JPS63132899A - 因子８含有分画の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 匡泉よΔ■里江匪 本発明は、少なくともタンパク質１ｙｔｇあたり因子■
（ＡＩ（Ｆ）２．５単位の比活性、ならびに多くても因
子■１０００単位あたり免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）１
（１１１ｇの割合を有し、治療または予防に用いたとき
のウィルスまたは細菌感染の危険が避けられているか、
またはそのほとんどが減じられている、因子■含有分画
の製造方法に関する。

従来技術 因子■濃縮物を製造するための多数の方法が、既に文献
で知られている。これらの方法は分画手段として、血漿
をエタノール、エーテル、ポリエチレングリコールおよ
び／またはグリシンで処理することを含んでいる。また
、プール［Ｐｏｏｌ、　ＴｈｅＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ
　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２７３．
１４４３（１９６５）］の血漿の冷凍沈澱法またはグロ
ブリン［Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｃｏｎｇｒ、Ｉｎｔ、Ｓｏ
ｃ、Ｂｌｏｏｄ　Ｔｒａｎｓｆ、、シトニー、オースト
ラリア、論文抄録集、１１０９頁（１９６６）］の血漿
の冷凍エタノール沈澱法も知られている。

さらに、米国特許Ｎｏ、３．９７３，００２には、餌漿
から得られた冷凍沈澱物を浸軟し、この浸軟物をクエン
酸塩−グルコース緩衝溶液中に懸濁し、遠心し、そして
こうして得られた緩衝液抽出物をｐ）（６，０〜６．８
に調節する方法が記載されている。

これらの条件下で、望ましくない不純物の沈澱が起こり
、そうした上で、残りの因子ＶＩＩＩを含有している残
留物を滅菌し、凍結乾燥する。しかし、この方法によっ
て得られる因子■生成物は、因子■単位数／巧タンパク
質で表すとわずかな比活性を示すにすぎない。さらに、
因子■単位数あたりの免疫グロブリンＧ（ｒｇＧ）の割
合が高く、望ましいものではない。

同様の方法が、英国特許Ｎｏ、　１，５５１，９２８、
ならびに米国特許Ｎｏ、４，１７０，６３９およびＮｏ
、４，１０４，２６６に記載されている。ここでも同様
に、ば［１漿から始めて凍結沈澱物を回収し、これを中
性の吐■範囲の緩衝液に溶解して望ましくないタンパク
質を分離し、上清を水酸化アルミニウムで処理してプロ
トロンビン複合体を分離し、次いで因子■含有溶液を濃
縮し、凍結乾燥している。この方法を用いたときでも、
因子■単位数／巧タンパク質で表される比活性は低く、
望ましいものではない。すなわち、米国特許Ｎｏ、４，
１０４，２６６に従って処理したときの比活性は、これ
に記載されているように、０．５〜０．６単位／Ｒ９タ
ンパク質を越えることはない。

ＰＣＴ公開Ｗ０８２１０４３９５により、因子■複合体
を精製し、濃縮する方法が知られているが、ここでは、
調製物をグリシン溶液で処理し、その上清を塩溶液で沈
澱させている。

本出願人の米国特許Ｎｏ、４，５２２，７５１には、向
上した比活性（少なくとも１．５単位の因子■／Ｒｇタ
ンパク質）を有する因子■（ＡＨＩ？’）含有調製物の
製造方法が記載されているが、ここでは、望ましくない
タンパク質の沈澱を、硫酸処理した多糖の存在下、中性
の範囲で行ない、アルコール沈澱によって上清から因子
■濃縮物を回収している。

最近行なわれた試験［Ｖｏｘ　Ｓａｎｇ、、４９：３１
９−３２２（１９８５）］により、因子■濃縮物中のＩ
ｇＧ複合体が、血友病患者におけるＴヘルパー／Ｔザブ
レッザー細胞比の変化ならびにリンパ球異當などの望ま
しくない反応を誘導することがわかった。

記載されている方法によると、望ましくない高含有量の
ｒｇｃは別にしても、因子■活性か実質的に減少するこ
となく熱処理による不活性化に耐えるには熱安定性が十
分でない生成物が得られることがわかった。現在、血漿
から調製し、患者に大口投与する、ウィルスまたは細菌
感染の危険性のない凝固因子調製物を保有する必要性が
存在しているが、用いられている不活性化法は、通常６
０℃以上の温度で数時間処理することを含むものである
。この必要性は因子■調製物についても当てはまるが、
知られているように、この後者は他の凝固因子に比べ比
較的影響を受けやすく、不安定である。

