CN116218746B - 一株具有降尿酸作用的植物乳植杆菌 - Google Patents
一株具有降尿酸作用的植物乳植杆菌 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种具有降尿酸作用的植物乳植杆菌，该菌株为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum NML21，其采用固体分离培养基从甘肃省甘南藏族自治州夏河县阿木去乎镇尼玛龙村的传统牦牛酸乳样品中分离得到；所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum NML21在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No.26508。本发明所得菌株在低pH及高浓度胆盐环境中生长状况良好，在模拟人工胃、肠液环境中分别胁迫3h存活率均高于80%，具有良好的耐受性。采用本发明植物乳植杆菌NML21，能够通过降低尿酸水平从而缓解高尿酸血症。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种具有降尿酸作用的植物乳植杆菌。
背景技术
高尿酸血症（Hyperuricemia，HUA）是一种因人体嘌呤代谢紊乱以及尿酸排泄失常从而导致的血尿酸含量显著高于正常值的慢性临床综合症，HUA患病率逐年上升并且常常伴发多种系统性疾病。HUA不仅是痛风发病的基础阶段，而且容易诱导糖尿病、高血压、尿酸盐肾病等慢性病，长期高尿酸水平对人体血管、心脏以及肾脏均会造成一系列不良后果。
当前，HUA的治疗预防措施主要利用外源药物作用以及限制饮食中嘌呤物质的摄入量两种途径。临床上的降尿酸药物大部分依赖于黄嘌呤氧化酶（Xanthine Oxidase，XO）抑制剂（别嘌呤醇）以及促尿酸排泄药（苯溴马隆）等，虽然降尿酸药物药效明显，但极易引起过敏反应、胃肠道反应以及肝功能损害等毒副作用和病人耐受性差等问题，长期使用会引起人体严重的不良反应。另外，由于高嘌呤食物众多，如红肉、海鲜类、肝脏类、禽类、啤酒等，目前很难通过限制饮食来控制HUA的发生。此外，食品添加剂中的鲜味剂也属于嘌呤类物质。因此，HUA患者还必须控制饮食中鲜味剂的摄取，这些对患者追求良好风味的饮食习惯受到很大影响。因此，亟待寻找新的途径方法来降低HUA人群血液中的尿酸，探索一种新型的、毒副作用低且具有一定食源性的HUA治疗与预防途径具有重要的意义。
乳酸菌作为人体肠道内正常菌群，能够调控人体血脂、血糖等代谢过程，乳酸菌以无毒、无害、无副作用的特点，在临床治疗和预防代谢性肠道疾病方面日益引起高度重视，并在有效调节胃肠道代谢功能方面展现出宽阔的临床应用前景和市场潜力。
发明专利CN110684685A公开了一种发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum9-4菌株，保藏号为CCTCC NO：M 2019619，其具有降解嘌呤的能力，但对肌苷和鸟苷的分解率最高也只有50％~60％左右，降解能力较差。又如发明专利CN106754479A公开了一种弯曲乳杆菌，命名为弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)5-1，保藏号为CGMCC No .12891，该菌株对肌苷和鸟苷的降解率能够达到90％左右。
已有研究发现乳酸菌可以通过降解或者吸收核苷竞争性减少肠道上皮对核苷的吸收，从而减少尿酸的生成，同时能够通过抑制黄嘌呤氧化酶的活性控制尿酸的生成，在治疗HUA上具有药物治疗无可比拟的优点。因此，筛选高效降解核苷及抑制黄嘌呤氧化酶活性的乳酸菌对于开发不同种类具有辅助降解尿酸的微生物菌剂或药物具有重要的现实意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有降尿酸作用的植物乳植杆菌。
