla comprende sacaridos capsulares de ambos serogrupos A y C, se prefiere que la relacion (p/p) de sacarido MenA:sacarido MenC sea mayor de 1 (por ejemplo 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 o superior). Se ha observado una inmunogenicidad mejorada del componente MenA cuando esta presente en exceso (masa/dosis) con respecto al componente MenC [138].
La composicion tambien puede comprender antigenos proteicos.
Los antigenos que pueden incluirse en la composicion de la invencion incluyen:
- un antigeno proteico del serogrupo B de N.meningitidis (vease a continuacion).
- una preparacion de vesmula de membrana externa (OMV) de N.meningitidis, tal como las desveladas en las ref. 139, 140, 141, 142 etc.
- antigenos de Helicobacter pylori tales como CagA [143 a 146], VacA [147, 148], NAP [149, 150, 151], HopX [por ejemplo 152], HopY [por ejemplo 152] y/o ureasa.
- un antigeno de sacarido de Streptococcus pneumoniae [por ejemplo 153, 154, 155].
- un antigeno del virus de la hepatitis A, tal como un virus inactivado [por ejemplo 156, 157].
- un antigeno del virus de la hepatitis B, tal como los antigenos de superficie y/o nucleo [por ejemplo., 157, 158].
- un antigeno del virus de la hepatitis C [por ejemplo 159].
- un antigeno acelular de Bordetella pertussis, tal como la holotoxina de pertussis (PT) y hemaglutinina filamentosa
(FHA) de B.pertussis, opcionalmente tambien junto con pertactina y/o aglutimgenos 2 y 3 [por ejemplo, las ref. 160 y 161].
- un antigeno celular de Bordetella pertussis.
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- un antigeno de difteria, tal como un toxoide de difteria [por ejemplo, capftulo 3 de la ref. 162] por ejemplo, el mutante CRM197 [por ejemplo 163].
- uno o mas antfgenos de la polio [por ejemplo 164, 165] tal como el virus de la polio inactivado (IPV)
- un antigeno del tetanos, tal como un toxoide tetanoso [por ejemplo, capftulo 4 de la ref. 162].
- un antigeno de sacarido, de Haemophilus influenzae B [por ejemplo, las ref. 166 a 174].
- antigenos de sarampion, paperas y/o rubeola [por ejemplo, capftulos 9, 10 y 11 de la ref. 162].
- un antigeno de N.gonorrhoeae.
- un antigeno de Chlamydia pneumoniae [por ejemplo, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181].
- un antigeno de Chlamydia trachomatis [por ejemplo, 182].
- un antigeno de Porphyromonas gingivalis [por ejemplo, 183].
- uno o mas antigenos de la rabia [por ejemplo 184] tal como un virus inactivado liofilizado [por ejemplo, 185, RabAvert™].
- uno o mas antfgenos de influenza [por ejemplo, capftulo 19 de la ref. 162], tal como las protemas de superficie hemaglutinina y/o neuraminidasa.
- un antigeno de Moraxella catarrhalis [por ejemplo 186].
- un antigeno de Streptococcus agalactiae (estreptococos del grupo B) [por ejemplo, 187, 188].
- un antigeno de sacarido de Streptococcus agalactiae (estreptococos del grupo B).
- un antigeno de Streptococcus pyogenes (estreptococos del grupo A) [por ejemplo, 188, 189, 190].
- un antigeno de Staphylococcus aureus [por ejemplo, 191].
- un antigeno de Bacillus antracis [por ejemplo, 192, 193, 194].
- un antigeno del virus del herpes simple (HSV). Un antigeno de HSV preferido para su uso con la invencion es una glicoprotema de membrana gD. Se prefiere el uso de gD de una cepa de HSV-2 (antfgeno de "gD2"). La composicion puede usar una forma de gD en la que se ha suprimido la region de anclaje de membrana C- terminal [195] por ejemplo, una gD truncada que comprende los aminoacidos 1-306 de la protema natural con la adicion de aparagina y glutamina en el extremo C-terminal. Esta forma de la protema incluye el peptido senal que se escinde para producir una protema madura de 283 aminoacidos. La eliminacion del anclaje permite que la protema se prepare en forma soluble.
- un antfgeno del virus del papiloma humano (HPV). Los antfgenos de HPV preferidos para su uso con la invencion son protemas de la capside L1, que pueden ensamblarse para formar estructuras conocidas como partmulas pseudovmcas (VLP). Las VLP pueden producirse por expresion recombinante de L1 en celulas de levadura (por ejemplo en S.cerevisiae) o en celulas de insecto (por ejemplo en celulas de Spodoptera, tal como celulas de S.frugiperda, o en celulas de Drosophila). Para las celulas de levadura, los vectores plasirndicos pueden portar el uno o mas genes L1; para las celulas de insecto, los vectores de baculovirus pueden portar el uno o mas genes L1. Mas preferentemente, la composicion incluye VLP de L1 de cepas de HPV-16 y HPV-18. Esta combinacion bivalente ha demostrado ser altamente eficaz [196]. Ademas de las cepas HPV-16 y HPV-18, tambien es posible incluir VLP de L1 de cepas de HPV-6 y HPV-11. Tambien es posible el uso de cepas oncogenicas de VPH. Una vacuna puede incluir entre 20-60 pg/ml (por ejemplo aproximadamente 40 pg/ml) de L1 por cepa de HPV.
- un antfgeno de un virus de la familia de los flaviviridae (genero flavivirus), tal como el virus de la fiebre amarilla, virus de la encefalitis japonesa, cuatro serotipos de virus del dengue, el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas y el virus del Nilo Occidental.
- un antfgeno de pestivirus, tal como el virus de la fiebre porcina clasica, el virus de la diarrea vmca bovina y/o el virus de la enfermedad fronteriza.
- un antfgeno de parvovirus por ejemplo, del parvovirus B 19.
- una protema prionica (por ejemplo, la protema prion CJD)
- una protema amiloide, tal como un peptido beta [197]
- un antfgeno de cancer, tal como los enumerados en la Tabla 1 de la ref. 198 o en las tablas 3 y 4 de la ref. 199.
La composicion puede comprender uno o mas de estos antfgenos adicionales.
Los antfgenos proteicos toxicos pueden desintoxicarse cuando sea necesario (por ejemplo, destoxificacion de la toxina pertussis por medios qmmicos y/o geneticos [161]).
Cuando se incluye un antfgeno difterico en la composicion, se prefiere tambien incluir antfgenos del tetanos y antfgenos de pertussis. De forma similar, cuando se incluye un antfgeno tetanico, se prefiere tambien incluir antfgenos de difteria y pertussis. De forma similar, cuando se incluye un antfgeno de pertussis, se prefiere tambien incluir antfgenos de difteria y tetanos.
Los antfgenos pueden adsorberse a una sal de aluminio.
Los antfgenos en la composicion estaran tfpicamente presentes a una concentracion de al menos 1 pg/ml cada uno. En general, la concentracion de cualquier antfgeno dado sera suficiente para provocar una respuesta inmune contra ese antfgeno.
Como alternativa al uso de antfgenos de protemas en la composicion de la invencion, puede usarse acido nucleico que codifica el antfgeno [por ejemplo, las ref. 200 a 208]. Por lo tanto, los componentes de protemas de las composiciones de la invencion pueden reemplazarse asf por acido nucleico (preferentemente ADN, por ejemplo, en forma de un plasmido) que codifica la protema.
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Antiaenos meninaococicos no sacaridos
Aunque los sacaridos capsulares de los serogrupos A, C, W135 e Y meninaococicos pueden usarse para generar inmunidad protectora, el mismo enfoque no ha funcionado para el serogrupo B. Por lo tanto, los sacaridos y conjugados modificados de la invencion pueden usarse juntos (por ejemplo, por separado o en mezcla) con antfgenos meninaococicos que no estan basados en sacaridos capsulares, por ejemplo, antfgenos protemicos, lipopolisacaridos o vesteulas de membrana.
Se han comunicado secuencias genomicas para los serogrupos A [209] y B [210,211] meninaococicos, y se pueden seleccionar antfgenos proteicos adecuados a partir de los polipeptidos codificados [por ejemplo, ref. 212-217]. Los antfgenos candidatos han sido manipulados para mejorar la expresion heterologa [ref. 218 a 220].
Una composicion preferida incluye una protema Tbp y una protema Hsf [221]. Hsf es una protema autotransportadora [222-224], tambien conocida como nhhA [224], GNA0992 [212] o NMB0992 [210]. Tbp es la protema de union a la transferrina [225-228], e incluye TbpA y TbpB y las formas de alto peso molecular y bajo peso molecular de TbpA y TbpB. Tbp incluye las protemas individuales descritas anteriormente y los complejos de las protemas y cualquier otra protema o complejos de los mismos capaces de unirse a la transferrina. Aunque la Tbp puede referirse a las formas de TbpA o TbpB de alto o bajo peso molecular, se prefiere que esten presentes formas tanto de alto peso molecular como de bajo peso molecular de TbpA y/o TbpB. Mas preferentemente, esta presente TbpA de alto peso molecular y bajo peso molecular.
