CN102089009A

CN102089009A - 偶联的Vi糖

Info

Publication number: CN102089009A
Application number: CN2009801278952A
Authority: CN
Inventors: F·米可利; P·科斯坦蒂诺; F·伯尔蒂
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics AG
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2008-06-13
Filing date: 2009-06-12
Publication date: 2011-06-08
Anticipated expiration: 2029-06-12
Also published as: EP2303333B1; NZ590089A; ZA201009304B; PT2303333E; AU2009259017B2; HUE025512T2; HRP20150527T1; ES2537019T3; US9475846B2; AU2009259017A1; US20110142876A1; US20130142822A1; PL2303333T3; SI2303333T1; CY1116379T1; WO2009150543A2; BRPI0915517B1; CA2727565A1; GB0810894D0; DK2303333T3

Abstract

采用己二酸二酰肼衍生CRM₁₉₇(白喉毒素的无毒变体)和破伤风类毒素作为载体蛋白，通过碳二亚胺介导的合成反应制备两种Vi偶联物。

Description

偶联的Vi糖

本申请要求2008年6月13日提交的英国专利申请0810894.6的优先权，其全部内容通过引用纳入本文。

技术领域

本发明涉及疫苗，更具体涉及针对伤寒的疫苗。

背景技术

伤寒是一种在全世界很多地方常见的严重疾病。将来自伤寒沙门菌(Salmonella typhi)的纯化荚膜多糖(Vi)用作疫苗，在5-45岁的个体中提供约70％针对伤寒的保护作用。然而，该疫苗不能建立免疫记忆，且在婴儿或幼童中无效[1]。与重组突变的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)胞外蛋白A偶联的Vi偶联疫苗(Vi-rEPA)在年幼儿童中引起加强应答，具有高度有效性[2]。

本发明的目的是提供可在工业规模上使用的生产Vi偶联疫苗的新方法。

发明内容

发明者设计了制备Vi偶联物的新方法，并生产了包含与CRM₁₉₇偶联的Vi的新偶联物。

本发明的第一方面提供制备Vi偶联物的方法。同时将接头如己二酸二酰肼(ADH)和碳二亚胺如1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDAC)加入包含载体蛋白如CRM₁₉₇或破伤风类毒素(TT)的溶液中，以产生衍生化载体蛋白。

可在加入ADH和EDAC前将缓冲液如2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)加入包含所述载体蛋白的溶液中。碳二亚胺与蛋白质的重量比通常是0.1-0.15，因为更高的碳二亚胺/蛋白质比率可导致聚集体形成。

所述载体蛋白衍生化后，通过例如透析或切向流过滤(TFF)去除任何过量的接头(例如ADH)。

同样用碳二亚胺激活Vi，随后将其与衍生化载体蛋白结合。可将各种比率的Vi和碳二亚胺用来激活Vi。可采用1∶1的摩尔比(Vi的COOH基和碳二亚胺的比率)，但为降低未偶联碳二亚胺衍生物(例如脲，如EDU、EDAC偶联的可溶性反应产物N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)脲)的残留量，可采用更高的比率，即摩尔过量的Vi，例如＞1.5∶1，理想为≥3∶1，如3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1或更高。可采用的最高比率为200∶1。这些比率高于参考文献3采用的比率。可在室温下例如约2分钟内激活Vi。

因此，所述方法包括以下步骤：

a)同时将接头、碳二亚胺和载体蛋白结合。

b)使Vi与碳二亚胺反应。

c)使步骤a)的产物与步骤b)的产物反应。

步骤a)和b)可以任何顺序进行。

可在步骤a)后但步骤c)前去除任何过量的接头。

本发明的该方面还提供制备Vi-CRM₁₉₇偶联物的方法，其中Vi与衍生化CRM₁₉₇结合。所述方法包括以下步骤：

a)使Vi与碳二亚胺反应。

b)使步骤a)的产物与衍生化CRM₁₉₇反应。

本发明的该方面还提供制备Vi-CRM₁₉₇偶联物的方法，其包括以下步骤：

a)使活化Vi与衍生化CRM₁₉₇反应。

参考文献3描述了通过以ADH为接头的碳二亚胺介导的合成反应制备Vi与rEPA和牛血清白蛋白(BSA)的偶联物的方法。然而，该方法不包括将rEPA/BSA、ADH和EDAC同时结合。而是在加入EDAC前将rEPA/BSA与ADH结合并混合。

本发明的第二方面提供Vi-CRM₁₉₇偶联物。可通过以上方法制备该偶联物，或可通过其它手段获得。

Vi糖

Vi是伤寒沙门菌(先前本身分类为一个种，现在称为肠道沙门菌(S.enterica)的伤寒血清型(serovar))的荚膜糖。也可在沙门菌的其它血清型(如肠道沙门菌的丙型副伤寒(paratyphi C)血清型或都柏林(dublin)血清型)和其它细菌如柠檬酸杆菌属(Citrobacter)(例如，弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)和杨氏柠檬酸杆菌(C.youngae))中发现Vi。所述Vi多糖是氨基己糖醛酸，C-3位置60-90％乙酰化的α1，4-N-乙酰氨基半乳糖醛酸的线型均聚物[4-9]。Vi上的O-乙酰取代是其引发保护性免疫应答的能力因素[10]。Vi的免疫原性与其O-乙酰化的程度密切相关。部分去-O-乙酰化可略微增加免疫原性，完全去-O-乙酰化会消除Vi的免疫原性[11]。

相对于天然情况下发现的荚膜糖，可化学修饰用于本发明的Vi糖。例如，所述Vi糖可部分去-O-乙酰化、去-N-乙酰化(部分或全部)、N-丙酰化(部分或全部)等。可在偶联之前、期间或之后进行去乙酰化，但优选在偶联前进行。可通过常规试验评价去乙酰化等的效果。

所述Vi糖可水解形成缩短的多糖(例如聚合度(DP)至少为10，例如20、30、40、50、60或更大)或寡糖(例如聚合度为2-10)。相对多糖，优选将寡糖用于疫苗。可通过离子交换色谱或比色试验[12]方便地测定所述平均聚合度。

此外，通过免疫双扩散已发现，果胶在C-2和C-3发生O-乙酰化时与Vi抗原性相同。Vi结构与果胶结构的不同之处在于Vi在C-2发生N-乙酰化、在C-3发生O-乙酰化。与破伤风类毒素偶联的O-乙酰化果胶在小鼠中引发Vi抗体，再注射引发加强应答[13，14]。相应地，可将O-乙酰化果胶用于本发明中取代Vi。然而，Vi偶联物已显示免疫原性显著大于其O-乙酰化果胶类似物，因此优选天然来源的Vi[13]。然而，应理解，提及“Vi”可包括“O-乙酰化果胶”和可能与Vi结构或抗原性相同并能引发识别天然Vi的抗体的任何其它分子。

“Vi”可指Vi多糖(例如聚合度(DP)至少为10，例如20、30、40、50、60或更大)或Vi寡糖(例如聚合度为2-10)，可经化学修饰。寡糖可以是母体多糖解聚和/或水解的结果。

Vi纯化

可通过已知技术纯化荚膜糖，如本文引用的参考文献所述。典型的方法包括碱提取、离心、过滤、RNA酶/DNA酶处理、蛋白酶处理、浓缩、尺寸排阻色谱、超滤、阴离子交换色谱和进一步超滤。

参考文献15公开了一种特别有用的方法，其通过引用纳入本文。

纯化Vi的方法可包括以下步骤：(a)沉淀Vi，之后(b)采用醇如乙醇溶解沉淀的Vi。

沉淀和醇溶解

沉淀可溶性多糖如Vi的很多技术均为本领域已知。优选的方法使用一种或多种阳离子去污剂。所述去污剂优选具有以下通式：

其中：R₁、R₂和R₃相同或不同，各表示烷基或芳基；或R₁和R₂与它们所连接的氮原子一起形成五元或六元饱和杂环，且R₃表示烷基或芳基；或R₁、R₂和R₃与它们所连接的氮原子一起形成五元或六元杂环，氮原子处不饱和，R₄表示烷基或芳基，且X^-表示阴离子。

