CN116769656A

CN116769656A - 一种发酵粘液乳杆菌yys-k2及其应用

Info

Publication number: CN116769656A
Application number: CN202310706818.4A
Authority: CN
Inventors: 官雪芳; 王�琦; 赵大洲; 黄君阳
Original assignee: Xiamen Yuanzhidao Biotech Co ltd; Institute of Agricultural Engineering Technology of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Xiamen Yuanzhidao Biotech Co ltd; Institute of Agricultural Engineering Technology of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2023-06-15
Filing date: 2023-06-15
Publication date: 2023-09-19

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，提供一种发酵粘液乳杆菌YYS‑K2及其应用。该发酵粘液乳杆菌YYS‑K2的保藏编号为CGMCC No.27129。该发酵粘液乳杆菌YYS‑K2可产乙醇脱氢酶(ADH)，具有良好的乙醇耐受力和降解能力，可在高浓度乙醇培养基中生长，同时该菌对α‑淀粉酶抑制有显著的抑制作用，具有显著的OH和DPPH自由基清除能力，具有良好的还原能力，该菌可为解酒产品、抗氧化产品和减肥产品(抑制α‑淀粉酶功能制品)等功能产品的开发提供新的益生菌源，具有重要的应用价值。

Description

一种发酵粘液乳杆菌YYS-K2及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种发酵粘液乳杆菌YYS-K2及其应用。

背景技术

酒自古是人类生活中不可或缺的重要食物，过量的饮酒会在体内代谢产生自由基等物质，长期饮酒对肝脏伤害极大、容易造成酒精肝、慢性乙醇中毒、啤酒肚、肥胖等，同时酒还会进入血脑屏障造成大脑功能障碍。

但酒作为人类文明发展的重要食品，在社交礼仪，缓解情绪压力，活跃气风上都有不可替代的作用，饮酒给人类带来的乐趣不可估量。因此，如何让人类体验饮酒乐趣的同时使其对机体产生最小的危害是一项很有意义的重要工作。

自由基作为化学反应活性极高的不成对电子的原子或基团，除了过量饮酒在体内产生，在有氧呼吸、细胞活动、房油烟、吸烟、汽车尾气、工业废气等环境污染物中也普遍存在，过量的自由基和氧化剂对机体带来各种危害，包括攻击机体细胞，分解机体组织等，并最终引起脑中风、老年痴呆、动脉硬化、癌症、糖尿病、氧化衰老等不同的健康问题。

另外，饮酒过程中还容易导致啤酒肚、肥胖等亚健康问题，而对α-淀粉酶进行抑制可减少饮酒过程中机体对碳水化合物的吸收，对其产生的肥胖问题可起到一定的抑制作用。

益生菌是一类对人类健康有益的微生物，已有研究表明：益生菌可以通过多种途径调理机体平衡，有些益生菌在生长过程中可以利用乙醇作为碳源代谢乙醇，有些则可产乙醇脱氢酶将乙醇降解。但是，目前来说，在本领域，兼具解酒、抗氧化、抑制α-淀粉酶作用的菌种的研究上仍是是空白的。

如何开发一款兼具显著降解乙醇(解酒功能)、可清除自由基、可缓解饮酒造成的肥胖的益生菌，正是本领域技术人员致力于解决的问题和难点。

发明内容

为解决上述背景技术提到的现有技术的不足，本发明提供一种发酵粘液乳杆菌YYS-K2，发酵粘液乳杆菌YYS-K2(Limosilactobacillus fermentum YYS-K2)于2023年4月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.27129。

本发明还提供一种组合物，其含有如上所述的发酵粘液乳杆菌YYS-K2。

在一实施例中，所述组合物包括微生物制剂、食品、保健品、药物中的一种。

在一实施例中，在所述组合物中，所述发酵粘液乳杆菌YYS-K2的数量≥1×10⁶CFU/mL或≥1×10⁶CFU/g。在一实施例中，在所述组合物中，所述发酵粘液乳杆菌YYS-K2的数量≥1×10⁸CFU/mL或≥1×10⁸CFU/g。

在一实施例中，所述组合物中包含发酵粘液乳杆菌YYS-K2未灭活菌、发酵粘液乳杆菌YYS-K2灭活菌、发酵粘液乳杆菌YYS-K2菌株的代谢物、发酵粘液乳杆菌YYS-K2冻干株中的一种或多种组合。

