WO2007032490A1 - チオレドキシンの製造方法 - Google Patents

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yeast
stress
thioredoxin
cells
load treatment
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Junji Yodoi
Yoshiharu Inoue
Shingo Izawa
Hiroshi Masutani
Kazuo Murata
Shogo Tamasu
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Kyoto University
Redox Bioscience Inc.
Kizakura Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing thioredoxin. More specifically, the present invention relates to a method for producing thioredoxin, which produces thioredoxin having a high yeast strength and a simple and efficient method.
  • Thioredoxin is one of the protein thiol-disulfide 'oxidoreductases that was also discovered in 1964 as a coenzyme for ribonucleotide reductase essential for DNA synthesis. Universally recognized. Thioredoxin functions as one of the major antioxidant enzymes in vivo along with peroxyredoxin, which uses it as an electron receptor, to control gene expression, cell proliferation, and cell death. It is known to express physiological activities such as regulation, elimination of reactive oxygen species in cells, inhibition of neutrophil activation, inhibition of neutrophil migration, and the like.
  • thioredoxin has an important protective effect against oxidative stress because it is resistant to symptoms and diseases that are closely related to oxidative stress such as aging, ischemic injury, acute lung failure, and diabetes. It has also been made clear. Thus, thioredoxin has various useful physiological activities and is considered useful for functional foods and pharmaceuticals.
  • thioredoxin When thioredoxin is used in foods and pharmaceuticals, a high degree of safety is required due to the fact that it is taken or administered to humans. Therefore, for the production of thioredoxin for food or pharmaceuticals, it is considered desirable to use yeast that has been used for bread and beer production and has many years of food experience. However, since thioredoxin biosynthesized by yeast accumulates in the yeast cells, conventionally, cultivated yeast cells can be physically obtained using glass beads or a French press in order to obtain thioredoxins. A step of crushing bacterial cells using a means or means using a cell wall lytic enzyme is employed.
  • Non-patent literature l Kondo N. et al., J Immunol 2004; 172: 442-448
  • Non-patent document 2 Das KC. Et al., Biochem Biophys Res Commun 2000; 277: 443-447
  • Non-patent document 3 Nakamura H. et al "Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 15143-1514 8
  • Non-Patent Document 4 Mitsui A. et al., Antioxide Redox Signal 2002; 4: 693-696
  • Non-Patent Document 5 Takagi Y. et al., Proc Natl Acad Sci US A. 1999; 96: 4131-4136
  • Non-Patent Document 6 Hoshino T. et al., Am J Respir Crit Care Med 2003; 168: 1075- 1083
  • Non-Patent Document 7 Hotta M. et al "J Exp Med 1998; 188: 1445-1451
  • Non-Patent Document 8 Yoon BI. Et al., Arch Environ Contam Toxicol 2001; 41: 232-236 Disclosure of the Invention
  • An object of the present invention is to solve the above-described problems of the prior art. Specifically, an object of the present invention is to provide a method for producing thioredoxin capable of producing high-purity thioredoxin in a simple and efficient manner.
  • the present inventor has intensively studied to solve the above problems, and by performing stress loading treatment on the yeast, it can be selectively released out of the yeast cells. It has been found that high-purity thioredoxin can be produced.
  • the present invention has been completed by further studies based on the strong knowledge. That is, the present invention provides the following methods for producing thioredoxin:
  • Item 1 A method for producing thioredoxin using yeast, comprising the step of releasing thioredoxin from the yeast cells by subjecting the yeast to a stress load treatment. Method.
  • Item 2 Stress load processing power Group power consisting of organic solvent stress, pH stress, osmotic stress, thermal stress, oxygen concentration stress, carbon source concentration stress, UV exposure, nitrogen source concentration stress, and electrical stimulation At least selected Item 2.
  • Stress load treatment power The production method according to Item 1, wherein the stress load treatment power is at least one stress factor selected from a group force consisting of organic solvent stress, pH stress, and osmotic stress.
  • Item 4 The production method according to Item 1, wherein the stress load treatment is an organic solvent stress load treatment in which yeast is exposed to an environment in which the organic solvent is present at a concentration of 5 to 30% by weight.
  • the stress load treatment is an organic solvent stress load treatment in which yeast is exposed to an environment in which the organic solvent is present at a concentration of 5 to 30% by weight.
  • Item 5 The production method according to Item 4, wherein the organic solvent is at least one selected from the group power consisting of ethanol, ethyl acetate, and acetone.
  • Item 6 The stress-loading treatment method according to claim 1, which is a pH-stressing treatment in which yeast is exposed to an environment in which the pH is adjusted to 2 to 4.
  • Item 7 The production method according to Item 1, wherein the stress load treatment is an osmotic stress load treatment in which yeast is added to a low osmotic pressure solution.
  • Item 8 The method according to Item 1, wherein the concentration of yeast during stress load treatment is 15 to 300 mg / mL in terms of wet cell weight.
  • Item 9 The production method according to Item 1, wherein the yeast belongs to the genus Saccharomyces or Digosaccharomyces.
  • Item 10 The production method according to Item 1, comprising the following steps (1) to (3):
  • the yeast is alcohol-fermenting yeast
  • the stress load treatment is an organic solvent stress load treatment
  • Item 2 The production method according to Item 1, comprising
  • thioredoxin can be selectively released to the outside of the yeast by performing stress load treatment on the yeast, so that disruption of the yeast cells is essential. Compared with the conventional manufacturing method, the contamination protein contamination can be greatly reduced, and high-quality thioredoxin can be obtained.
  • the production method of the present invention employs a simple means of performing stress load treatment on yeast, and can reduce the production cost of thioredoxin. It can be said that the sex is extremely high.
  • FIG. 1 shows the results of observing the release behavior of thioredoxin when 0 to 20% by weight of ethanol stress was applied to baker's yeast in Example 1.
  • A is the measurement result of thioredoxin released outside the cells when treated with 0-20 wt% ethanol at 37 ° C overnight
  • B 0-20% ethanol Measurement results of thioredoxin released outside the cells when treated at 4 ° C, 30 ° C, or 37 ° C for 2 hours
  • C is 20% ethanol at 37 ° C, 50 Measurement of thioredoxin released from the microbial cell (extracellular fraction) and thioredoxin (fraction of the microbial cell) remaining in the microbial cell after treatment at ° C or 60 ° C for 2 hours Results are shown.
  • thioredoxin is abbreviated as “a-TRX”. The same applies to Figures 2-7 below.
  • FIG. 2 In Example 1, the total protein was measured by CBB staining in the extracellular and intracellular fractions obtained by applying 0 or 20% ethanol stress to baker's yeast. In addition, the thioredoxin contained was measured by Western plot. It is a result. In Fig. 2, the upper row shows the results of CBB staining, and the lower row shows the results of detecting thioredoxin by Western plotting. In addition, in the results of Western blotting of the intracellular fraction at 20% ethanol loading and the extracellular fraction at 0% ethanol loading, the power to see a slight band is shown next to the bands in the left and right lanes. This is due to leakage.
  • FIG. 3 In Example 1, baker's yeast with a concentration of 15-300 mg (wet cell weight) / ml was released outside the cells when treated with 20% ethanol at 37 ° C for 2 hours. 3 shows the results of measuring thioredoxin (extracellular fraction) and thioredoxin (intracellular fraction) remaining in the microbial cell.
  • Example 1 the total protein of the extracellular fraction obtained by treating baker's yeast at pH 2.2 to 4.0 at 37 ° C for 2 hours was measured by CBB staining.
  • the thioredoxin contained was measured by Western blot.
  • the upper row shows the results of CBB staining, and the lower row shows the results of detection of thioredoxin by Western blot.
  • the lane labeled DW is obtained by applying distilled water as a sample.