特别优选用于所述方法的去污剂是四丁基铵盐和十六烷基三甲基铵盐(例如溴化盐)。特别优选溴化十六烷基三甲基铵(“CTAB”)[16]。CTAB也称为十六烷基三甲铵溴化物、西曲溴铵、塞太弗伦(Cetavlon)和塞第迈德(Centimide)。其它去污剂包括海美溴铵和肉豆蔻基三甲基铵盐。

Vi可在培养过程中被释放到培养基中。相应地，沉淀原料通常是离心细菌培养物的上清液或浓缩培养物。可过滤该材料去除混浊。

所述沉淀步骤可对Vi具有选择性，但其通常也会共沉淀其它组分(例如，蛋白质、核酸等)。

可先离心收集沉淀的Vi再溶解。

沉淀后，再溶解Vi(通常以与阳离子去污剂的复合物形式)。优选采用对Vi较具选择性的溶剂，以最大程度减少污染物(例如，蛋白质、核酸等)。已发现乙醇在该方面具有优势，其对CTAB-Vi复合物具有高选择性。也可使用其它低级醇(例如，甲醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、2-甲基-1-丙醇、2-甲基-2-丙醇、二元醇等)。

优选将所述醇加入沉淀Vi中，以使最终醇浓度(以醇和水的总含量计)达到50％-99％(例如，约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或约90％)，优选75％-95％。

可将纯形式的所述醇加入沉淀Vi中，或可将其以用可混溶溶剂(例如水)稀释的形式加入。优选的溶剂混合物是醇∶水混合物，优选比率为约70∶30到约95∶5(例如，75∶25、80∶20、85∶15、90∶10)。

与制备荚膜多糖的常规方法相比，沉淀后进行醇提取的两步法更快速简单。

不同于参考文献17所述的方法，该方法采用阳离子去污剂而非阴离子去污剂。不同于参考文献18的方法，沉淀不需要惰性多孔载体。

此外，不同于现有技术的方法，醇用来对Vi进行再溶解而非沉淀。

溶解多糖的进一步加工

再溶解后，进一步处理Vi以去除污染物，因为在人疫苗生产中即使很少的污染物也是不可接受的。

该处理可包括离心所述溶解的CTAB-Vi复合物，之后通过交换阳离子(例如通过加入钙盐或钠盐)从所得上清液中沉淀Vi，以产生不溶于醇但可溶于水的Vi沉淀。

可通过离心收集该沉淀，进一步用醇洗涤，如果需要，在水性溶液中进行再溶解。

该处理方法还通常包括一个或多个过滤步骤。

可采用深度过滤。这对澄清特别有用。

也可采用活性炭过滤。这可用于去除色素和痕量有机化合物。可重复直至例如OD_275nm＜0.2。

可采用尺寸过滤或超滤。

如果Vi水解，通常对水解产物进行筛分，以去除短链寡糖。可用各种方法如超滤后进行离子交换色谱达到此目的。

然而，本发明不限于纯化自天然来源的糖，可通过其它方法如全合成或部分合成获得所述糖。

偶联物

纯Vi是弱免疫原。因此，为达到保护性功效，可将Vi以Vi-载体偶联物提供给免疫系统。采用偶联于载体蛋白以增强碳水化合物抗原的免疫原性是众所周知的[例如在参考文献19-27等中综述]，特别用于儿科疫苗[28]。如上所述，糖可与载体蛋白或不同载体蛋白的混合物偶联。类似地，载体蛋白可携带糖或不同糖的混合物即多种不同的糖[29]。

本发明提供(i)Vi和(ii)载体蛋白CRM₁₉₇的偶联物。

CRM₁₉₇可直接或通过接头与Vi共价偶联。

可采用任何合适的偶联反应，必要时采用任何合适的接头。通常在偶联前对寡糖进行筛分。在本发明组合物包含解聚糖时，优选在偶联前进行解聚。

优选通过例如CRM₁₉₇中赖氨酸残基或精氨酸残基侧链中的-NH₂基团连接Vi与CRM₁₉₇。也可通过例如半胱氨酸残基侧链中的-SH基团连接CRM₁₉₇。或者，可通过如下所述的接头分子连接Vi与CRM₁₉₇。

通常在偶联前激活或官能化Vi。优选的技术采用碳二亚胺(例如1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDAC))。其它合适的技术采用酰肼、活性酯、降冰片烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDAC、TSTU(也参见参考文献30的引言)。

通常可采用任何已知方法例如参考文献31和32所述的方法通过接头基团连接载体蛋白。有用的连接类型是己二酸接头，其可通过以下方式形成：将游离的-NH₂基团(例如通过氨基化引入Vi)与己二酸(例如利用二酰亚胺激活)偶联，然后将蛋白质偶联到所得的糖-己二酸中间体[23，33，34]。另一种有用的连接类型是羰基接头，其可通过以下方式形成：使修饰Vi的游离羟基与CDI发生反应[35，36]，之后与蛋白质反应形成氨基甲酸酯连接。有用的接头是己二酸二酰肼ADH[37]。可用ADH衍生化所述载体蛋白(例如通过在羧酸侧基偶联碳二亚胺)，随后将其与Vi连接[3](例如再次通过偶联碳二亚胺)。其它接头包括β-丙酰胺基[38]、硝基苯基-乙胺[39]、卤代酰卤[40]、糖苷键[41]、6-氨基己酸[42]、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯(SPDP)[43]、C₄-C₁₂部分[44]等。也可采用碳二亚胺缩合反应[45]。

连接Vi与CRM₁₉₇的一种有用方法包括用胱胺或半胱胺(偶联碳二亚胺)对Vi进行硫醇化和随后与用SPDP衍生化的CRM₁₉₇反应[46]。

另一种有用的方法包括将氨基引入Vi，之后用己二酸二酯(例如己二酸N-羟基琥珀酰亚胺基二酯)进行衍生化并与CRM₁₉₇反应。

可采用双功能接头提供偶联引入Vi的氨基的第一基团和偶联载体(通常偶联载体中的胺)的第二基团。

因此，所述双功能接头中的第一基团能与Vi上的氨基(-NH₂)反应。该反应通常包括氨基氢的亲电取代。所述双功能接头中的第二基团能与载体上的氨基反应。该反应通常也包括氨基的亲电取代。

与Vi和载体蛋白的反应均涉及氨基时，优选采用双功能接头，例如式X-L-X的同型双功能接头，其中：两个X基团彼此相同，可与氨基反应；L是接头中的连接部分。有用的X基团是N-氧琥珀酰亚胺。L可具有式L′-L²-L′，其中L′是羰基。有用的L2基团是具有1-10个碳原子(例如，C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀)的直链烷基，例如-(CH₂)₄-。

其它X基团是与HO-L-OH结合时形成酯的基团，如降冰片烷、对硝基苯甲酸和磺基-N-羟基琥珀酰亚胺。

用于本发明的其它双功能接头包括丙烯酰卤(如丙烯酰氯)和卤代酰卤。

通常向修饰Vi中加入摩尔过量的接头。

优选的载体蛋白是细菌毒素，如白喉或破伤风毒素、其类毒素或突变体。这些常用于偶联疫苗。特别优选CRM₁₉₇白喉毒素突变体[47]。

其他合适的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)外膜蛋白复合物[48]、合成肽[49，50]、热激蛋白[51，52]、百日咳蛋白[53，54]、细胞因子[55]、淋巴因子[55]、激素[55]、生长因子[55]、包含来自各种病原体衍生抗原的多种人CD4⁺T细胞表位的人工蛋白[56]如N19[57]、来自流感嗜血杆菌(H.influenzae)的蛋白D[58-60]、肺炎球菌溶素[61]或其无毒衍生物[62]、肺炎球菌表面蛋白PspA[63]、摄铁蛋白[64]、来自艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[65]、重组铜绿假单胞菌胞外蛋白A(rEPA)[66]等。可采用载体蛋白混合物。单个载体蛋白可携带多个Vi糖[67]。