Otra composicion preferida incluye al menos un antfgeno seleccionado de cada una de al menos dos categonas diferentes de protema que tienen funciones diferentes dentro de Neisseria. Los ejemplos de tales categonas de protemas son: adhesinas, protemas autotransportadoras, toxinas, protemas integrales de la membrana externa y protemas de adquisicion de hierro. Estos antfgenos se pueden seleccionar como se indica a continuacion, usando la nomenclatura de referencia 229: al menos una adhesina de Neisseria seleccionada del grupo que consiste en FhaB, NspA PilC, Hsf, Hap, MafA, MafB, Omp26, NMB0315, NMB0995, NMB1119 y NadA; al menos un autotransportador de Neisseria seleccionado del grupo que consiste en Hsf, Hap, proteasa IgA, AspA, y NadA; al menos una toxina de Neisseria seleccionada del grupo que consiste en FrpA, FrpC, FrpA/C, VapD, NM-ADPRT (NMB1343) y uno o ambos del inmunotipo de LPS L2 y el inmunotipo de LPS L3; al menos una protema de adquisicion de Fe de Neisseria seleccionada del grupo que consiste en TbpA, TbpB, LbpA, LbpB, HpuA, HpuB, Lipo28 (GNA2132), Sibp, NMB0964, NMB0293, FbpA, Bcp, BfrA, BfrB y P2086 (XthA); al menos una protema asociada a la membrana de Neisseria, preferentemente, la protema de membrana externa, en particular la protema de membrana externa integral, seleccionada del grupo que consiste en PilQ, OMP85, FhaC, NspA, TbpA, LbpA, TspA, TspB, TdfH, PorB, MItA, HpuB, HimD, HisD, GNA1870, OstA, HlpA (GNA1946), NMB1124, NMB1162, NMB1220, NMB1313, NMB1953, HtrA, y PLDA (OMPLA). Se dice que estas combinaciones de antfgenos de Neisseria conducen a un aumento sorprendente de la eficacia de la vacuna contra la infeccion por Neisseria [229].
Las composiciones particularmente preferidas incluyen uno o mas de los siguientes cinco antfgenos [230]: (1) una protema "NadA", preferentemente en forma oligomerica (por ejemplo, en forma trimerica); (2) una protema "741"; (3) una protema "936"; (4) una protema "953"; y (5) una protema "287".
"NadA" (adhesina A de Neisseria) de MenB se desvela como la protema "961" en la referencia 215 (SEQ IDs 2943 y 2944) y como "NMB1994" en la referencia 210 (vease tambien el acceso al GenBank GI: 11352904 y 7227256). Un estudio detallado de la protema se puede encontrar en la referencia 231. Cuando se usa de acuerdo con la presente invencion, NadA puede adoptar diversas formas. Las formas preferidas de NadA son variantes de truncamiento o delecion de la secuencia de tipo silvestre, tales como las desveladas en las referencias 218 a 220. En particular, se prefiere NadA sin su anclaje de membrana C-terminal (por ejemplo, delecion de los residuos 351-405 para la cepa 2996).
La protema "741" de MenB se desvela en la referencia 215 (SEQ IDs 2535 y 2536) y como "NMB1870" en la referencia 210 (vease tambien el numero de acceso al GenBank GI: 7227128). La protema correspondiente en el serogrupo A [209] tiene el numero de acceso al GenBank 7379322. 741 es naturalmente una lipoprotema. Cuando se usa de acuerdo con la presente invencion, la protema 741 puede adoptar diversas formas. Las formas preferidas de 741 son variantes de truncamiento o delecion de la secuencia de tipo silvestre, tales como las desveladas en las referencias 218 a 220. En particular, el extremo N de 741 puede eliminarse hasta e incluyendo su secuencia poli- glicina (es dear, delecion de los residuos 1 a 72 para la cepa MC58), que a veces puede distinguirse en el presente documento por el uso de un prefijo "AG". Esta delecion puede mejorar la expresion. La delecion tambien elimina el sitio de lipidacion de 741. Se pueden encontrar varias secuencias 741 en las SEQ IDs 1 a 22 de la referencia 220, en las SEQ IDs 1 a 23 de la referencia 232, y en las SEQ IDs 1-299 de la referencia 233.
La protema "936" del serogrupo B se desvela en la referencia 215 (SEQ IDs 2883 y 2884) y como "NMB2091" en la referencia 210 (vease tambien el numero de acceso al GenBank GI: 7227353). El gen correspondiente en el serogrupo A [209] tiene el numero de acceso al GenBank 7379093. Cuando se usa de acuerdo con la presente invencion, la protema 936 puede adoptar diversas formas. Las formas preferidas de 936 son variantes de truncamiento o delecion de la secuencia de tipo silvestre, tales como las desveladas en las referencias 218 a 220. En particular, el peptido lfder N-terminal de 936 puede eliminarse (por ejemplo, eliminacion de los residuos 1 a 23
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para la cepa MC58, para dar 936(NL)).
La protema "953" del serogrupo B se desvela en la referencia 215 (SEQ IDs 2917 y 2918) y como "NMB1030" en la referencia 210 (vease tambien el numero de acceso al GenBank GI: 7226269). La protema correspondiente en el serogrupo A [209] tiene el numero de acceso al GenBank 7380108. Cuando se usa de acuerdo con la presente invencion, la protema 953 puede adoptar diversas formas. Las formas preferidas de 953 son variantes de truncamiento o delecion de la secuencia de tipo silvestre, tales como las desveladas en las referencias 218 a 220. En particular, el peptido lfder N-terminal de 953 puede eliminarse (por ejemplo, eliminacion de los residuos 1 a 19 para la cepa MC58).
La protema "287" del serogrupo B se desvela en la referencia 215 (SEQ IDs 3103 y 3104), como "NMB2132" en la referencia 210, y como "GNA2132" en la referencia 212 (vease tambien el numero de acceso al GenBank GI:7227388). La protema correspondiente en el serogrupo A [209] tiene el numero de acceso al GenBank 7379057. Cuando se usa de acuerdo con la presente invencion, la protema 287 puede adoptar diversas formas. Las formas preferidas de 287 son variantes de truncamiento o delecion de la secuencia de tipo silvestre, tales como las desveladas en las referencias 218 a 220. En particular, el extremo N de 287 puede eliminarse hasta e incluyendo su secuencia poli-glicina (por ejemplo, eliminacion de los residuos 1 a 24 para la cepa MC58, para dar AG287).
La protema 287 es preferentemente de la cepa 2996 o, mas preferentemente, de la cepa 394/98. La protema 741 es preferentemente de las cepas del serogrupo B MC58, 2996, 394/98, o 95N477, o de la cepa del serogrupo C 90/18311. La cepa MC58 es mas preferida. Las protemas 936, 953 y NadA son preferentemente de la cepa 2996. Cuando una composicion incluye un antigeno proteico particular (por ejemplo, 741 o 287), la composicion puede incluir ese antigeno en mas de una forma de variante por ejemplo, la misma protema, pero de mas de una cepa. Estas protemas pueden incluirse como protemas en tandem o separadas.
Otros antfgenos polipeptfdicos MenB que pueden incluirse en las composiciones de la invencion incluyen los que comprenden una de las siguientes secuencias de aminoacidos: SEQ ID NO:650 de ref. 213; SEQ ID NO:878 de ref. 213; SEQ ID NO:884 de ref. 213; SEQ ID NO:4 de ref. 214; SEQ ID NO:598 de ref. 215; SEQ ID NO:818 de ref. 215; SEQ ID NO:864 de ref. 215; SEQ ID NO:866 de ref. 215; SEQ ID NO:1196 de ref. 215; SEQ ID NO:1272 de ref. 215; SEQ ID NO:1274 de ref. 215; SEQ ID NO:1640 de ref. 215; SEQ ID NO:1788 de ref. 215; SEQ ID NO:2288 de ref. 215; SEQ ID NO:2466 de ref. 215; SEQ ID NO:2554 de ref. 215; SEQ ID NO:2576 de ref. 215; SEQ ID NO:2606 de ref. 215; SEQ ID NO:2608 de ref. 215; SEQ ID NO:2616 de ref. 215; SEQ ID NO:2668 de ref. 215; SEQ ID NO:2780 de ref. 215; SEQ ID NO:2932 de ref. 215; SEQ ID NO:2958 de ref. 215; SEQ ID NO:2970 de ref. 215; SEQ ID NO:2988 de ref. 215, o un polipeptido que comprende una secuencia aminoaddica que: (a) tiene el 50 % o mas de identidad (por ejemplo, el 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o mas) con respecto a dichas secuencias; y/o (b) comprende un fragmento de al menos n aminoacidos consecutivos de dichas secuencias, en las que n es 7 o mas (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o mas). Los fragmentos preferidos para (b) comprenden un epttopo de la secuencia relevante. Se pueden incluir mas de uno (por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o mas) de estos polipeptidos.
En algunas realizaciones, sin embargo, la composicion de la invencion incluye la misma protema pero procedente de mas de una cepa. Se ha descubierto que este enfoque es eficaz con la protema 741. Esta protema es un antfgeno extremadamente eficaz para provocar respuestas de anticuerpos anti-meningococicos, y se expresa en todos los serogrupos meningococicos. El analisis filogenetico muestra que la protema se divide en dos grupos, y que uno de ellos se divide de nuevo para dar tres variantes en total [234], y mientras que el suero elevado contra una variante dada es bactericida dentro del mismo grupo variante, no es activo contra las cepas que expresan una de las dos variantes, es dear, existe proteccion cruzada intra-variantes, pero no proteccion cruzada inter-variantes [232,234]. Para una maxima eficacia de la cepa cruzada, por lo tanto, se prefiere que una composicion incluya mas de una variante de la protema 741.
