JP4011115B2 - 新規な融合蛋白回収および精製方法 - Google Patents
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Description
一般的には、本発明は、蛋白回収および精製のための新規方法、より詳細には、チオレドキシン様融合蛋白、とりわけIL−11の回収および精製方法に関する。
発明の背景
現在、組み換え法の出現は、適当に形質転換された宿主細胞中での高レベルの蛋白生産を可能にしている。宿主細胞が目的蛋白を分泌しない場合、細胞から蛋白を放出させ、次いで、さらに蛋白を精製する必要がある。
細胞内蛋白の精製の初期工程は、蛋白の細胞外媒体への放出である。典型的には、ホモジナイズまたはビーズによる粉砕のごとき機械的破壊方を用いてこれを行う。一般的には、目的蛋白は効果的に遊離されるが、かかる方法はいくつかの不利な点を有するであろう。Engler,Protein Purification Process Engineering,Harrison eds.:37-55(1994)。処理途中にしばしば起こる温度の上昇は蛋白の不活性化を引き起こすかもしれない。そのうえ、得られた懸濁液は広スペクトルの汚染混入蛋白、核酸および多糖を含有する。核酸および多糖は溶液の粘度を上昇させ、遠心分離、クロスフロー濾過またはクロマトグラフィーといった後処理を複雑化させるおそれがある。これらの汚染混入物質と目的蛋白との複雑な関係は、精製プロセスを複雑化し、許容されない低収率をもたらす可能性がある。そのようなものとして、細胞内蛋白を放出するためのより選択的な手段があればダウンストリームプロセッシングはさらに容易となるであろう。細胞を透過性にし、そして/または細胞内蛋白を抽出するためのいくつかの方法が報告されている。これらの方法は、透過性を促進し、そして/または抽出を促進するための溶媒、界面活性剤、カオトロピック剤、抗生物質、酵素、およびキレート剤の使用を包含する。増殖中の醗酵培地へのグリシンのごときある種の化合物の添加は、ある種の細胞内酵素の放出を促進することが報告されている。最終的には、凍結乾燥または浸透圧ショックのごとき方法も、ある種の細胞内蛋白を放出させることが報告されている。しかしながら、これらの方法は必ずしもすべての細胞内E.coli蛋白について許容されるわけではなく、大規模な処理への使用には限界があり、そして/または他の不利な点を有する。
例えば、トルエンおよびクロロホルムのごとき溶媒は細胞内蛋白の放出を促進するが、これらの物質は毒性および/または変異原性であることが知られている。Belter et al.,Bioseparations-Downstream Processing for Biotechnology:77-94(1988)。Ames,J of Bact.160:1181-1183(1984)。Windholtz et al.,The Merck Index 10th Edition:300 & 1364(1983)。Naglak et al.,Separation Process in Biotechnology,Asenjo eds.:177-205(1990)。SDSのごときイオン性界面活性剤は、しばしば、単離蛋白を不可逆的に変性させる(Scopes,Protein Purification Principles and Practice 3rd edition,Cantor eds.,22-43(1994))。Triton X-100またはTriton X-114のごとき非イオン性界面活性剤は、通常には、変性を起こさないが、回収された蛋白は、しばしば、界面活性剤ミセルに結合し、界面活性剤不含蛋白を得るためにさらなる処理を要することがある。Scopesの上記文献参照。尿素およびグアニジン塩酸のごときカオトロピック剤は、完全な蛋白放出に要する濃度において変性を引き起こす(Naglakらの上記文献およびHettwer,Biotechnology and Bioengineering 33:886-895(1989))。それらの有効性は培養の増殖相に依存する(Ingram,L.,Bacteriol.146:331-336(1981))。E.coliの透過性に影響するポリミキシンBのごとき抗生物質(Hancock,Ann.Rev.Microbiol.38:237-264(19884))は、製造工程における抗生物質の使用に関する一般的問題のため、典型的には医薬品工業には用いられない。酵素として比較的高価であるため(Belterら上記文献、Naglakら上記文献)、そして当該酵素剤からの目的蛋白のさらなる精製が必要であるために(Naglakら上記文献)、比較的穏やかな蛋白放出手段であるリゾチームの使用は限られている。さらに、キレート剤は、しばしば、リゾチーム(Naglak et al.,Biochem.Biophys.Acta 506:64-80(1978))またはTriton X-100(Levie,Annals New York Academy of Sciences 235:109-129(1974))による抽出のごとき透過性化/蛋白放出法の有効性を増大させるために用いられるが、目的蛋白の非特異的放出の問題がある。例えば、キレーターの使用により、E.coli細胞内蛋白の18%までが放出され、リポ多糖(LPS)およびホスファチジル−エタノールアミンとの望ましくない複合体形成が起こりうる。Naglakら上記文献。
蛋白放出のための他の方法の使用も不利な点を有する。例えば、細胞が高浸透圧媒体に懸濁され、回収され、次いで、低浸透圧バッファー中に置かれる浸透圧ショック法(Nossal et al.,J.Biol.Chem.241:3055-3062(1966)には、他の抽出方法を用いるさらなる処理工程が必要であり(Moir et al.,Separation Processes in Biotechnology,Asenjo eds:76-94(1990))、あるいはまた低温において多量の液体を取り扱う必要がある(Naglakら上記文献)。このことは、大規模処理の際に当該方法を魅力的でなくする。凍結−融解処理も細胞内蛋白を放出させるが、低収率であり、しばしば、多数回の繰り返し、またはさらなる処理が必要となる(Naglakら上記文献、Bucke上記文献)。さらに、細胞ペースト凍結法は、他の抽出方法と比較すると、さらなる慣用的でない処理を必要とする。結局、グリシンのごとき試薬を醗酵中に添加して細胞外媒体への蛋白の放出を促進することが行われてきた(Aristidou et al.,Biotechnology Letters 15:331-336(1993))いくつかの細胞内蛋白の部分的放出が報告されているが、この方法は、醗酵と放出方法との直接カップリング、およびその後の複雑でありうる細胞外ブロスからの目的蛋白の分離を必要とする。
蛋白を宿主細胞から放出させたならば、他の細胞成分からの目的蛋白の精製が必要となる。不幸なことに、細胞溶解のごとき大部分の抽出アプローチは、蛋白を細胞プロテアーゼによる分解にさらすのみならず、得られた懸濁液の他のエレメントからの蛋白の単離をより困難なものにする。例えば、DNA、RNA、リン脂質およびリポ多糖(LPS)のごとき負に帯電した分子は、しばしば、アニオン交換クロマトグラフィー(Sassenfeld,TIBTECH 8:88-93(1990);Spears,Biotechnology vol 3-Bioprocessing,Rehm eds:40-51(1993))の使用、および/またはプロタミン硫酸(Kelley et al.,Bioseparation 1:333-349(1991))、ストレプトマイシン硫酸(Wang et al.eds,Fermentation and Enzyme Technology:253-256(1979))、ポリエチレンイミン(PEI)(Kelleyら上記文献;Sassenfeld上記文献)のごときポリカチオンとの沈殿、および/またはポリエチレングリコール(PEG)/リン酸またはPEG/デキストランのごとき不混合性ポリマー系を用いる水性二相抽出(Kelleyら上記文献、Strandberg et al.,Process Biochemistry 26:225-234(1991))を必要とする。別法として、硫酸アンモニウムまたは塩化カリウムのごとき中性塩の添加(Wheelwright,Protein Purification:Design and Scale up of Downstream Processing:87-98(1991);Englard et al.,Methods in Enzymology Volume 182,Deutscher eds.:285-300(1990))、および/またはPEGもしくはデキストラン硫酸のごときポリマー(Wangra上記文献;Wheelwright上記文献)により非蛋白性ポリアニオン性汚染混入物質から目的蛋白を沈殿させてもよい。目的蛋白が正に帯電している場合には、それは負に帯電した分子(それにより蛋白精製が実質的に不可能となっている)に結合するであろう。
典型的には、研究者は、上記した最初の分画工程を用いて目的蛋白から障害となるポリアニオンを分離してきた。不幸なことに、特に医薬試薬の製造に用いる場合には、これらの最初の分離方法にはいくつかの不利な点がある。例えば、細胞溶解物中に見いだされる大量の非蛋白性ポリアニオン性汚染混入物質は、アニオン交換クロマトグラフィー樹脂の結合容量を低下させる傾向がある。さらに、再生プロトコールは、しばしば、樹脂へのしつこいポリアニオンの結合のため効果的でない。最終的には、蛋白結合に都合のよい低イオン強度の条件はポリアニオン−蛋白相互作用の破壊において効果的でなく、分離不足を生じる(Scopes,Protein Purification and Practice 3rd edition,Cantor eds.171(1994))。プロタミン硫酸標品は、プロテアーゼおよびウイルス混入の問題がある。そのうえ、この試薬を用いると、所望でない蛋白の沈殿が生じうる(Scopes,Protein Purification Principles and Practice 2nd edition,Cantor eds.,21-71(1987))。医薬蛋白の処理加工において、処理剤としての抗生物質の使用に対する不安のため、一般的にはストレプトマイシン硫酸は使用されない(Scawen et al.,Handbook of Enzyme Biotechnology 2nd Edition,Wiseman eds.:15-53(1985))。PEI標品は、しばしば、種々の量のエチレンジアミンモノマーにより汚染され、それは発癌剤である疑いがある(Scawenら上記文献)。またPEIは多くの樹脂に不可逆的に結合する傾向があり、そのことによりPEI清澄化後に用いるクロマトグラフィー樹脂の有効性および種類が限られる。一般的には、水性二相抽出系は予想が困難であり、目的蛋白が適当な水性相に移動する条件を決定するための実験的アプローチがしばしば必要である(Kelleyら上記文献)。目的蛋白を特異的に沈殿させる方法は、しばしば、分離を効果的でなくする非蛋白性汚染物質の沈殿中の混入を生じる(Scopes上記文献;Wheelwright,Protein Purification:Designand Scale up of Downstream Processing:87-98(1991))。
したがって、効果的な蛋白放出方法(非蛋白性汚染混入物質の放出を最小化し、あるいはなくす)ならびに効果的な精製方法(非蛋白性汚染混入物質、特にポリアニオン性汚染混入物質を除去する)、さらには容易に大規模使用できる蛋白放出および精製方法に対する必要性が当該分野において存在し続けている。
発明の簡単な概要
融合蛋白を細胞から放出させるキレーターを溶液に添加することによる、チオレドキシン様融合蛋白の細胞から溶液中への放出および精製方法が本発明により提供される。キレーター添加前の温度は、キレーター添加後の温度よりも低くてもよく、例えば、20〜40℃の温度差であり、35℃の温度差が好ましい。詳細には、該方法は10L以上ないし全体積数百リットルまでの細胞懸濁液体積であると定義される大規模処理に用いることができる。次いで、2価カチオン/アルコール溶液を添加し、それにより、融合蛋白を含有する可溶性フラクション、および所望でない汚染混入物質を含有する不溶性フラクションを得る。2価カチオンは、例えば、マグネシウム、マンガンおよびカルシウムのみ、または混合物を包含する。アルコールはメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、イソ−ブタノールおよびターシャリー−ブタノールを包含する。好ましくは、最終アルコール濃度は5ないし30%であり、14%エタノールが好ましい。得られる2価カチオン濃度は1ないし1000mMの範囲であってよく、50ないし200mMが好ましく、200mMのマグネシウムが最も好ましい。125mMのマグネシウムおよび75mMのカルシウム;125mMのマグネシウムおよび75mMのマンガン;ならびに125mMのマグネシウム、38mMのマンガンおよび38mMのカルシウムの組み合わせも好ましい。
