BR112016010072B1 - conjugado, composição farmacêutica, usos do conjugado ou da composição farmacêutica, e de polissacarídeo de vi fragmentado, e, método para a fabricação de um conjugado - Google Patents

Abstract

CONJUGADO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USOS DO CONJUGADO OU DA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E DE POLISSACARÍDEO DE VI FRAGMENTADO, E, MÉTODO PARA A FABRICAÇÃO DE UM CONJUGADO. A invenção refere-se a um conjugado com base em polissacarídeo de Vi que é fragmentado e uma proteína carreadora, a composições compreendendo o dito conjugado e a métodos para fabricação de dos ditos conjugados e as composições.

Description

Fundamentos da Invenção

[001] Os sacarídeos das bactérias foram usados por muitos anos em vacinas. Como os sacarídeos são antígenos independentes de T, entretanto, estes são deficientemente imunogênicos. Além disso, eles são ineficazes em crianças ou bebês abaixo de 2 anos de idade. A conjugação a um carreador pode converter eficazmente antígenos independentes de T em antígenos dependentes de T, deste modo intensificando as respostas de memória e permitindo que a imunidade protetora se desenvolva. Até hoje, as vacinas de sacarídeos mais eficazes são, portanto, com base em glicoconjugados. O WO95/31994 e o WO94/03208, ambos da Yeda Research and Development Co. Ltd., US 5,204,098 e WO2008/081022 dizem respeito a conjugados de antígenos deficientemente imunogênicos.

[002] Muitos processos de conjugação fazem o uso de oligossacarídeos curtos e, desta maneira, isto ocorre principalmente para melhorar o processo de fabricação (melhor controle da consistência de fabricação, melhor caracterização do produto final). É bem conhecido que o comprimento da cadeia de sacarídeo pode ter um impacto na imunogenicidade de vacinas conjugadas (P. Costantino ET AL. Expert Opin. Drug Discov., 6 (2011) 1045). IN1330MUM2010 da Serum Institute of India Ltd diz respeito a um método para fabricação de fragmentos de polissacarídeo adequados para a conjugação. O US 6,045,805 também descreve métodos para fabricação de de oligossacarídeos.

[003] A febre tifoide permanece uma doença séria em países em desenvolvimento, afetando milhões de pessoas a cada ano (Crump JA ET AL., Bull. Wld. Hlth. Org. 82, 346-353 (2004); Ochai RL et al. E o Domi Typhoid Study Group, Bull. Wld. Hlth. Org. 86, 260-268 (2008)). Na última década, as vacinas conjugadas foram desenvolvidas contra esta doença. Por exemplo, uma vacina de conjugado segura e altamente imunogênica com base em carreador de proteína Vi (polissacarídeo de Salmonella enterica sorovar Typhi) e rEPA foi desenvolvida por NICHD/NIH (Lanh et al., N. Eng. J. Med. 2003; Thiem et al., Clin Vac. Immunol. 2011; Szu, Expert Rev. Vaccines 12(11), 1273-1286 (2013)). Diversos documentos debatem a imunogenicidade de Vi, suas vacinas conjugadas e o comprimento de cadeia considerado ótimo até aqui (Szu et al., Infection and Immunity, 1989, 3823; Szu et al., Infection and Immunity, 1991, 4555; Szu et al. Infection and Immunity, 1994, 5545; Kossaczka et al., Infection and Immunity, 1999, 5806; Cui et al., Clin. Vaccine Immunol., 17 (2010), 73-79; Micoli et al., Vaccine, 29 (2011), 712-720; An et al., Vaccine, 29 (2011), 7618-23; Rondini et al., Clin.Vaccine Immunol., 18 (2011), 460-68; An et al., Vaccine, 30 (2012), 1023-1028).

[004] Mais recentemente, um conjugado de vacina de Salmonella Typhi com base em Vi a partir de Citrobacter freundii sensu lato purificado e carreador de proteína CRM197 foi descrito por Micoli et al. Vaccine 2012 e Rondini et al., J. Infect. Dev Ctries, 2012. Quando testado em humanos, a vacina de conjugado Vi-CRM197 proviu respostas de anticorpo anti-Vi superiores em comparação com Vi não conjugado após uma imunização simples e em uma dose inferior (van Damme et al., PlosOne 2011; resultados adicionais apresentados na 8a International Conference on Typhoid Fever and Other Invasive Salmonelloses, Bangladesh, Março de 2013). Entretanto, a resposta anti-Vi seguindo a revacinação foi menor do que a resposta primária e a persistência anti-Vi foi menor do que o desejado (Bhutta et al. Lancet Infect Dis, 14 (2014) 119).

[005] Portanto, ainda existe uma necessidade para prover vacinas conjugadas melhoradas.

Sumário da invenção

[006] A invenção refere-se a um conjugado com base em polissacarídeo de Vi que é fragmentado e uma proteína carreadora. Em particular, o polissacarídeo de Vi fragmentado tem um peso molecular médio entre 40 e 55 kDa. A invenção ainda provê uma composição farmacêutica compreendendo o conjugado da invenção, um método para aumento de uma resposta imune em um mamífero compreendendo administrar um conjugado ou composição farmacêutica da invenção ao dito mamífero, um método para aumento de uma resposta imune dependente de T essencialmente livre de uma resposta imune independente de T em um mamífero compreendendo administrar um conjugado ou composição farmacêutica da invenção ao dito mamífero, um método para a prevenção de febre tifoide em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo em necessidade uma quantidade eficaz de um conjugado ou composição farmacêutica da invenção e um método para a fabricação do dito conjugado.

[007] Os conjugados preferidos da invenção devem ser capazes de induzir a resposta da memória, prover um efeito intensificador em revacinação e níveis de anticorpo sustentados. Idealmente, os conjugados devem ser eficazes em todas as idades de população, particularmente em crianças abaixo de 2 anos de idade.

Breve descrição das figuras

[008] A Figura 1 mostra as etapas sintéticas para fabricar os conjugados da presente invenção (PS = polissacarídeo fragmentado; prot. = proteína carreadora; RC=N=CR’ pode ser qualquer carbodiimida, tipicamente 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, por exemplo).

[009] A Figura 2 mostra a resposta imunológica em camundongos dos grupos 1 a 10. Os grupos 1 a 4 foram imunizados com os conjugados compreendendo Vi fragmentado e CRM197 como proteína carreadora, em que o Vi fragmentado no grupo 1 tem um peso molecular médio (avMW) de 9,5 kDa; o Vi fragmentado no grupo 2 tem um avMW de 22,8 kDa; o Vi fragmentado no grupo 3 tem um avMW de 42,7 kDa; e o Vi fragmentado no grupo 4 tem um avMW de 82 kDa. O grupo 5 foi injetado com conjugado de Vi natural a CRM197, grupos 6 a 9 com Vi fragmentado não conjugado tendo o avMW de grupos 1 a 4 respectivamente. O grupo 10 recebei o Vi natural.

[0010] A Figura 3 mostra a unidade de repetição de polissacarídeo de Vi de Salmonella Typhi, onde Ac é um grupo acetila.

[0011] A Figura 4 mostra os espectros de 1H RMN (em NaOD 200 mM, em RT, 500 MHz) indicativos da quantidade de O-acetilação em Vi natural e Vi fragmentado (grupo 1-4).

[0012] A Figura 5 mostra os perfis de HPLC-SEC (214 nm) do Vi natural em comparação com a mistura de Vi fragmentado e a Figura 6 mostra quatro grupos de Vi fragmentados (grupo 1-4) de avMW diferentes. A série de amostras em uma coluna TSK gel 3000 PWXL, eluindo com NaH2PO4 100 mM de NaCl 100mM 5% de CH3CN pH 7,2 em 0,5 ml/minuto; Vo 10,663 minutos; Vtot 23,326 minutos.

[0013] A Figura 7 mostra o perfil de HPLC-SEC (214 nm) de avMW de Vi fragmentado 42,7 kDa (coluna TSK gel 3000 PWXL, NaH2PO4 100 mM de NaCl 100mM 5% de CH3CN pH 7,2, 0,5 ml/minuto; Vo 10,663 minutos; Vtot 23,326 minutos; usando-se dextranos como padrões). 80 % da área de pico está entre 70 e 25 kDa.

[0014] A Figura 8 mostra a resposta observada em camundongos do tipo selvagem versus nocaute de célula T (TCR βδ-/-) quando imunizados com Vi não conjugado de comprimento total, um Vi conjugado de comprimento total e conjugados de Vi fragmentado.

[0015] A Figura 9 mostra a resposta observada em conjugados de Vi de comprimento total e conjugados de Vi fragmentado conjugados a CRM197, DT e TT.

Descrição detalhada da invenção

[0016] A presente invenção refere-se a conjugados compreendendo Vi fragmentado conjugados a uma proteína carreadora.

[0017] Para os propósitos de interpretar esta especificação, as seguintes definições aplicam-se e, quando apropriado, os termos usados no singular também incluirão o plural e vice-versa.

[0018] Como usado aqui, o termo “um”, “uma” e “o” e termos similares usados no contexto da presente invenção (especialmente no contexto das reivindicações) devem ser construídos para abranger tanto o singular quanto o plural a não ser que indicado de outra maneira ou claramente contradito pelo texto.

[0019] O termo “cerca de” em relação a um valor numérico x é opcional e significa, por exemplo, x+10%.

[0020] Como usado aqui, o termo “Vi” ou “polissacarídeo de Vi” refere-se ao polissacarídeo capsular de Salmonella enterica sorovar Typhi purificado a partir de Citrobacter (Rondini et al., J. Infect. Dev. Ctries, 2012).

[0021] Como usado aqui, o termo “polissacarídeo natural” refere-se ao polissacarídeo que não foi submetido a um processo, cujo propósito é reduzir o tamanho do dito polissacarídeo.

[0022] Como usado aqui, o termo “fragmentado” em referência ao polissacarídeo de Vi refere-se ao polissacarídeo de Vi tendo passado pela redução de tamanho, desta maneira reduzindo o número de unidades de repetição no polissacarídeo. Vi fragmentado, portanto, tem um avMW menor em comparação com o Vi natural. Por exemplo, o Vi fragmentado pode compreender de 30 a 300 unidades de repetição, em comparação com mais de 600 unidades de repetição para o Vi natural. A estrutura de unidade de repetição monomérica de Vi é mostrada na Figura 3. No Vi fragmentado da presente invenção, preferivelmente nenhuma mudança na estrutura da unidade de repetição é observada em comparação com o Vi natural. Isto pode ser confirmado por análise de 1H RMN (ver a Figura 4). Além disso, a porcentagem de grupos O-acetila no Vi fragmentado é preferivelmente o mesmo como o Vi natural (isto é, cerca de 95 % de O-acetilação) mas pode variar e diminuir a cerca de 65% de O-acetilação. A O-acetilação pode ser determinada por medições padrão, tais como 1H RMN, método colorimétrico Hestrin.

[0023] Como usado aqui, o termo “grupos” refere-se a grupos de Vi fragmentado tendo uma faixa definida de peso molecular médio e que pode ser separada por métodos padrão um do outro. Os grupos consistem de Vi fragmentado como definido aqui.

