ES2828039T3 - Vacunas conjugadas de salmonela - Google Patents

Abstract

Un conjugado para usar en una vacuna, comprendiendo dicho conjugado un polisacárido Vi fragmentado y una proteína portadora seleccionada entre CRM197 o toxoide diftérico, en el que el polisacárido fragmentado tiene un peso molecular promedio de entre 40 y 55 kDa.

Description

DESCRIPCIÓN

Vacunas conjugadas de salmonela

Antecedentes de la invención

Los sacáridos de bacterias se han utilizado durante muchos años en vacunas. Como los sacáridos son antígenos independientes de T, sin embargo, son poco inmunogénicos. Además, son ineficaces en bebés o niños pequeños menores de 2 años. La conjugación con un portador puede convertir eficazmente antígenos independientes de T en antígenos dependientes de T, mejorando así las respuestas de memoria y permitiendo que se desarrolle una inmunidad protectora. Por lo tanto, hasta la fecha, las vacunas de sacáridos más eficaces se basan en glicoconjugados. Los documentos WO95/31994 y WO94/03208, ambos de Yeda Research and Development Co. Ltd., US 5.204.098 y WO2008/081022 se refieren a conjugados de antígenos poco inmunogénicos.

Muchos procesos de conjugación hacen uso de oligosacáridos cortos, y esto es principalmente para mejorar el proceso de fabricación (mejor control de la consistencia de fabricación, mejor caracterización del producto final). Es bien sabido que la longitud de la cadena de sacáridos puede tener un impacto en la inmunogenicidad de las vacunas conjugadas (P. Costantino et al., Expert Opin. Drug Discov., 6 (2011) 1045). IN1330MUM2010 de Serum Institute of India Ltd se refiere a un procedimiento para preparar fragmentos de polisacáridos adecuados para la conjugación. El documento US 6.045.805 también describe procedimientos para preparar oligosacáridos.

La fiebre tifoidea sigue siendo una enfermedad grave en los países en desarrollo que afecta a millones de personas cada año (Crump JA et al., Bull. Wld. Hlth. Org. 82, 346-353 (2004); Ochai RL et al., y el Domi Typhoid Study Group, Bull. Wld. Hlth. Org. 86, 260-268 (2008)). En la última década se han desarrollado vacunas conjugadas para esta enfermedad. Por ejemplo, el NICHD/NIH desarrolló una vacuna conjugada segura y altamente inmunogénica basada en Vi (polisacárido de Salmonella entérica serovar Typhi) y portador de proteína rEPA (Lanh et al., N. Eng. J. Med.

2003; Thiem et al., Clin Vac. Immunol.2011; Szu, Expert Rev. Vaccines 12 (11), 1273-1286 (2013)). Varios artículos discuten la inmunogenicidad de Vi, sus vacunas conjugadas y la longitud de la cadena de Vi considerada hasta ahora óptima (Szu et al., Infection and Immunity, 1989, 3823; Szu et al., Infection and Immunity, 1991, 4555; Szu et al. Infection and Immunity, 1994, 5545; Kossaczka et al., Infection and Immunity, 1999, 5806; Cui et al., Clin. Vaccine Immunol., 17 (2010), 73-79; Micoli et al., Vaccine, 29 (2011), 712-720; An et al., Vaccine, 29 (2011), 7618-23; Rondini et al., Clin. Vaccine Immunol., 18 (2011), 460-68; An et al., Vaccine, 30 (2012), 1023-1028).

Más recientemente, Micoli et al., han descrito un conjugado de vacuna de Salmonella Typhi basado en Vi de Citrobacter freundii sensu lato purificado y portador de proteína CRM¹⁹⁷, Vaccine 2012 y Rondini et al., J. Infect. Dev Ctries, 2012. Cuando se probó en humanos, la vacuna conjugada Vi-CRM¹⁹⁷ proporcionó respuestas de anticuerpos anti-Vi más altas en comparación con Vi no conjugado después de una sola inmunización y en una dosis más baja (van Damme et al., PlosOne 2011; más resultados presentados en la 8a Conferencia Internacional sobre fiebre tifoidea y otras salmonelosis invasivas, Bangladesh, marzo de 2013). Sin embargo, la respuesta anti-Vi después de la revacunación fue menor que la respuesta primaria y la persistencia de anti-Vi fue más corta de lo deseado (Bhutta et al., Lancet Infect Dis, 14 (2014) 119).

El documento US 5.204.098 divulga polisacáridos capsulares Vi conjugados con proteínas dependientes de toxina. Por lo tanto, todavía existe la necesidad de proporcionar vacunas conjugadas mejoradas.

Sumario de la invención

La invención se refiere a un conjugado a base de polisacárido Vi fragmentado y una proteína portadora. En particular, el polisacárido Vi fragmentado tiene un peso molecular promedio de entre 40 y 55 kDa. La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende el conjugado de la invención. La invención también proporciona un conjugado o composición farmacéutica de acuerdo con la invención para su uso en la activación de una respuesta inmune en un mamífero. La invención proporciona además un conjugado o composición farmacéutica de acuerdo con la invención para su uso en la producción de una respuesta inmune dependiente de T esencialmente libre de una respuesta inmune independiente de T en un mamífero. La invención proporciona además un conjugado o composición farmacéutica de acuerdo con la invención para su uso en la prevención de enfermedades o fiebre tifoidea. La invención también proporciona un procedimiento para la fabricación de dicho conjugado. La invención proporciona además un conjugado para usar en una vacuna que se puede obtener mediante el procedimiento de la invención.

Los conjugados preferidos de la invención deberían poder inducir una respuesta de memoria, proporcionar un efecto de refuerzo tras la revacunación y niveles sostenidos de anticuerpos. Idealmente, los conjugados deberían ser efectivos en todas las edades de la población, particularmente en niños menores de 2 años.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra las etapas de síntesis para elaborar conjugados de la presente invención (PS = polisacárido fragmentado; prot. = proteína portadora; RC=N=CR 'puede ser cualquier carbodiimida, por ejemplo típicamente 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)cabodiimida).

La Figura 2 muestra la respuesta inmunológica en ratones de los grupos 1 a 10. Los grupos 1 a 4 se inmunizaron con conjugados que comprenden Vi fragmentado y CRM¹⁹⁷ como proteína portadora, en los que el Vi fragmentado en el grupo 1 tiene un peso molecular promedio (PMprom.) de 9,5 kDa; el Vi fragmentado en el grupo 2 tiene un PMprom. de 22,8 kDa; el Vi fragmentado en el grupo 3 tiene un PMprom. de 42,7 kDa; y el Vi fragmentado en el grupo 4 tiene un PMprom. de 82 kDa. El grupo 5 se inyectó con Vi nativo conjugado con CRM¹⁹⁷, los grupos 6 a 9 con Vi fragmentado no conjugado que tenía el PMprom. de los grupos 1 a 4 respectivamente. El grupo 10 recibió Vi nativo.

La Figura 3 muestra la unidad repetida del polisacárido Vi de Salmonella Typhi, en la que Ac es un grupo acetilo. La Figura 4 muestra los espectros de RMN de 1H (en NaOD 200 mM, a t A, 500 MHz) indicativos de la cantidad de O-acetilación en Vi nativo y Vi fragmentado (Grupo 1-4).

La Figura 5 muestra perfiles de HPLC-SEC (214 nm) de Vi nativo en comparación con mezcla de Vi fragmentada y la Figura 6 muestra cuatro grupos de Vi fragmentado (Grupo 1-4) de diferente PMprom. Las muestras se pasan por una columna TSK gel 3000 PWXL, eluyendo con NaH²PO⁴ NaCl 100 mM, CH³CN al 5% 100 mM, pH 7,2 a razón de 0,5 ml/min; Vo 10,663 min; Vtot 23,326 min.

La Figura 7 muestra el perfil de HPLC-SEC (214 nm) de Vi fragmentado PMprom. 42,7 kDa (columna TSK gel 3000 PWXL, NaH² PO⁴100 mM, NaCl 100 mM, CH³CN al 5%, pH 7,2, 0,5 ml/min; Vo 10,663 min; Vtot 23,326 min; utilizando dextranos como estándares). El 80% del área del pico está entre 70 y 25 kDa.

La Figura 8 muestra la respuesta observada en ratones de tipo silvestre frente a deficientes en células T (TCR p8‘ /_) cuando se inmunizan con Vi no conjugado de longitud completa, un conjugado de Vi de longitud completa y conjugados de Vi fragmentado.

La Figura 9 muestra la respuesta observada en conjugados de Vi de longitud completa y conjugados de Vi fragmentado conjugados con CRM¹⁹⁷ , DT y TT.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a conjugados que comprenden Vi fragmentado conjugado con una proteína portadora.

Para los propósitos de interpretar esta memoria descriptiva, se aplicarán las siguientes definiciones y, cuando sea apropiado, los términos usados en singular también incluirán el plural y viceversa.

Como se usa en este documento, el término "un", "uno, una", "el, la" y términos similares usados en el contexto de la presente invención (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) deben interpretarse para cubrir tanto el singular como el plural a menos que se indique lo contrario en este documento o que el contexto lo contradiga claramente.

El término "aproximadamente" en relación con un valor numérico x es opcional y significa, por ejemplo, x 10%.

Como se usa en el presente documento, el término "Vi" o "polisacárido Vi" se refiere al polisacárido capsular de Salmonella entérica serovar Typhi purificado de Citrobacter (Rondini et al., J. Infect. Dev. Ctries, 2012).

Como se usa en este documento, el término "polisacárido nativo" se refiere a un polisacárido que no ha sido sometido a un proceso, cuyo propósito es reducir el tamaño de dicho polisacárido.

Como se usa en el presente documento, el término "fragmentado" en referencia al polisacárido Vi se refiere al polisacárido Vi que ha sufrido una reducción de tamaño, reduciendo así el número de unidades repetidas en el polisacárido. Por lo tanto, Vi fragmentado tiene un PMprom. más bajo en comparación con Vi nativo. Por ejemplo, Vi fragmentado puede comprender de 30 a 300 unidades repetidas, en comparación con más de 600 unidades repetidas para Vi nativo. En la Figura 3 se muestra una estructura de la unidad repetitiva monomérica de Vi. En el Vi fragmentado de la presente invención, preferiblemente no se observan cambios en la estructura de la unidad repetitiva en comparación con el Vi nativo. Esto puede confirmarse mediante análisis de RMN de 1H (véase la Figura 4). Además, el porcentaje de grupos O-acetilo en el Vi fragmentado es preferiblemente el mismo que el del Vi nativo (es decir, aproximadamente un 95% de O-acetilación) pero puede variar y disminuir hasta aproximadamente un 65% de O-acetilación. La O-acetilación se puede determinar mediante mediciones estándar tales como RMN de 1H, procedimiento colorimétrico de Hestrin.

Como se usa en el presente documento, el término "agrupaciones" se refiere a grupos de Vi fragmentado que tienen un intervalo de peso molecular promedio definido y que pueden separarse unos de otros mediante procedimientos estándar. Los grupos consisten en Vi fragmentado como se define en este documento.