为解决上述问题，本发明所述的一种具有降尿酸作用的植物乳植杆菌，其特征在于：该菌株为植物乳杆菌Lactobacillus plantarumNML21，其采用固体分离培养基从甘肃省甘南藏族自治州夏河县阿木去乎镇尼玛龙村的传统牦牛酸乳样品中分离得到；所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarumNML21在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No.26508（保藏单位地址：中国.北京. 北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏日期：2023年2月7日）。
所述固体分离培养基是指MRS固体培养基或GM17固体培养基。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明植物乳植杆菌NML21对肌苷和鸟苷降解率分别为 96.57%和 98.33%；其MRS发酵上清液、菌悬液和无细胞提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制率分别为54.93%、32.41%、32.80%。同时，该菌株在低 pH及高浓度胆盐环境中生长状况良好，在模拟人工胃、肠液环境中分别胁迫 3h存活率均高于80%，具有良好的耐受性。
2、采用本发明植物乳植杆菌NML21，能够通过降低尿酸水平从而缓解高尿酸血症。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为本发明菌株的菌落形态图。
图2为本发明菌株的纯化菌落形态图。
图3为本发明菌株的革兰氏染色镜检结果图。
图4为本发明菌株的系统发育树。
图5为本发明中肌苷和鸟苷在高效液相色谱图中的保留时间。
图6为本发明中肌苷和鸟苷的标准曲线。
图7为本发明菌株降解核苷液相图。
图8为本发明菌株抑制黄嘌呤氧化酶活性图。
图9为本发明菌株酸耐受图。
图10为本发明菌株胆盐耐受图。
图11为本发明菌株模拟人工胃肠液耐受图。
具体实施方式
一种具有降尿酸作用的植物乳植杆菌，该菌株为植物乳杆菌Lactobacillus plantarumNML21，其采用固体分离培养基从甘肃省甘南藏族自治州夏河县阿木去乎镇尼玛龙村（海拔3500 m）的传统牦牛酸乳样品中分离得到；植物乳杆菌Lactobacillus plantarumNML21在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No.26508（保藏单位地址：中国.北京. 北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏日期：2023年2月7日）。
其中：固体分离培养基是指MRS固体培养基或GM17固体培养基。
MRS固体培养基是指称取54 g MRS肉汤，15 g琼脂粉于1000 mL蒸馏水中加热溶解，121℃灭菌15 min。
GM17固体培养基是指称取54 g GM17肉汤，15 g琼脂粉于1000 mL蒸馏水中加热溶解，121℃灭菌15 min。
对该植物乳杆菌Lactobacillus plantarumNML21进行生物学鉴定如下：
⑴形态特征：菌株革兰氏染色结果为阳性，杆状，单个排列，无芽孢。
⑵培养特征：菌株在分离培养基上37℃恒温培养48 h，菌落规则，乳白色，边缘整齐。
⑶遗传学特征，即菌株NML21的16S rDNA序列：全长为 1447bp。
实施例1 乳酸菌的分离、纯化及鉴定
1、菌种的分离：
称取1.0 g发酵酸乳，置于9.0mL 0.85%的灭菌生理盐水中，用生理盐水作一系列梯度稀释（如：1：100，1：1000，1：10000等），然后分别吸取不同发酵酸乳稀释液0.1mL分别于MRS固体培养基和GM17固体培养基上涂布，37℃恒温培养48h后观察菌落形态，结果如图1所示，菌株中间凸起呈半透明，表面是光滑的点状菌落，边缘规则且无褶皱。
2、菌种的纯化：
挑取平板上典型的（呈圆形或者不规则圆形，乳白色、不透明，且质地紧密、边缘平整，表面粗糙、干燥无光泽，菌落薄且菌落较小）单菌落，于固体平板上划线纯化2~3代后分离得到纯菌落，结果如图2所示。