本发明还提供一种发酵物，其为如上所述的发酵粘液乳杆菌YYS-K2发酵获得。

本发明还提供如上所述发酵粘液乳杆菌YYS-K2和/或其发酵物在制备功能产品中的应用。

在一实施例中，所述功能产品包括食品、保健品或药品。

在一实施例中，所述功能产品包括至少以下一种功能：

(1)降解乙醇；

(2)产ADH酶；

(3)清除自由基DPPH；

(4)清除OH自由基；

(5)具备还原能力；

(6)抑制α-淀粉酶酶活性。

在一实施例中，所述功能产品包括解酒产品、抗氧化产品以及抑制α-淀粉酶功能产品。

本发明还提供如上所述的发酵粘液乳杆菌YYS-K2或如上所述的组合物在制备发酵食品中的应用。

在一实施例中，发酵粘液乳杆菌YYS-K2作为益生菌，利用水果、中草药进行发酵以制备发酵食品。

基于上述，与现有技术相比，本发明提供的发酵粘液乳杆菌YYS-K2，具有以下有益效果：

本发明提供的发酵粘液乳杆菌YYS-K2可产乙醇脱氢酶(ADH)，具有良好的乙醇耐受力和降解能力，可在高浓度乙醇培养基中生长，同时该菌对α-淀粉酶抑制有显著的抑制作用，具有显著的OH和DPPH自由基清除能力，具有良好的还原能力，该菌可为解酒产品、抗氧化产品和减肥产品(抑制α-淀粉酶功能制品)等功能产品的开发提供新的益生菌源，具有重要的应用价值。

本发明的其它特征和有益效果将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他有益效果可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图；在下面描述中附图所述的位置关系，若无特别指明，皆是图示中组件绘示的方向为基准。

图1为发酵粘液乳杆菌YYS-K2的菌落形态图。

图2为发酵粘液乳杆菌YYS-K2的扫描电镜图。

图3为发酵粘液乳杆菌YYS-K2的16S r DNA目的片段扩增琼脂糖电泳图。

图4为发酵粘液乳杆菌YYS-K2的16S rDNA基因的系统发育树图谱。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；下面所描述的本发明不同实施方式中所设计的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要说明的是，本发明所使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义，不能理解为对本发明的限制；应进一步理解，本发明所使用的术语应被理解为具有与这些术语在本说明书的上下文和相关领域中的含义一致的含义，并且不应以理想化或过于正式的意义来理解，除本发明中明确如此定义之外。

本发明还提供如下所示操作示例和实施例：

本发明发酵粘液乳杆菌YYS-K2(Limosilactobacillus fermentum YYS-K2)是从乳扇中经过实验室选育获得。

本发明从乳扇中提取该菌的操作示例如下：

实施例1菌的筛选分离

取约1g乳扇样品置于乙醇浓度为8％(v/v)MRS液体培养基中，37℃恒温培养1-3(d)至培养基浑浊获得1代培养液，将1代培养液置于乙醇浓度为12％(v/v)MRS液体培养基，37℃恒温培养1-3d至培养基中至浑浊获得耐乙醇菌株的培养介质样品，将耐乙醇发酵介质样品稀释至10^-3、10^-4、10^-5，取0.1mL涂布于含有12％乙醇和2％CaCO₃的MRS固体培养基中，37℃恒温48-72h，选取能产生较大溶菌圈的疑似乳杆菌的单菌落若干株，纯化3次后，进行乙醇脱氢酶(ADH)的活性检测，选取ADH酶活力最高的菌株保存并命名为YYS-K2。

实施例2菌种的鉴定

2.1YYS-K2菌的形态观察

YYS-K2的菌落形态如图1所示，菌体形态如图2所示。YYS-K2的主要形态特征如下：菌落圆，在MRS培养基上呈乳白色、光滑、不透明；菌体杆状，宽0.6-0.9μm，长1-2.5μm。

2.2YYS-K2菌的碳源利用分析

采用HBI乳酸菌生化鉴定条(GB4789.35标准,购自海博生物)，具体为取出一条生化鉴定条，挑取纯化的YYS-K2部分菌落，分别接种到以下培养基：七叶苷、纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、麦芽糖、水杨苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖、菊糖、乳糖、1％马尿酸钠。接种完后做好标记，盖上盖子，放置36±1℃培养。培养结束后，放在记录卡上观察。

其中，1％马尿酸钠还需在培养结束后，沿着试管壁缓缓加入0.2mL茚三酮溶液，不要振荡，在36℃±1℃的水浴中放置10min后判读结果，判读结果详见表1。

表1 YYS-K2糖水化合物及主要生化反应情况

注：“+”为实验阳性，“-”为实验阴性。

结论：根据表1结果可知：YYS-K2可利用麦芽糖、蔗糖、棉子糖和乳糖等糖类物质，不能利用七叶苷、纤维二糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇、菊糖和马尿酸钠。

2.3 YYS-K2的分子生物学鉴定

①YYS-K2菌基因组DNA的提取：采用TIANGEN公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取，具体提取步骤参照该试剂盒的说明书。

②16S rDNA序列的PCR扩增：扩增16S rDNA基因序列，所用引物为：

②16S rDNA序列的PCR扩增：扩增16SrDNA基因序列，所用引物为F 9-27：5’-GAGTTT GAT CCT GGC TCA G-3’；R 1525-1542：5’–AGA AAG GAG GTG ATC CAG CC-3’；PCR反应体系：2×Mix 12.5μL，引物及DNA各1μL，ddH₂09.5μL。