偶联物可具有过量载体蛋白(w/w)或过量Vi(w/w)，例如比率范围为1∶5-5∶1。载体蛋白过量的偶联物通常具有的比率范围是0.2∶1-0.9∶1如0.5∶1，或重量相等(1∶1)。在一些实施方式中，所述Vi∶蛋白质比率是0.4∶1-1.2∶1。

在所述偶联物形成本发明免疫原性组合物中的Vi组分时，所述组合物也可包含游离的载体蛋白[68]。

偶联物中的Vi部分优选如上定义的低分子量的Vi多糖或寡糖。通常在偶联前对寡糖进行筛分。

所述蛋白质-Vi偶联物优选可溶于水和/或生理缓冲液。

药物组合物

本发明提供包含(a)Vi偶联物和(b)药学上可接受的载体的药物组合物。关于这样的载体的充分讨论见参考文献69。

微生物感染会影响身体的各个部分，因此可将本发明的组合物制备为各种形式。例如，可将所述组合物制备为液体溶液或悬浮液形式的注射剂。也可制备适合在注射前溶解或悬浮于液体运载体的固体形式。可将所述组合物制备为用于局部给药的制剂，例如油膏、乳膏或粉剂。可将所述组合物制备为用于口服的制剂，例如，片剂、胶囊或糖浆(任选调味)。可将所述组合物制备为采用细粉或喷雾的用于肺部给药的制剂，例如吸入剂。可将所述组合物制备为栓剂或阴道栓。可将所述组合物制备为用于鼻、耳或眼部给药的制剂，例如，滴剂、喷雾剂、或粉剂[例如参考文献70]。所述组合物可包含于漱口剂中。所述混合物可经冻干。

所述组合物优选无菌。其优选无热原。优选用缓冲液处理使其处于例如pH 6-pH 8，通常为约pH 7。

本发明的组合物可包含Vi偶联物和盐水。

本发明还提供包含本发明药物组合物的递送装置。所述装置可以是例如注射器或吸入器。

本发明的药物组合物优选免疫原性组合物，其包含免疫有效量的Vi免疫原。“免疫有效量”表示以单剂量或一系列剂量的一部分将该量给予个体能有效进行治疗或预防。该量根据待治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类群(例如，非人灵长类、灵长类等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗组成、治疗医生对医学情况的评价和其它相关因素而变化。预期所述量将落入可通过常规试验测定的较宽范围内。预期糖剂量为1μg-20μg，例如约5μg/剂。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案(例如包括加强剂量)。所述组合物可与其它免疫调节剂联合给药。

一旦配制好，可将本发明组合物直接给予对象。所述待治疗对象可以是动物；具体而言，可治疗人类对象。

本发明免疫原性组合物的使用可以是治疗性(即治疗已有的感染)或预防性(即防止将来的感染)的。

免疫原性组合物可不含佐剂。然而在其它实施方式中，免疫原性组合物可包含佐剂，其可发挥增强在接受所述组合物的患者中引发的免疫应答(体液免疫和/或细胞免疫)的作用。可用于本发明的佐剂包括但不限于：

·含矿物质的组合物，包括钙盐和铝盐(或其混合物)。钙盐包括磷酸钙(例如参考文献71公开的“CAP”颗粒)。铝盐包括氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等，所述盐可采取任何合适形式(例如凝胶、结晶、无定形等)。优选吸附于这些盐。也可将含矿物质的组合物配制为金属盐颗粒[72]。可采用称为氢氧化铝和磷酸铝的佐剂。这些名称是常规名称，但仅为使用方便，因为其均不是出现的实际化合物的准确描述(例如参见参考文献155第9章)。本发明可采用通常用作佐剂的任何“氢氧化物”或“磷酸盐”佐剂。称为“氢氧化铝”的佐剂通常是羟基氧化铝盐，其通常是至少部分结晶的。称为“磷酸铝”的佐剂通常是羟基磷酸铝，还常含有小量硫酸盐(即羟基磷酸硫酸铝)。可通过沉淀获得这些佐剂，沉淀期间的反应条件和浓度影响磷酸根取代所述盐中羟基的程度。本发明可使用氢氧化铝和磷酸铝的混合物。在这种情况下，磷酸铝多于氢氧化铝，例如重量比为至少2∶1，例如，≥5∶1、≥6∶1、≥7∶1、≥8∶1、≥9∶1等。给予患者的组合物中Al⁺⁺⁺的浓度优选小于10mg/ml，例如，≤5mg/ml、≤4mg/ml、≤3mg/ml、≤2mg/ml、≤1mg/ml等。优选范围是0.3-1mg/ml。优选最大值是0.85mg/剂。

·皂苷[参考文献155第22章]是在许多种类植物的树皮、叶、茎干、根甚至花中发现的甾醇糖苷和三萜糖苷的异质群体。已广泛研究了作为佐剂的得自皂皮树(Quillaia saponaria Molina)树皮的皂苷。皂苷也可商品化获自丽花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜)、满天星(Gypsophilla paniculata)(婚纱花)和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂如QS21，以及脂质制剂如ISCOM。QS21以商标Stimulon^TM出售。已采用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已鉴定了用这些技术专门纯化的组分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。优选的皂苷是QS21。制备QS21的方法参见参考文献73。皂苷制剂也可包含甾醇，如胆固醇[74]。皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献155第23章]。ISCOM通常也包含磷脂，如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷均可以用于ISCOM中。ISCOM优选包含QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。参考文献74-76中进一步描述了ISCOM。任选地，ISCOM可不含其它去污剂[77]。开发基于皂苷的佐剂的综述可参见参考文献78和79。

·细菌ADP-核糖基化毒素(例如，大肠杆菌(E.coli)不耐热肠毒素“LT”、霍乱毒素“CT”或百日咳毒素“PT”)及其脱毒衍生物，如称为LT-K63和LT-R72的突变毒素[80]。参考文献81中描述了将脱毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐剂，参考文献82中描述了将其用作胃肠外佐剂。

·生物粘着剂和粘膜粘着剂，如酯化透明质酸微球[83]或壳聚糖及其衍生物[84]。

·微粒(即直径约100nm-约150μm、更优选约200nm-约30μm或约500nm-约10μm的颗粒)由生物可降解的无毒材料(例如聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己内酯等)形成，优选聚(丙交酯-乙交酯共聚物)，并任选经处理而含有带负电荷的表面(例如用SDS处理)或带正电荷的表面(例如用阳离子去污剂，如CTAB处理)。

·脂质体(参考文献155第13和14章)。适合用作佐剂的脂质体制剂的例子见参考文献85-87所述。

·胞壁酰肽，如N-乙酰胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(“thr-MDP”)、N-乙酰基-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(去甲MDP)、N-乙酰葡萄糖胺酰-N-乙酰胞壁酰-L-Al-D-异谷氨酰胺-L-Ala-二棕榈酰丙酰胺(“DTP-DPP”或“Theramide^TM”)和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(“MTP-PE”)。

·聚氧(polyoxidonium)聚合物[88，89]或其它N-氧化的聚乙烯-哌嗪衍生物。

·CD1d配体，如α-糖基神经酰胺[90-97](例如α-半乳糖基神经酰胺)、含植物鞘氨醇的α-糖基神经酰胺、OCH、KRN7000[(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖基)-2-(N-二十六烷酰氨基)-1，3，4-十八烷三醇]、CRONY-101、3″-O-磺基-半乳糖基神经酰胺等。