Las composiciones de la invencion incluyen un pequeno numero (por ejemplo, menor de t antfgenos, donde t es 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o 3) de las protemas purificadas del serogrupo B. Las protemas se expresan preferentemente de forma recombinante en un huesped heterologo y luego se purifican. Para una composicion que incluye t antfgenos MenB, puede haber t polipeptidos separados pero, pero para reducir aun mas la complejidad, se prefiere que al menos dos de los antfgenos se expresen como una unica cadena polipeptfdica (una protema "tnbrida" [ref. 218 a 220]) es dear, de tal forma que t antfgenos formen menos de t polipeptidos. Las protemas Idbridas ofrecen dos ventajas principales: en primer lugar, una protema que puede ser inestable o poco expresada por sf sola puede ser asistida mediante la adicion de un companero tubrido adecuado que supera el problema; en segundo lugar, la fabricacion comercial se simplifica, ya que solo se necesita emplear una expresion y purificacion para producir dos protemas separadamente utiles. Un tubrido incluido en una composicion de la invencion puede comprender dos o mas (es dear 2, 3, 4 o 5) de las cinco protemas enumeradas anteriormente. Se prefieren dbridos que consisten en dos de las cinco protemas.
Otra composicion preferida incluye lipooligosacarido del serogrupo B (LOS) [235]. LOS pueden usarse ademas del polipeptido o polipeptidos del serogrupo B, o puede usarse en lugar de ellos.
Tambien pueden usarse vesmulas de membrana en las composiciones. Estas vesmulas pueden ser cualquier
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vesmula proteoliposomica obtenida alterando una membrana externa meningococica para formar vesmulas de la membrana externa que incluyen componentes proteicos de la membrana externa. Las "OMV" se preparan artificialmente a partir de bacterias (por ejemplo, por tratamiento con detergente) y son, por tanto, distintas de las microvesmulas (Mv [236]) y "OMV nativas" ("NOMv" [237]), ambas de las cuales son vesmulas de membrana de origen natural que se forman espontaneamente durante el crecimiento bacteriano y se liberan en el medio de cultivo. Las MV pueden obtenerse cultivando Neisseria en medio de cultivo de caldo, separando celulas enteras de las ampollas mas pequenas en el medio de cultivo de caldo y, a continuacion, recogiendo las MV del medio agotado de celulas. Las cepas para su uso en la produccion de MV pueden seleccionarse generalmente en base a la cantidad de MV producidas en el cultivo, por ejemplo, las ref. 238 y 239 describen Neisseria con alta produccion de MV. Las vesmulas tambien pueden obtenerse a partir de cepas desactivadas de mltA [240].
Para reducir la actividad pirogena, se prefiere que la bacteria tenga niveles bajos de endotoxina (LPS). Se conocen bacterias mutantes adecuadas, por ejemplo, Neisseria mutante [241] y Helicobacter mutante [242]. Los procedimientos para preparar membranas externas agotadas de LPS a partir de bacterias Gram-negativas se desvelan en la referencia 243.
La bacteria puede ser una bacteria de tipo silvestre, o puede ser una bacteria recombinante. Las bacterias recombinantes preferidas sobreexpresan (en relacion con la cepa de tipo silvestre correspondiente) inmunogenos tales como NspA, protema 287 [244], protema 741 [244], TbpA, TbpB, superoxido dismutasa [245], etc. La bacteria puede expresar mas de una protema de membrana externa de clase I PorA por ejemplo 2, 3, 4, 5 o 6 de los subtipos PorA: P1.7,16; P1.5,2; P1.19,15; P1.5c,10; P1.12,13; y P1.7h,4 [por ejemplo, las ref. 246 y 247].
Otras bacterias recombinantes que pueden usarse con la invencion tienen una o mas mutaciones para disminuir (o, preferentemente, desactivar) la expresion de productos genicos particulares (por ejemplo veanse las ref. 248 y 249). Los genes preferidos para la disminucion y/o desactivacion incluyen: (a) Cps, ctrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PilC, PorA, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, y/o TbpB [248]; (b) CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PhoP, PilC, PmrE, PmrF, PorA, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, y/o TbpB [249]; (c) transglicosilasa lftica NMB0033 [250]; (d) ExbB, ExbD, rmpM, CtrA, CtrB, CtrD, GalE, LbpA, LpbB, Opa, Opc, PilC, PorA, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, y/o TbpB [251]; y (e) CtrA, CtrB, CtrD, FrpB, OpA, OpC, PilC, PorA, PorB, SiaD, SynA, SynB, y/o SynC [252].
Las cepas preferidas dentro del serogrupo B como fuente de estos antfgenos no sacaridos son las cepas MC58, 2996, H44/76, 394/98 y New Zealand 98/254. Los mejores serotipos y cepas a utilizar, sin embargo, dependeran de las cepas prevalentes en una localizacion geografica determinada. Por ejemplo, Por ejemplo, el meningococo puede ser de cualquier serotipo (por ejemplo 1, 2a, 2b, 4, 14, 15, 16, etc.), de cualquier serosubtipo (P1.2; P1.4; P1.5; P1.5,2; P1.7,16; P1.7,16b; P1.9; P1.9,15; P1.12,13; P1.13; P1.14; P1.15; P1.21,16; P1.22,14; etc.) y de cualquier inmunotipo (por ejemplo L1; L3,3,7; L10; etc.), y las cepas preferidas incluyen: (a) B:4:P1.4; (b) B:4:P1.15; (c) B:15:P1.7,16; y (d) B:4:P1.7b,4. El meningococo puede ser de cualquier linaje adecuado, incluyendo linajes hiperinvasivos e hipervirulentos, por ejemplo, cualquiera de los siguientes siete linajes hipervirulentos: subgrupo I; subgrupo III; subgrupo IV-1; complejo ET-5; complejo ET-37; agrupacion A4; linaje 3. Estos linajes se han definido mediante electroforesis de enzimas multilocus (MLEE), pero tambien se ha utilizado la tipificacion de secuencia multilocus (MLST) para clasificar los meningococos [ref. 253] por ejemplo, el complejo ET-37 es el complejo ST-11 por MLST, el complejo ET-5 es ST-32 (ET-5), el linaje 3 es ST-41/44, etc.
Los antfgenos no sacaridos pueden usarse para inducir una respuesta de anticuerpo bactericida en suero que es eficaz contra dos o tres de los linajes hipervirulentos de MenB A4, ET-5 y el linaje 3. Tambien pueden inducir respuestas de anticuerpos bactericidas contra uno o mas del subgrupo de linajes hipervirulentos I, subgrupo III, subgrupo IV-1 o complejo ET-37, y contra otros linajes, por ejemplo, linajes hiperinvasivos. Estas respuestas de anticuerpos se miden convenientemente en ratones y son un indicador estandar de la eficacia de la vacuna [por ejemplo, vease la nota final 14 de la referencia 212]. La actividad bactericida en suero (SBA) mide la muerte bacteriana mediada por el complemento, y puede ser ensayada usando complemento de ser humano o bebe conejo. Las normas de la oMs requieren una vacuna para inducir al menos un aumento de 4 veces en SBA en mas del 90 % de los receptores.
La composicion no necesita inducir anticuerpos bactericidas contra cada una de las cepas MenB dentro de estos linajes hipervirulentos; en su lugar, para un grupo dado de cuatro cepas mas de meningococo de serogrupo B dentro de un linaje hipervirulento particular, los anticuerpos inducidos por la composicion con bactericidas contra al menos el 50 % (porejemplo, el 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o mas) del grupo. Los grupos preferidos de cepas incluiran cepas aisladas en al menos cuatro de los siguientes pafses: GB, AU, CA, NO, IT, US, NZ, NL, BR, y CU. El suero tiene preferentemente un tftulo bactericida de al menos 1024 (por ejemplo 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218 o superior, preferentemente, al menos 214) es decir, el suero es capaz de eliminar al menos el 50 % de las bacterias de ensayo de una cepa particular cuando se diluye 1/1024, como se describe en la referencia 212.
Las composiciones preferidas pueden inducir respuestas bactericidas frente a las siguientes cepas de meningococo del serogrupo B: (i) del grupo A4, cepa 961-5945 (B:2b:P1.21,16) y/o cepa G2136 (B:-); (ii) del complejo ET-5, cepa MC58 (B:15:P1.7,16b) y/o cepa 44/76 (B:15:P1.7,16); (iii) del linaje 3, cepa 394/98 (B:4:P1.4) y/o cepa BZ198 (B:NT:-). Las composiciones mas preferidas pueden inducir respuestas bactericidas contra las cepas 961-5945,
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44/76 y 394/98. Las cepas 961-5945 y G2136 son ambas cepas de referencia de MLST de Neisseria [id. 638 y 1002 en la ref. 254]. Cepa MC58 esta ampliamente disponible (por ejemplo ATCC BAA-335) y fue la cepa secuenciada en la figura 210. La cepa 44/76 se ha usado y caracterizado ampliamente (por ejemplo, ref. 255) y es una de las cepas de referencia de MLST de Neisseria [id. 237 en la ref. 254; fila 32 de la Tabla 2 en la ref. 256]. La cepa 394/98 se aislo originalmente en Nueva Zelanda en 1998, y ha habido varios estudios publicados que usan esta cepa (por ejemplo, las referencias 257 y 258). La cepa BZ198 es otra cepa de referencia de MLST [id. 409 en la ref. 254; fila 41 de la Tabla 2 en la referencia. 256]. La composicion puede inducir adicionalmente una respuesta bactericida frente a la cepa de serogrupo W135 LNP17592 (W135:2a:P1.5,2), a partir del complejo ET-37.
General
El termino "que comprende" incluye "que incluye", asf como "que consiste en", por ejemplo, una composicion "que comprende" X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X + Y.
La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente" por ejemplo, una composicion que esta "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra "sustancialmente" puede omitirse de la definicion de la invencion.
El termino "aproximadamente" en relacion a un valor numerico x significa, por ejemplo, x ± 10 %.
