CN105828839B - 沙门氏菌缀合物疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于片段化的Vi多糖和载体蛋白的缀合物，包含所述缀合物的组合物和用于制备所述缀合物和组合物的方法。

Description

沙门氏菌缀合物疫苗
发明背景
疫苗中已经多年使用来自细菌的糖类。虽然糖类是T非依赖性抗原，然而，它们是弱免疫原性的。此外，它们在2岁以下的婴儿或幼儿中无效。缀合至载体可以有效地将T非依赖性抗原转化为T依赖性抗原，从而增强记忆应答并允许发展保护性免疫。迄今为止，最有效的糖疫苗因此基于糖缀合物。均属于Yeda Research and Development Co. Ltd.的WO95/31994和WO94/03208、US 5,204,098和WO2008/081022涉及弱免疫原性抗原的缀合物。
许多缀合方法利用短寡糖，并且这主要用于改善制造工艺(更好地控制制造一致性，更好地表征最终产品)。众所周知的是，糖链长可以对缀合物疫苗的免疫原性具有影响(P. Costantino等人. Expert Opin. Drug Discov., 6 (2011) 1045)。Serum Instituteof India Ltd的IN1330MUM2010涉及制造适合于缀合的多糖片段的方法。US 6,045,805还描述用于制备寡糖的方法。
伤寒仍然是发展中国家中的严重疾病，其每年影响数百万人(Crump JA等人,Bull. Wld. Hlth. Org. 82, 346–353 (2004); Ochai RL等人 and the Domi TyphoidStudy Group, Bull. Wld. Hlth. Org. 86, 260–268 (2008))。在过去十年中，针对该疾病已经开发了缀合物疫苗。例如，NICHD/NIH开发了基于Vi(来自伤寒沙门氏菌肠血清变型(Salmonella enterica serovar Typhi)的多糖)和rEPA蛋白载体的安全和高免疫原性缀合物疫苗(Lanh等人, N. Eng. J. Med. 2003; Thiem等人, Clin Vac. Immunol. 2011;Szu, Expert Rev. Vaccines 12(11), 1273-1286 (2013))。许多论文讨论Vi的免疫原性、其缀合疫苗和被认为迄今最佳的Vi链长(Szu等人, Infection and Immunity, 1989,3823; Szu等人, Infection and Immunity, 1991, 4555; Szu等人 Infection andImmunity, 1994, 5545; Kossaczka等人, Infection and Immunity, 1999, 5806;Cui等人, Clin. Vaccine Immunol., 17 (2010), 73-79; Micoli等人, Vaccine, 29 (2011),712-720; An等人, Vaccine, 29 (2011), 7618-23; Rondini等人, Clin.VaccineImmunol., 18 (2011), 460-68; An等人, Vaccine,30 (2012), 1023–1028)。
最近，Micoli等人 Vaccine 2012和Rondini等人, J. Infect. Dev Ctries,2012已经描述基于来自广义地纯化的弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii ）的Vi和CRM197蛋白载体的伤寒沙门氏菌疫苗缀合物。当在人中测试时，Vi-CRM197缀合物疫苗与未缀合的Vi相比在单次免疫之后且以较低的剂量提供更高的抗Vi抗体应答(van Damme等人, PlosOne 2011; 在the 8 th International Conference on Typhoid Fever and Other Invasive Salmonelloses, Bangladesh, March 2013呈现的进一步结果)。然而，再次接种之后的抗Vi应答比初始应答更低，且抗Vi持续性比期望更短(Bhutta等人 Lancet Infect Dis, 14 (2014) 119)。
因此仍然需要提供改进的缀合物疫苗。
发明概述
本发明涉及基于片段化的Vi多糖和载体蛋白的缀合物。具体而言，片段化的Vi多糖具有40至55 kDa的平均分子量。本发明进一步提供包含本发明的缀合物的药物组合物，包括将本发明的缀合物或药物组合物施用于哺乳动物的用于在所述哺乳动物中产生免疫应答的方法，包括将本发明的缀合物或药物组合物施用于哺乳动物的用于在所述哺乳动物中产生基本上无T非依赖性免疫应答的T依赖性免疫应答的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的本发明的缀合物或药物组合物的用于在受试者中预防伤寒的方法，和用于制备所述缀合物的方法。
本发明的优选缀合物应当能够诱导记忆应答，提供再次接种后的加强效应和持续的抗体水平。理想地，所述缀合物应当在所有年龄的群体、特别是2岁以下的儿童中是有效的。
附图简述
图1显示用于制备本发明的缀合物的合成步骤(PS = 片段化的多糖；prot. = 载体蛋白；RC=N=CR’可以是任何碳二亚胺，例如，通常为1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺)。
图2显示组1至10的小鼠中的免疫应答。组1至4用包含片段化的Vi和作为载体蛋白的CRM197的缀合物免疫，其中组1中的片段化的Vi具有9.5 kDa的平均分子量(avMW)；组2中的片段化的Vi具有22.8 kDa的avMW；组3中的片段化的Vi具有42.7 kDa的avMW；且组4中的片段化的Vi具有82 kDa的avMW。组5用缀合至CRM197的天然Vi注射，组6至9分别用具有组1至4的avMW的未缀合的片段化的Vi注射。组10接受天然Vi。
图3显示伤寒沙门氏菌Vi多糖的重复单元，其中Ac是乙酰基。
图4显示表明天然Vi和片段化的Vi(合并物1-4)中的O-乙酰化的量的1H NMR谱(在NaOD 200 mM，在室温，500 MHz)。
图5显示天然Vi与片段化的Vi混合物相比的HPLC-SEC概况(214 nm)，且图6显示不同avMW的四种片段化的Vi合并物(合并物1-4)。样品在TSK凝胶3000 PWXL柱上运行，用NaH2PO4 100 mM NaCl 100mM 5% CH3CN (pH 7.2)以0.5 mL/min洗脱；Vo 10.663 min；Vtot23.326 min。
图7显示片段化的Vi avMW 42.7 kDa的HPLC-SEC概况(214 nm)(TSK凝胶3000PWXL柱, NaH2PO4 100 mM NaCl 100mM 5% CH3CN pH 7.2, 0.5 mL/min; Vo 10.663 min;Vtot 23.326 min；使用葡聚糖作为标准品)。峰面积的80％在70和25kDa之间。
图8显示当用全长未缀合的Vi、全长Vi缀合物和片段化的Vi缀合物免疫时，在野生型小鼠相比于T细胞敲除(TCR βδ-/-)小鼠中观察到的应答。
图9显示在缀合至CRM197、DT和TT的全长Vi缀合物和片段化的Vi缀合物中观察到的应答。
发明详述
本发明涉及包含缀合至载体蛋白的片段化的Vi的缀合物。
为了解释本说明书的目的，以下定义将适用，且在任何适当的时候，以单数使用的术语也包括复数，反之亦然。
如本文所用，在本发明的上下文中(特别是权利要求的上下文中)使用的术语“一(a)”和“一(an)”和“该(the)”“该”和类似术语应被解释为包括单数和复数两者，除非本文另有指明或与上下文明显矛盾。
关于数值x的术语“约”是任选的，且意指例如x±10％。
如本文所用，术语“Vi”或“Vi多糖”是指纯化自柠檬酸杆菌的伤寒沙门氏菌肠血清变型(Salmonella enterica serovar Typhi)的荚膜多糖(Rondini等人, J. Infect.Dev. Ctries, 2012)。
如本文所用，术语“天然的多糖”是指还没有经过处理的多糖，所述处理的目的在于降低所述多糖的大小。
如本文所用，关于Vi多糖的术语“片段化的”是指已经经历大小减小、因此降低多糖的重复单元的数目的Vi多糖。因此，与天然的Vi相比，片段化的Vi具有较低的avMW。例如，片段化的Vi可以包含30至300个重复单元，相比之下，天然的Vi包含超过600个重复单元。Vi单体重复单元的结构显示于图3。在本发明的片段化的Vi中，优选没有观察到与天然Vi相比重复单元的结构的变化。这可以通过1H NMR分析来证实(参见图4)。此外，片段化的Vi中的O-乙酰基的百分数优选与天然Vi相同(即，约95％O-乙酰化)，但可以变化，并降低至约65％O-乙酰化。O-乙酰化可以通过标准测量诸如1H NMR、Hestrin比色法来测定。
如本文所用，术语“合并物（pool）”是指具有定义的平均分子量范围且可以通过标准方法与彼此分离的片段化的Vi的组群。合并物由如本文所定义的片段化的Vi组成。