本発明のもう1つの具体例において、得られた第1の可溶性フラクションに亜鉛を添加し、そのことにより第2の不溶性フラクションを形成し、そこから融合蛋白を単離することができる。キレーターを添加して、第2の不溶性フラグメントから蛋白を可溶化させてもよい。亜鉛の適当な源は、塩化亜鉛および酢酸亜鉛を包含する。最終亜鉛濃度は1ないし500mMであってよく、50mM塩化亜鉛が好ましい。
本発明蛋白は、形質転換された宿主細胞、例えばE.coli中で組み換え的に生産することができ、あるいは血漿、尿等のごとき可溶性の源から精製することができる。可溶性の源から精製する場合、キレーターを用いる最初の放出工程を省略することができ、上記2価カチオン/アルコール溶液の添加から直接精製を開始することができる。
特に、EDTAの添加、次いで、溶液が125mMの塩化マグネシウム、75mMの塩化カルシウムおよび14%のエタノールを含むようにするMgCl2、エタノールおよびCaCl2の添加、次いで、得られた可溶性フラクションからの融合蛋白の単離による、チオレドキシン様融合蛋白の細胞から溶液中への放出および精製方法が本発明により提供される。EDTA最終濃度は0.1ないし100mMの範囲であってよく、15mMが好ましい。本発明の好ましい具体例において、キレーター添加前の温度はキレーター添加後の温度よりも実質的に低く、例えば、添加前約3℃、添加後約37℃である。結果的に塩化マグネシウムおよび塩化カルシウムの濃度は、1ないし100mMの範囲であってよく、最終エタノール濃度は5ないし30%であってよい。
本発明のもう1つの具体例において、融合蛋白および融合パートナーのpIと比較した場合の目的蛋白のpIの相違を利用することにより目的蛋白を精製することができる。融合蛋白の開裂の前に、2種の相補的なイオン交換樹脂を繰り返し用い、結合蛋白の開裂後、2種のさらなる相補的なイオン交換樹脂を繰り返し用いる。該精製方法は、融合蛋白、すなわち、目的蛋白に連結された融合パートナーのpIが目的蛋白および融合パートナーのpIとは同じでないという事実を利用する。
本発明によれば、吸着工程を非吸着工程とカップリングさせて、使用条件下で逆に帯電した分子を厳密に除去し、開裂反応により付与される有効性および選択性を向上させる。これには、目的蛋白および融合パートナーとの融合蛋白のpIの相違を有効ならしめるための適当な樹脂の選択、ならびに対応するpHおよびイオン強度条件の選択の両方が必要である。融合蛋白を精製するためには、逆の電荷の汚染混入物質を排除するためには目的蛋白のpIに近接したpHを有することが望ましい。開裂後、すべての逆の電荷の汚染混入物質を排除するためには目的蛋白のpIに近接したpHを有することが望ましい。典型的には、クロマトグラフィー工程においてのみpHを調節することは、高レベルの汚染混入物質の除去を達成しない。したがって、本発明は、「イオンフィルター」として非吸着工程の付加を行って、指数的に効果的な汚染混入物質の除去を行う。選択された相補的イオン交換樹脂の特別な組み合わせは、伝統的なイオン交換法で達成できる精製レベルよりもずっと高レベルの精製を達成する。
本発明方法によれば、チオレドキシン様融合蛋白は第1の樹脂に結合され、溶離され、第2の樹脂(該融合蛋白は結合しない)に適用され、次いで、未結合フラクション中に集められ、次に、チオレドキシン融合蛋白は開裂され、開裂蛋白は第3の樹脂に結合され、溶離され、第4の樹脂に適用され、次いで、第4の樹脂から未結合フラクション中に集められる。第1および第4の樹脂はアニオン交換樹脂であり、第2および第3の樹脂はカチオン交換樹脂である。第1および第4の樹脂がカチオン交換樹脂である場合、第2および第3の樹脂はアニオン交換樹脂である。融合蛋白のpIおよび目的蛋白のpIに基づいて樹脂を選択する。例えば、開裂前に融合蛋白が負に帯電していて、開裂後に目的蛋白が正に帯電する場合、第1および第4の樹脂はアニオン交換樹脂であり、第2および第3の樹脂はカチオン交換樹脂である。あるいはまた、開裂前に融合蛋白が正に帯電しており、開裂後に目的蛋白が負に帯電する場合、第1および第4の樹脂はカチオン交換樹脂であり、第2および第3の樹脂はアニオン交換樹脂である。適当なアニオン交換樹脂は、ジエチルアミノエタン(DEAE)、ポリエチレンイミン(PEI)および4級アミノエタン(QAE)のごとき正に帯電した基を有する。適当なカチオン交換樹脂は、スルホニル、スルフィルプロピル(SP)、カルボニルおよびカルボキシメチルのごとき負に帯電した基を有する。
Toyopearl(登録商標) QAEのごとき第1のアニオン交換樹脂にチオレドキシン−IL−11を結合させ、第1の溶離液(好ましい溶離液は、100〜500mM NaClを含有するpH7.5〜8.5の20〜100mM Trisバッファーおよび0〜150mM NaClを含有するpH5.5〜5.6の50〜200mMヒスチジンバッファーを包含するが、最も好ましい溶離液は75mMヒスチジン、75mM NaCl,pH6.2である)を用いて溶離し、S Sepharose(登録商標)Fast Flowのごとき第1のカチオン交換樹脂にこの溶離物を適用し、チオレドキシン−IL−11を未結合フラクション中に集め、次いで、チオレドキシン−希IL−11融合蛋白を開裂させて正に帯電したIL−11を得て、CM Sepharose(登録商標)Fast Flowのごとき第2のカチオン交換樹脂に結合させ(好ましい溶離液は、100〜500mM NaClを含有するpH9.0〜10.0の50〜300mMグリシンバッファーを包含するが、最も好ましい溶離液は150グリシン、150mM NaCl,pH9.5であるmM)、Toyopearl(登録商標)QAEのごとき第2のアニオン交換樹脂にこの第2の溶離物を適用し、次いで、未結合フラクション中にIL−11を集めることを包含するIL−11の精製方法も、本発明により提供される。
発明の詳細な説明
組み換え的に生産される蛋白の大規模生産のために、典型的には、まず蛋白を細胞から放出させる。融合蛋白、例えば、E.coli中でチオレドキシン融合蛋白として蛋白を生産することができ、蛋白は、チオレドキシン融合パートナーの影響により、細胞内膜および細胞外膜が隣接する部位(時々、Bayerのパッチと呼ばれる)に指向されると考えられている。本発明方法によれば、Tris-EDTAのごときキレーターを用いて宿主細胞を選択的に透過性にして、目的融合蛋白を放出させる。EDTA以外のキレーター、例えば、DPTA、EGTA、CDTA、クエン酸塩等を用いることもできる。キレーター濃度範囲、反応温度、ならびに溶液のpHおよびイオン強度に関してプロセスは容易に最適化され、それらは当業者によく知られている。キレーターの適切な濃度は、溶質の性質、溶液のpH、溶液の温度、溶液のイオン強度、および金属キレートに対するキレーターのモル分率により変化させられることを、当業者は容易に理解する。水溶液のpHが2ないし11の間、温度が10℃ないし60℃の間、イオン強度が0ないし1の間、キレートに対するキレーターのモル比が0.1:1.0ないし1.0:0.1であるのが好ましい。宿主細胞からの目的蛋白の放出をモニターすることにより当業者は最適条件を容易に確認することができる。典型的には、最終キレーター濃度は0.1mMないし100mMの範囲であり、15mMが好ましい。本発明の好ましい具体例において、キレーター添加前の温度はキレーター添加後の温度よりも実質的に低く、例えば、添加前約3℃、添加後約37℃である。
グラム陰性細菌の外膜中のリポ多糖は、マグネシウムおよび/またはカルシウムイオンとイオン的相互作用を起こす(Vaara,Microbuilogical Reviews 56:395-411(1992);Hanock,Ann.Rev.Microbiol.38:237-264(1984);Felix,Anal.Biochem.120:211-234(1982))。おそらく、キレーターは、負に帯電した基の逆イオンとしての2価イオン、例えばマグネシウムおよびカルシウムイオンに作用するのであろう。このことにより、解離、次いで、膜中の間隙の生成が誘発されて融合蛋白の選択的放出が可能になる。
融合蛋白の培地中への放出後、所望ならば細胞残渣を例えば遠心分離により除去することができる。しかしながら、本発明の1の利点は、他の清澄化方法に通常要求されるような細胞残渣の除去を要しないということである。DNA、RNA、リン脂質およびリポ多糖、ならびに目的融合蛋白のごとき負に帯電した分子が溶液中に存在する。目的融合蛋白が正に帯電している場合、それは負に帯電した分子に結合し、蛋白の精製を実質的に不可能にするであろう。DNAの除去のためのポリエチレンイミン(PEI)の使用が当業者によく知られている(Scawenら上記文献)。不幸なことに、PEIは残存量のモノマーであるエチレンイミン(EI)により常に汚染されており(Scawenら,上記)、EIはOSHAにより発癌性の疑いのある作用剤として分類されている。本発明によれば、マグネシウム、マンガン、および/またはカルシウム、ならびにアルコールという1種またはそれ以上の2価カチオンの混合物、例えば、Mg++/ROHを用いて溶液からの負に帯電した分子の除去を行うことができる(Rは1ないし4個の炭素の短い炭素鎖、例えばメチル、エチルおよびプロピルの種々の異性体ならびにsec−ブチルおよびtert−ブチルであり、エチルが好ましい)。典型的には、2価カチオンは、塩化物イオン、硫酸イオン、酢酸イオン等のごとき逆イオンと一緒になった塩として添加される。この2価カチオン/アルコール溶液を、本明細書において時々、「アルコール溶液」という。
アルコール溶液を添加すると、大部分(すべてではないとしても)の目的蛋白は溶液中に残るが、汚染混入物質は溶液から沈殿して不溶性フラクションを形成する。この工程もまた、濃度、pH、温度、および時間に依存する。最適条件下での長いインキュベーションは目的蛋白の不可逆的沈殿を生じるかもしれない。高い温度および/または濃度および/またはpHは、蛋白の沈殿を増加させるかもしれない。50℃よりも低い温度および5ないし30%の間の最終アルコール濃度が好ましく、32℃および14%(体積/体積%)エタノールが最も好ましい。不十分な2価カチオンおよび/またはアルコール濃度は、有効でない清澄化、非蛋白性汚染混入物質の除去を引き起こす。好ましくは、最終2価カチオン濃度は1ないし1000mM;または50ないし300mM、50ないし200mMの範囲が最も好ましい。
清澄化の促進のためには、マンガンおよび/またはカルシウム塩をMg++/ROH溶液に添加してもよく、その最終濃度は1ないし1000mMとし、総モル数が1ないし1000mM、または50ないし300mM、最も好ましくは50ないし200mMとなるようにする。複数の2価カチオンを用いる場合、好ましい最終濃度は合計50ないし200mMの塩であり、例えば、125mMのマグネシウムおよび75mMのカルシウムまたはマンガン、あるいはそれらの種々の組み合わせ、例えば約125mMのマグネシウムおよび約38mMのマンガンおよび約38mMのカルシウムである。本明細書の用語「モル数」は、1リットルの溶液中に溶解した化合物のグラム分子重量数を意味する。
アルコール溶液の添加により、80〜90%のDNAおよびLPS分子が溶液から除去される。次いで、得られる溶液をさらに処理して目的蛋白を溶液から取り出す。例えば、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、酢酸亜鉛等のごとき亜鉛(Zn++)塩を用いて目的蛋白を沈殿させることができる。得られる沈殿を濃縮し、遠心分離および濾過を包含する固体/液体分離法により除去することができる。次いで、EDTA、DPTA、EGTA、CDTA、またはクエン酸塩のごときキレート剤により沈殿蛋白を可溶化させ、さらに精製することができる。可溶化前に沈殿を貯蔵してもよい。亜鉛濃度、金属濃度に対するキレーター濃度、pH、温度等についてプロセスを最適化することができ、それらは当業者によく知られたことであり、目的蛋白に対して用に容易に調節することができる。当該分野において知られているように、メタノール、エタノール、およびアセトンのごとき有機溶媒存在下では不可逆的蛋白沈殿が起こるかもしれない(Pennell,The Plasma Proteins Volume 1,Putman eds.:9-42(1960);Wang et al.eds,Fermentation and Enzyme Technology:253-256(1979);Scopes,Protein Purification and Practice 2nd edition,Cantor eds.,21-71(1987))。典型的には、低温で短時間処理を行うことによりこの現象を最小化する。目的蛋白の沈殿に好ましい条件は、一般的には、pH=6.0ないし8.5、1ないし500mMのZn++、20℃未満の温度、および24時間未満の処理時間である。最も好ましい条件は、pH=7.0、0℃、15分、最終ZnCl2濃度50mMにおける沈殿である。