  • FIG. 5 is a result of observing the release behavior of thioredoxin when low osmotic stress, 20% ethanol stress, or low pH (pH 2.2 or 3.0) stress was applied to yeast in Example 1.
  • the measurement results of thioredoxin released outside the cells after 2 hours of treatment are shown.
  • B is a suspension of soy sauce yeast in distilled water (low osmotic shock) and treated at 37 ° C for 2 hours (lane shown as DW in Fig. 5B). 37% with 20% ethanol.
  • Treated for 2 hours at ° C (lane shown as EtoH in Figure 5B), or treated for 2 hours at 37 ° C at pH 2.2 and 3.0 (lanes shown as pH 2.2 and pH 3.0, respectively in Figure 5B)
  • the results of measurement of thioredoxin released to the outside of the cells are shown.
  • FIG. 6 In Example 1, when yeast other than baker's yeast was treated with 20% ethanol at 37 ° C for 2 hours or at pH 3.0 for 2 hours at 37 ° C, it was removed from the cells. Released chiredoki The measurement result of thin is shown.
  • the following yeasts were used for lanes 1 to 9 in FIG. 6: 1 sake yeast (Association No. 9); 2 sake yeast (Association No. 10); 3 sake yeast (Association No. 11); 4 Laboratory Yeast (YPH250); 5 baker's yeast; 6 wine yeast (OC2 strain); 7 beer yeast (No. 34); 8 brewer's yeast (No. 68); 9 brewer's yeast (No. 1056).
  • FIG. 7 shows the measurement results of thioredoxin released outside the cells when alcohol-fermenting yeast was cultured in Example 2.
  • the method for producing thioredoxin of the present invention is a method for producing thioredoxin using yeast, comprising a step of releasing thioredoxin from the yeast cells by subjecting the yeast to a stress load treatment. It is characterized by including.
  • the yeast used in the production method of the present invention is not particularly limited as long as it is a yeast having the ability to produce thioredoxin. That is, thioredoxin is a protein widely recognized in biological species, and any yeast can be used in the present invention as long as thioredoxin production ability is not impaired by genetic engineering techniques or natural mutation.
  • the yeast used in the present invention is a yeast into which thioredoxin derived from other organisms such as humans has been introduced by a genetic engineering technique, or a yeast having enhanced thioredoxin producing ability by a genetic engineering technique. May be.
  • yeasts used in the production method of the present invention include Saccharomyces, Ncosaccharomyces J3 ⁇ 4 (Torulop sis), Mycotorula, and Torrelaspora. ), Candida, Rhodotorula, Pichia, Schizosacc haromyces, Hansenula, etc.
  • preferred yeasts include: Examples include yeasts of the genus Saccharomyces and Digosaccharomyces.
  • the yeast used in the present invention is preferably baker's yeast, brewer's yeast, sake yeast, among others, preferably edible yeasts such as baker's yeast, brewer's yeast, sake yeast, wine yeast, and soy sauce yeast. It is. By using such a yeast, safe and efficient production of thioredoxin becomes possible.
  • yeast to be subjected to stress load treatment in the production method of the present invention yeast grown according to a normal culture method is used. Specifically, for example, batch culture, fed-batch culture, continuous culture and the like are employed as the yeast culture method. In the culture, it is desirable to appropriately control the culture conditions so that the thioredoxin content of the yeast is increased.
  • the culture is preferably performed using a jar mentor, and specific examples of the culture conditions include the following conditions:
  • ii1 ⁇ 4a about 0-5wm
  • the stress load treatment on the yeast is carried out on the yeast obtained by the above culture, it does not matter whether the yeast is separated and recovered from the culture solution.
  • the stress load treatment may be performed directly on the culture solution obtained by the culture.
  • the culture fluid force obtained by the above culture is also collected by a known means, and the collected yeast is added to a fresh liquid medium or various buffers to prepare a yeast-containing solution, and the yeast-containing solution Stress load processing may be performed on
  • the yeast subjected to the stress load treatment in the production method of the present invention may be a dry yeast obtained by drying the yeast obtained by the above culture.
  • Dry yeast can be obtained by a known method using a belt dryer, a drum dryer, a fluidized bed dryer, a hot air dryer, a gas dryer, an electric dryer or the like.
  • the concentration of yeast at the time of stress load treatment varies depending on the stress load treatment conditions, the type of yeast used, and the like.
  • To 300 mg / ml preferably 15 to 300 mg / ml, more preferably 15 to 200 mg / ml, particularly preferably about 30 to 120 mg / ml, or 0.1 to 250 mg / ml in terms of dry cell weight, preferably Is preferably adjusted to a concentration of about 10 to 250 mg / ml.
  • the concentration of yeast for stress load treatment is, for example, 1.0 x 10 2 to 1.0 X 10 1C) cells / ml, preferably 1.5 X 10 8 to 3.OX 10 9 cells / ml, more preferably 1.5 X 10 8 to 2.0 X 10 9 cells / ml Particularly preferred is 3.0 ⁇ 10 8 to 1.2 ⁇ 10 9 cells / ml.
  • the stress load treatment for yeast is a treatment for giving cell stimulation to yeast, and is performed by exposing the yeast to an environment in which a stress factor exists.
  • the “environment in which a stress factor exists” means an environment that induces a cellular response such as activation of an information transmission system to yeast.
  • Specific stress factors that are applied to yeast include organic solvent stress, pH stress (low pH shock, high pH shock), and osmotic stress (low osmotic shock, high osmotic pressure shock). , Heat stress (low temperature shock, high temperature shock), oxygen concentration stress (low oxygen concentration shock, high oxygen concentration shock), carbon source stress (low carbon source concentration shock, high carbon source concentration shock), UV exposure, nitrogen Source concentration stress (low nitrogen source concentration shock, high nitrogen source concentration shock), electrical stimulation, etc.
  • one stress factor may be loaded alone, or two or more stress factors may be loaded in any combination.
  • organic solvent stress, pH stress, osmotic pressure stress, thermal stress and combinations thereof are preferable, and organic solvent stress; a combination of organic solvent stress and high temperature shock; organic solvent A combination of stress and low pH shock.
  • each stress to be loaded on the yeast can be appropriately set according to the type of yeast to be used.
  • typical stress factors are listed and their specific aspects are shown below:
  • the enzyme is exposed to an environment where the concentration of the organic solvent is 5 to 30% by weight, preferably 15 to 20% by weight. Treat for 16 hours, preferably 2-4 hours.
  • an organic solvent such as ethanol, ethyl acetate and acetone, preferably ethanol
  • alcohol (ethanol) fermenting yeast when alcohol (ethanol) fermenting yeast is cultured, alcohol accumulates in the culture solution with the passage of the yeast culture time, and the alcohol itself gives organic solvent stress to the yeast. . Therefore, when using alcohol-fermenting yeast In addition, organic solvent stress can be applied simply by culturing the yeast. That is, when alcohol-fermenting yeast is used, the culture conditions are appropriately controlled, and the alcohol-fermenting yeast is cultured. After the alcohol having the above concentration is accumulated in the culture solution, the culture can be continued for the above-mentioned time. That's fine. More specifically, a method of culturing alcohol-fermenting yeast under the same conditions as those employed in the production of sake, beer, etc. is exemplified as a method for loading alcohol-fermenting yeast with alcohol.
  • the yeast By adding an organic or inorganic acid, the yeast is exposed to an environment in which ⁇ is adjusted to 2 to 4, preferably 2.6 to 3.6, and treated for 1 to 16 hours, preferably 2 to 4 hours. To do.
  • Yeast cultured in a high osmotic pressure medium or a normal medium is added to a low osmotic pressure solution such as distilled water, for example, 0.1 to 48 hours, preferably 1 to 16 hours, preferably 2 to 4 Time processing.
  • the yeast is exposed to a temperature of 37-60 ° C, preferably 37-50 ° C, and treated for 0.5-16 hours, preferably 1-2 hours.