[0024] Em seu tamanho natural, o polissacarídeo de Vi tem um peso molecular médio medido pela cromatografia de exclusão de tamanho por HPLC (HPLC-SEC) de cerca de 165 kDa. O Vi fragmentado usado na presente invenção tem um avMW entre 40 e 55 kDa. Este valor é medido por HPLC-SEC. Tipicamente, o peso molecular médio é calculado passando a amostra em uma coluna TSK gel 3000 PWXL, (30 cm x 7,8 mm; tamanho de partícula 7 μm; cod. 808021) com uma coluna de proteção TSK gel PWXL (4,0 cm x 6,0 mm; tamanho de partícula 12 μm; cod. 808033) (Tosoh Bioscience) usando-se dextranos como padrões (5, 25, 50, 80, 150 kDa). A fase móvel é 0,1 M de NaCl, 0,1 M de NaH2PO4, 5% de CH3CN, pH 7,2, na taxa de fluxo de 0,5 ml/minuto (método isocrático por 30 minutos). O método de calibração de vazio e volume de leito é realizado com X-DNA (Marcador de Peso Molecular de X-DNA III 0,12 a 21,2 kb; Roche) e azida de sódio (NaN3; Merck), respectivamente.

[0025] O Vi fragmentado da presente invenção ainda pode ser separado em grupos de faixas diferentes de peso molecular médio. Isto pode ser atingido por métodos conhecidos na técnica, tais como cromatografia de troca de ânion, cromatografia de exclusão de tamanho, filtração de fluxo tangencial.

[0026] Em uma modalidade da invenção, o Vi fragmentado tem um avMW de cerca de 40 a 55 kDa, mais preferivelmente de 42 a 53 kDa, ainda mais preferivelmente de 45 a 50 kDa. Em uma outra modalidade, o Vi fragmentado tem um avMW de cerca de 41 a 49 kDa, preferivelmente de 41 a 48 kDa, mais preferivelmente de 42 a 46 kDa. Em uma modalidade adicional, o Vi fragmentado tem um avMW de cerca de 43 kDa. Em uma outra modalidade, o Vi fragmentado tem um avMW de 51 a 55 kDa, preferivelmente de 52 a 54 kDa. Em uma outra modalidade, o Vi fragmentado tem um avMW de cerca de 53 kDa.

[0027] Ficará evidente para o versado que o peso molecular médio de Vi ou os seus fragmentos podem variar dependendo do método de medição. Como descrito aqui, os valores dados para o peso molecular médio são medidos por cromatografia de exclusão de tamanho por HPLC, tipicamente usando-se as colunas, tampão e padrões descritos aqui. Entretanto, o versado entenderá que mudanças na coluna, no tampão e /ou nos padrões usados afetarão o peso molecular médio calculado. Por exemplo, o Vi natural tem um avMW calculado de 148 kDa quando medido usando-se o sistema UPLC-SEC com coluna Acquity UPLC BEH200 1,7 mm (4,6 x 150 mm) em 0,45 ml/minuto em comparação com 165 kDa quando medido usando-se o método descrito neste. Portanto, as variações em avMW medido de cerca de +/- 10% podem ocorrer e serão medidas por um versado na técnica que a presente invenção não é limitada pelos valores absolutos para podem variar dentro dos limites de variações de medição.

[0028] Os grupos de Vi fragmentado usados na presente invenção podem ter certas distribuições de faixa de peso molecular médio que ainda podem ser caracterizadas em termos de índice de polidispersidade (PDI). O índice de polidispersidade é calculado como mostrado na equação abaixo: PDI = Mw / Mn onde Mw é o peso molecular médio ponderado e Mn é o peso molecular médio numérico.

[0029] Quanto mais estreita a distribuição de peso molecular, mais próximo o valor de PDI está de 1.

[0030] O grupo de Vi fragmentado pode ter uma distribuição de avMW em que pelo menos 80% do grupo tem um avMW entre 25 kDa e 70 kDa. Isto pode ter uma distribuição de avMW caracterizado em que pelo menos 50% do grupo tem um avMW entre 35 kDa e 60 kDa.

[0031] Este pode ter uma distribuição de avMW caracterizada em que pelo menos 30% do grupo tem um avMW entre 41 kDa e 55 kDa.

[0032] A fragmentação pode ser realizada por diversos métodos conhecidos na técnica, tais como hidrólise química do polissacarídeo natural, fragmentação enzimática por polissacarídeo natural, irradiação gama do polissacarídeo nativo ou métodos químicos, tais como sonicação, homogeneizador/microfluidizador/HPCDS de alta pressão (Sistema de rompimento celular por alta pressão) do polissacarídeo natural.

[0033] O método de fragmentação usado na presente invenção é selecionado tal que este pode produzir Vi fragmentado tendo um avMW menor do que 80 kDa, preferivelmente menor do que 60 kDa, mais preferivelmente entre 40 e 55 kDa.

[0034] O método também é preferivelmente selecionado tal que não existem alterações na estrutura das unidades de repetição.

[0035] Preferivelmente, a fragmentação não ocorre por métodos mecânicos. Preferivelmente, a fragmentação não ocorre por hidrólise alcalina.

[0036] O Vi fragmentado da presente invenção é preferivelmente obtido por hidrólise química com peróxido de hidrogênio. Usando-se este método, foi observado que o polissacarídeo de Vi pode ser reduzido em tamanho sem alterar a estrutura das unidades de repetição. Também, a hidrólise com peróxido de hidrogênio pode permitir a formação de Vi fragmentado tendo um peso molecular médio inferior do que quando se usa os métodos mecânicos.

[0037] Se o Vi fragmentado da presente invenção for obtido por hidrólise química com peróxido de hidrogênio, foi observado que a adição de uma quantidade catalítica de cloreto férrico (FeCl3) permite que a reação trabalhe sob condições mais brandas (temperatura mais baixa e tempo de reação mais curto). Desta maneira, em um aspecto da invenção, é provido um método para a fragmentação de um polissacarídeo compreendendo a etapa de reagir o polissacarídeo natural com peróxido de hidrogênio na presença de cloreto férrico. Mais particularmente, um aspecto da invenção refere-se a um método para fragmentar Vi compreendendo a etapa de reagir Vi natural com peróxido de hidrogênio na presença de cloreto férrico. Ainda mais particularmente, o método compreende reagir Vi com cerca de 3% de peróxido de hidrogênio em água e 0,1 mM de cloreto férrico. Preferivelmente, a temperatura da reação é de cerca de 20 a 40°C.

[0038] Em um outro aspecto da invenção, é provido um método para a fragmentação de um polissacarídeo compreendendo a etapa de reagir o polissacarídeo natural com peróxido de hidrogênio na presença de sulfato ferroso. O uso de sulfato ferroso, que é mais solúvel do que FeCl3, leva a um processo mais reprodutível. Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método para a fragmentação de Vi compreendendo a etapa de reagir Vi natural com peróxido de hidrogênio na presença de sulfato ferroso como o catalisador. Em particular, o método compreende reagir o Vi natural com cerca de 0,5% de peróxido de hidrogênio em água na presença de sulfato ferroso 0,1 mM. Preferivelmente, a temperatura da reação é de cerca de 20 a 40°C. O Vi fragmentado obtido por este método é preferivelmente submetido a uma etapa de aquecimento (cerca de 80°C) antes do uso nos métodos de conjunção da invenção.

[0039] A fragmentação é, em geral, seguida por purificação.

[0040] A purificação pode ser realizada por métodos conhecidos na técnica. Tipicamente, a purificação é realizada pela cromatografia de troca de ânion.

[0041] A purificação produz, tipicamente, “grupos” de Vi fragmentado de comprimento diferente e de faixas de peso molecular médio diferente.

[0042] A proteína carreadora dos presentes conjugados pode ser selecionada de CRM197 ou toxoide de difteria. Mais preferivelmente, a proteína carreadora é CRM197. A Figura 9 mostra a diferença em respostas imunológicas de Vi fragmentado conjugado a CRM197, toxoide de difteria (DT) e toxoide do tétano (TT). As respostas vistas para conjugados de Vi fragmentado com CRM197 e toxoide de difteria (DT) são típicos de uma resposta imune dependente de T (resposta imunológica inferior após a primeira injeção (dia 14 e 35) seguido por uma resposta intensificadora após a segunda injeção (dia 49)). Em comparação, os conjugados de Vi fragmentado com toxoide de tétano (TT) mostrou uma resposta de anticorpo alta a uma dose de vacina sem uma resposta anamnéstica clara a uma segunda dose, uma descoberta que é observada quando uma resposta independente de T proeminente está presente.

[0043] A invenção refere-se adicionalmente a um método para fabricação de um conjugado compreendendo Vi fragmentado e uma proteína carreadora selecionada de CRM197 ou toxoide de difteria compreendendo as etapas de: a) Fragmentar o polissacarídeo de Vi para obter um polissacarídeo de Vi fragmentado tendo um avMW de40 a 55 kDa; b) reagir o polissacarídeo de Vi fragmentado obtido na etapa a) com uma carbodiimida e N-hidroxissuccinimida em um pH de 5 a 6 para formar um éster de N-hidroxissuccinimida; c) reagir o éster de N-hidroxissuccinimida obtido na etapa b) com a proteína carreadora para produzir o dito conjugado.

[0044] Uma modalidade do presente método é descrita na Figura 1.

[0045] Neste presente método, a etapa a) é opcionalmente seguida pela etapa de purificação. A etapa de purificação produz grupos de Vi fragmentado de faixas de peso molecular médio diferentes. O grupo de Vi fragmentado tendo uma faixa de peso molecular médio diferente entre 40 e 55 kDa é usado nas etapas b) e c) do presente método.

[0046] A carbodiimida usada na etapa b) do presente método pode ser qualquer carbodiimida adequada que capaz de conjugar sacarídeos e proteínas em um meio aquoso. Tipicamente, a carbodiimida usada é 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida) (EDAC). Alternativamente, meto-p- toluenossulfonato de 1-ciclo-hexil-3-(2-morfolinoetil)carbodiimida (CMC) pode ser usado.

[0047] Na etapa b) do método, o polissacarídeo de Vi fragmentado está preferivelmente presente em uma concentração de 50 μmol/ml a 200 μmol/ml em termos de grupos COOH.

[0048] Na etapa b) do método, a concentração de Vi fragmentado pode ser de cerca de 15 mg/ml a cerca de 50 mg/ml. Quanto menor o avMW do Vi fragmentado, maior a concentração de Vi pode ser na etapa b) do presente método.

[0049] A razão molar de carbodiimida ao grupo COOH do Vi fragmentado no meio de reação pode variar entre 1:1 e 10:1. Este pode ser de 5:1. O número de grupos COOH de Vi fragmentado corresponde tipicamente ao número de unidades de repetição Vi.

[0050] Na etapa b), a reação dos grupos de ácido carboxílico do Vi fragmentado com a carbodiimida dá um intermediário de O-acilureia que por sua vez reage com N-hidroxissuccinimida (NHS) para formar um éster de N- hidroxissuccinimida.

[0051] A concentração de NHS usado na etapa b) é preferivelmente de cerca de 0,1 M a 0,4 M.

