KR0180237B1 - B형 간염 표면항원 용액으로부터 엔도톡신의 제거방법 - Google Patents

B형 간염 표면항원 용액으로부터 엔도톡신의 제거방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 제조합 효모로부터 정제된 B형간염 표면항원 용액을 킬레이트 화제와 계면활성제로 처리하여 반응시킨 다음, 이를 고분자막을 이용하여 여과한 후 그 잔류액을 pH 9.6 인산 일수소나트륨 용액으로 투석여과하여 킬레이트화제 및 계면활성제를 제거함을 특징으로 하는 B형 간염 표면항원 또는 B형 간염 전표면항원으로부터 엔도톡신을 제거하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 벙법은 분리하고자 하는 단백질 간의 분자량 차이가 크지 않은 본 발명의 분야에서 사용되기에 적합하며 크로마토그라피법에 비해 취급이 용이하고, 추가의 정제과정 없이 B형 간염 표면항원 또는 B형 간염 전표면항원을 바로 주사제로 사용할 수 있는 장점이 있다.

Description

B형 간염 표면항원 용액으로부터 엔도톡신의 제거방법
본 발명은 B형 간염 표면항원(HBsAg)용액으로부터 엔도톡신을 제거하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 재조합 효모로부터 정제된 B형 간염 표면항원 용액에 존재하는 엔도톡신을 킬레이트화제와 계면활성제로 처리하고 이를 고분자막으로 여과하여 분리제거하는 방법에 관한 것이다.
재조합 효모로부터 얻은 B형 간염 표면항원과 B형 간염 전표면항원(Pre S2HBV)은 단량체들이 발현된 후 응집체를 이룬 것으로 본자량이 200만 내지 300만이고 정제과정에서 혼입되는 엔도톡신은 지질이 붙은 다당류(LPS)가 주성분인 양성(兩性)물질로서, 두겹구조 또는 비시클을 이루며 분자량은 100만 이상이다.
유럽특허 제 135,435호는 재조합 단백질로부터 엔도톡신을 제거하는 방법에 관하여 기술하고 있다. 이 방법에 따르면 부틸세파로즈 크로마토그라피에 의해서 HBsAg를 정제할 경우 95%이상의 엔도톡신이 제거된다고 개시하고 있으나 엔도톡신 제거율 95%정도로는 최종 주사용액으로 사용할 수 없으므로 보다 정밀한 추가의 정제과정이 필요하다.
한편, 단량체인 인 성장호르몬, 알파 인터페론 등의 제조합 단백질과 고분자인 엔도톡신을 분자량의 차이에 따른 젤 여과 크로마토그라피에 의해 분리하는 정제기술도 개발되어 있는데 공지의 젤 여과 크로마토그라피법은 생물활성 단백질과 엔도톡신과의 분자량 차이가 큰 경우에는 적합하나 크로마토그라피법이 가지는 일반적인 불편함 이외에도 본 발명의 B형 간염 표면항원의 경우와 같이 구성단백질의 분자량의 차이가 크지 않은 경우에 적용할 수 있도록 하는 대책이 마련되어 있지 않은 문제점이 있다.
이에 본 발명자들은 전술한 크로마토그라피를 사용한 종래의 엔도톡신 제거방법들이 B형 간염 표면항원이나 B형 간염 전표면항원 용액에서 엔도톡신을 제거하기에는 부적합하다는 것을 발견하고 이들의 문제점들에 대하여 예의 연구한 결과, 지질이 붙은 다당류가 킬레이트화제 존재하에서는 분자량이 30만 내지 100만 사이인 마이셀을 형성하고, 계면활성제에 의해서는 분자량이 2만이하로 된다는 점을 발견하고 이점에 착안하여, 항원 용액을 킬레이트화제 및 계면활성제로 처리한 후 고분자막을 이용하여 엔도톡신과 B형 간염 표면항원 또는 엔도톡신과 B형 간염 전표면항원을 분리함으로써 엔도톡신을 제거하는 방법을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 재조합 효모로부터 정제된 B형 간염 표면항원 용액에 혼입된 엔도톡신을 제거함에 있어서, 이 용액을 킬레이트화제와 계면활성제로 처리하여 반응시킨 다음, 이를 고분자막을 이용하여 여과한 후 킬레이트화제와 계면활성제를 투석여과함을 특징으로 하는 B형 간염 표면항원 또는 B형 간염 전표면항원으로부터 엔도톡신을 분리제거하는 방법을 제공하는 것으로, 저분자화 과정을 거쳐 고분자막을 이용하여 엔도톡신을 분리함을 특징으로 하는 본 발명의 방법은 분리하고자 하는 단백질 간의 분자량 차이가 크지 않은 본 발명의 방법은 분리하고자 하는 단백질 간의 분자량 차이가 크지 않은 본 발명의 분야에서 사용되기에 적합하며 크로마토그라피법에 비해 취급이 용이하고 엔도톡신 제거율이 99% 이상으로서 추가의 정제과정 없이 바로 주사제로 사용할 수 있는 장점이 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 재조합 효모로부터 정제된 B형 간염 표면항원 용액을 킬레이트 화제와 계면활성제로 처리하여 반응시킨 다음, 이를 고분자막을 이용하여 여과하고 그 잔류액을 pH 9.6 인산 일수소나트륨 용액으로 투석여과하여 킬레이트화제 및 계면활성제를 제거함을 특징으로 하는 B형 간염 표면항원 또는 B형 간염 전표면항원으로부터 엔도톡신을 제거하는 방법이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 재조합 효모로부터 정제된 B형 간염 표면항원 용액을 킬레이트화제 및 계면활성제로 처리하여 반응시킨 후, 이 혼합 용액을 적당한 분자량 차단계수를 갖는 고분자막을 이용하여 질소압력하에서 투석여과시키면 HBsAg 또는 Pre S2HBV는 통과하지 못하는 반면, 엔도톡신은 여과막을 통과하여 여과액에 남게 되므로 HBsAg 또는 Pre S2HBV로부터 엔도톡신은 분리 제거되고 이어서, 이 잔류액에 함유되어 있는 킬레이트화제 및 계면활성제는 알칼리성 pH의 인산염 용액으로 투석여과하여 제거함으로써 달성된다.
본 발명에서 사용가능한 킬레이트화제는 EDTA, EGTA (Ethylene Glycolb-isℓ[Oxyethylene-Nitriel] Tetra Acetic acid)등이며, 바람직하기로는 EDTA를 1~10mM의 농도로 사용하는 것이다.
본 발명에서 사용할 수 있는 계면활성제로는 소디움 데옥시콜레이트(SDC), 소디움 도데실 설페이트(SDS), 데옥시콜레이트, 소디움 콜레이트 또는 콜레이트가 있는데, 바람직하기로는 담즙염의 일종인 SDC를 0.5~2%(w/v)로 사용하는 것이다.
또한, 고분자막은 분자량 차단계수가 10만 내지 30만인 한외여과막을 이용하는 것이 좋으며, 인산염 용액은 pH 9~10의 인산 일수소나트륨 용액이 적당하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
[실시예]
재조합 효모에서 얻은 B형 간염 표면항원 용액을 5mM EDTA와 1%(w/v) SDC로 처리하고 4℃에서 20시간 교반시켜서 엔도톡신을 저분자형태로 만든 후 한외여과 장치(사용막: YM100, Amicon 사 제품)을 이용하여 pH가 9.6인 5mM EDTA와 1%(w/v) SDC의 혼합액으로 10배씩 희석하여 5회 투석여과 한다.
잔류액을 pH 9.6인 10mM 인산 일수소나트륨 용액으로 잔류액의 10배로 희석하여 3회 투석여과하고 이 잔류액을 145mM의 염화나트륨이 함유된 10mM pH 7.4 인산 완충용액으로 10배로 희석하여 3회 투석여과한 다음, 잔류액을 라이뮬러스 아메보사이트 라이세이트(Limulus Amebocyte Lysate (LAL), Associaties of Cape Cod 사) 시험으로 분석하여 아래표와 같은 결과를 얻었다.