次いで、当該分野で知られた固体/液体分離法により沈殿を除去し、次いで、効果的に保存することができる。処理のこの段階において、蛋白はもはや溶液中にはなく、蛋白分解を受けるおそれが少ない。さらに、蛋白を少なくとも1オーダー濃縮するので、大規模処理の中間体の−20ないし−80℃における長期(約2カ月)凍結保存が容易となる。したがって、この工程は、プロセスの精製の部分からのデカップリング回収のための工程である。
さらなる処理の前に、蛋白沈殿をキレート剤で可溶化する。好ましい可溶化条件はpH=6.5ないし11、40℃未満の温度、および1モルあたりのキレーターのモル比約0.5ないし1000である。pH=8.0、20℃、1モルのZn++あたり5〜100モルの割合のキレーターEDTAを用いる可溶化が最も好ましい。典型的には、目的蛋白の70%以上が沈殿、固体液体分離および可溶化により回収される。
別法として、あるいはさらに、目的融合蛋白をさらに精製することができる。融合蛋白の開裂の前に2種のイオン交換樹脂を用い、融合蛋白の開裂後に2種のイオン交換樹脂を用いて精製を行うことができる。当該プロセスは、融合蛋白(すなわち、目的蛋白に連結された融合パートナー)のpIと目的蛋白および融合パートナーのpIとの相違を利用するものである。例えば、目的蛋白が融合パートナーとして発現された場合、ならびに蛋白の融合形態が開裂形態のpIとは実質的に異なる場合(例えば、蛋白の融合形態が塩基性のpIを有し、開裂形態は酸性のpIを有する場合(あるいはその逆も可)には融合形態は酸性であり、開裂形態は塩基性である)には、相補的なイオン交換樹脂を用いる開裂形態の精製のためにpIの相違を有利に用いることが可能である。
より詳細には、まず、融合蛋白を適当なタイプのイオン交換樹脂で精製する。例えば、負に帯電した融合蛋白を結合させるにはアニオン交換樹脂(あるいは逆に、正に帯電した融合蛋白を結合させるにはカチオン交換樹脂)を用いる。次に、融合形態の蛋白の場合とは異なるpIおよび操作pHを有する相補的なタイプのイオン交換樹脂を用いて、プロセスの流れからさらに汚染混入物質を除去する。例えば、酸性のpIを有する融合蛋白の場合には、操作pHが融合蛋白のpIよりも高く、操作pHにおいて融合蛋白は結合せずに樹脂を素通りするが、操作pHよりも高いpIを有する汚染混入物質は樹脂と結合する条件下でカチオン交換樹脂を用いることができる(あるいは逆に、塩基性のpIを有する融合蛋白の場合には、操作pHが融合蛋白のpIよりも低く、操作pHにおいて融合蛋白は結合せずに樹脂を素通りするが、操作pHよりも低いpIを有する汚染混入物質は樹脂と結合する条件下でアニオン交換樹脂を用いることができる。イオン交換クロマトグラフィーの分野の当業者に理解されているように、溶液のイオン強度を変化させる化合物を添加することによりpHについての必要条件を修飾してもよい。融合蛋白を未結合フラクション(時々、素通しフラクションという)中に簡単に集める。著しく異なるpIを有する汚染混入物質から精製された融合蛋白標品を生じさせるのは、これらの相補的イオン交換樹脂の組み合わせによる精製である。
次に、融合蛋白を開裂して構成蛋白、すなわち、融合形態とは有意に異なるpIを有する目的蛋白および融合パートナーとすることができる。次いで、さらなるイオン交換クロマトグラフィーの適用により目的蛋白の精製を行うことができる。融合形態が樹脂に結合しなかった場合には、目的の開裂蛋白が結合せずに樹脂を素通りし、一方汚染混入物質(未開裂融合蛋白および/または開裂中に遊離された目的蛋白の一部である融合パートナーを含む)は樹脂に結合する(あるいは逆に、融合形態が結合せずに樹脂から素通りした場合には、目的の開裂蛋白は樹脂に結合するが、汚染混入物質は結合しない)。より詳細には、まず、開裂反応生成物を、例えばカチオン交換樹脂に適用(開裂蛋白が正に帯電している場合)するか、あるいは逆にアニオン交換樹脂に適用する(生成蛋白が負に帯電している場合)。次に、開裂蛋白が結合せずに樹脂を素通りし、負に帯電した汚染混入物質(あるいは逆に、正に帯電した汚染混入物質)が樹脂に結合する条件下で相補的イオン交換樹脂、例えば、アニオン交換樹脂(あるいは逆に、カチオン交換樹脂)を用いる。目的蛋白を素通し画分中に集める。さらに、これらのさらなるイオン交換の組み合わせにより、目的蛋白とは著しく異なるpIを有する汚染混入物質をさらに精製して除去する。
イオン交換樹脂の多くの組み合わせが可能である。下表1には8つのバリエーション、すなわち、負に帯電した融合蛋白(正に帯電した開裂蛋白を伴う)の場合の4つのバリエーション、および正に帯電した融合蛋白(負に帯電した開裂蛋白を伴う)の場合の4つのバリエーションを示す。
選択される個々のバリエーションは、相補的な交換樹脂のいずれの配列が最大の精製効率を生じるかによる。例えば、チオレドキシン−IL−11の精製については、驚くべきことに、第1の配列(I)により最も効果的な精製が行われることがわかった。意外にも、ある種の正に帯電した汚染混入物質は第1のアニオン交換樹脂に結合し、チオレドキシン−IL−11融合蛋白とともに溶離される。次いで、これらの正に帯電した汚染混入物質はその後のカチオン交換樹脂に結合するが、チオレドキシン−IL−11融合蛋白は結合せず、素通りするだけである。かくして、特定の適用については、融合蛋白が最初の工程において結合する開裂前の配列を選択し、それにより大部分の汚染混入物質が素通しフラクション中に残存するようにすることが好ましい。同様に、開裂後の最初の工程において目的開裂蛋白が結合する開裂後の配列を選択し、それにより汚染混入物質の大部分が素通りフラクション中に残存するようにすることが好ましいかもしれない。
目的蛋白をアニオン交換樹脂から溶離するのに適する溶離液は当業者によく知られており、例えば、所望pH値を維持することができ、蛋白を樹脂から脱離させうる0ないし1.0Mのイオン性塩を含有するものが挙げられる。
目的蛋白をカチオン交換樹脂から溶離するのに適する溶離液は当業者によく知られており、例えば、所望pH値を維持することができ、蛋白を樹脂から脱離させうる0ないし1.0Mのイオン性塩を含有するものが挙げられる。
本発明によれば、望ましくは、組み換え系における発現のために選択された異種ペプチドまたは蛋白をコードいているDNA配列が、宿主細胞における発現のためにチオレドキシン様DNA配列に融合される。本明細書において、チオレドキシン様DNA配列は、E.coliチオレドキシンのアミノ酸配列に対する少なくとも30%のアミノ酸配列相同性により特徴づけられる蛋白または蛋白フラグメントをコードしているDNA配列であると定義される。McCoy,.et al.,USPN 5292646(1994年3月8日付与)にはE.coliチオレドキシン配列(該明細書中の配列番号:22)が開示されており、参照により本明細書に記載されているものとみなす。あるいはまた、本明細書において、チオレドキシン様DNA配列を、ヒトまたはE.coliチオレドキシンと実質的に同様の3次元構造を有し、活性部位ループを含んでいてもよいことにより特徴づけられる蛋白または蛋白フラグメントをコードしているDNA配列として定義する。グルタレドキシンのDNA配列はチオレドキシン様DNA配列の例であり、それは3次元コンホーメーションが実質的に同様であり、Cys....Cys活性ループを含む蛋白をコードしている。E.coliチオレドキシンのアミノ酸配列は、H.Eklund et al.,EMBO J.3, 1443-1449(1984)に記載されている。E.coliチオレドキシンの3次元構造は、A.Holmgren,J.Biol.Chem.264:13963-13966(1989)の図2に示されている。McCoyらの上記文献の図1において、ヌクレオチド2242〜2568はE.coliチオレドキシン蛋白をコードしているDNA配列を含む(Lim et al.,J.Bacteriol.,163:311-316(1985))(McCoyら上記文献)。E.coliチオレドキシンとグルタレドキシンの3次元構造の比較は、Xia,Protein Science I:310-321(1992)に公表されている。当業者に知られたチオレドキシン様蛋白についての情報を提供する目的で、参照により、これら4つの刊行物を本明細書に記載されているものとみなす。
本発明において有用なチオレドキシン様蛋白の第1の例として、E.coliチオレドキシンは以下の性質を有する。E.coliチオレドキシンは小型蛋白であり、わずか11.7kDであり、高レベルで産生される(>10%、細胞を溶解してA550/mlを10とした場合、15μMの濃度に匹敵する)。蛋白の小さなサイズおよび高レベル産生能は高い細胞内濃度に貢献する。さらにE.coliチオレドキシンは、所望ペプチドまたは蛋白への融合により引き起こされる構造全体の安定性に対する影響を最小限にしうる非常に安定で堅固な構造により特徴づけられる。
E.coliチオレドキシンの3次元構造は知られており、数個の表面ループを含み、それらは蛋白本体から突出した残基Cys33とCys36との間のはっきりとしたCys....Cys活性部位ループを含んでいる。このCys....Cys活性部位ループは同定可能でアクセス可能な表面ループ領域であり、構造全体の安定性に影響する蛋白の残りの部分との相互作用に関与しない。それゆえ、それはペプチド挿入についてのよい候補である。E.coliチオレドキシンのアミノおよびカルボキシル末端は両方とも蛋白の表面上にあり、融合のために容易にアクセスできる。ヒト・チオレドキシン、グルタレドキシンおよび他のチオレドキシン様分子も、このCys....Cys活性部位ループを有する
またE.coliチオレドキシンはプロテアーゼに対して安定である。よって、E.coliチオレドキシンは、E.coli発現系における使用に望ましいかもしれない。なぜなら、それはE.coliのプロテアーゼに対する安定性によりE.coli蛋白として特徴づけられるからである。またE.coliチオレドキシンは80℃までの熱および低pHに対しても安定である。
本発明において有用な、チオレドキシン様DNA配列によりコードされる他のチオレドキシン様蛋白は、同種のアミノ酸配列、ならびに類似の物理的および構造的特徴を有している。よって、他のチオレドキシン様蛋白をコードするDNA配列を、本発明E.coliチオレドキシンのかわりに用いてもよい。本発明の組成物および方法において本発明者により、例えば、他の種のチオレドキシン、例えば、ヒト・チオレドキシンをコードしているDNA配列が用いられた。NMR構造を比較することによりわかるように、ヒト・チオレドキシンは、E.coliの3次元構造と視覚的に重なりうる3次元構造を有している。またヒト・チオレドキシンは、E.coli蛋白に見いだされるCys....Cys活性部位ループと構造的および機能的に等価な活性部位ループを含む。イン・フレームでヒト・チオレドキシンのカルボキシル末端に融合したヒト・IL−11(すなわち、ヒト・チオレドキシン/IL−11融合蛋白)は、実施例1〜2において説明するE.coliチオレドキシン/IL−11融合蛋白と同じ発現特性を示した。したがって、ヒト・チオレドキシンはチオレドキシン様分子であり、本発明方法による蛋白および小型ペプチドの製造におけるE.coliチオレドキシンのかわりに、あるいはそれに加えて用いることができる。ヒト・チオレドキシン活性部位ループおよびアミノ末端への挿入も、E.coliチオレドキシンと同様、許容される。
本発明に用いてもよい他のチオレドキシン様配列は、蛋白グルタレドキシンおよび種々の種の相同物の全体または一部を包含する(A.Holmgren上記文献)。E.coliグルタレドキシンおよびE.coliチオレドキシンは20%未満のアミノ酸相同性を有するが、その2つの蛋白はコンホーメーションおよび機能の類似性を有し(Eklund et al.,EMBO J.3:1443-1449(1984))、グルタレドキシンは、E.coliチオレドキシンのCys....Cys活性部位ループと構造的および機能的に等価な活性部位ループを含む。それゆえ、グルタレドキシンは本明細書にて定義するチオレドキシン様分子である。