En su tamaño nativo, el polisacárido Vi tiene un peso molecular promedio medido por cromatografía de exclusión por tamaño HPLC (HPLC-SEC) de aproximadamente 165 kDa. El Vi fragmentado usado en la presente invención tiene un PMprom. de entre 40 y 55 kDa. Este valor se mide por HPLC-SEC. Normalmente, el peso molecular promedio se calcula pasando la muestra en una columna TSK gel 3000 PWXL (30 cm x 7,8 mm; tamaño de partícula 7 pm; cód.

808021) con un protector de columna TSK gel PWXL (4,0 cm x 6,0 mm; tamaño de partícula 12 |jm; cód. 808033) (Tosoh Bioscience) usando dextranos como estándares (5, 25, 50, 80, 150 kDa). La fase móvil es NaCI 0,1 M, NaH² PO⁴ 0,1 M, CH³CN al 5%, pH 7,2, a un caudal de 0,5 ml/min (procedimiento isocrático durante 30 min). La calibración del volumen del vacío y del lecho se realiza con A-ADN (A-DNA Molecular Weight Marker III 0,12-21,2 kb; Roche) y azida sódica (NaN³; Merck), respectivamente.

El Vi fragmentado de la presente invención puede además separarse en grupos de diferentes intervalos de peso molecular promedio. Esto se puede lograr mediante procedimientos conocidos en la técnica tales como cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de exclusión por tamaño, filtración de flujo tangencial.

En una realización de la invención, Vi fragmentado tiene un valor de PMprom. de aproximadamente 40 a 55 kDa, más preferiblemente de 42 a 53 kDa, incluso más preferiblemente de 45 a 50 kDa. En otra realización, Vi fragmentado tiene un PMprom. de aproximadamente 41 a 49 kDa, preferiblemente de 41 a 48 kDa, más preferiblemente de 42 a 46 kDa. En una realización adicional, Vi fragmentado tiene un PMprom. de aproximadamente 43 kDa. En una realización adicional, Vi fragmentado tiene un PMprom. de 51 a 55 kDa, preferiblemente de 52 a 54 kDa. En una realización adicional, Vi fragmentado tiene un PMprom. de aproximadamente 53 kDa.

Será evidente para el experto en la materia que el peso molecular promedio de Vi o sus fragmentos puede variar dependiendo del procedimiento de medición. Como se describe en el presente documento, los valores dados para el peso molecular promedio se miden mediante cromatografía de exclusión por tamaño HPLC, normalmente usando las columnas, tampón y estándares descritos en el presente documento. Sin embargo, el experto en la materia comprenderá que los cambios en la columna, el tampón y/o los estándares utilizados afectarán al peso molecular promedio calculado. Por ejemplo, Vi nativo tiene un PMprom. calculado de 148 kDa cuando se mide usando un sistema UPLC-SEC con columna Acquity UPLC BEH200 de 1,7 mm (4,6 x 150 mm) a razón de 0,45 ml/min en comparación con 165 kDa cuando se mide utilizando el procedimiento descrito en este documento. Por lo tanto, pueden producirse variaciones en el PMprom. medido de aproximadamente /-10% y un experto en la técnica entenderá que la presente invención no está limitada por los valores absolutos sino que puede variar dentro de los límites de las variaciones de medición.

Los grupos de Vi fragmentado usados en la presente divulgación tienen ciertas distribuciones de intervalos de peso molecular promedio que pueden caracterizarse adicionalmente en términos de índice de polidispersidad (PDI). El índice de polidispersidad se calcula como se muestra en la siguiente ecuación:

PDI = Mw/Mn

en la que Mw es el peso molecular promedio en peso y Mn es el peso molecular promedio en número.

Cuanto más estrecha es la distribución del peso molecular, más se acerca el valor de PDI a 1.

El grupo de Vi fragmentado puede tener una distribución de PMprom. caracterizada porque al menos el 80% del grupo tiene un PMprom. entre 25 kDa y 70 kDa. Puede tener una distribución de PMprom. caracterizada porque al menos el 50% del grupo tiene un PMprom. entre 35 kDa y 60 kDa.

Puede tener una distribución de PMprom. caracterizada porque al menos el 30% del grupo tiene un PMprom. entre 41 kDa y 55 kDa.

La fragmentación se puede llevar a cabo mediante varios procedimientos conocidos en la técnica, tales como hidrólisis química del polisacárido nativo, fragmentación enzimática del polisacárido nativo, irradiación gamma del polisacárido nativo o procedimientos mecánicos tales como sonicación, homogeneizador de alta presión/microfluidizador/HPCDS (sistema de disrupción celular de alta presión) del polisacárido nativo.

El procedimiento de fragmentación utilizado en la presente divulgación se selecciona de manera que pueda producir Vi fragmentado que tenga un PMprom. de menos de 80 kDa, preferiblemente menos de 60 kDa, más preferiblemente entre 40 y 55 kDa.

El procedimiento también se selecciona preferiblemente de modo que no haya alteraciones en la estructura de las unidades repetidas.

Preferiblemente, la fragmentación no se realiza mediante procedimientos mecánicos. Preferiblemente, la fragmentación no es por hidrólisis alcalina.

El Vi fragmentado de la presente invención se obtiene preferiblemente mediante hidrólisis química con peróxido de hidrógeno. Usando este procedimiento, se encontró que el polisacárido Vi se podía reducir de tamaño sin alterar la estructura de las unidades repetidas. Además, la hidrólisis con peróxido de hidrógeno podría permitir la formación de Vi fragmentado que tiene un peso molecular promedio más bajo que cuando se utilizan procedimientos mecánicos.

Si el Vi fragmentado de la presente invención se obtiene mediante hidrólisis química con peróxido de hidrógeno, se encontró que la adición de una cantidad catalítica de cloruro férrico (FeCh) permite que la reacción funcione en condiciones más suaves (temperatura más baja y tiempo de reacción más corto). Por lo tanto, en un aspecto de la divulgación, existe un procedimiento para fragmentar un polisacárido que comprende la etapa de hacer reaccionar el polisacárido nativo con peróxido de hidrógeno en presencia de cloruro férrico. Más particularmente, un aspecto de la divulgación se refiere a un procedimiento para fragmentar Vi que comprende la etapa de hacer reaccionar el Vi nativo con peróxido de hidrógeno en presencia de cloruro férrico. Incluso más particularmente, el procedimiento comprende hacer reaccionar Vi con peróxido de hidrógeno aproximadamente al 3% en agua y cloruro férrico 0,1 mM. Preferiblemente, la temperatura de reacción es de aproximadamente 20 a 40 °C.

En otro aspecto de la divulgación, existe un procedimiento para fragmentar un polisacárido que comprende la etapa de hacer reaccionar el polisacárido nativo con peróxido de hidrógeno en presencia de sulfato ferroso. El uso de sulfato ferroso, que es más soluble que el FeCh, conduce a un proceso más reproducible. La divulgación se refiere a un procedimiento para fragmentar Vi que comprende la etapa de hacer reaccionar el Vi nativo con peróxido de hidrógeno en presencia de sulfato ferroso como catalizador. En particular, el procedimiento comprende hacer reaccionar Vi nativo con peróxido de hidrógeno aproximadamente al 0,5% en agua en presencia de sulfato ferroso 0,1 mM. Preferiblemente, la temperatura de reacción es de aproximadamente 20 a 40 °C. El Vi fragmentado obtenido mediante este procedimiento se somete preferiblemente a una etapa de calentamiento (aproximadamente 80 °C) antes de su uso en los procedimientos de conjugación de la divulgación.

La fragmentación va seguida generalmente de purificación.

La purificación se puede llevar a cabo mediante procedimientos conocidos en la técnica. Normalmente, la purificación se realiza mediante cromatografía de intercambio aniónico.

La purificación típicamente produce "grupos" de Vi fragmentado de diferente longitud y diferentes intervalos de peso molecular promedio.

La proteína portadora de los presentes conjugados puede seleccionarse entre CRM¹⁹⁷ o toxoide diftérico. Lo más preferiblemente, la proteína portadora es CRM¹⁹⁷. La Figura 9 muestra la diferencia en las respuestas inmunológicas de Vi fragmentado conjugado con CRM¹⁹⁷, toxoide diftérico (DT) y toxoide tetánico (TT). Las respuestas observadas para conjugados de Vi fragmentado con CRM¹⁹⁷ y toxoide diftérico (DT) son típicas de una respuesta inmune dependiente de T (respuesta inmunológica más baja después de la primera inyección (días 14 y 35) seguida de una respuesta de refuerzo después de la segunda inyección (día 49)). En comparación, los conjugados de Vi fragmentado con toxoide tetánico (TT) mostraron una alta respuesta de anticuerpos a una dosis de vacuna sin una clara respuesta anamnésica a una segunda dosis, un hallazgo que se observa cuando está presente una respuesta prominente independiente de T.

La invención se refiere además a un procedimiento para fabricar un conjugado que comprende Vi fragmentado y una proteína portadora seleccionada de CRM¹⁹⁷ o toxoide diftérico que comprende las etapas de:

a) Fragmentar el polisacárido Vi para obtener un polisacárido Vi fragmentado que tiene un PMprom. de 40 a 55 kDa;

b) Hacer reaccionar el polisacárido Vi fragmentado obtenido en la etapa a) con una carbodiimida y N-hidroxisuccinimida a un pH de 5 a 6 para formar un éster de N-hidroxisuccinimida

c) Hacer reaccionar el éster de N-hidroxisuccinimida obtenido en la etapa b) con la proteína portadora para producir dicho conjugado.

En la Figura 1 se muestra una realización del presente procedimiento.

En el presente procedimiento, la etapa a) es seguida opcionalmente por una etapa de purificación. La etapa de purificación produce grupos de Vi fragmentado de diferentes intervalos de peso molecular promedio. El grupo de Vi fragmentado que tiene un intervalo de peso molecular promedio entre 40 y 55 kDa se usa en las etapas b) y c) del presente procedimiento.

La carbodiimida utilizada en la etapa b) del presente procedimiento puede ser cualquier carbodiimida adecuada que sea capaz de conjugar sacáridos y proteínas en un medio acuoso. Normalmente, la carbodiimida utilizada es 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)cabodiimida) (EDAC). Alternativamente, se puede usar meto-p-toluenosulfonato de 1-ciclohexil-3-(2-morfolinoetil)carbodiimida (CMC).

En la etapa b) del procedimiento, el polisacárido Vi fragmentado está presente preferiblemente en una concentración de 50 pmol/ml a 200 pmol/ml en términos de grupos COOH.

En la etapa b) del procedimiento, la concentración de Vi fragmentado puede ser de aproximadamente 15 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml. Cuanto menor sea el PMprom. de Vi fragmentado, mayor puede ser la concentración de Vi en la etapa b) del presente procedimiento.