PCR扩增程序：93℃预变性4min。然后94℃变性30s，55℃(16SrDNA)，72℃延伸90s，共30个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存。

③PCR产物检测及测序分析：取5ul的PCR产物，在加入EB的1.0％的琼脂糖中凝胶电泳分离检验，扩增得到16SrDNA目的片段长约1500bp左右(16S r DNA目的片段扩增琼脂糖电泳图详见图3)；

④系统发育分析：在NCBI数据中对各16S rRNA序列进行Blast比对分析，得到序列与Limosilactobacillus fermentum的序列同源性均大于99％，进行MEGA 4中的Neighbor-joining方法发育树的构建分析(结果见图4)。基因序列如下：

GCAAGCGGGGTGCTATACATGCAGTCGAACGCGTTGGCCCAATTGATTGACGGTGCTTGCACCTGATTGATTTTGGTCGCCAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCAGAAGCGGGGGACAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACGTTGTTCGCATGAACAACGCTTAAAAGATGGCTTCTCGCTATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGGACTGAGACACGGCCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACACGTATGAGAGTAACTGTTCATACGTTGACGGTATTTAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGAGAGTGCAGGCGGTTTTCTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATCGGAAACTGGATAACTTGAGTGCAGAAGAGGGTAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGACTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAA

CTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGA

AGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTGCGCCAACCCTAGAGATAGGGCGTTTCCTTCGGGAACGC

AATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACG

AGCGCAACCCTTGTTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAA

ACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAGATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCT

ACAATGGACGGTACAACGAGTCGCGAACTCGCGAGGGCAAGCAAATCTCTTAAAACCGTTCTCAG

TTCGGACTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATG

CCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACC

CAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGTGAAG

TCGTAACAAGGTAGCGAGGGCCC。

结论：结合YYS-K2菌的形态观察，HB I乳酸菌生化鉴定，以及DNA系统发育树中的同源性分析，确定YYS-K2为发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)菌种。

本发明提供的发酵粘液乳杆菌YYS-K2的性能表征如下：

实施例3发酵粘液乳杆菌YYS-K2在不同乙醇浓度培养基上的生长状况

(1)将发酵粘液乳杆菌YYS-K2母液按照2％的量分别接种于以下不同浓度乙醇的MRS培养基中37℃厌氧培养，分别于不同发酵时间(6、12、24、36h)取发酵液，测定菌体OD_600nm值，以未接菌的相同乙醇浓度的MRS培养基为空白对照，每一处理三个重复，菌体生长量；

其中，发酵粘液乳杆菌YYS-K2母液在不同浓度乙醇的MRS培养基中菌体OD_600nm值扣去空白影响，所获得的△OD_600nm的计算公式为：

△OD_600nm＝OD_样品-OD_空白；

其中，OD_空白表示未接菌的相同乙醇浓度的MRS培养基测得的OD值。

(2)通过测定在不同乙醇浓度中菌体的生长情况(具体详见表2数据表)，发现：

YYS-K2可以在乙醇浓度≤12％的MRS培养基中生长良好，在发酵36h后菌体△OD值大于1.0；在乙醇浓度为18-24(％)的MRS培养基中时，经过6-24的适应后，部分菌可显著生长，在发酵36h时，△OD_600nm值大于0.5，说明菌YYS-K2可在24％高浓度的乙醇胁迫环境中生长，这为其进一步在高浓度的乙醇环境中降解乙醇提供了良好的基础。

表2YYS-K2在含不同乙醇浓度培养基中的生长状况(△OD_600nm值)

注：表中不同字母a-g表示样品间存在显著的差异。

实施例4发酵粘液乳杆菌YYS-K2对高浓度乙醇的耐受力测试

(1)基于菌YYS-K2可在乙醇浓度为24％的环境中生长的特性，本研究分析浓度在大于24％的乙醇环境中的耐受力，具体测试方法为：

将培养了24h的YYS-K2，离心后取菌体稀释至原液体积制成菌悬液，将1mL的菌悬液加入到含有不同浓度乙醇的生理盐水中，制备成含有菌YYS-K2的终浓度为25-45％乙醇的菌悬液，37℃静置2h，分别取1mL的处理样品加入0.1mL的P I稀释液(P I即指碘化丙啶染液)，于37℃染色10mi n。采用流式细胞仪测定细菌总数P1和死菌数P2，其中，菌存活率％＝(P1-P2)/P1。