在其天然大小中，Vi多糖具有约165kDa的通过HPLC大小排阻色谱法(HPLC-SEC)测量的平均分子量。本发明中使用的片段化的Vi具有40至55 kDa之间的avMW。该值通过HPLC-SEC测量。通常，通过具有TSK凝胶PWXL保护柱(4.0 cm x 6.0 mm; 粒径12 µm; 编号808033)的TSK凝胶3000 PWXL柱(30 cm x 7.8 mm; 粒径7 µm; 编号808021)(TosohBioscience)上使用葡聚糖作为标准品(5、25、50、80、150 kDa)运行样品而计算平均分子量。流动相是0.1 M NaCl, 0.1 M NaH2PO4, 5% CH3CN, pH 7.2，流速为0.5 mL/min(等度方法，持续30分钟)。分别用λ-DNA (λ-DNA分子量标记III 0.12–21.2 kb; Roche)和叠氮化钠(NaN3; Merck)进行空隙和床体积校准。
本发明的片段化的Vi可以进一步分离成不同的平均分子量范围的合并物。这可以通过本领域中已知的方法诸如阴离子交换色谱、大小排阻色谱、切向流过滤来实现。
在本发明的一个实施方案中，片段化的Vi具有约40至55 kDa、更优选42至53 kDa、甚至更优选45至50 kDa的avMW。在另一个实施方案中，片段化的Vi具有约41至49 kDa、优选41至48 kDa、更优选42至46 kDa的avMW。在进一步实施方案中，片段化的Vi具有约43 kDa的avMW。在进一步实施方案中，片段化的Vi具有51至55 kDa、优选52至54 kDa的avMW。在进一步实施方案中，片段化的Vi具有约53 kDa的avMW。
对于本领域技术人员将明显的是，Vi或其片段的平均分子量可以根据测量的方法而变化。如本文所述，对于平均分子量给出的值通过HPLC大小排阻色谱、通常使用本文所述的柱、缓冲液和标准品来测量。然而，技术人员将理解，所使用的柱、缓冲液和/或标准品的变化将影响计算的平均分子量。例如，当使用具有Acquity UPLC BEH200 1.7 mm柱(4.6 x 150 mm)的UPLC-SEC系统以0.45 mL/min测量时，天然Vi具有148 kDa的计算的avMW，相比之下，当使用本文描述的方法测量时，具有165 kDa的计算的avMW。因此，约+/- 10％的测量的avMW的变化可以发生，并且本领域技术人员将理解的是，本发明不受绝对值限制，但可以在测量变化的范围内变化。
本发明中使用的片段化的Vi的合并物具有特定平均分子量范围分布，其可以在多分散指数(PDI)方面进一步表征。如下面方程中所示计算多分散指数：
PDI = Mw / Mn
其中Mw是重均分子量且Mn是数均分子量。
分子量分布越窄，PDI值越接近于1。
片段化的Vi的合并物可以具有特征在于合并物中的至少80％具有25 kDa和70kDa之间的avMW的avMW分布。其可以具有特征在于合并物中的至少50％具有35 kDa和60kDa之间的avMW的avMW分布。
其可以具有特征在于合并物中的至少30％具有41 kDa和55 kDa之间的avMW的avMW分布。
片段化可以通过本领域中已知的许多方法实施，所述方法诸如天然多糖的化学水解、天然多糖的酶促片段化、天然多糖的γ照射，或机械方法诸如天然多糖的超声处理、高压均化器/微流化器/HPCDS(高压细胞破碎系统)。
选择本发明中使用的片段化方法，使得其可以得到片段化的Vi，其具有小于80kDa、优选小于60 kDa、更优选40和55 kDa之间的avMW。
还优选选择方法，使得重复单元的结构没有变化。
优选地，片段化不通过机械方法。优选地，片段化不通过碱水解。
本发明的片段化的Vi优选通过用过氧化氢化学水解来获得。使用该方法，据发现，Vi多糖大小可以减小，而不改变重复单元的结构。此外，用过氧化氢水解可以使得形成片段化的Vi，其具有比使用机械方法时更低的平均分子量。
如果本发明的片段化的Vi通过用过氧化氢的化学水解而获得，则发现添加催化量的氯化铁(FeCl3)使得反应能够在较温和条件(较低的温度和较短的反应时间)下工作。因此，在本发明的一个方面，提供用于将多糖片段化的方法，其包括在氯化铁存在的情况下使天然多糖与过氧化氢反应的步骤。更具体地，本发明的一个方面涉及用于将Vi片段化的方法，其包括在氯化铁存在的情况下使天然Vi与过氧化氢反应的步骤。甚至更具体地，该方法包括使Vi与约3％过氧化氢在水和0.1mM氯化铁中反应。优选地，反应的温度为约20-40℃。
在本发明的另一个方面，提供用于将多糖片段化的方法，其包括在硫酸亚铁存在的情况下使天然多糖与过氧化氢反应的步骤。使用比FeCl3更可溶的硫酸亚铁导致更可重复的过程。在一个实施方案中，本发明涉及用于将Vi片段化的方法，其包括在作为催化剂的硫酸亚铁存在的情况下使天然Vi与过氧化氢反应的步骤。具体而言，该方法包括在0.1 mM硫酸亚铁存在的情况下使天然Vi与约0.5%过氧化氢在水中反应。优选地，反应的温度为约20-40℃。通过该方法获得的片段化的Vi优选在用于本发明的缀合方法中前经受加热步骤(约80℃)。
片段化通常随后为纯化。
纯化可以通过本领域中已知的方法来实施。通常，纯化通过阴离子交换色谱进行。
纯化通常得到不同的长度和不同的平均分子量范围的片段化的Vi的“合并物”。
本缀合物的载体蛋白可以选自CRM197或白喉类毒素。最优选地，载体蛋白是CRM197。图9显示缀合至CRM197、白喉类毒素(DT)和破伤风类毒素(TT)的片段化的Vi的免疫应答的差异。对于片段化的Vi与CRM197和白喉类毒素(DT)的缀合物看到的应答是T依赖性免疫应答典型的(第一次注射之后(第14和35天)的较低的免疫应答，随后为第二次注射之后(第49天)的加强应答)。相比之下，片段化的Vi与破伤风类毒素(TT)的缀合物显示对一个剂量的疫苗的高抗体应答，而无对第二剂量的明显回忆应答，这是当显著的T非依赖性应答存在时观察到的发现。
本发明进一步涉及用于制备包含片段化的Vi和选自CRM197或白喉类毒素的载体蛋白的缀合物的方法，其包括以下步骤：
a) 将Vi多糖片段化，以获得具有40至55 kDa的avMW的片段化的Vi多糖；
b) 使步骤a)中获得的片段化的Vi多糖与碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺在5至6的pH反应，以形成N-羟基琥珀酰亚胺酯
c) 使步骤b)中获得的N-羟基琥珀酰亚胺酯与载体蛋白，以产生所述缀合物。
本方法的一个实施方案描绘于图1中。
在本方法中，步骤a)任选随后为纯化步骤。纯化步骤得到不同平均分子量范围的片段化的Vi合并物。具有40和55 kDa之间的平均分子量范围的片段化的Vi合并物用于本方法的步骤b)和c)中。
本方法的步骤b)中使用的碳二亚胺可以是任何合适的碳二亚胺，其能够在水性介质中缀合糖和蛋白。通常，所使用的碳二亚胺是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)(EDAC)。或者，可以使用1-环己基-3-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基-对-甲苯磺酸酯(CMC)。
在该方法的步骤b)中，片段化的Vi多糖优选在COOH基团方面以50 µmol/mL至200µmol/mL的浓度存在。
在该方法的步骤b)中，片段化的Vi的浓度可以是约15 mg/mL至约50mg/mL。片段化的Vi的avMW越低，本方法的步骤b)中的Vi的浓度可以越高。
反应介质中的碳二亚胺与片段化的Vi的COOH基团的摩尔比可以在1:1至10:1之间变化。其可以为5:1。片段化的Vi的COOH基团的数目通常对应于Vi重复单元的数目。
在步骤b)中，片段化的Vi的羧酸基团与碳二亚胺的反应得到O-酰基脲中间体，其进而与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应以形成N-羟基琥珀酰亚胺酯。
步骤b)中使用的NHS的浓度优选为约0.1M至0.4M。
用于本发明的方法的反应介质通常是2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液。
用于步骤b)的反应时间通常为约1小时。反应温度通常为约20-30℃。
步骤b)中获得的所得中间体(用酯基团衍生的片段化的Vi)可以通过针对总糖含量的HPAEC-PAD(具有脉冲安培检测法的高效阴离子交换色谱)和针对NHS定量的离子对HPLC-RP(反相HPLC)进行分析。这允许测定活化的片段化的Vi重复单元(即，已经与NHS反应的片段化的Vi)的％。优选地，活化的片段化的Vi的％为10-50％，更优选约20-30％。
本方法的步骤b)中获得的中间体可以任选通过在低pH脱盐或乙醇沉淀进行纯化。
在本方法的步骤c)中，本方法的步骤b)中获得的N-羟基琥珀酰亚胺酯然后与载体蛋白反应以产生包含片段化的Vi和所述载体蛋白的缀合物。
载体蛋白是在制备用于疫苗中的缀合物中通常使用的蛋白。例如，载体蛋白可以是CRM197或白喉类毒素。最优选地，载体蛋白是CRM197。
载体蛋白可以在与本方法的步骤b)中获得的NHS酯反应前进行衍生化。蛋白载体可以通常用酰肼衍生化。通常，载体蛋白用己二酸二酰肼(ADH)衍生化(如显示于图1)。
如果CRM197用作本方法的步骤c)中的载体蛋白，Vi与CRM197的w/w比优选为2:1至1:2。例如，其可以是2:1、1:1或1:2。