[0052] O meio de reação para o método da presente invenção é tipicamente um tampão de ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico (MES).

[0053] O tempo de reação para a etapa b) é tipicamente de cerca de 1 hora. A temperatura de reação é tipicamente de cerca de 20 a 30°C.

[0054] O intermediário resultante obtido na etapa b) (Vi fragmentado derivado com grupos éster) pode ser analisado por HPAEC-PAD (Cromatografia de Troca de Ânion de Alto Desempenho com Detecção Amperométrica Pulsada) para o teor de açúcar total e par de íon HPLC-RP (HPLC de fase reversa) para a quantificação de NHS. Isto permite determinar a % de unidades de repetição de Vi fragmentado ativado (isto é, Vi fragmentado que reagiu com NHS). Preferivelmente, a % de Vi fragmentado ativado é de 10 a 50%, mais preferivelmente cerca de 20 a 30%.

[0055] O intermediário obtido na etapa b) do presente método pode ser opcionalmente purificado pela dessalinização em pH baixo ou precipitação de etanol.

[0056] Na etapa c) do presente método, o éster de N- hidroxissuccinimida obtido na etapa b) do presente método é então reagido com uma proteína carreadora para produzir um conjugado compreendendo Vi fragmentado e adita proteína carreadora.

[0057] A proteína carreadora é uma proteína tipicamente usada na fabricação de conjugados para o uso em vacinas. Por exemplo, a proteína carreadora pode ser CRM197 ou toxoide de difteria. Mais preferivelmente, a proteína carreadora é CRM197.

[0058] A proteína carreadora pode ser derivatizada antes da reação com o éster NHS obtido na etapa b) do presente método. A proteína carreadora pode ser tipicamente derivatizada com uma hidrazida. Tipicamente, a proteína carreadora é derivatizada com di-hidrazida de ácido adípico (ADH) (como mostrado na Figura 1).

[0059] Se CRM197 for usada como a proteína carreadora na etapa c) do presente método, a razão p/p de Vi a CRM197 é preferivelmente de 2:1 a 1:2. Por exemplo, este pode ser de 2:1, 1:1 ou 1:2.

[0060] Na etapa c) do método da presente invenção, a concentração de Vi fragmentado derivatizado, isto é, éster de N-hidroxissuccinimida (NHS), no meio de reação pode ser de cerca de 5 mg/ml a cerca de 10 mg/ml. Quanto menor o peso molecular médio de Vi fragmentado, mais alta a concentração do NHS-éster pode ser na etapa c) do presente método.

[0061] O tempo de reação para a etapa c) do método da invenção é tipicamente de cerca de 2 horas. A temperatura de reação para a etapa c) do método da invenção é tipicamente de cerca de 20 a 30°C. Os métodos conhecidos podem ser usados para estimar a finalização da reação.

[0062] A etapa de conjugação c) é preferivelmente realizada em tampão de MES pH 6, usualmente em uma concentração de cerca de 20 mM.

[0063] Na etapa c) do presente método, o pH é preferivelmente de cerca de 6. Este valor de pH é menor do que aquele relatado quando usa-se NHS em química de conjugação. Sem desejar estar ligado por teoria, acredita- se que nesta faixa de pH, a hidrólise de NHS é menor do que em pH mais alto pH, resultando em um processo de conjugação mais eficiente.

[0064] O conjugado obtido pelo presente método pode ser submetido a um processo de purificação adicional. Por exemplo, o conjugado pode ser purificado pela cromatografia de exclusão de tamanho ou filtração de fluxo tangencial, cromatografia hidrofóbica ou cromatografia de troca iônica.

[0065] No presente método, a presença de carbodiimida e NHS usados na etapa b) permite ter eficiência de conjugação alta sem alterar a estrutura das unidades de repetição de Vi fragmentado. Se apenas uma carbodiimida, tal como EDAC for usada (isto é, sem a presença de NHS), as concentrações altas da dita carbodiimida são requeridas para tornar o processo eficiente. Além disso, os grupos de N-acil ureia nos grupos COOH de Vi fragmentado são produzidos, modificando a estrutura do polissacarídeo e alterando seus epítopos. O uso de NHS evita a formação destes derivados. Com o presente método, a porcentagem destes derivados nos conjugados de Vi fragmentado é menor do que 2% em mol (carbodiimida/COOH de Vi) e também grupos de éster residual são inferiores do que 1% in mol.

[0066] Os conjugados obtidos pelo presente método também são caracterizados de Vi fragmentado livre, isto é, não conjugado que é menor do que 20%, preferivelmente menor do que 15%, mais preferivelmente menor do que 5%. Preferivelmente, nenhum Vi fragmentado livre é detectado. Adicionalmente, preferivelmente, nenhuma proteína livre é detectada. Os conjugados da presente invenção ainda podem ser caracterizados por seu Vi fragmentado à razão de proteína carreadora. Por exemplo, a razão p/p de Vi fragmentado: a proteína carreadora pode ser de cerca de 1,5:1 a cerca de 1:3. Estas razões podem variar dependendo da faixa de peso molecular médio do Vi fragmentado usado. Isto também pode variar dependendo da proteína carreadora usada. Quando CRM197 é usado como a proteína carreadora, a razão p/p de Vi para CRM197 pode ser de cerca de 0,33 a cerca de 1,33. Em uma modalidade da invenção, esta é de cerca de 0,33. Em uma modalidade da invenção, esta é de cerca de 0,52. Em uma modalidade da invenção, esta é de cerca de 0,64. Em uma modalidade da invenção, esta é de cerca de 1,33.

[0067] Quando o toxoide de difteria (DT) é usado como a proteína carreadora, a razão p/p de Vi para DT pode ser de cerca de 0,85.

[0068] Os conjugados da invenção preferivelmente têm pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% de O-acetilação. Em uma modalidade mais preferida, os conjugados da invenção têm cerca de 95% de O-acetilação. Isto é comparável à O-acetilação de Vi nativo e é uma confirmação que a estrutura das unidades de repetição monoméricas de Vi fragmentado não é alterada por fragmentação.

[0069] A porcentagem de O-acetilação pode ser medida por métodos conhecidos na técnica, tais como 1H RMN, método colorimétrico de Hestrin.

[0070] Em uma modalidade da invenção, o conjugado compreende de 5 a 25 μg de Vi fragmentado. Em uma modalidade da invenção, o conjugado compreende 8 μg de Vi fragmentado.

[0071] Em uma modalidade da invenção, a proteína carreadora no conjugado é CRM197. Em uma modalidade da invenção, o conjugado compreende de 5 a 25 μg CRM197. Em uma modalidade, o conjugado compreende de 10 a 15 μg de CRM197.

[0072] Em um conjugado da invenção, a quantidade de Vi fragmentado é de 8 μg e a quantidade de CRM197 é de 12,5 μg.

[0073] O conjugado da invenção ainda pode ser obtido pelo método descrito neste. Portanto, um conjugado obtenível pelo método da invenção também é parte da invenção.

[0074] O conjugado da presente invenção pode ser adicionalmente processado em uma composição farmacêutica. Deste modo, a invenção também provê uma composição farmacêutica compreendendo o conjugado da presente invenção em combinação com um carreador farmaceuticamente aceitável. Como usado aqui, o termo "carreador farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer e todos os solventes, meio de dispersão, revestimentos, tensoativos, antioxidantes, conservantes (por exemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotônicos, agentes de atraso de absorção, sais, conservantes, estabilizadores de medicamento, aglutinantes, excipientes, agentes de desintegração, lubrificantes, agentes adoçantes, agentes aromatizantes, pigmentos e outros e combinações destes, como deve ser conhecido àqueles versados na técnica (ver, por exemplo, em Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20° edição, ISBN: 0683306472). Exceto à medida que qualquer carreador convencional é incompatível com o ingrediente ativo, seu uso nas composições terapêuticas ou terapêuticas é considerado.

[0075] O termo "uma quantidade terapeuticamente efetiva" de um composto da presente invenção refere-se a uma quantidade do conjugado da presente invenção que extrairá a resposta biológica ou médica de um indivíduo, ou evitará uma doença, etc. Em uma modalidade não limitante, o termo “a quantidade terapeuticamente efetiva” refere-se a quantidade do composto da presente invenção que, quando administrada a um indivíduo, é efetiva para evitar a condição, ou um distúrbio ou uma doença mediada por Salmonella Typhi.

[0076] Como usado aqui, o termo “indivíduo” refere-se a um animal. Tipicamente o animal é um mamífero. Um indivíduo também se refere, por exemplo, a primatas (por exemplo, humanos, machos ou fêmeas), vacas, ovelha, cabras, cavalos, cães, gatos, coelhos, ratos, camundongos, peixe, pássaros e outros. E certas modalidades, o indivíduo é um primata. Ainda em outras modalidades, o indivíduo é um humano.

[0077] As infecções microbianas afetam várias áreas do corpo e deste modo as composições da invenção podem ser preparadas em várias formas. Por exemplo, as composições podem ser preparadas como injetáveis, como soluções líquidas ou suspensões. As formas sólidas adequadas para a solução em, ou suspensão em veículos líquidos antes da injeção também podem ser preparadas. A composição pode ser preparada pela administração tópica, por exemplo, como um unguento, creme ou pó. A composição pode ser preparada pela administração oral, por exemplo, como um tablete ou cápsula, ou como um xarope (opcionalmente aromatizado). A composição pode ser preparada pela administração pulmonar, por exemplo, como um inalador, usando um pó fino ou um pulverizador. A composição pode ser preparada como um supositório ou pessário. A composição pode ser preparada pela administração nasal, aural ou ocular, por exemplo, como gotas, como um pulverizador, ou como um pó. A composição pode ser incluída em um líquido para lavagem bucal. A composição pode ser liofilizada.

[0078] A composição farmacêutica é preferivelmente estéril. Ela é, preferivelmente, livre de pirogênio. É preferivelmente tamponada, por exemplo, entre pH 6 e pH 8, geralmente em torno do pH 7.

[0079] Uma composição da invenção pode compreender um conjugado da invenção e solução salina.

[0080] A invenção também provê um dispositivo de liberação contendo uma composição farmacêutica da invenção. O dispositivo pode ser, por exemplo, uma seringa ou um inalador.

[0081] As composições farmacêuticas da invenção são preferivelmente composições imunogênicas, em que estas compreendem uma quantidade imunologicamente efetivas de imunogênio de polissacarídeo. Para as ‘quantidades imunologicamente efetivas’, é significado que a administração daquela quantidade a um indivíduo, em uma dosagem simples ou como parte de uma série, é efetiva para prevenção. Esta quantidade varia dependendo da saúde e condição física do indivíduo a ser tratado, idade, grupo taxonômico do indivíduo a ser tratado (por exemplo, primata não humano, primata, etc.), a capacidade do sistema imune dos indivíduos para sintetizar os anticorpos, o grau de proteção desejado, a formulação da vacina, a avaliação do médico atendente da situação médica e outros fatores relevantes. É esperado que a quantidade divirja em uma faixa relativamente ampla que pode ser determinada através dos ensaios de rotina. Uma dosagem entre 1 μg e 20 μg de sacarídeo é esperada, por exemplo, a cerca de 5 μg/dose. O tratamento de dosagem pode ser uma lista de dosagem simples ou uma lista de dosagem múltipla (por exemplo, incluindo dosagens intensificadoras). A composição pode ser administrada em conjunção com outros agentes imunorreguladores.