La relación molar de carbodiimida con respecto al grupo COOH de Vi fragmentado en el medio de reacción puede variar entre 1:1 y 10:1. Puede ser 5:1. El número de grupos COOH de Vi fragmentado corresponde típicamente al número de unidades repetidas de Vi.

En la etapa b), la reacción de los grupos ácido carboxílico del Vi fragmentado con la carbodiimida produce un compuesto intermedio de O-acilurea que a su vez reacciona con N-hidroxisuccinimida (NHS) para formar un éster de N-hidroxisuccinimida.

La concentración de NHS usada en la etapa b) es preferiblemente de aproximadamente 0,1 M a 0,4 M.

El medio de reacción para el procedimiento de la presente invención es típicamente un tampón de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES).

El tiempo de reacción para la etapa b) es típicamente de aproximadamente 1 hora. La temperatura de reacción es típicamente de aproximadamente 20-30 °C.

El compuesto intermedio resultante obtenido en la etapa b) (Vi fragmentado derivatizado con grupos éster) se puede analizar mediante HPAEC-PAD (cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento con detección amperométrica pulsada) para determinar el contenido total de azúcar y la HPLC-RP de par iónico (HPLC de fase inversa) para cuantificación de NHS. Esto permite determinar el % de unidades repetidas de Vi fragmentado activadas (es decir, Vi fragmentado que ha reaccionado con NHS). Preferiblemente, el % de Vi fragmentado activado es de 10-50%, más preferiblemente aproximadamente 20-30%.

El compuesto intermedio obtenido en la etapa b) del presente procedimiento se puede purificar opcionalmente por desalinización a pH bajo o precipitación con etanol.

En la etapa c) del presente procedimiento, el éster de N-hidroxisuccinimida obtenido en la etapa b) del presente procedimiento se hace reaccionar luego con una proteína portadora para producir un conjugado que comprende Vi fragmentado y dicha proteína portadora.

La proteína portadora es una proteína que se usa típicamente en la fabricación de conjugados para uso en vacunas. Por ejemplo, la proteína portadora puede ser CR M -^o toxoide diftérico. Lo más preferiblemente, la proteína portadora es CRM¹⁹⁷.

El portador de proteína puede derivatizarse antes de la reacción con el éster de NHS obtenido en la etapa b) del presente procedimiento. La proteína portadora puede derivatizarse típicamente con una hidrazida. Normalmente, el portador de proteína se derivatiza con dihidrazida de ácido adípico (a Dh ) (como se muestra en la Figura 1).

Si se usa CRM¹⁹⁷ como proteína portadora en la etapa c) del presente procedimiento, la relación p/p de Vi con respecto a CRM¹⁹⁷ es preferiblemente de 2:1 a 1:2. Por ejemplo, puede ser 2:1, 1:1 o 1:2.

En la etapa c) del procedimiento de la presente invención, la concentración de Vi fragmentado derivatizado, es decir, éster de N-hidroxisuccinimida (NHS), en el medio de reacción puede ser de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml. Cuanto menor sea el peso molecular promedio de Vi fragmentado, mayor puede ser la concentración del éster de NHS en la etapa c) del presente procedimiento.

El tiempo de reacción para la etapa c) del procedimiento de la invención es típicamente de aproximadamente 2 horas. La temperatura de reacción para la etapa c) del procedimiento de la invención es típicamente de aproximadamente 20-30 °C. Se pueden usar procedimientos conocidos para evaluar la finalización de la reacción.

La etapa de conjugación c) se realiza preferiblemente en tampón MES pH 6, habitualmente a una concentración de aproximadamente 20 mM.

En la etapa c) del presente procedimiento, el pH es preferiblemente de aproximadamente 6. Este valor de pH es más bajo que el indicado cuando se usa NHS en química de conjugación. Sin pretender imponer ninguna teoría, se cree que en este intervalo de pH, la hidrólisis del NHS es más lenta que a un pH más alto, lo que da como resultado un proceso de conjugación más eficaz.

El conjugado obtenido mediante el presente procedimiento puede someterse a procesos de purificación adicionales. Por ejemplo, el conjugado puede purificarse mediante cromatografía de exclusión por tamaño o filtración de flujo tangencial, cromatografía hidrófoba o cromatografía de intercambio iónico.

En el presente procedimiento, la presencia de carbodiimida y NHS usados en la etapa b) permite tener una alta eficiencia de conjugación sin alterar la estructura de las unidades repetitivas Vi fragmentadas. Si solo se usa una carbodiimida tal como EDAC (es decir, sin la presencia de NHS), se requieren altas concentraciones de dicha carbodiimida para que el proceso sea eficiente. Además, se producen grupos N-acil urea en los grupos COOH de Vi fragmentado, modificando la estructura del polisacárido y alterando sus epítopos. El uso de NHS evita la formación de estos derivados. Con el presente procedimiento, el porcentaje de estos derivados en los conjugados de Vi fragmentado es menos del 2% en moles (carbodiimida/COOH de Vi) y también los grupos éster residuales son menos del 1% en moles. Los conjugados obtenidos por el presente procedimiento también se caracterizan por una cantidad de Vi libre, es decir, fragmentado no conjugado que es menos del 20%, preferiblemente menos del 15%, más preferiblemente menos del 5%. Preferiblemente, no se detecta Vi fragmentado libre. Además, preferiblemente no se detecta proteína libre. Los conjugados de la presente invención se pueden caracterizar además por su relación de Vi fragmentado con respecto a proteína portadora. Por ejemplo, la relación p/p de Vi fragmentado: portador de proteína puede ser de aproximadamente 1,5:1 a aproximadamente 1:3. Estas relaciones pueden variar dependiendo del intervalo de peso molecular promedio del Vi fragmentado utilizado. También pueden variar de acuerdo con la proteína portadora utilizada. Cuando se usa CRM¹⁹⁷ como la proteína portadora, la relación p/p de Vi a CRM¹⁹⁷ puede ser de aproximadamente 0,33 a aproximadamente 1,33. En una realización de la invención, es aproximadamente 0,33. En una realización de la invención, es aproximadamente 0,52. En una realización de la invención, es aproximadamente 0,64. En una realización de la invención, es de aproximadamente 1,33.

Cuando se usa toxoide diftérico (DT) como la proteína portadora, la relación p/p de Vi a DT puede ser de aproximadamente 0,85.

Los conjugados de la invención tienen preferiblemente al menos 60%, más preferiblemente al menos 80%, incluso más preferiblemente al menos 90% de O-acetilación. En una realización más preferida, los conjugados de la invención tienen aproximadamente un 95% de O-acetilación. Esto es comparable a la O-acetilación de Vi nativo y es una confirmación de que la estructura de las unidades repetidas monoméricas de Vi fragmentadas no se altera por fragmentación.

El porcentaje de O-acetilación puede medirse mediante procedimientos conocidos en la técnica tales como RMN de 1H, procedimiento colorimétrico de Hestrin.

En una realización de la invención, el conjugado comprende de 5 a 25 |jg de Vi fragmentado. En una realización de la invención, el conjugado comprende 8 jg de Vi fragmentado.

En una realización de la invención, la proteína portadora en el conjugado es CRM¹⁹⁷. En una realización de la invención, el conjugado comprende de 5 a 25 jg de CRM¹⁹⁷. En una realización, el conjugado comprende de 10 a 15 jg de CRM¹⁹⁷.

En un conjugado de la invención, la cantidad de Vi fragmentado es de 8 jg y la cantidad de CRM¹⁹⁷ es de 12,5 jg .

El conjugado de la invención puede obtenerse adicionalmente mediante el procedimiento descrito en el presente documento. Por lo tanto, un conjugado que se puede obtener mediante el procedimiento de la invención también forma parte de la invención. El conjugado de la presente invención se puede procesar adicionalmente en una composición farmacéutica. Por lo tanto, la invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el conjugado de la presente invención en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en este documento, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, tensioactivos, antioxidantes, conservantes (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, agentes retardadores de la absorción, sales, conservantes, estabilizadores de fármacos, aglutinantes, excipientes, agentes de desintegración, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, colorantes y similares y combinaciones de los mismos, como sabrán los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, en Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edición, ISBN: 0683306472). Excepto en la medida en que cualquier vehículo convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas o farmacéuticas.

El término "una cantidad terapéuticamente eficaz" de un compuesto de la presente invención se refiere a una cantidad del conjugado de la presente invención que provocará la respuesta biológica o médica de un sujeto, o evitará una enfermedad, etc. En una realización no limitante, el término "una cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad del compuesto de la presente invención que, cuando se administra a un sujeto, es eficaz para prevenir una afección, un trastorno o una enfermedad mediada por Salmonella Typhi.

Como se usa en este documento, el término "sujeto" se refiere a un animal. Normalmente, el animal es un mamífero. Un sujeto también se refiere, por ejemplo, a primates (por ejemplo, humanos, machos o hembras), vacas, ovejas, cabras, caballos, perros, gatos, conejos, ratas, ratones, peces, aves y similares. En ciertas realizaciones, el sujeto es un primate. En aún otras realizaciones, el sujeto es un ser humano.

Las infecciones microbianas afectan a diversas áreas del cuerpo y, por lo tanto, las composiciones de la invención se pueden preparar de diversas formas. Por ejemplo, las composiciones se pueden preparar como inyectables, bien sea como soluciones o suspensiones líquidas. También se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección. La composición se puede preparar para administración tópica, por ejemplo, como ungüento, crema o polvo. La composición se puede preparar para administración oral, por ejemplo, como comprimido o cápsula, o como jarabe (opcionalmente saborizado). La composición puede prepararse para administración pulmonar, por ejemplo, como inhalador, usando un polvo fino o un aerosol. La composición se puede preparar como supositorio o pesario. La composición se puede preparar para administración nasal, auditiva u ocular, por ejemplo, en forma de gotas, atomizador o como un polvo. La composición se puede incluir en un enjuague bucal. La composición puede liofilizarse.

La composición farmacéutica es preferiblemente estéril. Preferiblemente no contiene pirógenos. Preferiblemente está tamponado, por ejemplo, entre pH 6 y pH 8, generalmente alrededor de pH 7.

Una composición de la invención puede comprender un conjugado de la invención y una solución salina.

La invención también proporciona un dispositivo de administración que contiene una composición farmacéutica de la invención. El dispositivo puede ser, por ejemplo, una jeringa o un inhalador.

Las composiciones farmacéuticas de la invención son preferiblemente composiciones inmunogénicas, ya que comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de inmunógeno polisacárido. Por "cantidad inmunológicamente eficaz" se entiende que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea en una sola dosis o como parte de una serie, es eficaz para la prevención. Esta cantidad varía dependiendo del estado de salud y la condición física del individuo a tratar, la edad, el grupo taxonómico del individuo a tratar (por ejemplo, primates no humanos, primates, etc.), la capacidad del sistema inmunológico del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación del médico tratante de la situación médica y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad caiga en un intervalo relativamente amplio que se puede determinar mediante ensayos de rutina. Se espera una dosis de entre 1 |jg y 20 |jg de sacárido, por ejemplo, aproximadamente 5 jg/dosis. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis múltiple (por ejemplo, incluidas dosis de refuerzo). La composición se puede administrar junto con otros agentes inmunorreguladores.