在本发明的方法的步骤c)中，反应介质中的衍生化的片段化的Vi(即，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯)的浓度可以是约5 mg/mL至约10 mg/mL。片段化的Vi的平均分子量越低，本方法的步骤c)中的NHS-酯的浓度可以越高。
用于本发明的方法的步骤c)的反应时间通常为约2小时。用于本发明的方法的步骤c)的反应温度通常为约20-30℃。已知方法可以用于评价反应的完成。
缀合步骤c)优选在MES缓冲液(pH 6)中、通常以约20mM的浓度进行。
在本方法的步骤c)中，pH优选为约6。该pH值低于当在缀合化学法中使用NHS时报道的pH值。不希望受理论束缚，据信，在该pH范围中，NHS水解比在较高pH时更慢，导致更有效的缀合过程。
通过本方法获得的缀合物可以经受进一步纯化过程。例如，所述缀合物可以通过大小排阻色谱或切向流过滤、疏水色谱或离子交换色谱进行纯化。
在本方法中，步骤b)中使用的碳二亚胺和NHS的存在允许具有高缀合效率，而不改变片段化的Vi重复单元的结构。如果仅使用碳二亚胺诸如EDAC(即，不存在NHS)，则需要高浓度的所述碳二亚胺以使得该方法有效。此外，产生片段化的Vi的COOH基团上的N-酰基脲基团，修饰多糖结构且改变其表位。NHS的使用避免这些衍生物的形成。用本方法，片段化的Vi缀合物中的这些衍生物的百分数以摩尔计小于2％(Vi的碳二亚胺/COOH)，并且残留的酯基以摩尔计也小于1％。
由本方法获得的缀合物的特征还在于游离的、即未缀合的片段化的Vi的量，其为小于20％，优选小于15％，更优选小于5％。优选地，没有检测到游离的片段化的Vi。此外，优选没有检测到游离的蛋白。本发明的缀合物可以进一步特征在于它们片段化的Vi与载体蛋白比。例如，片段化的Vi:蛋白载体的w/w比可以是约1.5:1至约1:3。这些比率可以根据所使用的片段化的Vi的平均分子量范围而变化。它们也可以根据所使用的载体蛋白而变化。当CRM197用作蛋白载体时，Vi与CRM197的w/w比可为约0.33至约1.33。在本发明的一个实施方案中，其为约0.33。在本发明的一个实施方案中，其为约0.52。在本发明的一个实施方案中，其为约0.64。在本发明的一个实施方案中，其为约1.33。
当白喉类毒素(DT)用作蛋白载体时，Vi与DT的w/w比可为约0.85。
本发明的缀合物优选具有至少60％、更优选至少80％、甚至更优选至少90％O-乙酰化。在一个最优选的实施方案中，本发明的缀合物具有约95％ O-乙酰化。这与天然Vi的O-乙酰化相当，并且证实片段化不改变片段化的Vi单体重复单元的结构。
O-乙酰化的百分数可以通过本领域中已知的方法诸如1H NMR、Hestrin比色法来测量。
在本发明的一个实施方案中，所述缀合物包含5至25 µg片段化的Vi。在本发明的一个实施方案中，所述缀合物包含8 µg片段化的Vi。
在本发明的一个实施方案中，所述缀合物中的载体蛋白是CRM197。在本发明的一个实施方案中，所述缀合物包含5至25 µg CRM197。在一个实施方案中，所述缀合物包含10至15µg CRM197。
在本发明的一种缀合物中，片段化的Vi的量为8 µg，且CRM197的量为12.5 µg。
本发明的缀合物可以通过本文所述的方法进一步获得。因此，可通过本发明的方法获得的缀合物也是本发明的一部分。
本发明的缀合物可以进一步加工成药物组合物。因此，本发明还提供包含本发明的缀合物组合药学上可接受的载体的药物组合物。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣剂、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等及其组合，如本领域技术人员已知 (参见，例如，Gennaro(2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 第20版, ISBN:0683306472)。除了任何常规载体与活性成分不相容的范围以外，考虑其在治疗或药物组合物中的用途。
术语“治疗有效量”的本发明的化合物是指本发明的缀合物将引起受试者的生物学或医学应答或预防疾病等的量。在一个非限制性实施方案中，术语“治疗有效量”是指本发明的化合物当施用于受试者时有效预防由伤寒沙门氏菌介导的病况或病症或疾病的量。
如本文所用，术语“受试者”是指动物。通常，所述动物是哺乳动物。受试者还是指例如灵长类(例如，人，男性或女性)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠、鱼、禽类等。在某些实施方案中，所述受试者是灵长类。在还有其它实施方案中，所述受试者是人。
微生物感染影响身体的各个区域，所以可将本发明的组合物以各种形式制备。例如，可将所述组合物制备为可注射剂，作为液体溶液或悬浮液。也可制备适合在注射前溶解或悬浮于液体媒介物中的固体形式。所述组合物可以制备用于局部施用，例如作为软膏剂、乳膏剂或粉末剂。所述组合物可制备用于口服施用，例如作为片剂或胶囊，或作为糖浆剂(任选地调味)。可将所述组合物制备为使用细粉或喷雾进行肺部施用，例如作为吸入剂。可将所述组合物制备为栓剂或阴道栓。可将所述组合物制备用于鼻腔、耳部或眼部施用，例如作为滴剂，作为喷雾剂，或作为粉剂。可将所述组合物包括于漱口水中。可将所述组合物冻干。
所述药物组合物优选是无菌的。其优选无热原。优选将其缓冲在例如pH6至pH8、通常约pH7。
本发明的组合物可以包含本发明的缀合物和盐水。
本发明还提供含有本发明的药物组合物的递送装置。所述装置可以是例如，注射器或吸入器。
本发明的药物组合物优选为免疫原性组合物，因为它们包含免疫有效量的多糖免疫原。“免疫有效量”意指以单一剂量或作为一系列剂量的部分向个体施用该量对于预防是有效的。该量取决于待治疗个体的健康和身体状况、待治疗个体的年龄、分类组(例如非人灵长类动物、灵长类动物等)、个体的免疫系统合成抗体的能力、期望的保护程度、疫苗制剂、治疗医生对医学情况的评估和其他相关因素而不同。预期所述量将落入可通过常规试验确定的相对宽范围内。预期1µg至20µg的剂量的糖，例如约5µg/剂量。剂量处理可以是单剂量时间表或多剂量时间表(例如包括加强剂量)。所述组合物可以与其它免疫调节剂结合施用。
一旦配制，可以将本发明的组合物直接施用于受试者。待治疗的受试者可以是动物；具体而言，可以治疗人受试者。
通常预防性使用本发明的免疫原性组合物(即预防未来的感染)。
在一个实施方案中，药物组合物可以未佐剂化。
在另一个实施方案中，免疫原性组合物可以包括佐剂。所述佐剂可以用于增强在接受所述组合物的患者中引起的免疫应答(体液和/或细胞)。可以与本发明使用的佐剂包括，但不限于：
• 含有矿物质(包括钙盐和铝盐(或其混合物))的组合物。钙盐包括磷酸钙(例如US 6355271中公开的“CAP”颗粒)。铝盐包括氢氧化物、磷酸盐、硫酸盐等，其中所述盐采用任何合适形式(例如凝胶、结晶、无定形等)。优选吸附至这些盐。也可将含有矿物质的组合物配制为金属盐的颗粒WO2000/0023105。可使用已知为氢氧化铝和磷酸铝的佐剂。这些名称是常规的，但仅出于方便使用，因为其均不是存在的实际化合物的准确描述(例如参见Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (编辑Powell & Newman)Plenum Press 1995, 第9章)。本发明可使用通常用作佐剂的任何"氢氧化物"或"磷酸盐"佐剂。称为"氢氧化铝"的佐剂通常是羟基氧化铝盐(aluminum oxyhydroxide salts)(通常至少部分为晶体)。已知为“磷酸铝”的佐剂通常是羟基磷酸铝，经常还含有少量硫酸（即硫酸羟基磷酸铝）。它们可通过沉淀获得，沉淀期间的反应条件和浓度影响磷酸根取代所述盐中的羟基的程度。本发明可使用氢氧化铝和磷酸铝两者的混合物。在这种情况下，可以存在比氢氧化铝更多的磷酸铝， 例如重量比为至少2:1，例如，≥5:1、≥6:1、≥7:1、≥8:1、≥9:1等。施用于患者的组合物中Al+3的浓度优选小于10mg/ml，例如≤5mg/ml、≤4mg/ml、≤3mg/ml、≤2mg/ml、≤1mg/ml等。优选的范围是0.3-1mg/ml。优选0.85mg/剂量的最大值。