  • thioredoxin accumulated in the yeast cells is selectively released outside the cells. Therefore, thioredoxin can be obtained by recovering the protein released outside the cells. Specifically, after stress load treatment, the solid fraction containing yeast cells and the liquid fraction containing choredoxin are separated by a known solid-liquid separation means such as centrifugation, and the protein is known from the liquid fraction. It collects by means of this. The protein recovered in this manner contains a high proportion of thioredoxin, and can be used in the field of food and medicine as a protein containing thioredoxin.
  • the recovered thioredoxin-rich protein is subjected to known purification treatments such as salting out, affinity chromatography, ion exchange chromatography, gel filtration, membrane separation, and high performance liquid chromatography as necessary. As a result, the purity of cheredoxin can be further increased.
  • cerevisiae (Association Nos. 7, 10, and 11) were purchased from the Japan Brewing Association.
  • the wine yeast (OC2) was awarded by the University of Yamanashi Wine Research Center, and the soy sauce yeast (Zveosaccharomvc es rouxii) by the Markin Chungyu Corporation.
  • Yeast other than soy sauce yeast is cultured in a test tube containing 5 ml of YPD medium (containing 2% glucose, 1% yeast extract and 2% peptone) for 1-2 days at 28 ° C (seed culture) A portion of this was transferred to fresh YPD medium and cultured at 28 ° C until the logarithmic phase or stationary phase (3 days or more) was reached.
  • the soy sauce yeast was cultured under the same conditions as described above using a liquid medium having 5 wt% NaCl, 2 wt% glucose, 0.5 wt% fermented maternal extract, and 0.5 wt% peptone. Furthermore, the culture using the hyperosmotic medium was performed under the same conditions as described above using the YPD medium containing 1M sorbitol.
  • the measurement sample was subjected to SDS-PAGE (gel concentration 15%) according to a conventional method. The amount applied was adjusted so that 20 ⁇ g of protein was loaded in each lane. Proteins separated by SDS-PAGE were plotted on a PVDF (polyvinylidene fluoride) membrane, and then the rabbit antiserum immunized with thioredoxin 2 expressed and purified in E. coli was reacted as the primary antibody. Next, anti-rabbit IgG antibody conjugated with Horseradish peroxidase (HRP) was reacted as a secondary antibody, and then 4-redox-1-naphthol and H0 were added to obtain thioredox. A thin band was developed. It should be noted that the primary antibody used cannot distinguish between thioredoxin 1 and thioredoxin 2.
  • HRP horseradish peroxidase
  • the ethanol stress load treatment was performed by changing the conditions as appropriate based on the method shown below.
  • Yeast cultured in YPD medium until mid-logarithmic phase was collected, washed, and dispensed into microtubes by 30 OD units ( ⁇ 610 ⁇ m) (about 30 mg as wet cells).
  • ⁇ 610 ⁇ m
  • TCA trichloroacetic acid
  • the cells after ethanol stress loading treatment were suspended in 1501 distilled water, added with glass beads and crushed using Fast Prep. . After centrifugation (14000 rpm, 4 ° C, 10 minutes), transfer the resulting supernatant to a separate microtube of the cells and add 20 ⁇ 1 of 100% TCA solution in ice or at 4 ° C. The solution was allowed to stand still to precipitate the protein (fraction remaining in the fungus body). Centrifuge the samples (14000 rpm, 4 ° C, 10 minutes) for the samples precipitated by TCA (the fraction released from the cell and the fraction remaining in the cell), and collect the collected precipitate with 300-500 1 acetone. Washed.
  • the precipitate was then air-dried and then 12 1 distilled water, 4 / z 1 of 1 M Tris-HC1 buffer (pH 8), and 4 ⁇ l of 5 X sample buffer (62.5 mM Tris-HC1 buffer ( pH 6.8); 10% by weight glycerol, 2% by weight SDS, 3.55mM 2-mercaptoethanol, 0.0025% by weight bromophenol blue), suspended, and subjected to SDS-PAGE and Western blotting .
  • the pH stress (low pH shock) load treatment was performed by appropriately changing the conditions based on the method shown below.
  • ⁇ 610 ⁇ m
  • 1 ml of 50 mM citrate buffer (pH 2.2 to 4.0) was added, and the cells were well suspended and allowed to stand at 37 ° C. for 2 hours. After This operation is the same as in the case of the ethanol stress load.
  • the osmotic stress (low osmotic pressure shock) load treatment was performed by changing the conditions as appropriate based on the following method.
  • Yeast cultured to the mid-log phase in YPD medium containing 1M sorbitol was collected and washed with 1M sorbitol solution.
  • Dispense 30 OD units ( ⁇ 610 nm) (about 30 mg as wet cells) into a mouth tube, add 1 ml of distilled water, and suspend the cells well.
  • a hypoosmotic shock was applied by standing for a period of time. Subsequent operations are the same as in the case of the ethanol stress loading.
  • soy sauce yeast After collecting yeast cultured in a hyperosmotic medium containing 5% by weight NaCl, the cells are washed with a 5% by weight NaCl solution, and then the cells are suspended in distilled water. Hypotonic shock was applied by turbidity and standing at 37 ° C for 2 hours. Subsequent operations are the same as in the case of the ethanol stress load described above.
  • microbial cells (wet weight, baker's yeast) were allowed to stand at 37 ° C in the presence of 0-20 wt% ethanol, and the supernatant was precipitated with TCA to obtain the extracellularly released fraction. The entire amount was subjected to SDS-PAGE and Western blotting was performed with an anti-thioredoxin antibody. As a result, it was clarified that thioredoxin in the microbial cells was released out of the microbial cells with 10-20 wt% ethanol (see Fig. 1A).
  • ethanol stress loading treatment was carried out by changing the bacterial cell concentration. That is, using baker's yeast, each bacterial cell concentration of 15 to 300 mg (wet bacterial cell weight) / ml was treated with 20 wt% ethanol at 37 ° C. for 2 hours. The results obtained are shown in FIG. As a result, some thioredoxins remained in the cells at cell concentrations of 120 mg / ml or more, but most thioredoxins were released outside the cells compared to the amount of thioredoxin released outside the cells. It was confirmed that the stress load by ethanol was effective even when a high-density cell suspension was used.
  • Soy sauce yeast cultured in a medium containing 5% NaCl (856 mM) was washed with 5% NaCl aqueous solution, suspended in distilled water (low osmotic shock), and incubated at 37 ° C for 2 hours. No release of force thioredoxin was observed (see Figure 5B).
  • the release of thioredoxin, a soy yeast strain was observed at 20% ethanol stress (see Fig. 5B).
  • thioredoxin was released by suspending soy sauce yeast cells in 50 mM citrate buffer solution containing 5% NaCl at pH 2.2 and pH 3.0, release of thioredoxin was observed even at V and offset pH. The amount of thioredoxin released was higher at pH 3.0 (see Fig. 5B).
  • Alcohol-fermenting yeast (sake yeast; ⁇ cerevisia was cultured according to the koji process in the production of sake. Alcohol fermentation is carried out by adding yeast, rice, koji (sugar zyme enzyme), and water in three stages, called “third addition”. In addition, in the main koji process, the raw materials were mixed so that the rice: Koji: water (weight ratio) would be about 1: 0.24: 2. Was set to about 10 to 12.6 ° C. The culture solution was sampled at 4, 7, 11, 14, 18, 21, and 25 days after the operation of the distillate, and the sampled culture solution was centrifuged.