·γ-菊粉[98]或其衍生物，如藻类菊粉(algammulin)。

·水包油乳液。已知各种这类乳液，其通常包含至少一种油和至少一种表面活性剂，其中一种或多种油和一种或多种表面活性剂是生物可降解(可代谢)和生物相容的。所述乳液中的油滴直径通常小于5μm，甚至可具有亚微米直径，用微流化床实现这些小尺寸以提供稳定乳液。优选尺寸小于220nm的液滴，因为其可进行过滤灭菌。

·免疫刺激性寡核苷酸，如包含CpG基序(包含通过磷酸键与鸟苷残基连接的未甲基化胞嘧啶残基的二核苷酸序列)或CpI基序(包含与肌苷连接的胞嘧啶的二核苷酸序列)的寡核苷酸、双链RNA、含有回文序列的寡核苷酸或含有聚(dG)序列的寡核苷酸。免疫刺激性寡核苷酸可包含核苷酸修饰/类似物，如硫代磷酸酯修饰，可以是双链或(除RNA外)单链。参考文献99、100和101公开了可能的类似取代，例如用2’-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献102-107中进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂作用。CpG序列可导向TLR9，如基序GTCGTT或TTCGTT[108]。CpG序列可特异性诱导Th1免疫应答，如CpG-A ODN(寡脱氧核糖核苷酸)，或更特异地诱导B细胞应答，如CpG-B ODN。参考文献109-111中讨论了CpG-A和CpG-BODN。CpG优选CpG-A ODN。优选在构建CpG寡核苷酸时使其5’末端可被受体识别。任选使两个CpG寡核苷酸序列在3’末端连接以形成“免疫聚体(immunomer)”。参见例如参考文献108和112-114。有用的CpG佐剂是CpG7909，也称为ProMune^TM(科雷制药集团公司(Coley PharmaceuticalGroup，Inc.))。另一个是CpG1826。或者或此外，除使用CpG序列外，可使用TpG序列[115]，这些寡核苷酸可不含未甲基化的CpG基序。所述免疫刺激性寡核苷酸可富含嘧啶。例如，其可包含一个以上连续的胸腺嘧啶核苷酸(例如参考文献115公开的TTTT)，和/或其核苷酸组成中可具有＞25％的胸腺嘧啶(例如，＞35％、＞40％、＞50％、＞60％、＞80％等)。例如，其可包含一个以上连续的胞嘧啶核苷酸(例如参考文献115公开的CCCC)，和/或其核苷酸组成中可具有＞25％的胞嘧啶(例如，＞35％、＞40％、＞50％、＞60％、＞80％等)。这些寡核苷酸可不含未甲基化的CpG基序。免疫刺激性寡核苷酸通常包含至少20个核苷酸。其可包含少于100个核苷酸。

基于免疫刺激性寡核苷酸的特别有用的佐剂称为IC31^TM[116]。因此，本发明使用的佐剂可包含以下的混合物：(i)包含至少一个(优选多个)CpI基序的寡核苷酸(例如15-40个核苷酸)，和(ii)聚阳离子聚合物，如包含至少一个(优选多个)Lys-Arg-Lys三肽序列的寡肽(例如5-20个氨基酸)。所述寡核苷酸可以是包含26聚体序列5′-(IC)₁₃-3′的脱氧核苷酸。所述聚阳离子聚合物可以是包含11聚体氨基酸Lys-Leu-Lys-Leu5-Lys-Leu-Lys的肽。

·3-O-脱酰化单磷酰脂质A(“3dMPL”，也称为“MPL^TM”)[117-120]。在水性条件下，3dMPL可形成不同大小如直径＜150nm或＞500nm的胶束聚集体或颗粒。这些中的一种或两种可用于本发明，可通过常规试验选择较好的颗粒。本发明优选使用较小的颗粒(例如小到足以产生澄清的3dMPL水性悬液)，因为其具有优良的活性[121]。优选颗粒的平均直径小于220nm，更优选小于200nm、小于150nm或小于120nm，甚至平均直径小于100nm。然而在大多数情况下，所述平均直径不小于50nm。

·甲基肌苷5′-单磷酸酯(“MIMP”)[122]。

·多羟基化吡咯双烷类化合物[123]，如具有下式的化合物或其药学上可接受的盐或衍生物：

其中，R选自氢、直链或支链、未取代或取代、饱和或不饱和的酰基、烷基(例如环烷基)、烯基、炔基和芳基。例子包括但不限于：木麻黄(casuarine)、木麻黄-6-α-D-吡喃葡萄糖、3-表-木麻黄、7-表-木麻黄、3，7-二表-木麻黄等。

·咪唑喹啉化合物，如咪喹莫德(Imiquimod)(“R-837”)[124，125]、瑞喹莫德(Resiquimod)(“R-848”)[126]及其类似物和盐(例如盐酸盐)。有关免疫刺激性咪唑喹啉的其它细节可参见参考文献127-131。

·缩氨基硫脲化合物，如参考文献132公开的化合物。参考文献132中还描述了配制、制备和筛选活性化合物的方法。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子如TNF-α方面特别有效。

·色胺酮化合物，如参考文献133公开的化合物。参考文献133中还描述了配制、制备和筛选活性化合物的方法。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子如TNF-α方面特别有效。

·核苷类似物，如：(a)艾沙托立宾(Isatorabine)(ANA-245，7-硫杂-8-氧鸟苷)及其前药：

；(b)ANA975；(c)ANA-025-1；(d)ANA380；(e)参考文献134-136公开的化合物；(f)洛索立宾(Loxoribine)(7-烯丙基-8-氧代鸟苷)[137]。

·参考文献138公开的化合物，包括：酰基哌嗪化合物、吲哚二酮化合物、四氢异喹啉(THIQ)化合物、苯并环二酮化合物、氨基氮杂乙烯基(Aminoazavinyl)化合物、氨基苯并咪唑喹啉酮(ABIQ)化合物[139，140]、水合酞酰胺(hydrapthalamide)化合物、二苯甲酮化合物、异噁唑化合物、固醇化合物、喹唑酮(quinazilinone)化合物、吡咯化合物[141]、蒽醌化合物、喹喔啉化合物、三嗪化合物、吡唑并嘧啶化合物和吲哚化合物[142]。

·氨烷基氨基葡糖苷磷酸酯衍生物，如RC529[143，144]。

·磷腈，如例如参考文献145和146中所述的聚[二(羧基苯氧基)磷腈](poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene])(“PCPP”)。

·式I、II或III的化合物或其盐：

如参考文献147所定义，如“ER 803058”、“ER 803732”、“ER 804053”、“ER 804058”、“ER 804059”、“ER 804442”、“ER 804680”、“ER804764”、“ER 803022”或“ER 804057”，例如：

·大肠杆菌(Escherichia coli)脂质A的衍生物，如OM-174(如参考文献148和149所述)。

·包含与含磷酸无环主链连接的脂质的化合物，如TLR4拮抗剂E5564[150，151]：

参考文献155和156中更详细地讨论了这些和其它佐剂活性物质。组合物中的抗原和佐剂通常形成掺合物。

组合物可包含两种或多种所述佐剂。例如，其可有利地同时包含水包油乳液和3dMPL等。

可用于本发明的特定水包油乳液佐剂包括但不限于：

·角鲨烯、吐温80和司盘85的亚微米乳液。所述乳液的体积组成可以是约5％角鲨烯、约0.5％聚山梨酯80和约0.5％司盘85。以重量计，这些比例为4.3％角鲨烯、0.5％聚山梨酯80和0.48％司盘85。该佐剂称为“MF59”[152-154]，更详细的描述见参考文献155第10章和参考文献156第12章。所述MF59乳液宜包含柠檬酸根离子，例如10mM柠檬酸钠缓冲液。

·角鲨烯、生育酚和吐温80的乳液。所述乳液可包含磷酸盐缓冲盐水。其还可包含司盘85(例如1％)和/或卵磷脂。这些乳液可含有2-10％角鲨烯、2-10％生育酚和0.3-3％吐温80，角鲨烯∶生育酚的重量比优选≤1，因为这可提供更稳定的乳液。角鲨烯和吐温80的体积比可为约5∶2。可通过以下方法制备一种这样的乳液：将吐温80溶解于PBS产生2％溶液，然后将90ml该溶液与5g DL-α-生育酚和5ml角鲨烯的混合物混合，然后使该混合物微流体化。所得乳液可含有例如平均直径为100-250nm、优选约180nm的亚微米油滴。