[0082] Uma vez formulado, as composições da invenção podem ser administradas diretamente ao indivíduo. Os indivíduos a serem tratados podem ser animais; em particular, indivíduos humanos podem ser tratados.

[0083] As composições imunogênicas da invenção são tipicamente usadas profilaticamente (isto é para evitar infecção futura).

[0084] Em uma modalidade, a composição farmacêutica pode ser não adjuvantada.

[0085] Em outra modalidade, uma composição imunogênica pode incluir um adjuvante. O adjuvante pode funcionar para intensificar as respostas imunes (humoral e/ou celular) extraídas em um indivíduo que recebeu a composição. Os adjuvantes que podem ser usados com a invenção incluem, mas não são limitados a: • Uma composição contendo mineral, incluindo sais de cálcio e sais de alumínio (ou misturas destes). Os sais de cálcio incluem fosfato de cálcio (por exemplo, as partículas “CAP” divulgadas em US 6355271). Os sais de alumínio incluem hidróxidos, fosfatos, sulfatos, etc., com os sais tomando qualquer forma adequada (por exemplo, gel, cristalino, amorfo, etc.). A absorção destes sais é preferida. As composições contendo mineral também podem ser formuladas como uma partícula do sal metálico WO2000/0023105. Os adjuvantes conhecidos como hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio podem ser usados. Estes nomes são convencionais, mas são usados para conveniência apenas, como uma descrição precisa do composto químico atual que está presente (por exemplo, ver Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995, capítulo 9). A invenção pode usar qualquer um dos adjuvantes de “hidróxido” ou “fosfato” que são em geral usados como adjuvantes. Os adjuvantes conhecidos como “hidróxido de alumínio” são tipicamente sais de oxi-hidróxido de alumínio, que são usualmente pelo menos parcialmente cristalino. Os adjuvantes conhecidos como “fosfato de alumínio” são tipicamente hidroxifosfato de alumínio, também frequentemente contendo uma quantidade menor de sulfato (isto é sulfato de hidroxifosfato de alumínio). Estes podem ser obtidos pela precipitação e as condições de reação e concentrações durante a precipitação influenciam o grau de substituição do fosfato para hidroxila no sal. A invenção pode usar uma mistura de tanto hidróxido de alumínio quanto um fosfato de alumínio. Neste caso aqui pode ser mais fosfato de alumínio do que hidróxido, por exemplo, uma razão em peso de pelo menos 2:1, por exemplo, >5:1, >6:1, >7:1, >8:1, >9:1, etc. A concentração de Al+3 em uma composição para administração a um indivíduo é preferivelmente menor do que 10 mg/ml, por exemplo, <5 mg/ml, <4 mg/ml, <3 mg/ml, <2 mg/ml, <1 mg/ml, etc. Uma faixa preferida está entre 0,3 e 1 mg/ml. Um máximo de 0,85 mg/dose é preferido. Saponinas (Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995, capítulo 22) que são um grupo heterólogo de glicosídeos de esterol e glicosídeos de triterpenoide que são observados na casca da árvore, folhas, talos, raízes e ainda flores de uma ampla faixa de espécies de plantas. A saponina da casca da árvore da árvore Quillaia saponaria Molina foi amplamente estudada como adjuvantes. A saponina também pode ser comercialmente obtida de Smilax ornata (sarsaprilla), Gypsophila paniculata (véu de noiva) e Saponaria officianalis (erva saboeira). As formulações adjuvantes de saponina incluem as formulações purificadas, tal como QS21, bem como formulações de lipídeo, tal como ISCOMs. QS21 é comercializada como Stimulon™. As composições de saponina foram purificadas usando HPLC e RP-HPLC. As frações purificadas específicas usando estas técnicas foram identificadas, incluindo QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B e QH-C. Preferivelmente, a saponina é QS21. Um método de produção de QS21 é divulgado em US 5.057.540. As formulações de saponina também podem compreender um esterol, tal como colesterol (WO96/33739). As combinações de saponina e colesteróis podem ser usadas para formar as partículas únicas denominadas complexos de imunoestimulação (ISCOMs) (Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995, capítulo 23). Os ISCOMs tipicamente também incluem um fosfolipídeo tal como fosfatidiletanolamina ou fosfatidilcolina. Qualquer saponina conhecida pode ser usada em ISCOMs. Preferivelmente, o ISCOM inclui um ou mais de QuilA, QHA & QHC. Os ISCOMs ainda são descritos em WO96/33739 e EP 0109942. Opcionalmente, os ISCOMS podem ser isentos de detergente adicional WO00/07621. Uma revisão do desenvolvimento de adjuvantes com base em saponina pode ser observada em refs. Barr et al. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:247-271 & Sjolanderet et al. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:321-338. Toxinas de ribosilação de ADP bacterianas (por exemplo, a enterotoxina termolábil E.coli “LT”, toxina de cólera “CT”, ou toxina de coqueluche “PT”) e derivados desentoxicados destes, tal como as toxinas mutantes conhecidas como LT-K63 e LT-R72 (Pizza et al. (2000) Int J Med Microbiol 290:455-461). O uso de toxinas ribosilação ADP desintoxicadas como adjuvantes mucosais é descrito no WO95/17211 e como adjuvantes parenterais no WO98/42375. Bioadesivos e mucoadesivos, tal como microesferas ácidas hialurônicas esterificadas (Singh et al] (2001) J Cont Release 70:267-276) ou quitosano e seus derivados (WO99/27960). Micropartículas (isto é uma partícula de ~100 nm a ~150 μm em diâmetro, mais preferivelmente ~200 nm a ~30 μm em diâmetro, ou ~500 nm a ~10 μm em diâmetro) formadas a partir de materiais que são biodegradáveis e não tóxicos (por exemplo, um poli(ácido α- hidróxi), um ácido poli-hidroxibutírico, um poliortoéster, um polianidrido, um policaprolactona, etc.), com poli(lactídeo-co-glicolídeo) sendo preferido, opcionalmente tratado para ter uma superfície negativamente carregada (por exemplo, com SDS) ou uma superfície positivamente carregada (por exemplo, com um detergente catiônico, tal como CTAB). Lipossomos (Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995, Capítulos 13 & 14). Os exemplos de formulações de lipossomo adequados para o uso como adjuvantes são descritos em US 6.090.406 e US 5.916.588. Peptídeos de Muramila, tal como N-acetilmuramil-L-treonil-D- isoglutamina (“thr-MDP”), N-acetil-normuramil-L-alanil-D- isoglutamina (nor-MDP), N-acetilglucsaminil-N-acetilmuramil-L- Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitóxi propilamida (“DTP-DPP”, ou “Theramide™), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L- alanina-2-(1'-2'dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforilóxi)- etilamina (“MTP-PE”). Um Polímero de polioxidônio (Dyakonova et al. (2004) Int Immunopharmacol 4(13):1615-23) ou outro derivado de poletileno- piperazina N-oxidado. Um ligante CD1d, tal como um α-glicosilceramida (De Libero et al, Nature Reviews Immunology, 2005, 5: 485-496 e US 5.936.076) (por exemplo, α-galactosilceramida), α-glicosilceramidas contendo fitosfingosina, OCH, KRN7000 [(2S,3S,4R)-1-O-(α-D- galactopiranosil)-2-(N-hexacosanoilamino)-1,3,4-octadecanotriol], CRONY-101, 3''-O-sulfo-galactosilceramida, etc. Uma gama inulina (Cooper (1995) Pharm Biotechnol 6:559-80) ou derivado deste, tal como algamulina. Uma emulsão óleo em água. Várias tais emulsões são conhecidas e estas tipicamente incluem pelo menos um óleo e pelo menos um tensoativo, com os óleos e tensoativos sendo biodegradáveis (metabolizável) e biocompatíveis. As gotículas de óleo na emulsão são geralmente inferiores do que 5 μm em diâmetro e ainda podem ter um diâmetro submícron, com estes tamanhos inferiores sendo atingidos com um microfluidizador para prover as emulsões estáveis. As gotículas com um tamanho menor do que 220 nm são preferidas como estas podem ser submetidas a esterilização por filtro. Um oligonucleotídeo imunoestimulador, tal como um contendo um motivo CpG (uma sequência de dinucleotídeo contendo um resíduo de citosina não metilado ligado pela ligação de fosfato a um resíduo de guanosina), ou um motivo CpI (uma sequência de dinucleotídeo contendo citosina ligada a inosina), ou um RNA filamentado duplo, ou um oligonucleotídeo contendo uma sequência palindrômica, ou um oligonucleotídeo contendo uma poli(dG) sequência. Os oligonucleotídeos imunoestimuladores podem incluir modificações de nucleotídeo/análogos tal como modificações de fosforotioato e podem ser filamentados duplos ou filamentados simples (exceto por RNA). As referências Kandimalla et al. (2003) Nucleic Acids Research 31:2393-2400 e WO99/62923 divulgam substituições de análogo possíveis, por exemplo, substituição de guanosina com 2'- desóxi-7-deazaguanosina. O efeito do adjuvante de oligonucleotídeos CpG ainda é debatido nas referências tal como Krieg (2003) Nature Medicine 9:831-835, McCluskie et al. (2002) FEMS Immunology and Medical Microbiology 32:179-185, WO98/40100, US 6.207.646. US 6.239.116. US 6.429.199. Uma sequência CpG pode ser direcionada a TLR9, tal como o motivo GTCGTT ou TTCGTT (Kandimalla et al. (2003) Biochemical Society Transactions 31 (parte 3):654-658). A sequência CpG pode ser específica para a indução de uma resposta imune Th1, tal como um CpG-A ODN (oligodesoxinucleotídeo), ou pode ser mais específico para indução de uma resposta da célula B, um tal CpG-B ODN. CpG-A e CpG-B ODNs são debatidos em refs. Blackwell et al. (2003) J Immunol 170:4061-4068, Krieg (2002) Trends Immunol 23:64-65, WO01/95935. Preferivelmente, o CpG é um CpG-A ODN. Preferivelmente, o oligonucleotídeo CpG é construído de modo que a extremidade 5' é acessível para reconhecimento do receptor. Opcionalmente, duas sequências CpG de oligonucleotídeo podem ser ligadas em suas extremidades 3' para formar “imunômeros”. Ver, por exemplo, as referências Kandimalla et al. (2003) BBRC 306:948-953, Bhagat et al. (2003) BBRC 300:853861 e WO03/035836. Um adjuvante CpG útil é CpG7909, também conhecido como ProMune™ (Coley Pharmaceutical Grupo, Inc.). Outro é CpG1826. Como um alternativo, ou em adição, ao uso das sequências CpG, as sequências TpG podem ser usadas (WO01/22972) e estes oligonucleotídeos podem estar livres de motivos CpG não metilados. O oligonucletídeo imunoestimulador pode ser rico em pirimidina. Por exemplo, pode compreender mais do que um nucleotídeo de timidina consecutivo (por exemplo, TTTT, como divulgado na ref. WO01/22972) e/ou pode ter uma composição de nucleotídeo com >25% de timidina (por exemplo, >35%, >40%, >50%, >60%, >80%, etc.). Por exemplo, pode compreender mais do que um nucleotídeo de citosina consecutivo (por exemplo, CCCC como divulgado na WO01/22972) e/ou pode ter uma composição de nucleotídeo com >25% de citosina (por exemplo, >35%, >40%, >50%, >60%, >80%, etc.). Estes oligonucleotídeos podem estar livres de motivos CpG não metilados. Os oligonucleotídeos imunoestimuladores tipicamente compreenderão pelo menos 20 nucleotídeos. Estes podem compreender menos que 100 nucleotídeos.