• 皂苷(Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (编辑Powell& Newman) Plenum Press 1995, 第22章)，其为在许多种类植物的树皮、叶、茎干、根和甚至花中发现的甾醇糖苷和三萜糖苷的异质群体。已广泛研究了作为佐剂的来自皂树(Quillaia saponaria Molina)树皮的皂苷。皂苷也可商业获得自丽花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜)、满天星(Gypsophilla paniculata)(婚纱花)和肥皂草 (Saponaria officianalis)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂诸如QS21，以及脂质制剂诸如ISCOM。QS21作为Stimulon™销售。已使用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已鉴定了用这些技术的特定纯化级分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。优选地，所述皂苷为QS21。产生QS21的方法公开于US 5,057,540。皂苷制剂也可包含甾醇，诸如胆固醇(WO96/33739)。皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒(Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (编辑Powell & Newman) Plenum Press 1995, 第23章)。ISCOM通常还包括磷脂，诸如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷均可用于ISCOM中。优选地，ISCOM包括QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。WO96/33739和EP 0109942中进一步描述了ISCOM。任选地，ISCOM可不含额外去污剂WO00/07621。开发基于皂苷的佐剂的综述可参见参考文献Barr等人. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:247-271& Sjolanderet等人. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:321-338。
• 细菌ADP-核糖基化毒素(例如大肠杆菌不耐热肠毒素“LT”、霍乱毒素“CT”或百日咳毒素“PT”)及其脱毒的衍生物，诸如称为LT-K63和LT-R72的突变体毒素(Pizza等人(2000) Int J Med Microbiol 290:455-461)。脱毒的ADP-核糖基化毒素作为粘膜佐剂的用途描述于WO95/17211，且作为胃肠外佐剂的用途描述于WO98/42375。
• 生物粘附剂和粘膜粘附剂，诸如酯化的透明质酸微球(Singh et al] (2001) J Cont Release 70:267-276)或壳聚糖及其衍生物(WO99/27960)。
• 优选由生物可降解且无毒的材料(例如，聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己内酯等)与丙交酯乙交酯共聚物形成的微粒(即直径为～100nm至～150μm，更优选直径 ～200nm至～30μm，直径～500nm至～10μm的颗粒)，其任选经处理以具有带负电表面(例如用SDS处理)或带正电表面 (例如用阳离子去污剂诸如CTAB处理)。
• 脂质体(Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (编辑Powell & Newman) Plenum Press 1995, 第13 & 14章)。适合用作佐剂的脂质体制剂的实例描述于US 6,090,406和US 5,916,588。
• 胞壁酰肽，诸如N-乙酰基胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(“thr-MDP”)、N-乙酰基-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰基葡糖胺基-N-乙酰基胞壁酰-L-Al-D-异谷氨酸-L-Ala-二棕榈酰氧基丙基酰胺(“DTP-DPP”或“Theramide™”)、N-乙酰基胞壁酰-L-丙酰胺-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰基氧基)-乙胺(“MTP-PE”)。
• Polyoxidonium聚合物(Dyakonova等人 (2004) Int Immunopharmacol 4(13):1615-23)或其它N-氧化的聚乙烯-哌嗪衍生物。
• CD1d配体，诸如α-糖基神经酰胺(De Libero等人，Nature Reviews Immunology, 2005, 5: 485-496和US 5,936,076)(例如α-半乳糖基神经酰胺)、含有植物鞘氨醇的α-糖基神经酰胺、OCH、KRN7000 [(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-半乳吡喃糖基)-2-(N-二十六烷基(hexacosanoyl)氨基)-1,3,4-十八烷三醇]、CRONY-101、3''-O-硫代-半乳糖基神经酰胺等。
• γ菊粉(Cooper (1995) Pharm Biotechnol 6:559-80)或其衍生物，诸如algammulin。
• 水包油乳液。各种此类乳液是已知的，并且它们通常包括至少一种油和至少一种表面活性剂，其中所述油和表面活性剂是可生物降解的(可代谢的)和生物相容的。乳液中的油滴直径通常小于5μm，并且可以甚至具有亚微米直径，用微流化床实现这些小尺寸以提供稳定乳液。优选尺寸小于220nm的液滴，因为这些液滴可以进行过滤除菌。
• 免疫刺激寡核苷酸，诸如含有CpG基序的(含有通过磷酸键连接至鸟苷残基的未甲基化的胞嘧啶残基的二核苷酸序列)或含有CpI基序的(含有连接至肌苷的胞嘧啶的二核苷酸序列)的免疫刺激寡核苷酸、或双链RNA或含有回文序列的寡核苷酸或含有聚(dG)序列的寡核苷酸。免疫刺激性寡核苷酸可以包括核苷酸修饰/类似物诸如硫代磷酸酯修饰，且可以是双链或(除了RNA)单链的。参考文献Kandimalla等人. (2003) Nucleic Acids Research 31:2393-2400和WO99/62923公开了可能的类似物取代，例如用2’-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献诸如Krieg (2003) Nature Medicine 9:831-835、McCluskie等人(2002) FEMS Immunology and Medical Microbiology 32:179-185、WO98/40100、US 6,207,646、US 6,239,116,、US 6,429,199中进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂作用。CpG序列可针对TLR9，诸如基序GTCGTT或TTCGTT (Kandimalla等人 (2003) Biochemical Society Transactions 31 (part 3):654-658)。CpG序列可特异性诱导Th1免疫应答，诸如CpG-AODN(寡脱氧核苷酸)，或其可更特异地诱导B细胞应答，诸如CpG-B ODN。参考文献Blackwell等人 (2003) J Immunol 170:4061-4068、Krieg (2002) Trends Immunol 23:64-65、WO01/95935中讨论了CpG-A和CpG-B ODN。优选地，CpG为CpG-A ODN。优选地，构建CpG寡核苷酸，使得5’末端可被受体识别。任选地，将两个CpG寡核苷酸序列在其3’末端连接以形成“免疫聚体(immunomers)”。参见例如参考文献Kandimalla等人 (2003) BBRC 306:948-953、Bhagat等人(2003) BBRC 300:853-861和WO03/035836。一种有用的 CpG佐剂是CPG7909，也称为ProMune™ (Coley Pharmaceutical Group, Inc.)。另一种是CpG1826。作为使用CpG序列的替代方案，或除了使用CpG序列以外，可以使用TpG序列(WO01/22972)，且这些寡核苷酸可以不含未甲基化的CpG基序。免疫刺激性寡核苷酸可富含嘧啶。例如，其可包含多于一个连续的胸腺嘧啶核苷酸(例如TTTT，如参考文献WO01/22972中所公开)，和/或其可具有含有＞25％(例如 ＞35％、＞40％、＞50％、＞60％、＞80％等)胸苷的核苷酸组成。例如，其可包含多于一个连续的胞嘧啶核苷酸(例如CCCC，如参考文献WO01/22972中所公开)，和/或其可具有含有＞25％(例如＞35％、＞40％、＞50％、 ＞60％、＞80％等)胞嘧啶的核苷酸组成。这些寡核苷酸可不含未甲基化的 CpG基序。免疫刺激性寡核苷酸将通常包含至少20个核苷酸。它们可包含少于100个核苷酸。
基于免疫刺激性寡核苷酸的特别有用的佐剂已知为IC-31™(Schellack等人(2006) Vaccine 24:5461-72)。因此，与本发明使用的佐剂可包含以下的混合物：(i)包括至少一个(且优选多个)CpI基序的寡核苷酸(例如15-40个核苷酸)，和(ii)聚阳离子聚合物，诸如包括至少一个(且优选多个)Lys-Arg-Lys三肽序列的寡肽(例如5-20个氨基酸)。所述寡核苷酸可以是包含26聚体序列5'-(IC)13-3'的脱氧核苷酸。所述聚阳离子聚合物可以是包含11聚体氨基酸序列Lys-Leu-Lys-Leu5-Lys-Leu-Lys的肽。