El termino "alquilo" se usa en el presente documento para referirse a grupos alquilo tanto en forma lineal como ramificada. Sin embargo, el termino "alquilo" se refiere habitualmente a grupos alquilo en formas rectas. El grupo alquilo puede estar interrumpido con 1, 2 o 3 heteroatomos seleccionados entre -O-, -NH- o -S-. El grupo alquilo puede estar tambien interrumpido con 1, 2 o 3 dobles y/o triples enlaces. Sin embargo, el termino "alquilo" se refiere habitualmente a grupos alquilo que no tienen interrupciones de heteroatomo o interrupciones de doble o triple enlace. Cuando se hace referencia a alquilo C1-6, se refiere a que el grupo alquilo puede contener cualquier numero de atomos de carbono entre 1 y 6 (por ejemplo C1, C2, C3, C4, C5, C6).
El termino "alquileno" se utiliza en el presente documento para referirse a un grupo alquilo divalente, como se ha definido anteriormente. Cuando se hace referencia a alquileno C1-5, se refiere a que el grupo alquileno puede contener cualquier numero de atomos de carbono entre 1 y 5 (por ejemplo C1, C2, C3, C4, C5). De forma similar, cuando se hace referencia a alquileno C1-4, se refiere a que el grupo alquileno puede contener cualquier numero de atomos de carbono entre 1 y 4 (por ejemplo C1, C2, C3, C4).
La expresion "grupo amino" incluye grupos de formula -NH2 o -NH-E, donde E es un grupo protector de nitrogeno. Los ejemplos de grupos protectores de nitrogeno tfpicos se han descrito anteriormente.
El termino "amina" se refiere a un grupo de formula -NH2, a menos que el contexto indique otra cosa.
La expresion "sacarido capsular modificado" se refiere a un sacarido que se puede obtener a partir de un sacarido capsular nativo mediante una modificacion adecuada. De este modo, la secuencia basica de unidades monosacarido repetidas en el sacarido capsular nativo se retiene en los sacaridos capsulares modificados de la presente invencion.
El termino "sacarido" incluye tanto oligosacaridos (por ejemplo, que contienen de 2 a 39 unidades de monosacarido) como polisacaridos (por ejemplo, que contienen 40 o mas unidades de monosacarido). Como se encuentra naturalmente en las bacterias, los sacaridos capsulares nativos generalmente toman la forma de polisacaridos. Los polisacaridos pueden manipularse para dar oligosacaridos mas cortos. Los oligosacaridos pueden obtenerse por purificacion y/o despolimerizacion seguida de un dimensionado del polisacarido nativo (por ejemplo, mediante hidrolisis en acido suave, por calentamiento, por cromatograffa de dimensionamiento etc.).
En los casos donde se usan materiales animales (y particularmente bovinos) en el cultivo de celulas, deben obtenerse a partir de fuentes que esten libres de encepalopatfas espongiformes transmisibles (TSE) y, en particular, libres de encefalopatfa espongiforme bovina (EEB). En general, se prefiere cultivar las celulas en total ausencia de materiales procedentes de animales.
Se apreciara que los grupos ionizables pueden existir en la forma neutra mostrada en las formulas en el presente documento, o pueden existir en forma cargada, por ejemplo, dependiendo de pH. Por lo tanto, un grupo fosfato puede mostrarse como -P-O-(OH)2, esta formula es meramente representativa del grupo fosfato neutro, y se incluyen otras formas cargadas por la invencion. De forma similar, las referencias en el presente documento a grupos cationicos y anionicos se deben tomar para referirse a la carga que esta presente en ese grupo en condiciones fisiologicas, por ejemplo, cuando una amina -NH2 se protona para dar el grupo -NH3+ cationico, esta protonacion es una que se produce a pH fisiologico. Ademas, cuando se desprotona un carboxilo -COOH para dar el grupo -COO' anionico, esta protonacion es una que puede ocurrir a pH fisiologico. Ademas, la invencion incluye sales de las formas cargadas de moleculas de la invencion. Los anillos de azucar pueden existir en forma abierta y cerrada y, aunque las formas cerradas se muestran en formulas estructurales en el presente documento, las formas abiertas tambien se incluyen por la invencion. De forma similar, la invencion incluye formas isomericas de las moleculas de la invencion, incluyendo tautomeros (por ejemplo, tautomeros de imina/enamina), conformeros, enantiomeros, diaestereoisomeros, etc.
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Despues del serogrupo, la clasificacion meningococica incluye serotipo, serosubtipo y despues inmunototipo, y la nomenclature estandar enumera serogrupo, serotipo, serosubtipo e inmunotipico, separados cada uno por un colon por ejemplo, B:4:P1.15:L3,7,9. Dentro del serogrupo B, algunos linajes causan enfermedades con frecuencia (hiperinvasivos), algunos linajes causan formas mas graves de enfermedad que otros (hipervirulentos), y otros raramente causan enfermedad en absoluto. Se reconocen siete linajes hipervirulentos, a saber, los subgrupos I, III e IV-1, complejo ET-5, complejo ET-37, el grupo A4 y el linaje 3. Estos se han definido por electroforesis de enzimas multilocus (MLEE), pero tambien se ha utilizado tipificado de secuencias multilocus para clasificar los meningococos [ref. 256].
Breve descripcion de las figuras
La figura 1 proporciona un esquema para la smtesis qrnmica de conjugados CRMi97-MenA. Las estructuras predominantes de "MenA10/90" (oligosacarido MenA que comprende un grupo de bloqueo 4,5- dihidroxipentilcarbamato en aproximadamente el 10 % de las unidades de monosacarido y un grupo de bloqueo 2-hidroxietilcarbamato en aproximadamente el 90 % de las unidades de monosacarido) y "MenA10/0 "(oligosacarido MenA que comprende un grupo de bloqueo 4,5-dihidroxipentilcarbamato en aproximadamente el 10 % de las unidades de monosacarido).
La figura 2 proporciona el perfil analttico de intercambio anionico a 214 nm de oligosacaridos MenA antes (panel A) y despues del dimensionamiento (panel B).
La figura 3 proporciona el espectro de 1H RMN de 600 MHz a 25 °C del oligosacarido MenA sin modificacion qrnmica (panel A), oligosacarido MenA10/90 (panel B) y oligosacarido MenA10/0 (panel C).
La figura 4 compara el porcentaje de fosfomonoester desarrollado durante el almacenamiento a 37 °C por oligosacarido MenA sin modificacion qrnmica, oligosacarido MenA10/90 y oligosacarido MenA10/0.
La figura 5 proporciona el espectro de 31P RMN del oligosacarido MenA.
La figura 6 compara el grado de polimerizacion (DP), medido por 31P RMN, durante el almacenamiento a 37 °C del oligosacarido MenA sin modificacion qrnmica, oligosacarido MenA10/90 y oligosacarido MenA10/0.
La figura 7 proporciona el perfil SDS-Page de conjugados de oligosacaridos CRM-MenA: Carril M - Marcadores Mw; Carril 1 - CRM; Carril 2 - CRM-MenA10/90; y Carril 3- CRM-MenA10/0.
La figura 8 compara el sacarido libre (FS) liberado durante el almacenamiento a 37 °C de conjugados de oligosacarido CRM-MenA10/90 y conjugados de oligosacarido CRM-MenA10/0.
La figura 9 compara el porcentaje de fosfomonoester desarrollado durante el almacenamiento a 37 °C mediante conjugados de oligosacarido CRM-MenA10/90 y conjugados de oligosacarido CRM-MenA10/0.
Modos para llevar a cabo la invencion
Ejemplo de referenda 1
Modificacion del oligosacarido Men A
Hidrolisis controlada del polisacarido MenA
Los oligosacaridos MenA se generaron por hidrolisis qrnmica de una solucion de polisacarido MenA. En resumen, el polisacarido MenA se solubilizo a una concentracion final de 10 mg/ml en tampon acetato 50 mM, pH 4,75. La solucion se calento a 73 °C hasta que se alcanzo un grado de polimerizacion (DP) de aproximadamente 10. La hidrolisis se controlo monitorizando la variacion de la actividad optica de la solucion (a Hg 365 nm) con el tiempo de acuerdo con la siguiente ecuacion: DP = 1/{0,5817[1-(at/am)]}, donde am es el valor medio de la potencia optica rotatoria de 6 muestras cuando la temperatura de la solucion es de 50 °C y at es la potencia de rotacion optica en el instante t. La hidrolisis se detuvo cuando se alcanzo el valor de a correspondiente a un DP de 10. Al final de la reaccion de hidrolisis, la solucion se enfrio a temperatura ambiente y el pH se corrigio a aproximadamente 6,5.
Fraccionamiento del tamano del oligosacarido MenA
La hidrolisis acida controlada del polisacarido MenA genera una polidispersion con el DP medio diana. Para la preparacion de conjugado, la polidispersion de oligosacaridos puede restringirse adicionalmente usando un fraccionamiento de tamano de dos etapas. Estas etapas de dimensionamiento tfpicamente cambian la DP de los oligosacaridos MenA de un valor de aproximadamente 10 a un valor entre 15 y 20, medida por la relacion molar entre los valores de fosforo total (Pt) y de fosfatomonoester terminal (Pm). La concentracion de Pt se determino de acuerdo con el procedimiento descrito en la referencia 259 y se determino Pm midiendo el fosfato inorganico liberado por reaccion enzimatica con fosfatasa acida de patata [260].
En resumen, el hidrolizado de MenA se filtro primero a traves de una membrana de flujo tangencial de 30 KDa para
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20
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30
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40
45
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55
eliminar especies de alto peso molecular. Durante este procedimiento, el producto se concentro aproximadamente 10 veces y despues se diafiltro contra 13 volumenes de tampon acetato 5 mM, pH 6,5. El permeado, que contema los oligosacaridos deseados, se recogio mientras se retiraba la fraccion retenida.