[0086] Um adjuvante particularmente útil com base em torno do oligonucleotídeos imunoestimuladores é conhecido como IC31™(Schellack et al. (2006) Vaccine 24:5461-72). Deste modo, um adjuvante usado com a invenção pode compreender uma mistura de (i) um oligonucleotídeo (por exemplo, entre 15-40 nucleotídeos) incluindo pelo menos um motivo CpI (e preferivelmente múltiplo) e (ii) um polímero policatiônico, tal como um oligopeptídeo (por exemplo, entre 5-20 aminoácidos) incluindo pelo menos uma sequência de tripeptídeo Lys-Arg-Lys (e preferivelmente múltiplo). O oligonucleotídeo pode ser um desoxinucleotídeo compreendendo a sequência 26-mer 5'-(IC) 13-3'. O polímero policatiônico pode ser um peptídeo compreendendo aminoácido 11-mer Lys-Leu-Lys-Leu5-Lys-Leu-Lys. • O Lipídeo A de monofosforila 3-O-desacilada (‘3dMPL’, também conhecido como ‘MPL™’) (Myers et al. (1990) páginas 145-156 de Cellular and molecular aspects of endotoxin reactions, Ulrich (2000) Capítulo 16 (páginas 273-282) of Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Volume 42 of Methods in Molecular Medicine series), Johnson et al. (1999) J Med Chem 42:4640-9, Baldrick et al. (2002) Regulatory Toxicol Pharmacol 35:398-413). Nas condições aquosas, 3dMPL pode formar os agregados ou partículas micelares com tamanhos diferentes, por exemplo, com um diâmetro <150 nm ou >500 nm. Qualquer um ou ambos destes podem ser usados com a invenção e as partículas melhores podem ser selecionadas pelo ensaio de rotina. As partículas inferiores (por exemplo, menor o suficiente para dar uma suspensão aquosa clara de 3dMPL) são preferidas para o uso de acordo com a invenção por causa de sua atividade superior (WO 94/21292). As partículas preferidas têm um diâmetro médio menor do que 220 nm, mais preferivelmente menor do que 200 nm ou menor do que 150 nm ou menor do que 120 nm e ainda podem ter um diâmetro médio menor do que 100 nm. Em mais casos, entretanto, o diâmetro médio não será menor do que 50 nm. 5'-monofosfato de metil inosina (“MIMP”) (Signorelli & Hadden (2003) Int Immunopharmacol 3(8):1177-86). Um composto de pirolizidina poli-hidroxilado (WO2004/064715), tal como um tendo a fórmula:

onde R é selecionado do grupo compreendendo hidrogênio, grupos de acila, alquila (por exemplo, cicloalquila), alquenila, alquinila e arila retos ou ramificados, substituídos ou não substituídos, saturados ou não saturados, ou um sal farmaceuticamente aceitáveis ou derivados destes. Os exemplos incluem, mas não são limitados a: casuarina, casuarina-6-α-D-glucopiranose, 3-epi-casuarina, 7-epi-casuarina, 3,7-diepi-casuarina, etc. Um composto de imidazoquinolina, tal como Imiquimod (“R-837”) (US 4.680.338, US 4.988.815), Resiquimod (“R-848”) (WO92/15582) e seus análogos; e sais destes (por exemplo, os sais de cloridretos). Os detalhes adicionais em torno das imidazoquinolinas imunoestimuladoras podem ser observados nas referências Stanley (2002) Clin Exp Dermatol 27:571-577, Wu et al. (2004) Antiviral Res. 64(2):79-83, Vasilakos et al. (2000) Cell Immunol. 204(1):64-74, Patentes US 4689338, 4929624, 5238944, 5266575, 5268376, 5346905, 5352784, 5389640, 5395937, 5482936, 5494916, 5525612, 6083505, 6440992, 6627640, 6656938, 6660735, 6660747, 6664260, 6664264, 6664265, 6667312, 6670372, 6677347, 6677348, 6677349, 6683088, 6703402, 6743920, 6800624, 6809203, 6888000 e 6924293 e Jones (2003) Curr Opin Investig Drugs 4:214-218. Um composto de tiosemicarbazona, tal como aquele divulgado na referência WO2004/060308. Os métodos de formulação, fabricação e avaliação para os compostos ativos também são descritos neste. Os tiosemicarbazonas são particularmente efetivos na estimulação das células mononucleares de sangue periférico humano para a produção de citocinas, tal como TNF-α. Um composto de triptantrina, tal como aquele divulgado na referência WO2004/064759. Os métodos de formulação, fabricação e avaliação para os compostos ativos também são descritos neste. Os tiosemicarbazonas são particularmente efetivos na estimulação das células mononucleares de sangue periférico humano para a produção de citocinas, tal como TNF-α. Um análogo de nucleosídeo, tal como: (a) Isatorabina (ANA-245; 7-tia-8-oxoguanosina):

e pró-medicamentos destes; (b) ANA975; (c) ANA-025-1; (d) ANA380; (e) os compostos divulgados nas referências US 6.924.271, US2005/0070556, US 5.658.731, Loxoribina (7-allil-8-oxoguanosina) (Patente US 5.011.828). Compostos divulgados na referência WO2004/87153, incluindo: compostos de Acilpiperazina, compostos de Indolediona, compostos de Tetra-hidraisoquinolina (THIQ), compostos de Benzociclodiona, compostos de Aminoazavinila, compostos de Aminobenzimidazol quinolinona (ABIQ) (US 6.605.617, WO02/18383), compostos de Hidraptalamida, compostos de Benzofenona, compostos de Isoxazol, compostos de esterol, compostos de Quinazilinona, compostos de pirrol (WO2004/018455), compostos de Antraquinona, compostos de Quinoxalina, compostos de Triazina, compostos de Pirazalopirimidina e compostos de Benzazol (WO03/082272). Um derivado de fosfato de aminoalquil glucosaminida, tal como RC-529 [Johnson et al. (1999) Bioorg Med Chem Lett 9:2273-2278, Evans et al. (2003) Expert Rev Vaccines 2:219-229). Um fosfazeno, tal como poli[di(carboxilatofenoxi)fosfazeno] (“PCPP”) como descrito, por exemplo, nas referências Andrianov et al. (1998) Biomaterials 19:109-115 e Payne et al. (1998) Adv Drug Delivery Review 31:185-196.

[0087] Como definido no WO03/011223, tal como ‘ER 803058’, ‘ER 803732’, ‘ER 804053’, ER 804058’, ‘ER 804059’, ‘ER 804442’, ‘ER 804680’, ‘ER 804764’, ER 803022 ou ‘ER 804057’ por exemplo:

Derivados de lipídeo A de Escherichia coli tal como OM-174 (descritos em refs. Meraldi et al. (2003) Vaccine 21:2485-2491 & Pajak et al. (2003) Vaccine 21:836-842). Compostos contendo lipídeos ligados a uma estrutura acíclica contendo fosfato, tal como o antagonista TLR4 E5564 (Wong et al. (2003) J Clin Pharmacol 43(7):735-42, US2005/0215517):

[0088] Estas e outras substâncias ativas adjuvantes são debatidas nas referências Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995 & Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols.

[0089] Os antígenos e adjuvantes em uma composição estarão tipicamente na mistura.

[0090] As composições podem incluir dois ou mais dos ditos adjuvantes. Por exemplo, estes podem vantajosamente incluir tanto uma emulsão óleo em água quanto 3dMPL, etc.

[0091] Os adjuvantes de emulsão óleo em água específicos úteis com a invenção incluem, mas não são limitados a: • Uma emulsão de submícron de esqualeno, Tween 80 e Span 85. A composição da emulsão em volume pode ser a cerca de 5% de esqualeno, a cerca de 0,5% de polissorbato 80 e a cerca de 0,5% de Span 85. Em termos de peso, estas razões tornam-se 4,3% de esqualeno, 0,5% de polissorbato 80 e 0,48% de Span 85. Este adjuvante é conhecido como ‘MF59’ (WO90/14837, Podda & Del Giudice (2003) Expert Rev Vaccines 2:197-203, Podda (2001) Vaccine 19: 2673-2680), como descrito em mais detalhes no Capítulo 10 de Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995 e capítulo 12 of Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Volume 42 of Methods in Molecular Medicine series). A emulsão MF59 vantajosamente inclui íons de citrato, por exemplo, 10 mM de tampão de citrato de sódio. • Uma emulsão de esqualeno, um tocoferol e Tween 80. A emulsão pode incluir solução salina tamponada por fosfato. Também pode incluir Span 85 (por exemplo, a 1%) e/ou lecitina. Estas emulsões podem ter de 2 a 10% de esqualeno, de 2 a 10% de tocoferol e de 0,3 a 3% de Tween 80 e a razão em peso de esqualeno: tocoferol é preferivelmente <1 neste provê uma emulsão mais estável. O esqualeno e Tween 80 podem estar presentes em razão de volume de cerca de 5:2. Uma tal emulsão pode ser feita pela dissolução Tween 80 em PBS para dar uma solução de 2%, então a mistura de 90 ml desta solução com uma mistura de (5 g de DL-α-tocoferol e 5 ml de esqualeno), então microfluidizando a mistura. A emulsão resultante pode ter gotículas de óleo de submícron, por exemplo, com um diâmetro médio entre 100 e 250 nm, preferivelmente, a cerca de 180 nm. Uma emulsão de esqualeno, um tocoferol e um detergente Triton (por exemplo, Triton X-100). A emulsão também pode incluir um 3d-MPL (ver abaixo). A emulsão pode conter um tampão de fosfato. Uma emulsão compreendendo um polissorbato (por exemplo, polissorbato 80), um detergente Triton (por exemplo, Triton X-100) e um tocoferol (por exemplo, um succinato de α-tocoferol). A emulsão pode incluir estes três componentes em uma razão em massa de cerca de 75:11:10 (por exemplo, 750 μg/ml de polissorbato 80, 110 μg/ml de Triton X-100 e 100 μg/ml de succinato de α-tocoferol) e estas concentrações devem incluir qualquer contribuição destes componentes a partir dos antígenos. A emulsão também pode incluir esqualeno. A emulsão também pode incluir um 3d-MPL (ver abaixo). A fase aquosa pode conter um tampão de fosfato. Uma emulsão de esqualeno, polissorbato 80 e poloxâmero 401 (“Pluronic™ L121”). A emulsão pode ser formulada na solução salina tamponada por fosfato, pH 7,4. Esta emulsão é um veículo de liberação útil para dipeptídeos de muramila e foi usada com treonil- MDP no adjuvante “SAF-1” (Allison & Byars (1992) Res Immunol 143:519-25) (0,05-1% de Thr-MDP, 5% de esqualano, 2,5% de plurônico L121 e 0,2% de polissorbato 80). Também pode ser usado sem o Thr-MDP, como no adjuvante “AF” (Hariharan et al. (1995) Cancer Res 55:3486-9) (5% de esqualano, 1,25% de Plurônico L121 e 0,2% de polissorbato 80). A microfluidização é preferida. • Uma emulsão tendo de 0,5-50% de um óleo, 0,1-10% de um fosfolipídeo e 0,05-5% de um tensoativo não iônico. Como descrito em WO95/11700, os componentes de fosfolipídeo preferidos são fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, esfingomielina e cardiolipina. Os tamanhos de gotículas de submícron são vantajosos. • Uma emulsão óleo em água de submícron de um óleo não metabolizável (tal como óleo mineral leve) e pelo menos um tensoativo (tal como lecitina, Tween 80 ou Span 80). Os aditivos podem ser incluídos, tal como saponina QuilA, colesterol, um conjugado de saponina-lipófilo (tal como GPI-0100, descrito em US 6.080.725, produzido pela adição de amina alifática a desacilsaponina por intermédio do grupo de carboxila de ácido glucurônico), brometo de dimetildioctadecilamônio e/ou N,N- dioctadecil-N,N-bis (2-hidroxietil)propanodiamina. • Uma emulsão em que a saponina (por exemplo, QuilA ou QS21) e um esterol (por exemplo, um colesterol) são associados com micelas hélicas (WO2005/097181).