• 3-O-脱酰基化的单磷酰脂质A(‘3dMPL’，也称为‘MPL™’)(Myers等人(1990)Cellular and molecular aspects of endotoxin reactions的第145-156页，Ulrich(2000) Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Methods in Molecular Medicine系列的第42卷)的第16章 (第273-282页)，Johnson等人(1999) J Med Chem 42:4640-9和Baldrick等人(2002) Regulatory Toxicol Pharmacol 35:398-413)。在水性条件下，3dMPL可以形成具有不同大小的胶束聚集体或颗粒，例如具有＜150nm或＞500nm的直径。这些中的任一者或两者均可以用于本发明，且可以通过常规测定选择更好的颗粒。根据本发明优选使用较小的颗粒(例如足够小以提供澄清的3dMPL的水性悬浮液)，这是因为它们优异的活性(WO 94/21292)。优选的颗粒具有小于220nm、更优选小于200nm或小于150nm或小于120nm的平均直径，且甚至可以具有小于100nm的平均直径。然而，在大多数情况下，平均直径将不小于50nm。
• 甲基肌苷5′-单磷酸酯(“MIMP”)(Signorelli & Hadden (2003) Int Immunopharmacol 3(8):1177-86)。
• 多聚羟化吡咯双烷化合物(WO2004/064715)，诸如具有下式的化合物：
Figure 606869DEST_PATH_IMAGE001
其中R选自氢、直链或支链的、未取代的或取代的、饱和的或不饱和的酰基、烷基(例如环烷基)、烯基、炔基和芳基或其药学上可接受的盐或衍生物。实例包括，但不限于：木麻黄素(casuarine)、木麻黄素-6-α-D-吡喃葡萄糖、3-表-木麻黄素、7-表-木麻黄素、3，7-二表-木麻黄素等。
• 咪唑并喹啉化合物，诸如咪喹莫特(“R-837”)(US 4,680,338、US 4,988,815)、瑞喹莫德(“R-848”)(WO92/15582)和它们的类似物；及其盐(例如盐酸盐)。关于免疫刺激性咪唑并喹啉类的进一步细节可见参考文献Stanley (2002) Clin Exp Dermatol 27:571-577、Wu等人(2004) Antiviral Res. 64(2):79-83、Vasilakos等人(2000) Cell Immunol. 204(1):64-74、美国专利4689338、4929624、5238944、5266575、5268376、5346905、5352784、5389640、5395937、5482936、5494916、5525612、6083505、6440992、6627640、6656938、6660735、6660747、6664260、6664264、6664265、6667312、6670372、6677347、6677348、6677349、6683088、6703402、6743920、6800624、6809203、6888000和6924293以及Jones(2003) Curr Opin Investig Drugs 4:214-218。
• 缩氨基硫脲化合物，诸如参考文献WO2004/060308中公开的那些。活性化合物的配制、制备和筛选的方法也描述于其中。缩氨基硫脲类在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子诸如TNF-α中特别有效。
• 色胺酮化合物，诸如参考文献WO2004/064759中公开的那些。活性化合物的配制、制备和筛选的方法也描述于其中。缩氨基硫脲类在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子诸如TNF-α中特别有效
• 核苷类似物，诸如：(a)艾沙托立宾(Isatorabine)(ANA-245；7-硫杂-8- 氧代鸟苷)：
Figure 524009DEST_PATH_IMAGE002
。
• 及其前药；(b)ANA975；(c)ANA-025-1；(d)ANA380；(e)参考文献US 6,924,271、US2005/0070556、US 5,658,731中公开的化合物。洛索立宾(7-烯丙基-8-氧代鸟苷) (美国专利5,011,828)。
• 参考文献WO2004/87153中公开的化合物，包括：酰基哌嗪化合物、吲哚二酮化合物、四氢异喹啉(THIQ)化合物、苯并环二酮化合物、氨基氮杂乙烯基化合物、氨基苯并咪唑喹啉酮(ABIQ)化合物(US 6,605,617、WO02/18383)、水合酞酰胺(Hydrapthalamide)化合物、二苯甲酮化合物、异噁唑化合物、甾醇化合物、喹唑啉酮(Quinazilinone)化合物、吡咯化合物(WO2004/018455)、蒽醌化合物、喹喔啉化合物、三嗪化合物、吡唑并嘧啶化合物和吲哚(Benzazole)化合物(WO03/082272)。
• 氨基烷基葡糖苷磷酸酯衍生物，诸如RC-529[Johnson等人(1999) Bioorg Med Chem Lett 9:2273-2278, Evans等人(2003) Expert Rev Vaccines 2:219-229)。
• 磷腈，诸如聚[二(羧基合苯氧基)磷腈](poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene]) (“PCPP”)，如例如描述于参考文献Andrianov等人(1998) Biomaterials 19:109-115 and Payne等人 (1998) Adv Drug Delivery Review 31:185-196.
Figure 21856DEST_PATH_IMAGE003
Figure 417065DEST_PATH_IMAGE004
Figure 231437DEST_PATH_IMAGE005
如定义于WO03/011223，诸如‘ER 803058’、‘ER 803732’、‘ER 804053’、ER804058’、‘ER 804059’、‘ER 804442’、‘ER 804680’、‘ER 804764’、ER 803022或‘ER804057’，例如：
Figure 789774DEST_PATH_IMAGE007
来自大肠杆菌的脂质A的衍生物，诸如OM-174 (描述于参考文献Meraldi等人(2003) Vaccine 21:2485-2491 & Pajak等人 (2003) Vaccine 21:836-842)。
• 含有连接至含有磷酸酯的非环骨架的脂质的化合物，诸如TLR4拮抗剂E5564(Wong等人(2003) J Clin Pharmacol 43(7):735-42, US2005/0215517):
Figure 457516DEST_PATH_IMAGE008
这些和其它佐剂-活性物质在参考文献Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (编辑Powell & Newman) Plenum Press 1995 & Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols中更详细讨论。
组合物中的抗原和佐剂通常处于混合物中。
组合物可包括所述佐剂中的两种或更多种。例如，它们可有利地包括水包油乳液和3dMPL两者，等。
可与本发明使用的具体水包油乳液佐剂包括但不限于：
• 角鲨烯、Tween80和Span 85的亚微米(submicron)乳液。所述乳液的体积组成可以是约5％角鲨烯、约0.5％聚山梨醇酯80和约0.5％Span 85。在重量方面，这些比率变为4.3％角鲨烯、0.5％聚山梨醇酯80和0.48％Span 85。这种佐剂已知为‘MF59’(WO90/14837,Podda & Del Giudice (2003) Expert Rev Vaccines 2:197-203, Podda (2001)Vaccine 19: 2673-2680)，如Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (编辑Powell & Newman) Plenum Press 1995的第10章和Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Volume 42 of Methods in Molecular Medicine series)的第12章中更详细描述。MF59乳液有利地包括柠檬酸根离子，例如10mM柠檬酸钠缓冲液。
• 角鲨烯、生育酚和Tween80的乳液。所述乳液可包括磷酸盐缓冲盐水。它也可包括Span 85 (例如1％)和/或卵磷脂。这些乳液可具有2-10％角鲨烯、2-10％生育酚和0.3-3％Tween80，且角鲨烯：生育酚的重量比优选≤1 ，因为这提供更稳定的乳液。角鲨烯和Tween80可以约5:2的体积比存在。可通过以下制备一种此类乳液：将Tween80溶解于PBS以产生2％溶液，然后混合90ml该溶液与(5g DL-α-生育酚和5ml鲨烯)的混合物，然后微流化该混合物。所得乳液可具有亚微米油滴，例如平均直径为100-250nm，优选约180nm。