En la segunda etapa, el permeado se fracciono por cromatograffa en columna de intercambio anionico. Esta etapa esta disenada para eliminar las especies de bajo Pm caracterizadas por un DP de menos de 6, que pueden ser poco inmunogenas [261]. La mezcla de oligosacaridos obtenida a partir de la ultrafiltracion de 30 KDa se cargo sobre una columna rellena con Q-Sepharose Fast Flow previamente equilibrada con acetato sodico 5 mM, pH 6,5. La relacion oligosacarido/volumen rellenado era de 17 mg/ml de resina rellenada. Despues, la columna se lavo con 5 volumenes de columna (vc) del tampon de equilibrado. Despues se aplico un lavado de 10 vc de tampon de acetato sodico 5 mM/NaCl 125 mM, pH 6,5, a la columna para eluir oligosacaridos de DP < 6. La fraccion de oligosacaridos deseada se recupero entonces por elucion con tampon de acetato sodico 5 mM/NaCl 500 mM, pH 6,5. El desprendimiento con 5 vc de NaCl 2 M y la desinfeccion con NaOH 1 M completaron el procedimiento.
Se utilizo cromatograffa analttica de intercambio anionico para medir la polidispersion de oligosacaridos antes y despues del fraccionamiento. En resumen, las polidispersiones de oligosacarido MenA se analizaron por HPLC usando una columna Mono-Q HR 5/5. Despues de equilibrar con agua, se cargo en la columna 1 ml de muestra que contema aproximadamente 1 mg de sacarido, que luego se desarrollo con un gradiente lineal del 0 al 60 % de NaCl 1 M a un caudal de 0,5 ml. El cromatograma se monitorizo a 214 nm. Se uso una preparacion estandar de un oligosacarido MenA monodisperso que tema un DP definido de 5 y 6, respectivamente, como se evidencio mediante Espectrometna de Masas y 1H RMN, para identificar la presencia o eliminacion de oligosacaridos que teman un DP menor que 6 en las muestras de polidispersion ensayadas. La figura 2 muestra los perfiles analtticos del hidrolizado (panel A) en comparacion con el oligosacarido MenA clasificado (panel B).
Intercambio contraionico
El eluato de Q-Sepharose del procedimiento de fraccionamiento de tamano de dos etapas se ultrafiltro en una membrana de 3 KDa con el fin de intercambiar el contraion de sodio con tetrabutilamonio, que confiere solubilidad al oligosacarido en disolventes no acuosos. En resumen, la solucion de oligosacarido MenA se diafiltro contra 4 volumenes de bromuro de tetrabutilamonio 10 mM seguido de 10 volumenes de agua. Se recogio la fraccion retenida, que contema el producto deseado, y se desecho el permeado. Se elimino el agua del material retenido por evaporacion rotatoria.
Modificacion quimica del oligosacarido MenA
El oligosacarido MenA se modifico usando activacion de 1,1-carbonildiimidazol (CDI) seguido de reaccion con 1- amino-4,5-pentandiol (APD) en solitario o APD y 2-aminoetanol (ETA), con el fin de obtener dos estructuras diana diferentes (figura 1):
i) Oligosacarido MenA que comprende un grupo de bloqueo de 4,5-dihidroxipentilcarbamato sobre aproximadamente el 10 % de las unidades de monosacarido y un grupo de bloqueo 2-hidroxietilcarbamato sobre aproximadamente el 90 % de las unidades de monosacarido (MenA10/90); y y
ii) Oligosacarido MenA que comprende un grupo de bloqueo 4,5-dihidroxipentilcarbamato sobre aproximadamente el 10 % de las unidades de monosacarido (MenA10/0).
En resumen, el oligosacarido MenA derivado de la ultrafiltracion de membrana de 3 KDa descrito anteriormente se solubilizo en DMSO hasta una concentracion final de aproximadamente 10 mg/ml. A esta solucion se le anadio un exceso molar de 20 veces de CDI (con respecto al numero de moles de unidades de monosacarido de MenA) y la solucion se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. Despues, la solucion de oligosacarido activada se anadio a continuacion a 9 volumenes de acetato de etilo frio (-20 °C) seguido de una solucion 2 M de CaCl2 hasta una concentracion final equimolar con las unidades de monosacarido MenA. La mezcla se agito durante 30 minutos y, despues de la sedimentacion del oligosacarido, la mayor parte del sobrenadante se elimino por succion y el granulo se recupero por centrifugacion, se lavo 3 veces con acetato de etilo y se seco al vacfo.
Para la adicion de grupos de bloqueo, el oligosacarido activado se solubilizo en DMSO hasta una concentracion final de 10 mg/ml. Para obtener el oligosacarido "MenA10/0", se anadio un exceso molar de 0,1 veces (relativo al numero de moles de unidades de monosacarido MenA) de APD, y la reaccion se agito durante 2 horas a temperatura ambiente. Despues de este tiempo, se anadieron diecinueve volumenes de tampon de fosfato sodico 0,25 M, pH 6,5, bajo agitacion. Cualquier opalescencia formada durante esta operacion se elimino por filtracion a traves de una membrana de 0,2 pm. Para obtener el oligosacarido "MenA10/90", se anadio un exceso molar de 0,6 veces de trietilamina y un exceso molar de 0,1 veces de APD y la reaccion se agito durante 2 horas a temperatura ambiente. Posteriormente, se anadio un exceso molar de 50 veces (en relacion con el numero de moles de unidades de monosacarido MenA) de ETA y la reaccion continuo en agitacion durante 2 horas mas. Una vez mas, despues de este tiempo, se anadieron diecinueve volumenes de tampon de fosfato sodico 0,25 M, pH 6,5 en agitacion y se elimino cualquier opalescencia por filtracion a traves de una membrana de 0,2 pm.
Las soluciones en bruto de oligosacarido derivatizado se purificaron a partir del exceso de reactivos de bajo peso
molecular por ultrafiltracion en una membrana de 3 KDa. Las soluciones se concentraron en primer lugar aproximadamente 20 veces y despues se diafiltraron frente a 10 volumenes de tampon de fosfato sodico 0,1 M, pH
7.2, seguido de 10 volumenes de agua destilada. Los productos purificados se recuperaron de las fracciones retenidas, descartandose los permeados.
5 Confirmacion de modificaciones quimicas por 1H RMN
Los oligosacaridos MenA modificados qmmicamente se caracterizaron por RMN para confirmar que se habfan producido las modificaciones qrnmicas deseadas.
El espectro 1H RMN del oligosacarido MenA nativo se muestra en la figura 3, panel A. El espectro es segun las referencias publicadas [262, 263]. 1H RMN realizada en APD puro y ETA dio las siguientes senales: Senales APD: 10 HOCH2ACHb(OH) CH2CCH2DCHeNH2 (Ha a 3,6 ppm, HB a 3,7 ppm, HC a 1,5 ppm, HD a 1,6 ppm, HE a 2,7 ppm);
Senales ETA: HOCH2FCH2GNH2 (HF a 4,4 ppm, HG a 3,6 ppm). Estas asignaciones se utilizaron como una grna para identificar las senales APD y ETA en los espectros de los oligosacaridos derivatizados. El espectro 1H RMN del oligosacarido MenA10/90 se indica en la figura 3, panel B. El espectro 1H RMN del oligosacarido MenA10/0 se indica en la figura 3, panel C. El enlace covalente entre los grupos ETA o APD y los grupos carbonilo introducidos en la 15 posicion 4 y/o 3 de N-acetilmanosamina se confirmo mediante la correlacion heteronuclear (1H,13C) detectada en los espectros HSQC. Se detectaron picos de correlacion de largo alcance entre los grupos carbonilo y el HG de ETA o HE de APD. De forma similar, los grupos carbonilo dieron una correlacion de largo alcance con los protones geminales en la posicion 3/4 de N-acetilmanosamina. Los porcentajes de grupos APD introducidos por el tratamiento qrnmico se estimaron mediante la integracion de senales seleccionadas procedentes de APD y MenA. Las senales 20 superpuestas de HD+Hc a 1,5 ppm (grupos APD) se integraron frente al pico H2 a 4,6 ppm (oligosacarido MenA). En diferentes experimentos se sustituyeron del 6 % al 14 % de unidades de monosacarido MenA con grupos APD. Siguiendo el mismo enfoque, Los grupos ETA se estimaron por la relacion con HF senales solapadas a 3,6 ppm (grupos ETA) contra el pico H2 a 4,6 ppm (oligosacarido MenA). Debido al solapamiento parcial con las senales ApD (HA a 3,6 ppm y HB a 3,7 ppm), la integral de HF se resto por el 1/4 del valor de HD+Hc. En diferentes experimentos 25 se sustituyeron del 66 % al 85 % de unidades de monosacarido MenA con grupos ETA. Como se esperaba, en la figura 3, no estan presentes las senales del panel C relacionadas con los grupos ETA, lo que confirma la estructura propuesta y la idoneidad de la RMN como herramienta para la elucidacion de la estructura y la evaluacion de la identidad. La figura 3, el panel A indica que la O-acetilacion se conserva despues de la hidrolisis acida del polisacarido meningococico del serogrupo A y, aunque los grupos carbamato cambian el campo magnetico local y 30 hacen la asignacion mas complicada, el estado de O-acetilacion parece mantenerse despues de la modificacion qrnmica (figura 3, paneles B y C).
Estabilidad de los oligosacaridos MenA
La degradacion del oligosacarido MenA, una consecuencia de la hidrolisis en enlaces fosfodiester, da lugar a grupos fosfomonoester recien formados. La estabilidad de los oligosacaridos MenA10/90 y MenA 10/0 se comparo con la 35 estabilidad de un oligosacarido nativo.