3、菌种形态学观察及保藏：
以革兰氏阳性、过氧化氢酶试验阴性为标准判定为疑似乳酸菌。首先进行革兰氏染色，挑选染色后为紫色的菌落滴加H2O2，若不产生气泡，则为目标菌株，使用显微镜观察菌体形态，并将菌种在-80℃脱脂乳甘油中冷冻保存。结果如图3所示，菌株在革兰氏染色试剂的作用下呈蓝紫色，表明为革兰氏阳性菌。镜检视野内菌落形态均一，在细胞形态上分别呈现为杆状（有长有短），排列形态为单个排列或呈链条状排列。
4、菌种分子生物学鉴定：
提取菌株的基因组DNA进行片段扩增。采用乳酸菌16S rDNA基因的通用引物：正向引物，27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，反向引物，1492R：5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3，1.5% 琼脂糖凝胶电泳，目标片段长度约1500 bp，在0.2mL离心管中加入表1所示成分，轻弹混匀，瞬时离心收集管壁上的液滴至管底，在PCR扩增仪上进行PCR反应，反应参数如表2所示。反应完成后，用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(美国Axygen Biosciences公司)回收3 µLPCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。确认PCR扩增片段。
表1 PCR扩增反应体系
表2 PCR扩增反应程序
取各个菌种纯化后的PCR产物，使用测序仪ABI3730-XL(美国 AppliedBiosystems公司)进行DNA测序。测序完成后用NCBI Blast程序将拼接后的序列文件与NCBI16S数据库中的数据进行比对，得到与待测物种序列相似性最大的物种信息，即为鉴定结果。
测定结果显示菌株NML21的 16S rDNA 序列，全长为 1447bp，系统进化树如附图4所示。序列如序列表中SEQ ID NO.1第1位到1447位所示的核苷酸序列构成。
实施例2 乳酸菌高效降解核苷的筛选
1、核苷标准曲线的制作：
采用高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatograph, HPLC）法检测鸟苷、肌苷的含量，通过外标法确定标准品的保留时间，绘制标准曲线。
分别配制0.5g/L鸟苷和肌苷标准溶液，并用孔径0.22µm的水系滤膜过滤后，分别进样确定它们的保留时间，然后吸取相同体积的肌苷和鸟苷标准溶液混合配成肌苷-鸟苷标准溶液，将 5、8、11、14、17和20 µL肌苷-鸟苷溶液分别注入配有紫外波长检测器和色谱柱，基于外标法进行标准曲线测定。
所用液相色谱仪为Agilent 1260，流动相为等梯度乙腈：0.1%磷酸水溶液=3：97，反相色谱柱选择Symmetry C18(5μm，4.6×250mm)。流速：1 mL /min，柱温30℃，设定时间：10 min，在 254 nm 波长处测定肌苷和鸟苷的含量。
高效液相色谱外标法测定核苷的结果如图5 所示，肌苷在本色谱条件下保留时间为5.682 min，鸟苷保留时间为4.729 min。以标准溶液进样量和峰面积进行线性回归，得到线性回归方程，结果如图6所示，标准曲线分别为y = 2364.1x + 7.2895，R² = 1，y =2301.4x +6.4148，R² = 1。其中y为峰面积，x为肌苷或鸟苷的质量（µg）。
2、乳酸菌降解核苷测定：
取2.0 mL活化二代菌液，4℃ 4500r/min离心10min，弃上清，收集菌体，菌体用0.85%的无菌生理盐水洗涤2次并用生理盐水调整菌液OD600nm为1.5，向清洗后的菌体中加入750µL肌苷-鸟苷-中性磷酸钾溶液，37℃条件下、120 r/min 振荡培养 1 h。孵育后将所得菌液在4℃、4500 r/min 离心10 min，所得上清液与反应终止剂（0.1mol/L高氯酸溶液）按体积 9：1 混合均匀后，0.22µm水系滤膜过滤后吸取5µL用于HPLC检测，用标准曲线计算上清液中残余肌苷和鸟苷的含量。