• 角鲨烯、生育酚和Triton 去污剂(例如Triton X-100)的乳液。所述乳液也可包括3d-MPL(参见下文)。所述乳液可含有磷酸盐缓冲液。
• 包含聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯80)、Triton 去污剂(例如Triton X-100)和生育酚(例如α-生育酚琥珀酸酯)的乳液。所述乳液可包括质量比约75∶11∶10的这三种组分(例如750μg/ml聚山梨醇酯80、110μg/mlTriton X-100和100μg/mlα-生育酚琥珀酸酯)，并且这些浓度应当包括来自抗原的这些组分的任何贡献。所述乳液也可包括角鲨烯。所述乳液还可包括3d-MPL(参见下文)。所述水相可包含磷酸盐缓冲液。
• 角鲨烯、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆401(“普朗尼克™ L121”)的乳液。所述乳液可在pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水中配制。该乳液是胞壁酰二肽的有用递送媒介物，且已在“SAF-1”佐剂(Allison & Byars (1992) Res Immunol 143:519-25)中与苏氨酰-MDP一起使用(0.05-1％ Thr-MDP，5％角鲨烯，2.5％普朗尼克L121和0.2％聚山梨醇酯80)。它也可以不与Thr-MDP使用，如“AF”佐剂(Hariharan等人(1995) Cancer Res 55:3486-9)(5％角鲨烯，1.25％普朗尼克 L121和0.2％聚山梨醇酯80)中。优选微流化。
• 具有0.5-50％油、0.1-10％磷脂和0.05-5％非离子型表面活性剂的乳液。如WO95/11700中所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。亚微米液滴尺寸是有利的。
• 不可代谢油(诸如轻矿物油)和至少一种表面活性剂(诸如卵磷脂，Tween80或Span 80)的亚微米水包油乳液。可包括添加剂，诸如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂缀合物(诸如US 6,080,725中所述通过经由葡萄糖醛酸的羧基将脂族胺添加至脱酰基皂苷而产生的GPI-0100)、二甲基双十八烷基溴化铵和/或N，N-双十八烷基-N，N-双(2-羟乙基)丙二胺。
• 其中皂苷(例如QuilA或QS21)和甾醇(例如胆固醇)结合为螺旋胶束的乳液(WO2005/097181)。
本发明还提供本发明的缀合物，其用于医药中。例如，在一个实施方案中，本发明的缀合物用于在哺乳动物中产生抗体应答。
本发明还提供用于在哺乳动物中产生免疫应答的方法，其包括将本发明的缀合物或药物组合物施用于所述哺乳动物。本发明还提供用于在哺乳动物中产生基本上无T非依赖性免疫应答的T依赖性免疫应答的方法，其包括将本发明的缀合物或药物组合物施用于所述哺乳动物。
本发明还提供本发明的缀合物或药物组合物在制备用于预防疾病的疫苗中的用途。
在一个实施方案中，本发明还提供本发明的缀合物在制备用于预防哺乳动物中的伤寒的药物中的用途。
通过这些方法和用途产生的免疫应答将通常包括抗体应答，优选保护性抗体应答。用于评价糖免疫之后的抗体应答的方法是本领域中众所周知的。例如，ELISA测定(酶联免疫吸附测定)通常用于测量抗Vi IgG应答。抗体应答优选是IgG应答，具有糖缀合物疫苗特有的从IgM转换至IgG的典型同种型。免疫应答通常是预防性的。哺乳动物优选是人。
本发明的缀合物被认为与其中Vi多糖还没有片段化的缀合物相比在生成T依赖性应答中是更有效的。“T依赖性”应答意指能够诱导再次注射之后的抗Vi应答(典型的回忆应答)的增加的缀合物。“基本上无T非依赖性应答的T依赖性应答”意指缀合物不能在T细胞敲除小鼠中诱导抗Vi应答。
生成T依赖性应答的缀合物被认为相比于生成T非依赖性应答的缀合物是有利的，因为已经发现T非依赖性应答不诱导记忆，被认为在2岁以下的儿童中是次优的，不会导致二级淋巴组织的生发中心中的体细胞高变和因此抗体应答的亲和力成熟(参见例如Pollard A.J.等人, Nat. Rev. Immunol., 2009; 9: 213)。此外，T非依赖性应答可以诱导对后续接种的低应答的状态(参见例如Poolman J. 等人, Expert Rev. Vaccines,2011; 10: 307)。
本发明的缀合物似乎生成T依赖性应答，如图2和图8中所示。图2显示本发明的片段化的Vi缀合物与天然Vi缀合物相比和与未缀合的天然和片段化的Vi相比在小鼠中的抗Vi抗体应答。所使用的材料的描述在实施例5的表中给出。可以看到，对于组1至4(对应于缀合至CRM197的片段化的Vi合并物1至4)，尽管在第14天(T14)与天然Vi缀合物(组5)相比抗ViIgG应答更低(与天然Vi相比对于合并物1-3显著，分别p = 0.0418，<0.0001，0.0297)，但在第35天(T49)在第二次注射后两周观察到可注意到的加强作用(p = 0.004-0.008)。如图2中所示，增加的抗Vi在第一次注射之后被天然Vi-CRM197 (组5)诱导，且在第二次注射之后没有增加。当使用较低剂量的天然Vi-CRM197缀合物(0.044 µg、0.35 µg和2.8 µg - 数据未显示)时，还观察到这种第二次注射之后的增加的缺乏，表明抗体水平的增加的缺乏不是由于一个剂量之后诱导最大应答。可以推测，对天然Vi缀合物的应答是由于长天然Vi链充当T非依赖性抗原的能力。这得到以下事实支持：未缀合的天然Vi(组10)能够诱导比较短Vi链(组6至9)更高的应答，即使比天然Vi缀合物(组5)更低。相反，片段化的Vi缀合物(组1至4)在第14天诱导较低响应，其通过第二次注射进一步增加，在两个剂量之后达到与天然Vi缀合物相当的抗Vi IgG抗体滴度。当与具有较低平均分子量的片段化的Vi缀合物(组1至3)和天然Vi缀合物(组5)相比时，特征在于82 kDa的Vi链长的组4缀合物显示中间行为。事实上，在第14天的应答比用更短的片段化的Vi缀合物更高，且比用天然Vi缀合物没有显著不同。
如图2中所示，与天然Vi(组10)相比，未缀合的片段化的Vi诱导减弱的Vi IgG抗体应答(组6至9)。对天然Vi(165kDa)的应答高于对片段化的Vi(82kDa - 组9)的应答，其进而高于对片段化的Vi(分别9.5 kDa，22.8 kDa，42.7 kDa – 组6至8)的应答(在第14天，未缀合的片段化的Vi合并物1至3诱导的应答相对于天然Vi显著更低，其中分别p = 0.0004，0.0056，0.0403)。因此，本发明人已经鉴定了临界链长(约82 kDa)，低于该链长，Vi多糖不再能够充当T非依赖性抗原。优选从不能诱导T非依赖性抗原特征的应答的多糖制备的Vi-缀合物。
为了验证对于未缀合的片段化的Vi引发T非依赖性抗体应答的能力受损害且片段化的Vi缀合物能够诱导基本上无T非依赖性应答的T依赖性应答的假设，在T细胞敲除小鼠(TCR βδ-/-小鼠)中测试片段化的Vi-CRM197和天然Vi-CRM197缀合物。如图8中可见，T细胞敲除小鼠仅对未缀合和缀合的全长Vi应答，但没有对片段化的Vi缀合物应答。此外，与T细胞敲除小鼠中相比，缀合、但非未缀合的天然Vi能够在野生型中诱导更高的应答(p=0.028，第14天；p=0.002，第42天)，表明野生型小鼠中的高应答源自混合的T依赖性/T非依赖性活性。
因此，本发明的一个方面涉及用于在哺乳动物中产生基本上无T非依赖性免疫应答的T依赖性免疫应答的方法，其包括将本发明的缀合物或药物组合物施用于所述哺乳动物。
在本发明的一个方面，提供用于在哺乳动物中增强多糖缀合物产生的免疫应答的方法。所述方法包括：
a) 鉴定未缀合的多糖停止诱导显著的抗Vi IgG抗体应答的平均分子量值；
b) 产生平均分子量低于步骤a)中确定的值的多糖的缀合物，和
c) 将步骤b)中获得的缀合物施用于哺乳动物。
本发明的缀合物(即含有缀合至如本文所定义的载体蛋白的片段化的Vi)，在诱导适当的抗体应答中，比未缀合的片段化的Vi更有效(参见图2)。
本发明的组合物将通常直接施用于受试者。直接递送可通过肠胃外注射(例如皮下、腹膜内、静脉内、肌内或至组织间隙)，或通过直肠、经口、阴道、局部、透真皮、真皮内、经眼、经鼻、经耳或经肺施用完成。优选注射或鼻内施用。
本发明可用于引发全身和/或粘膜免疫。
根据本发明制备的疫苗可用于治疗儿童(包括婴儿)和成人两者。因此，受试者可以为小于1 岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。接受疫苗的优选受试者为年轻人(例如≤5岁)。然而，所述疫苗不仅适用于这些组，还可更广泛地用于人群中。
治疗可通过单剂量时间表或多剂量时间表。多剂量可用于初次免疫时间表和/或加强免疫时间表。在多剂量时间表中，各个剂量可通过相同或不同的途径(例如肠胃外引发和粘膜加强，粘膜引发和肠胃外加强等)给予。多于一个剂量(通常两个剂量或三个剂量)的施用尤其可用于免疫幼稚的患者。多个剂量将通常间隔至少1周 (例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16 周等)进行施用。一个实例时间表在6周龄时提供第一剂量，且在10周龄时提供第二次剂量，以便与现有婴儿免疫一致(与EPI疫苗共施用)。该初始时间表可以随后为儿童的第一个生日之后的加强剂量。