チオレドキシン様ドメインを有する蛋白ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)またはその一部、および種々の種の相同物(Edman et al.,Nature 317:267-270(1985))をコードしているDNA配列をチオレドキシン様DNA配列として用いてもよい。なぜなら、PDIの繰り返しドメインは、E.coliチオレドキシンに対して30%よりも高い相同性を有し、その繰り返しドメインは、E.coliチオレドキシンのCys....Cys活性部位ループに構造的および機能的に等価な活性部位ループを含むからである。当業者に知られ、利用されうるグルタレドキシンおよびPDIについての情報を提供する目的で、参照により、これら3つの刊行物を本明細書に記載されているものとみなす。
同様に、E.coliチオレドキシンとのアミノ酸配列相同性に基づいて、あるいはまた3次元構造の類似性およびE.coliチオレドキシンのCys....Cys活性部位ループに構造的および機能的に等価な活性部位ループの存在に基づいて、ホスホイノシチド特異的ホスホリパーゼC(PI−PLC)、そのフラグメントおよび種々の種の相同物(Bennett et al.,Nature 334:268-270(1988))をコードしているDNA配列を本発明において使用してもよい。アミノ酸配列相同性に基づいて、あるいはまた3次元構造の類似性およびE.coliチオレドキシンのCys....Cys活性部位ループに構造的および機能的に等価な活性部位ループの存在に基づけば、ERp72のごとき小胞体蛋白、または種々の種の相同物(Mazzarella et al.,J.Biol.Chem.265:1094-1101(1990))をコードしているDNA配列の全体または一部も、本発明の目的からすれば、チオレドキシン様DNA配列として包含される。もう1つのチオレドキシン様配列は、成人T細胞白血病由来因子(ADF)または他の種の相同物(N.Wakasugi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:8282-8286(1990))の全体または一部をコードしているDNA配列である。現在、ADFはヒト・チオレドキシンであると考えられている。同様に、E.coliのペリプラズムにおけるジスルフィド結合形成を促進することに関与している蛋白、dsbA遺伝子の産物(Bardwell et al.,Cell 67:581-589(1991))も、チオレドキシン様配列と考えられる。当業者に知られ、利用されうるPI−PLC、ERp72、ADF、およびdsbAについての情報を提供する目的で、参照により、これら4つの刊行物を本明細書に記載されているものとみなす。
上で用いたチオレドキシン様DNA配列の定義からすると、E.coliチオレドキシンに対する30%のアミノ酸配列に基づけば、あるいはE.coliもしくはヒト・チオレドキシンに対する3次元構造の実質的類似性を有し、E.coliチオレドキシンのCys....Cys活性部位ループに構造的および機能的に等価な活性部位ループを有することに基づけば、上で特に確認しなかった他の配列、またはおそらくまだ同定され公表されていない配列もチオレドキシン様配列であるかもしれないと考えられる。例えばX線結晶回折像または2次元NMRスペクトル法により分析した3次元構造を公表されたE.coliの3次元構造と比較し、次いで、そに分子のアミノ酸配列を分析してE.coliチオレドキシンののCys....Cys活性部位ループに構造的かつ機能的に等価な活性部位ループを有するかどうかを決定することにより、当業者は、後に述べた2つの特徴を分子が有するかどうかを決定することができる。3次元構造またはコンホーメーションにおける「実質的に類似」とは、グルタレドキシンのようにE.coliチオレドキシンに対して類似であることを意味する。さらに、コンピューターによる1次配列の分析(Ellis et al,Biochemistry 31:4882-4892(1992))によりチオレドキシン様蛋白の同定を可能にする推定アルゴリズムが描かれた。上の記載に基づいて、当業者は、過度の実験をすることなく本発明に用いるチオレドキシン様DNA配列を選択そ同定し、あるいは所望ならば修飾することができよう。例えば、もとのチオレドキシンまたはもとのチオレドキシン様配列の一部に作成された、生成する構造に影響しない単一の点突然変異は、もとのチオレドキシンまたはもとのチオレドキシン様配列の対立遺伝子変種と同様、もう1つのチオレドキシン様配列である。
厳密なまたは緩やかなハイブリダイゼーション条件下でE.coliチオレドキシンまたはその構造上の相同物にハイブリダイゼーションするDNA配列も、本発明に用いるチオレドキシン様蛋白をコードしている。1のかかる厳密なハイブリダイゼーション条件の例は、65℃の4XSSC中でのハイブリダイゼーション、次いで0.1XSSC中65℃で1時間の洗浄である。別法として、典型的な厳密なハイブリダイゼーション条件は、42℃の50%ホルムアミド、4XSSC中である。厳密でないハイブリダイゼーション条件の例は、50℃の4XSSC中または42℃の30〜40%のホルムアミド中のハイブリダイゼーションである。すべてのかかるチオレドキシン様配列の使用は本発明に包含されると確信する。
選択ペプチドまたは蛋白のDNA配列およびチオレドキシン様配列のDNA配列を含んでなる本発明融合配列の構築には、慣用的な遺伝子工学的方法を用いる。Sambrook et al.,Molecular Cloning.A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York(1989)参照。融合配列を多くの異なる方法で調製することができる。例えば、選択異種蛋白をチオレドキシン様分子のアミノ末端に融合させてもよい。別法として、選択蛋白をチオレドキシン様分子のカルボキシル末端に融合させてもよい。構造的に束縛されない方法にて、小型ペプチド配列をチオレドキシン様配列の上記位置に融合させて融合配列を得ることもできる。
所望異種ペプチドまたは蛋白がチオレドキシン様蛋白に融合したこの融合配列は、蛋白またはペプチドの安定性を増大させる。アミノまたはカルボキシル末端において、融合がいずれかの蛋白のもとの構造を脱安定化させないような方法で、所望異種ペプチドまたは蛋白を融合させる。さらに、可溶性チオレドキシン様蛋白への融合は、選択異種ペプチドまたは蛋白の溶解度を改善する。
チオレドキシン様分子の活性部位ループ中にペプチドを融合させることは種々の理由により好ましい。非特異的蛋白ジスルフィドオキシド−レダクターゼとしての蛋白の主要機能を保持しており、広範な他の蛋白表面と相互作用でき、その結果挿入配列の存在を特に許容する、活性部位ループ周辺のチオレドキシン表面上領域が存在する。さらに、活性部位ループ領域は、強力な2次構造のセグメントにより結合され、ペプチド結合のための多くの利点を提供する。チオレドキシン様蛋白の活性部位ループに挿入された小型ペプチドは、3次構造の維持に関与しない蛋白部位に存在する。それゆえ、かかる融合蛋白の構造は安定である。実際、以前の研究により、E.coliチオレドキシンが活性部位ループに近接した位置で開裂されて2個のフラグメントとなりうるが、やはり3次元的相互作用は蛋白をもとの状態に安定化することが示されている。
E.coliチオレドキシンの活性部位ループは配列NH2...Cys33−Gly−Pro−Cys36...COOHを有する。選択ペプチドを活性部位ループ部分においてチオレドキシン様蛋白に融合させることは、ペプチドを両末端において束縛し、ペプチドのコンホーメーションの自由度を減少させ、その結果ペプチドがとりうる別の構造の数を減少させる。挿入ペプチドはシステイン残基によりいずれかの末端に結合され、もとのチオレドキシンにおけるのと同様に互いにジスルフィド結合を形成し、挿入ペプチドのコンホーメーションの自由度をさらに限定するかもしれない。そのうえ、本発明は、ペプチドをチオレドキシン様蛋白の表面上に置く。かくして、本発明は、生物学的に活性のあるペプチドのコンホーメーションのスクリーニングにおけるペプチドの使用、およびこの構造中の活性部位ループに挿入されたペプチドを提供することによる他のアッセイに対して、他とは異なる利点を提供する。
また、ループ中へのペプチドの融合は、E.coliのアミノペプチダーゼおよびカルボキシペプチダーゼの作用からペプチドを保護する。さらに、ペプチド遺伝子融合のための正しい位置におけるループ領域をコードしているE.coliチオレドキシンDNA配列の部分中に制限エンドヌクレアーゼ開裂部位RsrIIがすでに存在している(McCoyらの上記文献の図4参照)。RsrIIはDNA配列CGG(A/T)CCGを認識し、3ヌクレオチド長の5’突出粘着末端を残す。それゆえ、相補的粘着末端を有するDNAはこの部位にただ1つの方向で挿入されるであろう。
本明細書の用語「融合蛋白」は、別の蛋白、例えば融合パートナーに共有結合した「目的蛋白」を包含するが、これに限らない。融合蛋白の開裂生成物は、融合パートナーおよび目的蛋白を含む。本明細書の用語「チオレドキシン融合蛋白」は、チオレドキシン様DNA(上記)および目的蛋白をコードしている別のDNAの発現産物を包含するが、これに限らない。
本明細書の用語「アニオン交換樹脂」は、ジエチルアミノエタン(DEAE)、ポリエチレンイミン(PEI)または4級アミノエタン(QAE)基のごとき正に帯電した懸垂基が結合したいずれかのタイプの支持体を包含するが、これらに限らない。基はpHにかかわらず正に帯電していてもよく、あるいは特定のpHにおいて正に帯電しており、そのpH範囲の外側では中性(無電荷)であってもよい。
本明細書の用語「カチオン交換樹脂」は、スルホニル、スルフィルプロピル(SP)、カルボキシル、またはカルボキシメチル(CM)基のごとき負に帯電した懸垂基が結合したいずれかのタイプの支持体を包含するが、これらに限らない。基はpHにかかわらず負に帯電していてもよく、あるいは特定のpHにおいて負に帯電しており、そのpH範囲の外側では中性(無電荷)であってもよい。本明細書に用語「帯電」は、正味の電荷の大きさにかかわらずゼロでない正または負の正味の静電気電荷を有する化学種を包含するが、これらに限らない。
本明細書の用語「負に帯電」は、操作バッファーのpHおよびイオン強度においてアニオン交換クロマトグラフィー樹脂に吸着する化学種(帯電していても、していなくてもよい);あるいは操作バッファーのpHおよびイオン強度においてカチオン交換クロマトグラフィー樹脂に吸着しない化学種を包含するが、これらに限らない。
本明細書の用語「正に帯電」は、操作バッファーのpHおよびイオン強度においてカチオン交換クロマトグラフィー樹脂に吸着する化学種(帯電していても、していなくてもよい);あるいは操作バッファーのpHおよびイオン強度においてアニオン交換クロマトグラフィー樹脂に吸着しない化学種を包含するが、これらに限らない。
後で詳細に説明するように、一般的には、用語「宿主細胞」は、形質転換された、あるいはされていないグラム陰性微生物を包含する。
本明細書に用語「キレーター」は、溶液中で金属イオンとともに2つまたはそれ以上の分子間通常結合または配位結合を形成して、各結合金属イオンとともに1つまたはそれ以上の複素環を形成する化合物を包含するが、これらに限らず、例えばエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ジエチレントリアミノ五酢酸(DPTA)、エチレングリコール−ビス(2−アミノエチルエーテル)四酢酸(EGTA)、1,2−シクロヘキサンジアミン四酢酸(CDTA)、およびクエン酸を包含するが、これらに限らない。
本明細書の用語「2価カチオン」は、Mg++(マグネシウム)、Mn++(マンガン)、Ca++(カルシウム)等のごとき種を包含するが、これらに限らない。
本明細書の用語「集める」は、カラムクロマトグラフィー樹脂からプロセスの流れをポンプで流して未結合フラクション(時々、素通しフラクションという)を集めるプロセスを包含するが、これに限らない。
組み換え法により製造された蛋白の形質転換細胞からの精製によって本発明方法を説明するが、該方法は、細胞中に天然状態で存在する蛋白の精製にも適用でき、一般的には、源にかかわらず溶液からの蛋白の精製に用いることができる。
下記実施例は本発明の実施を説明する。これらの例は説明のためだけのものであり、特許請求されている本発明の範囲を何ら限定するものではない。実施例1は融合蛋白の構築を説明し;実施例2は融合蛋白の発現を説明し;実施例3はキレーターを用いる細胞からの蛋白の選択的放出を説明し;実施例4は溶液からの負に帯電した分子の除去を説明し;実施例5は亜鉛を用いる選択的沈殿を説明し;実施例6は目的蛋白の融合パートナーからの開裂後のpIの相違に基づく融合蛋白の精製に関する。