(2)采用上述方法对菌存活率进行测试，以表征菌在乙醇中的耐受力，耐受力测试结果详见表3；

结论：测试结果表明菌YYS-K2在乙醇浓度为25-40％的生理盐水胁迫环境中的静置2h后，菌的存活率为26.23-12.21(％)之间，在乙醇浓度高达45％的生理盐水环境中，菌的存活率仍可保持在8.32％左右；表明菌YYS-K2具有良好的乙醇耐受能力。

表3YYS-K2在高浓度乙醇胁迫环境中的耐受力

实施例5发酵粘液乳杆菌YYS-K2对乙醇的降解率

(1)分析菌YYS-K2在不同乙醇浓度中的降解率，具体降解率测试方法为：

将培养了24h的YYS-K2发酵菌液，按照5％的接种量接种于含有不同浓度乙醇的200mL的MRS培养基中，以未接菌的同样乙醇浓度的MRS培养基为对照组，于37℃静置发酵24h，获得各待测样品。

按照国标GB/T 15038-2006测定待测定样品的乙醇含量，具体为：

取各待测样品100mL于500mL的含有少量玻璃珠蒸馏瓶中，加入100mL的纯净水，采用全玻璃蒸馏器蒸馏样品并收集蒸馏液至约100mL，将蒸馏液于20℃水浴锅中稳定30mi n，采用酒精计测试蒸馏液酒精度和温度，通过酒精计温度浓度换算表计算出各处理的实际酒精含量；

乙醇降解率的计算公式为：

乙醇降解率/％＝(对照乙醇含量-发酵后乙醇含量)×100％/对照乙醇含量。

其中，对照乙醇含量为：未接菌的对照组的待测样品测得的乙醇含量。

发酵后乙醇含量为：菌YYS-K2按照5％的接种量接种于含有不同浓度乙醇的200mL的MRS培养基中发酵所获得的待测样品，其测得乙醇含量。

(2)测试得到的YYS-K2对乙醇的降解率见下表4，根据数据可知：

在乙醇含量为4％、8％和16％(v/v)时，YYS-K2对乙醇的降解率为分别为74.28％，52.90％和29.21％，表明YYS-K2对乙醇有良好的降解作用。

表4 YYS-K2对乙醇的降解作用分析

乙醇含量/％	4	8	16
				乙醇降解率％	74.28±1.54	52.90±0.97	29.21±3.97

实施例6发酵粘液乳杆菌YYS-K2产乙醇脱氢酶能力

(1)具体菌YYS-K2产乙醇脱氢酶能力的测试方法为：

将YYS-K2于MRS液体培养基中发酵培养24h，取发酵液50mL，5500rpm/min离心10min，取上清液待测；

同时另取5mL的上清液原液，加入5mL的pH为2.5的人工胃液中混匀，迅速取1mL的混合液作为处理0h对照组测定ADH酶，其余混合液置于37℃水浴锅中，分别于1h和2h取样1mL，获得胃液环境处理上清液液，用于测定ADH酶，每一处理重复三次。

其中，ADH酶检测采用乙醇脱氢酶(ADH)活性检测试剂盒(Solarbio LifeSciences)进行，方法参照试剂盒说明书，具体操作如下：

空白对照管：在96微孔板(UV板)中依次加入20ul ddH₂O，8ul试剂二，152u l试剂一，20u l试剂三，加入同一个微孔板后迅速混匀于340nm测定吸光值，分别记录15s和75s时的吸光值，分别记为A1和A2,Δ空白管＝A1-A2(空白管只做1-2个)；

测定管：在96微孔板(UV板)中依次加入20u l样品上清液，8u l试剂二，152u l试剂一，20u l试剂三，加入同一个微孔板后迅速混匀于340nm测定吸光值，分别记录15s和75s时的吸光值，分别记为A3和A4；

其中，Δ空白管＝A3-A4；上清液ADH(U/mL)＝2.68×(ΔA测定管-ΔA空白管)。胃液处理后的ADH(U/mL)＝2.68×(ΔA测定管-ΔA空白管)×上清液稀释倍数(本实验的稀释倍数为2)。

(2)YYS-K2发酵上清液及上清液胃液处理液的ADH酶测试结果详见表5，通过测试结果可知：每1mL的YYS-K2发酵上清液每1mi n产生的ADH酶为0.121U/mL，在pH值为2.5的胃液环境中处理1h和2h后，酶活力与0h相比，无显著差异(P≤0.05)，表明YYS-K2不仅产较高的ADH酶，其产生的ADH酶活性具有良好的胃液耐受力。

表5菌YYS-K2产乙醇脱氢酶能力

实施例7发酵粘液乳杆菌YYS-K2对OH和DPPH自由基清除能力及还原力测试

(1)OH和DPPH自由基清除能力及还原力测试方法具体为：

YYS-K2菌悬液待测样品制备：将培养24h后的发酵粘液乳杆菌YYS-K2发酵液4500r/mi n、4℃条件下离心10mi n，倒掉上清液取沉淀用质量分数为0.85％的生理盐水清洗2次后重悬，调整菌悬液密度OD_600nm为1.0左右(菌个数为3.0×10⁸cfu/mL)，获得菌悬液待测样品；