発明の目的および構成 本発明の目的は、上記の問題を解決し、そして比活性を
少なくとも因子■２．５単位まで高め、免疫グロブリン
Ｇの割合をできるだけ低くした、因子■（ＡＨｒ’）含
有分画を製造するための方法を搗供することである。さ
らに、得られた調製物は、望ましくない方法で因子■の
活性を低下させることなく熱処理によって不活性化する
ことができるよう、熱的に安定なものであるべきである
。

本発明によれば、この目的は以下の手段を組み合わせる
ことによって達成される： ａ）硫酸処理した多糖類の存在下、ほぼ中性の範囲にあ
る吐Ｉで、因子ＶＩＩＩを含有する血漿分画の溶液から
望ましくないタンパク質を沈澱させ、分離すること； ｂ）このようにして精製した因子■含有溶液を、硫酸ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム−グリシン、塩化ナトリ
ウム−グリシン、硫酸ナトリウム、硫酸ナトリウム−ク
エン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム−クエン酸ナトリ
ウム、クエン酸塩−グリシンから選ばれるタンパク質沈
澱剤で処理して、因子■含有沈澱物を沈澱させること； Ｃ）この因子■含符沈澱物を溶解し、凍結乾燥すること
：および ｄ）おそらく存在しているであろうウィルスを不活性化
するに十分な時間および温度で、この凍結乾燥物を熱処
理すること。

上に示した塩類あるいは塩−アミノ酸の組み合わＵ・が
、タンパク質沈澱剤となること、および従来技術の欄に
示したように、凝固因子調製物の製造時に既に用いられ
ていることは自体知られている。

それでもなお、できるだけＩｇＧ含ｍの低いところで高
い因子■の比活性を示し、同時に十分熱的に安定な、こ
れまで知られていたらのより優れた生成物を回収しうろ
ことが本発明に係る組み合わせの利点である。

凍結乾燥物を、０．０５（５重量％）以上かつ０゜７０
（７０重量％）以下の水分ｎ１好ましくは０゜４０（４
０ｍｍ％）以下の水分量に調節し、密閉した容器中、５
０〜１２１’Ｃの温度範囲で、蒸気分圧上昇のもとで処
理するのめ（好ましい。

蒸気による凍結乾燥物の処理は、０．Ｏ１〜２バールの
圧力で１００時間以内行なうのが適当である。

繁殖性かつ濾過性病原体としては、特に肝炎ウィルスま
たはＨＩ　Ｖ　（ヒト免疫欠損ウィルス）を考慮に入れ
る。

好ましい態様では、タンパク質沈澱剤による因子■含有
溶液の沈澱は、５．６〜６．８のＩ）Ｈおよび１〜４０
℃の温度で行なう。

本発明方法の有用な態様は、以下の手段を組み合わせる
ことを特徴とする： ａ）所望によりヘパリン、ヘバリノイド、ヘパリンと抗
トロンビンＩＩＩの複合化合物［アテプレックス（Ａｔ
ｈｅｐｌｅｘ）］および／またはアプロチニンを含有す
るクエン酸緩衝液中、６．０〜６，４のｐＨおよび０〜
２５℃、好ましくは４〜８℃の温度で、凍結性澱物溶液
から望ましくないタンパク質を沈澱させ、分離すること
； ｂ）この精製した因子■含有上清を、８〜３５％の濃度
および５．６〜６．８のｐＨの、硫酸アンモニウム、硫
酸アンモニウム−グリシン、塩化ナトリウム−グリシン
、硫酸ナトリウム、硫酸ナトリウム−クエン酸ナトリウ
ム、硫酸アンモニウム−クエン酸ナトリウム、クエン酸
塩−グリシンを含有する溶液で処理して、因子■含有沈
澱物を沈澱させること； Ｃ）この因子■含有沈澱物を、抗トロンビン−ヘパリノ
イドまたは抗トロンビン−■−ヘパリノイド複合体、な
らびにアルブミンを含有する塩化ナトリウム−クエン酸
ナトリウム緩衝液に溶解し、限外濾過するか、または透
析し、凍結乾燥し、そして熱処理によって不活性化する
こと。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。