·角鲨烯、生育酚和曲通(Triton)去污剂(例如曲通X-100)的乳液。所述乳液还可包含3d-MPL(见下)。所述乳液可包含磷酸盐缓冲液。

·包含聚山梨酯(例如聚山梨酯80)、曲通去污剂(例如曲通X-100)和生育酚(如琥珀酸α-生育酚酯)的乳液。所述乳液包含这三种组分的质量比可为约75∶11∶10(例如750μg/ml聚山梨酯80、110μg/ml曲通X-100和100μg/ml琥珀酸α-生育酚酯)，这些浓度应包括抗原中这些组分的任何贡献。所述乳液还可包含角鲨烯。

所述乳液还可包含3d-MPL(见下)。所述水相可包含磷酸盐缓冲液。

·角鲨烯、聚山梨酯80和泊洛沙姆401(“Pluronic^TM L121”)的乳液。可以用pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水配制所述乳液。该乳液是胞壁酰二肽的有用的递送载体，已与苏氨酰-MDP一起用于“SAF-I”佐剂[157](0.05-1％Thr-MDP、5％角鲨烯、2.5％普流罗尼克(Pluronic)L121和0.2％聚山梨酸酯80)。也可不与Thr-MDP一起使用，如“AF”佐剂[158](5％角鲨烯、1.25％普流罗尼克L121和0.2％聚山梨酸酯80)。优选微流体化。

·含有0.5-50％油、0.1-10％磷脂和0.05-5％非离子表面活性剂的乳液。如参考文献159所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴尺寸。

·不可代谢油(如轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(如卵磷脂、吐温80或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包含添加剂，如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂性偶联物(如通过葡糖醛酸的羧基将脂族胺加入去酰基皂苷产生的GPI-0100，如参考文献160所述)、溴化二甲基二十八烷基铵和/或N，N-二十八烷基-N，N-双(2-羟乙基)丙二胺。

·皂苷(例如QuilA或QS21)和固醇(例如胆固醇)结合成螺旋胶束的乳液[161]。

医学治疗和应用

本发明还提供用于医学例如用于在哺乳动物中引起抗体应答的本发明Vi偶联物。

本发明还提供在哺乳动物中引起抗体反应的方法，包括将本发明的Vi偶联物或药物组合物给予所述哺乳动物。

本发明还提供本发明的Vi偶联物在制备用于预防或治疗哺乳动物的伤寒的药物中的应用。

这些方法和应用引起的免疫应答通常包括抗体应答，优选保护性抗体应答。评价糖免疫后抗体应答的方法为本领域熟知。所述抗体应答优选IgA或IgG应答。所述免疫应答可以是预防性和/或治疗性的。所述哺乳动物优选人。

通常直接给予患者本发明的组合物。可通过胃肠外注射(例如，皮下、静脉内、肌内或给予到组织间隙)，或通过直肠、口服、阴道、局部、透皮、真皮内、眼部、鼻部、耳部或肺部给药完成直接递送。优选注射或鼻内给药。

本发明可用来引发全身和/或粘膜免疫。

本发明制备的疫苗可用来治疗儿童(包括婴儿)和成年人。因此，对象可小于1岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。接受所述疫苗的优选对象是年幼对象(例如≤5岁)。然而所述疫苗不仅适用于这些人群，可用于更广泛的人群。

可通过单剂量方案或多剂量方案进行治疗。多剂量可以用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可通过相同或不同途径给予各种剂量，例如采用胃肠外初次免疫和粘膜加强免疫、粘膜初次免疫和胃肠外加强免疫等。给予一个以上剂量(通常两个剂量)对免疫原初(immunological naive)患者特别有用。一般以至少1周(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周等)的间隔给予多个剂量。示例性方案在6周龄时提供第一剂量，10周龄时提供第二剂量，以与现存的婴儿免疫一致(与EPI疫苗联合给药)。该初次免疫方案之后，在儿童周岁生日后实施加强剂量。

本发明的偶联物可与非Vi抗原组合在单个组合物中以便对多种病原体同时免疫。作为制备联合疫苗的替代方法，可在与其它疫苗基本相同的时间(例如在向健康护理专业人员或疫苗接种中心的同一次医疗咨询或就诊期间)将偶联物给予患者。用于这些联合疫苗或伴随给药的抗原包括例如，来自无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和/或铜绿假单胞菌、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、脑膜炎奈瑟球菌(如血清群(serogroup)A、C、W135和/或Y的糖或偶联糖)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(如糖或偶联糖)等的免疫原。

在一个实施方式中，组合物可包含结合甲型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi A)抗原如H或O抗原(例如O:2糖抗原)的本发明Vi偶联物，以提供二价伤寒疫苗。在另一个实施方式中，组合物可包含结合鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)抗原如H或O抗原(例如O:9糖)的本发明Vi偶联物。在另一个实施方式中，组合物可包含结合肠炎伤寒沙门菌(Salmonella enteritidis)抗原如H或O抗原(例如O:4，5糖)的本发明Vi偶联物。

定义

术语“包含”包括“含有”以及“由……组成”，例如“包含”X的组合物可仅由X组成或可含有其它物质，例如X+Y。

词语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。在必要时，词语“基本上”可从本发明的定义中省略。

与数值x相关的术语“约”是任选的，其表示例如x±10％。

将动物(特别是牛)材料用于培养细胞时，其应获自未患传染性海绵状脑病(TSE)，特别是未患牛海绵状脑病(BSE)的来源。总之，优选在完全不含动物来源材料的情况下培养细胞。

在将化合物作为组合物的一部分给予人体时，该化合物可被合适的前药所替代。

附图简述

图1显示伤寒沙门菌Vi(α1，4-N-乙酰氨基半乳糖醛酸)的结构式。

图2显示制备衍生化蛋白质的反应方案。

图3显示对CRM₁₉₇和用ADH衍生化的CRM₁₉₇的SEC分析。

图4显示对用ADH衍生化的破伤风类毒素的SEC分析。

图5显示SDS凝胶电泳图谱，从左到右依次为TT、TT_ADH、CRM和CRM_ADH。

图6显示制备Vi-蛋白质偶联物的反应方案。

图7和图8显示Vi和破伤风类毒素在聚丙烯酰胺葡聚糖(Sephacryl)S-1000上的凝胶过滤分布。

图9显示“合并物1”的凝胶过滤分布，图10显示“合并物2”的分布。

图11显示对Vi-TT_ADH的SEC分析。

图12显示透析后Vi-CRM_ADH反应混合物的SDS凝胶电泳分布(3-8％凝胶)。泳道2是CRM_ADH(5μg)，泳道3-5分别是10μl批次04-06的透析后反应混合物。

图13显示在聚丙烯酰胺葡聚糖S-1000上纯化批次06。

图14显示SDS-PAGE分布(3-8％凝胶)：“2”-3μg CRM_ADH，“3”-10μl反应混合物和批次06纯化的组分1-11和12-22。

图15-17显示比较获自批次04-06的合并物1、获自批次04-06的合并物2和获自批次06的合并物1和2的SEC分析。

图18显示抗Vi抗体的平均值。图18A和18B显示来自不同批次偶联物的数据，但各批次中的对照组相同。在18A和18B中从左到右依次为：PBS、Vi、Vi+CRM₁₉₇、Vi+TT、Vi-CRM₁₉₇、Vi-TT、含明矾的Vi-CRM₁₉₇、含明矾的Vi-TT和含CFA+IFA的Vi-CRM₁₉₇。