1)OH自由基清除能力测定：

将1mL的1,10-菲罗啉溶液(2.5mmo l/L)、1mL的PBS(pH7.4)和0.5mL待测菌液混合均匀，随后加入1mL的FeSO₄溶液(2.5mmo l/L)和0.5mL的H₂O₂溶液(20mmo l/L)，37℃水浴1h，检测其在536nm处OD值。

其中，OH自由基清除率的计算公式为：

OH自由基清除率/％＝(A_实验-A_对照)/(A_空白-A_对照)×100％；

其中，A_对照为等体积PBS溶液代替样品的吸光值；A_空白为等体积PBS代替H₂O₂溶液吸光值，A_实验为待测菌液样品测得的吸光值。

2)2,2-联苯基-1-苦基肼基(DPPH)自由基清除能力实验：

分别取以上菌悬液待测样品2mL，加入2mL的含有0.2mmoL/L DPPH无水乙醇溶液中混匀，室温避光反应30mi n，8000r/mi n离心10分钟，在517nm处测OD值；

DPPH自由基清除率的计算公式如下：

DPPH自由基清除率(％)＝[1-(A₁-A₂)/A₀]×100％；

其中A₁为实验组吸光值，A₀为等体积无水乙醇替代样品组吸光值，A₂为等体积无水乙醇替代DPPH无水乙醇溶液吸光值。

3)还原能力测定：

取YYS-K2菌悬液待测样品将0.5mL 1％的铁氰化钾、0.5mL PBS缓冲液(pH6.6)和0.5mL样液混合后，50℃水浴20mi n后，将混合液体极速冷却；随后加入0.5mL 10％三氯乙酸，4000r/mi n离心10mi n，取待测样品1mL，加入1mL超纯水和1mL 0.1％三氯化铁溶液，震荡混合均匀，常温放置10mi n后，测700nm处OD值。

还原能力的计算公式如下：

还原能力/％＝(A₁-A₀)/A₁×100％；

其中，A₁为样品组吸光度值；A₀为PBS缓冲液代替样品的吸光度值。

(2)上述OH自由基清除能力、DPPH自由基清除率、还原率的测试结果详见表6，根据测试结果可知：

YYS-K2菌悬液对OH自由基清除率为47.46％,表明发酵粘液乳杆菌YYS-K2有显著的OH自由基清除能力。

YYS-K2菌悬液对DPPH自由基清除率为16.90％，表明发酵粘液乳杆菌YYS-K2对DPPH自由基有一定的清除能力。

YYS-K2菌悬液的还原率为15.46％，表明发酵粘液乳杆菌YYS-K2具有一定的还原能力。

表6发酵粘液乳杆菌YYS-K2对自由基清除能力

样品	OH自由基清除率/％	DPPH自由基清除率/％	还原力/％
				YYS-K2菌悬液	47.46±3.37	16.90±2.98	15.46±1.35

实施例8：发酵粘液乳杆菌YYS-K2对α-淀粉酶的抑制作用

(1)α-淀粉酶的抑制作用测试方法为：

制备YYS-K2菌悬液，具体为：将培养24h后的发酵粘液乳杆菌YYS-K24000r/min、4℃条件下离心10min，倒掉上清液取沉淀用质量分数为0.85％的生理盐水清洗2次后重悬，调整菌悬液密度OD为分别为1.5和1.0(菌个数分别为6.7和3.0×10⁸cfu/mL)，获得菌悬液待测样品。

α-淀粉酶抑制测试：向酶标板中滴加100uL的0.6mg/mL的α-淀粉酶PBS溶液，L加入待测样液100uL在37℃反应30分钟，向体系中滴加淀粉溶液100uL,再在37℃下反应15分钟。最后滴加稀碘液5uL，在酶标仪上测660nm处的OD值；

α-淀粉酶抑制率的计算公式为：

α-淀粉酶抑制率/％＝[(B-C)-(B-A)]/(B-C)×100％；

其中A为实验组，B为不含α-淀粉酶样品空白组，C为不含测试样品对照组。

(2)测试结果如下表7，可知：在OD_600nm值为1.5和1.0时对α-淀粉酶的抑制率分别为68.54％和41.82％，表明YYS-K2菌悬液对α-淀粉酶有良好的抑制作用。