実施例！ 急速冷凍および再解凍により、血漿１６．５１２から凍
結沈澱物１５０ｇを回収した。これを、硫酸処理した多
糖ｒＳ　Ｐ　５４　Ｊ［ベネケミー（Ｂｅｎｅｃｈｅｍ
ｉｅ）１９０ＪＩ９、アナプレックス９単位ならびにア
プロチニン２７，０００単位を含有するクエン酸三ナト
リウム緩衝液９００ｘＱに溶解した。溶液のｌ）Ｈを６
．２５に、温度を４℃に調節して、望ましくないタンパ
ク質を沈澱させ、遠心して分離した。

この上清を、ｐＩ（６，０〜６．３および室温で攪拌し
ながら、ｔ２０９／ｆ２グリシンおよび８５９／Ｑ硫酸
アンモニウムの沈澱濃度になるまで、グリシンおよび硫
酸アンモニウムと徐々に混合した。

生成した沈澱を遠心して分離し、塩化ナトリウム−クエ
ン酸塩緩衝液に溶解し１．同じ緩衝液に対して透析した
。この透析物を、１０ｏ／ｍＱグリシンおよび２ｍ９／
ｍＱアルブミンの濃度となるまでグリシンおよびアルブ
ミンと混合し、この溶液を凍結乾燥した。得られた粉体
の凍結乾燥物の一部を水蒸気で８ｗ／ｖ％の水分量に調
節し、他の部分を２４〜２６ｗ／ｗ％の水分ｍに調節し
た。

これらの湿らせた調製物を、密閉した容器中、窒素雰囲
気下、６０または７０℃で１０〜１００時間熱処理にか
けて、存在しているであろうウィルスを不活性化した。

次いで、因子■の比活性を測定した。熱−不活性化を行
なわずに実施例１に従って得られた凍結乾燥物と比較し
て、結果を次第１表に示す。

寒り罠本発明による実施例１ 因子■、凍結乾燥物 熱処理面　　　　　　　５４．７　Ｕ／ｍＱ、　　１０
０％比活性　　　　　　　　４ＪＩＵ／ｉｇ因子■１，
０００単位 あたりのＩ　ｇＧ　ｍ　　　　　１．８　ｊ１９囚子■
、水分子ｆ１７．９％の凍結乾燥物６０℃で１０時間加
熱　　５３．６　Ｕ／！ＩＱ　　ｇｇ％６０℃で７０時
間加熱　　４２．５　Ｕ／戚　７８％６０℃で１００時
間加熱　　４０．ＯＵ／ｚ１２　７３％７０℃で１０時
間加熱　　４３．３　Ｕ／ＲＱ　　７９％囚子■、水分
子１２５．２％の凍結乾燥物６０℃で１０時間加熱　　
４５．ＯＵ／１８２％実施例２ 本発明に従って得られた調製物が、熱安定性に関して、
既知の調製物（たとえば、米国特許Ｎｏ、４゜５２２．
７５１の調製物）より優れていることを明らかにするた
め、グリシンおよび硫酸アンモニウムによる沈澱の代わ
りに１．４５モル／Ｉ２グリシンのび右下で８％エヂル
アルコールをｐｒ−ｒ６．ｏで用いて、実施例１の初め
の部分を繰り返した。沈澱を分離し、塩化ナトリウム−
グリシン−アルブミンのクエン酸緩衝液に溶解し、凍結
乾燥し、この凍結乾燥物を水蒸気でそれぞれ８ｗ／ｗ％
および２４〜２６ｗ／ｗ％の水分量に再調節し、実施例
１に記載のようにして窒素雰囲気下で加熱した。結果を
次第２表に示すが、これらの結果は、一方で、■ｇＧ含
ｍの上昇がかなり大きいことを示しく１．８ｏに対して
３０Ｍ）、他方で、従来技術比較例の熱処理後の比活性
が明らかに低下することを示している（特に、長期加熱
後に）。