[0092] A invenção também provê um conjugado da invenção, para uso na medicina. Por exemplo, em uma modalidade, o conjugado da invenção é usado para aumentar uma resposta de anticorpo em um mamífero.

[0093] A invenção também provê um método para aumento de uma resposta imune em um mamífero, compreendendo administrar um conjugado ou composição farmacêutica da invenção ao mamífero. A invenção também provê um método para aumento de uma resposta imune dependente de T essencialmente livre de uma resposta imune independente de T em um mamífero, compreendendo administrar um conjugado ou composição farmacêutica da invenção ao mamífero.

[0094] A invenção também provê o uso de um conjugado ou composição farmacêutica da invenção na fabricação de uma vacina para a prevenção da doença.

[0095] Em uma modalidade, a invenção também provê o uso de um conjugado da invenção na fabricação de um medicamento para prevenção da febre tifoide em um mamífero.

[0096] A resposta imune aumentada pelos métodos e usos geralmente incluirá uma resposta de anticorpo, preferivelmente uma resposta de anticorpo protetor. Os métodos para avaliar as respostas de anticorpo após a imunização de sacarídeo são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, ensaio ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado por enzima) é comumente usado para medir a resposta anti-Vi IgG. A resposta de anticorpo é preferivelmente uma resposta IgG, com isotipo típico trocando de características IgM para IgG das vacinas glicoconjugadas. A resposta imune tipicamente é profilática. O mamífero é preferivelmente um humano.

[0097] Os conjugados da presente invenção são considerados ser mais efetivos na geração de uma resposta dependente T comparada aos conjugados onde o polissacarídeo de Vi não foi fragmentado. Para resposta “dependente T” é significado que os conjugados são capazes de induzir um aumento na resposta anti-Vi após reinjeção (resposta anamnéstica típica). Para “resposta dependente T essencialmente livre da resposta independente T” é significado que os conjugados não são capazes de induzir uma resposta anti-Vi em camundongos de nocaute de célula T.

[0098] Os conjugados que geram uma resposta dependente T são considerados vantajosos na geração de uma resposta independente T visto que as respostas independentes T foram observadas não induzir memória, são consideradas subfavoráveis em crianças com 2 anos de idade, não levam a hipermutação somática nos centros germinais dos tecidos linfoides secundários e por esta razão maturação por afinidade da resposta de anticorpo (ver, por exemplo, Pollard A.J. et al., Nat. Rev. Immunol., 2009; 9: 213). Além disso, as respostas independentes T podem incluir um estado de hipossensibilidade à vacinação subsequente (ver, por exemplo, Groupman J. et al., Expert Rev. Vaccines, 2011; 10: 307).

[0099] Os conjugados da invenção aparecem para gerar uma resposta dependente T como é mostrado na Figura 2 e na Figura 8. A Figura 2 mostra a resposta de anticorpo anti-Vi em camundongos para os conjugados Vi fragmentados da invenção comparados ao conjugado de Vi natural e comparados ao conjugado de Vi não natural e fragmentado. A descrição dos materiais usada é dada na tabela do exemplo 5. Pode ser visto que, para os grupos 1 a 4 (correspondente aos grupos de Vi fragmentados 1 a 4 conjugados a CRM197) apesar da resposta anti-Vi IgG menor no dia 14 (T14) comparado ao conjugado de Vi natural (grupo 5) (significante para os grupos 1-3 comparados ao Vi natural, com p = 0,0418, <0,0001, 0,0297 respectivamente), um efeito intensificador visível é observado duas semanas após a segunda injeção no dia 35 (T49) (p = 0,004-0,008). Como mostrado na Figura 2, o anti-Vi aumentado foi induzido pelo Vi-CRM197 natural (grupo 5) após a primeira injeção e não aumenta após a segunda injeção. Esta falta de aumento após a segunda injeção também foi observada quando as dosagens inferiores de conjugado de Vi-CRMm natural foram usadas (0,044 μg, 0,35 μg e 2,8 μg - dados não mostrados), indicando que a falta de aumento nos níveis de anticorpo não é devido a uma resposta máxima sendo induzida seguindo uma dosagem. Pode ser hipotetizado que a resposta ao conjugado de Vi natural é devido a capacidade de da cadeia Vi natural longa atuar como antígeno independente T. Este é suportado pelo fato que o Vi natural não conjugado (grupo 10) é capaz de induzir uma resposta mais alta do que as cadeias Vi mais curtas (grupos 6 a 9), ainda se menor do que conjugado de Vi natural (grupo 5). Em contraste, conjugados Vi fragmentados (grupos 1 a 4) induzem a resposta menor no dia 14 que ainda foram aumentados pela segunda injeção, atingindo tituladores anti-Vi IgG comparáveis após duas dosagens como conjugado de Vi natural. O Grupo 4 conjugado, caracterizado pelo comprimento de cadeia Vi de 82 kDa mostrou um comportamento intermediário quando comparado aos conjugados do Vi fragmentado tendo peso molecular médio inferior (grupos 1 a 3) e conjugado de Vi natural (grupo 5). De fato, a resposta no dia 14 foi maior do que com os conjugados Vi fragmentados mais curtos e não significantemente diferentes do que com conjugado de Vi natural.

[00100] Como pode ser visto na Figura 2, Vi fragmentado não conjugado induz uma resposta de anticorpo Vi IgG diminuída (grupos 6 a 9) comparada com Vi natural (grupo 10). A resposta a Vi natural (165kDa) é maior do que a resposta ao Vi fragmentado (82kDa - grupo 9), que é por sua vez maior do que a resposta ao Vi fragmentado (9,5 kDa, 22,8 kDa, 42,7 kDa - grupos 6 a 8 respectivamente) (no 14 a resposta induzida pelos grupos de Vi fragmentados não conjugados 1 a 3 é significantemente menor com relação ao Vi natural, com p = 0,0004, 0,0056, 0,0403 respectivamente). Deste modo, os inventores identificaram um comprimento de cadeia crítica (cerca de 82 kDa) abaixo do qual o polissacarídeo de Vi não é mais longo capaz de atuar como antígeno independente T. Os conjugados Vi preparados de polissacarídeos incapazes de induzir a característica de resposta dos antígenos independentes T são preferidos.

[00101] A fim de verificar a hipótese que para o Vi fragmentado não conjugado a capacidade de extrair uma resposta de anticorpo independente T é prejudicada e que os conjugados Vi fragmentados são capazes de induzir uma resposta dependente de T essencialmente livre de uma resposta independente T, conjugados Vi-CRM197 fragmentados e Vi-CRM197 naturais foram testados nos camundongos de nocaute na célula T (camundongos TCR βδ-/-). Como pode ser visto na Figura 8, os camundongos de nocaute da célula T respondem apenas ao Vi de comprimento total conjugado ou não conjugado, mas não aos conjugados de Vi fragmentados. Além disso, o Vi natural conjugado, mas não conjugado é capaz de induzir uma resposta mais alta no tipo selvagem do que nos camundongos de nocaute de célula T (p=0,028 dia 14; p=0,002 dia 42), indicando que a resposta alta nos camundongos de tipo selvagem deriva-se de atividade dependente T/independente T misturada.

[00102] Deste modo, um aspecto da invenção refere-se a um método para aumento de uma resposta imune dependente de T essencialmente livre de uma resposta imune independente de T em um mamífero, compreendendo administrar o conjugado ou a composição farmacêutica da invenção ao dito mamífero.

[00103] Em um aspecto da invenção, aqui é provido um método para intensificar a resposta imune produzida por um conjugado de polissacarídeo em um mamífero. O método compreende: a) identificar o valor do peso molecular médio em que um polissacarídeo não conjugado interrompe para induzir uma resposta de anticorpo anti-Vi IgG significante; b) produzir um conjugado de polissacarídeo com peso molecular médio abaixo do valor determinado na etapa a) e c) administrar o conjugado obtido na etapa b) a um mamífero.

[00104] Os conjugados da presente invenção, isto é, contendo conjugado de Vi fragmentado a uma proteína carreadora como definido neste, também são mais efetivos do que Vi fragmentado não conjugado na indução de uma resposta de anticorpo apropriada (ver a Figura 2).

[00105] As composições da invenção geralmente serão administradas diretamente a um indivíduo. A liberação direta pode ser acompanhada pela injeção parenteral (por exemplo, subcutaneamente, intraperitonealmente, intravenosamente, intramuscularmente, ao espaço intersticial de um tecido), ou pela administração retal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intradérmica, ocular, nasal, aural ou pulmonar. A administração de injeção ou intranasal é preferida.

[00106] A invenção pode ser usada para extrair a imunidade sistêmica e/ou mucosal.

[00107] As vacinas preparadas de acordo com a invenção podem ser usadas para tratar tanto crianças (incluindo crianças jovens) quanto adultos. Deste modo um indivíduo pode ser menor do que 1 ano de idade, 1-5 anos de idade, 5-15 anos de idade, 15-55 anos de idade, ou pelo menos 55 anos de idade. Os indivíduos preferidos para receber as vacinas são jovens (por exemplo, <5 anos de idade). As vacinas não são adequadas unicamente para estes grupos, entretanto e podem ser mais usadas geralmente em uma população.