表7 YYS-K2对α-淀粉酶的抑制作用

实施例9发酵粘液乳杆菌YYS-K2在模拟人工模拟胃液环境及含有乙醇的胃液环境中的存活率分析

(1)存活率测试过程为：

取发酵24h的菌YYS-K2，5500r/min离心10min收集菌体，加入同体积的生理盐水(0.85％)混匀备用；

配制人工胃液(125mM NaCl，7mM KCl,45mM NaHCO₃和3g/L pepsin)，调pH值至2.0、2.5、3.0，经0.22μM微孔滤膜过滤后备用；取1mL的处理样品于9mL的pH值为2.75的人工胃液中，置于37℃恒温培养，在处理1、2、3、5h取样，每次取0.9mL，加入0.1mL PI(PI即指碘化丙啶染液)，37℃染色10min，取0.1ml于0.9mL的超纯水中，流式细胞仪检测细菌总数P1/％和死亡数P2/％，并计算细菌存活率；

细菌存活率的计算公式为：

细菌存活率/％＝(P1/％-P2/％)/P1/％。

(2)菌YYS-K2在不同胃液环境中的存活率见下表8，根据数据可知：

菌YYS-K2在胃液2.0的pH环境中可存活1h，存活率为91.31％；在pH值为2.5的模拟胃液环境中处理1-5h时，YYS-K2的存活率为82.71-93.94％，在pH值为3.0的模拟胃液环境中处理1-5h时，YYS-K2的存活率为86.78-95.41％，表明YYS-K2在人工模拟胃液环境中有很强的耐受能力，这为其在胃液环境中降解乙醇提供了良好的基础。

表8YYS-K2在人工模拟胃液环境中的存活率/％

实施例10发酵粘液乳杆菌YYS-K2在含有乙醇的胃液环境中的存活率分析

(2)在含有乙醇的胃液环境中的存活率测试过程：

配置人工胃液+乙醇环境(人工胃液调pH值2.5+不同浓度乙醇)，取1mL的处理的菌液于9mL的pH值为2.75的人工胃液中，置于37℃恒温培养，在处理1、2、3、4h取样，每次取0.9mL，加入0.1mL P I，37℃染色10mi n，取0.1m l于0.9mL的超纯水中，流式细胞仪检测细菌总数P1/％和死亡数P2/％，计算细菌存活率；

细菌存活率的计算公式为：

细菌存活率/％＝(P1/％-P2/％)/P1/％。

菌YYS-K2在人工模拟胃液(pH＝2.75)+乙醇环境中的存活率数据见表9，根据数据可知：

菌YYS-K2在乙醇含量为5％的胃液中，处理1-4h时：YYS-K2的存活率为77.73-87.01％，存活率极高；在乙醇浓度为10％的胃液环境中处理1h和2h时，存活率分别为81.81％和29.24％，存活效果极佳。

表9YYS-K2在人工模拟胃液(pH＝2.5)+乙醇环境中的存活率/％

实施例11发酵粘液乳杆菌YYS-K2在模拟人工胰液环境中的生存能力分析

(1)取发酵24h的菌YYS-K2，8000r/mi n离心5mi n收集菌体，加入同体积的生理盐水(0.85％)混匀备用；配制蛋白胰液(0.1％胰液素w/v，0.15％牛胆汁)，分别调pH值至7.5和8.0，经0.22μM微孔滤膜过滤后备用，取1mL的处理的菌液于9mL的不同pH值的蛋白胰液中，置于37℃恒温培养，在处理3、6(h)取样，每次取0.9mL，加入0.1ml PI稀释液，37℃染色10mi n，流式细胞仪检测细菌总数P1/％和死亡率P2/％，计算细菌存活率；

细菌存活率的计算公式为：

细菌存活率/％＝P1/％-P2/％。

(2)菌YYS-K2的细菌存活率结果见表10，根据数据可知：

菌YYS-K2在pH为7.5的胰液环境中处理3和6(h)时，存活率大于99％，表明其不受7.5胰液环境胁迫的影响；在pH为8.0的胰液环境中存活率为51.28-58.12％，具有良好的胰液耐受能力。

表10YYS-K2在人工模拟胰液环境中的存活率/％

本发明还提供以下发酵粘液乳杆菌YYS-K2的应用示例：

实施例12发酵粘液乳杆菌YYS-K2制备益生菌剂

将发酵粘液乳杆菌YYS-K2接种于培养基，例如MRS培养基0-38℃培养大于15h，离心收集菌体细胞，重悬于例如生理盐水或PBS缓冲液中，制备获得含发酵粘液乳杆菌YYS-K2的液体菌制剂。可选地，将发酵粘液乳杆菌YYS-K2菌体细胞重悬于细胞保护剂和载体中，冷冻干燥获得含发酵粘液乳杆菌YYS-K2的固体菌粉制剂。

可选地，可将发酵粘液乳杆菌YYS-K2作为原料组分应用于解酒产品、抗氧化类产品、减肥(抑制α-淀粉酶酶)产品(例如食品和保健品)中，发酵粘液乳杆菌YYS-K2可以以液体或固体制剂的形式存在于所述产品中；进一步地，发酵粘液乳杆菌YYS-K2可作为原料组分与食品或保健食品中常用的解酒食品、抗氧化类食品、减肥食品物质配伍食用，以制备食品、保健食品或药物。