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Abstract

　本発明の目的は、簡便で効率的な方法で、酵母から高純度のチオレドキシンを製造できるチオレドキシンの製造方法を提供することである。 　酵母を用いたチオレドキシンの製造において、以下の工程(i)～(iii)を経て、チオレドキシンを製造する：(1)酵母の培養を行う工程、(2)前記工程で得られた酵母に対して、ストレス負荷処理を行い、チオレドキシンを酵母の菌体外に放出させる工程、及び(3)菌体外に放出されたチオレドキシンを回収する工程。

Description

明 細 書
チォレドキシンの製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、チォレドキシンの製造方法に関する。より詳細には、簡便で効率的な方 法で酵母力も高純度のチォレドキシンを製造する、チォレドキシンの製造方法に関 する。
背景技術
[0002] チォレドキシンは、 DNA合成に必須のリボヌクレオチドリダクタ一ゼの補酵素として 1 964年に大腸菌力も発見されたタンパク質チオール-ジスルフイド'ォキシドレダクター ゼの一つであり、あらゆる生物種に普遍的に認められる。チォレドキシンは、それを電 子受容体とするペルォキシレドキシン等と共に生体内で主要な抗酸ィヒ酵素の一つと して機能して、遺伝子発現の制御、細胞増殖の制御、細胞死の制御、細胞内に活性 酸素種の消去、好中球の活性化阻害、好中球の遊走阻害等の生理活性を発現する ことが知られている。更に、チォレドキシンは、老化、虚血障害、急性肺不全、糖尿病 等の酸化ストレスに密接な関係を示す症状や疾病に対して抵抗性を示すことから、 酸化ストレスに対して重要な保護作用を示すことも明らかにされている。このように、 チォレドキシンには各種有用生理活性があり、機能性食品や医薬品等に有用である と考えられている。
[0003] チォレドキシンを食品や医薬品に利用する場合、ヒトに摂取又は投与されるという 性質上、高度の安全性が要求される。そのため、食品又は医薬品用のチォレドキシ ンの製造には、パンやビールの製造等に使用されており長年の食経験がある酵母を 使用することが望ましいと考えられている。し力しながら、酵母により生合成されたチ ォレドキシンは酵母の菌体内に蓄積されるため、従来、酵母力らチォレドキシンを得 るには、培養した酵母菌体をガラスビーズやフレンチプレスによる物理的手段又は細 胞壁溶解酵素を用いる手段を用いて、菌体を破砕する工程が採用されている。その ため、従来のチォレドキシンの製造方法では、酵母菌体の破砕によって、チォレドキ シン以外の夾雑タンパク質も多く混在してしま 、、得られるチォレドキシンの純度が低 くなるという問題点があった。また、酵母を使用して高純度のチォレドキシンを製造す る方法として、酵母の菌体を破砕した後に所定の膜分画を行う方法も提案されて ヽる
1S この方法でも、チォレドキシンの純度の点では未だ満足できるものはない。更に、 クロマトグラフィー、塩析、膜分離等の公知の精製処理を組み合わせて実施すること により、チォレドキシンの純度を高めることは可能である力 大量の菌体を出発材料と する実用レベルの生産を考慮すると、これらの精製処理のみでチォレドキシンの純度 を高めるのは現実的ではない。
[0004] このように、純度の高いチォレドキシンの製造技術に関しては、産業上実用可能な 方法は、未だ十分に確立されて!、るとは言えな 、のが現状である。
非特許文献 l : Kondo N. et al., J Immunol 2004; 172: 442-448
非特許文献 2 : Das KC. et al., Biochem Biophys Res Commun 2000; 277: 443-447 非特許文献 3 : Nakamura H. et al" Proc Natl Acad Sci U S A. 2001; 98: 15143-1514 8
非特許文献 4 : Mitsui A. et al., Antioxide Redox Signal 2002; 4: 693-696
非特許文献 5 : Takagi Y. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1999; 96:4131-4136 非特許文献 6 : Hoshino T. et al., Am J Respir Crit Care Med 2003; 168: 1075-1083 非特許文献 7 : Hotta M. et al" J Exp Med 1998; 188: 1445-1451
非特許文献 8 :Yoon BI. Et al., Arch Environ Contam Toxicol 2001; 41: 232-236 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明の目的は、上記従来技術の課題を解決することである。詳細には、本発明 は、簡便で効率的な方法で、酵母力 高純度のチォレドキシンを製造できるチォレド キシンの製造方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、酵母に対してストレ ス負荷処理を行うことによって、チォレドキシン選択的に酵母の菌体外に放出させる ことができ、高純度のチォレドキシンの製造が可能になることを見出した。本発明は、 力かる知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成したものである。 即ち、本発明は、下記に掲げるチォレドキシンの製造方法を提供する：
項 1. 酵母を用いてチォレドキシンを製造する方法であって、酵母に対してストレス 負荷処理を行うことにより、チォレドキシンを酵母の菌体外に放出させる工程を含む ことを特徴とする、チォレドキシンの製造方法。
項 2. ストレス負荷処理力 有機溶媒ストレス、 pHストレス、浸透圧ストレス、熱ストレ ス、酸素濃度ストレス、炭素源濃度ストレス、紫外線暴露、窒素源濃度ストレス、及び 電気刺激よりなる群力 選択される少なくとも 1種のストレス要因を負荷する処理であ る、項 1に記載の製造方法。
項 3. ストレス負荷処理力 有機溶媒ストレス、 pHストレス、及び浸透圧ストレスよりな る群力も選択される少なくとも 1種のストレス要因を負荷する処理である、項 1に記載 の製造方法。
項 4. ストレス負荷処理が、有機溶媒が 5〜30重量％の濃度で存在する環境下に 酵母を晒す有機溶媒ストレス負荷処理である、項 1に記載の製造方法。
項 5. 有機溶媒が、エタノール、酢酸ェチル、及びアセトンよりなる群力 選択される 少なくとも 1種である、項 4に記載の製造方法。
項 6. ストレス負荷処理力 pHが 2〜4に調整された環境下に酵母を晒す pHストレ ス負荷処理である、請求項 1に記載の製造方法。
項 7. ストレス負荷処理が、低浸透圧溶液中に酵母を添加する浸透圧ストレス負荷 処理である、項 1に記載の製造方法。
項 8. ストレス負荷処理時の酵母の濃度力 湿菌体重量換算で 15〜300mg/mLで ある、項 1に記載の製造方法。
項 9. 酵母が、サッカロマイセス属又はジゴサッカロマイセス属に属する酵母である、 項 1に記載の製造方法。
項 10. 下記工程 (1)〜(3)を含む、項 1に記載の製造方法：
(1)酵母の培養を行う工程、
(2)前記工程で得られた酵母に対して、ストレス負荷処理を行い、チォレドキシンを酵 母の菌体外に放出させる工程、及び
(3)菌体外に放出されたチォレドキシンを回収する工程。 項 11. 酵母がアルコール発酵酵母であり、ストレス負荷処理が有機溶媒ストレス負 荷処理であって、
アルコール発酵酵母を培養して培養液中にアルコールを蓄積させ、当該アルコール が蓄積した培養液中で当該アルコール発酵酵母を保持することにより、チォレドキシ ンを当該アルコール発酵酵母の菌体外に放出させる工程を含む、項 1に記載の製造 方法。