实施本发明的方式

Vi纯化

用100K膜将改进LB培养基中的5L弗氏柠檬酸杆菌WR7001样品的上清液浓缩(20倍)到250ml。用1M(2.5L)NaCl、然后用水(1.5L)并再次使用100K膜渗滤所述样品，弃去渗透物。采用0.22μm过滤器去除混浊。随后加入0.9％CTAB以形成Vi-CTAB沉淀。在18000g下离心15分钟，弃去上清液。

将沉淀悬浮在乙醇(96％，110ml)中，室温下混合过夜，随后在18000g下离心50分钟，之后弃去所得沉淀。向所述上清液中加入0.1M NaCl以形成凝胶，将其在18000g下离心10分钟。收集沉淀，用乙醇洗涤，然后溶于水性NaCl(1M，50ml)中并过滤。将渗余物加入80％乙醇中，在18000g下离心10分钟。再次用乙醇洗涤所述沉淀。所述沉淀的一部分留在悬浮液(批次A)中。分别收集批次A(97mg)和批次B(170mg)两部分。

在改良方法中，用100K膜将所述上清液浓缩到8.0-10.0g/L。用1MNaCl、Tris 0.1M、EDTA 0.02M pH 7.3(2.5L)，然后用水(2.5L)并再次使用100K膜渗滤所述样品，弃去渗透物。随后加入2.0％CTAB以形成Vi-CTAB沉淀。将所述沉淀在18,000g下离心15分钟，弃去上清液。然后用水洗涤所述沉淀，离心并重悬于乙醇(85％)中，混合直到完全溶解。使所述溶液通过SP10和炭过滤器。用0.2M NaCl沉淀滤液，在18000g下离心5分钟。将沉淀重悬于1.0M NaCl中以使浓度达到3-5mg/mL。用水和0.22μM过滤器渗滤该溶液。

所述纯化方法产率良好，提供纯度优良(蛋白质少于0.5％，核酸少于0.01％)的糖，该方法足够温和从而能保持高水平的O-乙酰化。

破伤风类毒素衍生化

向破伤风类毒素(溶于50-100mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液，pH 6.18-6.20)中加入ADH(3.25/mg蛋白质)和盐酸1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDAC)(EDAC/蛋白质＝0.152w/w)。在室温下反应1小时。

用0.2M NaCl、5mM MES缓冲液pH 7.05、2-8℃下和5mM MES缓冲液pH 7.00、2-8℃下透析所述反应混合物。获得衍生化破伤风类毒素(产率86％)。

CRM₁₉₇衍生化

向CRM₁₉₇(11.5mg/ml，溶于50-100mM、pH 6.0的MES缓冲液)中加入ADH(3.5mg/mg蛋白质)和EDAC(EDAC/蛋白质＝0.15w/w)。在室温、pH 6.0-6.2下反应1小时。将pH保持在该范围内防止蛋白质沉淀。

用5mM MES缓冲液、0.2M NaCl pH 7.0、然后用5mM MES缓冲液pH 7.0、4℃下对所述反应混合物透析过夜。通过微量BCA分析测定蛋白质(产率75-85％)。向产物中加入10％(w/v)蔗糖，置于-20℃下储存。可将其储存在pH 7.0的5mM MES中而不使用蔗糖。

衍生化蛋白质的鉴定

通过比色法(TNBS法)验证用ADH对蛋白质进行的衍生化。

通过MS Maldi-Tof测定ADH和TT的摩尔比约为11。

通过MS Q-Tof测定ADH和CRM₁₉₇的摩尔比。这显示以存在不同数目的连接蛋白质的接头(3-10个，主要产物含6个连接接头)为特征的若干产物的形成。

采用3-8％tris-乙酸盐凝胶(NuPAGE)通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测所述衍生化蛋白质(随后检测所述偶联物)。向0.5M(1/5v/v)DTT和NuPAGE LDS样品缓冲液(1/5v/v)中加入样品(5-20μl，使蛋白质含量达到5μg)。在100℃加热所述混合物1分钟，将所述样品加入孔中。使所述凝胶在30mA、Tris-乙酸盐SDS运行缓冲液(英杰公司(Invitrogen))中进行电泳。最后用简单蓝色安全染料(Simply Blue Safe Stain)(英杰公司)对其染色。

发现衍生化蛋白质的SDS-PAGE图谱和SEC分布(214nm，TSK凝胶4000；100mM磷酸盐缓冲液+100mM NaCl+5％CH₃CN，pH 7.0)与天然蛋白质的相似(参见图3-5)。

Vi与衍生化破伤风类毒素的偶联

在pH 6.08的缓冲溶液中，将EDAC(4.4mg)加入Vi(4.6mg)，使其在室温下反应2分钟。

室温下，在pH 7.0的缓冲溶液(1.5ml 5mM MES缓冲液)中，衍生化破伤风类毒素(9.2mg)与活化Vi反应3小时([TT_ADH]＝3.15mg ml^-1，[Vi]＝1.53mg ml^-1，TT_ADH/Vi比率(w)＝2，[EDAC]＝1.5mg ml^-1)。

用0.2M NaCl、10mM磷酸盐缓冲液pH 7.07、4℃下透析所述反应混合物，通过聚丙烯酰胺葡聚糖S-1000(1.5x90cm)用10mM磷酸盐缓冲液、200mM NaCl pH 7.00下对其进行纯化。

在偶联物纯化过程中，收集两种分子量不同的不同合并物(参见图7)。Vi和TT在聚丙烯酰胺葡聚糖S-1000上的凝胶过滤分布显示见图7和图8：

·从游离蛋白质纯化偶联物是可行的(合并物1)。

·从游离糖纯化偶联物是不可行的(合并物2-游离Vi与偶联物的共洗脱液)。

因此，合并物1包含的游离Vi应少于合并物2。

图9显示未偶联蛋白质在聚丙烯酰胺葡聚糖S-1000(1.6x90cm)上的分布，使用10mM磷酸盐、200mM NaCl，pH 7，流速为0.2ml/分钟。图10显示游离Vi在聚丙烯酰胺葡聚糖S-1000(相同条件)上的分布。

用pH 7.0的2mM磷酸盐缓冲液透析合并物1和2，其含量如下：

通过SEC分析表征所述偶联物(参见图11，214nm，TSK凝胶6000；100mM磷酸盐缓冲液+100mM NaCl+5％CH₃CN，pH 7.0)：

·PSVi-TT_ADH合并物1：多糖26.8μg/ml，蛋白质64.64μg/ml

·PSVi-TT_ADH合并物2：多糖82.8μg/ml，蛋白质123.68μg/ml

·PSVi：1.4mg/ml

·TT_ADH：0.1mg/ml

Vi与衍生化CRM₁₉₇的偶联

如下制备三个不同批次(“04”、“05”和“06”)的Vi-CRM_ADH：

在pH 6.0的缓冲溶液(1.65ml 20mM MES缓冲液)中，将EDAC(4.4mg)加入Vi(4.6mg，EDAC∶Vi摩尔比约为1.43∶1)中，室温下混合2分钟。(在随后的实验中，为进行比较，减少EDAC的量，采用5∶l和9∶1的摩尔比。用这些衍生化糖获得的CRM₁₉₇偶联物具有更好的可表征性和重复性，未偶联的CRM-ADH＜5％。比率5∶1好于1.4∶1，比率9∶1好于5∶1)。

在pH 7.0的缓冲溶液(1.085ml 5mM MES缓冲液)中，衍生化CRM₁₉₇(9.2mg)与活化Vi在室温下反应3小时(([CRM_ADH]＝3.07mg ml^-1，[Vi]＝1.53mg ml^-1，CRM_ADH/Vi比率(w)＝2，[EDAC]＝1.47mg ml^-1)，在此过程中采用MES缓冲液将pH保持在6.0-6.20以避免沉淀。

如上所述，将CRM_ADH加入pH 7的5mM MES缓冲液。必须使最终混合物处于pH 6.0、不低于50-60mM的MES缓冲液，以使pH在反应本身过程中保持恒定。