第２表比較例 因子■、凍結乾燥物 熱処理前　　　　　　　５４．３　ｔＪ／πＱ１００％
比活性　　　　　　　　２．６９ｔＪ／ｍ９囚子■ｔ、
ｏｏｏ単位 アｒ：リノＩｇＣ；ｍ　　　　　３０　Ｈ因子■、水分
Ｑ７．９％の凍結乾燥物 ６０℃で１０時間加熱　　５０．５１Ｊ／ｒｔＱ　　９
３％６０℃で７０時間加熱　　２４．４　Ｕ／スｄ　　
４５％６０℃で１００時間加熱　　２６．６　Ｕ／酎　
４９％７０℃で１０時間加熱　　２９．３　Ｕ／１５４
％囚子■、水分量２５，２％の凍結乾燥物６０℃で１０
時間加熱　　２４．４　ＴＪ／雇　４５％実施例３ 実施例１の初めの部分を繰り返した；１０％塩化ナトリ
ウムおよび１２％硫酸アンモニウムの沈澱濃度となるま
で、水溶液中で塩化ナトリウムと硫酸アンモニウムを組
み合わせて用い、因子■濃縮物を沈澱させた。さらに、
実施例１のようにして、処理し、遠心し、溶解し、透析
し、凍結乾燥し、加湿した。結果を第３表に示す。

第３表 因子■、凍結乾燥物 熱処理前　　　　　　　４２．６　Ｕ／ＲＱ　　１００
％比活性　　　　　　　　３．１８Ｕ／ｉ９囚子■ｔ、
ｏｏｏ単位 あたりのＩｇＧｍ　　　　　９Ｈ 因子■、水分量８％の凍結乾燥物 ７０℃で１０時間加熱　　　３０Ｕ／酎　７１％因子■
、水分ｍ２４．６％の凍結乾燥物３２１Ｊ／１１（１７
５％ 実施例４ 実施例１の初めの部分を繰り返した；５％クエン酸ナト
リウムおよび１２．５％硫酸アンモニウムの沈澱濃度と
なるまで、水溶液中でクエン酸ナー　　トリウムと硫酸
アンモニウムを組み合わせて用い、因子■製置法を沈澱
させた。さらに、実施例１のようにして、処理し、遠心
し、溶解し、透析し、凍結乾燥し、加湿した。結果を第
４表に示す。

匿±汲 因子■、凍結乾燥物 熱処理ｎ’ｉ　　　　　　　　４２．２１Ｊ／ｙ、Ｑ　
　１００％比活性　　　　　　　　３．４９０／巧囚子
■１，０００単位 あたりのＩｇＧｍ　　　　２．６ｍｇ 囚子■、水分ｍ８，３％の凍結乾燥物 ７α℃で１０時間加熱　　３２．８　Ｕ／ｍＱ　　７８
％因子■、水分ｍ　２７　、１％の凍結乾燥物６０℃で
１０時間加熱　　３４．５　Ｕ／ｒ；ｒＱ　　８２％実
施例５ 実施例１の初めの部分を繰り返した。１３．２％硫酸ア
ンモニウムの沈澱濃度となるまで、硫酸アンモニウムの
塩溶液を用いて因子■Ｐｔ縮物合法澱させた。さらに、
実施例１のようにして、処理し、遠心し、溶解し、透析
し、凍結乾燥し、加湿した。

結果を第５表に示す。

第５表 因子■、凍結乾燥物 熱処理前　　　　　　　４８．６　Ｕ／ｌＱ　　１００
％比活性　　　　　　　　５．７０Ｕ／ｒｌＩｇ囚子■
１，０００単位 あたりノＩｇＧｍ　　　　　Ｏ，６１１９囚子〜１、水
分子１７．７％の凍結乾燥物７０℃で１０時間加熱　　
２ｇ、９　Ｕ／酎　５９％囚子因子水分量２３．７％の
凍結乾燥物６０℃で１０時間加熱　　３９．２　Ｕ／村
　８１％すべての場合において、得られた因子■製置法
のＩｇＧｍは１０３１９よりはるかに少なく、かつ熱処
理した後の残留活性は７０％以上である。