発明の効果
[0008] 本発明の製造方法によれば、酵母に対してストレス負荷処理を行うことによって、酵 母菌体外にチォレドキシンを選択的に放出させることができるので、酵母菌体の破砕 を必須としていた従来の製造方法に比べて、夾雑タンパク質の混在を大幅に低減で き、高純度のチォレドキシンを得ることが可能になる。
[0009] また、本発明の製造方法は、酵母に対してストレス負荷処理を行うという簡便な手 段を採用しており、チォレドキシンの製造コストの低減をも可能ならしめるので、その 産業上の有用性は極めて高 、と言える。
図面の簡単な説明
[0010] [図 1]実施例 1において、パン酵母に 0〜20重量％のエタノールストレスを負荷した際 に、チォレドキシンの放出挙動を観察した結果である。図中、 Aには、 0〜20重量％ のエタノールで、 37°Cで一晩処理した際に、菌体外に放出されたチォレドキシンの測 定結果； Bには、 0〜20%のエタノールで、 4°C、 30°C、又は 37°Cで 2時間処理した際 に、菌体外に放出されたチォレドキシンの測定結果;及び Cには、 20%のエタノールで 、 37°C、 50°C、又は 60°Cで 2時間処理した際に、菌体外に放出されたチォレドキシン（ 菌体外画分)及び菌体内に残存して!/、たチォレドキシン (菌体内画分)の測定結果を 示す。
[0011] なお、図 1中、チォレドキシンを「a - TRX」と略記する。以下の図 2〜7においても同 様である。
[図 2]実施例 1において、パン酵母に 0又は 20%のエタノールストレスを負荷すること により得られた菌体外画分及び菌体内画分にっ ヽて、その総タンパク質を CBB染色 により測定すると共に、含有しているチォレドキシンをウェスタンプロットにより測定し た結果である。図 2中、上段には CBB染色結果を示し、下段にはウェスタンプロットに よりチォレドキシンを検出した結果を示す。なお、 20%エタノール負荷時の菌体内画 分、及び 0%エタノール負荷時の菌体外画分のウェスタンブロットの結果にぉ 、て僅 かにバンドが見える力 これらは左右のレーンのバンドの横漏れによるものである。
[図 3]実施例 1において、 15〜300mg (湿菌体重量) / mlの濃度のパン酵母に対して、 2 0%エタノールで 37°Cで 2時間処理した際に、菌体外に放出されたチォレドキシン (菌 体外画分)及び菌体内に残存して 、たチォレドキシン (菌体内画分)を測定した結果 を示す。
[図 4]実施例 1において、パン酵母を、 pH2.2〜4.0で、 37°Cで 2時間処理することによ り得られた菌体外画分について、その総タンパク質を CBB染色により測定すると共に 、含有しているチォレドキシンをウェスタンブロットにより測定した結果である。図 4中、 上段には CBB染色結果を示し、下段にはウェスタンブロットによりチォレドキシンを検 出した結果を示す。なお、図中、 DWと示すレーンは、蒸留水をサンプルとしてァプラ ィしたものである。
[図 5]実施例 1において、低浸透圧ストレス、 20%のエタノールストレス、又は低 pH (p H2.2又は 3.0)ストレスを酵母に負荷した際に、チォレドキシンの放出挙動を観察した 結果である。図中、 Aには、実験室酵母及びパン酵母を、 20%のエタノールで 37°Cで 2時間処理（図 5A中、 EtOHと表記するレーン）、蒸留水に懸濁 (低浸透圧ショック）し て 37°Cで 2時間処理（図 5A中、 DWと表記するレーン）、又は SD培地（2重量％ =約 11 0 mMグルコース、及び 1重量％ポリペプトン含有）に懸濁して 37°Cで 2時間処理（図 5A 中、 SDと表記するレーン)した際に菌体外に放出されたチォレドキシンの測定結果を 示す。また、図中、 Bには、醤油酵母を蒸留水に懸濁 (低浸透圧ショック）して 37°Cで 2 時間処理（図 5B中、 DWと表記するレーン）、 20%のエタノールで 37°Cで 2時間処理（ 図 5B中、 EtoHと表記するレーン）、又は pH2.2及び 3.0で 37°Cで 2時間処理（図 5B中 、それぞれ pH2.2、 pH3.0と表記するレーン)した際に、菌体外に放出されたチォレド キシンの測定結果を示す。
[図 6]実施例 1において、パン酵母以外の酵母に対して、 20%のエタノールで 37°Cで 2時間処理又は pH3.0で 37°Cで 2時間処理した際に、菌体外に放出されたチォレドキ シンの測定結果を示す。なお、図 6中のレーン 1〜9は、それぞれ以下の酵母を使用 した：1 清酒酵母 (協会 9号）； 2 清酒酵母 (協会 10号）； 3 清酒酵母 (協会 11号）； 4 実験室酵母 ( YPH250) ; 5 パン酵母； 6 ワイン酵母（OC2株）； 7 ビ ール酵母 (No.34) ; 8 ビール酵母 (No.68) ; 9 ビール酵母 (No.1056)。
[図 7]実施例 2において、アルコール発酵酵母を培養した際に、菌体外に放出された チォレドキシンの測定結果を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0012] 以下、本発明につ 、て詳述する。
[0013] 本発明のチォレドキシンの製造方法は、酵母を用いてチォレドキシンを製造する方 法であって、酵母に対してストレス負荷処理を行うことにより、チォレドキシンを酵母の 菌体外に放出させる工程を含むことを特徴とする。
[0014] 本発明の製造方法に使用される酵母としては、チォレドキシン産生能を有する酵母 である限り、特に制限されない。即ち、チォレドキシンは生物種に広く認められるタン ノ ク質であり、遺伝子工学的手法又は自然変異等によりチォレドキシン産生能が欠 損されていないことを限度として、あらゆる酵母を本発明に使用できる。本発明に使 用される酵母は、ヒト等の他の生物由来のチォレドキシンが遺伝子工学的手法により 導入されている酵母や、遺伝子工学的手法等によりチォレドキシン産生能が高めら れて 、る酵母であってもよ 、。
[0015] 本発明の製造方法に使用される酵母として、具体的には、サッカロマイセス属 (Sacc haromyces 、ンコサッカロマイセス J¾ (Zygosaccharomyces)、トルロプンス為 (Torulop sis)、ミコトノレラ属 (Mycotorula)、トノレラスポラ属 (Torulaspora)、カンディダ属 (Candida )、ロドトルラ属（Rhodotorula)、ピキア属（Pichia)、シゾサッカロマイセス属（Schizosacc haromyces)、ハンセヌラ属（Hansenula)等の酵母例示される。これらの中で、好ましい 酵母として、サッカロマイセス属及びジゴサッカロマイセス属の酵母が挙げられる。
[0016] 本発明に使用される酵母としては、パン酵母、ビール酵母、清酒酵母、ワイン酵母、 醤油酵母等の食用酵母であることが望ましぐ中でもパン酵母、ビール酵母、清酒酵 母は好適である。このような酵母を使用することにより、安全で効率的なチォレドキシ ンの製造が可能になる。 [0017] 本発明の製造方法においてストレス負荷処理に供される酵母は、通常の培養方法 に従って増殖させたものが使用される。具体的には、酵母の培養方法としては、例え ば、回分培養、流加培養、連続培養等が採用される。当該培養では、酵母のチォレ ドキシン含有量が増大するように、培養条件を適宜制御しておくことが望ましい。また 、当該培養は、好適にはジャーフアーメンターを用いて実施され、その培養条件とし て具体的には以下の条件が挙げられる：
培養温度： 28〜33°C程度
培養時間： 1〜120時間
培養液の pH： 4〜7程度程度
ii¼a： 0〜5wm程度
撹拌速度： 100〜700rpm程度。