用聚丙烯酰胺葡聚糖S-1000柱(1.5x 90cm)、10mM磷酸钠缓冲液、200mM NaCl在pH 7、4℃下纯化所述反应混合物。

作为替代的纯化手段，可如下所述通过切向超滤(100K或300K膜)从偶联物中去除CRM_ADH：用pH 7.2的10mM磷酸盐缓冲液将反应混合物从15ml稀释到50ml；膜：维瓦弗勒(Vivaflow)200cm²100K(再生纤维素)；P_进：1.2-1.3巴；P_出：0.4巴；流速：22.4ml/分钟；渗透物体积：1.4L；(28个循环，用pH 7.2的10mM磷酸盐缓冲液)；最终渗余物体积为152ml。

通过微量BCA(蛋白质含量)、吖啶橙滴定和NMR/HPAEC-PAD(糖含量)、¹H NMR(O-乙酰化水平和EDAC衍生物定量)、HPLC和SDS-PAGE表征所述偶联物。

图13显示在聚丙烯酰胺葡聚糖S-1000(聚丙烯酰胺葡聚糖S-10001.6cmx90cm；流速：0.2ml/分钟；洗脱剂：200mM NaCl，10mM NaH₂PO₄，pH 7.0)上纯化批次06。收集以分子量区分的两个不同合并物中各批次的组分(就批次06而言为1-11和12-22)。第一合并物(早期组分)经纯化不含游离糖，而第二合并物包含未确定量的游离糖。

用pH 7.5的2mM NaH₂PO₄在4℃下透析所述合并物过夜，含量为：

图15-17显示这些合并物的比较SEC分析(TSK凝胶6000PW(托索哈斯公司(TosoHaas))分析柱(7.5mmx30.0cm)，洗脱剂：100mM NaCl，100mM NaH₂PO₄，5％CH₃CN，pH 7.2；流速：0.5mL/分钟；V₀：约13.5分钟-V₁：约27.8分钟)。

所述偶联物进行无菌过滤(0.22μm)，分装并储存在-80℃(4℃)下。

体内活性的测定

使用的抗原

使用在之前实施例中制备的Vi-TT偶联物。采用与VJ-CRM_ADH批次04-06基本相同的条件制备VJ-CRM_ADH批次03。也采用与VJ-CRM_ADH批次04-06基本相同的条件制备Vi-CRM_ADH批次01，但不同之处在于比率CRM_ADH/Vi(w)等于1。用Vi-rEPA免疫的超免疫小鼠血清获自NIH。

偶联物特征

研究设计

a：佐剂为明矾的偶联物

b：初次免疫的佐剂是CFA，第2次和第3次免疫的佐剂是IFA

免疫

将Balb/c雌性小鼠分为14组，每组8只，用2.5μg Vi、Vi-偶联物或Vi和ADH-衍生化载体蛋白的物理混合物进行皮下免疫。仅第13和14组接受10μg的免疫剂量。

每两周给予三次注射，每次200μl，各次免疫后采血两周。

第9-12组接受的佐剂是明矾，第13和14组的佐剂是完全弗氏佐剂(CFA，初次注射)和不完全弗氏佐剂(IFA，第2次和第3次注射)。

ELISA法

用碳酸盐缓冲液(0.05M，pH 9.6)配制的100μl lμg/ml Vi包被96孔ELISA板(马克西索普(Maxisorp)，能肯公司(Nunc))的孔，置于4℃过夜。用于包被的Vi纯化自弗氏柠檬酸杆菌WR7011。第二天上午，用PBS-吐温20(PBST，0.05％)配制的5％脱脂牛奶以200μl/孔在室温(RT)封闭所述孔板1小时。用PBST洗涤后，将100μl/孔的小鼠血清(以1∶200稀释于含0.1％BSA的PBST)在RT下培育2小时。再经过三次洗涤后，将100μl/孔偶联碱性磷酸酶的山羊抗小鼠IgG第二抗体(西格玛(Sigma)A3438，用0.1％BSA的PBST作1∶10000稀释)在RT下培育1小时。将碱性磷酸酶底物(p-NPP，西格玛N2765)溶于二乙醇胺缓冲液(1M，pH 9.8)，再次洗涤后在RT下培育1小时。采用ELISA读数计在405和490nm对孔板读数。通过将490nm扣除至405nm的值获得用于测定抗体单位的吸光度值。在希尔图分析后，相对于超免疫小鼠抗Vi标准血清表示抗体单位。

将用Vi-rEPA免疫的超免疫小鼠血清用作内部阳性对照。

各小鼠血清一式三份用于三个不同的ELISA板上，数据以算术平均值和标准误差表示。一个抗体单位定义为在标准ELISA中光密度等于1的标准血清稀释度的倒数。

第1、2、3、5、6、9、10、13、14组的抗CRM抗体值

所有组别中的抗Vi抗体值

结果见图18。

本领域技术人员明白本发明的各种改进和变动而不背离本发明的范围和构思。虽然已结合具体的优选实施方式描述了本发明，但应理解，权利要求不应过分地受限于这些具体实施方式。实际上，本领域技术人员理解的用来实施本发明的所述方式的各种改进都在权利要求的范围内。

参考文献

[1]Guzman等(2006)Vaccine 24(18)：3804-11.

[2]Canh等(2004)Infect Immun.72(11)：6586-8.

[3]Kossaczka等(1997)Infect Immun 65(6)：2088-93.

[4]Clark等(1958)J Biol Chem 230：81-89.

[5]Heyns等(1967)Carbohydr Res 3：340-353.

[6]Heyns等(1959)Chem Ber 92：2435-2438.

[7]Webster等(1954)Arch Biochem Biophys 50：223-224.

[8]Webster等(1954)J Immunol 73：16-22.

[9]Whiteside等(1961)J Immunol 86：538-542.

[10]Kao等(2004)Vaccine 22：335-344.

[11]Szu等(1991)Infect Immun 59(12)：4555-61.

[12]Ravenscroft等(1999)Vaccine 17：2802-2816.

[13]Szu等(1994)Infect Immun 62(12)：5545-9.

[14]WO 96/011709.

[15]US-A-2005/0106181.

[16]Inzana(1987)Infect.Immun.55：1573-1579.

[17]WO98/32873.

[18]欧洲专利0072513.

[19]Lindberg(1999)Vaccine 17增刊2：S28-36

[20]Buttery和Moxon(2000)J R Coll Physicians Lond 34：163-8

[21]Ahmad和Chapnick(1999)Infect Dis Clin North Am 13：113-33，vii

[22]Goldblatt(1998)J.Med.Microbiol.47：563-567

[23]EP-B-O 477508

[24]美国专利5,306,492

[25]WO98/42721

[26]Dick等刊于《偶联疫苗》(Conjugate Vaccines)(Cruse等编)卡尔格出版公司(Karger)，巴塞尔，1989，第10卷，48-114

[27]Hermanson《生物偶联技术》(Bioconjugate Techniques)，学术出版社，加州圣迭戈(1996)

[28]Ramsay等(2001)Lancet 357(9251)：195-6

[29]WO99/42130

[30]WO98/42721

[31]美国专利4,882,317

[32]美国专利4,695,624

[33]MoI.Immunol，1985，22，907-919

[34]EP-A-0208375

[35]Bethell G.S.等，J.Biol Chem.，1979，254，2572-4

[36]Hearn M.T.W.，J.Chromatogr.，1981，218，509-18

[37]美国专利4,965,338

[38]WO00/10599.

[39]Gever等，Med.Microbiol.Immunol，165：171-288(1979).

[40]美国专利4,057,685.

[41]美国专利4,673,574；4,761,283；4,808,700.

[42]美国专利4,459,286.

[43]美国专利5,204,098

[44]美国专利4,663,160.

[45]WO2007/000343.

[46]Szu等(1987)J Exp Med 1166(5)：1510-24.

[47]研究披露(Research Disclosure)，453077(2002年1月)

[48]EP-A-0372501.