Claims (6)

  1. 재조합 효모로부터 정제된 B형 간염 표면항원 용액을 킬레이트화제와 계면활성제로 처리하여 반응시킨 다음, 이를 고분자막을 이용하여 여과하고, 잔류액을 알칼리성 pH의 인산염 용액으로 투석여과하여 킬레이트화제 및 계면활성제를 제거함을 특징으로 하는 B형 간염 표면항원 또는 B형 간염 전표면항원으로부터 엔도톡신을 제거하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 킬레이트화제는 EDTA 또는 EGTA임을 특징으로 하는 B형 간염 표면항원 또는 B형 간염 전표면항원으로부터 엔도톡신을 제거하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 계면활성제는 SDC, SDS, 데옥시콜레이트, 소디움 콜레이트와 콜레이트 중에서 선택됨을 특징으로 하는 B형 간염 표면항원 또는 B형 간염 전표면항원으로부터 엔도톡신을 제거하는 방법.
  4. 제1항 내지 제 3항에 있어서, 상기 킬레이트화제는 1mM~10mM 농도의 EDTA이고, 상기 계면활성제는 0.5~2%(w/v) 농도의 SDC임을 특징으로 하는 B형 간염 표면항원 또는 B형 간염 전표면항원으로부터 엔도톡신을 제거하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 고분자막은 분자량 차단계수가 10만 내지 30만인 한외여피막임을 특징으로 하는 B형 간염 표면항원 또는 B형 간염 전표면항원으로부터 엔도톡신을 제거하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 인산염 용액이 pH 9 내지 10인 인산 일수소나트륨 용액인 것을 특징으로 하는 B형 간염 표면항원 또는 B형 간염 전표면항원으로부터 엔도톡신을 제거하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR100356738B1 (ko) * 2000-09-07 2002-10-18 주식회사 삼양제넥스 염기성 단백질로부터 엔도톡신을 제거하는 방법

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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