[0018] 本発明の製造方法において、酵母に対するストレス負荷処理は、上記培養により得 られた酵母に対して実施される限り、該酵母の培養液からの分離回収の有無は問わ ない。例えば、当該ストレス負荷処理は、上記培養により得られた培養液に対して直 接実施してもよい。また、上記培養により得られた培養液力も公知の手段により酵母 を回収し、回収した酵母を新鮮な液体培地又は各種緩衝液等に添加することにより 酵母含有溶液を調製し、該酵母含有溶液に対してストレス負荷処理を実施してもよ い。
[0019] 本発明の製造方法においてストレス負荷処理に供される酵母は、上記培養により 得られた酵母を乾燥させた乾燥酵母であってもよい。乾燥酵母は、ベルトドライヤー、 ドラムドライヤー、流動床乾燥機、温風乾燥機、ガス乾燥機、電気乾燥機等を用いて 公知の方法で得ることができる。
[0020] 本発明において、ストレス負荷処理を行う際の酵母の濃度については、ストレス負 荷処理の条件、使用する酵母の種類等によって異なるが、例えば、湿菌体重量換算 で、通常 0. l〜300mg/ml、好ましくは 15〜300mg/ml、更に好ましくは 15〜200mg /ml、特に好ましくは 30〜120mg/ml程度の濃度、或いは乾燥菌体重量換算で 0. 1 〜250mg/ml、好ましくは 10〜250mg/ml程度の濃度に調整しておくことが望ましい。 また、他の観点から、ストレス負荷処理の酵母の濃度については、例えば、 1. 0 X 10 2〜1. 0 X 101C)cells/ml、好ましくは 1. 5 X 108〜3. O X 109cells/ml、更に好ましくは 1. 5 X 108〜2. 0 X 109cells/ml、特に好ましくは 3. 0 X 108〜1. 2 X 109cells/mlが 挙げられる。
[0021] 酵母に対するストレス負荷処理は、酵母に細胞刺激を与える処理のことであり、スト レス要因が存在する環境に酵母を晒すことにより行われる。ここで、 「ストレス要因が 存在する環境」とは、酵母に対して、情報伝達系の活性化等の細胞応答を誘発させ る環境を意味する。
[0022] 酵母に負荷されるストレス要因としては、具体的には、有機溶媒ストレス、 pHストレ ス（低 pHショック、高 pHショック）、浸透圧ストレス（低浸透圧ショック、高浸透圧ショッ ク）、熱ストレス (低温ショック、高温ショック）、酸素濃度ストレス (低酸素濃度ショック、 高酸素濃度ショック)、炭素源濃度ストレス (低炭素源濃度ショック、高炭素源濃度ショ ック）、紫外線暴露、窒素源濃度ストレス (低窒素源濃度ショック、高窒素源濃度ショッ ク）、電気刺激等が挙げられる。
[0023] これらのストレス要因の内、 1つのストレス要因を単独で負荷してもよぐまた 2っ以 上のストレス要因を任意に組み合わせて負荷してもよい。これらの中で、好ましくは、 有機溶媒ストレス、 pHストレス、浸透圧ストレス、熱ストレス及びこれらの組み合わせ が挙げられ、更に好ましくは、有機溶媒ストレス;有機溶媒ストレスと高温ショックの組 み合わせ；有機溶媒ストレスと低 pHショックの組み合わせが挙げられる。
[0024] 酵母に負荷させる各ストレスの具体的条件については、使用する酵母の種類等に 応じて適宜設定することができる。一例として、代表的なストレス要因を挙げて、その 具体的態様を以下に示す：
有機溶媒ストレス
エタノール、酢酸ェチル、アセトン等の有機溶媒、好ましくはエタノールを使用して 、該有機溶媒の濃度が 5〜30重量％、好ましくは 15〜20重量％となる環境下に酵 母を晒し、 1〜16時間、好ましくは 2〜4時間処理する。
[0025] また、アルコール (エタノール)発酵酵母を培養すると、当該酵母の培養時間の経 過と共に培養液中にアルコールが蓄積し、このアルコール自体が当該酵母に対して 有機溶媒ストレスを与えることになる。従って、アルコール発酵酵母を使用する場合 には、当該酵母の培養を行うだけで有機溶媒ストレスを負荷することもできる。即ち、 アルコール発酵酵母を使用する場合には、培養条件を適宜制御してアルコール発 酵酵母の培養を行って、培養液中に上記濃度のアルコールを蓄積させた後、培養を 上記時間継続させればよい。より具体的には、アルコール発酵酵母にアルコール負 荷を行う方法として、清酒やビール等の製造時に採用される培養と同条件で、アルコ ール発酵酵母を培養する方法が例示される。
低 ΌΗショック
有機酸又は無機酸を添加することにより、 ρΗが 2〜4、好ましくは 2. 6〜3. 6に調 整された環境下に酵母を晒し、 1〜16時間、好ましくは 2〜4時間処理する。
低浔诱圧ショック
高浸透圧の培地又は通常の培地で培養した酵母を、蒸留水等の低浸透圧溶液中 に添カ卩し、例えば 0. 1〜48時間、好ましくは 1〜16時間、好ましくは 2〜4時間処理 する。
高温ショック
37〜60°C、好ましくは 37〜50°Cの温度環境下に酵母を晒し、 0. 5〜16時間、好 ましくは 1〜2時間処理する。
斯くしてストレス負荷処理することによって、酵母の菌体内に蓄積されているチォレ ドキシンが選択的に菌体外に放出される。従って、菌体外に放出されたタンパク質を 回収することにより、チォレドキシンを得ることができる。具体的には、ストレス負荷処 理後に、遠心分離等の公知の固液分離手段により、酵母菌体を含む固体画分とチ ォレドキシンを含む液体画分に分離し、該液体画分からタンパク質を公知の手段に より回収する。このようにして回収されたタンパク質中にはチォレドキシンが高 、割合 で含有しており、チォレドキシン高含有タンパク質として、食品や医薬品の分野で使 用することができる。更に、回収されたチォレドキシン高含有タンパク質を、必要に応 じて、塩析、ァフィユティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾 過、膜分離、高速液体クロマトグラフィー等の公知の精製処理に供することにより、チ ォレドキシンの純度を更に高めることもできる。
実施例 [0027] 以下、実施例及び試験例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定さ れるものではない。
実施例 1
1. ,験材料 び ,験
<使用菌株 >
実験室酵母 cerevisiaeYPH250 (MATa trpl- Δ 1 his3- Δ 200 leu2- Δ 1 lys2- 801 ade2- 101 ura3- 52)株は Yeast Genetic Stock Centerより取り寄せた株で、京都大学 農学研究科で植え継いでいたものを使用した。パン酵母^, cerevisiae)はオリエンタ ル酵母工業株式会社から分与されたものを用いた。ビール酵母 ( cerevisiae) (No.3
4、 68、及び 1056)は中越酵母工業株式会社から取り寄せたものを用いた。清酒酵母 (
5. cerevisiae) (協会 7、 10、 11号）は日本醸造協会力 取り寄せたものを用いた。ワイ ン酵母（OC2)は山梨大学ワイン研究センターから、また醤油酵母 (Zveosaccharomvc es rouxii)はマルキン忠勇株式会社からそれぞれ恵与を受けた。
[0028] <酵母の培養 >
醤油酵母以外の酵母は、 5mlの YPD培地（2重量％グルコース、 1重量％酵母エキス 、 2重量 %ペプトン含有)を含む試験管で 1〜2日間 28°Cで培養した菌体 (種培養）の一 部を新しい YPD培地に移し、 28°Cで対数期又は定常期（3日以上）になるまで培養を 行なった。また、醤油酵母の培養は、 5重量％ NaCl、 2重量％グルコース、 0.5重量％酵 母エキス、 0.5重量 %ペプトン力 なる液体培地を用いて、上記と同条件で行った。更 に、高浸透圧培地を用いた培養は、 1Mソルビトールを含む YPD培地を用いて、上記 と同条件で行った。