可将本发明的缀合物与其它抗原组合成用于针对多种病原体同时免疫的单一组合物。作为制备组合疫苗的替代方案，可将缀合物与其他疫苗基本上同时(例如在到医疗保健专业或接种中心的同一医学会诊或诊视期间)施用于受试者。用于这些组合疫苗中或用于伴随施用的抗原包括，例如，来自无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、金黄色葡萄糖球菌(Staphylococcus aureus)和/或铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeuruginosa)、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、脑膜炎奈瑟氏菌(诸如糖类或缀合的糖类，对于血清群A、C、W135和/或Y)、肺炎链球菌(诸如糖类或缀合的糖类)等的免疫原。
在一个实施方案中，组合物可包含本发明的缀合物组合缀合至载体蛋白的甲型副伤寒沙门氏菌抗原，诸如H或O抗原(例如，O:2糖抗原)，以提供二价伤寒疫苗。在另一个实施方案中，组合物可包含本发明的缀合物组合缀合至载体蛋白的鼠伤寒沙门氏菌抗原，诸如H或O抗原(例如，O:9糖抗原)。在另一个实施方案中，组合物可包含本发明的缀合物组合缀合至载体蛋白的肠炎沙门氏菌抗原，诸如H或O抗原(例如，O:4,5糖抗原)。在另一个实施方案中，本发明的缀合物可以与抗原组合，所述抗原以被称为膜抗原的广义模块(GMMA)或天然外膜囊泡(NOMV)的外膜颗粒的形式呈现。此类膜颗粒的实例公开于例如WO2012/049662和WO2011/036564中。
以下实施例意欲说明本发明，并且不应当被解释为对其进行限制。温度以摄氏度给出。最终产物、中间体和原料的结构通过标准分析方法(例如微量分析和光谱特征)进行证实。所使用的缩写是本领域中常规的那些。
缩写
ADH 己二酸二酰肼
avMW 平均分子量
BCA 二喹啉甲酸测定法
EDAC 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺
h 小时
HPAEC-PAD 高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测
HPLC 高压液相色谱
HR 高分辨率
IR 红外光谱仪
kDa 千道尔顿
LCMS 液相色谱和质谱
M 摩尔浓度
MS 质谱
min 分钟
mL 毫升
mM 毫摩尔浓度
NHS N-羟基琥珀酰亚胺
NMR 核磁共振
PS 多糖
rpm 每分钟转数
RT 室温
SEC 大小排阻色谱
TFF 切向流过滤。
实施例1
制备片段化的Vi合并物和分离的方法。
将Vi溶解于水中，并添加H2O2 30% wt，用于具有2.5 mg/mL Vi和5% (wt/v) H2O2的最终浓度。将混合物在80±0.5℃加热2小时。此时之后，将混合物注射于Hiscreen CaptoQ柱(4.7 mL/直至100 mg片段化的Vi混合物的树脂负载率)，且使用梯度步骤方法分离不同平均分子量(avMW)的四种群体。NaH2PO4 20 mM pH 7.2和NaH2PO4 20 mM NaCl 1M pH 7.2分别用作缓冲液A和B。将片段化的Vi混合物负载于水中，且渐增avMW的合并物分别在25、30、37和45%缓冲液B洗脱。将各收集的合并物在SEC Sephadex G-15柱上针对水脱盐。
获得片段化的Vi合并物通过用于avMW计算的HPLC-SEC(参见图6)、用于Vi含量的HPAEC-PAD(Micoli等人, Vaccine 2011)、用于CHO基团测定的微BCA(使用NAcGlcN作为标准品)(Meeuwsen等人.Journal of Bioscience and Bioengineering, 2000 89(1):107-109)进行表征。1H NMR用于验证Vi身份并计算O-乙酰化水平(参见图4)(Micoli等人.Vaccine 2011)。图7显示片段化的Vi合并物3的HPLC-SEC概况，其具有42.7 kDa的avMW和25和70 kDa之间的面积(214 nm)的80％。
Figure 126395DEST_PATH_IMAGE009
实施例2
通过使用H2O2和FeCl3制备片段化的Vi和分离的方法。
将100 mg Vi PS溶解于水中；并添加FeCl3 10 mM和H2O2 30% wt，用于具有2.5mg/mL Vi、0.1 mM FeCl3和3% (wt/v) H2O2的最终浓度。将混合物在30±0.1℃加热1小时。此时之后，将混合物以5 mg片段化的Vi混合物/mL树脂的负载率注射至Capto Q柱上。NaH2PO4 20 mM pH 7.2和NaH2PO4 20 mM NaCl 1M pH 7.2分别用作缓冲液A和B。将片段化的Vi混合物负载于350 mM NaCl中，且目的群体在40%的缓冲液B洗脱。将片段化的Vi合并物通过TFF 30-kDa针对10个体积的水进行渗滤。将片段化的Vi合并物通过针对avMW计算的HPLC-SEC、针对Vi含量的HPAEC-PAD、针对验证Vi身份和计算O-乙酰化水平的1H NMR进行表征。具体而言，对于一种制备物，获得avMW 53.8 kDa的片段化的Vi(少于17%面积<30 kDa且少于16％面积> 80 kDa)。O-乙酰化水平仍高(88％)。
实施例3
通过使用H2O2和FeSO4制备片段化的Vi和分离的方法。
将100 mg Vi PS溶解于水中；并添加FeSO4 10 mM和H2O2 30% wt，用于具有2.5mg/mL Vi、0.1 mM FeSO4和0.5% (wt/v) H2O2的最终浓度。将混合物在30±0.1℃加热2小时。此时之后，将EDTA添加至10 mM的最终浓度以猝灭催化剂。通过切向流过滤(30-kDa膜)除去过氧化氢，并用NaH2PO4 10 mM pH 7缓冲液交换。将混合物在80℃加热2小时，然后以5mg片段化的Vi混合物/mL树脂的负载率注射至Capto Q柱上。NaH2PO4 20 mM pH 7.2和NaH2PO4 20 mM NaCl 1M pH 7.2分别用作缓冲液A和B。将片段化的Vi混合物负载于缓冲液A中，且期望MW的群体在线性梯度中(50个柱体积中从100％缓冲液A至100％缓冲液B)分离。将选择的片段化的Vi合并物通过TFF 30-kDa针对10个体积的水进行渗滤。将片段化的Vi合并物通过针对avMW计算的HPLC-SEC、针对Vi含量的HPAEC-PAD、针对验证Vi身份和计算O-乙酰化水平的1H NMR进行表征。具体而言，对于一种制备物，获得avMW 43.4 kDa的片段化的Vi(少于20%面积<25 kDa且少于20%面积> 70 kDa)。O-乙酰化水平仍高(85％)。
实施例4
制备片段化的Vi缀合物的方法
对于片段化的Vi合并物1-3(实施例1中获得)的缀合，以下程序用于缀合物制备。将片段化的Vi以50 mg/mL的浓度溶解于MES 100 mM (pH 6)中。添加NHS，然后添加EDAC，以具有5的EDAC/Vi重复单元摩尔比和NHS浓度0.33 M。将反应在室温混合1小时。此时之后，添加如Micoli等人.Vaccine 2011中先前描述制备的CRM197-ADH，以具有MES 20 mM (pH 6)中的7.8 mg/mL的Vi和蛋白浓度(1的Vi与蛋白w/w比)。将混合物在室温混合2小时。通过HPLC-SEC (TSK凝胶3000 PWXL柱)验证缀合物形成，且在反应混合物中没有观察到残余蛋白。在1.6 cmx60 cm Sephacryl 100 HR柱上通过大小排阻色谱通过未反应的PS分离缀合物。将不含未缀合的片段化的Vi的级分合并在一起并表征。
将纯化的缀合物通过用于总Vi含量的HPAEC-PAD(Micoli等人.Vaccine 2011)、用于总蛋白含量的微BCA、用于测定缀合物的avMW分布和评价游离蛋白和游离糖的量的HPLC-SEC进行表征。对于合并物3和合并物4缀合物，通过Capto Adhere/HPAEC-PAD方法估计游离糖。下表报道实施例5中测试的缀合物的主要特征。
对于实施例1中获得的片段化的Vi合并物4，上述反应条件导致凝胶形成，这可能是因为该群体的较高avMW。对于该特定合并物，用15 mg/mL的Vi浓度、0.1 M的NHS浓度和5的EDAC/Vi重复单元摩尔比进行用EDAC/NHS的活化步骤。相同条件用于与CRM197-ADH的缀合步骤。
通过Capto Adhere/HPAEC-PAD方法测定缀合物中的游离Vi的量