根据公式V=(C1-C2)/60，a=(C1-C2/C1)*100%计算不同菌株对肌苷或鸟苷的降解速率和降解率。式中：V为降解速率（µg/L/min），C1为鸟苷（肌苷）的初始量（g/L），C2为鸟苷（肌苷）的残留量（g/L）。
实施结果如图7 所示，计算结果如表3所示。
表3 本发明菌株对核苷的降解作用
由图7和表3可以看出，菌株NML21对肌苷的降解速率为6.04 μg/L/min，降解率为96.57%；对鸟苷的降解速率为6.15 μg/L/min，降解率为98.33%。
实施例3 乳酸菌对黄嘌呤氧化酶活性的抑制作用
⑴制备MRS发酵上清液：
取10mL活化至对数期的乳酸菌菌液6000 r/min离心10 min，收集上清液即为MRS发酵上清液
⑵制备菌悬液：
收集⑴中所得菌体沉淀，该菌体沉淀用无菌的PBS缓冲液洗涤2次，再重悬于PBS中，调整OD600 nm使其为1.0，37℃孵育12 h即为菌悬液。
⑶制备无细胞提取物：
将浓度为1×108CFU/mL的细胞悬浮液在超声功率为300 W，处理5 s，并以间隔5 s的条件下冰浴超声破碎10 min，再将超声后的菌悬液于8000 r/min离心5 min，取上清液过0.22 µm的微孔水系滤膜得到无细胞提取物。
⑷黄嘌呤氧化酶的抑制能力评价反应体系如表4。
表4 黄嘌呤氧化酶抑制率测定反应体系
取1.5mL黄嘌呤底物溶液（0.20 g/L），1.5mL提取液（即：MRS发酵上清液或菌悬液或无细胞提取物）混匀，然后加入2 mL预先在37℃下保温20min的黄嘌呤氧化酶液（0.20 U/mL）。启动反应，在波长 295nm的紫外条件下记录反应时间内（每隔2min记录一次实验数据）的吸光度值变化。对照样中把黄嘌呤氧化酶液用灭菌的PBS缓冲液替换。黄嘌呤氧化酶的活性用黄嘌呤氧化酶的抑制率来表达。由于黄嘌呤在295nm的波长下有吸光值，所以须扣除不加样品和酶吸光度值。每个样品做三次平行实验。用酶标仪（TECAN，infinite M200）检测波长为295nm的反应液。以别嘌呤醇为阳性对照，黄嘌呤氧化酶抑制率的计算公式如下：
抑制率（%）=[1-(C-D)/(A-B)]
式中：A是含有黄嘌呤氧化酶不含样品的吸光度；B是不含黄嘌呤氧化酶和样品的吸光度；C是含有黄嘌呤氧化酶和样品的吸光度；D是含有样品但不含黄嘌呤氧化酶的吸光度。
测定结果如图8所示，别嘌呤醇对XO抑制率达到77.80%，MRS发酵上清液、菌悬液和无细胞提取物对XO的抑制率分别为54.93%、32.41%、32.80%。
实施例4 乳酸菌耐受特性研究
1、酸耐受性：
活化至对数期的菌液按接种量2%分别接种于pH 2.0、2.5、3.0、3.5和6.5的MRS液体培养基中，37℃恒温培养24 h。各梯度未接种的MRS液体培养基作为空白对照，在600 nm下测吸光度值，重复三次试验取平均值。
MRS液体培养基是指称取54 g MRS肉汤于1000 mL蒸馏水中加热溶解，121℃灭菌15 min。
实施结果如图9所示，在培养周期内乳酸菌发酵液OD值随pH值降低而减小，随着pH值的上升，乳酸菌菌株生长状况趋于良好，发酵液的OD值快速上升。当pH值为极低的2.0 和2.5时，发酵液处于低酸环境，菌株NML21生长速度变缓。
2、胆盐耐受性：
活化至对数期的菌液按接种量2%分别接种到含0.0、0.1、0.2和0.3%牛胆盐的MRS液体培养基中，37℃恒温培养24 h。各胆盐浓度未接种的MRS液体培养基为空白对照，在630nm下测吸光度值，重复三次试验取平均值。
实施结果如图10所示，在培养周期内OD值随胆盐浓度的升高而降低。当不添加牛胆盐时，乳酸菌菌株生长状况良好，发酵液的OD值迅速上升。当胆盐浓度为0.2%和0.3%时，乳酸菌生长繁殖速度趋缓，菌体处于低生存状态。
3、模拟人工胃液耐受性：