Una vez formuladas, las composiciones de la invención se pueden administrar directamente al sujeto. Los sujetos a tratar pueden ser animales; en particular, se pueden tratar sujetos humanos. Las composiciones inmunogénicas de la invención se usan típicamente de manera profiláctica (es decir, para prevenir infecciones futuras).

En una realización, la composición farmacéutica puede no tener adyuvante.

En otra realización, una composición inmunogénica puede incluir un adyuvante. El adyuvante puede funcionar para mejorar las respuestas inmunes (humoral y/o celular) provocadas en un paciente que recibe la composición. Los adyuvantes que pueden usarse con la invención incluyen, pero no se limitan a:

• Una composición que contiene minerales, que incluye sales de calcio y sales de aluminio (o mezclas de las mismas). Las sales de calcio incluyen fosfato de calcio (por ejemplo, las partículas "CAP" divulgadas en el documento US 6355271). Las sales de aluminio incluyen hidróxidos, fosfatos, sulfatos, etc., tomando las sales cualquier forma adecuada (por ejemplo, gel, cristalina, amorfa, etc.). Se prefiere la adsorción para estas sales. Las composiciones que contienen minerales también se pueden formular como una partícula de sal metálica, véase el documento WO2000/0023105. Se pueden usar los adyuvantes conocidos como hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio. Estos nombres son convencionales, pero se utilizan únicamente por conveniencia, ya que ninguno es una descripción precisa del compuesto químico real que está presente (por ejemplo, véase Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995,, capítulo 9). La invención puede usar cualquiera de los adyuvantes "hidróxido" o "fosfato" que se usan en general como adyuvantes. Los adyuvantes conocidos como "hidróxido de aluminio" son típicamente sales de oxihidróxido de aluminio, que normalmente son al menos parcialmente cristalinas. Los adyuvantes conocidos como "fosfato de aluminio" son típicamente hidroxifosfatos de aluminio, que a menudo también contienen una pequeña cantidad de sulfato (es decir, sulfato de hidroxifosfato de aluminio). Pueden obtenerse por precipitación, y las condiciones y concentraciones de reacción durante la precipitación influyen en el grado de sustitución de fosfato por hidroxilo en la sal. La invención puede utilizar una mezcla de hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio. En este caso, puede haber más fosfato de aluminio que hidróxido, por ejemplo, una relación en peso de al menos 2:1, por ejemplo, >5:1, >6:1, >7:1, >8:1, >9:1, etc. La concentración de Al+3 en una composición para la administración a un paciente es preferiblemente menor de 10 mg/ml por ejemplo, <5 mg/ml, <4 mg/ml, <3 mg/ml, <2 mg/ml, <1 mg/ml, etc. Un intervalo preferido está entre 0,3 y 1 mg/ml. Se prefiere un máximo de 0,85 mg/dosis.

• Saponinas (Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995, capítulo 22) que son un grupo heterólogo de glucósidos de esterol y glucósidos triterpenoides que se encuentran en la corteza, hojas, tallos, raíces e incluso flores de una amplia gama de especies vegetales. La saponina de la corteza del árbol Quillaia saponaria Molina ha sido ampliamente estudiada como adyuvante. La saponina también se puede obtener comercialmente de Smilax ornata (zarzaparilla), Gypsophilla paniculata (velo de novia) y Saponaria officianalis (raíz de jabón). Las formulaciones de adyuvantes de saponina incluyen formulaciones purificadas, tales como QS21, así como formulaciones de lípidos, tales como ISCOM. QS21 se comercializa como StimulonMR. Las composiciones de saponina se han purificado usando HPLC y RP-HPLC. Se han identificado fracciones purificadas específicas que utilizan estas técnicas, incluidas QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B y QH-C. Preferiblemente, la saponina es QS21. Un procedimiento de producción de QS21 se divulga en el documento US 5.057.540. Las formulaciones de saponina también pueden comprender un esterol, tal como el colesterol (documento WO96/33739). Se pueden usar combinaciones de saponinas y colesteroles para formar partículas únicas llamadas complejos inmunoestimulantes (ISCOM) (Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995, capítulo 23). Los ISCOM normalmente también incluyen un fosfolípido como fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina. En los ISCOM se puede utilizar cualquier saponina conocida. Preferiblemente, el ISCOM incluye uno o más de QuilA, QHA y QHC. Los ISCOM se describen adicionalmente en los documentos WO96/33739 y EP 0109942. Opcionalmente, los ISCOM pueden carecer de detergente adicional, véase el documento WO00/07621. Se puede encontrar una revisión del desarrollo de adyuvantes basados en saponina en las referencias Barr et al., (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32: 247­ 271 y Sjolanderet et al., (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32: 321-338.

Toxinas bacterianas de ribosilación de ADP (por ejemplo, la enterotoxina termolábil de E. coli "LT", la toxina del cólera "CT" o la toxina de la tos ferina "PT") y sus derivados detoxificados, tales como las toxinas mutantes conocidas como LT-K63 y LT-R72. (Pizza et al., (2000) Int J Med Microbiol 290: 455-461). El uso de toxinas ribosilantes de ADP detoxificadas como adyuvantes de la mucosa se describe en el documento WO95/17211 y como adyuvantes parenterales en el documento WO98/42375.

Bioadhesivos y mucoadhesivos, tales como microesferas esterificadas de ácido hialurónico (Singh et al] (2001) J Cont Release 70: 267-276) o quitosano y sus derivados (documento WO99/27960).

Micropartículas (es decir, una partícula de ~100 nm a — 150 pm de diámetro, más preferiblemente de ~200 nm a ~30 pm de diámetro, o de — 500 nm a — 10 pm de diámetro) formadas a partir de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo, un poli(a-hidroxiácido), un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc.), prefiriéndose poli(láctida-co-glicólido), opcionalmente tratadas para tener una superficie cargada negativamente (por ejemplo, con SDS) o una superficie cargada positivamente (por ejemplo, con un detergente catiónico, tal como CTAB).

Liposomas (Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995, capítulos 13 y 14). Se describen ejemplos de formulaciones de liposomas adecuadas para su uso como adyuvantes en los documentos US 6.090.406 y US 5.916.588.

Péptidos de muramilo, tales como N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina ("thr-MDP"), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilglucosaminil-N-acetilmuramil-L-AI-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxipropilamda ("DTP-DPP" o "TheramideMR), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina ("MTP-PE").

Un polímero de polioxidonio (Dyakonova et al., (2004) Int Immunopharmacol 4 (13): 1615-23) u otro derivado de polietilen-piperazina N-oxidado.

Un ligando CD1d, tal como una a-glicosilceramida (De Libero et al., Nature Reviews Immunology, 2005, 5: 485­ 496 y el documento US 5.936.076) (por ejemplo, a-galactosilceramida), a-glicosilceramidas que contienen fitosfingosina, OCH, KRN7000 [(2S,3S,4R)-1-O-(a-D-galactopiranosil)-2-(N-hexacosanoilamino)-1,3,4-octade canotriol], CRONY-101, 3"-O-sulfo-galactosilceramida, etc.

Una gamma inulina (Cooper (1995) Pharm Biotechnol 6: 559-80) o un derivado de la misma, tal como algammulina.

Una emulsión de aceite en agua. Se conocen varias de tales emulsiones, y típicamente incluyen al menos un aceite y al menos un tensioactivo, siendo el aceite o los aceites y el tensioactivo o tensioactivos biodegradables (metabolizables) y biocompatibles. Las gotitas de aceite en la emulsión son generalmente de menos de 5 pm de diámetro, e incluso pueden tener un diámetro submicrométrico, alcanzándose estos pequeños tamaños con un microfluidizador para proporcionar emulsiones estables. Se prefieren las gotitas con un tamaño inferior a 220 nm, ya que pueden someterse a esterilización por filtro.

Un oligonucleótido inmunoestimulador, tal como uno que contiene un motivo CpG (una secuencia de dinucleótidos que contiene un residuo de citosina no metilado unido por un enlace fosfato a un residuo de guanosina), o un motivo Cpl (una secuencia de dinucleótidos que contiene citosina unida a inosina), o un ARN bicatenario, o un oligonucleótido que contiene una secuencia palindrómica, o un oligonucleótido que contiene una secuencia de poli(dG). Los oligonucleótidos inmunoestimuladores pueden incluir modificaciones/análogos de nucleótidos tales como modificaciones de fosforotioato y pueden ser bicatenarios o (excepto para el ARN) monocatenarios. Las referencias Kandimalla et al., (2003) Nucleic Acids Research 31: 2393-2400 y el documento WO99/62923 divulgan posibles sustituciones de análogos, por ejemplo, reemplazo de guanosina por 2'-desoxi-7-deazaguanosina. El efecto adyuvante de los oligonucleótidos CpG se analiza adicionalmente en referencias tales como Krieg (2003) Nature Medicine 9: 831-835, McCluskie et al., (2002) FEMS Immunology and Medical Microbiology 32: 179-185, y los documentos WO98/40100, US 6.207.646, US 6.239.116, US 6.429.199. Una secuencia de CpG puede dirigirse a TLR9, tal como el motivo GTCGTT o TTCGTT (Kandimalla et al., (2003) Biochemical Society Transactions 31 (parte 3): 654-658). La secuencia de CpG puede ser específica para inducir una respuesta inmune Th1, tal como un ODN (oligodesoxinucleótido) de CpG-A, o puede ser más específica para inducir una respuesta de células B, tal como ODN de CpG-B. Los ODN de CpG-A y CpG-B se describen en las referencias Blackwell et al., (2003) J Immunol 170: 4061-4068, Krieg (2002) Trends Immunol 23: 64-65, documento WO01/95935. Preferiblemente, el CpG es un ODN de CpG-A. Preferiblemente, el oligonucleótido de CpG se construye de manera que el extremo 5' sea accesible para el reconocimiento del receptor. Opcionalmente, se pueden unir dos secuencias de oligonucleótidos de CpG en sus extremos 3' para formar "inmunómeros". Véanse, por ejemplo, las referencias Kandimalla et al., (2003) BBRC 306: 948-953, Bhagat et al., (2003) BBRC 300: 853­ 861 y el documento WO03/035836. Un adyuvante de CpG útil es CpG7909, también conocido como ProMuneMR (Coley Pharmaceutical Group, Inc.). Otro es CpG1826. Como alternativa, o además, al uso de secuencias de CpG, se pueden usar secuencias de TpG (documento WO01/22972), y estos oligonucleótidos pueden estar libres de motivos CpG no metilados. El oligonucleótido inmunoestimulador puede ser rico en pirimidina. Por ejemplo, puede comprender más de un nucleótido de timidina consecutivo (por ejemplo, TTTT, como se divulga en la referencia WO01/22972), y/o puede tener una composición de nucleótidos con > 25% de timidina (por ejemplo, > 35%,> 40%, > 50%, > 60%, > 80%, etc.). Por ejemplo, puede comprender más de un nucleótido de citosina consecutivo (por ejemplo, CCCC como se divulga en el documento WO01/22972) y/o puede tener una composición de nucleótidos con > 25% de citosina (por ejemplo, > 35%, > 40%, > 50% , > 60%, > 80%, etc.). Estos oligonucleótidos pueden estar libres de motivos CpG no metilados. Los oligonucleótidos inmunoestimuladores comprenderán típicamente al menos 20 nucleótidos. Pueden comprender menos de 100 nucleótidos.