En resumen, las soluciones de los oligosacaridos MenA, en un intervalo de concentracion de 1,4 a 3 mg/ml, se incubaron a 37 °C en tampon de histidina 10 mM, pH 7,2. En diferentes puntos de tiempo durante un periodo de 42 dfas, se analizaron los oligosacaridos para determinar la cantidad de fosfomonoester generada durante el almacenamiento.
40 La figura 4 muestra el aumento de grupos fosfomonoester durante el almacenamiento a 37 °C para los tres oligosacaridos mencionados anteriormente. El porcentaje de fosfomonoester se calculo como [Pm(t)-Pm(0)] x 100/[(Pt(0)-Pm(0)], donde Pm(t) y Pt(t) son las concentraciones de grupos fosfomonoester y fosforo total en el tiempo t; y Pm(0) y Pt(0) son las concentraciones de grupos fosfomonoester y fosforo total en el momento 0. La concentracion total de fosforo (Pt) se determino de acuerdo con el procedimiento descrito en la referencia 259 y el 45 fosfato monoester terminal (Pm) se determino mediante la medicion del fosfato inorganico liberado por reaccion enzimatica con fosfatasa acida de patata [260].
Los oligosacaridos MenA10/90 y MenA10/0 mostraron una estabilidad mejorada en comparacion con el oligosacarido nativo, como se evidencia por la tendencia reducida a liberar grupos fosfomonoester a lo largo del tiempo. Estos resultados muestran que la estabilidad del oligosacarido MenA puede mejorarse bloqueando los 50 grupos hidroxilo en las posiciones 4 y 3 de N-acetilmanosamina con un grupo de bloqueo de acuerdo con la presente invencion.
De forma similar, se utilizo el analisis de 31P RMN [264] para evaluar la estabilidad de los oligosacaridos MenA modificados en comparacion con el oligosacarido nativo a 37 °C durante 42 dfas en tampon de histidina 10 mM pH
7.2. En resumen, el grado medio de despolimerizacion (avDP) se determino por la relacion molar entre el 55 fosfodiester en los grupos de cadena (Pen cadena) y los grupos finales no reductores de fosfomonoester (Pextremo no red.)
(figura 5).
avDP — [Pen cadena + 1]/Pextremo no red]
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Una vez mas, los oligosacaridos MenA10/90 y MenA10/0 mostraron una estabilidad mejorada en comparacion con el oligosacarido nativo, como se evidencia por el mayor grado de polimerizacion en todos los puntos temporales (figura 6).
Tabla I
- Muestra
- avDP
- 0 d
- 7 d 14 d 21 d 28 d 35 d 42 d
- Oligo MenA Nativo
- 19,2 17,5 17,1 14,7 13,8 12,8 11,5
- Oligo MenA10/0
- 24,9 23,8 22,6 20,5 19,1 18,2 16,8
- Oligo MenA10/90
- 24,3 24,3 24,1 23,5 23,5 23,6 23,1
Conjugados CRMigj-MenA
Generacion de grupos aldehidicos reactivos por oxidacion de peryodato controlada
Los grupos hidroxilo adyacentes de los grupos de bloqueo de 4,5-dihidroxipentilcarbamato derivados de APD en los oligosacaridos MenA10/90 y MenA10/0 se oxidaron mediante tratamiento con peryodato sodico limitado para generar grupos aldehidicos reactivos. En resumen, se hicieron reaccionar soluciones de oligosacaridos MenA10/90 y MenA10/0 en tampon de fosfato sodico 0,1 M, pH 7,2, con 0,1 moles de NaIO4 por mol de unidades de monosacarido MenA. Las reacciones se realizaron en la oscuridad con agitacion, y se monitorizaron espectrofotometricamente a 225 nm. Despues de aproximadamente 2 horas, la absorbancia de 225 nm alcanzo una meseta. La cantidad de grupos aldehidicos generados por la reaccion se determino analizando la cantidad equimolar de formaldehudo liberada durante la oxidacion [265]. Las reacciones se detuvieron por adicion de etilenglicol a una concentracion final equimolar con NaIO4.
La generacion de grupos aldehidicos fue casi cuantitativa en comparacion con el numero inicial de grupos de bloqueo de 4,5-dihidroxipentilcarbamato.
Purificacion de oligosacaridos oxidados
Los oligosacaridos oxidados se purificaron por ultrafiltracion sobre una membrana de 3 KDa. Las soluciones se concentraron 2 veces y luego se diafiltraron frente a 10 volumenes de NaCl 0,5 M seguido de 10 volumenes de agua destilada. Se recogio la fraccion retenida, que contema el producto deseado, y se desecho el permeado. Se elimino el agua del material retenido por evaporacion rotatoria.
Conjugacion con CRM197
Los oligosacaridos MenA oxidados se conjugaron con CRM197, un mutante no toxico de la toxina de difteria [266], a traves de aminacion reductora para obtener CRM-MenA10/90 y CRM-MenA10/0 respectivamente (figura 1).
En resumen, los oligosacaridos MenA oxidados se solubilizaron en una solucion de 50 mg/ml de CRM197 a una relacion de 13 moles de grupos aldehidicos por mol de protema. Se anadio tampon fosfato sodico 100 mM, pH 7,2, para obtener una concentracion de protema final de 30 mg/ml. Despues, se anadio una solucion 2 M de NaBHaCN en tampon de fosfato sodico 10 mM, pH 7,2, para obtener un exceso molar de 70 veces de NaB^CN con respecto a los grupos aldehidicos. Las reacciones se realizaron durante 3 dfas a 37 °C. Despues, se anadieron catorce volumenes de tampon fosfato sodico 10 mM, pH 7,2 seguido de un exceso molar de 25 veces de NaBH4 (con respecto al relativo al numero de moles de grupos aldehidicos). El pH se controlo a 8,5 y la mezclas se agitaron durante 2 h a temperatura ambiente para inactivar cualquier grupo aldehfdico residual. Al final de la etapa de inactivacion, el pH se corrigio de nuevo a 7,2, y las soluciones se filtraron a traves de una membrana de poro de 0,2 pm.
Purificacion de conjugados
Los conjugados se purificaron del exceso de reactivos y oligosacaridos sin reaccionar residuales por ultrafiltracion en una membrana de 30 KDa. Las mezclas de reaccion se diafiltraron contra 100 volumenes de tampon fosfato sodico 0,01 M, pH 7,2, seguido de 50 volumenes de histidina 10 mM, pH 7,2. Las soluciones que conteman los conjugados purificados se filtraron entonces a traves de una membrana de poro de 0,2 pm y se almacenaron a 2-8 °C.
Confirmacion de conjugacion con CRM197
La conjugacion de los oligosacaridos MenA con CRM197 se demostro por SDS-Page (figura 7). SDS-Page se realizo de acuerdo con la referencia 267 usando acrilamida al 7,5 % para la apilacion y acrilamida al 7,5 % para el gel de separacion. Antes de la electroforesis, las muestras se trataron 1:4 con tampon de muestra y se hirvieron durante 10 min. La electroforesis se llevo a cabo a 200 V de tension constante durante aproximadamente 40 min. Los geles se
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10
15
20
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desarrollaron con una solucion de tincion de Coomassie durante aproximadamente 20 minutos y se desnaturalizaron en solucion de acido acetico/EtOH (7/40 %) durante aproximadamente 4 horas.
El perfil de los conjugados en la figura 7 se desplaza hacia pesos moleculares mas altos comparados con CRM197, y es marcadamente diferente de CRM197. El analisis SDS-Page tambien demuestra la presencia de material de alto peso molecular. Este material puede formarse durante la reaccion de conjugacion, lo que permite multiples puntos de union de CRM197 por molecula de oligosacarido.
Los conjugados tambien se analizaron en cuanto al contenido de sacaridos y protemas. Se observaron relaciones de sacarido/protema que oscilaban entre 0,20 y 0,32 (peso/peso).
Estabilidad de los conjugados CRMi97-MenA
La estabilidad de los conjugados CRMi97-MenA se determino midiendo la liberacion de sacarido no conjugado en el tiempo, que es resultado de la hidrolisis de los enlaces fosfodiester.
Los dispositivos Centricon 30 (capacidad de 2 ml) se acondicionaron por aclarado con 1 ml de agua destilada y centrifugando dos veces. Se anadieron 60 pl de solucion salina a 940 pl de muestra (CRM-MenA10/90 o CRM- MenA10/0) que contema aproximadamente 0,3 mg/ml de sacarido. El contenido total de fosforo se midio como se ha descrito anteriormente antes de anadir las mezclas a los dispositivos. Los dispositivos se centrifugaron a 1942 g hasta que se dejaron 100-200 pl de solucion en la camara de retencion y despues se lavaron con 2 x 1 ml de solucion salina y se centrifugaron de nuevo. La solucion en la camara de permeado se recupero y el volumen de la muestra se ajusto con solucion salina a 3 ml. El permeado derivado de cada muestra se analizo para determinar el contenido de fosforo total como se describio anteriormente.
El valor (P2/P1) x 100, donde P1 es el fosforo total antes del tratamiento con centricon y P2 es el fosforo total despues del tratamiento con centricon, representa el porcentaje de sacarido libre. Experimentos de muestras enriquecidas para demostrar la recuperacion del oligosacarido libre a traves de la membrana se llevaron a cabo anadiendo 60 pl de aproximadamente 2 mg/ml de oligosacarido a 940 pl de muestra o solucion salina y aplicando despues el procedimiento de separacion descrito anteriormente. La recuperacion fue consistentemente superior al 80 %.