[0029] <チォレドキシンのウェスタンブロッテイング >
測定サンプルを常法に従い SDS-PAGE (ゲル濃度 15%)に供した。各レーンには 20 μ gのタンパク質がロードされるようにアプライ量を調整した。 SDS- PAGEによって分離 したタンパク質を PVDF (ポリフッ化ビ-リデン)膜にプロットし、次いで、大腸菌で発現 •精製したチォレドキシン 2を用いて免疫したゥサギの抗血清を 1次抗体として反応さ せた。次いで、 Horseradish peroxidase (HRP)をコンジュゲートした抗ゥサギ IgG抗体 を 2次抗体として反応させた後、 4-クロ口- 1-ナフトール及び H 0をカ卩えてチォレドキ シンのバンドを発色させた。なお、用いた 1次抗体はチォレドキシン 1とチォレドキシン 2を区別することはできな 、ことを確認して 、る。
[0030] <エタノールストレス負荷処理方法 >
エタノールストレス負荷処理は、以下に示す方法をベースとして、適宜その条件を 変更して実施した。
[0031] YPD培地で対数期中期まで培養した酵母を集菌、洗浄し、 30 OD unit分（ λ =610 η m) (湿菌体として約 30 mg)ずつマイクロチューブに分注した。これに、 0〜20%の濃度 のエタノールを含む蒸留水 lmlをカ卩えて菌体をよく懸濁し、 37°Cにて 2時間静置するこ とにより、エタノールストレス負荷処理を行った。その後、遠心（14000rpm、 3分）により 菌体を沈殿させ、上清を別のマイクロチューブに移し、 50 1の 100%トリクロ口酢酸（TC A)溶液を加えて氷中又は 4°Cで静置して、タンパク質を沈殿させた (菌体外放出画分 ) o別途、エタノールストレス負荷処理した後の菌体を 150 1の蒸留水に懸濁し、ガラ スビーズを加え Fast Prepを用いて破砕した。菌体破砕物を遠心（14000rpm、 4°C、 10 分）した後、得られた上清を菌体内別のマイクロチューブに移し、 20 μ 1の 100% TCA 溶液を加えて氷中又は 4°Cで静置して、タンパク質を沈殿させた (菌体内残存画分)。 TCAにより沈殿させたサンプル (菌体外放出画分、及び菌体内残存画分)をそれぞ れ遠心（14000rpm、 4°C、 10分）し、回収された沈殿を 300〜500 1のアセトンで洗浄 した。次いで、この沈殿を風乾させた後、 12 1の蒸留水、 4 /z 1の 1 M Tris- HC1緩衝 液（pH 8)、及び 4 μ 1の 5 Xサンプルバッファー（62.5 mM Tris- HC1 buffer (pH 6.8)； 1 0重量％グルセロール、 2重量％ SDS、 3.55mM 2-メルカプトエタノール、 0.0025重量％ ブロモフエノールブルー含有）を添カ卩して懸濁し、 SDS-PAGE及びウェスタンブロッテ イングを行なった。
[0032] < pHストレス（低 pHショック）負荷処理方法 >
pHストレス (低 pHショック)負荷処理は、以下に示す方法をベースとして、適宜その 条件を変更して実施した。
[0033] YPD培地で対数期中期まで培養した酵母を集菌、洗浄し、 30 OD unit分（ λ =610 η m) (湿菌体として約 30 mg)ずつマイクロチューブに分注した。これに、 50mMクェン酸 緩衝液 (pH 2.2〜4.0) lmlを加えて菌体をよく懸濁し、 37°Cにて 2時間静置した。以後 の操作は上記エタノールストレス負荷の場合と同様である。
[0034] <浸透圧ストレス (低浸透圧ショック）負荷処理方法 >
浸透圧ストレス (低浸透圧ショック)負荷処理は、以下に示す方法をベースとして、 適宜その条件を変更して実施した。
[0035] 1Mソルビトールを含む YPD培地で対数期中期まで培養した酵母を集菌し、 1Mソル ビトール溶液で洗浄した。 30 OD unit分（λ =610 nm) (湿菌体として約 30 mg)ずつマ イク口チューブに分注し、 1mlの蒸留水をカ卩えて菌体をよく懸濁し、 37°Cにて 2時間静 置することによって、低浸透圧ショックを与えた。以後の操作は上記エタノールストレ ス負荷の場合と同じである。また、比較のため、蒸留水の代わりに、 SD培地 (2重量％ =約 110 mMグルコース、及び 1重量％ポリペプトン含有）を用いて、同様に試験を行つ た。
[0036] また、醤油酵母の場合は、 5重量％ NaClを含む高浸透圧培地で培養した酵母を集 菌した後に 5重量％ NaCl溶液で菌体を洗浄し、次いで菌体を蒸留水に懸濁して 37°C にて 2時間静置することによって、低浸透圧ショックを与えた。以後の操作は上記エタ ノールストレス負荷の場合と同じである。
[0037] 2. 睡菓
<エタノールストレス負荷の検討結果 >
30mgの菌体（湿重量、パン酵母）を 0〜20重量％エタノール存在下で、 37°Cでー晚 静置した後、その上清を TCA沈殿させて菌体外放出画分を得、その全量を SDS-PA GEに供し抗チォレドキシン抗体にてウェスタンブロッテイングを行なった。その結果、 10〜20重量 %エタノールにより菌体内のチォレドキシンは菌体外に放出されることが 明らかになった（図 1A参照)。
[0038] 更に、より温和なチォレドキシン放出条件を検討することを目的として、パン酵母を 用いて、 4°C、 30°C、及び 37°Cで 0〜20重量％のエタノール存在下で 2時間静置したの ち、菌体外へ放出されたチォレドキシンの検出を行なった。その結果、 37°C、 2時間 でチォレドキシンの菌体外への放出が確認された（図 1B参照)。
[0039] 次に、パン酵母を用い、エタノール濃度を 20重量％に固定し、抽出温度を 37°C、 50 。C、及び 60°Cに設定し、菌体外へ放出されるチォレドキシン、及び菌体内に残存す るチォレドキシンの測定を行なった。その結果、 37°C、 2時間の処理で、菌体内のチ ォレドキシンはほぼ菌体外に抽出されることが分力つた（図 1C参照)。また、 50°Cや 6 0°Cでは 30分間のエタノール負荷処理で、ほぼ全てのチォレドキシンを放出させ得る ことも確認された (図 1C参照)。
[0040] 次に、パン酵母を用いて、 20重量％エタノールで over night (約 16時間）、及び 2時間 処理した際に菌体外に放出されるタンパク質を CBB ( Coomassie Brilliant Blue )染色 すると共に、ウェスタンブロッテイングによるチォレドキシンの検出を行なった。即ち、 エタノールストレス負荷した後に回収した菌体外画分及び菌体内画分のそれぞれ全 量を SDS-PAGEに供した後、 CBB染色及びウェスタンブロッテイングによるチォレドキ シンの検出を行なった。得られた結果を図 2に示す。この結果、 20重量％ェタノールで 37°C、 over night処理することにより、菌体内のタンパク質の一部が菌体外に放出さ れることが分力つた。一方、 2時間の処理では菌体内のタンパク質は殆ど菌体外に放 出されておらず、僅かに低分子量のタンパク質の放出を認めるだけであった。一方、 ウェスタンブロッテイングの結果からは、菌体内のチォレドキシンはほぼ全て菌体外 に放出されているのが確認された。
[0041] <エタノールストレス負荷における菌体濃度の検討結果 >
20重量 %エタノールによるストレス負荷処理における菌体濃度の影響を検討するた めに、菌体の濃度を変化させてエタノールストレス負荷処理を行なった。即ち、パン 酵母を用いて、 15〜300mg (湿菌体重量) /mlの各菌体濃度として 20重量 %エタノール で 37°Cで 2時間処理を行なった。得られた結果を図 3に示す。この結果、 120mg/ml以 上の菌体濃度では菌体内にチォレドキシンが一部残存していたが、菌体外に放出さ れたチォレドキシン量と比べると、ほとんどのチォレドキシンは菌体外に放出されてい ると考えられ、高密度の菌体懸濁液を用いてもエタノールによるストレス負荷が有効 であることが確認できた。