[00108] O tratamento pode ser por uma lista de dosagem simples ou uma lista de dosagem múltipla. As dosagens múltiplas podem ser usadas em uma lista de imunização primária e/ou em uma lista de imunização intensificadora. Em uma lista de dosagem múltipla as várias dosagens podem ser dadas pelas mesmas vias ou diferentes, por exemplo, um início parenteral e intensificação mucosal, um início mucosal e intensificação parenteral, etc. A administração de mais do que uma dosagem (tipicamente duas dosagens ou três dosagens) é particularmente úteis nos pacientes imunologicamente simples. As dosagens múltiplas serão tipicamente administradas pelo menos 1 semana a parte (por exemplo, a cerca de 2 semanas, a cerca de 3 semanas, a cerca de 4 semanas, a cerca de 6 semanas, a cerca de 8 semanas, a cerca de 10 semanas, a cerca de 12 semanas, a cerca de 16 semanas, etc). Um exemplo da lista provê uma primeira dosagem em 6 semanas de idade e uma segunda dosagem em 10 semanas de idade, para coincidir com as imunizações infantis existentes (coadministração com vacinas EPI). Esta lista primária pode ser seguida por uma dosagem intensificadora após o primeiro aniversário da criança.

[00109] Os conjugados da invenção podem ser combinados com outros antígenos em uma composição simples para imunização simultânea contra os patogênicos múltiplos. Como uma alternativa para fabricação de uma vacina combinada, os conjugados podem ser administrados aos indivíduos substancialmente ao mesmo tempo como (por exemplo, durante a mesma consulta médica ou visita a um profissional de saúde ou centro de vacinação) outras vacinas. Os antígenos para uso nestas vacinas de combinação ou para administração simultânea incluem, por exemplo, imunogênicos de Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus e/ou Pseudomonas aeuruginosa, vírus de hepatite A, vírus de hepatite B, Neisseria meningitidis (tal como sacarídeos ou sacarídeos conjugados, para sorogrupos A, C, W135 e/ou Y), Streptococcus pneumoniae (tal como sacarídeos ou sacarídeos conjugados), etc.

[00110] Em uma modalidade, uma composição pode compreender um conjugado da invenção em combinação com um antígeno Salmonella Paratyphi A, tal como um antígeno H ou O (por exemplo, um antígeno de sacarídeo O:2, conjugado a uma proteína carreadora, para prover uma vacina tifoide bivalente. Em uma modalidade, uma composição pode compreender um conjugado da invenção em combinação com um antígeno Salmonella Typhimurium, tal como um antígeno H ou O (por exemplo, um sacarídeo O:9), conjugado a uma proteína carreadora. Em uma modalidade, uma composição pode compreender um conjugado da invenção em combinação com um antígeno Salmonella Enteritidis, tal como um antígeno H ou O (por exemplo, um sacarídeo O:4,5), conjugado a uma proteína carreadora. Em uma modalidade, os conjugados da invenção podem ser combinados com antígenos apresentados na forma de partículas de membrana externas denominadas módulos generalizados para antígenos de membrana (GMMA) ou vesículas de membrana externa natural (NOMV). Os exemplos de tais partículas de membrana são divulgados em, por exemplo, WO2012/049662 e WO2011/036564.

[00111] Os seguintes exemplos são pretendidos ilustrar a invenção e não devem ser construídos como limitações a estes. As temperaturas são dadas em graus Celsius. A estrutura dos produtos finais, intermediários e materiais de partida é confirmada pelos métodos analíticos padrão, por exemplo, microanálise e características espectroscópicas. As abreviações usadas são aquelas convencionais na técnica. Abreviações ADH di-hidrazida de ácido adípico avMW peso molecular médio BCA ensaio de ácido bicinconínico EDAC 1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida h hora(s) HPAEC-PAD Cromatografia de Troca de Ânion de Desempenho Alto ligado com Detecção Amperométrica Pulsada HPLC cromatografia líquida de alta pressão HR resolução alta IR espectroscopia infravermelha kDa kilo Dalton LCMS cromatografia líquida e espectrometria de massa M molar MS espectroscopia de massa min minutos mL mililitro(s) mM milimolar NHS N-hidroxissuccinimida RMN ressonância magnética nuclear PS polissacarídeo rpm rotação por minuto RT temperatura ambiente SEC cromatografia de exclusão de tamanho TFF filtração de fluxo tangencial

Exemplo 1 Método para fabricação de grupos de Vi fragmentados e separação.

[00112] Vi foi solubilizado em água e H2O2 30% em peso foi adicionado para ter uma concentração final de 2,5 mg/ml de Vi e 5% (p/v) de H2O2. A mistura foi aquecida a 80±0,5°C por 2 horas. Após este tempo, a mistura foi injetada em coluna Hiscreen Capto Q (4,7 ml de carregamento de resina até 100 mg de mistura de Vi fragmentado) e quatro populações em peso molecular médio diferente (avMW) foram separadas usando-se um método de etapa gradiente. NaH2PO4 20 mM pH 7,2 e NaH2PO4 20 mM de NaCl 1M pH 7,2 foram usados como tampão A e B respectivamente. Mistura de Vi fragmentado foi carregada em água e grupos de avMW crescente foram eluídos em 25, 30, 37 e 45% de tampão B respectivamente. Cada grupo coletado foi dessalinizado contra água em uma coluna SEC Sephadex G-15.

[00113] Grupos de Vi fragmentados obtidos foram caracterizados por HPLC-SEC para o cálculo de avMW (ver a Figura 6), HPAEC-PAD para o teor de Vi (Micoli et al., Vaccine 2011), micro BCA (usando-se NAcGlcN como o padrão) para a determinação dos grupos CHO (Meeuwsen et al. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2000 89(1): 107-109). 1H RMN foi usado para verificar a identidade de Vi e calculando nível de O-acetilação (ver a Figura 4) (Micoli et al. Vaccine 2011). A Figura 7 mostra o perfil de HPLC- SEC do pool3 do Vi fragmentado, tendo avMW de 42,7 kDa e 80% da área (214 nm) entre 25 e 70 kDa.

Exemplo 2 Método para fabricação de Vi fragmentado pelo uso de H2O2 e FeCl3 e separação.

[00114] 100 mg de Vi PS foi solubilizado em água; FeCl3 10 mM e H2O2 30% em peso foram adicionados para ter uma concentração final de 2,5 mg/ml de Vi, 0,1 mM de FeCl3 e 3% (p/v) de H2O2. A mistura foi aquecida a 30±0,1°C por 1h. Após este tempo, a mistura foi injetada em uma coluna Capto Q carregando 5 mg de mistura de Vi fragmentado por ml de resina. NaH2PO4 20 mM pH 7,2 e NaH2PO4 20 mM de NaCl 1M pH 7,2 foram usados como tampão A e B respectivamente. A mistura de Vi fragmentado foi carregada em 350 mM de NaCl e a população de interesse foi eluído em 40% de tampão B. O grupo de Vi fragmentado foi diafiltrado contra 10 volumes de água por TFF 30-kDa. O grupo de Vi fragmentado foi caracterizado por HPLC-SEC para o cálculo de avMW, HPAEC-PAD para o teor de Vi, 1H RMN para verificar a identidade de Vi e calculando nível de O-acetilação. Em particular, para uma preparação de Vi fragmentado de avMW 53,8 kDa foi obtido (menos de 17% de área < 30 kDa e menos 16% de área > 80 kDa). O nível de O-acetilação permaneceu alto (88%).

Exemplo 3 Método para fabricação de Vi fragmentado pelo uso de H2O2 e FeSO4 e separação.

[00115] 100 mg de Vi PS foi solubilizado em água; FeSO4 10 mM e H2O2 30% em peso foram adicionados para ter uma concentração final de 2,5 mg/ml de Vi, 0,1 mM de FeSO4 e 0,5% (p/v) de H2O2. A mistura foi aquecida a 30±0,1°C por 2 horas. Após este tempo, EDTA foi adicionado a uma concentração final de 10 mM para extinguir o catalisador. O peróxido de hidrogênio foi removido pela filtração do fluxo tangencial (membrana de 30 kDa) e tampão trocado por NaH2PO4 10 mM pH 7. A mistura foi aquecida a 80°C por 2h e então injetado em uma coluna Capto Q carregando 5 mg de mistura de Vi fragmentado por ml de resina. NaH2PO4 20 mM pH 7,2 e NaH2PO4 20 mM de NaCl 1M pH 7,2 foram usados como tampão A e B respectivamente. Mistura de Vi fragmentado foi carregado em tampão A e a população de MW desejado foi fracionado em gradiente linear (de tampão A a 100% a tampão B a 100% em 50 volumes de coluna). O grupo de Vi fragmentado selecionado foi diafiltrado contra 10 volumes de água por TFF 30-kDa. O grupo de Vi fragmentado foi caracterizado por HPLC-SEC para o cálculo de avMW, HPAEC-PAD para o teor de Vi, 1H RMN para verificar a identidade de Vi e calculando nível de O-acetilação. Em particular, para uma preparação de, Vi fragmentado de avMW 43,4 kDa foi obtido (menos 20% de área < 25 kDa e menos 20% de área > 70 kDa). O nível de O-acetilação permaneceu alto (85%).

Exemplo 4 Método para fabricação dos conjugados de Vi fragmentado

[00116] Para a conjugação de grupos de Vi fragmentados 1 a 3 (obtidos no exemplo 1), o seguinte procedimento foi usado para conjugar a preparação. O Vi fragmentado foi solubilizado em MES 100 mM pH 6 em uma concentração de 50 mg/ml. NHS e então EDAC foram adicionados para ter razão molar de unidades de repetição de EDAC/Vi de 5 e concentração de NHS 0,33 M. A reação foi misturada em RT por 1h. Após este tempo, CRM197-ADH, preparada como previamente descrito em Micoli et al. Vaccine 2011, foi adicionado para ter concentração de Vi e proteína de 7,8 mg/ml (razão p/p de Vi para proteína de 1) em MES 20 mM pH 6. A mistura foi misturada em RT por 2 horas. A formação de conjugado foi verificada por HPLC-SEC (coluna TSK gel 3000 PWXL) e nenhuma proteína residual foi observada nas misturas de reação. O conjugado foi separado por PS não reagido por cromatografia de exclusão de tamanho, em uma coluna 1,6 cmx60 cm Sephacryl 100 HR. As frações livres de Vi fragmentado não conjugado foram unidos e caracterizados.

[00117] Os conjugados purificados foram caracterizados por HPAEC- PAD para teor de Vi total (Micoli et al. Vaccine 2011), micro BCA para teor de proteína total, HPLC-SEC para determinar a distribuição de avMW do conjugado e estima a quantidade de proteína livre e sacarídeo livre. Para sacarídeos livres de conjugados de grupo 3 e grupo 4 foi estimado pelo método Capto Adhere/HPAEC-PAD. A tabela abaixo relata as características principais dos conjugados testados no exemplo 5.

[00118] Para o grupo 4 de Vi fragmentado obtido no exemplo 1, as condições de reação descritas acima resultaram na formação de gel, provavelmente por causa do avMW mais alto desta população. Para este grupo particular, a etapa de ativação com EDAC/NHS foi realizada com uma concentração de Vi de 15 mg/ml, concentração de NHS 0,1 M e razão molar de unidades de repetição EDAC/Vi de 5. As mesmas condições foram usadas para a etapa de conjugação com CRM197-ADH.