La figura 8 muestra que el conjugado CRM-MenA10/90 mostro una tendencia reducida a liberar sacarido libre en comparacion con CRM-MenA10/0. FS (sacarido libre) se calcula como % de FS (t) -% de FS (0) donde % de FS (t) y % de FS (0) son los porcentajes de sacaridos libres en el momento t y 0 respectivamente.
La estabilidad de los conjugados CRMw-MenA tambien se determino midiendo la generacion de fosfomonoester durante el almacenamiento. En resumen, las soluciones de los conjugados, en un intervalo de concentracion de 157 a 253 pg/ml, se incubaron a 37 °C en tampon de histidina 10 mM, pH 7,2. En diferentes puntos de tiempo durante un periodo de 42 dfas, los conjugados se analizaron para determinar la cantidad de fosfomonoester generada durante el almacenamiento.
La figura 9 muestra el aumento de grupos fosfomonoester durante el almacenamiento a 37 °C para los dos conjugados mencionados anteriormente. El porcentaje de fosfomonoester se calculo como se ha descrito anteriormente. El conjugado CRM-MenA 10/90 mostro una tendencia reducida a generar fosfomonoester en comparacion con CRM-MenA10/0.
Inmunogenicidad de los conjugados CRM-MenA
Con el fin de evaluar la capacidad de los conjugados MenA para obtener anticuerpos que reconocen el polisacarido capsular nativo MenA, se llevaron a cabo experimentos de inmunogenicidad en ratones.
Formulacion de la vacuna
Los conjugados CRM-MenA10/90 y CRM MenA 10/0 se mezclaron con tampon de fosfato de sodio y una suspension de AlPO4 para obtener concentraciones finales de 20 pg/ml de sacarido y 0,6 mg/ml de Al3 + en tampon fosfato sodico 10 mM, pH 7,2. Para las formulaciones no adyuvadas, la suspension de AlPO4 se reemplazo con tampon de fosfato sodico. Antes de la inmunizacion, las vacunas resultantes se diluyeron 1:5 con una solucion salina.
Inmunizacion de ratones
Se inmunizaron grupos de 8 ratones Balb/c, hembras de 6-8 semanas, dos o tres veces s.c. con 0,5 ml de vacunas conjugadas que conteman 2 pg de sacarido. En el caso del programa de dos inyecciones, el intervalo entre la primera y la segunda dosis fue de cuatro semanas. Las extracciones de sangre se realizaron antes de la inmunizacion y dos semanas despues de la segunda dosis. En el caso del esquema de tres dosis, las vacunas se administraron los dfas 0, 14 y 28 y se realizaron extracciones de sangre en el momento cero, un dfa antes (despues de 2 dosis de suero) y 14 dfas despues (despues de 3 dosis) de la tercera inmunizacion.
Inmunogenicidad
Los sueros de los ratones inmunizados se analizaron para detectar anticuerpos IgG totales de polisacaridos capsulares anti-MenA espedficos y para determinar la actividad bactericida en suero mediada por complemento (SBA) contra el serogrupo A de Neisseria meningitidis.
5 Se determinaron anticuerpos IgG totales de polisacaridos capsulares anti-MenA espedficos esencialmente de acuerdo con el procedimiento de la referencia 268, adaptado para el analisis de sueros animales. Cada suero de raton individual se analizo por duplicado mediante una curva de titulacion. Los tftulos de polisacarido anti-MenA se calcularon como Unidad de Elisa de Raton (MEU)/ml usando un software basado en el Procedimiento de Ensayo de Lmea de Referencia. Se calcularon los tftulos geometricos medios (GMT) para cada grupo de inmunizacion.
10 Se midio SBA en las agrupaciones de suero post II y post III (cuando fue apropiado) para cada grupo de inmunizacion. El protocolo estandar de SBA se baso en el inoculo de la cepa bacteriana de ensayo (MenA F8238) en caldo Mueller Hinton con la adicion de glucosa al 0,25 %. El cultivo bacteriano se incubo a 37 °C en presencia de CO2 al 5 % y el crecimiento se detuvo cuando la bacteria alcanzo la fase exponencial temprana del crecimiento, aproximadamente 0,220-0,240 OD600. Las bacterias se diluyeron a 10'4 con BSA al 1 % en tampon GBBS y se 15 incubaron durante 1 hora a 37 °C con CO2 al 5 % en presencia de agrupamientos de suero inactivado por calor (30 minutos a 56 °C) y suero de bebe conejo al 25 % como fuente de complemento. Las mezclas de reaccion se sembraron a continuacion sobre agar de Mueller Hinton y se incubaron durante una noche a 37 °C. Los tftulos bactericidas se expresaron como la dilucion de suero redproco dando un 50 % de muerte de las bacterias.
La Tabla II muestra los tftulos de IgG totales de polisacarido capsular anti-MenA expresados como GMT (+/- 95 20 ftmites de confianza) segun se midio por ELISA y los tftulos de SBA inducidos por CRM-MenA10/90 y CRM-
MenA10/0. Ambos conjugados fueron capaces de inducir en ratones anticuerpos de polisacaridos anti-MenA espedficos con actividad funcional bactericida.
Tabla II
- Vacuna
- GMT del tftulo ELISA post 2 (+/- 95 % de IC) Tftulo de SBA post 2
- CRM-MenA 10/0 lote 5/ AlPO4
- 346 (230; 520) >4096<8192
- CRM-MenA 10/90 lote 5/AlPO4
- 270 (217;336) 4096
En un segundo experimento, la inmunogenicidad en ratones de CRM-MenA10/90 se ensayo con y sin APO4. La 25 inmunogenicidad del CRM-MenA10/90 se confirmo en la Tabla III, que muestra los tftulos de anticuerpo IgG anti- MenA espedficos inducidos despues de dos y tres inmunizaciones y la actividad bactericida mediada por complemento de estos anticuerpos. Se encontro que los tftulos de preinmunizaciones eran negativos (SBA <4). Estos datos sugieren que la presencia del adyuvante mejora la respuesta a anticuerpos. La imunogenicidad observada en el conjugado es claramente una consecuencia de la conjugacion qrnmica del oligosacarido con la 30 protema transportadora, ya que una mezcla ffsica del oligosacarido MenA, CRM197 y APO4 no era inmunogena.
Tabla III
- Vacuna
- GMT del tftulo ELISA post 2 (+/- 95 % de IC) GMT del tftulo ELISA post 3 (+/- 95 % de IC) Tftulo de SBA post 2 Tftulo de SBA post 3
- CRM-MenA10/90 lote 11 APO4
- 867 (585; 1285) 1299 (1008; 1675) 2048 4096
- CRM-MenA 10/90 lote 11
- 388 (249; 604) 426 (241; 751) 1024 2048
- OligoMenA10/90 lote 11+ CRM197+ APO4 (mezcla ffsica de antfgenos no conjugados)
- 2 2 <4 <4
Ejemplo 2
Modificacion del polisacarido Men A
Modificacion quimica del polisacarido MenA
35 Se anadieron 20 mg de polisacarido capsular nativo MenA (0,072 mmol) a 170 mg (2,5 mmol) de imidazol y 1 ml de CH3CN. En agitacion con una barra magnetica, se anadieron 163 pl (1,59 mmol) de anlddrido acetico y la reaccion se incubo a 55 °C durante 21 h. La relacion molar de imidazol:anlddrido acetico fue de 2:4. Se utilizo una etapa de diafiltracion usando una membrana de celulosa Centricon (corte de peso molecular de 1 kDa) contra agua Milli-Q (1:7 vol/vol) para purificar el producto de reaccion. El material se seco finalmente al vado (SpeedVac).
40 Conformacion de modificaciones quimicas por 1H y 13C RMN
10
15
20
25
30
35
40
Para establecer el grado de acetilacion, se realizo una caracterizacion estructural completa del polisacarido capsular MenA modificado por espectroscopia 1H y 13C RMN.
Se utilizo analisis cuantitativo de RMN para cuantificar el nivel de O-acetilacion de las cadenas de sacaridos. El porcentaje de O-acetilacion se estimo mediante la integracion del pico H230AC (proton en la posicion C-2 de los residuos de N-acetilmanosamina O-acetilados en C-3), pico H240AC (proton en la posicion C-2 de los residuos de N- acetil-manosamina O-acetilados en C-4) y pico H2DEOAC (proton en la posicion C-2 de los residuos de N-acetil- manosamina con O-acetilacion), en comparacion con Hi (proton en la posicion C-1 de los residuos de N-acetil- manosamina). El nivel de O-acetilacion total se obtuvo por la suma de las integraciones de los picos H230AC y H240AC
%O - Acetilacion = [H230Ac + H240Ac]/[HiOAc + HiDEOAC]
Ademas, Ademas, se estimo el porcentaje de O-acetilacion mediante la integracion del pico H230AC/H240AC (proton en la posicion C-3 de los residuos N-acetil-manosina O-acetilados en C-3 y proton en la posicion C-4 de los residuos de N-acetil-manosamina O-acetilado en C-4), en comparacion con Hi (proton en la posicion C-1 de los residuos de N- acetil-manosanina).
%O - Acetilacion = [H230Ac + H240Ac]/[HiOAc + HiDEOAC]
Estabilidad de los polisacaridos MenA
Se uso el analisis de 31P RMN para evaluar la estabilidad del polisacarido capsular MenA modificado totalmente acetilado en comparacion con el polisacarido nativo y el oligosacarido correspondiente a 37 °C durante 42 dfas en tampon de histidina 10 mM pH 7,2, como se ha descrito anteriormente.
El polisacarido MenA modificado totalmente O-acetilado era mucho mas estable que el polisacarido capsular nativo y el oligosacarido correspondiente.