Un adyuvante particularmente útil basado en oligonucleótidos inmunoestimuladores se conoce como IC31MR (Schellack et al., (2006) Vaccine 24: 5461-72). Por lo tanto, un adyuvante usado con la invención puede comprender una mezcla de (i) un oligonucleótido (por ejemplo, entre 15-40 nucleótidos) que incluye al menos uno (y preferiblemente múltiples) motivos Cpl, y (ii) un polímero policatiónico, tal como un oligopéptido (por ejemplo, entre 5-20 aminoácidos) que incluyen al menos una (y preferiblemente múltiples) secuencia o secuencias tripeptídicas Lys-Arg-Lys. El oligonucleótido puede ser un desoxinucleótido que comprende la secuencia 5'-(IC)13-3' de 26 mer. El polímero policatiónico puede ser un péptido que comprende el aminoácido Lys-Leu-Lys-Leus-Lys-Leu-Lys, de 11-mer.

Lípido A Monofosforilado 3-O-desacilado ('3dMPL', también conocido como 'MPLMR') (Myers et al. (1990) páginas 145-156 de (Cellular and molecular aspects of endotoxin reactions, Ulrich (2000) Capítulo 16 (páginas 273-282) de Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Volumen 42 de Methods in Molecular Medicine series), Johnson et al., (1999) J Med Chem 42:4640-9, Baldrick et al., (2002) Regulatory Toxicol Pharmacol 35:398-413). En condiciones acuosas, 3dMPL puede formar agregados micelares o partículas con diferentes tamaños, por ejemplo, con un diámetro <150 nm o > 500 nm. Se puede usar uno o ambos de estos con la invención, y las mejores partículas se pueden seleccionar mediante un ensayo de rutina. Se prefieren las partículas más pequeñas (por ejemplo, lo suficientemente pequeñas para producir una suspensión acuosa transparente de 3dMPL) debido a su actividad superior (documento WO 94/21292). Las partículas preferidas tienen un diámetro medio inferior a 220 nm, más preferiblemente inferior a 200 nm o inferior a 150 nm o inferior a 120 nm, e incluso pueden tener un diámetro medio inferior a 100 nm. En la mayoría de los casos, sin embargo, el diámetro medio no será inferior a 50 nm.

5'-monofosfato de metilinosina ("MIMP") (Signorelli y Hadden (2003) Int Immunopharmacol 3 (8): 1177-86). Un compuesto de pirrolizidina polihidroxilado (documento WO2004/064715), tal como uno que tiene la fórmula:

en la que R se selecciona del grupo que comprende hidrógeno, acilo lineal o ramificado, no sustituido o sustituido, saturado o insaturado, grupos alquilo (por ejemplo cicloalquilo), alquenilo, alquinilo y arilo, o una sal o derivado farmacéuticamente aceptable de los mismos. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a: casuarina, casuarina-6-a-D-glucopiranosa, 3-epi-casuarina, 7-epi-casuarina, 3,7-diepi-casuarina, etc.

Un compuesto de imidazoquinolina, tal como Imiquimod ("R-837") (documentos US 4.680.338, US 4.988.815), Resiquimod ("R-848") (documento WO92/15582) y sus análogos; y sales de los mismos (por ejemplo, las sales hidrocloruro). Se pueden encontrar más detalles sobre las imidazoquinolinas inmunoestimuladoras en las referencias Stanley (2002) Clin Exp Dermatol 27: 571-577, Wu et al., (2004) Antiviral Res. 64 (2): 79-83, Vasilakos et al., (2000) Cell Immunol. 204 (1): 64-74, patentes estadounidenses Nos. 4689338, 4929624, 5238944, 5266575, 5268376, 5346905, 5352784, 5389640, 5395937, 5482936, 5494916, 5525612, 6083505, 6440992, 6627640, 6656938, 66760764, 6627640, 6656938 664 , 6664265, 6667312, 6670372, 6677347, 6677348, 6677349, 6683088, 6703402, 6743920, 6800624, 6809203, 6888000 y 6924293, y Jones (2003) Curr Opin Investig Drugs 4: 214-218.

Un compuesto de tiosemicarbazona, tales como los divulgados en la referencia WO2004/060308. También se describen en el mismo procedimientos de formulación, fabricación y selección de compuestos activos. Las tiosemicarbazonas son particularmente eficaces en la estimulación de células mononucleares de sangre periférica humana para la producción de citocinas, tales como TNF-a.

Un compuesto de triptantrina, tal como los divulgados en la referencia WO2004/064759. También se describen en el mismo procedimientos de formulación, fabricación y selección de compuestos activos. Las tiosemicarbazonas son particularmente eficaces en la estimulación de células mononucleares de sangre periférica humana para la producción de citocinas, tales como TNF-a.

Un análogo de nucleósido, tal como: (a) Isatorabina (ANA-245; 7-tia-8-oxoguanosina):

y profármacos de los mismos; (b) ANA975; (c) ANA-025-1; (d) ANA380; (e) los compuestos divulgados en las referencias US 6.924.271, US2005/0070556, US 5.658.731, Loxoribina (7-alil-8-oxoguanosina) (patente de los Estados Unidos No. 5.011.828).

Los compuestos divulgados en la referencia WO2004/87153, que incluyen: compuestos de acilpiperazina, compuestos de indoldiona, compuestos de tetrahidraisoquinolina (THIQ), compuestos de benzociclodiona, compuestos de aminoazavinilo, compuestos de aminobencimidazol quinolinona (ABIQ) (documentos US 6.605.617, WO02/18383), compuestos de hidraftalamida, compuestos de benzofenona, compuestos de isoxazol, compuestos de esterol, compuestos de quinazilinona, compuestos de pirrol (documento WO2004/018455), compuestos de antraquinona, compuestos de quinoxalina, compuestos de triazina, compuestos de pirazalopirimidina y compuestos de benzazol (documento WO03/082272).

Un derivado de fosfato de aminoalquil glucosaminida, tal como RC-529 [Johnson et al., (1999) Bioorg Med Chem Lett 9: 2273-2278, Evans et al., (2003) Expert Rev Vaccines 2: 219-229).

Un fosfaceno, tal como poli[di(carboxilatofenoxi)fosfaceno] ("PCPP") como se describe, por ejemplo, en las referencias Andrianov et al., (1998) Biomaterials 19: 109-115 y Payne et al., (1998) Adv Drug Delivery Review 31: 185-196.

como se define en el documento WO03/011223, tal como 'ER 803058', 'ER 803732', 'ER 804053', 'ER 804058',' ER 804059', 'ER 804442', 'ER 804680', 'ER 804764', 'ER 803022' o 'ER 804057', por ejemplo:

Derivados del lípido A de Escherichia coli tales como OM-174 (descrito en las referencias, Meraldi et al., (2003) Vaccine 21: 2485-2491 y Pajak et al., (2003) Vaccine 21: 836-842).

Compuestos que contienen lípidos unidos a una cadena principal acíclica que contiene fosfato, tal como el antagonista de TLR4 E5564 (Wong et al., (2003) J Clin Pharmacol 43 (7): 735-42, US2005/0215517):

Estas y otras sustancias adyuvantes activas se discuten con más detalle en las referencias Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995 & Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols.

Los antígenos y adyuvantes en una composición estarán típicamente mezclados.

Las composiciones pueden incluir dos o más de dichos adyuvantes. Por ejemplo, pueden incluir ventajosamente tanto una emulsión de aceite en agua como 3dMPL, etc.

Los adyuvantes de emulsión de aceite en agua específicos útiles con la invención incluyen, pero no se limitan a:

• Una emulsión submicrométrica de escualeno, Tween 80 y Span 85. La composición de la emulsión en volumen puede ser aproximadamente 5% de escualeno, aproximadamente 0,5% de polisorbato 80 y aproximadamente 0,5% de Span 85. En términos de peso, estas proporciones se convierten en 4,3% de escualeno, 0,5% de polisorbato 80 y 0,48% de Span 85. Este adyuvante se conoce como 'MF59' (documento WO90/14837, Podda & Del Giudice (2003) Expert Rev Vaccines 2:197-203, Podda (2001) Vaccine 19: 2673-2680), como se describe en más detalle en el capítulo 10 de Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995 y el capítulo 12 de Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Volumen 42 de Methods in Molecular Medicine series). La emulsión MF59 incluye ventajosamente iones citrato, por ejemplo, tampón de citrato de sodio 10 mM.

• Una emulsión de escualeno, un tocoferol y Tween 80. La emulsión puede incluir solución salina tamponada con fosfato. También puede incluir Span 85 (por ejemplo, al 1%) y/o lecitina. Estas emulsiones pueden tener de 2 a 10% de escualeno, de 2 a 10% de tocoferol y de 0,3 a 3% de Tween 80, y la relación en peso de escualeno: tocoferol es preferiblemente < 1 ya que esto proporciona una emulsión más estable. El escualeno y el Tween 80 pueden tener una relación de volumen presente de aproximadamente 5:2. Una de estas emulsiones se puede preparar disolviendo Tween 80 en PBS para obtener una solución al 2%, luego mezclando 90 ml de esta solución con una mezcla de (5 g de DL-a-tocoferol y 5 ml de escualeno), luego microfluidizando la mezcla. La emulsión resultante puede tener gotitas de aceite submicrométricas, por ejemplo, con un diámetro medio de entre 100 y 250 nm, preferiblemente alrededor de 180 nm.

• Una emulsión de escualeno, un tocoferol y un detergente Triton (por ejemplo, Triton X-100). La emulsión también puede incluir un 3d-MPL (véase más abajo). La emulsión puede contener un tampón de fosfato.

• Una emulsión que comprende un polisorbato (por ejemplo, polisorbato 80), un detergente Triton (por ejemplo, Triton X-100) y un tocoferol (por ejemplo, un succinato de a-tocoferol). La emulsión puede incluir estos tres componentes en una proporción de masa de aproximadamente 75:11:10 (por ejemplo, 750 pg/ml de polisorbato 80, 110 pg/ml de Triton X-100 y 100 pg/ml de succinato de a-tocoferol), y estas concentraciones deben incluir cualquier contribución de estos componentes de los antígenos. La emulsión también puede incluir escualeno. La emulsión también puede incluir un 3d-MPL (véase más abajo). La fase acuosa puede contener un tampón de fosfato.