[49]EP-A-0378881.

[50]EP-A-0427347.

[51]WO93/17712

[52]WO94/03208.

[53]WO98/58668.

[54]EP-A-0471177.

[55]WO91/01146

[56]Falugi等(2001)Eur J Immunol 31：3816-3824.

[57]Baraldo等(2004)Infect Immun 72(8)：4884-7.

[58]EP-A-0594610.

[59]Ruan等(1990)J Immunol145：3379-3384.

[60]WO00/56360.

[61]Kuo等(1995)Infect Immun 63：2706-13.

[62]Michon等(1998)Vaccine.16：1732-41.

[63]WO02/091998.

[64]WO01/72337

[65]WO00/61761.

[66]WO00/33882

[67]WO99/42130

[68]WO96/40242

[69]Gennaro(2000)《莱明顿：药学科学与实践》(Remington：TheScience and Practice of Pharmacy.)第20版，ISBN：0683306472.

[70]Almeida和Alpar(1996)J.Drug Targeting 3：455-467.

[71]美国专利6355271.

[72]WO00/23105.

[73]US 5,057,540.

[74]WO96/33739.

[75]EP-A-0109942.

[76]WO96/11711.

[77]WO00/07621.

[78]Barr等(1998)Advanced Drug Delivery Reviews 32：247-271.

[79]Sjolanderet等(1998)Advanced Drug Delivery Reviews 32：321-338.

[80]Pizza等(2000)Int J Med Microbiol290：455-461.

[81]WO95/17211.

[82]WO98/42375.

[83]Singh等(2001)J Cont Release 70：267-276.

[84]WO99/27960.

[85]US 6,090,406

[86]US 5,916,588

[87]EP-A-0626169.

[88]Dyakonova等(2004)Int Immunopharmacol4(13)：1615-23.

[89]FR-2859633.

[90]De Libero等，Nature Reviews Immunology，2005，5：485-496

[91]美国专利5,936,076.

[92]Oki等，J.Clin.Investig.，113：1631-1640

[93]US2005/0192248

[94]Yang等，Angew.Chem.Int.Ed，2004，43：3818-3822

[95]WO2005/102049

[96]Goff等，J.Am.Chem.，Soc，2004，126：13602-13603

[97]WO03/105769

[98]Cooper(1995)Pharm Biotechnol 6：559-80.

[99]Kandimalla等(2003)Nucleic Acids Research 31：2393-2400.

[100]WO02/26757.

[101]WO99/62923.

[102]Krieg(2003)Nature Medicine 9：831-835.

[103]McCluskie等(2002)FEMS Immunology and MedicalMicrobiology 32：179-185.

[104]WO98/40100.

[105]美国专利6,207,646.

[106]美国专利6,239,116.

[107]美国专利6,429,199.

[108]Kandimalla等(2003)Biochemical Society Transactions 31(第3部分)：654-658.

[109]Blackwell等(2003)J Immunol 170：4061-4068.

[110]Krieg(2002)Trends Immunol 23：64-65.

[111]WO01/95935.

[112]Kandimalla等(2003)BBRC 306：948-953.

[113]Bhagat等(2003)BBRC 300：853-861.

[114]WO03/035836.

[115]WO01/22972.

[116]Schellack等(2006)Vaccine 24：5461-72.

[117]Myers等(1990)《内毒素反应的细胞和分子方面》(Cellular and molecular aspects of endotoxin reactions)第145-156页.

[118]Ulrich(2000)参考文献156第16章(第273-282页).

[119]Johnson等(1999)J Med Chem 42：4640-9.

[120]Baldrick等(2002)Regulatory Toxicol Pharmacol 35：398-413.

[121]WO 94/21292.

[122]Signorelli和Hadden(2003)Int Immunopharmacol 3(8)：1177-86.

[123]WO2004/064715.

[124]US 4,680,338.

[125]US 4,988,815.

[126]WO92/15582.

[127]Stanley(2002)Clin Exp Dermatol 27：571-577.

[128]Wu等(2004)Antiviral Res.64(2)：79-83.

[129]Vasilakos等(2000)Cell Immunol.204(1)：64-74.

[130]美国专利4689338，4929624，5238944，5266575，5268376，5346905，5352784，5389640，5395937，5482936，5494916，5525612，6083505，6440992，6627640，6656938，6660735，6660747，6664260，6664264，6664265，6667312，6670372，6677347，6677348，6677349，6683088，6703402，6743920，6800624，6809203，6888000和6924293.

[131]Jones(2003)Curr Opin Investig Drugs 4：214-218.

[132]WO2004/060308.

[133]WO2004/064759.

[134]US 6,924,271.

[135]US2005/0070556.

[136]US 5,658,731.

[137]美国专利5,011,828.

[138]WO2004/87153.

[139]US 6,605,617.

[140]WO02/18383.

[141]WO2004/018455.

[142]WO03/082272.

[143]Johnson等(1999)Bioorg Med Chem Lett 9：2273-2278.

[144]Evans等(2003)Expert Rev Vaccines 2：219-229.

[145]Andrianov等(1998)Biomaterials 19：109-115.

[146]Payne等(1998)Adv Drug Delivery Review 31：185-196.

[147]WO03/011223.

[148]Meraldi等(2003)Vaccine 21：2485-2491.

[149]Pajak等(2003)Vaccine 21：836-842.

[150]Wong等(2003)J Clin Pharmacol 43(7)：735-42.

[151]US2005/0215517.

[152]WO90/14837.

[153]Podda和Del Giudice(2003)Expert Rev Vaccines 2：197-203.

[154]Podda(2001)Vaccine 19：2673-2680.

[155]《疫苗设计：亚基和佐剂方法》(Vaccine Design：The Subunit and Adjuvant Approach)(Powell和Newman编)Plenum出版社1995(ISBN0-306-44867-X).

[156]《疫苗佐剂：制备方法和研究方案》(Vaccine Adjuvants：Preparation Methods and Research Protocols)(分子药物方法(Methods in Molecular Medicine)系列，第42卷).ISBN：1-59259-083-7.O′Hagan编.

[157]Allison和Byars(1992)Res Immunol 143：519-25.

[158]Hariharan等(1995)Cancer Res 55：3486-9.

[159]WO95/11700.

[160]美国专利6,080,725.

[161]WO2005/097181.

Claims

1.一种生产Vi偶联物的方法，其包括以下步骤：

a)同时将接头、碳二亚胺和载体蛋白结合；

b)从步骤a)的产物中去除任何过量的接头；

c)使Vi与碳二亚胺反应；和

d)使步骤b)的产物与步骤c)的产物反应。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过透析去除所述过量接头。

3.如以上任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述载体蛋白是CRM₁₉₇或破伤风类毒素。

4.如以上任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述碳二亚胺是1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDAC)。

5.如以上任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述接头是己二酸二酰肼。

6.一种包含与CRM₁₉₇连接的Vi的偶联物。

7.如权利要求6所述的偶联物，其特征在于，所述Vi通过己二酸二酰肼(ADH)接头与CRM₁₉₇连接。

8.一种包含如权利要求6或7所述的偶联物的药物组合物，所述偶联物与药学上可接受的载体结合。

9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物不含佐剂。

10.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物还包含佐剂。

11.如权利要求8或10中任一项所述的组合物，其包含盐水。

12.如权利要求8-11中任一项所述的组合物，其特征在于，单位剂量的所述组合物包含5μg Vi糖。

13.一种在哺乳动物中引起免疫应答的方法，包括将如权利要求5-9中任一项所述的偶联物或药物组合物给予所述哺乳动物。

14.一种衍生化Vi糖的方法，包括使所述糖与碳二亚胺反应，其中Vi∶碳二亚胺的摩尔比＞3∶1。

15.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述比率＞5∶1。

16.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述比率＞9∶1。

17.如权利要求11、12或13所述的方法，其特征在于，所述碳二亚胺是EDAC。