Tabla IV
- Muestra
- avDP
- 0 d
- 7 d 14 d 21 d 28 d 35 d 42 d
- Poli MenA nativo
- >50 >50 44,6 29,6 26,9 20,8 18,3
- Oligo MenA Nativo
- 17,3 15,5 13,0 12,0 11,0 10,4 9,6
- Poli MenA totalmente Ac
- >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50
Estos resultados confirman que la estabilidad del oligosacarido MenA puede mejorarse bloqueando los grupos hidroxilo en las posiciones 4 y 3 de N-acetilmanosamina con un grupo de bloqueo de acuerdo con la presente invencion.
Se entendera que la invencion se ha descrito unicamente a modo de ejemplo y se pueden hacer modificaciones manteniendose dentro del alcance de la invencion.
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Claims (21)
- 510152025REIVINDICACIONES1. Un sacarido capsular modificado que comprende un grupo de bloqueo en una posicion de grupo hidroxilo en al menos el 80 % de las unidades de monosacaridos del sacarido capsular nativo correspondiente, en el que el grupo de bloqueo tiene la formula (la):-O-X-Y (la)en la queX es C(O);Y es R3; y R3 es alquilo C1-6en el que el sacarido capsular nativo correspondiente comprende unidades de monosacarido unidas por enlaces fosfodiester.
- 2. El sacarido capsular modificado de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que R3 es alquilo C1-3.
- 3. El sacarido capsular modificado de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que R3 es CH3.
- 4. El sacarido capsular modificado de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que R3 es alquilo C2 o alquilo C3.
- 5. El sacarido capsular modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que elsacarido capsular nativo correspondiente es un sacarido del serogrupo A de Neisseria meningitidis, particularmente en el que el grupo de bloqueo esta en cualquiera de las posiciones 4 y/o 3 del sacarido del serogrupo A de Neisseria meningitidis correspondiente, mas particularmente en el que el grupo de bloqueo esta en cualquiera de las posiciones 4 del sacarido del serogrupo A de Neisseria meningitidis correspondiente,
- 6. El sacarido capsular modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que todas las unidades de monosacarido del sacarido tienen grupos de bloqueo.
- 7. El sacarido capsular modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el sacarido capsular modificado es un oligosacarido.
- 8. El sacarido capsular modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que:a) el sacarido modificado comprende un grupo hidroxilo anomerico terminal o un grupo amino derivado de un grupo hidroxilo anomerico terminal; o ob) hay al menos una unidad de monosacarido del sacarido capsular modificado donde dos grupos hidroxilo adyacentes del sacarido capsular nativo correspondiente no comprenden grupos de bloqueo.
- 9. Un sacarido de formula:
imagen1 en la queT tiene la formula (A) o (B):imagen2 5 n es un numero entero de 1 a 100;cada grupo Z se selecciona independientemente entre OH, OAc o un grupo de bloqueo como se define en las reivindicaciones 1 a 4; ycada grupo Q se selecciona independientemente de entre OH, OAc o un grupo de bloqueo como se define en las reivindicaciones 1 a 4;10 V se selecciona de entre -NH2, -NHE, -NE1E2, W2, o -O-D, en la que: E, E1 y E2 son grupos protectores denitrogeno, que pueden ser iguales o diferentes, y D es un grupo protector de oxfgeno;W se selecciona entre -OH o un grupo de bloqueo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4;W1 se selecciona entre -OH o un grupo de bloqueo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 4;W2 se selecciona entre -OH o un grupo de bloqueo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4;y en las que al menos uno de los grupos Z y el 80-99 % de los grupos Q son grupos de bloqueo como se define en las reivindicaciones 1 a 4, el 1-20 % de los grupos Q son OAc y el resto de los grupos Q son OH.20 10. El sacarido de acuerdo con la reivindicacion 9, en el que al menos el 10 % de los grupos Z son grupos debloqueo y/o n es un numero entero de 15 a 25.510152025303540 - 11. Un procedimiento de modificacion de un sacarido capsular que comprende las etapas de:(a) proporcionar un sacarido capsular que tiene al menos un grupo hidroxilo en una unidad de monosacarido; y(b) convertir dicho al menos un grupo hidroxilo en un grupo de bloqueo como se define en las reivindicaciones 1 a 4 en al menos el 80 % de las unidades de monosacarido del sacarido capsular, particularmente en el quela etapa (b) comprende la etapa de:(bl) hacer reaccionar el sacarido capsular con [(R3C(O)]2O en presencia de un catalizador de imidazol.
- 12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 11, en el que el sacarido capsular en la etapa (a) es un oligosacarido capsular, particularmente en el que el oligosacarido capsular se puede obtener por despolimerizacion y dimensionamiento del polisacarido capsular nativo correspondiente, o el sacarido capsular en la etapa (a) es un polisacarido capsular nativo y el procedimiento comprende ademas una etapa (c) en la que se dimensiona el producto de la etapa (b), proporcionando de este modo un oligosacarido capsular modificado.
- 13. Un procedimiento para modificar un polisacarido del serogrupo A de Neisseria meningitidis que comprende las etapas de:(A)(a) proporcionar un polisacarido del serogrupo A de Neisseria meningitidis nativo;(b) despolimerizar y dimensionar dicho polisacarido para proporcionar un oligosacarido; y(c) convertir al menos un grupo hidroxilo del oligosacarido en un grupo de bloqueo, de acuerdo con la reivindicacion 11; o(B)(a) proporcionar un polisacarido del serogrupo A de Neisseria meningitidis nativo;(b) convertir al menos un grupo hidroxilo del polisacarido en un grupo de bloqueo, de acuerdo con la reivindicacion 11; y(c) despolimerizar y dimensionar el polisacarido resultante.
- 14. Un procedimiento de preparacion del sacarido capsular modificado de las reivindicaciones 1 a 10, que es un procedimiento de smtesis total que comprende formar enlaces glicosfdicos entre dos o mas unidades de monosacarido.
- 15. Un conjugado sacarido-protema de un sacarido modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, particularmente en el que la protema es una toxina o un toxoide bacteriano, por ejemplo, toxina difterica o toxoide difterico, mas particularmente en el que la toxina o toxoide bacteriano es CRM197.
- 16. Un procedimiento depreparacion de un conjugado sacarido-protema que comprende las etapas de:(A)(a) proporcionar un sacarido capsular modificado de acuerdo con la reivindicacion 8, parte a); y(b) conjugar el sacarido capsular modificado en una protema a traves del grupo hidroxilo anomerico terminal o el grupo amino derivado de un grupo hidroxilo anomerico terminal; o(B)(a) proporcionar un sacarido capsular modificado de acuerdo con la reivindicacion 8, parte b);(b) convertir al menos uno de los pares de grupos hidroxilo adyacentes en grupos aldetndo por escision oxidativa; y(c) unir el sacarido capsular modificado a una protema por aminacion reductora.
- 17. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 16, en el que la protema es como se define en la reivindicacion 15.
- 18. Una molecula que comprende un resto de sacarido de formula:510
imagen3 en la queT tiene la formula (A) o (B):imagen4 n es un numero entero de 1 a 100;cada grupo Z se selecciona independientemente de OH o un grupo de bloqueo como se define en las reivindicaciones 1 a 4; ycada grupo Q se selecciona independientemente de OH o un grupo de bloqueo como se define en las reivindicaciones 1 a 4;W se selecciona entre OH o un grupo de bloqueo como se define en las reivindicaciones 1 a 4;L es O, NH, NE, S o Se;en las que el enlace covalente libre de L esta unido a un transportador proteico; en las que el transportador proteico es como se define en la reivindicacion 15;y en las que al menos uno de los grupos Z y el 80-99 % de los grupos Q son grupos de bloqueo como se define en las reivindicaciones 1 a 4, el 1-20 % de los grupos Q son OAc y el resto de los grupos Q son OH. - 19. Una molecula que comprende un sacarido de formula:
imagen5 en la queT tiene la formula (A) o (B):imagen6 5 n, Z, Q, W, W1 y V son como se define en la reivindicacion 9, y al menos uno de los grupos Z y/o al menos unode los grupos Q tienen la formula (IIa) o (IIb):-O-X-Y' (IIa) -O-R4 (IIb)en la queX es C(O), S(O) o SO2;10 Y' es NR2R4;R2 es H o alquilo C1-6; yR4 es -alquileno Ci-4-CH(O) o -alquileno C1-5-NH-, en la que el grupo -NH- es parte de un transportador proteico;en la que el transportador proteico es una protema definida en la reivindicacion 15 15 y en la que al menos el 80 % de las unidades de monosacarido del sacarido tienen grupos de bloqueo como se define en las reivindicaciones 1-4. - 20. Una composicion farmaceutica que comprende (a) un sacarido modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y/o un conjugado sacarido-protema de acuerdo con la reivindicacion 15, y/o una molecula de acuerdo con la reivindicacion 18 o 19, y (b) un vetnculo farmaceuticamente aceptable, particularmente quecomprende ademas un antigeno de sacarido de uno o mas de los serogrupos C, W135 e Y de N. meningitidis, siendo el sacarido opcionalmente un oligosacarido y estando conjugado opcionalmente con una protema transportadora, y/o que comprende ademas un adyuvante de vacuna tal como un fosfato de aluminio.
- 21. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 20, que es una vacuna contra una enfermedad causada por N. 5 meningitidis.
- 22. El sacarido modificado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10; el conjugado de acuerdo con la reivindicacion 15; o la molecula de acuerdo con la reivindicacion 18 o 19, para su uso como un medicamento, particularmente para su uso en la prevencion o tratamiento de una enfermedad causada por una o mas bacterias encapsuladas, mas particularmente en el que la enfermedad es meningitis bacteriana.10
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