• Una emulsión de escualano, polisorbato 80 y poloxámero 401 ("PluronicMR L121"). La emulsión se puede formular en solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4. Esta emulsión es un vehículo de administración útil para dipéptidos de muramilo y se ha utilizado con treonil-MDP en el adyuvante "SAF-1" (Allison & Byars (1992) Res Immunol 143: 519-25) (0,05-1% de Thr-MDP, 5% de escualano, 2,5% de Pluronic L121 y 0,2% de polisorbato 80). También se puede usar sin Thr-MDP, tal como en el adyuvante "AF" (Hariharan et al., (1995) Cancer Res 55: 3486-9) (5% de escualano, 1,25% de Pluronic L121 y 0,2% de polisorbato 80). Se prefiere la microfluidización.

• Una emulsión que tiene de 0,5 a 50% de un aceite, 0,1 a 10% de un fosfolípido y 0,05 a 5% de un tensioactivo no iónico. Como se describe en el documento WO95/11700, los componentes de fosfolípidos preferidos son fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, esfingomielina y cardiolipina. Los tamaños de gotitas submicrométricas son ventajosos.

• Una emulsión submicrométrica de aceite en agua de un aceite no metabolizable (tal como un aceite mineral ligero) y al menos un tensioactivo (tal como lecitina, Tween 80 o Span 80). Se pueden incluir aditivos, tales como saponina QuilA, colesterol, un conjugado de saponina-lipófilo (tal como GPI-0100, descrito en el documento US 6.080.725, producido por adición de amina alifática a desacilsaponina a través del grupo carboxilo del ácido glucurónico), bromuro de dimetildioctadecilamonio y/o N,N-dioctadecil-N,N-bis(2-hidroxietil) propanodiamina. • Una emulsión en la que una saponina (por ejemplo, QuilA o QS21) y un esterol (por ejemplo, un colesterol) están asociados como micelas helicoidales (documento WO2005/097181).

La invención también proporciona un conjugado de la invención, para uso en medicina. Por ejemplo, en una realización, el conjugado de la invención se utiliza para generar una respuesta de anticuerpos en un mamífero.

También se divulga un procedimiento para generar una respuesta inmune en un mamífero, que comprende administrar un conjugado o composición farmacéutica de la invención al mamífero. También se divulga un procedimiento para generar una respuesta inmune dependiente de T esencialmente libre de una respuesta inmune independiente de T en un mamífero, que comprende administrar un conjugado o composición farmacéutica de la invención al mamífero.

La invención también proporciona una vacuna que comprende el conjugado o la composición farmacéutica de la invención para su uso en la prevención de enfermedades.

En una realización, la invención también proporciona el conjugado o la composición farmacéutica de la invención para su uso en la prevención de la fiebre tifoidea.

La respuesta inmune provocada por estos procedimientos y usos generalmente incluirá una respuesta de anticuerpos, preferiblemente una respuesta de anticuerpos protectora. Los procedimientos para evaluar las respuestas de anticuerpos después de la inmunización con sacáridos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el ensayo ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) se usa comúnmente para medir la respuesta de IgG anti-Vi. La respuesta de anticuerpos es preferiblemente una respuesta de IgG, con el cambio de isotipo típico de IgM a IgG característico de las vacunas de glicoconjugado. La respuesta inmunitaria suele ser profiláctica. El mamífero es preferiblemente un ser humano.

Se cree que los conjugados de la presente invención son más eficaces para generar una respuesta dependiente de T en comparación con los conjugados en los que el polisacárido Vi no se ha fragmentado. Por respuesta "dependiente de T" se entiende que los conjugados pueden inducir un aumento en la respuesta anti-Vi después de la reinyección (respuesta anamnésica típica). Por "respuesta dependiente de T esencialmente libre de respuesta independiente de T" se entiende que los conjugados no pueden inducir una respuesta anti-Vi en ratones con células T inactivas.

Los conjugados que generan una respuesta dependiente de T se consideran ventajosos sobre los que generan una respuesta independiente de T ya que se ha encontrado que las respuestas independientes de T no inducen memoria, se consideran subóptimas en niños menores de 2 años, no conducen a la hipermutación somática en los centros germinales de los tejidos linfoides secundarios y, por lo tanto, a la maduración por afinidad de la respuesta de anticuerpos (véase, por ejemplo, Pollard AJ et al., Nat. Rev. Immunol., 2009; 9: 213). Además, las respuestas independientes de T pueden inducir un estado de hiporreactividad a la vacunación posterior (véase, por ejemplo, Poolman J. et al., Expert Rev. Vaccines, 2011; 10: 307).

Los conjugados de la invención parecen generar una respuesta dependiente de T como se muestra en la Figura 2 y la Figura 8. La Figura 2 muestra la respuesta del anticuerpo anti-Vi en ratones para los conjugados de Vi fragmentado de la invención en comparación con el conjugado de Vi nativo y en comparación con Vi nativo no conjugado y fragmentado. La descripción de los materiales utilizados se presenta en la tabla del ejemplo 5. Se puede observar que, para los grupos 1 a 4 (correspondientes a grupos 1 a 4 de Vi fragmentado conjugados con CRM¹⁹⁷) a pesar de una respuesta menor IgG anti-Vi el día 14 (T14) en comparación con el conjugado de Vi nativo (grupo 5) (significativo para los grupos 1-3 en comparación con el Vi nativo, con p = 0,0418, <0,0001, 0,0297 respectivamente), se observa un efecto de refuerzo notable dos semanas después de la segunda inyección al día 35 (T49) (p = 0,004-0,008). Como se muestra en la Figura 2, el anti-Vi aumentado fue inducido por el Vi-CRMw nativo (grupo 5) después de la primera inyección y no aumentó después de la segunda inyección. Esta falta de aumento después de la segunda inyección también se observó cuando se utilizaron dosis más bajas del conjugado Vi-CRMw nativo (0,044 |jg, 0,35 |jg y 2,8 |jg; datos no mostrados), lo que indica que la falta de aumento en los niveles de anticuerpos no se debe a una respuesta máxima que es inducida después de una dosis. Puede plantearse la hipótesis de que la respuesta al conjugado Vi nativo se debe a la capacidad de la cadena Vi nativa larga para actuar como antígeno independiente de T. Esto está respaldado por el hecho de que el Vi nativo no conjugado (grupo 10) puede inducir una respuesta más alta que las cadenas Vi más cortas (grupos 6 a 9), incluso si es menor que el conjugado Vi nativo (grupo 5). En contraste, los conjugados Vi fragmentado (grupos 1 a 4) indujeron una respuesta más baja el día 14 que se incrementó aún más con una segunda inyección, alcanzando títulos de IgG anti Vi comparables después de dos dosis como conjugado de Vi nativo. El conjugado del grupo 4, caracterizado por una longitud de cadena de Vi de 82 kDa, mostró un comportamiento intermedio en comparación con los conjugados de Vi fragmentado que tienen un peso molecular promedio más bajo (grupos 1 a 3) y el conjugado de Vi nativo (grupo 5). De hecho, la respuesta en el día 14 fue mayor que con los conjugados de Vi fragmentado más cortos y no significativamente diferente que con el conjugado de Vi nativo.

Como puede mostrarse en la Figura 2, Vi fragmentado no conjugado induce una respuesta de anticuerpos IgG de Vi disminuida (grupos 6 a 9) en comparación con Vi nativo (grupo 10). La respuesta a Vi nativo (165 kDa) es mayor que la respuesta a Vi fragmentado (82 kDa - grupo 9), que a su vez es mayor que la respuesta a Vi fragmentado (9,5 kDa, 22,8 kDa, 42,7 kDa - grupos 6 a 8 respectivamente) (en el día 14, la respuesta inducida por los Grupos 1 a 3 de Vi fragmentado no conjugado es significativamente menor con respecto al Vi nativo, con p = 0,0004, 0,0056, 0,0403 respectivamente). Por lo tanto, los inventores han identificado una longitud de cadena crítica (aproximadamente 82 kDa) por debajo de la cual el polisacárido Vi ya no puede actuar como antígeno independiente de T. Se prefieren los conjugados de Vi preparados a partir de polisacáridos que no pueden inducir una respuesta característica de los antígenos independientes de T.

Con el fin de verificar las hipótesis de que para Vi fragmentado no conjugado, la capacidad de provocar una respuesta de anticuerpos independiente de T está deteriorada, y que los conjugados de Vi fragmentado pueden inducir una respuesta dependiente de T esencialmente libre de una respuesta independiente de T, se ensayaron conjugados de Vi-CRM ¹⁹⁷ fragmentado y Vi-CRM¹⁹⁷ nativo en ratones deficientes en células T (ratones TCR p6"/_). Como se puede observar en la Figura 8, los ratones deficientes en células T responden sólo a Vi de longitud completa conjugado y no conjugado, pero no a los conjugados de Vi fragmentado. Además, el Vi nativo conjugado pero no sin conjugar es capaz de inducir una respuesta más alta en los ratones de tipo silvestre que en los ratones deficientes en células T (p = 0,028 día 14; p = 0,002 día 42), lo que indica que la alta respuesta en ratones de tipo silvestre se deriva de actividad mixta dependiente de T/independiente de T.

Por lo tanto, la divulgación se refiere a un procedimiento para generar una respuesta inmune dependiente de T esencialmente libre de una respuesta inmune independiente de T en un mamífero, que comprende administrar el conjugado o la composición farmacéutica de la invención a dicho mamífero.

También se divulga un procedimiento para potenciar la respuesta inmune producida por un conjugado de polisacárido en un mamífero. El procedimiento comprende:

a) identificar el valor de peso molecular promedio en el que un polisacárido no conjugado deja de inducir una respuesta de anticuerpo IgG anti-Vi significativa;

b) producir un conjugado de polisacárido con peso molecular promedio por debajo del valor determinado en la etapa a), y

c) administrar el conjugado obtenido en la etapa b) a un mamífero.

Los conjugados de la presente invención, es decir, que contienen Vi fragmentado conjugado con una proteína portadora como se define en este documento, también son más eficaces que Vi fragmentado no conjugado para inducir una respuesta de anticuerpo apropiada (véase la Figura 2).

Las composiciones de la invención generalmente se administrarán directamente a un sujeto. La administración directa se puede lograr mediante administración por inyección parenteral (por ejemplo, subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular o al espacio intersticial de un tejido), o por vía rectal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intradérmica, ocular, nasal, auditiva o pulmonar. Se prefiere la administración por inyección o intranasal.

La invención puede usarse para provocar inmunidad sistémica y/o mucosa.

Las vacunas preparadas de acuerdo con la invención se pueden usar para tratar tanto a niños (incluidos bebés) como a adultos. Por lo tanto, un sujeto puede tener menos de 1 año, 1 a 5 años, 5 a 15 años, 15 a 55 años o al menos 55 años. Los sujetos preferidos para recibir las vacunas son los jóvenes (por ejemplo, < 5 años). Sin embargo, las vacunas no son adecuadas únicamente para estos grupos y pueden usarse de manera más general en una población.