[0042] < pHストレス (低 pHショック)負荷の検討結果 >
低 pHショック（50mMクェン酸緩衝液）によるチォレドキシンの菌体外への放出につ いてパン酵母を用いて検討を行なった。この結果、エタノールストレス負荷の場合と 同様に主として低分子量のタンパク質成分が細胞外に放出され、 pHの低下に伴って その量も増加したが、チォレドキシが最も抽出されたのは pH 3.2の場合であった（図 4 参照)。
[0043] <浸透圧ストレス (低浸透圧ショック)負荷の検討結果 >
物理的な刺激として、浸透圧ストレス負荷によるチォレドキシンの菌体外への放出 を試みた。低浸透圧ストレスとして、 1Mソルビトールを含む YPD培地でパン酵母又は 実験室酵母を培養した後に、 1Mソルビトールで菌体を洗浄した後、蒸留水に懸濁（ 低浸透圧ショック）して 37°Cで 2時間インキュベートした。その結果、実験室株ではェ タノ一ルストレス負荷に匹敵するレベルのチォレドキシンの放出が観察された。パン 酵母でもチォレドキシンの放出が認められた力 その放出効率はエタノールストレス 負荷の場合を下回った（図 5A参照)。また、 1Mソルビトールで洗浄後、 SD培地 (2重 量％ =約 110 mMグルコース、及び 1重量％ポリペプトン含有）に懸濁した場合にはチォ レドキシンの放出は観察されな力つた（図 5A参照)。
[0044] 5%の NaCl (856 mM)を含む培地で培養した醤油酵母を 5% NaCl水溶液で洗浄した 後、蒸留水に懸濁 (低浸透圧ショック）して 37°Cで 2時間インキュベートした力 チォレ ドキシンの放出は認められなかった（図 5B参照）。一方、 20%エタノールストレス負荷 では醤油酵母菌体力 のチォレドキシンの放出が観察された（図 5B参照)。更に、 5% NaClを含む pH 2.2及び pH 3.0の 50mMクェン酸緩衝液に醤油酵母菌体を懸濁して チォレドキシンの放出を行なったところ、 V、ずれの pHでもチォレドキシンの放出が認 められたが、チォレドキシンの放出量は pH 3.0の場合の方が高かった（図 5B参照）。
[0045] <パン酵母以外の酵母に対するエタノールストレス負荷及び pHストレス（低 pHショ ック)負荷の検討結果 >
パン酵母以外の酵母についても、上記と同様にして、エタノールストレス負荷又は 低 pHショックを与えることによって、チォレドキシンの放出に与える影響を検討した。 得られた結果を図 6に示す。この結果から、 20%エタノールの処理により、清酒酵母（ 協会 7, 10, 11号；図 6の A)、実験室酵母^. ^i^kk YPH250 ;図 6の B)、ワイン酵 母（OC2株；図 6の C)、及びビール酵母（No. 34, 68, 1056；図 6の C)からも、チォレ ドキシンが菌体外に放出されることが確認された。また、低 pHショック (pH 3.0)を与え た場合、清酒酵母においても、チォレドキシの放出は同様に観察されたが、放出量 はエタノールストレス負荷の場合よりも若干少なめであった（図 6A参照)。更に、低 pH ショックによるチォレドキシの放出は、実験室酵母やビール酵母 (No. 34, 68, 1056) でも観察された。
[0046] <総合考察 >
以上の結果から、使用する酵母の特性に応じて、適用なストレス負荷条件を適宜設 定することにより、酵母の菌体外にチォレドキシンを選択的に放出させることが可能 になることが明らかになった。
[0047] 実施例 2
清酒の製造における醪工程に準じて、アルコール発酵酵母 (清酒酵母;^ cerevisia を培養した。清酒醸造における醪工程では、「添 (first addition)」、「仲 (second addi tion)」、「留 (third addition)」という 3段階に分けて酵母、米、コウジ (糖ィ匕酵素）、及び 水を仕込んで、アルコール発酵が行われている。本試験では、一般的な手法で、清 酒の製造における醪工程を行った。なお、本醪工程では、留後に、米:コウジ:水 (重 量比）がおよそ 1 : 0. 24 : 2. 2となるように原料を混合して、発酵温度は 10〜12.6°C程 度にした。留の操作の後の 4、 7、 11、 14、 18、 21、及び 25日目に培養液のサンプリン グを行なった。サンプリングした培養液を遠心分離して、上清を回収し、当該上清 lm Lに対して 50 μ 1の 100% TCA溶液を添カ卩して、 4°Cで静置することによりタンパク質を 沈殿させた。次いで、この沈殿を遠心（14000rpm、 4°C、 10分)し、回収された沈殿を 3 00〜500 1のアセトンで洗浄した。次いで、この沈殿を風乾させた後、 12 1の蒸留水 、 4 1の 1 M Tris- HC1緩衝液（pH 8)、及び 4 μ 1の 5 Xサンプルバッファー（62.5 mM Tris-HCl buffer (pH 6.8) ; 10重量％グルセロール、 2重量％ SDS、 3.55mM 2-メルカプ トエタノール、 0.0025重量％ブロモフエノールブルー含有）を添カ卩して懸濁し、 SDS-P AGE及びウェスタンブロッテイングを行なった。
[0048] 結果を図 7に示す。図 7から明らかなように、発酵後期において、培養液中の TRX 漏出量が増大していることが確認された。なお、留後 21〜25日目の培養液には、エタ ノールが 17.1〜17.5%の濃度で蓄積していた。即ち、本結果は、発酵後期にアルコ ール発酵酵母が産生したアルコールが培地に蓄積し、この蓄積されたアルコールが ストレス要因となって、酵母の菌体外にチォレドキシンを選択的に放出されたことを示 している。

Claims

請求の範囲
[1] 酵母を用いてチォレドキシンを製造する方法であって、酵母に対してストレス負荷 処理を行うことにより、チォレドキシンを酵母の菌体外に放出させる工程を含むことを 特徴とする、チォレドキシンの製造方法。
[2] ストレス負荷処理力 有機溶媒ストレス、 pHストレス、浸透圧ストレス、熱ストレス、酸 素濃度ストレス、炭素源濃度ストレス、紫外線暴露、窒素源濃度ストレス、及び電気刺 激よりなる群力も選択される少なくとも 1種のストレス要因を負荷する処理である、請求 項 1に記載の製造方法。
[3] ストレス負荷処理力 有機溶媒ストレス、 pHストレス、及び浸透圧ストレスよりなる群 力も選択される少なくとも 1種のストレス要因を負荷する処理である、請求項 1に記載 の製造方法。
[4] ストレス負荷処理が、有機溶媒が 5〜30重量％の濃度で存在する環境下に酵母を 晒す有機溶媒ストレス負荷処理である、請求項 1に記載の製造方法。
[5] 有機溶媒が、エタノール、酢酸ェチル、及びアセトンよりなる群力 選択される少な くとも 1種である、請求項 4に記載の製造方法。
[6] ストレス負荷処理力 pHが 2〜4に調整された環境下に酵母を晒す pHストレス負荷 処理である、請求項 1に記載の製造方法。
[7] ストレス負荷処理が、低浸透圧溶液中に酵母を添加する浸透圧ストレス負荷処理で ある、請求項 1に記載の製造方法。
[8] ストレス負荷処理時の酵母の濃度力 湿菌体重量換算で 15〜300mg/mLである、 請求項 1に記載の製造方法。
[9] 酵母が、サッカロマイセス属又はジゴサッカロマイセス属に属する酵母である、請求 項 1に記載の製造方法。
[10] 下記工程 (1)〜(3)を含む、請求項 1に記載の製造方法：
(1)酵母の培養を行う工程、
(2)前記工程で得られた酵母に対して、ストレス負荷処理を行い、チォレドキシンを酵 母の菌体外に放出させる工程、及び
(3)菌体外に放出されたチォレドキシンを回収する工程。
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