特許出願人　イムノ・アクヂエンゲゼルシャフト・フ、
ニール・ヘミシューメディツィニッシェ・プロデュクテ

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくともタンパク質１ｍｇあたり因子VIII（Ａ
   ＨＦ）２．５単位の比活性、ならびに多くても因子VII
   I１０００単位あたり免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）１０
   ｍｇの割合を有し、治療または予防に用いたときのウィ
   ルスまたは細菌感染の危険が避けられているか、または
   そのほとんどが減じられている因子VIII含有分画の製造
   方法であって、 ａ）因子VIIIを含有する血漿分画溶液を調製し、ｂ）硫
   酸処理した多糖類の存在下、ほぼ中性の範囲にあるｐＨ
   で、該溶液から望ましくないタンパク質を沈澱させ、分
   離して、精製した因子VIII含有溶液を得、 ｃ）該精製した因子VIII含有溶液を、硫酸アンモニウム
   、硫酸アンモニウム−グリシン、塩化ナトリウム−グリ
   シン、硫酸ナトリウム、硫酸ナトリウム−クエン酸ナト
   リウム、硫酸アンモニウム−クエン酸ナトリウム、クエ
   ン酸塩−グリシンからなる群から選ばれるタンパク質沈
   澱剤で処理して、因子VIII含有沈澱物を沈澱させ、 ｄ）該因子VIII含有沈澱物を溶解し、凍結乾燥して、凍
   結乾燥物を得、そして、 ｅ）おそらく存在しているであろうウィルスを不活性化
   するに十分な時間および温度で、該凍結乾燥物を熱処理
   することからなる方法。
2. （２）該凍結乾燥物を、０．０５（５重量％）以上かつ
   ０．７０（７０重量％）以下の水分量に調節し、密閉し
   た容器中、５０〜１２１℃の範囲の温度で、蒸気分圧上
   昇のもとで処理する第（１）項記載の方法。
3. （３）該水分量を０．４０（４０重量％）以下に調節す
   る第（２）項記載の方法。
4. （４）該凍結乾燥物を、０．０１〜２バールの圧力で１
   ００時間以内、蒸気処理する第（１）項記載の方法。
5. （５）該ウィルスが、肝炎ウィルスおよびＨＩＶ（ヒト
   免疫欠損ウィルス）からなる群から選ばれる繁殖性かつ
   濾過性病原体である第（１）項記載の方法。
6. （６）該タンパク質沈澱剤による該因子VIII含有溶液の
   沈澱を、５．６〜６．８のｐＨおよび１〜４０℃の温度
   で行なう第（１）項記載の方法。
7. （７）少なくともタンパク質１ｍｇあたり因子VIII（Ａ
   ＨＦ）２．５単位の比活性、ならびに多くても因子VII
   I１０００単位あたり免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）１０
   ｍｇの割合を有し、治療または予防に用いたときのウィ
   ルスまたは細菌感染の危険が避けられているか、または
   そのほとんどが減じられている因子VIII含有分画の製造
   方法であって、 ａ）クエン酸緩衝液中で、第１の因子VIII含有凍結沈澱
   物溶液を調製し、 ｂ）硫酸処理した多糖類の存在下、６．０〜６．４のｐ
   Ｈおよび０〜２５℃の温度で、該第１の溶液から望まし
   くないタンパク質を沈澱させ、分離して、精製した因子
   VIII含有上清を得、 ｃ）該精製した因子VIII含有上清を、硫酸アンモニウム
   、硫酸アンモニウム−グリシン、塩化ナトリウム−グリ
   シン、硫酸ナトリウム、硫酸ナトリウム−クエン酸ナト
   リウム、硫酸アンモニウム−クエン酸ナトリウム、クエ
   ン酸塩−グリシンからなる群がら選ばれるタンパク質沈
   澱剤を用い、８〜３５％の濃度および５．６〜６．８の
   ｐＨで処理して、因子VIII含有沈澱物を沈澱させ、 ｄ）該因子VIII含有沈澱物を、抗トロンビン−ヘパリノ
   イド複合体および抗トロンビン−III−ヘパリノイド複
   合体のいずれかならびにアルブミンを含有する塩化ナト
   リウム−クエン酸ナトリウム緩衝液に溶解して第２の溶
   液を得、 ｅ）該第２の溶液を限外濾過するか、または透析し、凍
   結乾燥して凍結乾燥物を得、そして ｆ）おそらく存在しているであろうウィルスを不活性化
   するに十分な時間および温度で、該凍結乾燥物を熱処理
   することからなる方法。
8. （８）該クエン酸緩衝液が、ヘパリン、ヘパリノイド、
   ヘパリンと抗トロンビンIIIの複合化合物、およびアプ
   ロチニンからなる群の少なくとも１種を含有している第
   （７）項記載の方法。
9. （９）沈澱および分離を４〜８℃の温度で行なう第（７
   ）項記載の方法。