El tratamiento puede ser mediante un programa de dosis única o un programa de dosis múltiple. Se pueden usar múltiples dosis en un programa de inmunización primaria y/o en un programa de inmunización de refuerzo. En un programa de dosis múltiples, las diversas dosis pueden administrarse por la misma vía o por vías diferentes, por ejemplo, una estimulación parenteral y un refuerzo de la mucosa, una estimulación de la mucosa y un refuerzo parenteral, etc. La administración de más de una dosis (típicamente dos dosis o tres dosis) es particularmente útil en pacientes que no han recibido inmunización previa. Típicamente, se administrarán múltiples dosis con al menos 1 semana de diferencia (por ejemplo, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc.). Un ejemplo de esquema proporciona una primera dosis a las 6 semanas de edad y una segunda dosis a las 10 semanas de edad, para coincidir con las inmunizaciones infantiles existentes (coadministración con vacunas EPI). Este programa primario puede ir seguido de una dosis de refuerzo después del primer cumpleaños del niño.

Los conjugados de la invención se pueden combinar con otros antígenos en una única composición para la inmunización simultánea contra múltiples patógenos. Como alternativa a la preparación de una vacuna combinada, los conjugados pueden administrarse a los sujetos sustancialmente al mismo tiempo que (por ejemplo, durante la misma consulta médica o visita a un profesional sanitario o centro de vacunación) con otras vacunas. Los antígenos para usar en estas vacunas combinadas o para la administración concomitante incluyen, por ejemplo, inmunógenos de Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus y/o Pseudomonas aeruginosa, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, Neisseria meningitidis (tales como sacáridos o sacáridos conjugados A, para los serogrupos A, C, W135 y/o Y), Streptococcus pneumoniae (como sacáridos o sacáridos conjugados), etc.

Una composición puede comprender un conjugado de la invención en combinación con un antígeno A de Salmonella Paratyphi, tal como un antígeno H u O (por ejemplo, un antígeno sacárido O:2, conjugado con una proteína portadora, para proporcionar una vacuna tifoidea bivalente. Una composición puede comprender un conjugado de la invención en combinación con un antígeno de Salmonella Typhimurium, tal como un antígeno H u O (por ejemplo, un sacárido O:9), conjugado con una proteína portadora. Una composición puede comprender un conjugado de la invención en combinación con un antígeno de Salmonella Enteritidis, tal como un antígeno H u O (por ejemplo, un sacárido O:4,5), conjugado con una proteína portadora. Los conjugados de la invención pueden combinarse con antígenos presentados en forma de partículas de la membrana externa denominadas módulos generalizados para antígenos de membrana (GMMA) o vesículas de membrana externa nativa (NOMV). Se divulgan ejemplos de dichas partículas de membrana, por ejemplo, en los documentos WO2012/049662 y WO2011/036564.

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar la invención. Las temperaturas se dan en grados Celsius. La estructura de los productos finales, intermedios y materiales de partida se confirma mediante procedimientos analíticos estándar, por ejemplo, microanálisis y características espectroscópicas. Las abreviaturas utilizadas son las convencionales en la técnica.

Abreviaturas

ADH: dihidrazida ácida adípica

PMprom.: peso molecular promedio

BCA: ensayo con ácido bicinconínico

EDAC: 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida

h: hora(s)

HPAEC-PAD Cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento acoplada con detección amperométrica pulsada

HPLC: cromatografía líquida de alta presión

HR: alta resolución

IR: espectroscopia infrarroja

kDa: kilo Dalton

LCMS: cromatografía líquida y espectrometría de masas

M: molar

MS: espectrometría de masas

min: minutos

mL: mililitro(s)

mM: milimolar

NHS: N-hidroxisuccinimida

RMN: resonancia magnética nuclear

PS: polisacárido

rpm: rotación por minuto

RT: temperatura ambiente

SEC: cromatografía de exclusión por tamaño

TFF: filtración de flujo tangencial

Ejemplo 1

Procedimiento de preparación de grupos de Vi fragmentadas y separación.

Vi se solubilizó en agua y se añadió H²O² al 30% en peso para tener una concentración final de 2,5 mg/ml de Vi y 5% (p/v) de H²O². La mezcla se calentó a 80 ± 0,5 °C durante 2 h. Pasado este tiempo, la mezcla se inyectó en la columna Hiscreen Capto Q (4,7 ml de resina cargando hasta 100 mg de mezcla Vi fragmentada) y se separaron cuatro poblaciones de diferente peso molecular promedio (PMprom.) usando un procedimiento de gradiente en etapas. Se utilizaron NaH² PO⁴20 mM pH 7,2 y NaH² PO⁴20 mM, NaCl 1M pH 7,2 como tampón A y B respectivamente. La mezcla de Vi fragmentada se cargó en agua y se eluyeron grupos de PMprom. crecientes con 25, 30, 37 y 45% de tampón B, respectivamente. Cada grupo recogido se desalinizó contra agua en una columna SEC Sephadex G-15. Los grupos de Vi fragmentado obtenidos se caracterizaron por HPLC-SEC para el cálculo de PMprom. (véase la Figura 6), HPAEC-PAD para el contenido de Vi (Micoli et al., Vaccine 2011), micro BCA (usando NAcGlcN como estándar) para la determinación de grupos CHO (Meeuwsen et al., Journal of Bioscience and Bioengineering, 2000 89 (1): 107-109). Se usó RMN de 1H para verificar la identidad de Vi y calcular el nivel de O-acetilación (véase la Figura 4) (Micoli et al., Vaccine 2011). La Figura 7 muestra el perfil de HPLC-SEC del grupo 3 de Vi fragmentado, que tiene PMprom. de 42,7 kDa y 80% del área (214 nm) entre 25 y 70 kDa.

Ejemplo 2

Procedimiento de preparación de Vi fragmentado utilizando H²O² y FeCh y separación.

Se solubilizaron 100 mg de PS Vi en agua; se añadieron FeCl3 10 mM y H²O² al 30% en peso para tener una concentración final de 2,5 mg/ml de Vi, FeCh 0,1 mM y H²O² al 3% (p/v). La mezcla se calentó a 30 ± 0,1 °C durante 1 hora. Pasado este tiempo, la mezcla se inyectó en una columna Capto Q cargando 5 mg de mezcla Vi fragmentada por ml de resina. Se utilizaron NaH² PO⁴ 20 mM pH 7,2 y NaH² PO⁴ 20 mM, NaCl 1M pH 7,2 como tampón A y B respectivamente. La mezcla de Vi fragmentado se cargó en NaCI 350 mM y la población de interés se eluyó al 40% del tampón B. Se diafiltró el grupo de Vi fragmentado frente a 10 volúmenes de agua mediante TFF de 30 kDa. El grupo de Vi fragmentado se caracterizó por HPLC-SEC para el cálculo de PMprom., HPAEC-PAD para el contenido de Vi, RMN de 1H para verificar la identidad de Vi y calcular el nivel de O-acetilación. En particular, para una preparación se obtuvo Vi fragmentado de PMprom. 53,8 kDa (menos de 17% del área <30 kDa y menos del 16% de área > 80 kDa). El nivel de O-acetilación se mantuvo alto (88%).

Ejemplo 3

Procedimiento de preparación de Vi fragmentado usando H²O² y FeSO⁴ y separación.

Se solubilizaron 100 mg de PS Vi en agua; se añadieron FeSO⁴ 10 mM y H²O² al 30% en peso para tener una concentración final de 2,5 mg/ml de Vi, FeSO⁴0,1 mM y H²O² al 0,5% (p/v). La mezcla se calentó a 30 ± 0,1 °C durante 2 h. Después de este tiempo, se añadió EDTA hasta una concentración final de 10 mM para inactivar el catalizador. El peróxido de hidrógeno se eliminó mediante filtración de flujo tangencial (membrana de 30 kDa) y el tampón se intercambió con NaH² PO⁴ 10 mM, pH 7. La mezcla se calentó a 80 °C durante 2 h y luego se inyectó en una columna Capto Q cargando 5 mg de mezcla Vi fragmentada por mL de resina. Se utilizaron NaH² PO⁴20 mM pH 7,2 y NaH² PO⁴ 20 mM, NaCl 1M pH 7,2 como tampón A y B respectivamente. La mezcla de Vi fragmentada se cargó en tampón A y la población del PM deseado se fraccionó en gradiente lineal (desde el 100% de tampón A hasta el 100% de tampón B en 50 volúmenes de columna). El grupo de Vi fragmentado seleccionado se diafiltró frente a 10 volúmenes de agua mediante TFF de 30 kDa.

El grupo de Vi fragmentado se caracterizó por HPLC-SEC para el cálculo de PMprom., HPAEC-PAD para el contenido de Vi, RMN de 1H para verificar la identidad de Vi y calcular el nivel de O-acetilación. En particular, para una preparación, se obtuvo Vi fragmentado de PMprom. 43,4 kDa (menos del 20% de área < 25 kDa y menos del 20% de área > 70 kDa). El nivel de O-acetilación se mantuvo alto (85%).

Ejemplo 4

Procedimiento para elaborar los conjugados de Vi fragmentado

Para la conjugación de grupos 1-3 de Vi fragmentado (obtenidos en el ejemplo 1), se usó el siguiente procedimiento para la preparación del conjugado. Se solubilizó Vi fragmentado en MES 100 mM pH 6 a una concentración de 50 mg/ml. Se añadieron NHS y luego EDAC para tener una relación molar de unidades repetidas EDAC/Vi de 5 y una concentración de NHS de 0,33 M. La reacción se mezcló a TA durante 1 h. Pasado este tiempo, CRM¹⁹⁷-ADH, preparado como se describió previamente en Micoli et al., Vaccine 2011, se añadió para tener una concentración de Vi y proteína de 7,8 mg/ml (relación de Vi a proteína p/p de 1) en MES 20 mM pH 6. La mezcla se mezcló a TA durante 2 h. La formación del conjugado se verificó mediante HPLC-SEC (columna TSK gel 3000 PWXL) y no se observó proteína residual en las mezclas de reacción. El conjugado se separó mediante PS sin reaccionar mediante cromatografía de exclusión por tamaño, en una columna Sephacryl 100 HR de 1,6 cm x 60 cm. Las fracciones libres de Vi fragmentado no conjugado se agruparon y caracterizaron.

Los conjugados purificados se caracterizaron por HPAEC-PAD para el contenido total de Vi (Micoli et al., Vaccine 2011), micro BCA para el contenido de proteína total, HPLC-SEc para determinar la distribución de PMprom. del conjugado y evaluar la cantidad de proteína libre y sacárido libre. Para los conjugados del grupo 3 y grupo 4, el sacárido libre se estimó mediante el procedimiento Capto Adhere/HPAEC-PAD. La siguiente tabla reporta las principales características de los conjugados probados en el ejemplo 5.

Para el grupo 4 de Vi fragmentado obtenido en el ejemplo 1, las condiciones de reacción descritas anteriormente dieron como resultado la formación de gel, probablemente debido al PMprom. más alto de esta población. Para este grupo en particular, la etapa de activación con EDAC/NHS se realizó con una concentración de Vi de 15 mg/ml, una concentración de NHS de 0,1 M y una relación molar de unidades repetidas de EDAC/Vi de 5. Se utilizaron las mismas condiciones para la etapa de conjugación con CRM¹⁹⁷-ADH .