实施例13发酵粘液乳杆菌YYS-K2制备发酵食品

制备发酵粘液乳杆菌YYS-K2发酵母液，以各种水果、中草药、谷物原料，各种糖类为辅料，接种发酵粘液乳杆菌YYS-K2，在一定的温度条件下(30-38℃)发酵一定的时间，制备发酵物，发酵物灭活或未灭活处理，原液或不同比例稀释后，加入常用饮料辅料，制备成发酵食品。

根据上述实施例的结果得出，本发明提供的发酵粘液乳杆菌YYS-K2具有以下性能和效果：

a.可利用纤维二糖、麦芽糖、水杨苷、蔗糖、乳糖等碳源物质。

b.在pH为2.0的胃液环境中存活1h，存活率高达91.31(％)，在pH值为2.5-3.0的人工模拟胃液环境中可至少存活5h，存活率在82.71-95.41(％)之间。

c.在含有5％(v/v)乙醇的胃液环境中处理0-4h，存活率在77.73-87.01(％)之间，在10％(v/v)乙醇的胃液环境中处理0-2h，存活率在29.24-81.81％之间。

d.在pH为7.5的胰液环境中处理6h，存活率高达99.81％，在pH为8.0胰液环境中处理6h，存活率均大于51％。

e.可在乙醇浓度高达24％(v/v)的MRS培养基胁迫环境中实现正生长，发酵36h后，菌OD_600nm值大于0.5。

f.可在乙醇浓度高达25-45(％)(v/v)的胁迫环境中存活2h，存活率为8.32-26.23(％)。

g.可产ADH酶，该ADH酶在胃液环境中处理0-2h时，其酶活性不受胃液环境的影响。

h.具有良好的乙醇降解能力，可显著抑制α-淀粉酶活性，具有显著的OH和DPPH自由基清除能力，具有良好的还原能力。

i.菌YYS-K2从日常食物中分离获得，食用安全性高，能够作为减肥、抗氧化、解酒产品应用于普通食品、保健食品和药品中，具有广泛的应用前景。

综上所述，与现有技术相比，本发明提供的发酵粘液乳杆菌YYS-K2，具有以下有益效果：

该发酵粘液乳杆菌YYS-K2可产乙醇脱氢酶(ADH)，具有良好的乙醇耐受力和降解能力，可在高浓度乙醇培养基中生长，同时该菌对α-淀粉酶抑制有显著的抑制作用，具有显著的OH和DPPH自由基清除能力，具有良好的还原能力，该菌为在功能性产品的开发提供新的益生菌源，具有重要的应用价值，例如：

(1)发酵粘液乳杆菌YYS-K2可作为组合物的原料组分，制备具有上述功能的组合物；其中，组合物包括但不限于微生物制剂、食品、保健品或药物等。

其中，菌种存在于组合物中的形式，包括但不限于发酵粘液乳杆菌YYS-K2未灭活菌、发酵粘液乳杆菌YYS-K2灭活菌、发酵粘液乳杆菌YYS-K2菌株的代谢物、发酵粘液乳杆菌YYS-K2冻干株中的一种或多种组合形式。优选地，在所述组合物中，所述发酵粘液乳杆菌YYS-K2的数量≥1×10⁶CFU/mL或≥1×10⁶CFU/g。进一步优选地，所述发酵粘液乳杆菌YYS-K2的数量≥1×10⁸CFU/mL或≥1×10⁸CFU/g。

(2)可以以各种植物(例如水果、中草药、谷物等)为原料，与各种配料配合，接种发酵粘液乳杆菌YYS-K2进行发酵处理制备发酵物，该发酵物可应用于制备具有解酒、抗氧化或减肥功能的产品中；

其中，发酵原料可以是常规使用的各类植物发酵原料，辅料也可采用现有常规辅料，包括但不限于上述方案选择。所述发酵物但不限于用于制备发酵食品，还可以是保健品、药品等产品；

综上，发酵粘液乳杆菌YYS-K2和/或其发酵物根据其特性，可应用于包括至少以下一种功能的功能产品中：

(1)具备显著的降低乙醇水平；

(2)产ADH酶；

(3)显著的清除自由基DPPH水平；

(4)显著的清除OH自由基水平；

(5)具备显著的还原能力；

(6)具备显著的抑制α-淀粉酶酶活性水平。

其中，具备上述(1)-(6)功能的产品包括但不限于解酒产品、抗氧化产品以及减肥(抑制α-淀粉酶)功能产品，具有解酒、抗氧化、减肥等显向功效；还可以是具有基于(1)-(6)的功能产生的其他显向功效的产品；其中，所述功能产品包括但不限于食品、保健品或药品。