実施例1−融合蛋白分子の調製
目的ポリペプチドをコードしているDNAに連結されたチオレドキシン様配列を含む融合DNAを構築し、適当な宿主細胞中でDNA構築物を発現させることによりチオレドキシン様融合蛋白を製造することができる。例えば、チオレドキシン様配列としてE.coliチオレドキシンおよび選択異種蛋白として組み換えIL−11(Paul et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:7512-7516(1990);同時係属米国特許出願SN07/526474およびSN07/441100ならびにPCT特許出願公開WO91/07495(1991年5月30日公開)も参照、参照によりこれらを本明細書に記載されているものとみなす)を用いて本発明チオレドキシン様融合蛋白を調製することができる。Sambrook,et al.,Molecular Cloning.A Laboratory Manual,2nd edition,Cold Spring Harbor laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1989)に記載された標準的なDNA取り扱い法を用いて、公表された配列に基づいてE.coliチオレドキシン(trxA)遺伝子(McCoyら上記文献)をクローン化し、種々の関連E.coli発現プラスミドを構築するために使用した。
他の配列に融合していないE.coliのtrzA遺伝子を含む最初の発現プラスミドpALtrxA−781を構築した。さらにこのプラスミドは、関連IL−11融合プラスミドについて以下に詳述する配列を含んでいた。この最初のプラスミドはE.coli宿主株GI724において全細胞蛋白の10%よりも多いチオレドキシン蛋白の蓄積を指令するものであり、trxA/IL−11融合配列構築のために以下に説明するようにこれをさらに加工した。
別法として、標準的なDNA取り扱い法(上記文献)を用いて、例えば位置2、31および63あるいはまた位置31および63のヒスチジン残基のごとき金属結合/キレーティングアミノ酸残基を含むように修飾されたチオレドキシン様分子を、同時係属USSN08/165301に記載のごとく調製した。
関連プラスミド発現ベクターpALtrxA/EK/IL11ΔPro−581の全配列(McCoyら上記文献の図1に示される)は以下の特徴を有する:
ヌクレオチド1〜2060は、プラスミドpUC−18由来のDNAc配列(Norrander et al.,Gene 26:101-106(1983))を含み、該配列は宿主E.coli株に抗生物質アンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子およびcolE1由来の複製開始点を含有する配列を含む。ヌクレオチド2061〜2221は、バクテリオファージλの大左方プロモーター(pL)のDNA配列(Sanger et al.,J.Mol.Biol.162:729-773(1982))を含み、該配列は3つのオペレーター配列OL1、OL2およびOL3を含む。オペレーターはλcIリプレッサー蛋白の結合部位であり、その細胞内レベルはpLからの転写開始量を制御する。ヌクレオチド2222〜2241は、バクテリオファージT7の遺伝子10由来の強力なリボソーム結合配列(Dunn and Studier,J.Mol.Biol.166:477-535(1983))を含む。
ヌクレオチド2242〜2568は、E.coliチオレドキシン蛋白のDNA配列(Lim et al.,J.Bacteriol.163:311-316(1985))を含む。このプラスミドのチオレドキシンコーディング配列の末端には翻訳終結コドンは存在しない。
ヌクレオチド2569〜2583は、短い、親水性の、柔軟性のあるスペーサーペプチド「−−GSGSG−−」のアミノ酸配列をコードしているDNA配列を含む。ヌクレオチド2584〜2598は、エンテロキナーゼ(EC 3.4.4.8)の開裂認識部位のアミノ酸配列「−−DDDDK−−」(Maroux et al.,J.Biol.Chem.246:5031-5039(1971))をコードしているDNA配列を提供する。
もう1つの具体例として、さらにコドンをただ1つだけプラスミドのリンカー配列に挿入して、ヒドロキシルアミンによるチオレドキシン−IL−11融合蛋白の化学的開裂のための特異的部位を導入することができる。pALtrxA/EK/IL11ΔPro−581の残基2598と2599との間に導入されたヌクレオチドトリプレット「−AAT−」はアスパラギン残基をコードする。このアスパラギンはすぐ後のグリシン残基と一緒になって新たなヒドロキシルアミン開裂部位を構成する。実施例6で詳述する適当な条件下で、アスパラギン残基とグリシン残基との間でヒドロキシルアミン開裂が起こるであろう。このもう1つの具体例のさらなる特徴として、他の2つの所望でないヒドロキシルアミン開裂部位を除去するための標準的方法により、野生型チオレドキシンに存在する2個の天然のアスパラギン残基(アミノ酸84および107)をグルタミンに変化させ、かくして、その後の精製工程を妨害しうるさらなるヒドロキシルアミン開裂生成物を減少させてもよい。
ヌクレオチド2599〜3132は、成熟ヒト・IL−11の修飾形態のアミノ酸配列(正常蛋白において通常見いだされるN末端プロリル残基を欠失している)をコードしているDNA配列(Paul et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:7512-7516(1990))を含む。該配列は、IL−11配列の3’末端に翻訳終結コドンを含む。
ヌクレオチド3133〜3159は、制限エンドヌクレアーゼ部位を含む「リンカー」DNA配列を提供する。ヌクレオチド3160〜3232は、E.coliのaspA遺伝子配列(Takagi et al.,Nucl.Acids Res.13:2063-2074(1985))に基づく転写終結配列を提供する。ヌクレオチド3233〜3632はpUC−18由来のDNA配列である。
実施例2において説明するように、適切な条件下で培養した場合、適当なE.coli宿主株中でこのプラスミドベクターは高レベル(全細胞蛋白の約10%)のチオレドキシン/IL−11融合蛋白の生産を指令しうる。対照的に、チオレドキシンに融合されていない場合には、類似の宿主/ベクター系において発現された場合、全細胞蛋白のわずか0.2%しかIL−11は蓄積しなかった。
実施例2−融合蛋白の発現
実施例1記載のプラスミド構築物を用い、下記プロトコールに従ってチオレドキシン/IL−11融合蛋白を製造する。Dagert and EhrliCh,Gene 6:23(1979)の方法により、pALtrxA/EK/IL11ΔPro−581をE.coli宿主株GI724(F-,lacIq,lacPL8,ampC::λcI+)中に形質転換する。形質転換されていない宿主株E.coli G1724を、適用可能な法律および規則に従った特許目的で1991年1月31日にATCC番号55151としてAmerican Type Culture Collection,12301 Parklawn Drive,Rockville,Marrylandに寄託した。1mMのMgSO4を含有し、0.5% w/vグルコース、0.2% w/vカザミノ酸および100μg/mlアンピシリンを補足されたM9培地(Miller,"Experiments in Molecular Genetics",Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1972))からなるIMC培地を含有する1.5%寒天プレート上で形質転換体を選択する。
GI724は、ampC遺伝子座において染色体中に安定に組み込まれた野生型λcIリプレッサー遺伝子を有しており、それはSalmonella typhimuriumのtrpプロモーター/オペレーター配列の転写制御下にある。GI724において、λcI蛋白は、最少培地または上記IMCのごときカザミノ酸を補足された最少培地のごときトリプトファン不含培地中での増殖中にのみ作られる。GI724培養物中へのトリプトファンの添加はtrpプロモーターを抑制し、λcIの合成のスイッチをオフにし、pLプロモーターが細胞中にある場合にはpLプロモーターからの転写の誘導を徐々に引き起こす。
pALtrxA/EK/IL11 Pro−581で形質転換されたGI724をIMC培地(3xMgSO4含有)中で30℃で増殖させてA600を20とする。培養物のグルコース濃度を約0.2%(重量/体積)に維持する。7.5Mアンモニア水を用いてpHを7.0に維持する。トリプトファンを添加して最終濃度100μg/mlとし、培養物をさらに4時間37℃でインキュベーションする。この期間中、チオレドキシン/IL−11融合蛋白が蓄積して全細胞蛋白の約10%となる。
すべての融合蛋白は可溶性細胞フラクション中に見いだされ、これを以下のように精製してその後の分析に供する。50mM HEPES pH8.0,1mMフッ化フェニルメチルスルホニル中20000psiにおいてフレンチプレスで細胞を溶解する。15000xg、30分の遠心分離により溶解物を清澄化し、上清をQAE-Toyopearl(登録商標)カラムに負荷する。素通しフラクションを捨て、融合蛋白を50mM HEPES pH8.0,100mM NaClで溶離する。溶離物を2M NaClとし、フェニル−Toyopearl(登録商標)カラムに負荷する。素通しフラクションを再度捨て、融合蛋白を50mM HEPES pH8.0,0.5M NaClで溶離する。
次いで、融合蛋白を25mM HEPES pH8.0に対して透析し、この段階で80%以上の純度である。T1165バイオアッセイ(Paulら上記文献)により、精製チオレドキシン/IL−11蛋白は8x105U/mgの活性を示す。この値は、モル基準とした場合、同じアッセイにおけるCOS細胞由来のIL−11について見いだされる活性2X106U/mgに非常に近い。1mlの10mM Tris−Cl(pH8.0)/10mM CaCl2中で、融合蛋白1ミリグラムを、100ユニットのウシ・エンテロキナーゼ(Leipnieks et al.,J.Biol.Chem.254:1677-1683(1979))を用いて37℃で20時間開裂する。25mM HEPES pH8.0中QAE−Toyopearl(登録商標)カラムに通すことによりIL−11を反応生成物から回収するのであるが、IL−11は素通しフラクション中に見いだされる。未開裂融合蛋白、チオレドキシンおよびエンテロキナーゼはカラムに結合したままである。この方法で調製したIL−11は、T1165アッセイにおいて、2.5x106U/mgの生物学的活性を有する。その物理的および化学的特性を以下のようにして決定する:
(1)分子量
Schagger,et al.,Anal.Biochem.166:368-379(1987)の方法に従って還元条件下での10%SDS−PAGE(トリシン系)により測定すると、IL−11の分子量は約21kDであることがわかる。蛋白は1本のバンドとして泳動する。
(2)エンドトキシン含量
製造者の指示に従って行うLAL(Limulus変形細胞溶解物、Pyrotel、Associates of Cape Cod,Inc.,Woods Hole,Massachusetts,USAから得られる)アッセイにおいて、IL−11のエンドトキシン含量は1ミリグラムのIL−11あたり0.1ナノグラム未満であることがわかる。
(3)等電点
IL−11の理論上の等電点はpH11.70である。3.5から9.5までのpH範囲のLKB Ampholite PAGplateを用いるポリアクリルアミドゲル等電点フォーカシングにより測定すると、IL−11は9.5以上の所に泳動する。IL−11は塩基性すぎるので正確な等電点の測定は不可能である。
(4)蛍光吸収スペクトル
1cm石英セル中0.1%水溶液について測定すると、IL−11の蛍光吸収スペクトルは335〜337nmにおいてエミッション極大を示す。
(5)UV吸収
1cm石英セル中0.1%水溶液について測定すると、IL−11の蛍光吸収スペクトルは278〜280nmにおいて吸収極大を示す。
(6)アミノ酸組成
アミノ酸配列に基づくIL−11の理論上のアミノ酸組成は以下のとおり:
下記のようにして均一なIL−11試料を気相加水分解に供する:6N HCIおよび2Nフェノール試薬を加水分解容器に入れ、その中に45μlの1:10希釈された(重量/H2O)IL−11を入れて濃縮乾固したチューブを挿入する。試料を真空下で密封し、110℃で36時間加水分解する。加水分解後、試料を乾燥し、500μlのNa−S試料希釈用バッファーに再懸濁する。Beckman 7300自動アミノ酸分析装置でアミノ酸分析を行う。ニンヒドリンでのポストカラム誘導体化後のアミノ酸の分離にはカチオン交換カラムを用いる。1級アミノ酸を570nmで検出し、2級アミノ酸を440nmで検出する。各アミノ酸について8ポイントのキャリブレーション曲線を描く。
典型的には、ある種のアミノ酸は回収されないので、5種のアミノ酸のみについての結果を以下に示す。蛋白を脱塩せずに加水分解を行うので、たいていのアミノ酸について100%の回収率が達成される。
標準化してGLX=10(cDNA配列に基づくIL−11中のグルタミンおよびグルタミン酸残基の推定数)とすることにより組み換えIL−11 1分子あたりの各アミノ酸残基の相対回収率を決定する。GLXの回収について得られた値(ピコモル)を10で割ってGLX商を得る。各アミノ酸の回収率について得られた値(ピコモル)を試料のGLX商で割って、試料中の各アミノ酸の相対回収率を表す数を得る(GLX残基の定量的回収率に対して標準化されている)。各アミノ酸残基の平均数に対する予想値の相関係数は0.985以上であり、各アミノ酸について観察された残基数は推定配列とよく一致していることが示される。
(7)アミノ末端配列決定
製造者の指示に従ってABI 471A蛋白配列決定装置(ABI,Inc.)を用いてIL−11(95%アセトニトリルTFA中に緩衝化されている)を配列決定する。アミノ末端配列決定により、チオレドキシン融合蛋白から生成したIL−11が正しいIL−11のアミノ酸配列を含み、ただ1種のアミノ末端が観察されることが確認される。
(8)ペプチドマッピング
10mM Tris,pH8、1M尿素および2mM 4−アミノベンズアミジン二塩酸(PABA)中、37℃で4時間、エンドプロテイナーゼAsp−N(Boehringer Mannheim)(IL−11に対するAsp−N 1:500)でIL−11を開裂する。次いで、Aバッファー(蒸留水中50mM NaPO4,pH4.3)およびBバッファー(100%イソプロパノール)(流速1ml/分で100%Aから25%Aおよび75%Bまで(1%/分の割合で交換))を用いるC4VydacカラムによるHPLCに試料を供する。ペプチドマップにより、チオレドキシン融合蛋白から生成したIL−11が予想されるIL−11のN末端およびC末端配列を含むことが確認される。
(9)溶解度
下記物質中でのIL−11蛋白を試験して以下の結果を得る:
水 非常に可溶性
エチルアルコール 非常に可溶性
アセトン 非常に可溶性
1M塩化ナトリウム 非常に可溶性
10%蔗糖 非常に可溶性
(10)糖組成および蛋白/多糖含量(%)
IL−11蛋白のポリペプチド骨格に結合した糖部分の不存在は、そのアミノ酸配列(典型的な糖結合部位を含まない)により示される。
ヒドロキシルアミン開裂部位を有する融合構築物を作る場合、開裂を以下のように行う:チオレドキシンおよびIL−11配列の間にヒドロキシルアミン開裂部位を含むように上記のごとく修飾されたチオレドキシン/IL−11融合蛋白を、ヒドロキシルアミンとの反応において化学的に開裂する。濃度2.5mg/mlの修飾融合蛋白を、0.1M CHESバッファー(pH9.7)中1Mヒドロキシルアミンを含む反応系で開裂する。反応を35℃で11時間行い、4℃まで冷却し、Tris−HCl(pH7.3)の添加によりpHを8.0まで低下させることにより反応停止する。
実施例3−選択的蛋白放出
収集された無傷のE.coliの細胞質からの融合蛋白の選択的放出は、Tris/EDTAのごときキレーターによる細胞外膜の脱安定化の結果として起こる。キレート剤EDTAは、外膜中のリポ多糖(LPS)を安定化している2価カチオンを結合することによってグラム陰性細菌を透過性にすると考えられている。本発明の好ましい具体例において、まず細胞を放出工程前に収集するが、細胞培養培地にキレーターを直接添加するだけでもよい。過剰のキレーターを添加して、キレーターにより結合される培養培地中に存在する物質によって消費されないようなキレーターの供給を保証する。
680mM Tris,240mM EDTA,pH8.0の溶液を、冷却(3℃)された収集細胞を入れた収集/放出容器に添加することにより選択的放出を行う。最終バッファー組成は50mM Trisおよび15mM EDTAであり、得られる懸濁液中のE.coli濃度は1リットルあたり250グラム(湿細胞重量)である。懸濁液を37℃に加熱し、30分インキュベーションする。5N NaOHのごとき塩基を用いて放出懸濁液のpHを約8.5とする。この処理により、融合蛋白および一連の構成的E.coli蛋白が放出される。目的蛋白の80%以上を含有する全細胞蛋白の約50%および細胞DNAの15%が放出される。Tris/EDTA溶液を収集細胞懸濁液に添加した後、細胞から遊離した蛋白量をBradfordアッセイ(Bradford,M.,Analytical Biochemistry 72:248-254(1976))によりモニターする。
表2は、この放出工程のために制御される操作パラメーター(好ましい目標ならびに好ましい範囲を包含する)を掲載する。当業者は、より広い範囲であっても同様の効果が得られることを理解するであろう。表3は、モニターされる操作パラメーターを掲載する。
放出工程により、DNA、RNAおよびLPSのごときポリアニオン性種も細胞から放出される。放出懸濁液中のこれらの非蛋白性成分の存在は、懸濁液を濁らせ、濾過しにくくする。実施例4記載の清澄化工程によりそれらを除去する。
実施例4−清澄化および負に帯電した分子の除去
非蛋白性成分の選択的沈殿により処理材料を清澄化し、濾過プロセスへと送る。2M MgCl2、95%エタノール、次いで2M CaCl2を放出懸濁液の入った収集/放出容器に逐次添加することにより沈殿を開始させる。得られる懸濁液中の反応物質濃度は125mM MgCl、75mM CaCl2、および14%(体積/体積%)エタノールである。最短5分で行われる沈殿条件を、32℃、pH7.5に制御する。反応物質濃度およびpH、温度、および反応時間を表4に示す限度内に制御する。最大遠心力15000xg、滞留時間1.4分、沈降距離0.5mmにおける連続遠心分離により非蛋白性成分を懸濁液から除去する。所望ならば、インライン(in-line)0.5μm濾過により残存粒子を懸濁液の流れから除去することができる。溶液中に存在していたDNAの80%以上およびLPSの90%以上が除去される。目的蛋白の回収率は約80%である。プロセスの品質を示すものとして蛋白濃度(Bradfordアッセイ)および濁度(OD600)をモニターする。
表4は、この清澄化工程のために制御される操作パラメーター(好ましい目標ならびに好ましい範囲を包含する)を掲載する。当業者は、より広い範囲であっても同様に効果的であることを容易に理解することができる。表5は、モニターされるパラメーターの質的特性を掲載する。
実施例5−選択的沈殿
清澄化工程後、目的蛋白の選択的沈殿を用いることが可能である。19体積の4℃の清澄化上清に1体積の1M ZnCl2を添加することによりこれを行う。2.5M Tris塩基を用いて懸濁液のpHを7.0に維持する。懸濁液を15時間インキュベーション後、生じた沈殿を、最大遠心力15000xg、沈降距離2.5cm、滞留時間3分の連続遠心分離により回収する。次いで、回収した沈殿を液体窒素で凍結し、−80℃に保存する。次いで、20mM Tris/100mM EDTA(pH=8.0)中、20℃で、1リットルのバッファーにつき100グラムの沈殿の割合で沈殿を可溶化させる。逆相HPLCにより測定すると、当該プロセスにおいて目的蛋白の75%以上が回収されている。
実施例6−精製
清澄化工程(実施例4)後、使用可能な処理方法(選択的沈殿(実施例5)の別法)は、十字フロー膜濾過を用いる限外濾過/透析濾過である。この工程により清澄化融合蛋白溶液が濃縮され、蛋白はイオン交換クロマトグラフィーに適した低イオン強度バッファー中に置き換えられる。十字フロー装置に用いる膜は多孔性フィルターとして役立ち、分子量に基づいて物質を分離する。高分子量の溶液成分(例えば、蛋白)は膜により保持され、低分子量の成分(例えば、無機塩およびバッファー成分)は多孔性膜構造を自由に通過し、透過液中へと除去される。
バッファーが膜を通って出て行くのと同じ速度で置換バッファーを十字フロー保持液中に添加する場合、最初のバッファーは連続的に希釈される(蛋白透析)。これらの条件下で、低分子量化合物が容易に交換され、蛋白濃度は一定のままである。保持液の5倍体積のバッファーの添加により、最初のバッファーの99%またはそれ以上が置換される。置換バッファーを保持液に添加するよりも早い速度でバッファーを十字フロー装置から取る場合、蛋白溶液が濃縮される。
回収プロセスの最初の限外濾過/透析濾過工程(UFDF #1)により濃縮され、バッファー交換により融合蛋白は濾過された清澄化上清中に置き換えられる。このプロセスには一連のプレート−アンド−フレーム(plate-and-frame)膜カートリッジ、例えばMillipore(登録商標)Pellicon再生セルロースカセットフィルター(膜の分子量カットオフ≦10kDa)を用いる。さらに、インラインプレフィルター(Millipore(登録商標)Milligard,孔サイズ1.2μm)を保持液の連続濾過に使用して膜を汚す粒子を除去する。当該工程の目標温度は8℃である。
使用前に、限外濾過装置の支柱および膜を20Mm Tris,0.3M NaCl,pH8.0で洗って系を平衡化する。貯蔵タンク中の濾過清澄化上清(FCS)に9.32%(重量/体積)の割合で4M NaCl溶液を添加し、次いで、処理開始前に混合する。ポンプで正の膜通過圧をかけてFCSを膜に流し、透過液を捨てながら保持液を容器に再循環させる。FCSは約3倍に濃縮される(濃縮I)。濃縮Iの完了後、透過液の流速と同じ流速で20mM Tris,0.3M NaCl,pH8.0の希釈液を貯蔵容器に添加する(透析濾過I)。このようにして、FCSのバッファーを連続的に希釈バッファーで希釈する。全透過液体積が濃縮Iの体積の5倍またはそれ以上となった場合に透析濾過が完了する。もとのバッファー中に存在した低分子量物質の99%以上が除去される。
全透過液体積が濃縮Iの最終体積の5倍またはそれ以上である場合、保持液をさらに10%濃縮する(濃縮II)。濃縮蛋白溶液を洗い出すのに十分な体積の20mM Tris,pH8.0を装置に流して、初発FCS体積の約0.4倍の体積としてプールする。UFDF#1プールを容器からポンプで取り出し、きれいなオートクレーブ済み圧力容器に固定されたオートクレーブ済み0.2μmのフィルターに通す。さらなる処理まで濾液を2〜10℃でプールする。
この工程からの融合蛋白の平均回収率は89%である。表6は、この工程中制御される操作パラメーターを掲載する。
例えば、rhIL−11のごとき目的蛋白の精製は、まず、正に帯電した汚染混入物質からの融合蛋白の精製;次いで、融合蛋白のその構成成分、すなわちrhIL−11およびチオレドキシンへの開裂;次いで、目的蛋白、例えばrhIL−11の精製を包含する。
2種のイオン交換クロマトグラフィー工程を用いて融合形態の蛋白の精製を行う。融合蛋白の開裂後、さらに2種のイオン交換クロマトグラフィー工程を用いて開裂形態の蛋白を精製する。最初のクロマトグラフィー工程において、アニオン交換樹脂、例えばToyopearl(登録商標)QAEを用いてプロセスの流れから融合蛋白(および他の負に帯電した蛋白)を吸着させ、次いで次の工程においてカチオン交換樹脂、例えばS Sepharose(登録商標)Fast Flowを用いてプロセスの流れから正に帯電した蛋白を吸着させるが、融合蛋白はカラムを素通りする。
Toyopearl(登録商標)QAE 550Cは、4級アミンで共有結合誘導体化された堅固なポリマー支持体からなる強力なアニオン交換樹脂である。操作pHにおいて正味の負電荷を有する蛋白および多価イオン性物質(例えば、ポリヌクレオチドおよびリポ多糖)は、溶液のイオン強度の関数としてこの樹脂に結合する。低塩濃度においてToyopearl(登録商標)QAE樹脂を用いて、生成物の流れから融合蛋白をイオン性相互作用により吸着させる。適当なバッファー中のpHを低下させることおよびイオン強度を増加させることの両方によりチオレドキシン/rhIL−11融合蛋白の溶離を行う。適切な溶離液は、100〜500mM NaClを含有するpH7.5〜8.5の20〜100mM Trisバッファー、または0〜150mM NaClを含有するpH5.5〜6.6の50〜200mMヒスチジンバッファーを包含する。