NaCl 0.8 g、KH2PO40.02g、Na2HPO40.115g、胃蛋白酶0.35 g，pH调整为2.5得到模拟人工胃液（100 mL），用0.22 μm规格的的微滤膜过滤备用。取1.0 mL活化至对数期的菌液接种于9.0 mL模拟人工胃液，37℃培养3 h，于0 h和3 h采用平板菌落计数法进行活菌计数，根据以下公式计算各菌株存活率：
存活率/%=N1/N0*100
式中：N1为经模拟胃液处理后的乳酸菌菌株的活菌数(CFU/mL)；
N0为未经模拟胃液处理的乳酸菌菌株的活菌数(CFU/mL)。
4、模拟人工肠液耐受性：
NaCl 0.8 g、KH2PO40.02g、Na2HPO40.115g、牛胆盐1.8 g、胰蛋白酶0.1g ，pH调整为8.0得到模拟人工肠液（100 mL），用0.22 μm的微滤膜过滤备用。取1.0 mL活化至对数期的菌液接种到9.0 mL模拟人工胃液中，37℃培养3 h后，吸取1.0mL经过人工胃液的悬浮液加入到9.0 mL模拟人工肠液中，37℃培养3 h后，于0 h和3 h采用平板菌落计数法进行活菌计数，根据以下公式计算各菌株存活率：
存活率/%=Ns/N0*100
式中：NS为经模拟肠液处理后的乳酸菌菌株的活菌数(CFU/mL) ；
N0为未经模拟肠液处理的乳酸菌菌株的活菌数(CFU/mL) 。
实施结果如图11所示，菌株在人工胃液中的活菌数呈现下降趋势，初始活菌数达到108CFU/mL以上，在人工胃液中处理3 h 后，菌株的活菌数在106CFU/mL 以上，存活率为90.86%。经过 3 h人工胃液培养后，再转运至人工肠液培养 3 h，随着培养时间的延长，活菌数虽呈现出下降的趋势，但仍然维持在 106CFU/mL 以上，且存活率下降，为84.30%，说明肠道中的胆盐和消化酶对菌株存活率影响显著。经过3h的人工肠液与3h的人工胃液相比，菌株的活菌数及存活率变动幅度不大。
综上所述，本发明植物乳植杆菌具有高效降解嘌呤核苷（鸟苷和肌苷）以及抑制黄嘌呤氧化酶活性的能力，同时在低 pH及高浓度胆盐环境中生长状况良好，在模拟人工胃、肠液环境中胁迫 3h存活率较高。因此，植物乳植杆菌NML21是辅助防治高尿酸血症微生态菌剂开发与应用的良好菌株。
Claims (2)
1.一种具有降尿酸作用的植物乳植杆菌，其特征在于：该菌株为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum NML21，其采用固体分离培养基从甘肃省甘南藏族自治州夏河县阿木去乎镇尼玛龙村的传统牦牛酸乳样品中分离得到；所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum NML21在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No.26508。
2.如权利要求1所述的一种具有降尿酸作用的植物乳植杆菌，其特征在于：所述固体分离培养基是指MRS固体培养基或GM17固体培养基。
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| CN115786187A (zh) * | 2022-11-04 | 2023-03-14 | 天津科技大学 | 一株能降解尿酸的植物乳杆菌、益生菌组合物及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Research on bacterial community characteristics of traditional fermented yak milk in the Tibetan Plateau based on high-throughput sequencing;Shifang Wu等;Peer J;20230125;第11卷;e14733 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NL2037437A (en) | 2024-05-06 |
| CN116218746A (zh) | 2023-06-06 |
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