需要说明的是：

(1)定义：

本文中所使用的术语食品”一词是广义的，包括人类的食物和饮物。在某些实施方案中，所述食物产品适合于以及设计用于人类进食。本申请可用于制备粉剂、片剂等固体制剂，也分散于液体中制成液体制剂等适用于人类口服的制剂，包括但不限于粉体。

所述组合物包括但不限于微生物制剂、食品、保健品、药品，所述含有发酵粘液乳杆菌YYS-K2的组合物可用于其他形式的产品中。

所述发酵粘液乳杆菌YYS-K2在组合物中的存在形式包括但不限于未灭活菌、灭活菌、代谢物、冻干株等形式，预期所述发酵粘液乳杆菌YYS-K2还可以采用其他形式存在于组合物中。

所述功能产品包括上述降解乙醇、产ADH酶、清除自由基DPPH、清除OH自由基、具备还原能力、抑制α-淀粉酶酶活性等作用，根据上述作用，其应用到功能产品的显向功效为解酒、抗氧化以及减肥；由于其具有上述降解乙醇、产ADH酶、清除自由基DPPH、清除OH自由基、具备还原能力、抑制α-淀粉酶酶活性等作用，其应用产品的功效包括但不限于为解酒、抗氧化以及减肥，其他的通过上述作用所可以起到的对人体的功效均可。

(2)本申请涉及的相关现有技术手段或现有技术术语：

“OD”值是optical density(光密度)的缩写，又称吸光度，光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量存在定量关系，可以用这种定量关系测定被测物浓度。“OD_x”是将波长设定为Xnm时测定的光密度值，是追踪液体培养物中微生物密度的标准指标，通常用来指示菌体细胞密度。其中，“OD”值测定方法为现有技术，其原理和方法此处不再累述。

“DPPH”为自由基2，2-联苯基-1-苦基肼基，“OH”为自由基羟基。

采用流式细胞仪测定细菌总数P1和死菌数P2为现有技术，其原理和方法此处不再累述。

采用酒精计测试蒸馏液酒精度和温度，通过酒精计温度浓度换算表计算出各处理的实际酒精含量的方法，此为现有技术，，其原理和方法此处不再累述。

采用HBI乳酸菌生化鉴定条进行碳源利用分析，此为现有技术，其原理和方法此处不再累述。

(3)实施例中所使用的各培养基的配方如下：

MRS培养基(g/L)：酪蛋白胨10、牛肉提取物10、酵母提取物5、葡萄糖5、醋酸钠5、K2HPO4 2、柠檬酸二铵2、MgSO₄.7H₂O 0.2、MnSO₄.H₂O 0.05、吐温80 1；pH 6.2，固体培养基在以上基础上加2％琼脂和2％CaCO₃、121℃灭菌15min。

X％浓度的乙醇的MRS培养基：将上述MRS培养基灭菌后，按照体积比例加入不同量的乙醇,其中，X％指代MRS培养基中的乙醇浓度值。

如未明确指出，本发明实施例中涉及的实验操作方法为本领域常规的实验操作方法，涉及的试剂或仪器均可从正规渠道商购获得。

另外，本领域技术人员应当理解，尽管现有技术中存在许多问题，但是，本发明的每个实施例或技术方案可以仅在一个或几个方面进行改进，而不必同时解决现有技术中或者背景技术中列出的全部技术问题。本领域技术人员应当理解，对于一个权利要求中没有提到的内容不应当作为对于该权利要求的限制。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种发酵粘液乳杆菌YYS-K2，其特征在于：其保藏编号为CGMCC No.27129。

2.组合物，其特征在于：含有如权利要求1所述的发酵粘液乳杆菌YYS-K2。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于：所述组合物包括微生物制剂、食品、保健品、药物中的一种。

4.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于：所述组合物中包含发酵粘液乳杆菌YYS-K2未灭活菌、发酵粘液乳杆菌YYS-K2灭活菌、发酵粘液乳杆菌YYS-K2菌株的代谢物、发酵粘液乳杆菌YYS-K2冻干株中的一种或多种组合。

5.发酵物，其特征在于：其为如权利要求1所述的发酵粘液乳杆菌YYS-K2发酵获得。

6.发酵粘液乳杆菌YYS-K2和/或其发酵物在制备功能产品中的应用，其特征在于：所述发酵粘液乳杆菌YYS-K2采用如权利要求1所述的发酵粘液乳杆菌YYS-K2。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述功能产品包括食品、保健品或药品。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述功能产品包括至少以下一种功能：

(1)降解乙醇；

(2)产ADH酶；

(3)清除自由基DPPH；

(4)清除OH自由基；

(5)具备还原能力；

(6)抑制α-淀粉酶酶活性。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述功能产品包括解酒产品、抗氧化产品以及减肥功能产品。

10.如权利要求1所述的发酵粘液乳杆菌YYS-K2或如权利要求2-4任一项所述的组合物在制备发酵食品中的应用。