Determinación de la cantidad de Vi libre en el conjugado por el procedimiento Capto Adhere/HPAEC-PAD

Para el tratamiento de la muestra se utilizó el sedimento derivado de 500 pl de suspensión de resina Capto Adhere, lavada con AcONa 20 mM, CH³CN al 30% pH 5. Se agregaron 1,3 ml de conjugado en NaH² PO⁴ 20 mM pH 7,2 (concentración de Vi total en el rango de 60-150 pg/ml) de 390 pl de CH³CN (la solución resultante se indica en este documento como muestra cargada). Se añadió un mililitro de la muestra cargada a la resina y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos en una rueda giratoria. Después de este tiempo, la muestra se centrifugó (5 min a 4 °C, 14000 rpm) y el sobrenadante (indicado como flujo continuo) se desperdició. El sedimento se lavó (adición de disolvente a la resina, mezclado a mano) con 1 ml de AcONa 20 mM, CH³CN al 30% pH 5 (dos veces). El sedimento se recuperó mediante centrifugación (5 min a 4 °C, 14000 rpm). Los sobrenadantes (volumen total de 2 ml) recogidos se indicaron como solución de lavado. El sedimento se añadió de 500 pl de AcONa 1 M, CH³CN al 30% pH 5, se mezcló a mano y se separó mediante centrifugación (5 min a 4 °C, 14000 rpm). Esta operación se repitió seis veces, agrupando los sobrenadantes indicados como solución de separación (volumen total de 3 ml). La solución de separación, la solución de lavado, el flujo continuo y 0,5 ml de la muestra cargada se secaron en SpeedVac y se reconstituyeron en el mismo volumen de agua. Todas las muestras se analizaron mediante HPLC-SEC (emisión de fluorescencia) para verificar la ausencia de conjugados en las soluciones de flujo, lavado y separación. La muestra cargada y la solución de tira se ensayaron para determinar el contenido de Vi mediante HPAEC-PAD.

La relación del contenido de Vi en la solución de separación (Vi no conjugado) y en la solución cargada (Vi total), corregida por dilución, representa el % de Vi libre en la muestra.

Caracterización de conjugados por HPLC-SEC

Se utilizó HPLC-SEC para caracterizar conjugados en términos de proteína libre y sacárido libre. Todas las muestras se eluyeron en una columna TSK gel G3000 PWXL (30 cm x 7,8 mm; tamaño de partícula 7 pm; código 808021) con un protector de columna TSK gel PWXL (4,0 cm x 6,0 mm; tamaño de partícula 12 pm; código 808033) (Tosoh Biociencia). La fase móvil fue NaCl 0,1 M, NaH² PO⁴ 0,1 M, CH³CN al 5%, pH 7,2 a un caudal de 0,5 ml/min (procedimiento isocrático durante 30 min). También se utilizó HPLC-SEC para estimar la cantidad de proteína no conjugada (detección de emisión de fluorescencia) y Vi fragmentado (para el grupo 1 y 2) (detección del índice de refracción) en muestras conjugadas. El área de proteína sin reaccionar se cuantificó con respecto a una curva de calibración construida con muestras de proteína en el intervalo de 5-50 pg/mL. El porcentaje de proteína no conjugada se calculó dividiendo la cantidad de proteína libre detectada por HPLC-SEC por la cantidad total de proteína cuantificada en la muestra mediante micro BCA. De manera similar, la cantidad de Vi fragmentado no conjugado se cuantificó con respecto a una curva de calibración de Vi fragmentado (del mismo PMprom.) en el intervalo de 20 a 50 pg/ml. El porcentaje de sacárido no conjugado se calculó dividiendo la cantidad de Vi libre detectado por HPLC-SEC por la cantidad total de sacárido cuantificado en la muestra por HPAEC-PAD.

Ejemplo 5

Conjugados de Vi fragmentado (DT y TT como portador)

La conjugación del grupo 3 de Vi (obtenido en el ejemplo 1) se realizó usando DT (toxoide diftérico) y TT (toxoide tetánico) como proteínas portadoras. Se activó Vi fragmentado como se describe en el ejemplo 3 y se añadió DT-ADH o TT-ADH (preparados como CRM¹⁹⁷-ADH) en la etapa de conjugación, usando las mismas condiciones de reacción descritas en el ejemplo 3 (relación p/p de Vi a proteína de 1). Se caracterizaron DT-ADH y TT-ADH por un mayor número de enlazadores de ADH introducidos por proteína (12 y 23,5 respectivamente frente a 6 de CRM¹⁹⁷). Las principales características de los conjugados resultantes se indican en la Tabla siguiente.

Ejemplo 6

Pruebas in vivo en ratones

Se inmunizaron diez grupos de ratones hembra CD1 de 10 semanas de edad con conjugados Vi-CRMw que tenían Vi de diferente longitud de cadena (como se obtuvo en el ejemplo 3, grupos 1 a 4 en la tabla siguiente), con conjugado de Vi-CRM 197 nativo (grupo 5 en la tabla siguiente) y con los correspondientes polisacáridos Vi no conjugados (grupos ⁶ a 10). La siguiente tabla resume el diseño del estudio. Se administraron dos inyecciones subcutáneas de 200 |jl cada una que contenía ⁸ jg de antígeno Vi en los días 0 y 35, con sangrados en los días 14, 35 y 49. Los antígenos se inyectaron en solución salina sin adyuvante. La respuesta anti-Vi y anti-CRMi⁹⁷ se evaluó mediante ELISA (como se muestra en la Figura 2).

Como puede verse en la Figura 2, entre Vi no conjugado (grupos 6-10), Vi de longitud completa (grupo 10) fue el único capaz de inducir una respuesta clara después de la primera inyección. Lo mismo sucedió con el conjugado correspondiente (grupo 5). Vi nativo-CRM ^fue el único capaz de inducir una alta respuesta ya después de la primera inyección, sin refuerzo después de la segunda inyección. De manera diferente, con todos los conjugados de Vi fragmentado (grupos 1-4), la respuesta fue baja después de la primera inyección y significativamente mayor después de la reinyección.

Se realizó un estudio posterior para comparar conjugados de Vi nativo y fragmentado-CRM^ en ratones de tipo silvestre y TCR pS^ (Figura ⁸ ). Diez grupos de ratones CD1 hembra de tipo silvestre (grupos 1-5 en la tabla siguiente) y deficientes en células T (grupos 6-10 en la tabla siguiente), de 10 semanas de edad, se inmunizaron con conjugados Vi-CRM ¹⁹⁷ que tenían Vi de diferente longitud de cadena, con conjugado Vi nativo-CRM¹⁹⁷ y con polisacárido Vi no conjugado nativo. Se administraron dos inyecciones subcutáneas de 200 j l cada una que contenían ⁸ jg de antígeno Vi en los días 0 y 28, con sangrados los días 14, 28 y 42. Se inyectaron antígenos en solución salina sin adyuvante. La respuesta anti-Vi y anti-CRMw se evaluó mediante ELISA (como se muestra en la Figura ⁸ ).

Los datos obtenidos confirmaron la hipótesis de que Vi fragmentado no puede inducir una respuesta independiente de T y que los conjugados Vi-CRMw correspondientes pueden inducir una respuesta dependiente de T esencialmente libre de una respuesta independiente de T en ratones.

Ejemplo 7 - Ensayo in vivo en ratones de Vi fragmentado (fVi) y de longitud completa (grupo 3 descrito en el ejemplo 1) conjugado con diferentes proteínas portadoras

Se inmunizaron seis grupos de ⁸ ratones hembra CD1 de 10 semanas de edad con los conjugados reportados en la Tabla siguiente.

continuación

Se administraron dos inyecciones subcutáneas de 200 |jl que contenían cada una 1 |jg de antígeno Vi en los días 0 y 35, con sangrados los días 14, 35 y 49. Los antígenos se inyectaron en solución salina sin adyuvante. El anti-Vi se evaluó mediante ELISA (como se muestra en la Figura 9).

Como puede verse en la Figura 9, con todos los conjugados Vi nativos se observó una alta respuesta en el día 14, sin refuerzo después de la segunda inyección. La respuesta de IgG anti-Vi fue similar en todos los conjugados Vi nativos de longitud completa, independientemente del portador utilizado. Con los conjugados Vi fragmentado, se observó un aumento de la respuesta IgG anti-Vi (efecto de refuerzo) después de la segunda inyección para C R M -^y DT, pero no para TT, lo que sugiere que Vi fragmentado conjugado con CRM¹⁹⁷ o DT puede inducir una respuesta inmune dependiente de T esencialmente libre de una respuesta independiente de T. Después de la segunda inyección, la respuesta de IgG anti-Vi fue similar independientemente del vehículo utilizado.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Un conjugado para usar en una vacuna, comprendiendo dicho conjugado un polisacárido Vi fragmentado y una proteína portadora seleccionada entre CRM¹⁹⁷ o toxoide diftérico, en el que el polisacárido fragmentado tiene un peso molecular promedio de entre 40 y 55 kDa.

2. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polisacárido fragmentado tiene un peso molecular promedio de entre 41 y 49 kDa.

3. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polisacárido fragmentado tiene un peso molecular promedio de 51 a 55 kDa.

4. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polisacárido fragmentado tiene un peso molecular promedio de entre 42 y 46 kDa.

5. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polisacárido fragmentado tiene un peso molecular promedio de entre 45 y 50 kDa.

⁶. El conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la proteína portadora es CRM¹⁹⁷.

7. Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a ⁶ en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

⁸. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, en la que la composición no tiene adyuvante.

9. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, en la que la composición comprende un adyuvante.

10. El conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a ⁶ o la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 para su uso en la generación de una respuesta inmune en un mamífero.

11. El conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a ⁶ o la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 para su uso en la generación de una respuesta inmune dependiente de T esencialmente libre de una respuesta inmune independiente de T en un mamífero.

12. Una vacuna que comprende el conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a ⁶ o una composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 para su uso en la prevención de enfermedades.

13. El conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a ⁶ o la composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 para su uso en un procedimiento de prevención de la fiebre tifoidea.

14. Un procedimiento para fabricar un conjugado que comprende polisacárido Vi fragmentado y una proteína portadora seleccionada de CRM¹⁹⁷ o toxina diftérica que comprende las etapas de:

a. Fragmentación del polisacárido Vi para obtener un polisacárido Vi fragmentado con un peso molecular promedio de 40 a 55 kDa

b. Hacer reaccionar el polisacárido Vi fragmentado obtenido en la etapa a) con una carbodiimida y N-hidroxisuccinimida a un pH de 5 a 6 para formar un éster de N-hidroxisuccinimida

c. Hacer reaccionar el derivado de Vi del éster de N-hidroxisuccinimida obtenido en la etapa b) con la proteína portadora para producir un conjugado.

15. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la proteína portadora es CRM¹⁹⁷.

16. Un conjugado para su uso en una vacuna obtenible mediante un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 o 15.