源自500 µL Capto Adhere树脂悬浮液且用20 mM AcONa 30% CH3CN (pH 5)洗涤的沉淀用于样品的处理。向1.3 mL 20 mM NaH2PO4 (pH 7.2)中的缀合物(范围60-150 µg/mL中的总Vi浓度)中添加390 µL CH3CN(所得溶液在此处表示为负载样品)。将一毫升负载样品添加至树脂上，并在旋转轮上在室温孵育30分钟。此时之后，将样品离心(5分钟，在4℃，14000 rpm)，并洗出上清液(表示为流通物)。用1 mL 20 mM AcONa 30% CH3CN (pH 5)洗涤沉淀(溶剂添加至树脂，通过手工混合)(两次)。通过离心回收沉淀(5分钟，在4℃，14000 rpm)。收集的上清液(2 mL总体积)表示为洗涤溶液。向沉淀添加500 µL 1 M AcONa30% CH3CN (pH 5)，通过手工混合，并通过离心分离(5分钟，在4℃，14000 rpm)。将该操作重复六次，合并上清液，表示为剥离溶液(3 mL总体积)。将剥离溶液、洗涤溶液、流通物和0.5 mL负载样品在SpeedVac中干燥，并重构于相同体积的水中。所有样品都通过HPLC-SEC(荧光发射)分析以验证流通物、洗涤和剥离溶液中不存在缀合物。通过HPAEC-PAD测定负载样品和剥离溶液的Vi 含量。
剥离溶液(未缀合的Vi)和负载溶液(总Vi)中的针对稀释度校正的Vi含量的比率代表样品中的游离Vi的％。
通过HPLC-SEC表征缀合物
HPLC-SEC用于在游离蛋白和游离糖方面表征缀合物。在具有TSK凝胶PWXL保护柱(4.0 cmx6.0 mm; 粒径12 µm; 编号808033) (Tosoh Bioscience)的TSK凝胶G3000 PWXL柱(30 cmx7.8 mm; 粒径7 µm; 编号808021)上洗脱所有样品。流动相是0.1 M NaCl, 0.1 MNaH2PO4, 5% CH3CN, pH 7.2，流速为0.5 mL/min(等度方法，持续30分钟)。HPLC-SEC还用于估计缀合物样品中的未缀合蛋白(荧光发射检测)和片段化的Vi(对于合并物1和2)(折射率检测)的量。关于用范围5–50 µg/mL中的蛋白样品构建的校准曲线定量未反应的蛋白的面积。通过将通过HPLC-SEC检测的游离蛋白的量除以通过微BCA在样品中定量的蛋白的总量而计算未缀合的蛋白的百分数。类似地，关于范围20-50 µg/mL中的(相同avMW的)片段化的Vi的校准曲线定量未缀合的片段化的Vi的量。通过将通过HPLC-SEC检测的游离Vi的量除以通过HPAEC-PAD在样品中定量的糖的总量而计算未缀合的糖的百分数。
实施例5
片段化的Vi缀合物(DT和TT作为载体)
使用DT(白喉类毒素)和TT(破伤风类毒素)作为载体蛋白进行Vi合并物3(实施例1中获得)的缀合。如实施例3中所述活化片段化的Vi，并使用实施例3中描述的相同反应条件(1的Vi与蛋白w/w比)，在缀合的步骤中添加DT-ADH或TT-ADH(如CRM197-ADH制备)。通过每蛋白引入的较高数目的ADH接头(针对6个CRM197，分别为12和23.5)表征DT-ADH和TT-ADH。所得缀合物的主要特征报道于下表中。
缀合物 Vi avMW(kDa) 每摩尔蛋白引入的ADH接头的数目 Vi与蛋白比率(w/w) Vi与蛋白摩尔比 %游离Vi %游离CRM<sub>197</sub>
Vifrag-DT P3 52.9 12 0.86 1.01 <20 nd
Vifrag-TT P3 52.9 23.5 0.4 1.16 <6.8 nd
实施例6
小鼠中的体内测试
用具有不同链长的Vi的Vi-CRM197缀合物(如实施例3中获得，下表中的组1至4)，用天然的Vi-CRM197缀合物(下表中的组5)，和用相应的未缀合的Vi多糖(组6至10)免疫十组10周龄的CD1雌性小鼠。下表概述研究设计。在第0和35天给予两次200 µL的皮下注射(各自含有8 µg Vi抗原)，在第14、35和49天采血。注射盐水溶液中的无佐剂的抗原。通过ELISA评估抗-Vi和抗-CRM197应答(如图2中显示)。
组# 抗原名称 Vi avMW (kDa) Vi剂量 (µg) CRM<sub>197</sub>剂量(µg)
1 VifragCRM<sub>197</sub> P1 9.5 8 24.2
2 VifragCRM<sub>197</sub> P2 22.8 8 15.4
3 VifragCRM<sub>197</sub> P3 42.7 8 12.5
4 VifragCRM<sub>197</sub> P4 82.0 8 6.0
5 ViCRM<sub>197</sub> 165.0 8 6.3
6 片段化的Vi合并物1 9.5 8 -
7 片段化的Vi合并物2 22.8 8 -
8 片段化的Vi合并物3 42.7 8 -
9 片段化的Vi合并物4 82.0 8 -
10 天然Vi 165.0 8 -
如图2中可见，在未缀合的Vi(组6-10)间，全长Vi(组10)是唯一能够在第一次注射之后诱导明确的应答的。相应的缀合物(组5)同样如此。天然Vi-CRM197是唯一能够在第一次注射之后已经引起高应答的，第二次注射之后无加强。不同地，对于所有片段化的Vi缀合物(组1-4)，该应答在第一次注射之后低，且在再次注射之后显著更高。
进行随后研究以比较野生型和TCR βδ-/-小鼠中的天然和片段化的Vi-CRM197缀合物(图8)。用具有不同链长的Vi的Vi-CRM197缀合物，用天然的Vi-CRM197缀合物，和用天然的未缀合的Vi多糖免疫十组10周龄的雌性CD1野生型(下表中的组1-5)和T细胞敲除小鼠(下表中的组6-10)。在第0和28天给予两次200 µL的皮下注射(各自含有8 µg Vi抗原)，在第14、28和42天采血。注射盐水溶液中的无佐剂的抗原。通过ELISA评估抗-Vi和抗-CRM197应答(如图8中显示)。
Figure 342930DEST_PATH_IMAGE011
获得的数据证实，在小鼠中，片段化的Vi不能诱导T非依赖性应答，且相应的Vi-CRM197缀合物能够诱导基本上无T非依赖性应答的T依赖性应答。
实施例7 –缀合至不同的载体蛋白的全长和片段化的Vi (fVi)(实施例1中描述的 合并物3)在小鼠中的体内测试
用下表中报道的缀合物免疫六组 8个10周龄的CD1雌性小鼠。
缀合物 缀合的Vi与蛋白摩尔比 总Vi与蛋白w/w比 %游离Vi %游离蛋白
Vi-CRM<sub>197</sub> 0.46 1.37 6.7 nd
Vi-DT 1.11 3.14 6 nd
Vi-TT 0.78 1.27 34.2 nd
fVi-CRM<sub>197</sub> 0.65 0.58 <15 nd
fVi-DT 1.01 0.86 <20 nd
fVi-TT 1.16 0.4 <6.8 nd
nd: 未检测到。
在第0和35天给予两次200 µL的皮下注射(各自含有1 µg Vi抗原)，在第14、35和49天采血。注射盐水溶液中的无佐剂的抗原。通过ELISA评估抗-Vi应答(如图9中显示)。
如图9中可见，对于所天然的Vi缀合物，在第14天观察到高应答，在第二次注射之后无加强。独立于所使用的载体，抗Vi IgG应答在所有全长天然Vi缀合物中是类似的。对于片段化的Vi缀合物，对于CRM197和DT观察到在第二次注射之后抗Vi IgG应答的增加(加强效应)，但对于TT没有观察到，表明缀合至CRM197或DT的片段化的Vi能够诱导基本上无T非依赖性应答的T依赖性免疫应答。在第二次注射之后，不依赖于所使用的载体，抗Vi IgG应答是类似的。

Claims (14)

1.适合于疫苗中使用的缀合物，其包含片段化的Vi多糖和选自CRM197或白喉类毒素的载体蛋白，其中所述片段化的多糖具有40和55 kDa之间的平均分子量。
2.根据权利要求1的缀合物，其中所述片段化的多糖具有41和49 kDa之间的平均分子量。
3.根据权利要求1的缀合物，其中所述片段化的多糖具有51至55 kDa的平均分子量。
4.根据权利要求1至3中任一项的缀合物，其中所述载体蛋白是CRM197。
5.药物组合物，其包含权利要求1至4中任一项的缀合物和药学上可接受的载体。
6.根据权利要求5的药物组合物，其中所述组合物是未佐剂化的。
7.根据权利要求5的药物组合物，其中所述组合物包含佐剂。
8.根据权利要求1至4中任一项的缀合物或权利要求5至7中任一项的药物组合物在制备用于在哺乳动物中预防伤寒的药物中的用途。
9.根据权利要求1至4中任一项的缀合物或权利要求5至7中任一项的药物组合物在制备用于预防由伤寒杆菌介导的疾病的疫苗中的用途。
10.根据权利要求1至4中任一项的缀合物或权利要求5至7中任一项的药物组合物在制备用于在个体中预防伤寒的疫苗中的用途。
11.用于制备包含片段化的Vi多糖和选自CRM197或白喉毒素的载体蛋白的缀合物的方法，其包括以下步骤：
a. 将Vi多糖片段化，以获得具有40至55 kDa的平均分子量的片段化的Vi多糖；
b. 使步骤a中获得的片段化的Vi多糖与碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺在5至6的pH反应，以形成N-羟基琥珀酰亚胺酯；和
c. 使步骤b中获得的N-羟基琥珀酰亚胺酯Vi衍生物与所述载体蛋白反应，以产生缀合物。
12.根据权利要求11的方法，其中所述载体蛋白是CRM197。
13.根据权利要求11或12的方法可获得的适合于疫苗中使用的缀合物。
14.具有40至55kDa的平均分子量的片段化的Vi多糖和选自CRM197或白喉类毒素的载体蛋白在制备缀合物疫苗中的用途。
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