Determinação de quantidade de Vi livre no conjugado pelo método Capto Adhere/HPAEC-PAD

[00119] O grânulo que deriva de 500 μL de suspensão de resina Capto Adhere, lavado com 20 mM de AcONa 30% de CH3CN pH 5, foi usado para o tratamento da amostra. 1,3 ml de conjugado em 20 mM de NaH2PO4 pH 7,2 (concentração de Vi total na faixa de 60 a 150 μg/ml) foi adicionado de 390 μL de CH3CN (a solução resultante é indicada aqui como amostra carregada). Um mililitro da amostra carregada foi adicionado na resina e incubado em RT por 30 minutos em uma roda rotativa. Após este tempo, a amostra foi centrifugada (5 minutos a 4°C 14000 rpm) e o sobrenadante (indicado como fluxo direto) consumido. O grânulo foi lavado (adição de solvente à resina, misturado manualmente) com 1 ml 20 mM AcONa 30% de CH3CN pH 5 (duas vezes). O grânulo foi recuperado por centrífuga (5 minutos a 4°C 14000 rpm). Os sobrenadantes (2 ml de volume total) coletados foram indicados como solução de lavagem. O grânulo foi adicionado de 500 μl de 1 M AcONa 30% de CH3CN pH 5, misturado manualmente e separado por centrífuga (5 minutos a 4°C 14000 rpm). Esta operação foi repetida seis vezes unindo os sobrenadantes indicados como solução de retirada (3 ml de volume total). A solução de retirada, solução de lavagem, fluxo direto e 0,5 ml da amostra carregada foi secada em speedvac e reconstituída no mesmo volume de água. Todas as amostras foram analisadas por HPLC-SEC (emissão de fluorescência) para verificar a ausência de conjugados em fluxo direto, soluções de lavagem e retirada. A amostra carregada e a solução de retirada foram estimadas quanto ao teor de Vi por HPAEC-PAD.

[00120] A razão de teor de Vi na solução de retirada (Vi não conjugado) e na solução carregada (total Vi), corrigida por diluição, representa a % de Vi livre na amostra. Caracterização de conjugados por HPLC-SEC

[00121] HPLC-SEC foi usado para caracterizar os conjugados em termos de proteína livre e sacarídeo livre. Todas as amostras foram eluídas em uma coluna TSK gel G3000 PWXL (30 cm x 7,8 mm; tamanho de partícula 7 μm; cod. 808021) com coluna de proteção TSK gel PWXL (4,0 cm x 6,0 mm; tamanho de partícula 12 μm; cod. 808033) (Tosoh Bioscience). A fase móvel foi de 0,1 M de NaCl, 0,1 M de NaH2PO4, 5% de CH3CN, pH 7,2 na taxa de fluxo de 0,5 ml/minuto (método isocrático por 30 minutos). HPLC-SEC também foi usado para estimar a quantidade de proteína não conjugada (detecção de emissão de fluorescência) e Vi fragmentado (para o grupo 1 e 2) (detecção de índice de refração) em amostras conjugadas. A área de proteína não reagida foi quantificada com respeito a uma curva de calibração construída com amostras de proteína na faixa de 5 a 50 μg/ml. A porcentagem de proteína foi calculada dividindo a quantidade de proteína livre detectada por HPLC-SEC pela quantidade total de proteína quantificada na amostra por micro BCA. Similarmente, a quantidade de Vi fragmentado não conjugado foi quantificado com respeito a uma curva de calibração de Vi fragmentado (do mesmo avMW) na faixa de 20 a 50 μg/ml. A porcentagem de sacarídeo não conjugado foi calculada dividindo a quantidade de Vi livre detectado por HPLC-SEC pela quantidade total de sacarídeo quantificado na amostra por HPAEC-PAD.

Exemplo 5 Conjugados de Vi fragmentado (DT e TT como carreador)

[00122] A conjugação do grupo 3 de Vi (obtido no exemplo 1) foi realizada usando-se DT (toxoide de difteria) e TT (toxoide do tétano) como proteínas carreadoras. O Vi fragmentado foi ativado como descrito no exemplo 3 e DT-ADH ou TT-ADH (preparado como CRM197-ADH) foram adicionados na etapa de conjugação, usando-se as mesmas condições de reação descritas no exemplo 3 (razão p/p de Vi para proteína de 1). DT-ADH e TT-ADH foram caracterizados por um número alto de ligantes de ADH introduzidos por proteína (12 e 23,5 respectivamente contra 6 de CRM197). As características principais dos conjugados resultantes são relatados na Tabela abaixo.

Exemplo 6 Teste in vivo em camundongos

[00123] Dez grupos de camundongos fêmeas com 10 semanas de idade foram imunizados com conjugados de Vi-CRM197 tendo Vi de comprimento de cadeia diferente (como obtido no exemplo 3, grupos 1 a 4 na tabela abaixo), com conjugado de Vi-CRM197 natural (grupo 5 na tabela abaixo) e com os Vis de polissacarídeos não conjugados correspondentes (grupos 6 a 10). A tabela abaixo resumiu o projeto do estudo. Duas injeções subcutâneas de 200 μL cada contendo 8 μg de antígeno Vi foram dados nos dias 0 e 35, com sangrias nos dias 14, 35 e 49. Os antígenos foram injetados com em solução salina sem adjuvante. A resposta anti-Vi e anti-CRM197 foi avaliada por ELISA (como mostrado na Figura 2).

[00124] Como pode ser visto na Figura 2, entre o Vi não conjugado (grupos 6 a 10), o Vi de comprimento total (grupo 10) foi o [único capaz de induzir uma resposta clara após a primeira injeção. O mesmo foi verdade para o conjugado correspondente (grupo 5). Vi Nativo-CRM197 foi o único capaz de induzir uma resposta alta já após a primeira injeção, sem intensificador após a segunda injeção. Diferentemente, com todos os conjugados de Vi fragmentado (grupos 1 a 4), a resposta foi baixa após a primeira injeção e significantemente a primeira injeção e significantemente mais alta após a reinjeção.

[00125] Um estudo subsequente foi realizado para comparar conjugados de Vi naturais e fragmentado-CRM197 em camundongos do tipo selvagem e TCR βδ-/- (Figura 8). Dez grupos de fêmeas CD1 tipo selvagem (grupos 1 a 5 na tabela abaixo) e camundongos de nocaute de célula T (grupos 6 a 10 na tabela abaixo), 10 semanas de idade foram imunizados com conjugados de Vi-CRM197 tendo Vi de comprimento de cadeia diferente, com conjugado de Vi-CRM197 natural e com Vi de polissacarídeo não conjugado natural. Duas injeções subcutâneas de 200 μl cada contendo 8 μg de antígeno Vi foram dados nos dias 0 e 28, com sangrias nos dias 14, 28 e 42. Os antígenos foram injetados em solução salina sem o adjuvante. Resposta Anti- Vi e anti-CRM197 foi avaliado por ELISA (como mostrado na Figura 8).

[00126] Os dados obtidos confirmaram as hipóteses que o Vi fragmentado não é capaz de induzir uma resposta independente de T e que corresponde ao conjugado de Vi-CRM197 são capazes de induzir uma resposta dependente de T essencialmente livre de uma resposta independente de T em camundongos. Exemplo 7 - Teste in vivo em camundongos de comprimento total e Vi fragmentado (fVi) (grupo 3 descrito no exemplo 1) conjugado às proteínas carreadoras diferentes

[00127] Seis grupos de 8 camundongos fêmeas CD1 10 semanas de idade foram imunizados com conjugados relatados na Tabela abaixo.

nd: não detectável

[00128] Duas injeções subcutâneas de 200 μl cada contendo 1 μg de antígeno de Vi foram dados nos dias 0 e 35, com sangrias nos dias 14, 35 e 49. Os antígenos foram injetados na solução salina sem adjuvante. Anti-Vi foi avaliado por ELISA (como mostrado na Figura 9).

[00129] Como pode ser visto na Figura 9, com todos os conjugados de Vi naturais uma resposta no dia 14 foi observada, sem intensificação após a segunda injeção. A resposta de IgG anti-Vi foi similar em todos os conjugados Vi natural de comprimento total independente do carreador usado. Com Vi fragmentado conjugado, um aumento da resposta de IgG anti-Vi (efeito intensificador) após a segunda injeção ser observada para CRM197 e DT, mas não para TT, sugerindo que o Vi fragmentado conjugado a CRM197 ou DT são capazes de induzir uma resposta imune dependente de T essencialmente livre de uma resposta independente de T. Após a segunda injeção, a resposta de IgG anti-Vi foi similar independente do carreador usado.

Claims (17)

1. Conjugado adequado para uso em vacina compreendendo um polissacarídeo de Vi fragmentado e uma proteína carreadora selecionada de CRM197 ou toxoide de difteria, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo fragmentado tem um peso molecular médio de entre 40 e 55 kDa.

2. Conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo fragmentado tem um peso molecular médio de entre 41 e 49 kDa.

3. Conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo fragmentado tem um peso molecular médio de entre 51 e 55 kDa.

4. Conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo fragmentado tem um peso molecular médio de entre 42 e 46 kDa.

5. Conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo fragmentado tem um peso molecular médio de entre 45 e 50 kDa.

6. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a proteína carreadora é CRM197.

7. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica compreende o conjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em combinação com um carreador farmaceuticamente aceitável.

8. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a composição é não adjuvantada.

9. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a composição compreende um adjuvante.

10. Uso do conjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou da composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que o conjugado ou a composição farmacêutica são usados na fabricação de uma vacina para aumento de uma resposta imune em um mamífero.

11. Uso do conjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou da composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que o conjugado ou a composição farmacêutica são usados na fabricação de uma vacina para aumento de uma resposta imune dependente de T essencialmente livre de uma resposta imune independente de T em um mamífero.

12. Uso do conjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou da composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que o conjugado ou a composição farmacêutica são usados na fabricação de uma vacina para a prevenção da doença.

13. Uso do conjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou da composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que o conjugado ou a composição farmacêutica são usados na fabricação de uma vacina para a prevenção de febre tifoide em um indivíduo.

14. Método para a fabricação de um conjugado compreendendo polissacarídeo de Vi fragmentado e uma proteína carreadora selecionada de CRM197 ou toxina de difteria, caracterizado pelo fato de que o método compreende as etapas de: a. Fragmentar o polissacarídeo de Vi para obter um polissacarídeo de Vi fragmentado tendo um peso molecular médio de 40 a 55 kDa; b. Reagir o polissacarídeo de Vi fragmentado obtido na etapa a) com uma carbodiimida e N-hidroxissuccinimida em um pH de 5 a 6 para formar um éster de N-hidroxissuccinimida; c. Reagir o derivado de éster de N-hidroxissuccinimida Vi obtido na etapa b) com a proteína carreadora para produzir um conjugado.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a proteína carreadora é CRM197.

16. Conjugado adequado para uso em vacina, caracterizado pelo fato de que o conjugado é obtenível por um método como definido em qualquer uma das reivindicações 12 ou 13.

17. Uso de polissacarídeo de Vi fragmentado, caracterizado pelo fato de ser na manufatura de uma vacina conjugada, em que a vacina conjugada compreende um polissacarídeo de Vi fragmentado tendo um peso molecular médio de 40 a 55 kDa e uma proteína carreadora selecionada de CRM197 ou toxoide de difteria.

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