S Sepharose(登録商標)Fast Flowは、スルホン酸基で誘導体化された架橋アガロースマトリックスからなる強力なカチオン交換クロマトグラフィーゲルである。操作バッファーのpHよりも高い等電点を有する汚染混入物質(蛋白ならびに多価イオン性物質)は、電荷の相互作用によりS Sepharose(登録商標)Fast Flowに結合する。
融合蛋白を結合させ、次いで、QAEカラムから溶離させ、S Sepharose(登録商標)Fast Flowに通し、次いで、S Sepharose(登録商標)Fast Flow未結合フラクション中に回収する。QAEカラムの溶離条件が最適化されて、S Sepharose(登録商標)Fast Flowに結合するチオレドキシン/rhIL−11融合蛋白を最少にし、一方では融合蛋白よりも高いpIを有する汚染混入物質はS Sepharose(登録商標)Fast Flow樹脂に結合し、プロセスの流れから除去されるようになっている。
Toyopearl(登録商標)QAE 550CカラムおよびS Sepharose(登録商標)Fast Flowカラムの両方を平衡化し、周囲温度で操作する。S Sepharose(登録商標)Fast Flowカラムを150mMヒスチジン,150mM NaCl,pH6.2で平衡化し、次いで、75mMヒスチジン,75mM NaCl,pH6.2で平衡化する。次に、Toyopearl(登録商標)QAE 550Cカラムを20mM Tris,pH8.0で平衡化する。次いで、上記UFDF#1濃縮物を平衡化されたToyopearl(登録商標)QAEカラム上に線速度1.5cm/分またはそれ以下で負荷する。
負荷完了後、Toyopearl(登録商標)QAEカラムを1.5cm/分またはそれ以下の20mM Tris,pH8.0で洗浄する。次いで、QAEカラムを1.0cm/分またはそれ以下の75mM NaCl,75mMヒスチジン,pH6.2で溶離する。蛋白がQAEからムから溶離し始めたら、カラム出口をS Sepharose(登録商標)Fast Flowカラムに接続する。直列カラムの溶離ピークを単一プールとして集める。
チオレドキシン/rhIL−11融合蛋白は、カラムの約5倍体積のところのピークとしてカラムから溶離する(カラム体積はToyopearl(登録商標)QAEカラムの寸法を基準とする)。表7は、この工程中、通常にモニターされる操作パラメーターを掲載する。この工程からのチオレドキシン/rhIL−11融合蛋白の平均回収率は91%である。
QAE Toyopearl(登録商標)およびS Sepharose(登録商標)Fast Flowクロマトグラフィーによる融合蛋白の精製後、この実施例においては融合連結配列中のアスパラギニル−グリシルペプチド結合において蛋白を化学的に開裂してrhIL−11およびチオレドキシンを得る。
ヒドロキシルアミンを求核試薬として用いる温和な塩基性条件下でのアスパラギニル−グリシルペプチド結合の開裂は十分に実証されており、一般的な方法が記載されている(Bornstein,P.,and Balian,G.Cleavage at Asn-Gly bonds with hydroxylamine.Meth.Enzymol.47(E):132-145(1977))。アスパラギニル−グリシルペプチド結合はヒドロキシルアミンに特に感受性があるが、アスパラギニル−ロイシル、アスパラギニル−メチオニル、およびアスパラギニル−アラニルの開裂も報告されており、比較的ゆっくりと開裂が起こる可能性がある(Bornstein上記文献)。
Toyopearl(登録商標)QAE/S Sepharose(登録商標)FFの溶離物プールを開裂反応容器に添加する。Toyopearl(登録商標)QAE/S Sepharose(登録商標)FFの溶離物の半分ないし同体積のヒドロキシルアミン開裂溶液(3.0Mヒドロキシルアミン−HCl,0.3M CHES,pH9.7)を容器に添加する。10N NaOHを用いて混合物のpHを9.3(35℃で測定)に合わせ、温度を約35℃にする。
ゆるやかに撹拌してから9時間後、反応混合物の温度およびpHを低下させることにより開裂反応を終了する。反応混合物の温度を8℃またはそれ以下に下げ、中和溶液(2.0M Tris,pH7.3)を添加することにより混合物のpHを9.3に調節する。冷却後、反応混合物の体積の5分の1の体積のさらなる中和溶液を添加する。中和された開裂混合物を、さらなる処理の前に8℃またはそれ以下で保存しておく。開裂反応の操作パラメーターを表8に詳述する。
チオレドキシン/rhIL−11融合蛋白の平均開裂率は73%である。開裂反応後のプロセスの流れ中に存在する最も優勢な蛋白は、残存している未開裂チオレドキシン/rhIL−11融合蛋白ならびに2種の開裂生成物rhIL−11およびチオレドキシンである。
構成成分であるrhIL−11およびチオレドキシンへの融合蛋白の化学的開裂後、プロセスの流れを濃縮し、十字フロー膜濾過を使用する2回目の限外濾過/透析濾過工程を用いて低イオン強度のバッファーへとバッファー交換する。2回目の限外濾過/透析濾過工程(UFDF#2)には一連のプレート−アンド−フレーム膜カートリッジ、例えばMillipore(登録商標)Pellicon再生セルロースカセットフィルイター(分子量カットオフ≦10kDa)を用いる。さらに、インラインプレフィルター(Millipore(登録商標)Milligard,孔サイズ1.2μm)を保持液の連続濾過に用いて、膜を汚す可能性のある粒子を除去する。目標温度≦8℃において処理工程を行う。使用前に、限外濾過装置の支柱および膜を20mM Tris,0.2M NaCl,pH8.0で平衡化する。膜の平衡化後、開裂混合物を貯蔵容器からポンプで正の膜透過圧をかけて膜へ流す。保持液を貯蔵容器に再循環させ、透過液の流れを捨てる。これにより、開裂反応混合物中に存在するrhIL−11が濃縮され、初めの体積約6.5分の1となる。
濃縮完了後、透過液の流速と同じ流速で20mM Tris,0.2M NaCl,pH8.0の希釈液の流れを保持液容器に添加する。このようにして、開裂反応バッファーを連続的に希釈バッファーで希釈する。透過液の体積が濃縮された保持液の体積の少なくとも5倍になるまでこの透析濾過プロセスを継続する。透析濾過完了後、濃縮蛋白溶液を洗い出すのに十分な20mM Tris,0.2M NaCl,pH8.0を限外濾過装置に流して(濃縮溶液体積の約30〜40%)、次の処理工程を開始するまでrhIL−11プール(濃縮溶液および洗い出し)を貯蔵容器中に保存する。この工程からのrhIL−11の平均回収率は89%である。表9は、この工程中、制御される操作パラメーターを掲載する。
UFDF #2工程後、2種のイオン交換クロマトグラフィー工程を用いてrhIL−11を精製する。最初の工程において、カチオン交換樹脂(この例はCM Sepharose(登録商標)Fast Flowである)を用いてプロセスの流れからrhIL−11を吸着させる。すべての工程を2〜8℃の温度にて行う。まず、カラムを20mM Tris,0.5M NaCl,pH8.0を含有するバッファーで平衡化し、次いで、20mM Tris,pH8.0を含有するバッファーで平衡化する。3.2cm/分またはそれ以下の速度で未精製rhIL−11プールをポンプでCM Sepharose(登録商標)カラムに通す。次いで、カラムを0.15Mグリシン,pH9.5で洗浄する。CM Sepharose(登録商標)カラムを0.15Mグリシン,0.15M NaCl,pH9.5で溶離し、周囲温度の一定体積の精製水を入れた収集容器に入れてピークを希釈する。カラム溶離ピークを単一ピークとして集め、周囲温度のさらなる精製水を添加して最終希釈を行う(1部の溶離ピークを3部の精製水で希釈)。この工程からのrhIL−11の平均回収率は75%である。カラム操作パラメーターを表10に詳述する。
最終クロマトグラフィー工程はアニオン交換クロマトグラフィー工程であり、この実施例においては、rhIL−11生成物の流れからアニオン性汚染混入物質を吸着するToyopearl(登録商標)QAE 550Cを用いる。Toyopearl(登録商標)QAE未吸着フラクション中にrhIL−11を回収する。
カラム操作を室温で行う。Toyopearl(登録商標)QAE 550Cカラムを1Mグリシン,pH9.5で平衡化し、次いで、40mMグリシン,pH9.5で平衡化する。希釈されたCM Sepharose(登録商標)ピークをポンプでカラムに流し、さらなる40mMグリシン,pH9.5を流して負荷物中の残存rhIL−11生成物をカラムから洗い流す。未結合負荷物溶離物および洗浄液を貯蔵容器中に集める。次いで、5%(v/v)870mM NaH2PO4,pH5.0を添加することによりこのプールを中和する。カラム操作パラメーターを表11において詳述する。
この工程のrhIL−11の平均回収率は約95%である。この工程以前には除去されないチオレドキシン/rhIL−11融合蛋白は、SDS−PAGEにより検出されるレベル以下にまで除去されている。溶離物プールは高度に精製されたrhIL−11を含む(少量(5%未満)の短いrhIL−11分子を伴う)。
特定の方法および成分に関して本発明を説明したが、当業者は本発明を考慮して変更および修飾を思いつくであろうということが理解される。効果的な試薬濃度、pH、および温度はプロセスおよび蛋白に特異的なものであり、当業者に明らかなように、アニオン性汚染混入物質の性質および目的蛋白の化学的特性および安定性に応じて容易に調節できるものである。
上記の典型的実施例に記載した本発明における多くの修飾および変更を当業者が行うであろう。したがって、添付した請求の範囲において明らかなかかる制限のみが請求の範囲に課されるはずである。よって、添付した請求の範囲は、特許請求されている本発明の範囲内のすべてのかかる均等な変更を包含するものである。
Claims (84)
- チオレドキシン融合蛋白の細胞から溶液中への放出および精製方法であって、下記工程:
該溶液にキレーターを添加して、該蛋白を該細胞から該溶液へと放出させること、次いで
該溶液に2価カチオン/アルコール溶液を添加して第1の可溶性フラクションおよび第1の不溶性フラクションを得ること
を特徴とし、
該2価のカチオンが、マグネシウム、マンガン、およびカルシウムからなる群より選択されるメンバーであり;そして
該アルコールが、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、イソ−ブタノール、およびターシャリー−ブタノールからなる群より選択されるメンバーである、
方法。 - 下記工程:
該融合蛋白を該第1の可溶性フラクションから単離すること
をさらに特徴とする請求項1の方法。 - 下記工程:
該溶液の温度を上昇させること
をさらに特徴とする請求項1の方法。 - 該温度が20ないし40℃上昇させられる請求項3の方法。
- 該温度が3℃から37℃まで上昇させられる請求項3の方法。
- 該細胞がE.coliである請求項1の方法。
- 該キレーターがEDTA、EGTA、CDTA、DPTA、およびクエン酸からなる群より選択されるメンバーである請求項1の方法。
- 該キレーターがEDTAである請求項7の方法。
- 該EDTAの最終濃度が0.1ないし100mMである請求項7の方法。
- 該EDTAの最終濃度が15mMである請求項7の方法。
- 該2価カチオン/アルコール溶液がマグネシウム/マンガン/アルコール溶液である請求項1の方法。
- 該2価カチオン/アルコール溶液がマグネシウム/カルシウム/アルコール溶液である請求項1の方法。
- 該2価カチオン/アルコール溶液がマグネシウム/マンガン/カルシウム/アルコール溶液である請求項1の方法。
- 該2価カチオン/アルコール溶液がマグネシウム/アルコールである請求項1の方法。
- 該アルコールがエタノールである請求項1の方法。
- 該アルコールの最終濃度が5ないし30%である請求項1の方法。
- 該アルコールの最終濃度が14%である請求項15の方法。
- 該2価カチオンの最終濃度が1ないし1000mMの範囲である請求項1の方法。
- 該2価カチオンの最終濃度が50ないし200mMの範囲である請求項18の方法。
- 該マグネシウムの最終濃度が200mMである請求項14の方法。
- 該マグネシウムの最終濃度が125mMであり、カルシウムの最終濃度が75mMである請求項12の方法。
- 該マグネシウムの最終濃度が125mMであり、マンガンの最終濃度が75mMである請求項11の方法。
- 該マグネシウムの最終濃度が125mMであり、マンガンの最終濃度が38mMであり、該カルシウムの最終濃度が38mMである請求項13の方法。
- 下記工程:
亜鉛を該第1の可溶性フラクションに添加して第2の不溶性フラクションおよび第2の可溶性フラクションを得ること
をさらに特徴とする請求項1の方法。 - 該第2の不溶性フラクションから該蛋白を単離する工程をさらに特徴とする請求項24の方法。
- キレーターを添加して該第2の不溶性フラクションから該蛋白を可溶化させる工程をさらに特徴とする請求項25の方法。
- 該亜鉛が塩化亜鉛、硫酸亜鉛、および酢酸亜鉛からなる群より選択されるメンバーである請求項24の方法。
- 該亜鉛の最終濃度が1ないし500mMである請求項24の方法。
- 該亜鉛の最終濃度が50mM塩化亜鉛である請求項24の方法。
- 該蛋白が形質転換宿主中で組み換え的に生産されるものである請求項1の方法。
- 2価カチオン/アルコール溶液を溶液に添加して第1の可溶性フラクションおよび第1の不溶性フラクションを得る工程を特徴とする、溶液中の蛋白の精製方法であって、
該2価のカチオンが、マグネシウム、マンガン、およびカルシウムからなる群より選択されるメンバーであり;そして
該アルコールが、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、イソ−ブタノール、およびターシャリー−ブタノールからなる群より選択されるメンバーである、
方法。 - 下記工程:
該蛋白を該第1の可溶性フラクションから単離すること
をさらに特徴とする請求項31の方法。 - 該2価カチオンがマグネシウム、マンガン、およびカルシウムからなる群より選択されるメンバーである請求項31の方法。
- 該アルコールがエタノールである請求項31の方法。
- 該アルコールの最終濃度が5ないし30%である請求項31の方法。
- 該アルコールの最終濃度が14%である請求項31の方法。
- 該2価カチオンの最終濃度が1ないし1000mMの範囲である請求項31の方法。
- 該マグネシウムの最終濃度が200mMである請求項31の方法。
- 該マグネシウムの最終濃度が125mMであり、カルシウムの最終濃度が75mMである請求項31の方法。
- 該チオレドキシン融合蛋白がチオレドキシンIL−11融合蛋白であり、該キレーターがEDTAである、請求項1の方法。
- 該EDTAの最終濃度が0.1ないし100mMの範囲である請求項40の方法。
- 該EDTAの最終濃度が15mMである請求項41の方法。
- 下記工程:
MgCl2、CaCl2およびエタノールを含む溶液を添加して可溶性フラクションおよび不溶性フラクションを得ること、次いで、
蛋白を該可溶性フラクションから単離すること
をさらに特徴とする請求項40の方法。 - 該MgCl2およびCaCl2の最終濃度が1ないし1000mMの範囲であり、該エタノールの最終濃度が5ないし30%の範囲である請求項43の方法。
- 該MgCl2の最終濃度が125mMであり、該CaCl2の最終濃度が75mMであり、該エタノールの最終濃度が14%である請求項44の方法。
- 開裂前においては該蛋白は負に帯電していて、融合パートナーおよび目的蛋白を含んでなるものであり、開裂後においては蛋白は正に帯電した目的蛋白であり、下記工程:
該負に帯電した蛋白を第1のアニオン交換樹脂に結合させること、
該負に帯電した蛋白を第1の溶離液で溶離して第1の溶離物を得ること、
該第1の溶離物を第1のカチオン交換樹脂に適用すること、
該負に帯電した蛋白を該第1のカチオン交換樹脂からの未結合フラクション中に集めること、
該負に帯電した蛋白を開裂して正に帯電した蛋白を得ること、
該正に帯電した蛋白を第2のカチオン交換樹脂に結合させること、
該正に帯電した蛋白を第2の溶離液で溶離して第2の溶離物を得ること、
該第2の溶離物を第2のアニオン交換樹脂に適用すること、次いで、
該正に帯電した蛋白を該第2のアニオン交換樹脂からの未結合フラクション中に集めること
をさらに特徴とする請求項2の方法。 - 該チオレドキシン融合蛋白がチオレドキシンおよびIL−11を含んでなるものである請求項46の方法。
- 該第1および該第2のアニオン交換樹脂がジエチルアミンエタン(DEAE)、ポリエチレンイミン(PEI)、および4級アミノエタン(QAE)からなる群より選択される正に帯電したメンバーを有するアニオン交換樹脂である請求項46の方法。
- 該第1および第2のカチオン交換樹脂がスルホニル、スルフィルプロピル(SP)、カルボキシル、およびカルボキシメチルからなる群より選択される負に帯電したメンバーを有するカチオン交換樹脂である請求項46の方法。
- 該第1の溶離液が、
(a)pH7.5ないし8.5の20ないし100mMのTris、100ないし500mMのNaCl、および
(b)pH5.5ないし6.6の50ないし200mMのヒスチジンバッファー、0ないし150mMのNaCl
からなる群より選択されるメンバーである請求項47の方法。 - 該第2の溶離液が、pH9.0ないし10.0の50ないし300mMのグリシンバッファーおよび100ないし500mMのNaClである請求項47の方法。
- 下記工程:
該融合蛋白を第1の樹脂に結合させること、
該融合蛋白を第1の溶離液で溶離して第1の溶離物を得ること、
該第1の溶離物を第2の樹脂に適用すること、
該融合蛋白を該第2の樹脂からの未結合フラクション中に集めること、
該融合蛋白を開裂して開裂蛋白を得ること、
該開裂蛋白を第3の樹脂に結合させること、
該蛋白を第3の溶離液で溶離して第3の溶離物を得ること、
該第3の溶離物を第4の樹脂に適用すること、次いで
該蛋白を該第4の樹脂からの未結合フラクション中に集めること
をさらに特徴とする請求項2の方法。 - 開裂前において該融合蛋白が負に帯電したものである請求項52の方法。
- 該チオレドキシン融合蛋白がチオレドキシン/IL−11融合蛋白である請求項52の方法。
- 該第1および第4の樹脂がアニオン交換樹脂であり、該第2および第3の樹脂がカチオン交換樹脂である請求項53の方法。
- 開裂前において該融合蛋白が正に帯電したものである請求項52の方法。
- 該第1および第4の樹脂がカチオン交換樹脂であり、該第2および第3の樹脂がアニオン交換樹脂である請求項56の方法。
- 下記工程:
該融合蛋白を第1の樹脂に適用すること、
該融合蛋白を該第1の樹脂からの未結合フラクション中に集めること、
該融合蛋白を第2の樹脂に結合させること、
該融合蛋白を第1の溶離液で溶離して第1の溶離物を得ること、
該融合蛋白を開裂して開裂蛋白を得ること、
該開裂蛋白を第3の樹脂に結合させること、
該蛋白を第2の溶離液で溶離して第2の溶離物を得ること、
該第2の溶離物を第4の樹脂に適用すること、次いで
該蛋白を該第4の樹脂からの未結合フラクション中に集めること
をさらに特徴とする請求項2の方法。 - 該チオレドキシン融合蛋白がチオレドキシン/IL−11融合蛋白である請求項58の方法。
- 開裂前において該融合蛋白が負に帯電したものである請求項58の方法。
- 該第1および第3の樹脂がカチオン交換樹脂であり、該第2および第4の樹脂がアニオン交換樹脂である請求項60の方法。
- 開裂前において該融合蛋白が正に帯電したものである請求項58の方法。
- 該第1および第3の樹脂がアニオン交換樹脂であり、該第2および第4の樹脂がカチオン交換樹脂である請求項62の方法。
- 下記工程:
該融合蛋白を第1の樹脂に適用すること、
該融合蛋白を該第1の樹脂からの未結合フラクション中に集めること、
該融合蛋白を第2の樹脂に結合させること、
該融合蛋白を第1の溶離液で該第2の樹脂から溶離して第1の溶離物を得ること、
該融合蛋白を開裂して開裂蛋白を得ること、
該開裂蛋白を第3の樹脂に適用すること、
該蛋白を該第3の樹脂からの未結合フラクション中に集めること、
該蛋白を第4の樹脂に結合させること、次いで
該蛋白を該第4の樹脂から溶離すること
をさらに特徴とする請求項2の方法。 - 開裂前において該融合蛋白が負に帯電したものである請求項64の方法。
- 該融合蛋白がチオレドキシン/IL−11融合蛋白である請求項64の方法。
- 該第1および第4の樹脂がカチオン交換樹脂であり、該第2および第3の樹脂がアニオン交換樹脂である請求項65の方法。
- 開裂前において該融合蛋白が正に帯電したものである請求項64の方法。
- 該第1および第4の樹脂がアニオン交換樹脂であり、該第2および第3の樹脂がカチオン交換樹脂である請求項68の方法。
- 下記工程:
該融合蛋白を第1の樹脂に結合させること、
該融合蛋白を第1の溶離液で該第1の樹脂から溶離して第1の溶離物を得ること、
該第1の溶離物を第2の樹脂に適用すること、
該融合蛋白を該第2の樹脂からの未結合フラクション中に集めること、
該融合蛋白を開裂して開裂蛋白を得ること、
該開裂蛋白を第3の樹脂に適用すること、
該蛋白を該第3の樹脂からの未結合フラクション中に集めること、
該蛋白を第4の樹脂に結合させること、次いで
該蛋白を該第4の樹脂から溶離すること
をさらに特徴とする請求項2の方法。 - 開裂前において該融合蛋白が負に帯電したものである請求項70の方法。
- 該チオレドキシン融合蛋白がチオレドキシン/IL−11融合蛋白である請求項70の方法。
- 該第1および第3の樹脂がアニオン交換樹脂であり、該第2および第4の樹脂がカチオン交換樹脂である請求項71の方法。
- 開裂前において該融合蛋白が正に帯電したものである請求項70の方法。
- 該第1および第3の樹脂がカチオン交換樹脂であり、該第2および第4の樹脂がアニオン交換樹脂である請求項74の方法。
- 該チオレドキシン融合蛋白がチオレドキシン−IL−11であり、下記工程:
チオレドキシン−IL−11を第1のアニオン交換樹脂に結合させること、
第1の溶離液で溶離して第1の溶離物を得ること、
該第1の溶離物を第1のカチオン交換樹脂に適用すること、
該チオレドキシン−IL−11を該第1のカチオン交換樹脂からの未結合フラクション中に集めること、
該チオレドキシン−IL−11融合蛋白を開裂して正に帯電したIL−11を得ること、
該正に帯電したIL−11を第2のカチオン交換樹脂に結合させること、
該IL−11を第2の溶離液で溶離して第2の溶離物を得ること、
該第2の溶離物を第2のアニオン交換樹脂に適用すること、
該IL−11を該第2のアニオン交換樹脂からの未結合フラクション中に集めること、
をさらに特徴とする請求項2の方法。 - 該第1および第2のアニオン交換樹脂がジエチルアミンエタン(DEAE)、ポリエチレンイミン(PEI)、および4級アミノエタン(QAE)からなる群より選択される正に帯電したメンバーを有するアニオン交換樹脂である請求項76の方法。
- 該アニオン交換樹脂がToyopearl(登録商標)QAEである請求項77の方法。
- 該第1および第2のカチオン交換樹脂がスルホニル、スルフィルプロピル(SP)、カルボキシル、およびカルボキシメチルからなる群より選択される負に帯電したメンバーを有するカチオン交換樹脂である請求項76の方法。
- 該第1のカチオン交換樹脂がS Sepharose(登録商標)Fast Flowである請求項79の方法。
- 該第2のカチオン交換樹脂がCM Sepharose(登録商標)Fast Flowである請求項79の方法。
- 該第1の溶離液が、
(a)pH7.5ないし8.5の20ないし100mMのTris、100ないし500mMのNaCl、および
(b)pH5.5ないし6.6の50ないし200mMのヒスチジンバッファー、0ないし150mMのNaCl
からなる群より選択されるメンバーである請求項76の方法。 - 該第2の溶離液が、pH9.0ないし10.0の50ないし300mMのグリシンバッファーおよび100ないし500mMのNaClである請求項76の方法。
- 該チオレドキシン融合蛋白がチオレドキシン−IL−11であり、下記工程:
チオレドキシン−IL−11をToyopearl(登録商標)QAEに結合させること、
75mM NaCl、75mMヒスチジン,pH6.2で溶離すること、
該第1の溶離物をS Sepharose(登録商標)Fast Flowに適用すること、
該チオレドキシン−IL−11を該S Sepharose(登録商標)Fast Flowからの未結合フラクション中に集めること、
該チオレドキシン−IL−11融合蛋白を開裂して正に帯電したIL−11を得ること、
該正に帯電したIL−11をCM Sepharose(登録商標)Fast Flowに結合させること、
該IL−11を0.15Mグリシン、0.15M NaCl,pH9.5で溶離すること、
該第2の溶離物をToyopearl(登録商標)QAEに適用すること、次いで
該IL−11を該Toyopearl(登録商標)QAEからの未結合フラクション中に集めること
をさらに特徴とする請求項2の方法。
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